La plataforma Visium HD de transcriptómica espacial permite realizar un perfilado a nivel de transcriptoma con una resolución cercana a la de una sola célula.
Sin embargo, la segmentación precisa de las células para definir los límites espaciales depende en gran medida de las imágenes histológicas. Los enfoques anteriores tienen dificultades para definir las células cuando los tejidos tienen una alta densidad celular, están inflamados o mineralizados, lo que provoca una transferencia cruzada de transcritos y una agrupación inexacta. Para abordar este problema, desarrollamos TENGU (Unidad de enriquecimiento y agrupación de señales transcripcionales), un completo paquete de software bioinformático integral. A diferencia de las herramientas existentes, TENGU emplea un enfoque de segmentación basado en los transcritos, priorizando la densidad de la señal transcripcional como la modalidad principal y utilizando las imágenes histológicas solo como un complemento secundario en las regiones no resueltas.
Estos límites iniciales se optimizan aún más mediante un novedoso algoritmo de simulación celular impulsado por la transcriptómica. El refinamiento iterativo de los límites basado en las probabilidades de expresión génica localizadas minimiza eficazmente la dispersión espacial y preserva las firmas moleculares biológicamente distintas. El proceso integra de forma fluida la segmentación de tejidos, la anotación de tipos celulares de alta resolución y el análisis básico de la comunicación célula-célula (CCC) con conciencia espacial. Realizamos pruebas exhaustivas de TENGU en comparación con los procesos de Bin2cell y 10X Genomics para la segmentación celular en diversos microambientes técnicamente desafiantes.
TENGU demostró una mayor distinción transcripcional en el cerebro murino, capturó con éxito los osteocitos incrustados en la matriz y localizó las redes críticas de CCC osteoinmunes (Tgfb e Il1a) en un modelo murino de osteomielitis. TENGU también resolvió los centros de señalización pro-tumorogénicos específicos de la especie (MDK-SDC4) dentro de un xenoinjerto de cáncer colorrectal humano altamente compactado. Al mitigar las limitaciones de la segmentación tradicional dependiente de imágenes, TENGU proporciona un marco computacional altamente adaptable y robusto que permite a los investigadores decodificar con precisión la compleja microanatomía funcional tanto de los tejidos sanos como de los patológicos.
La aparición de la transcriptómica espacial de alta resolución, como la plataforma Visium HD de 10x Genomics, ha redefinido nuestra capacidad para investigar la arquitectura de los tejidos mediante el mapeo de la expresión del transcriptoma completo a una resolución casi unicelular, basada en una cuadrícula contigua de cuadrados de 2 μm ([1],[2]). Aunque esta y otras plataformas han permitido la captura de grandes cantidades de información transcripcional, la correcta asignación de un transcripto dado a una célula específica, lo que requiere la definición de los límites celulares en la muestra de tejido, sigue siendo un desafío. La correcta asignación de transcritos a su célula de origen es esencial para una anotación y un análisis significativos de los tipos de células y la comunicación entre ellas.
Los flujos de trabajo computacionales actuales (por ejemplo, Space Ranger, Bin2cell, ENACT) intentan definir los límites celulares basándose en gran medida en supuestos morfológicos derivados de las imágenes correspondientes de secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina ([3]–[5]). Desafortunadamente, estos enfoques basados en imágenes a menudo no tienen en cuenta la variación biológica de las formas celulares, la calidad inconsistente de las muestras y la difusión lateral de los transcritos durante la permeabilización del tejido. En consecuencia, sufren de la asignación incorrecta de transcritos a células adyacentes y de la identificación incorrecta de los límites celulares, lo que dificulta el análisis posterior ([6],[7]).
En este estudio, presentamos TENGU (Unidad de enriquecimiento y agrupación de señales transcripcionales), un completo paquete de software bioinformático diseñado específicamente para superar estas limitaciones para los datos de Visium HD. TENGU mejora el análisis de la transcriptómica espacial al ofrecer tres capacidades principales. En primer lugar, TENGU utiliza la segmentación basada en la señal transcripcional. En lugar de depender únicamente de la histología, TENGU prioriza la densidad molecular para definir los límites de segmentación primarios, capturando células que pueden pasarse por alto u ocultarse en la imagen estándar. En segundo lugar, TENGU utiliza la simulación celular basada en la transcriptómica. Para eliminar el ruido de los datos y resolver la difusión de los transcritos, TENGU utiliza el marco de simulación celular probabilística, Proseg ([8]). Al refinar iterativamente las formas segmentadas en función de la probabilidad de sus patrones de expresión génica localizados, este paso agrupa dinámicamente los transcritos altamente correlacionados y restaura las firmas moleculares biológicamente distintas. En tercer lugar, TENGU proporciona un flujo de trabajo analítico completo. La segmentación de alta fidelidad se integra a la perfección en un flujo de trabajo posterior completo para mejorar la interpretación biológica. TENGU cuenta con módulos integrados para la incrustación espacial de objetos, la exportación de visualizaciones interactivas, la anotación automatizada de tipos de células de alta resolución y el análisis de la comunicación célula-célula (CCC) con conciencia espacial, lo que proporciona información funcional útil dentro de un paquete único y unificado.
Realizamos pruebas exhaustivas de TENGU en comparación con el flujo de trabajo estándar de 10x Genomics y Bin2cell. Nuestros resultados demuestran la superioridad de TENGU en cuanto a la distinción transcripcional y la resolución espacial en microambientes muy diversos y técnicamente desafiantes, incluido el cerebro murino, el hueso murino descalcificado y un xenoinjerto de cáncer colorrectal humano altamente compacto y de dos especies.
Materiales y métodos
Modelo murino de osteomielitis
Se obtuvieron ratones C57BL/6J de tipo salvaje del Jackson Laboratory. Los ratones se alojaron en jaulas de 2 a 5 animales, utilizando una mezcla de sustrato de mazorca de maíz de 1/4″ y papel de enriquecimiento blanco, ambos producidos por Andersons Incorporated. Se proporcionó agua y una dieta irradiada Purina 5V5R a los ratones ad libitum. El rango de temperatura en la sala era de 68 a 79 °F, con un punto de ajuste de 71 ± 2. La humedad de la sala oscilaba entre el 30% y el 70%. La sala tenía un ciclo de luz de 12:12 horas y la iluminación era de 364 lux medida a 1 metro del suelo. Se anestesiaron los ratones y se expuso quirúrgicamente el fémur derecho, como se describió anteriormente ([9],[10]). Se generó un defecto unicortical utilizando una aguja de calibre 21 y se inoculó el surco con 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de la cepa S. aureus USA300 LAC suspendida en 2 μL de PBS. Se cerraron la fascia muscular y la piel, y se permitió que la infección progresara durante 10 días, momento en el que se sacrificaron los ratones y se recolectó la extremidad quirúrgica. Todos los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas.
Hibridación in situ de ARN
Los fémures se fijaron en formaldehído de Millonig al 10% durante 48 horas a 4 °C y se descalcificaron en EDTA al 14% (pH 7,4) durante 7 días a 4 °C. Las muestras se deshidrataron en etanol al 100%, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 8 μm. La hibridación in situ de ARN se realizó utilizando el ensayo RNAscope® 2.5 HD Assay-Red según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las secciones se desparafinaron e incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar la actividad peroxidasa endógena. A continuación, las secciones se trataron con RNAscope® Custom Pretreatment Reagent (Advanced Cell Diagnostics, EE. UU.) durante 30 minutos para mejorar la permeabilidad del tejido. La hibridación se realizó con la sonda de ratón Tnfsf11 (rojo) y Acp5 (azul) durante 2 horas a 40 °C en un horno HybEZ II (Advanced Cell Diagnostics, EE. UU.). La amplificación de la señal se llevó a cabo secuencialmente utilizando los reactivos AMP1-AMP6 con pasos de lavado entre las incubaciones. El cromógeno Fast Red se preparó mezclando Fast Red-A y Fast Red-B en una proporción de 60:1 y se aplicó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se contrateñeron con hematoxilina al 25%, se decoloraron en agua amoniacal al 0,02%, se secaron a 60 °C durante 5 minutos y se montaron con EcoMount (Biocare Medical, EE. UU.) antes de la imagen en un microscopio Keyence BZ-X810 (Keyence, EE. UU.).
Análisis de transcriptómica espacial de Visium HD
Las secciones de tejido óseo utilizadas para Visium HD se prepararon utilizando el mismo procedimiento de procesamiento de FFPE y corte de secciones descrito anteriormente para RNAscope®. Las secciones de tejido se desparafinaron y se desentretaron según el Manual de preparación de tejidos Visium HD FFPE (CG000684, Rev. D, 10× Genomics, EE. UU.). La hibridación de la sonda, la ligación y la transferencia se realizaron utilizando el flujo de trabajo de expresión génica espacial Visium HD (CG000685, Rev. A, 10× Genomics, EE. UU.). Brevemente, el conjunto de sondas del transcriptoma completo de ratón v2 se hibridó con las secciones de tejido durante 18 horas, seguido de la ligación de la sonda. Los productos de la sonda ligados se liberaron y se transfirieron a una placa Visium HD (área de captura de 6,5 × 6,5 mm) utilizando el instrumento CytAssist (10× Genomics, EE. UU.). A continuación, se realizó la extensión y la amplificación de la sonda para generar bibliotecas de secuenciación. Las bibliotecas finales se indexaron utilizando el conjunto de índices duales TS A (10x Genomics) y se secuenciaron en un Illumina NovaSeq X Plus utilizando lecturas duales e indexadas emparejadas (Lectura 1: 151 ciclos; i7: 10 ciclos; i5: 10 ciclos; Lectura 2: 151 ciclos).
El preprocesamiento de los datos de Visium HD (.fastq) se realizó con Space Ranger v4.0.1. Si bien el flujo de trabajo proporciona resultados a la resolución nativa de 2 μm, así como a 8 μm y 16 μm de agrupación, todos los análisis posteriores utilizaron exclusivamente los datos agrupados de 2 μm.
Segmentación basada en la transcriptómica y simulación celular
Para identificar los límites de segmentación, el marco TENGU utiliza un flujo de trabajo computacional de dos etapas: segmentación primaria y refinamiento probabilístico posterior. El marco integra y amplía Bin2Cell v0.3.4 ([4]) y Proseg v3.1.0 ([8]) para ejecutar una inferencia de segmentación robusta en los datos de Visium HD. TENGU adapta Bin2Cell a un enfoque basado en la señal transcripcional, donde los recuentos transcripcionales espacialmente resueltos (resolución de 2 μm) se convierten en una representación de señal continua. StarDist v0.9.2 ([11]) equipado con el modelo de fluorescencia 2D versátil, se aplicó a esta señal para inferir los límites celulares independientemente de la histología. La optimización se realizó en tres parámetros críticos para maximizar el recuento de genes medio por unidad segmentada: (i) el filtro gaussiano (sigma) para normalizar las señales de entrada; (ii) el umbral de probabilidad (pt) para la detección de candidatos celulares; y (iii) el umbral de supresión no máxima (nms) para regular la superposición de unidades adyacentes. En regiones complejas con alta densidad celular o bajo contraste transcripcional, esta segmentación primaria se complementó con un paso basado en imágenes secundario utilizando el modelo StarDist 2D 10X H&E en la imagen histológica correspondiente. La conciliación de estas modalidades basadas en la señal transcripcional y la imagen produjo un mapa de segmentación base unificado. Finalmente, se implementó Proseg ([8]) para realizar una simulación celular probabilística en la segmentación base. Al modelar la incertidumbre espacial y transcripcional, Proseg ajusta iterativamente la geometría celular y reasigna los transcritos, lo que da como resultado un conjunto final de unidades segmentadas refinadas adecuadas para un análisis posterior avanzado (Figura S1 complementaria para obtener más detalles sobre el flujo de trabajo).
Anotación de tipos de células
El flujo de trabajo de TENGU incluye un módulo dedicado y flexible para la anotación automatizada de tipos de células. Si bien la arquitectura admite fácilmente métodos de predicción alternativos, para este estudio utilizamos CellTypist v1.7.1 ([12]), un clasificador de aprendizaje automático supervisado. Antes de la clasificación, las matrices de expresión génica de Visium HD se normalizaron logarítmicamente y se formatearon para cumplir con los requisitos de CellTypist. Se generaron predicciones utilizando dos categorías de modelos de referencia. En primer lugar, utilizamos modelos CellTypist preentrenados disponibles públicamente derivados de conjuntos de datos de cerebro de ratón adulto ([13]) y cáncer colorrectal humano ([14]). En segundo lugar, implementamos un modelo CellTypist personalizado entrenado en nuestro conjunto de datos de hueso murino publicado anteriormente ([15]), que fue diseñado específicamente para capturar principalmente la heterogeneidad transcripcional dentro de los linajes mesenquimales y con heterogeneidad transcripcional adicional de las células hematopoyéticas. Para todos los análisis, CellTypist se ejecutó en modo de predicción estándar, lo que generó asignaciones discretas de tipos de células y sus puntuaciones de confianza asociadas para cada unidad segmentada.
Para garantizar una amplia interoperabilidad, todos los objetos segmentados finales y la anotación de tipos de células se pueden exportar al formato .zarr de estándar abierto para su uso por herramientas analíticas de terceros. Utilizamos el paquete de Python SpatialData ([16]) versión 0.6 y el software de la suite R versión 4.5 para el análisis de datos y la visualización. Además, los datos se pueden exportar en el formato .loupe, lo que permite una visualización espacial interactiva de los resultados a través de Loupe Browser v9.0.0.
Análisis de la interacción ligando-receptor
Para evaluar cuantitativamente la comunicación célula-célula espacialmente restringida, derivamos una puntuación de interacción ligando-receptor ponderada por distancia para todos los pares de células remitentes y receptoras potenciales. Después de la aplicación de un umbral de expresión de referencia (recuentos positivos), se identificaron las células que expresan ligandos (remitentes) y las células que expresan receptores (receptoras). La proximidad espacial entre una célula que expresa ligando y una célula que expresa receptor se determinó calculando la distancia euclidiana entre los centroides de sus polígonos de segmentación. La puntuación final de interacción célula-célula (CCS) incorpora la expresión del ligando, la expresión del receptor y una penalización de decaimiento espacial exponencial, definida matemáticamente como:
Donde representa el nivel de expresión del ligando en la célula remitente, representa el nivel de expresión del receptor en la célula receptora, es la distancia euclidiana entre los centroides y es la distancia media célula a célula global. Este término de decaimiento exponencial garantiza que las interacciones distales se penalicen en gran medida, lo que modela con precisión la probabilidad reducida de difusión funcional del ligando en el microambiente del tejido.
Cuantificación de la distinción transcripcional
Para evaluar cuantitativamente la singularidad transcriptómica de las poblaciones celulares segmentadas y evaluar la robustez de nuestro agrupamiento, calculamos la puntuación de Silueta en un rango de umbrales de dimensionalidad. Para evitar las distorsiones de distancia no lineales introducidas por las proyecciones 2D, como UMAP, esta métrica se calculó directamente dentro del espacio de análisis de componentes principales (PCA) de alta dimensión. Para garantizar la eficiencia computacional y eliminar el sesgo de muestreo en las diferentes evaluaciones, se seleccionó una submuestra aleatoria consistente de 10.000 células utilizando una semilla aleatoria fija. La puntuación de Silueta se calculó posteriormente en este conjunto celular exacto en un número variable de componentes principales superiores (que oscilan entre 2 y 50) utilizando la biblioteca scikit-learn en Python. La dimensionalidad óptima para evaluar la mezcla transcriptómica se determinó identificando la puntuación de Silueta más alta, que representa el óptimo matemático entre la captura de la verdadera varianza biológica y la minimización del ruido técnico.
Cuantificación de la dispersión espacial
Para evaluar cuantitativamente el grado de dispersión espacial y la mezcla transcriptómica entre las unidades segmentadas, calculamos una puntuación de pureza de vecindad para cada método de segmentación. Para cada célula individual, identificamos sus diferentes k (5–1.000) vecinos físicos más cercanos en el espacio de coordenadas de tejido 2D utilizando un algoritmo de k vecinos más cercanos implementado a través de la biblioteca Python scikit-learn. La pureza local para cada célula se definió como la fracción de sus k vecinos que compartían exactamente la misma etiqueta de tipo celular. Estos valores locales se promediaron luego en todas las células del conjunto de datos para generar una puntuación global de pureza de vecindad. Una puntuación global más cercana a 1 indica que las células están rodeadas principalmente por su propio tipo (formando dominios biológicamente cohesivos y contiguos), mientras que las puntuaciones más bajas indican una alta dispersión espacial y mezcla transcriptómica.
Modelo murino de osteomielitis
Se obtuvieron ratones C57BL/6J de tipo salvaje del Jackson Laboratory. Los ratones se alojaron en jaulas de 2 a 5 animales utilizando una mezcla de sustrato de cáscara de maíz de 1/4″ y papel de enriquecimiento blanco, ambos producidos por Andersons Incorporated. Se proporcionó agua ad libitum y una dieta Purina irradiada 5V5R. El rango de temperatura en la habitación fue de 68 a 79 °F con un punto de ajuste de 71 ± 2. La humedad de la habitación osciló entre el 30% y el 70%. La habitación tenía un ciclo de luz de 12:12 horas y la iluminación fue de 364 lux medida a 1 metro del suelo. Se anestesiaron los ratones y se expuso quirúrgicamente el fémur derecho, como se describió previamente ([9],[10]). Se generó un defecto unicortical utilizando una aguja de calibre 21 y el surco se inoculó con 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de la cepa S. aureus USA300 LAC suspendida en 2 μL de PBS. Se cerraron la fascia muscular y la piel, y se permitió que la infección continuara durante 10 días, momento en el que se sacrificaron los ratones y se recolectó la extremidad quirúrgica. Todos los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas.
Hibridación in situ de ARN
Los fémures se fijaron en formaldehído de Millonig al 10% durante 48 h a 4 °C y se descalcificaron en EDTA al 14% (pH 7,4) durante 7 días a 4 °C. Las muestras se deshidrataron en etanol al 100%, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 8 μm. La hibridación in situ de ARN se realizó utilizando el ensayo RNAscope® 2.5 HD Assay-Red según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las secciones se desparafinaron e incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos a temperatura ambiente para desactivar la actividad de la peroxidasa endógena. Luego, las secciones se trataron con RNAscope® Custom Pretreatment Reagent (Advanced Cell Diagnostics, EE. UU.) durante 30 minutos para mejorar la permeabilidad del tejido. La hibridación se realizó con la sonda de ratón Tnfsf11 (rojo) y Acp5 (azul) durante 2 h a 40 °C en un horno HybEZ II (Advanced Cell Diagnostics, EE. UU.). La amplificación de la señal se llevó a cabo secuencialmente utilizando los reactivos AMP1-AMP6 con pasos de tampón de lavado entre las incubaciones. El cromógeno Fast Red se preparó mezclando Fast Red-A y Fast Red-B en una proporción de 60:1 y se aplicó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se contrateñeron con hematoxilina al 25%, se tiñeron en agua de amoníaco al 0,02%, se secaron a 60 °C durante 5 minutos y se montaron con EcoMount (Biocare Medical, EE. UU.) antes de la obtención de imágenes en un microscopio Keyence BZ-X810 (Keyence, EE. UU.).
Análisis transcriptómico espacial Visium HD
Las secciones de tejido óseo utilizadas para Visium HD se prepararon utilizando el mismo procedimiento de procesamiento de FFPE y corte de secciones descrito anteriormente para RNAscope®. Las secciones de tejido se desparafinaron y se desentrelazaron según el Manual de preparación de tejidos Visium HD FFPE (CG000684, Rev. D, 10× Genomics, EE. UU.). La hibridación, la ligación y la transferencia de la sonda se realizaron utilizando el flujo de trabajo de expresión génica espacial Visium HD (CG000685, Rev. A, 10× Genomics, EE. UU.). Brevemente, el conjunto de sondas de todo el transcriptoma de ratón v2 se hibridó con las secciones de tejido durante 18 h, seguido de la ligación de la sonda. Los productos de la sonda ligados se liberaron y se transfirieron a una placa Visium HD (área de captura de 6,5 × 6,5 mm) utilizando el instrumento CytAssist (10× Genomics, EE. UU.). La extensión y la amplificación de la sonda se realizaron posteriormente para generar bibliotecas de secuenciación. Las bibliotecas finales se indexaron utilizando el conjunto de índices duales TS A (10x Genomics) y se secuenciaron en un Illumina NovaSeq X Plus utilizando lecturas duales e indexadas emparejadas (Lectura 1: 151 ciclos; i7: 10 ciclos; i5: 10 ciclos; Lectura 2: 151 ciclos).
El preprocesamiento de los datos de Visium HD (.fastq) se realizó con Space Ranger v4.0.1. Si bien la canalización proporciona resultados en la resolución nativa de 2 μm, así como en el agrupamiento de 8 μm y 16 μm, todos los análisis posteriores utilizaron exclusivamente los datos agrupados de 2 μm.
Segmentación basada en la transcriptómica y simulación celular
Para identificar los límites segmentados, el marco TENGU utiliza una canalización computacional de dos etapas: segmentación primaria y refinamiento probabilístico posterior. El marco integra y amplía Bin2Cell v0.3.4 ([4]) y Proseg v3.1.0 ([8]) para ejecutar una inferencia de segmentación robusta en los datos de Visium HD. TENGU adapta Bin2Cell en un enfoque de "señal transcripcional primero", donde los recuentos transcripcionales resueltos espacialmente (resolución de 2 μm) se convirtieron en una representación de señal continua. StarDist v0.9.2 ([11]) equipado con el modelo de fluorescencia versátil 2D, se aplicó a esta señal para inferir los límites de las células independientemente de la histología. La optimización se realizó en tres parámetros críticos para maximizar el recuento medio de genes por unidad segmentada: (i) el filtro gaussiano (sigma) para normalizar las señales de entrada; (ii) el umbral de probabilidad (pt) para la detección de candidatos a células; y (iii) el umbral de supresión no máxima (nms) para regular la superposición de unidades adyacentes. En regiones complejas con alta densidad celular o bajo contraste transcripcional, esta segmentación primaria se complementó mediante un paso basado en imágenes secundario utilizando el modelo StarDist 2D 10X H&E en la imagen histológica correspondiente. La conciliación de estas modalidades basadas en la señal transcripcional y la imagen produjo un mapa de segmentación base unificado. Finalmente, se implementó Proseg ([8]) para realizar una simulación celular probabilística en la segmentación base. Al modelar la incertidumbre espacial y transcripcional, Proseg ajusta iterativamente la geometría de las células y reasigna los transcritos, lo que da como resultado un conjunto final de unidades segmentadas refinadas adecuadas para análisis posteriores avanzados (Figura S1 complementaria para obtener más detalles sobre el flujo de trabajo).
Anotación del tipo celular
La canalización TENGU incluye un módulo dedicado y flexible para la anotación automatizada del tipo celular. Si bien la arquitectura admite fácilmente métodos de predicción alternativos, para este estudio utilizamos CellTypist v1.7.1 ([12]), un clasificador de aprendizaje automático supervisado. Antes de la clasificación, las matrices de expresión génica de Visium HD se normalizaron logarítmicamente y se formatearon para cumplir con los requisitos de CellTypist. Las predicciones se generaron utilizando dos categorías de modelos de referencia. Primero, utilizamos modelos CellTypist preentrenados disponibles públicamente derivados de conjuntos de datos de todo el cerebro de ratón adulto ([13]) y cáncer colorrectal humano ([14]). En segundo lugar, implementamos un modelo CellTypist personalizado entrenado en nuestro conjunto de datos de hueso murino publicado anteriormente ([15]), que fue diseñado específicamente para capturar principalmente la heterogeneidad transcripcional dentro de las líneas celulares mesenquimales y con heterogeneidad transcripcional adicional de las células hematopoyéticas. Para todos los análisis, CellTypist se ejecutó en modo de predicción estándar, lo que generó asignaciones discretas de tipo celular y sus puntuaciones de confianza asociadas para cada unidad segmentada.
Para garantizar una amplia interoperabilidad, todos los objetos segmentados finales y la anotación del tipo celular se pueden exportar al formato .zarr de estándar abierto para su uso por herramientas analíticas de terceros. Utilizamos el paquete de Python SpatialData ([16]) versión 0.6 y el software de la suite R versión 4.5 para el análisis y la visualización de datos. Además, los datos se pueden exportar en el formato .loupe, lo que permite una visualización espacial interactiva de los resultados a través de Loupe Browser v9.0.0.
Análisis de la interacción ligando-receptor
Para evaluar cuantitativamente la comunicación célula-célula espacialmente restringida, derivamos una puntuación de interacción ligando-receptor ponderada por distancia para todos los pares de células remitentes y receptoras potenciales. Después de la aplicación de un umbral de expresión de referencia (recuentos positivos), se identificaron las células que expresan ligandos (remitentes) y las células que expresan receptores (receptoras). La proximidad espacial entre una célula que expresa ligando y una célula que expresa receptor se determinó calculando la distancia euclidiana entre los centroides de sus polígonos de segmentación. La puntuación final de interacción célula-célula (CCS) incorpora la expresión del ligando, la expresión del receptor y una penalización de decaimiento espacial exponencial, definida matemáticamente como:
Donde, representa el nivel de expresión del ligando en la célula remitente, representa el nivel de expresión del receptor en la célula receptora, es la distancia euclidiana entre los centroides y es la distancia media célula a célula global. Este término de decaimiento exponencial garantiza que las interacciones distales se penalicen en gran medida, lo que modela con precisión la probabilidad reducida de difusión funcional del ligando en el microambiente tisular.
Cuantificación de la singularidad transcriptómica
Para evaluar cuantitativamente la singularidad transcriptómica de las poblaciones celulares segmentadas y evaluar la robustez de nuestro agrupamiento, calculamos la puntuación de Silueta en un rango de umbrales de dimensionalidad. Para evitar las distorsiones de distancia no lineales introducidas por las proyecciones 2D, como UMAP, esta métrica se calculó directamente dentro del espacio de análisis de componentes principales (PCA) de alta dimensión. Para garantizar la eficiencia computacional y eliminar el sesgo de muestreo en las diferentes evaluaciones, se seleccionó una submuestra aleatoria consistente de 10.000 células utilizando una semilla aleatoria fija. La puntuación de Silueta se calculó posteriormente en este conjunto celular exacto en un número variable de componentes principales superiores (que oscilan entre 2 y 50) utilizando la biblioteca scikit-learn en Python. La dimensionalidad óptima para evaluar la mezcla transcriptómica se determinó identificando la puntuación de Silueta más alta, que representa el óptimo matemático entre la captura de la verdadera varianza biológica y la minimización del ruido técnico.
Cuantificación de la dispersión espacial
Para evaluar cuantitativamente el grado de dispersión espacial y la mezcla transcriptómica entre las unidades segmentadas, calculamos una puntuación de Pureza de Vecindad para cada método de segmentación. Para cada célula individual, identificamos sus k vecinos físicos más cercanos (de 5 a 1000) en el espacio de coordenadas tisulares 2D, utilizando un algoritmo de k vecinos más cercanos implementado a través de la biblioteca Python scikit-learn. La pureza local para cada célula se definió como la fracción de sus k vecinos que compartían exactamente la misma etiqueta de tipo celular. Estos valores locales se promediaron luego en todas las células del conjunto de datos para generar una puntuación global de Pureza de Vecindad. Una puntuación global más cercana a 1 indica que las células están principalmente rodeadas por su propio tipo (formando dominios biológicamente cohesivos y contiguos), mientras que las puntuaciones más bajas indican una alta dispersión espacial y mezcla transcriptómica.
Resultados
Paquete de software bioinformático completo para el análisis de datos de Visium HD
El flujo de trabajo computacional de TENGU, resumido en la Figura 1A, consta de tres procedimientos principales. 1) Segmentación: TENGU adapta la canalización Bin2Cell ([4]), utilizando tanto modalidades basadas en transcritos como en imágenes. Para el enfoque primario, basado en transcritos, TENGU aplica el modelo de fluorescencia versátil StarDist 2D ([11]). Optimizamos tres parámetros clave para maximizar el número medio de genes por unidad segmentada (una métrica común para evaluar los datos de transcriptómica espacial): (i) normalización de la señal de entrada (variando el filtrado gaussiano (sigma) para la reducción del ruido de la señal basada en imágenes a la señal del transcripto), (ii) el umbral de probabilidad ((pt) para modular la detección de células a partir de la señal) y (iii) el umbral de supresión no máxima ((nms) para controlar el grado de superposición entre las unidades segmentadas). Los resultados de la optimización de parámetros para muestras de ratón representativas, utilizando química basada en sondas (hueso y cerebro) o química basada en la captura de poli(A) 3’ (cerebro y xenoinjerto), se ilustran en la Figura 1B. El mismo conjunto de parámetros de sigma = 50, pt = 0,01 y nms = 0,01, produjo el mayor número de genes por unidad segmentada. En áreas celulares densas donde los límites de señal no resueltos dificultan este enfoque primario, la segmentación se complementa con un paso secundario basado en imágenes, utilizando el modelo StarDist 2D 10X H&E ([3]). Posteriormente, los bins cuadrados de 2 μm que se encuentran dentro de los límites de segmentación se agregan para construir el perfil transcripcional de cada unidad segmentada. 2) Refinamiento: La salida de segmentación inicial se introduce en una simulación probabilística de células utilizando Proseg ([8]), que refina tanto los límites espaciales como los perfiles transcripcionales de las unidades segmentadas. 3) Procesamiento y exportación posteriores: Las unidades refinadas se exportan en formato .loupe para la visualización interactiva a través del Navegador 10X Loupe, así como en el formato de estándar abierto .zarr para matrices multidimensionales grandes. Además, TENGU cuenta con un módulo computacional para ayudar en la anotación de células utilizando modelos scRNA-seq seleccionados por el usuario, como CellTypist ([12]). Cualquier predicción de tipo celular resultante se integra perfectamente en los objetos exportados. Finalmente, TENGU incluye un módulo para calcular la comunicación célula-célula (CCC) espacialmente restringida utilizando datos de interacción ligando-receptor de una base de datos especificada por el usuario ([17]).
Análisis comparativo de los enfoques de segmentación y simulación de células
A continuación, realizamos un análisis comparativo de los resultados de la segmentación en un conjunto de datos de tejido cerebral de Visium HD (basado en sondas) derivado de TENGU, Bin2cell y 10X (consulte la figura suplementaria S1 para obtener un resumen del flujo de trabajo de Bin2cell y 10x). Los métodos Bin2cell y 10x se basan en los modelos versátiles 2D de la imagen H&E y la fluorescencia proporcionados como modelo estándar del paquete de software StarDist. Bin2cell utiliza los resultados de la segmentación de las imágenes H&E como principal y complementa con los resultados de la segmentación de la señal del transcripto como secundario. 10X desarrolló un modelo H&E StarDist v6 personalizado internamente, derivado de más de 17.500 parches de imágenes H&E obtenidos de >150 imágenes de secciones H&E de una variedad de tejidos y métodos de preservación, y utilizó el modelo para la segmentación. Posteriormente, los bins de 2 μm que se encuentran dentro de los límites de segmentación derivados de los dos métodos se agregaron para construir el perfil transcripcional de cada unidad segmentada.
Bin2cell produjo el mayor número de unidades segmentadas, identificando más de 60.000, en comparación con TENGU y el enfoque 10x, que ambos produjeron aproximadamente 40.000 unidades (Figura 1C). Cabe destacar que el 91% de las unidades segmentadas de TENGU contaban con el respaldo directo de las señales de transcripto subyacentes, en contraste con solo el 12% para Bin2cell. Después de la simulación de células, observamos una ligera reducción en el número total de unidades segmentadas para los métodos 10x (1.083 unidades) y Bin2cell (1.683 unidades), mientras que TENGU no se vio afectado (Figura 1D). Esta reducción en 10x y Bin2cell se debió principalmente a la eliminación de artefactos de segmentación de falsos positivos (Figura suplementaria S2). Debido a que el algoritmo de simulación expande los límites de las unidades segmentadas mediante la agregación de señales cercanas y transcripcionalmente similares (Figura 1F), hubo un aumento global en el número medio de genes por unidad segmentada en comparación con las segmentaciones originales (Figura 1D).
A continuación, comparamos los volúmenes de células simuladas, derivados de la simulación de células, con el número de bins de 2 μm constituyentes asignados a cada unidad segmentada en los tres métodos (Figura 1E). En esta gráfica log-log, una estricta correlación lineal en el límite inferior representa el volumen mínimo teórico, donde el límite simulado está estrictamente restringido al área espacial física de los bins espaciales asignados. Si bien esta línea de base establece el mínimo teórico, aún observamos cierta inflación del volumen total en los tres métodos. Esta inflación se produce cuando los límites simulados se expanden hacia los espacios intercelulares vacíos (áreas celulares dispersas) y los bordes de los tejidos, lo que puede conducir a una sobreestimación del tamaño de las células para un subconjunto de unidades segmentadas. Luego, comparamos los resultados de la segmentación y la simulación de células derivados de los tres enfoques. Centrándonos en las regiones altamente celulares del hipocampo (Figura 1F) que contienen estructuras anatómicas densamente empaquetadas y de organización laxa. La señal basal del transcripto de los bins de 2 μm se visualizó como un mapa de calor de densidad de fondo para servir como una verdad fundamental para la ubicación molecular. Para cada enfoque analítico, los límites de segmentación de células iniciales (azul) y los límites de células simuladas resultantes (rojo) se superpusieron a la señal del transcripto. La evaluación visual de las capas de células, como el giro dentado, revela distintas diferencias en la resolución espacial entre las herramientas. Si bien el enfoque 10x captura la organización celular general, los límites de las células simuladas (rojo) a veces se desvían de las regiones de transcripto más densas. Por el contrario, el enfoque Bin2cell genera límites simulados que parecen demasiado densos y generalizados, lo que dificulta el mantenimiento de los espacios intercelulares distintos y potencialmente sobreestima el volumen de las células. En contraste, TENGU demuestra una alta fidelidad morfológica. Los límites de las células simuladas (rojo) generados por TENGU mantienen una estricta concordancia tanto con los límites de las células principales (azul) como con la densidad del transcripto subyacente. Además, al evitar la fusión artificial de células vecinas en estructuras anatómicas densamente empaquetadas que no se pueden discriminar solo por las señales del transcripto, TENGU agrupa las células que comparten perfiles transcripcionales similares en una unidad segmentada y luego reduce el ruido mediante la simulación de células.
La simulación de células mejora las firmas transcripcómicas y la concordancia espacial
Para evaluar la precisión biológica de los perfiles transcripcómicos generados por cada enfoque de segmentación, realizamos una anotación automatizada de tipos de células utilizando el modelo CellTypist y los datos de scRNA-seq del cerebro de ratón ([18]), así como una referencia integral de scRNA-seq del cerebro ([19]). Evaluamos específicamente el impacto de nuestro algoritmo de simulación de células comparando las segmentaciones base con sus contrapartes simuladas (denotadas con una notación prima). Un análisis de las puntuaciones de confianza de la predicción del tipo de célula para 20 tipos de células seleccionados (11 que exhiben una puntuación mediana > 0,5 en al menos un método, y 9 elegidos en función de sus distintas estructuras topológicas dentro de la referencia MERFISH ([19])) reveló que la aplicación del paso de simulación de células mejoró constantemente la confianza de la predicción en todos los métodos (Figura 2A). En particular, TENGU con simulación de células (TENGU’) logró las puntuaciones de confianza mediana generales más altas en un amplio espectro de tipos de células identificados, superando notablemente su línea de base de pre-simulación (TENGU) y las salidas simuladas de los métodos alternativos (10X’ y Bin2cell’).
Para validar la precisión espacial de los perfiles simulados, comparamos los tipos de células mapeados con un conjunto de datos de transcriptómica espacial MERFISH coincidentes ([19]), que sirvió como una verdad fundamental de alta resolución a nivel de célula única (Figura 2B). El mapeo de los tipos de células predichos a sus coordenadas espaciales (Figura 2C) reveló que los tres métodos generalmente exhibieron una buena concordancia espacial con la arquitectura anatómica establecida delineada por la referencia MERFISH, incluso en los casos en que sus puntuaciones de confianza de la predicción del tipo de célula fueron bajas. Una inspección más detallada de regiones anatómicas específicas de las capas corticales (Figura 2D), observamos que, a pesar de producir puntuaciones generales de predicción de tipo de célula relativamente bajas, las distribuciones espaciales de estas poblaciones siguieron siendo altamente concordantes con la verdad fundamental de MERFISH. Además, el análisis de la formación del hipocampo destacó la mayor resolución espacial proporcionada de forma única por TENGU’ (Figura 2E). TENGU’ localizó con precisión subtipos neuronales especializados, como las neuronas glutamatérgicas CA3 y del giro dentado (DG) (clusters 017 y 037, respectivamente) con límites espaciales distintos que se asemejaban estrechamente a los datos de MERFISH. Además, los mapas de calor de confianza espacial confirmaron visualmente que, si bien se capturó la topología general en todos los métodos, las asignaciones de tipo de célula de TENGU’ dentro de las regiones anatómicas densamente empaquetadas poseían puntuaciones de predicción marcadamente más altas en comparación con las asignaciones dispersas y de baja confianza producidas por 10X’ y Bin2cell’.
Para complementar las anotaciones automatizadas y evaluar la capacidad de agrupamiento de cada método, realizamos un agrupamiento no supervisado estándar utilizando parámetros de cálculo idénticos y visualizamos el panorama transcriptómico general mediante incrustaciones UMAP (Figura 2F). Bajo una resolución de agrupamiento fija, observamos diferencias claras en el número de poblaciones distintas recuperadas con éxito por cada canalización. Específicamente, TENGU’ delimitó 17 grupos transcriptómicos distintos en las incrustaciones UMAP, mientras que los perfiles transcriptómicos más ruidosos de 10x’ y Bin2cell’ dieron como resultado la fusión artificial de estados estrechamente relacionados, lo que produjo solo 16 y 12 grupos, respectivamente. Para evaluar cuantitativamente esta distinción transcriptómica, calculamos la puntuación de Silhouette dentro del espacio de componentes principales (PC) de alta dimensión, basándonos en los resultados del agrupamiento (Figura 2H, izquierda). TENGU’ y 10x’ obtuvieron las puntuaciones de Silhouette generales más altas, alcanzando un máximo óptimo alrededor de 20 componentes principales y llegando a valores (aproximadamente 0,17) comparables a los informados previamente para datos complejos de secuenciación de ARN unicelular ([20], [21]), superando notablemente a Bin2cell’. En conjunto, este aumento en la recuperación de grupos y la separación de alta dimensión indican que TENGU’ y 10X’ preservan mejor las firmas moleculares distintas necesarias para un agrupamiento robusto en etapas posteriores en comparación con Bin2cell’. Al proyectar estos grupos no supervisados de nuevo en el espacio tisular, TENGU’ produjo dominios espaciales contiguos y biológicamente plausibles que reflejaban la anatomía conocida del cerebro del ratón ([13], [19], [22], [23]) (Figura 2G). En contraste, los grupos espaciales generados por 10X’ y Bin2cell’ exhibieron una mezcla transcriptómica y una dispersión espacial notables. Para cuantificar esta observación, calculamos la puntuación de pureza de vecindad en un rango de vecinos espaciales (k) (Figura 2H, derecha). TENGU’ superó consistentemente tanto a Bin2cell’ como a 10X’, manteniendo una puntuación de pureza significativamente mayor (comenzando por encima de 0,60 en k=5). Si bien todos los métodos mostraron una disminución en la pureza a medida que el tamaño del vecindario aumentaba hacia k=1000, TENGU’ mantuvo una relación señal-ruido superior en toda la escala. En conjunto, estos resultados indican que TENGU’ agrega eficazmente las señales locales relevantes al tiempo que minimiza el sangrado transcriptómico entre las células vecinas, preservando las firmas moleculares distintas necesarias para un agrupamiento robusto y una identificación de tipos celulares altamente confiable.
Para evaluar aún más el rendimiento en diferentes químicas de ensayo, examinamos los resultados del agrupamiento y el mapeo espacial derivados de la química 3’ poly-A del tejido cerebral del ratón (Figuras 2J y 2I). En comparación con los perfiles espaciales y transcriptómicos iniciales (Figura 2B), esta muestra produjo puntuaciones cuantitativas generales notablemente más bajas (comparar con la Figura 2A). Sin embargo, a pesar de estas métricas reducidas, la topología celular resultante siguió siendo biológicamente aceptable y mantuvo una organización tisular contigua. Si bien esta estructura espacial era funcional, no logró la claridad topológica robusta y la definición espacial de alta resolución demostrada en la Figura 2C. En esencia, incluso dentro de las limitaciones de este conjunto de datos, TENGU’ continuó produciendo los mejores resultados, superando con éxito a los otros métodos.
Análisis transcriptómico espacial del microambiente óseo
Para evaluar el rendimiento de TENGU’ en tejidos con altas barreras técnicas, aplicamos nuestra canalización al hueso de ratón descalcificado, un tejido notoriamente difícil para la transcriptómica espacial debido a su densa matriz extracelular mineralizada y su baja celularidad. La muestra utilizada para este estudio fue un fémur de un modelo murino de osteomielitis por Staphylococcus aureus, que incluye hueso cortical, médula ósea y un absceso que involucra la médula, el hueso cortical y se extiende fuera del hueso (Figura 3A) ([24]). TENGU’ segmentó con éxito los datos transcriptómicos, manteniendo un número robusto de unidades segmentadas y aumentando sustancialmente el número medio de genes detectados por unidad en comparación con la canalización 10X’ (Figura 3B). Los resultados de la segmentación y la simulación de células se exportaron como un archivo .loupe y se visualizaron en el software Loupe Browser. Esta mayor recuperación transcriptómica se tradujo directamente en una resolución de agrupamiento superior utilizando parámetros de cálculo idénticos, y el mapeo de los grupos no supervisados de nuevo en las coordenadas espaciales reveló que TENGU’ delimitó 25 poblaciones celulares distintas, mientras que la canalización 10X’ más ruidosa resolvió solo 21 (Figura 3A).
Validación in situ y detección de osteocitos incrustados en la matriz
La muestra de osteomielitis ósea contiene inflamación localizada intensa y reabsorción ósea inducida por la infección ([24]). Comparamos los perfiles de expresión derivados computacionalmente con la hibridación in situ de RNAscope de una sección adyacente (Figura 3C). TENGU’ proporcionó un mapeo de expresión localizado y altamente preciso de los marcadores clave que impulsan esta patología. Por ejemplo, la expresión espacial normalizada de Tnfsf11 (RANKL), una citocina crítica que se sobreexpresa durante la osteomielitis para estimular la osteoclastogénesis, fue mejor capturada por TENGU’. Nuestra canalización delimitó límites biológicos más nítidos y una señal de expresión más fuerte dentro de las lesiones de remodelación activa que la señal producida por 10X’ (Figura 3D). Además, tanto TENGU’ como 10X’ mapearon con precisión la expresión de Acp5, un marcador de osteoclastos, destacando las poblaciones de osteoclastos activos que reabsorben el hueso y reflejando estrechamente la verdad fundamental de RNAscope (Figura 3E).
A continuación, para anotar los tipos de células de las unidades segmentadas para un análisis de mayor resolución, construimos un modelo CellTypist de células residentes del hueso derivadas de un conjunto de datos seleccionado de nuestro estudio anterior ([15]). Es importante destacar que la vista ampliada del hueso cortical destaca una importante ventaja técnica de TENGU’, a saber, la detección exitosa de osteocitos incrustados profundamente dentro del tejido mineralizado (Figura 3F). Capturar firmas transcriptómicas de osteocitos maduros es un desafío reconocido en la biología espacial debido a la mala penetración de la sonda y el bajo rendimiento de ARN ([25]). TENGU’ supera con éxito esta barrera, produciendo señales transcriptómicas en regiones donde el método 10x’, que se basa únicamente en imágenes de H&E para la segmentación, sufre un abandono grave.
Formación ósea reactiva e interacciones osteoinmunes
A continuación, nos centramos en el efecto de la infección en el periostio del hueso, también conocido como formación ósea reactiva o reacción periostial ([26]). Se sabe poco sobre los mecanismos que impulsan la formación de esta estructura, que se produce en la superficie periostial en los bordes del absceso. TENGU’ y 10X’ preservaron y mapearon con éxito la compleja arquitectura de esta estructura, resolviendo de forma distinta las capas de condrocitos, Osteo-CAR, preosteoblastos, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos, todo ello rodeado de células Osteo-X (Figura 3G). Además, centrándonos en el área en la que el nivel de destrucción ósea es mayor, TENGU’ pudo mapear la cavidad medular altamente heterogénea (Figura 3H). Aquí, TENGU’ delimitó claramente la colocalización espacial de osteoclastos que reabsorben el hueso junto con una rica diversidad de poblaciones hematopoyéticas e inmunes, incluidas monocitos/macrófagos, neutrófilos, células B y progenitores linfoides (LMPP/HSPC).
Análisis espacial de la comunicación célula-célula en el microambiente óseo
Habiendo establecido que TENGU’ proporciona una distinción transcriptómica superior y una resolución espacial dentro del complejo microambiente óseo mineralizado (Figura 3), buscamos a continuación aprovechar esta segmentación de alta fidelidad para mapear las redes de comunicación célula-célula (CCC) con conocimiento espacial. Para este análisis, utilizamos una base de datos de ligandos y receptores seleccionada de un estudio anterior ([27]), que comprende 11.395 interacciones potenciales. Primero, calculamos las puntuaciones de interacción ligando-receptor integrales en todas las unidades segmentadas, teniendo en cuenta tanto los niveles de expresión como la proximidad espacial en función de la formulación empírica.
Para anclar nuestras métricas de proximidad, primero determinamos la distancia del vecino más cercano en todas las células segmentadas dentro del espacio tisular (Figura 4A). Esto estableció la arquitectura física de base de la red celular, revelando una distancia media entre células de 46 μm. Dado que la señalización parácrina se basa en los gradientes de difusión biológica, calculamos iterativamente las puntuaciones de CCC en radios de vecindad en expansión (que van desde la línea de base de 46 μm hasta 1474 μm) para evaluar cómo las limitaciones espaciales afectan la detección de pares de ligandos y receptores funcionales (Figura 4B). Como se esperaba, observamos un aumento robusto tanto en la frecuencia como en la diversidad de las interacciones detectadas a medida que el radio se expandía. Sin embargo, esta diversidad se estabilizó en aproximadamente 8400 interacciones, y extender el radio más allá de ~737 μm no produjo una ganancia significativa en los nuevos tipos de ligandos y receptores. Esto sugiere que un umbral de 737 μm captura eficazmente la distancia de señalización biológica funcional máxima dentro de este contexto tisular específico.
Distinguir los modos de señalización espacial en función del radio funcional
Para caracterizar aún más la naturaleza biofísica de las redes de comunicación identificadas, evaluamos la relación entre la fuerza de la interacción (puntuación de CCC) y el radio espacial funcional máximo requerido para lograr esa interacción para cada par de ligandos y receptores específico (Figura 4C). Al categorizar estas interacciones por sus mecanismos de señalización establecidos en función de la base de datos ([27]), nuestro marco espacial diferenció con éxito entre las interacciones dependientes del contacto localizadas y las redes basadas en la difusión más amplias. Como se esperaba, las vías conocidas clasificadas como que utilizan el contacto directo entre células generalmente operaban dentro de limitaciones espaciales más estrictas, lo que se correlacionaba con radios funcionales máximos más cortos. Por el contrario, las vías de señalización secretadas demostraron un rango significativamente más amplio de distancias de comunicación efectivas en toda la arquitectura tisular. En particular, al rastrear simultáneamente la puntuación de interacción y el alcance espacial, TENGU’ proporciona una metodología basada en datos para inferir los límites biofísicos de los pares de ligandos y receptores no caracterizados o “desconocidos”.
Mapeo de centros de señalización osteogénica e inflamatoria
Para demostrar la utilidad biológica de nuestro marco básico de CCC con conocimiento espacial, visualizamos las interacciones de ligandos y receptores específicas dentro de nichos patológicos y de remodelación distintos. Primero, nos centramos en el área de formación ósea reactiva de la muestra de osteomielitis (Figura 4D). Aquí, mapeamos la distribución espacial del eje de señalización Tgfb (factor de crecimiento transformante beta) y Tgfbr2 (receptor 2 de TGF-beta), una vía fundamental para la osteoblastogénesis y la reparación ósea ([28]). TENGU’ resolvió con éxito un centro de señalización espacial ajustado, delimitando claramente las poblaciones específicas de emisores (expresores de ligandos) y receptores (expresores de receptores). La interacción se localizó en gran medida en la población de células Osteo-X ([15]), formando el borde exterior de la estructura de formación ósea reactiva (Figura 4D). Estos resultados sugieren que la señalización autocrina o parácrina de Tgfb es importante para la función de las células Osteo-X durante el proceso de formación ósea reactiva y destacan la capacidad de TENGU para detectar una CCC específica dentro de un entorno complejo y altamente activo.
A continuación, examinamos la cavidad medular, que presenta una gran heterogeneidad y se caracteriza por una intensa infiltración inmune inducida por el modelo de osteomielitis por S. aureus (Figura 4E). En este nicho inflamatorio, evaluamos la interacción espacial entre la potente citocina proinflamatoria Il1a (Interleucina-1 alfa) y su receptor Il1r2. A diferencia de la señalización de TGF-β, que se encuentra confinada estructuralmente en el periostio, el eje Il1a–Il1r2 reveló una arquitectura espacial distinta, impulsada por el crosstalk inmune-estromal e inmune-inmune. TENGU’ mapeó estas interacciones en todo el espacio medular, que presenta una alta infiltración, capturando las complejas redes de señalización localizadas entre las poblaciones mieloides reclutadas (por ejemplo, neutrófilos y monocitos/macrófagos) y el microambiente circundante. En conjunto, estas visualizaciones espaciales demostraron que TENGU’ decodifica eficazmente la microanatomía funcional tanto de la reparación tisular como de la inflamación patológica activa.
Resolución espacial específica de la especie en un denso microambiente tumoral
Para demostrar aún más la versatilidad de TENGU’ en diversas arquitecturas tisulares y químicas de secuenciación, aplicamos nuestro pipeline a un modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal humano (CCR) implantado en el colon del ratón. Este tejido se procesó utilizando una química de captura basada en poli(A) 3’, que captura inherentemente transcritos de ambos organismos simultáneamente. La evaluación de las métricas de mapeo globales reveló que las células cancerosas humanas eran mucho más activas transcripcionalmente que el tejido huésped murino, representando el 84,1% de las lecturas mapeadas totales. Este dominio general resultó en una distribución muy sesgada, con unidades segmentadas individuales pobladas abrumadoramente por transcritos humanos, en lugar de murinos (Figura 4F, consulte la Figura S3 suplementaria para un diagrama espacial). Para eliminar el sangrado transcriptómico entre especies y centrarnos estrictamente en la dinámica de señalización intratumoral, establecimos un umbral estricto de especificidad de la especie, reteniendo solo las unidades segmentadas que contenían >95% de lecturas humanas. El número de genes detectados por unidad segmentada se ilustra en el diagrama de violín adjunto.
Utilizando un modelo CellTypist entrenado con datos de células únicas de CCR humano ([14]), mapeamos con éxito la compleja heterogeneidad espacial del compartimento tumoral humano. TENGU’ identificó distintos estados epiteliales malignos junto con poblaciones inmunes y estromales humanas infiltrantes, capturando la arquitectura compartimentada del microambiente tumoral (MET) (Figura 4G). En particular, el cálculo de la distancia al vecino más cercano dentro de este tumor resaltó una restricción física drásticamente diferente en comparación con el microambiente óseo. La distancia mediana de célula a célula en el xenoinjerto fue de solo 13 μm (Figura 4H), lo que refleja la naturaleza hiperproliferativa y compacta de un tumor epitelial sólido.
Mapeo de centros de señalización protumorogénica y metabólica
A pesar de esta alta densidad celular, TENGU’ resolvió con éxito las redes de comunicación célula-célula espacial. Al hacer un zoom en las regiones tumorales activas, mapeamos la distribución espacial localizada del eje de señalización MDK (Midkine) y SDC4 (Sindecan-4) (Figura 4I). Midkine es un potente factor de crecimiento que se une a la heparina, y su interacción con el receptor de proteoglicano SDC4 es un impulsor clave de la proliferación de CCR, la angiogénesis y la remodelación de las uniones focales ([29]). En particular, TENGU’ delimitó poblaciones de emisores y receptores espacialmente distintas; la expresión del ligando MDK (límites negros) se concentró en gran medida dentro de las densas islas de células epiteliales malignas, mientras que la expresión del receptor SDC4 (límites grises) se mapeó predominantemente en los márgenes estromales y endoteliales adyacentes. Esta clara segregación espacial visualiza un eje de señalización que impulsa la expansión tumoral hacia el exterior. De manera similar, resolvimos la distinta arquitectura espacial de la interacción de la red NAMPT (Nicotinamida fosforibosiltransferasa) e ITGB1 (Integrina beta-1) (Figura 4J). La señalización extracelular de NAMPT a través de los receptores de integrina sirve como un puente metabólico e inflamatorio crucial en el MET, promoviendo la supervivencia de las células cancerosas bajo estrés metabólico e impulsando la reprogramación estromal fibrótica ([30]). En lugar de una colocalización ubicua, TENGU’ resaltó distintos bolsillos de células que expresan NAMPT (emisores) que señalan a través del espacio tisular a células estromales que expresan ITGB1 (receptores) distribuidas estructuralmente.
Paquete de software bioinformático completo para el análisis de datos de Visium HD
El flujo de trabajo computacional de TENGU, resumido en la Figura 1A, consta de tres procedimientos principales. 1) Segmentación: TENGU adapta el pipeline Bin2Cell ([4]), utilizando tanto modalidades basadas en transcritos como en imágenes. Para el enfoque principal, basado en transcritos, TENGU aplica el modelo de fluorescencia versátil StarDist 2D ([11]). Optimizamos tres parámetros clave para maximizar el número medio de genes por unidad segmentada (una métrica común para evaluar los datos de transcriptómica espacial): (i) normalización de la señal de entrada (variando el filtro gaussiano (sigma) para la reducción del ruido de la señal basada en imágenes a los transcritos), (ii) el umbral de probabilidad ((pt) para modular la detección de células a partir de la señal) y (iii) el umbral de supresión no máxima ((nms) para controlar el grado de superposición entre las unidades segmentadas). Los resultados de la optimización de parámetros para muestras representativas de ratón, utilizando una química basada en sondas o una química basada en la captura de poli(A) 3’, se ilustran en la Figura 1B. El mismo conjunto de parámetros de sigma = 50, pt = 0,01 y nms = 0,01 produjo el mayor número de genes por unidad segmentada. En áreas celulares densas donde los límites de señal no resueltos dificultan este enfoque principal, la segmentación se complementa con un paso secundario basado en imágenes que utiliza el modelo StarDist 2D 10X H&E ([3]). Posteriormente, los cuadrados de 2 μm que caen dentro de los límites de segmentación se agregan para construir el perfil transcripcional de cada unidad segmentada. 2) Refinamiento: La salida de segmentación inicial se introduce en una simulación probabilística de células utilizando Proseg ([8]), que refina tanto los límites espaciales como los perfiles transcripcionales de las unidades segmentadas. 3) Procesamiento y exportación posteriores: Las unidades refinadas se exportan al formato .loupe para la visualización interactiva a través del 10X Loupe Browser, así como al formato .zarr de estándar abierto para matrices multidimensionales grandes. Además, TENGU cuenta con un módulo computacional para ayudar con la anotación de células utilizando modelos scRNA-seq seleccionados por el usuario, como CellTypist ([12]). Cualquier predicción de tipo de célula resultante se integra perfectamente en los objetos exportados. Finalmente, TENGU incluye un módulo para calcular la comunicación célula-célula espacialmente restringida (CCC) utilizando datos de interacción ligando-receptor de una base de datos especificada por el usuario ([17]).
Análisis comparativo de los enfoques de segmentación y simulación de células
A continuación, realizamos un análisis comparativo de los resultados de la segmentación en un conjunto de datos de tejido cerebral Visium HD (basado en sondas) derivados de TENGU, Bin2cell y 10X (consulte la Figura S1 suplementaria para un resumen del flujo de trabajo de Bin2cell y 10x). Los métodos Bin2cell y 10x se basan en los modelos 2D versátiles de la imagen H&E y la fluorescencia proporcionados como modelo estándar del paquete de software StarDist. Bin2cell utiliza los resultados de la segmentación de las imágenes H&E como principal y complementa con los resultados de la segmentación de la señal transcripcional como secundario. 10X desarrolló un modelo StarDist v6 H&E personalizado internamente derivado de más de 17.500 parches de imágenes H&E obtenidos de >150 imágenes de secciones H&E de una variedad de tejidos y métodos de preservación y utilizó el modelo para la segmentación. Posteriormente, los cuadrados de 2 μm que caen dentro de los límites de segmentación derivados de los dos métodos se agregaron para construir el perfil transcripcional de cada unidad segmentada.
Bin2cell produjo el mayor número de unidades segmentadas, identificando más de 60.000, en comparación con TENGU y el enfoque 10X, que ambos produjeron aproximadamente 40.000 unidades (Figura 1C). En particular, el 91% de las unidades segmentadas de TENGU contaron con el respaldo directo de las señales transcripcionales subyacentes, en contraste con solo el 12% para Bin2cell. Después de la simulación de células, observamos una ligera reducción en el número total de unidades segmentadas para los métodos 10X (1.083 unidades) y Bin2cell (1.683 unidades), mientras que TENGU no se vio afectado (Figura 1D). Esta reducción en 10X y Bin2cell se debió principalmente a la eliminación de artefactos de segmentación falsos positivos (Figura S2 suplementaria). Debido a que el algoritmo de simulación expande los límites de las unidades segmentadas agregando señales cercanas y transcripcionalmente similares (Figura 1F), hubo un aumento global en el número medio de genes por unidad segmentada en comparación con las segmentaciones originales (Figura 1D).
A continuación, comparamos los volúmenes de células simuladas, derivados de la simulación de células, con el número de cuadrados de 2 μm que componen cada unidad segmentada en los tres métodos (Figura 1E). En este diagrama log-log, una estricta correlación lineal en el límite inferior representa el volumen mínimo teórico, donde el límite simulado está estrictamente restringido al área espacial física de los cuadrados asignados. Si bien esta línea de base establece el mínimo teórico, aún observamos cierta inflación del volumen total en los tres métodos. Esta inflación se produce cuando los límites simulados se expanden hacia espacios intercelulares vacíos (áreas de células dispersas) y bordes de tejido, lo que puede conducir a una sobreestimación del tamaño de las células para un subconjunto de unidades segmentadas. Luego, comparamos los resultados de la segmentación y la simulación de células derivados de los tres enfoques. Centrándonos en las regiones altamente celulares del hipocampo (Figura 1F) que contienen estructuras anatómicas densamente empaquetadas y de organización laxa. La señal transcripcional basal de los cuadrados de 2 μm se visualizó como un mapa de calor de densidad de fondo para servir como una verdad fundamental para la ubicación molecular. Para cada enfoque analítico, los límites de segmentación de células iniciales (azul) y los límites de células simuladas resultantes (rojo) se superpusieron a la señal transcripcional. La evaluación visual de las capas de células, como el giro dentado, revela distintas diferencias en la resolución espacial entre las herramientas. Si bien el enfoque 10X captura la organización celular general, los límites de células simuladas (rojo) a veces se desvían de las regiones de transcritos más densas. Por el contrario, el enfoque Bin2cell genera límites simulados que parecen demasiado densos y generalizados, lo que dificulta el mantenimiento de los espacios intercelulares distintos y posiblemente sobreestima el volumen de las células. En contraste, TENGU demuestra una alta fidelidad morfológica. Los límites de células simuladas (rojo) generados por TENGU mantienen una estricta concordancia con los límites de las células principales (azul) y la densidad de transcritos subyacente. Además, al evitar la fusión artificial de células vecinas en estructuras anatómicas densamente empaquetadas que no se pueden discriminar solo por las señales transcripcionales, TENGU agrupa las células que comparten perfiles transcripcionales similares en una unidad segmentada y luego reduce el ruido mediante la simulación de células.
La simulación de células mejora las firmas transcripcionales y la concordancia espacial
Para evaluar la precisión biológica de los perfiles transcriptómicos generados por cada enfoque de segmentación, realizamos una anotación automatizada de tipos de células utilizando el modelo CellTypist y datos de scRNA-seq del cerebro de ratón ([18]), así como una base de datos integral de scRNA-seq del cerebro ([19]). Evaluamos específicamente el impacto de nuestro algoritmo de simulación de células comparando las segmentaciones base con sus contrapartes simuladas (denotadas con una notación prima). Un análisis de las puntuaciones de confianza de la predicción del tipo de célula para 20 tipos de células seleccionados (11 que exhiben una puntuación mediana > 0,5 en al menos un método, y 9 elegidos en función de sus distintas estructuras topológicas dentro de la base de datos MERFISH ([19])) reveló que la aplicación del paso de simulación de células mejoró constantemente la confianza de la predicción en todos los métodos (Figura 2A). En particular, TENGU con simulación de células (TENGU’) logró las puntuaciones medianas de confianza general más altas en un amplio espectro de tipos de células identificados, superando notablemente tanto su línea de base de pre-simulación (TENGU) como las salidas simuladas de los métodos alternativos (10X’ y Bin2cell’).
Para validar la precisión espacial de los perfiles simulados, comparamos los tipos de células mapeados con un conjunto de datos de transcriptómica espacial MERFISH correspondiente ([19]), que sirvió como una referencia de alta resolución y de una sola célula (Figura 2B). El mapeo de los tipos de células predichos a sus coordenadas espaciales (Figura 2C) reveló que los tres métodos generalmente exhibieron una buena concordancia espacial con la arquitectura anatómica establecida delineada por la referencia MERFISH, incluso en casos en los que sus puntuaciones de confianza de la predicción del tipo de célula fueron bajas. Una inspección más detallada de regiones anatómicas específicas de las capas corticales (Figura 2D) reveló que, a pesar de obtener puntuaciones generales de predicción del tipo de célula relativamente bajas, las distribuciones espaciales de estas poblaciones siguieron siendo muy concordantes con la referencia MERFISH. Además, el análisis de la formación del hipocampo destacó la resolución espacial mejorada proporcionada de forma única por TENGU’ (Figura 2E). TENGU’ localizó con precisión subtipos neuronales especializados, como las neuronas glutamatérgicas de CA3 y del giro dentado (DG) (clusters 017 y 037, respectivamente), con límites espaciales distintos que se asemejaban estrechamente a los datos de MERFISH. Además, los mapas de calor de confianza espacial confirmaron visualmente que, si bien se capturaron las topologías generales en todos los métodos, las asignaciones de tipos de células de TENGU’ dentro de regiones anatómicas densamente empaquetadas poseían puntuaciones de predicción notablemente más altas en comparación con las asignaciones dispersas y de menor confianza producidas por 10X’ y Bin2cell’.
Para complementar las anotaciones automatizadas y evaluar la capacidad de agrupamiento de cada método, realizamos un agrupamiento no supervisado estándar utilizando parámetros de cálculo idénticos y visualizamos el panorama transcriptómico general mediante incrustaciones UMAP (Figura 2F). Bajo una resolución de agrupamiento fija, observamos diferencias claras en el número de poblaciones distintas recuperadas con éxito por cada canalización. En concreto, TENGU’ delineó 17 clústeres transcriptómicos distintos en la incrustación UMAP, mientras que los perfiles transcriptómicos más ruidosos de 10x’ y Bin2cell’ dieron como resultado la fusión artificial de estados estrechamente relacionados, lo que produjo solo 16 y 12 clústeres, respectivamente. Para evaluar cuantitativamente esta distinción transcriptómica, calculamos la puntuación de silueta dentro del espacio de componentes principales (PC) de alta dimensión en función de los resultados del agrupamiento (Figura 2H, izquierda). TENGU’ y 10x’ lograron las puntuaciones de silueta generales más altas, alcanzando su punto máximo alrededor de 20 componentes principales y alcanzando valores (aproximadamente 0,17) comparables a los informados previamente para datos complejos de scRNA-seq ([20],[21]), superando notablemente a Bin2cell’. En conjunto, este aumento en la recuperación de clústeres y la separación de alta dimensión indican que TENGU’ y 10X’ preservan mejor las firmas moleculares distintas necesarias para un agrupamiento posterior robusto en comparación con Bin2cell’. Al proyectar estos clústeres no supervisados de nuevo en el espacio tisular, TENGU’ produjo dominios espaciales contiguos y biológicamente plausibles que reflejaron la anatomía conocida del cerebro del ratón ([13],[19],[22],[23]) (Figura 2G). En contraste, los clústeres espaciales generados por 10X’ y Bin2cell’ exhibieron una mezcla transcriptómica notable y una dispersión espacial. Para cuantificar esta observación, calculamos la puntuación de pureza del vecindario en un rango de vecinos espaciales (k) (Figura 2H, derecha). TENGU’ superó constantemente tanto a Bin2cell’ como a 10X’, manteniendo una puntuación de pureza significativamente más alta (comenzando por encima de 0,60 en k=5). Si bien todos los métodos mostraron una disminución de la pureza a medida que el tamaño del vecindario aumentaba hacia k=1000, TENGU’ mantuvo una relación señal-ruido superior en toda la escala. En conjunto, estos resultados indican que TENGU’ agrega eficazmente las señales locales relevantes al tiempo que minimiza el sangrado transcriptómico entre las células vecinas, preservando las firmas moleculares distintas necesarias para un agrupamiento robusto y una identificación del tipo de célula altamente confiable.
Para evaluar aún más el rendimiento en diferentes químicas de ensayo, examinamos los resultados de agrupamiento y mapeo espacial derivados de la química de poli-A 3’ del tejido cerebral del ratón (Figuras 2J y 2I). En comparación con los perfiles espaciales y transcriptómicos iniciales (Figura 2B), esta muestra produjo puntuaciones cuantitativas generales notablemente más bajas (comparar con la Figura 2A). Sin embargo, a pesar de estas métricas reducidas, la topología celular resultante siguió siendo biológicamente aceptable y mantuvo una organización tisular contigua. Si bien esta estructura espacial era funcional, no logró la claridad topológica robusta y la definición espacial de alta resolución demostrada en la Figura 2C. En esencia, incluso dentro de las limitaciones de este conjunto de datos, TENGU’ continuó produciendo los mejores resultados, superando con éxito a los otros métodos.
Análisis de la transcriptómica espacial del microambiente óseo
Para evaluar el rendimiento de TENGU’ en tejidos con altas barreras técnicas, aplicamos nuestra canalización al hueso de ratón descalcificado, un tejido notoriamente difícil para la transcriptómica espacial debido a su densa matriz extracelular mineralizada y su baja celularidad. La muestra utilizada para este estudio fue un fémur de un modelo murino de osteomielitis por Staphylococcus aureus, que incluye hueso cortical, médula ósea y un absceso que involucra la médula, el hueso cortical y se extiende fuera del hueso (Figura 3A) ([24]). TENGU’ segmentó con éxito los datos transcriptómicos, manteniendo un número robusto de unidades segmentadas y aumentando sustancialmente el número mediano de genes detectados por unidad en comparación con la canalización 10X’ (Figura 3B). Los resultados de la segmentación y la simulación de células se exportaron como un archivo .loupe y se visualizaron en el software Loupe Browser. Esta recuperación transcriptómica enriquecida se tradujo directamente en una resolución de agrupamiento superior utilizando parámetros de cálculo idénticos, y el mapeo de los clústeres no supervisados de nuevo en las coordenadas espaciales reveló que TENGU’ delineó 25 poblaciones celulares distintas, mientras que la canalización 10X’ más ruidosa resolvió solo 21 (Figura 3A).
Validación in situ y detección de osteocitos incrustados en la matriz
La muestra de osteomielitis ósea contiene inflamación localizada intensa y reabsorción ósea inducida por la infección ([24]). Comparamos los perfiles de expresión derivados computacionalmente con la hibridación in situ de RNAscope de una sección adyacente (Figura 3C). TENGU’ proporcionó un mapeo de expresión localizado altamente preciso de los marcadores clave que impulsan esta patología. Por ejemplo, la expresión espacial normalizada de Tnfsf11 (RANKL), una citocina crítica que se sobreexpresa durante la osteomielitis para estimular la osteoclastogénesis, fue mejor capturada por TENGU’. Nuestra canalización delineó límites biológicos más nítidos y una señal de expresión más fuerte dentro de las lesiones de remodelación activa que la señal producida por 10X’ (Figura 3D). Además, tanto TENGU’ como 10X’ mapearon con precisión la expresión de Acp5, un marcador de osteoclastos, destacando las poblaciones de osteoclastos activos que reabsorben el hueso y reflejando estrechamente la referencia de RNAscope (Figura 3E).
A continuación, para anotar los tipos de células de las unidades segmentadas para un análisis de mayor resolución, construimos un modelo CellTypist de células residentes en el hueso derivado de un conjunto de datos seleccionado de nuestro estudio anterior ([15]). Es importante destacar que la vista ampliada del hueso cortical destaca una importante ventaja técnica de TENGU’, a saber, la detección exitosa de osteocitos incrustados en lo profundo del tejido mineralizado (Figura 3F). Capturar firmas transcriptómicas de osteocitos maduros es un desafío reconocido en la biología espacial debido a la mala penetración de la sonda y el bajo rendimiento de ARN ([25]). TENGU’ supera con éxito esta barrera, produciendo señales transcriptómicas en regiones donde el método 10X’, que se basa únicamente en imágenes de H&E para la segmentación, sufre un abandono grave.
Formación ósea reactiva e interacciones osteoinmunes
A continuación, nos centramos en el efecto de la infección en el periostio óseo, también conocido como formación ósea reactiva o reacción periostial ([26]). Se sabe poco sobre los mecanismos que impulsan la formación de esta estructura, que se produce en la superficie periostial en los bordes del absceso. TENGU’ y 10X’ preservaron y mapearon con éxito la compleja arquitectura de esta estructura, resolviendo de forma distinta las capas de condrocitos, osteo-CAR, preosteoblastos, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos, todo ello rodeado de células osteo-X (Figura 3G). Además, al centrarse en el área en la que el nivel de destrucción ósea es mayor, TENGU’ pudo mapear la cavidad medular altamente heterogénea (Figura 3H). Aquí, TENGU’ delineó claramente la colocalización espacial de osteoclastos que reabsorben el hueso junto con una rica diversidad de poblaciones hematopoyéticas e inmunes, incluidas monocitos/macrófagos, neutrófilos, células B y progenitores linfoides (LMPP/HSPC).
Análisis espacial de la comunicación célula-célula en el microambiente óseo
Habiendo establecido que TENGU’ proporciona una distinción transcriptómica superior y una resolución espacial dentro del complejo microambiente óseo mineralizado (Figura 3), buscamos a continuación aprovechar esta segmentación de alta fidelidad para mapear las redes de comunicación célula-célula (CCC) con conocimiento espacial. Para este análisis, utilizamos una base de datos seleccionada de ligandos y receptores de un estudio anterior ([27]), que comprende 11.395 interacciones potenciales. Primero, calculamos las puntuaciones de interacción ligando-receptor integrales en todas las unidades segmentadas, teniendo en cuenta tanto los niveles de expresión como la proximidad espacial en función de la formulación empírica.
Para anclar nuestras métricas de proximidad, primero determinamos la distancia al vecino más cercano en todas las células segmentadas dentro del espacio tisular (Figura 4A). Esto estableció la arquitectura física de base de la red celular, revelando una distancia celular mediana de 46 μm. Dado que la señalización parácrina se basa en los gradientes de difusión biológica, calculamos iterativamente las puntuaciones de CCC en radios de vecindad en expansión (que van desde la línea de base de 46 μm hasta 1474 μm) para evaluar cómo las limitaciones espaciales afectan la detección de pares de ligandos y receptores funcionales (Figura 4B). Como se esperaba, observamos un aumento robusto tanto en la frecuencia como en la diversidad de las interacciones detectadas a medida que el radio se expandía. Sin embargo, esta diversidad se estabilizó en aproximadamente 8400 interacciones, y la extensión del radio más allá de ~737 μm no produjo una ganancia significativa en los nuevos tipos de ligandos y receptores. Esto sugiere que un umbral de 737 μm captura eficazmente la distancia de señalización biológica funcional máxima dentro de este contexto tisular específico.
Distinguir los modos de señalización espacial en función del radio funcional
Para caracterizar aún más la naturaleza biofísica de las redes de comunicación identificadas, evaluamos la relación entre la intensidad de la interacción (puntuación CCC) y el radio espacial funcional máximo necesario para lograr esa interacción para cada par ligando-receptor específico (Figura 4C). Al categorizar estas interacciones según sus mecanismos de señalización establecidos, basándonos en la base de datos ([27]), nuestro marco espacial diferenció con éxito entre interacciones localizadas y dependientes del contacto, y redes más amplias basadas en la difusión. Como se anticipó, las vías conocidas clasificadas como que utilizan el contacto directo entre células generalmente operaron dentro de límites espaciales más ajustados, lo que se correlacionó con radios funcionales máximos más cortos. Por el contrario, las vías de señalización secretadas demostraron un rango significativamente más amplio de distancias de comunicación efectivas en toda la arquitectura del tejido. En particular, al rastrear simultáneamente la puntuación de interacción y el alcance espacial, TENGU proporciona una metodología basada en datos para inferir los límites biofísicos de pares ligando-receptor no caracterizados o "desconocidos".
Mapeo de centros de señalización osteogénica e inflamatoria
Para demostrar la utilidad biológica de nuestro marco CCC básico con conciencia espacial, visualizamos las interacciones ligando-receptor específicas dentro de nichos patológicos y de remodelación distintos. Primero, nos centramos en el área de formación ósea reactiva de la muestra de osteomielitis (Figura 4D). Aquí, mapeamos la distribución espacial del eje de señalización Tgfb (factor de crecimiento transformante beta) y Tgfbr2 (receptor de TGF-beta 2), una vía fundamental para la osteoblastogénesis y la reparación ósea ([28]). TENGU resolvió con éxito un centro de señalización espacial ajustado, delineando claramente las poblaciones específicas de emisores (expresores de ligandos) y receptores (expresores de receptores). La interacción se localizó en gran medida en la población de células Osteo-X ([15]), formando el borde exterior de la estructura de formación ósea reactiva (Figura 4D). Estos resultados sugieren que la señalización autocrina o parácrina de Tgfb es importante para la función de las células Osteo-X durante el proceso de formación ósea reactiva y resaltan la capacidad de TENGU para detectar un CCC específico dentro de un entorno complejo y altamente activo.
A continuación, examinamos la cavidad medular altamente heterogénea, que se caracteriza por una intensa infiltración inmune impulsada por el modelo de osteomielitis S. aureus (Figura 4E). En este nicho inflamatorio, evaluamos la interacción espacial entre la potente citocina proinflamatoria Il1a (Interleucina-1 alfa) y su receptor Il1r2. A diferencia de la señalización de TGF-β estructuralmente confinada en el periostio, el eje Il1a–Il1r2 reveló una arquitectura espacial distinta impulsada por el crosstalk inmune-estromal e inmune-inmune. TENGU mapeó estas interacciones en todo el espacio medular fuertemente infiltrado, capturando las complejas redes de señalización localizadas entre las poblaciones de células mieloides reclutadas (por ejemplo, neutrófilos y monocitos/macrófagos) y el microentorno circundante. En conjunto, estas visualizaciones espaciales demostraron que TENGU decodifica eficazmente la microanatomía funcional tanto de la reparación de tejidos como de la inflamación patológica activa.
Resolución espacial específica de la especie en un denso microentorno tumoral
Para demostrar aún más la versatilidad de TENGU en diversas arquitecturas de tejidos y químicas de secuenciación, aplicamos nuestro flujo de trabajo a un modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal humano (CCR) implantado en el colon del ratón. Este tejido se procesó utilizando una química basada en la captura de poli(A) 3', que inherentemente captura transcritos de ambos organismos simultáneamente. La evaluación de las métricas de mapeo global reveló que las células cancerosas humanas eran mucho más activas transcripcionalmente que el tejido huésped murino, lo que representó el 84,1% de las lecturas mapeadas totales. Este dominio general resultó en una distribución muy sesgada, con unidades segmentadas individuales pobladas abrumadoramente por transcritos humanos, en lugar de murinos (Figura 4F, consulte la Figura S3 complementaria para un diagrama espacial). Para eliminar el sangrado transcripcional entre especies y centrarnos estrictamente en la dinámica de señalización intratumoral, establecimos un umbral de especificidad de especie estricto, reteniendo solo las unidades segmentadas que contenían >95% de lecturas humanas. El número de genes detectados por unidad segmentada se ilustra en el diagrama de violín adjunto.
Utilizando un modelo CellTypist entrenado con datos de una sola célula de CCR humano ([14]), mapeamos con éxito la compleja heterogeneidad espacial del compartimento tumoral humano. TENGU identificó distintos estados epiteliales malignos junto con poblaciones inmunitarias y estromales humanas infiltrantes, capturando la arquitectura compartimentada del microentorno tumoral (MET) (Figura 4G). En particular, el cálculo de la distancia al vecino más cercano dentro de este tumor resaltó una restricción física drásticamente diferente en comparación con el microentorno óseo. La distancia mediana de célula a célula en el xenoinjerto fue de solo 13 μm (Figura 4H), lo que refleja la naturaleza hiperproliferativa y compactada de un tumor epitelial sólido.
Mapeo de centros de señalización protumorogénica y metabólica
A pesar de esta alta densidad celular, TENGU resolvió con éxito las redes de comunicación célula-célula espacial. Al hacer zoom en las regiones tumorales activas, mapeamos la distribución espacial localizada del eje de señalización MDK (Midkine) y SDC4 (Sindecan-4) (Figura 4I). Midkine es un potente factor de crecimiento que se une a la heparina, y su interacción con el receptor de proteoglicano SDC4 es un impulsor fundamental de la proliferación de CCR, la angiogénesis y la remodelación de las uniones focales ([29]). En esencia, TENGU delineó poblaciones de emisores y receptores espacialmente distintas; la expresión del ligando MDK (límites negros) se concentró en gran medida dentro de las densas islas de células epiteliales malignas, mientras que la expresión del receptor SDC4 (límites grises) se mapeó predominantemente en los márgenes estromales y endoteliales adyacentes. Esta clara segregación espacial visualiza un eje de señalización que impulsa la expansión tumoral hacia afuera. De manera similar, resolvimos la distinta arquitectura espacial de la red de interacción NAMPT (nicotinamida fosforibosiltransferasa) e ITGB1 (integrina beta-1) (Figura 4J). La señalización extracelular de NAMPT a través de los receptores de integrina sirve como un puente metabólico e inflamatorio crucial en el MET, promoviendo la supervivencia de las células cancerosas bajo estrés metabólico e impulsando la reprogramación del estroma fibrótico ([30]). En lugar de una colocalización ubicua, TENGU resaltó distintos bolsillos de células que expresan NAMPT (emisores) que señalan a través del espacio tisular a células estromales que expresan ITGB1 (receptores) estructuralmente extendidas.
Discusión
La rápida adopción de la transcriptómica espacial de alta resolución, en particular la plataforma Visium HD, ha creado la necesidad de marcos computacionales sólidos capaces de procesar conjuntos de datos masivos sin sacrificar la fidelidad biológica. En este estudio, desarrollamos TENGU, un flujo de trabajo bioinformático de extremo a extremo que navega con éxito la compleja interacción entre el registro de imágenes, la agrupación transcripcional y el mapeo de la interacción espacial. Al demostrar la eficacia de TENGU en arquitecturas altamente diversas, que van desde estructuras cerebrales murinas organizadas hasta huesos mineralizados dispersos y xenoinjertos de tumores humanos altamente compactados, destacamos su adaptabilidad y rendimiento superior en comparación con los flujos de trabajo estándar existentes.
Un desafío fundamental y persistente en la transcriptómica espacial es lograr una verdadera resolución a nivel de una sola célula. Las secciones de tejido estándar preparadas para la plataforma Visium HD suelen tener un grosor de 5 a 10 μm, lo que significa que a menudo capturan solo un fragmento transversal de una célula en lugar de su totalidad. Además, el ángulo físico de la sección del tejido influye en gran medida en cómo se proyectan los límites morfológicos en el área de captura 2D. En consecuencia, una única "unidad segmentada" definida computacionalmente puede incluir inadvertidamente fragmentos superpuestos de múltiples células físicas distintas. Sin embargo, TENGU aplica un paso de simulación celular impulsado por la transcriptómica utilizando el marco sólido Proseg ([8]) para minimizar la mezcla transcripcional de diferentes tipos de células en las unidades segmentadas refinando iterativamente los límites en función de las probabilidades de expresión génica localizadas. En esencia, incluso en los casos en que una unidad segmentada fusiona físicamente múltiples células debido a una densidad de tejido extrema, la simulación garantiza que los contenedores espaciales agregados compartan perfiles de expresión altamente correlacionados. Por lo tanto, la unidad segmentada es probable que represente un tipo de célula biológicamente homogéneo. Este mecanismo preserva la distinción transcripcional necesaria para un agrupamiento de alta resolución preciso y mejora la confianza en las predicciones del tipo de célula utilizando modelos de secuenciación de ARN de una sola célula.
Una métrica común utilizada para evaluar los datos de transcriptómica espacial es el número total de transcritos detectados por célula. Sin embargo, lograr un rendimiento transcripcional comparable al de la secuenciación de ARN de una sola célula estándar no debe considerarse un punto de referencia universal, ya que la recuperación de transcritos depende en gran medida del tejido. Por ejemplo, si bien los tejidos blandos como el cerebro pueden producir perfiles transcripcionales sólidos que se acercan a los niveles de una sola célula, los tejidos como el hueso descalcificado sufren inherentemente un rendimiento de ARN mucho menor. Esta reducción en el número mediano de transcritos detectados por unidad segmentada es una consecuencia inevitable del procesamiento químico riguroso requerido para la descalcificación y la barrera física de la matriz extracelular mineralizada. En consecuencia, si bien las herramientas computacionales pueden maximizar la recuperación de datos, se requiere una mayor optimización de los protocolos experimentales y de preparación de tejidos para estos microentornos desafiantes.
Más allá de la definición de la identidad celular, un objetivo principal de la biología espacial es descubrir la comunicación célula-célula dentro de los microentornos. TENGU proporciona un módulo básico y optimizado para la comunicación célula-célula espacial (CCC). Reconocemos que el panorama bioinformático para CCC se está expandiendo rápidamente ([31]). Este crecimiento ha resultado en la aparición continua de algoritmos altamente especializados y diversas colecciones de bases de datos de ligandos y receptores. TENGU está diseñado para complementar en lugar de competir con estas herramientas avanzadas. Al priorizar la generación de unidades segmentadas matemáticamente sólidas y facilitar su exportación a formatos de estándar abierto (por ejemplo, .h5ad, .zarr), TENGU sirve como una puerta de enlace de alta fidelidad. Los investigadores pueden utilizar el módulo CCC de TENGU para el análisis exploratorio, al tiempo que conservan la flexibilidad para exportar sin problemas los datos espaciales limpios a flujos de trabajo de terceros más complejos y especializados.
En resumen, TENGU ofrece un marco computacional adaptable diseñado para el análisis de transcriptómica espacial de datos de Visium HD. Al utilizar un enfoque de simulación celular impulsado por la transcriptómica para refinar los límites espaciales derivados de las segmentaciones iniciales de la señal transcripcional, el flujo de trabajo genera unidades segmentadas altamente cohesivas y biológicamente distintas. Más allá de la segmentación fundamental, TENGU ofrece información funcional procesable al integrar a la perfección módulos integrados para la incrustación espacial, la anotación automatizada de tipos de células de alta resolución y el análisis de comunicación célula-célula con conciencia espacial (CCC). En conjunto, este enfoque integrado proporciona a los investigadores una herramienta sólida para caracterizar e interpretar mejor las complejas dinámicas espaciales en diversos microentornos de tejidos.
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