La hipermetilación de NOS1 podría participar en el desarrollo del cáncer colorrectal y estar asociada con su pronóstico.

El cáncer colorrectal (CCR) es un problema de salud pública de gran importancia, ya que es el tercer cáncer más diagnosticado y la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [^[1]]. La vía clásica de la tumorigénesis colorrectal se caracteriza por una secuencia adenoma-carcinoma que puede durar décadas y requiere la acumulación progresiva de alteraciones genéticas y epigenéticas [^[2],^[3]]. A medida que la transformación maligna se desarrolla gradualmente, el prometedor pronóstico del CCR depende de la detección temprana y la intervención oportuna [^[4]]. Sin embargo, a pesar de los avances, los desafíos en la detección y el seguimiento del cáncer persisten debido a las limitaciones de los biomarcadores existentes. Esto pone de manifiesto la necesidad de explorar ampliamente otros factores implicados en el desarrollo del CCR, investigando específicamente la regulación epigenética de los genes que aún no se han asociado con la tumorigénesis. Dicha exploración contribuye a una comprensión más integral, acercándonos a la capacidad de distinguir con precisión los adenomas con potencial maligno.

Los cambios epigenéticos están estrechamente asociados con la tumorigénesis, y se ha demostrado que los mecanismos epigenéticos, como la metilación del ADN, desempeñan un papel fundamental en la iniciación y la progresión del cáncer [[3–5]]. La metilación aberrante, caracterizada por la hipermetilación del promotor y el silenciamiento transcripcional de los genes supresores de tumores, como CDKN2A, MLH1 y APC, es un evento característico en las etapas iniciales de la carcinogénesis colorrectal [[6–8]]. Además, se ha demostrado que las diferencias en los perfiles de metilación afectan la probabilidad de que los pólipos progresen a CCR. Los patrones de metilación del ADN con diferencias significativas se han propuesto como biomarcadores para el diagnóstico del cáncer, el pronóstico y la predicción de la respuesta al tratamiento [^[9],^[10]]. SEPT9 y la combinación de NDRG4 y BMP3 son dos biomarcadores diagnósticos basados en la metilación aprobados para el CCR, y SDC2, VIM, APC, MGMT, SFRP1, SFRP2 y NDRG4 tienen funciones distintas relacionadas con la progresión tumoral colorrectal [^[11]]. Dada la complejidad del desarrollo del CCR y la posible participación de diversos factores, adoptar inicialmente un análisis más amplio en diversos tipos de cáncer es un enfoque estratégico para descubrir nuevos biomarcadores potenciales para el CCR. Aunque los cánceres poseen sus propias identidades genéticas, las modificaciones epigenéticas son características de todos los cánceres.

NOS1, ubicado en el cromosoma 12q24.2, produce varias transcripciones de ARNm empalmadas alternativamente que pueden dar como resultado cinco isoformas de proteínas diferentes [[12–14]]. La proteína NOS1, también conocida como óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS), es una enzima importante que se encuentra predominantemente en las neuronas y las células endoteliales, y es responsable de la generación de óxido nítrico. Las funciones específicas de las neuronas de NOS1 han sido bien documentadas [^[15],^[16]]. Sin embargo, el papel de NOS1 en los tejidos no neuronales ha recibido poca atención. Cabe destacar que estudios previos han informado sobre la participación de NOS1 en la progresión de enfermedades cardiovasculares, obesidad y diversos cánceres, incluido el cáncer de colon, el carcinoma nasofaríngeo y el melanoma [[17–19]]. Además, los estudios han identificado NOS1 como un gen de susceptibilidad o un gen relacionado con el pronóstico en el CCR [[20–22]], lo que presenta evidencia adicional de la participación de NOS1 en la tumorigénesis y la metástasis colorrectal. Sin embargo, el papel de la metilación de NOS1 en el desarrollo del CCR aún no está claro.

En este estudio, evaluamos sistemáticamente la expresión y el estado de metilación de NOS1 en diversos tipos de cáncer, utilizando datos de la base de datos UCSC Xena. Confirmamos la hipermetilación de NOS1 en el conjunto de datos interno 1 de 48 pacientes con CCR y lo validamos posteriormente utilizando el conjunto de datos interno 2, que incluyó un tamaño de muestra ampliado que comprendía 286 pacientes con CCR, 81 pacientes con adenoma avanzado (AA) y 81 pacientes con adenoma no avanzado (NAA). Además, se determinaron los niveles de expresión de NOS1 en muestras de lesiones y tejidos normales emparejados en el conjunto de datos interno 3, que incluyó 68 CCR, 45 AA y 40 NAA, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR). Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando datos de recuento de ARN de pacientes con CCR de la base de datos UCSC Xena. Finalmente, investigamos el impacto de NOS1 en la supervivencia específica de la enfermedad (DSE) en pacientes con CCR basándose en datos de la base de datos UCSC Xena y los conjuntos de datos internos.

Materiales y métodos

Diseño del estudio e inclusión de sujetos

Se llevó a cabo un estudio sistemático bien diseñado. Primero, identificamos la baja expresión de NOS1 y la hipermetilación del promotor en el CCR utilizando datos de RNA-Seq y HM450 de la base de datos UCSC Xena. La hipermetilación de NOS1 se confirmó principalmente mediante datos de metilación del ADN generados utilizando MassARRAY EpiTyper en 48 pares de tejidos de CCR y tejidos normales en el conjunto de datos interno 1. Además, el estado de metilación de NOS1 se evaluó en 286 CCR, 81 AA y 81 NAA en nuestro conjunto de datos interno 2 para caracterizar completamente los patrones de cambios en la metilación en NOS1 durante el desarrollo del CCR. Además, se incluyeron 68 CCR, 45 AA y 40 NAA en el conjunto de datos interno 3 para cuantificar los niveles de transcripción de NOS1. Las características básicas de los pacientes del estudio se muestran en el archivo adicional 1 (Tabla S1). Finalmente, los pacientes con CCR con datos de metilación del ADN medidos con éxito en los conjuntos de datos internos 1 y 2 se agruparon para evaluar la asociación de la hipermetilación de NOS1 con la supervivencia específica del CCR. La inclusión de pacientes con CCR se basó en datos del Hospital del Pueblo de Shaoxing entre enero de 2015 y julio de 2018. Los pacientes con adenomas colorrectales (AA o NAA) se obtuvieron de una cohorte poblacional en curso desde 1989 en el condado de Jiashan, provincia de Zhejiang, China, que se ha descrito en detalle anteriormente [^[23]]. Todos los pacientes fueron confirmados patológicamente, excluyendo aquellos con poliposis adenomatosa familiar (PAF), antecedentes de CCR y tratamiento antitumoral preoperatorio. Se obtuvo una muestra de lesión colorrectal (carcinoma o adenoma) confirmada histológicamente y una muestra de mucosa normal adyacente correspondiente de cada paciente. Las muestras de tejido normal adyacente se recolectaron a 5 cm del neoplasma primario. Los adenomas con al menos un adenoma convencional ≥ 1 cm de diámetro o con histología avanzada (características histológicas tubulovillosas/villosas o displasia de alto grado o severa) se definieron como AA, y los adenomas < 1 cm de diámetro sin histología avanzada se definieron como NAA [^[24]]. Los estadios patológicos del CCR se clasificaron en I, II, III y IV según el manual de estadificación del cáncer del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC) [^[25]]. Nuestro estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (#2019–052, actualización de 2019). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes individuales incluidos en el estudio.

Análisis de bases de datos públicas

Obtuvimos datos de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y metilación del ADN (HM450) para 33 tipos de cáncer y datos clínicos para el CCR de la base de datos UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). Se utilizaron un total de 11 sitios CpG (cg20285745, cg04883903, cg03538436, cg04529785, cg04899175, cg20840426, cg18834729, cg02962597, cg21006686, cg21273407, cg18243853) ubicados en el promotor de NOS1. Además, descargamos datos de expresión de ARN (GSE44076, GSE21510, GSE18105 y GSE73360) de pacientes con CCR de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Aislamiento de ADN y modificación con bisulfito

El ADN genómico de los tejidos congelados se extrajo utilizando un kit de tejido de ADN (TianLong Biotech, Xi’an, China) y se trató con bisulfito de sodio utilizando un kit EZ Methylation Gold (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos estándar.

Ensayo Sequenom EpiTYPER

El análisis cuantitativo de la metilación del ADN del promotor de NOS1 se realizó utilizando MassARRAY EpiTyper (Sequenom, San Diego, CA, EE. UU.). Los cebadores se diseñaron utilizando el software en línea EpiDesigner (https://epidesigner.com/, archivo adicional 1: Tabla S2). La región objetivo contenía 49 sitios CpG, de los cuales 43 se detectaron con éxito. Los sitios CpG vecinos cercanos que no podían distinguirse mediante el ensayo MassARRAY se analizaron como unidades CpG. Por lo tanto, los 43 sitios CpG se combinaron en 29 unidades CpG para análisis posteriores. Las unidades CpG que produjeron datos en más del 80% de las muestras, así como las muestras con detección de metilación en más del 80% de las unidades CpG, pasaron el control de calidad. En el conjunto de datos interno 1, se incluyeron 28 unidades CpG en los análisis debido a la baja tasa de detección de CpG9 (59,38%). En el conjunto de datos interno 2, se incluyeron 27 unidades CpG en los análisis, ya que CpG24 se excluyó además debido a la menor tasa de detección (75,89%) (archivo adicional 1: Figura S1). Los valores beta de estas unidades CpG estaban entre 0 y 1, y se calculó el valor promedio de todas las unidades CpG detectadas con éxito como el nivel medio de metilación del promotor de NOS1.

Aislamiento de ARN, transcripción inversa y RT-qPCR

El ARN total se extrajo de las muestras de tejido utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN purificado se transcribió inversamente a ADNc utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) (Takara, Otsu, Shiga, Japón). La amplificación se realizó utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara, Otsu, Shiga, Japón) en un Light Cycler 480 (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). El gen doméstico, GAPDH, se utilizó como referencia interna. Los experimentos se repitieron tres veces. La expresión relativa de NOS1 se calculó utilizando el método 2−ΔΔCT. Los cebadores específicos utilizados para la RT-qPCR se enumeran en el archivo adicional 1 (Tabla S2).

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes

GSEA determina si un conjunto definido de genes es significativamente diferente entre dos estados biológicos [^[26]]. Se utilizó la base de datos de conjuntos de genes c2.cp.kegg.v2023.1. El subconjunto KEGG de conjuntos de genes seleccionados (Hs. symbols. gmt). Los datos de expresión génica se analizaron para identificar los genes expresados diferencialmente (DEG) utilizando el paquete edgeR. Se empleó GSEA para dilucidar las diferencias funcionales en los genes entre los grupos de baja y alta expresión de NOS1. La agrupación se basó en la proporción de ‘NOS1 bajo’ a ‘NOS1 alto’ dentro de las muestras de CCR estudiadas. FDR, puntuación de enriquecimiento normalizada (NES) y valor p se analizaron para clasificar cada vía de señalización de enriquecimiento fenotípico. Para analizar más a fondo las implicaciones funcionales de NOS1, se realizó un análisis de anotación funcional utilizando las bases de datos Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), que caracterizaron los procesos biológicos, las funciones moleculares, las localizaciones celulares y las vías de señalización en las que participa NOS1.

Análisis estadístico

Los resultados se muestran como la media y la desviación estándar (DE) para las variables continuas y como números y porcentajes para las variables categóricas. Se utilizaron la prueba t de Student pareada y la prueba de Wilcoxon para evaluar las diferencias en la metilación del ADN y los niveles de expresión entre los tejidos de la lesión y los tejidos normales. La relación entre la metilación del ADN y los niveles de expresión génica se probó utilizando la correlación de Spearman. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para realizar comparaciones múltiples entre los grupos. En el análisis de supervivencia, se utilizó un corte óptimo que empleó el índice de Youden basado en la curva ROC dependiente del tiempo para dicotomizar a los pacientes del estudio en grupos de alto y bajo riesgo. Se generaron curvas de Kaplan-Meier de supervivencia específica de la enfermedad (DSE) y se realizó una prueba de rango logarítmico para evaluar las diferencias de supervivencia entre los grupos. El valor pronóstico se analizó utilizando un modelo de regresión de Cox multivariado ajustado por edad, sexo y estadio TNM. Se calcularon las razones de riesgo (RR) y los intervalos de confianza del 95% (IC del 95%).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando R, versión 4.2.3. Todas las pruebas fueron de dos colas y la significación estadística se estableció en p < 0,05.

Diseño del estudio e inclusión de sujetos

Se llevó a cabo un estudio sistemático bien diseñado. Primero, identificamos la baja expresión de NOS1 y la hipermetilación del promotor en el CRC utilizando datos de RNA-Seq y HM450 de la base de datos UCSC Xena. La hipermetilación de NOS1 se confirmó principalmente mediante datos de metilación del ADN generados utilizando MassARRAY EpiTyper en 48 pares de tejidos de CRC y tejidos normales en el conjunto de datos interno 1. Además, el estado de metilación de NOS1 se evaluó en 286 CRCs, 81 adenomas avanzados (AA) y 81 adenomas no avanzados (NAA) en nuestro conjunto de datos interno 2 para caracterizar completamente los patrones de cambios en la metilación de NOS1 durante el desarrollo del CRC. Adicionalmente, se incluyeron 68 CRCs, 45 AAs y 40 NAAs del conjunto de datos interno 3 para cuantificar los niveles de transcripción de NOS1. Las características básicas de los pacientes del estudio se muestran en el Archivo Suplementario 1 (Tabla S1). Finalmente, los pacientes con CRC con datos de metilación del ADN medidos con éxito en los conjuntos de datos internos 1 y 2 se agruparon para evaluar la asociación de la hipermetilación de NOS1 con la supervivencia específica del CRC. La inclusión de pacientes con CRC se basó en datos del Hospital del Pueblo de Shaoxing entre enero de 2015 y julio de 2018. Los pacientes con adenomas colorrectales (AA o NAA) se obtuvieron de una cohorte poblacional en curso desde 1989 en el condado de Jiashan, provincia de Zhejiang, China, que se ha descrito en detalle anteriormente [^[23]]. Todos los pacientes fueron confirmados patológicamente, excluyendo aquellos con poliposis adenomatosa familiar (PAF), antecedentes de CRC y tratamiento antitumoral preoperatorio. Se obtuvo una muestra de lesión colorrectal (carcinoma o adenoma) confirmada histológicamente y la muestra de mucosa normal adyacente correspondiente de cada paciente. Las muestras de tejido normal adyacente se recolectaron a 5 cm del neoplasma primario. Los adenomas con al menos un adenoma convencional ≥ 1 cm de diámetro o con histología avanzada (características histológicas tubulovellosas/vellosas o displasia de alto grado o severa) se definieron como AA, y los adenomas < 1 cm de diámetro sin histología avanzada se definieron como NAA [^[24]]. Los estadios patológicos del CRC se clasificaron en I, II, III y IV según el manual de estadificación del cáncer del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC) [^[25]]. Nuestro estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (#2019–052, actualización de 2019). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes individuales incluidos en el estudio.

Análisis de bases de datos públicas

Obtuvimos datos de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y metilación del ADN (HM450) para 33 tipos de cáncer y datos clínicos para CRC de la base de datos UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). Se utilizaron un total de 11 sitios CpG (cg20285745, cg04883903, cg03538436, cg04529785, cg04899175, cg20840426, cg18834729, cg02962597, cg21006686, cg21273407, cg18243853) ubicados en el promotor de NOS1. Además, descargamos datos de expresión de ARN (GSE44076, GSE21510, GSE18105 y GSE73360) de pacientes con CRC de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Aislamiento de ADN y modificación con bisulfito

El ADN genómico de tejidos recién congelados se extrajo utilizando un kit de ADN para tejidos (TianLong Biotech, Xi’an, China) y se trató con bisulfito de sodio utilizando un kit EZ Methylation Gold (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos estándar.

Ensayo Sequenom EpiTYPER

El análisis cuantitativo de la metilación del ADN del promotor de NOS1 se realizó utilizando MassARRAY EpiTyper (Sequenom, San Diego, CA, EE. UU.). Los cebadores se diseñaron utilizando el software en línea EpiDesigner (https://epidesigner.com/, Archivo Suplementario 1: Tabla S2). La región objetivo contenía 49 sitios CpG, de los cuales 43 se detectaron con éxito. Los sitios CpG vecinos cercanos que no podían distinguirse mediante el ensayo MassARRAY se analizaron como unidades CpG. Por lo tanto, los 43 sitios CpG se combinaron en 29 unidades CpG para análisis posteriores. Las unidades CpG que produjeron datos en más del 80% de las muestras, así como las muestras con llamada de metilación en más del 80% de las unidades CpG, pasaron el control de calidad. En el conjunto de datos interno 1, se incluyeron 28 unidades CpG en los análisis debido a la baja tasa de detección de CpG9 (59,38%). En el conjunto de datos interno 2, se incluyeron 27 unidades CpG en los análisis, ya que CpG24 se excluyó además debido a la menor tasa de detección (75,89%) (Archivo Suplementario 1: Figura S1). Los valores beta de estas unidades CpG estaban entre 0 y 1, y se calculó el valor promedio de todas las unidades CpG detectadas con éxito como el nivel medio de metilación del promotor de NOS1.

Aislamiento de ARN, transcripción inversa y qRT-PCR

Se extrajo el ARN total de las muestras de tejido utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN purificado se transcribió inversamente a ADNc utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) (Takara, Otsu, Shiga, Japón). La amplificación se realizó utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara, Otsu, Shiga, Japón) en un Light Cycler 480 (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). El gen de referencia, GAPDH, se utilizó como referencia interna. Los experimentos se repitieron por triplicado. La expresión relativa de NOS1 se calculó utilizando la fórmula 2−ΔΔCT. Los cebadores específicos utilizados para qRT-PCR se enumeran en el Archivo Suplementario 1 (Tabla S2).

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes

GSEA determina si un conjunto definido de genes es significativamente diferente entre dos estados biológicos [^[26]]. Se utilizó la base de datos de conjuntos de genes c2.cp.kegg.v2023.1. El subconjunto KEGG de conjuntos de genes seleccionados (Hs. symbols. gmt) en este estudio. Los datos de expresión génica se analizaron para identificar genes expresados diferencialmente (DEG) utilizando el paquete edgeR. Se empleó GSEA para dilucidar las diferencias funcionales en los genes entre los grupos de baja y alta expresión de NOS1. La agrupación se basó en la proporción de ‘NOS1 bajo’ a ‘NOS1 alto’ dentro de las muestras de CRC estudiadas. FDR, la puntuación de enriquecimiento normalizada (NES) y el valor p se analizaron para clasificar cada vía de señalización de enriquecimiento fenotípico. Para profundizar en las implicaciones funcionales de NOS1, se realizó un análisis de anotación funcional utilizando las bases de datos Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), que caracterizaron los procesos biológicos, las funciones moleculares, las localizaciones celulares y las vías de señalización en las que participa NOS1.

Análisis estadístico

Los resultados se muestran como la media y la desviación estándar (DE) para las variables continuas y como números y porcentajes para las variables categóricas. Se utilizaron la prueba t de Student pareada y la prueba de Wilcoxon para evaluar las diferencias en la metilación del ADN y los niveles de expresión entre los tejidos de la lesión y los tejidos normales. La relación entre la metilación del ADN y los niveles de expresión génica se probó utilizando la correlación de Spearman. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para realizar comparaciones múltiples entre grupos. En el análisis de supervivencia, se utilizó un corte óptimo que empleaba el índice de Youden basado en la curva ROC dependiente del tiempo para dicotomizar a los pacientes del estudio en grupos de alto y bajo riesgo. Se generaron curvas de Kaplan-Meier de supervivencia específica de la enfermedad (DSS) y se realizó una prueba de rango logarítmico para evaluar las diferencias de supervivencia entre los grupos. El valor pronóstico se analizó utilizando un modelo de regresión de Cox multivariado ajustado por edad, sexo y estadio TNM. Se calcularon las razones de riesgo (HR) y los intervalos de confianza del 95% (IC del 95%).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando R, versión 4.2.3. Todas las pruebas fueron de dos colas y la significación estadística se estableció en p < 0,05.

Resultados

Baja expresión e hipermetilación de NOS1 en cánceres humanos mediante una base de datos en línea

Se realizaron análisis de expresión diferencial de NOS1 entre los tejidos tumorales y los tejidos normales en 33 cánceres de la base de datos UCSC Xena. En comparación con los tejidos normales, se encontró una expresión significativamente menor de NOS1 en los tejidos tumorales de 18 cánceres (p < 0,05) (Figura 1(A–R), Archivo Suplementario 1: Figura S2A-O), de los cuales 12 cánceres mostraron una hipermetilación significativa en NOS1, con la mayor diferencia observada en el CRC (Δβ = 0,19) (Figura 2(A–R)).

Confirmación de la hipermetilación de NOS1 en los cánceres colorrectales internos

El estado de metilación de NOS1 en 46 de los 48 pares de tejidos tumorales colorrectales y tejidos normales adyacentes se midió con éxito. La media y los niveles individuales de metilación de 28 unidades CpG en el promotor de NOS1 fueron significativamente más altos en los tejidos tumorales de CRC que en los tejidos normales adyacentes (p < 0,01) (Figura 3A). Específicamente, se encontró hipermetilación de NOS1 en el 91,3% (42/46) de los pacientes con CRC (Figura 3B).

Dilucidación de los patrones de hipermetilación de NOS1 en diferentes etapas de la carcinogénesis colorrectal

Para dilucidar el patrón de cambios en la metilación de NOS1 durante la carcinogénesis colorrectal, el estado de metilación de NOS1 se detectó con éxito en las lesiones y los tejidos normales adyacentes de 286 CRCs, 81 AA y 81 NAA en el conjunto de datos interno 2. Los niveles de metilación de NOS1 fueron consistentemente más altos en los tejidos de CRC (Figura 4A) y AA (Figura 4B) que en sus tejidos normales correspondientes, pero no en la comparación entre NAA y sus tejidos normales adyacentes (Figura 4C). En consecuencia, la hipermetilación de NOS1 en los tejidos de la lesión ocurrió con mayor frecuencia en el CRC (83,7%, 231/276), de forma intermedia en el AA (74,0%, 57/77) y con menor frecuencia en el NAA (60,5%, 46/76) (Figura 4D). Excepto por CpG4.5, CpG19 y CpG44, se observó una hipermetilación significativa en la mayoría de las unidades CpG. Además, los cambios de hipermetilación aberrantes aumentaron de NAA a AA y CRC (p_ tendencia < 0,001) (Archivo Suplementario 1: Tabla S3).

Afirmación del estado de expresión de NOS1 en diferentes etapas del desarrollo del cáncer colorrectal

Exploramos además la expresión de NOS1 en los tejidos de CRC utilizando GEO y encontramos que la expresión de NOS1 se redujo significativamente en los tejidos de CRC (Figura 5A). Además, se detectó la expresión de NOS1 en pares de lesiones y tejidos normales adyacentes de 68 CRCs, 45 AAs y 40 NAAs en el conjunto de datos interno 3. Se encontró una expresión significativamente menor de NOS1 en los CRCs (p < 0,001) (Figura 5B), pero no en los AAs (Figura 5B) ni en los NAAs (Figura 5B). Para explorar aún más los posibles mecanismos del gen NOS1 en el CRC, se realizó GSEA en función de los datos de recuento de ARN de la base de datos UCSC Xena. Los análisis de vías mostraron que la alta expresión de NOS1 se correlacionó positivamente con la firma ‘PATHWAYSINCANCER’ (Figura 5C). Con base en las anotaciones GO y KEGG, encontramos que NOS1 está involucrado en varias vías biológicas relevantes para el CRC, incluido la producción de óxido nítrico, la respuesta a la hipoxia y la señalización mediada por cGMP. NOS1 también participó en las vías metabólicas del arginina y el nitrógeno que influyen en el equilibrio redox, la regulación vascular y el microambiente inmunitario tumoral (Archivo Suplementario 1: Tabla S4, Tabla S5).

Exploración de la importancia pronóstica de NOS1 en pacientes con cáncer colorrectal

Utilizando la base de datos UCSC Xena, encontramos que la expresión de NOS1 se correlacionó significativamente de forma negativa con los niveles de metilación en cuatro de los 18 cánceres, incluido el CRC (r = -0,151, p = 0,021) (Figura 6A, Archivo Suplementario 1: Tabla S6). En consecuencia, encontramos además que los pacientes con baja expresión tenían una supervivencia significativamente mejor que aquellos con alta expresión, y que aquellos con alta metilación tenían una mejor supervivencia que aquellos con baja metilación (Figura 6B-C).

Además, incluimos 327 pacientes con CRC y datos completos de metilación del ADN de los conjuntos de datos internos 1 y 2 para los análisis de supervivencia. Hubo 70 muertes específicas de CRC, con un tiempo medio de seguimiento de 4,62 años. Como se muestra en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, 11 de las 27 unidades de CpG estaban significativamente asociadas con la supervivencia del CRC. Los pacientes con altos niveles de metilación de NOS1 presentaban una mejor supervivencia que aquellos con bajos niveles de metilación (Figura 6D, Archivo suplementario 1: Figura S3). El análisis de regresión de Cox multivariante reveló que la metilación de NOS1 era un biomarcador pronóstico independiente para los pacientes con CRC (HR = 0,52, IC del 95%: 0,29-0,95, p = 0,032) (Figura 6E).

Baja expresión e hipermetilación de NOS1 en cánceres humanos mediante una base de datos en línea

Se realizaron análisis de expresión diferencial de NOS1 entre tejidos tumorales y normales en 33 tipos de cáncer de la base de datos UCSC Xena. En comparación con los tejidos normales, se encontró una expresión significativamente menor de NOS1 en los tejidos tumorales de 18 cánceres (p < 0,05) (Figura 1 (A-R), Archivo suplementario 1: Figura S2A-O), de los cuales 12 cánceres mostraron una hipermetilación significativa en NOS1, con la mayor diferencia observada en el CRC (Δβ = 0,19) (Figura 2 (A-R)).

Confirmación de la hipermetilación de NOS1 en cánceres colorrectales de nuestro estudio

El estado de metilación de NOS1 en 46 de los 48 pares de tejidos tumorales colorrectales y tejidos normales adyacentes se midió con éxito. La media y los niveles individuales de metilación de 28 unidades de CpG en el promotor de NOS1 fueron significativamente más altos en los tejidos tumorales de CRC que en los tejidos normales adyacentes (p < 0,01) (Figura 3A). Específicamente, se encontró hipermetilación de NOS1 en el 91,3% (42/46) de los pacientes con CRC (Figura 3B).

Elucidación de los patrones de hipermetilación de NOS1 en diferentes etapas de la carcinogénesis colorrectal

Para dilucidar el patrón de los cambios en la metilación de NOS1 durante la carcinogénesis colorrectal, el estado de metilación de NOS1 se detectó con éxito en lesiones y tejidos normales adyacentes de 286 CRCs, 81 AAs y 81 NAAs en el conjunto de datos interno 2. Los niveles de metilación de NOS1 fueron consistentemente más altos en el CRC (Figura 4A) y los tejidos de AA (Figura 4B) que en sus tejidos normales correspondientes, pero no en la comparación entre NAA y sus tejidos normales adyacentes (Figura 4C). En consecuencia, la hipermetilación de NOS1 en los tejidos de las lesiones ocurrió con mayor frecuencia en el CRC (83,7%, 231/276), de forma intermedia en el AA (74,0%, 57/77) y con menor frecuencia en el NAA (60,5%, 46/76) (Figura 4D). Excepto por CpG4.5, CpG19 y CpG_44, se observó una hipermetilación significativa en la mayoría de las unidades de CpG. Además, los cambios de hipermetilación aberrante aumentaron desde NAA hasta AA y CRC (p < 0,001) (Archivo suplementario 1: Tabla S3).

Confirmación del estado de expresión de NOS1 en diferentes etapas del desarrollo del cáncer colorrectal

Exploramos más a fondo la expresión de NOS1 en los tejidos de CRC utilizando GEO y encontramos que la expresión de NOS1 se redujo significativamente en los tejidos de CRC (Figura 5A). Además, se detectó la expresión de NOS1 en pares de lesiones y tejidos normales adyacentes de 68 CRCs, 45 AAs y 40 NAAs en el conjunto de datos interno 3. Se encontró una expresión significativamente menor de NOS1 en los CRCs (p < 0,001) (Figura 5B), pero no en los AAs (Figura 5B) ni en los NAAs (Figura 5B). Para explorar más a fondo los posibles mecanismos del gen NOS1 en el CRC, se realizó GSEA basándose en los datos de recuento de ARN de la base de datos UCSC Xena. Los análisis de vías mostraron que la alta expresión de NOS1 se correlacionaba positivamente con la firma 'PATHWAYSINCANCER' (Figura 5C). Basándonos en las anotaciones GO y KEGG, encontramos que NOS1 participa en varias vías biológicas relevantes para el CRC, incluida la producción de óxido nítrico, la respuesta a la hipoxia y la señalización mediada por cGMP. NOS1 también participa en las vías metabólicas del arginina y el nitrógeno que influyen en el equilibrio redox, la regulación vascular y el microambiente inmunitario tumoral (Archivo suplementario 1: Tabla S4, Tabla S5).

Exploración de la importancia pronóstica de NOS1 en pacientes con cáncer colorrectal

Utilizando la base de datos UCSC Xena, encontramos que la expresión de NOS1 se correlacionaba significativamente de forma negativa con los niveles de metilación en cuatro de los 18 cánceres, incluido el CRC (r = -0,151, p = 0,021) (Figura 6A, Archivo suplementario 1: Tabla S6). En consecuencia, encontramos además que los pacientes con baja expresión presentaban una supervivencia significativamente mejor que aquellos con alta expresión, y que aquellos con alta metilación presentaban una mejor supervivencia que aquellos con baja metilación (Figura 6B-C).

Además, incluimos 327 pacientes con CRC y datos completos de metilación del ADN de los conjuntos de datos internos 1 y 2 para los análisis de supervivencia. Hubo 70 muertes específicas de CRC, con un tiempo medio de seguimiento de 4,62 años. Como se muestra en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, 11 de las 27 unidades de CpG estaban significativamente asociadas con la supervivencia del CRC. Los pacientes con altos niveles de metilación de NOS1 presentaban una mejor supervivencia que aquellos con bajos niveles de metilación (Figura 6D, Archivo suplementario 1: Figura S3). El análisis de regresión de Cox multivariante reveló que la metilación de NOS1 era un biomarcador pronóstico independiente para los pacientes con CRC (HR = 0,52, IC del 95%: 0,29-0,95, p = 0,032) (Figura 6E).

Discusión

La comprensión actual del estado de metilación de NOS1 durante la carcinogénesis colorrectal es limitada. En este estudio, utilizando una base de datos en línea, encontramos primero una baja expresión de NOS1 en 18 cánceres, entre los cuales 12 se identificaron como significativamente hipermetilados, incluido el CRC. Se confirmó la hipermetilación significativa de NOS1 en pacientes con CRC. Además, se observó una hipermetilación significativa de NOS1 durante la carcinogénesis colorrectal y el nivel de metilación aumentó a medida que la enfermedad progresaba desde AA hasta CRC. Sin embargo, solo se observó una menor expresión de NOS1 en nuestras muestras de tejido de CRC interno, pero no en los pacientes con AA y NAA. Por último, basándonos en una base de datos en línea y conjuntos de datos internos, confirmamos que la hipermetilación de NOS1 es un posible biomarcador pronóstico para los pacientes con CRC.

La metilación del ADN, un aspecto crucial de la regulación epigenética, ha demostrado desempeñar un papel importante en el CRC. La hipermetilación del promotor de genes específicos se ha estudiado en el CRC [^[27], ^[28]] y numerosos estudios han destacado que la hipermetilación del promotor del ADN puede participar en el desarrollo del cáncer mediante la inactivación de genes supresores de tumores [^[29], ^[30]]. Sin embargo, aún se desconoce mucho sobre el papel de NOS1 en el desarrollo del CRC, especialmente en términos de la asociación entre su metilación, expresión y funcionalidad. En este estudio, se identificó una baja expresión e hipermetilación de NOS1 en 12 de 33 tipos de cáncer, incluido el CRC, y estos hallazgos se validaron posteriormente en pacientes con CRC de nuestros conjuntos de datos internos. Aunque solo se encontró una baja expresión de NOS1 en nuestros pacientes con CRC interno, pero no en los pacientes con AA y NAA, se observó una relación entre la alta metilación y la baja expresión de NOS1 en el desarrollo del CRC. Además, la baja expresión y la hipermetilación de NOS1 se asocian con un pronóstico favorable en los pacientes con CRC. Específicamente, se encontró que la hipermetilación de NOS1 era un biomarcador pronóstico independiente para los pacientes con CRC. Nuestros hallazgos son coherentes con los de otros estudios [^[31], ^[32]], que han informado que la metilación de genes, como la hipermetilación de MGMT, se asocia con un mejor pronóstico en los pacientes con CRC. Además, se considera que la alta expresión de NOS1 en los tejidos de CRC es un factor de riesgo en un modelo pronóstico del CRC [^[22]]. Por lo tanto, los pacientes con CRC con hipermetilación de NOS1 y la correspondiente baja expresión pueden ser posibles biomarcadores para una mejor supervivencia del CRC.

Nuestro estudio actual proporciona información sobre la secuencia de progresión de adenoma a cáncer del CRC. Se ha informado que los cambios epigenéticos se producen durante la transición de un estado normal a lesiones precancerosas a un estado canceroso. Sin embargo, la mayoría de los estudios anteriores se han centrado principalmente en el perfilado global de los tumores colorrectales, con poca atención a las lesiones premalignas [^[33]]. Los adenomas colorrectales son las lesiones precancerosas más comunes, y se cree que los adenomas avanzados tienen un mayor potencial de transformación maligna [^[34]]. El estudio de estas lesiones premalignas podría ayudar a dilucidar la biología de la tumorigénesis colorrectal. En nuestro estudio, se identificaron niveles de metilación de NOS1 significativamente diferentes entre las diferentes etapas de las lesiones colorrectales. Se encontró hipermetilación de NOS1 en el 83,7%, 74,0% y 60,5% de los pacientes con CRC, AA y NAA, respectivamente, lo que apoya la idea de que los patrones de metilación aberrantes aparecen en las primeras etapas de la progresión neoplásica colorrectal [^[35]]. Además, la hipermetilación de NOS1 fue más común en las unidades de CpG de AA que en NAA. Esto indica que el mecanismo biológico subyacente a la aparición de AA es mucho más cercano a la etapa tumoral que el de NAA y que la acumulación de metilación aberrante se identifica principalmente en la etapa de adenoma avanzado [^[32]]. En conjunto, la hipermetilación de NOS1 tiene el potencial de ser un biomarcador para la detección temprana del CRC. Nuestros hallazgos pueden ayudar a proporcionar pistas para la futura práctica clínica, ya que la metilación se ha reconocido como un cambio epigenético estable [^[36]].

Los hallazgos de estudios anteriores han sugerido la participación de NOS1 en la patogénesis del CRC. Por ejemplo, Wang et al. revelaron que la NOS1 mitocondrial inhibe la apoptosis en las células de cáncer de colon [^[37]], y los modelos animales de colitis mostraron una expresión alterada de la NOS1 [^[38]]. En particular, la NOS1, junto con la NOS2 y la NOS3, constituyen la familia de la óxido nítrico sintasa (NOS), liberando radicales libres de óxido nítrico biológicamente activos como subproducto [^[39]]. El NO es uno de los mensajeros más importantes capaces de regular diversas actividades biológicas en las células y los tejidos [^[40]]. Además, se ha demostrado que el NO tiene efectos tanto antitumorales como promotores del tumor, dependiendo de su momento, ubicación y concentración [^[41], ^[42]]. Estudios anteriores han demostrado que las tres isoformas pueden participar en la promoción o inhibición de la etiología del cáncer mediante la producción de NO [^[19], ^[43], ^[44]]. Las alteraciones de la metilación pueden ser generalizadas, mientras que los genes afectados tienden a ser específicos del cáncer e involucran múltiples vías de señalización [^[45]]. Se ha descubierto que la alta expresión de NOS2 aumenta la actividad de la ADN metiltransferasa en la metaplasia intestinal (MI) de las lesiones precancerosas, acelerando así la metilación anormal del ADN [^[46]]. Se observó que la alta expresión de NOS3 se asociaba con la metástasis en el cáncer gástrico y el cáncer de hígado [^[47]]. Estudios anteriores han encontrado que el NO puede inhibir la actividad de la ADN metiltransferasa 3B (DNMT3B) mediante la modificación por nitrosilación. Curiosamente, nuestro análisis reveló patrones distintos de metilación y expresión de NOS1 en el CRC. Esta divergencia probablemente refleja sus diferentes funciones y contextos regulatorios. La NOS2 a menudo se sobreexpresa en los microambientes inflamatorios y se ha implicado en la promoción de la progresión tumoral a través del daño del ADN mediado por el NO y la angiogénesis [^[48]]. La NOS3 es un regulador clave de la homeostasis vascular, y su sobreexpresión puede mejorar la metástasis tumoral [^[47]]. En contraste, la NOS1 se expresa predominantemente en los tejidos neuronales y el sistema nervioso entérico (SNE), y su silenciamiento puede estar relacionado con la disfunción del SNE o la pérdida de un eje de señalización de NO supresor de tumores en las células epiteliales colorrectales [^[15], ^[16]]. Este patrón isoforma-específico subraya el papel único de la metilación de NOS1 como un posible biomarcador en el desarrollo y el pronóstico del CRC.

Los resultados de GSEA mostraron que el grupo con alta expresión de NOS1 presentaba una mayor cantidad de vías relacionadas con el cáncer, así como varias otras vías, y la disminución de la expresión de NOS1 se relacionó con una reducción de las vías relacionadas con el cáncer. Un análisis más detallado de GO y las vías KEGG permitió delimitar aún más los procesos biológicos y las vías de señalización específicas asociadas con NOS1 en el CCRC. En particular, se observó que NOS1 participaba en la biosíntesis de óxido nítrico, la respuesta a la hipoxia y la señalización mediada por cGMP. NOS1 también participó en las vías metabólicas del arginina y el nitrógeno que influyen en el equilibrio redox, la regulación vascular y el microambiente inmunitario tumoral. Estas vías están intrincadamente relacionadas con la carcinogénesis colorrectal [^[49],^[50]]. Existe una considerable heterogeneidad molecular entre los tumores colorrectales, lo que da como resultado diferentes vías de tumorigénesis [^[9],^[38]]. El sistema nervioso entérico (SNE) es un componente poco estudiado del microambiente tumoral, y las investigaciones previas han destacado su papel en los cánceres del sistema digestivo [^[51],^[52]]. Sin embargo, su papel en el desarrollo del CCRC sigue siendo poco conocido [^[53]]. Curiosamente, los genes asociados con el SNE, como NDRG4 [^[54]], se encontraron en el conjunto de los mejores biomarcadores específicos del CCRC. NOS1 también está relacionado con el SNE y muestra una correlación positiva con NDRG4 cuando se analiza en una base de datos en línea. Además, se observó una correlación significativa entre los cambios en la metilación relacionados con el sistema nervioso y la formación temprana de adenomas colorrectales [^[55]]. Más allá de establecer la hipermetilación de NOS1 como un biomarcador prometedor para la estimación del riesgo durante la carcinogénesis colorrectal y el pronóstico, nuestros análisis de enriquecimiento funcional ilustran sus posibles funciones en vías relevantes para el cáncer, desde la señalización del NO y la adaptación a la hipoxia hasta la regulación inmunometabólica. En conjunto, inferimos una posible asociación entre el sistema nervioso, los cambios en la metilación y el desarrollo del CCRC.

Una observación potencialmente contraintuitiva en nuestro estudio es que la hipermetilación de NOS1 y la reducción de la expresión se asociaron con una mejor supervivencia en los pacientes con CCRC. Aunque la hipermetilación de NOS1 se produce durante la progresión del CCRC, esta favorable asociación pronóstica puede explicarse desde varias perspectivas biológicas. En primer lugar, el NO derivado de NOS1 exhibe funciones dependientes del contexto en el cáncer. Si bien los bajos niveles de NO pueden favorecer la supervivencia celular, la producción excesiva de NO puede desencadenar estrés oxidativo, daño al ADN e inflamación crónica [^[41],^[42]], todo lo cual promueve la progresión tumoral y la resistencia a la terapia. Por lo tanto, el silenciamiento epigenético de NOS1 puede reducir la generación excesiva de NO y restringir la agresividad tumoral. En segundo lugar, la hipermetilación de NOS1 puede servir como un marcador sustituto de fenotipos tumorales menos malignos, como una mejor diferenciación o una etapa tumoral más temprana, en lugar de determinar directamente el pronóstico. En tercer lugar, la función de NOS1 en el CCRC es distinta de la de otras isoformas de NOS y aún no se ha caracterizado por completo. Nuestros resultados destacan los complejos y específicos del contexto roles de NOS1 en la tumorigénesis colorrectal y respaldan el valor de la metilación de NOS1 como biomarcador pronóstico.

En particular, ningún estudio previo ha investigado la hipermetilación de NOS1 en el desarrollo y el pronóstico del CCRC. No obstante, nuestro estudio tiene algunas limitaciones. En primer lugar, aunque nuestro estudio sugiere que la hipermetilación de NOS1 puede desempeñar un papel importante en la progresión del adenoma a carcinoma, se necesitan más estudios funcionales para dilucidar su mecanismo en la carcinogénesis colorrectal. En segundo lugar, se necesita validación con muestras más grandes, poblaciones de estudio diversas y tipos de muestras biológicas (células, etc.) para verificar la consistencia de los resultados actuales. Por último, las relaciones entre los niveles de metilación de NOS1 y los biomarcadores pronósticos bien conocidos, como el fenotipo de metilación de la isla CpG (CIMP), las mutaciones de BRAF y RAS, no pudieron explorarse en nuestro estudio, ya que estos datos no estaban disponibles para nuestros pacientes internos o la base de datos UCSC Xena. Se requiere una vigilancia clínica más prolongada y un mayor ajuste de otros factores relevantes para proporcionar evidencia del valor clínico de este biomarcador epigenético.

Conclusión

En resumen, basándonos en la elucidación sistemática de la baja expresión y la hipermetilación de NOS1 en múltiples cánceres utilizando bases de datos en línea, se confirmó además su hipermetilación en el cáncer colorrectal y el adenoma avanzado utilizando nuestra base de datos interna, con niveles que aumentan constantemente desde el adenoma avanzado hasta el cáncer. Además, la hipermetilación de NOS1 se asoció significativamente con una mejor supervivencia en los pacientes con cáncer colorrectal. Por lo tanto, puede ser un biomarcador prometedor para la estimación del riesgo durante la carcinogénesis colorrectal y el pronóstico.