El análisis del lipidoma de las células cancerosas y sus vesículas extracelulares revela firmas lipídicas específicas del tipo de cáncer y permite el diseño de liposomas miméticos de las vesículas extracelulares.

Los lípidos desempeñan un papel fundamental en la estructura y función celular, ya que son componentes esenciales de las membranas, reservorios de energía y moléculas de señalización. Las alteraciones en el metabolismo de los lípidos se reconocen cada vez más como características distintivas del cáncer, contribuyendo a la progresión tumoral, la metástasis y la resistencia al tratamiento (Santos y Schulze ^[2012]). Estas alteraciones se manifiestan en diversas clases de lípidos, como los lisofosfolípidos, los fosfolípidos, los esfingolípidos y los esteroles (Tabla S1), cada uno de los cuales desempeña funciones distintas en la homeostasis celular. Las células cancerosas suelen presentar desequilibrios entre los ácidos grasos saturados e insaturados, lo que afecta directamente a la fluidez de la membrana y a las vías de señalización que impulsan la transformación maligna (Guo et al. ^[2023], ^[2024]; Levental et al. ^[2016]). Dentro de las membranas celulares, microdominios especializados conocidos como balsas lipídicas, enriquecidos en colesterol y esfingolípidos, funcionan como plataformas críticas para la transducción de señales y el tráfico de proteínas. Las células cancerosas exhiben alteraciones características en estas balsas, lo que facilita la señalización aberrante que promueve el desarrollo y la progresión del tumor (Li et al. ^[2022]) (revisado en Mollinedo y Gajate ^[2020]). Estas modificaciones basadas en lípidos contribuyen colectivamente a la reprogramación metabólica que respalda la mayor proliferación, supervivencia y capacidad invasiva de las células cancerosas (revisado en Mollinedo y Gajate ^[2020]).

Los vehículos extracelulares (VE) son partículas encerradas en bicapas lipídicas que se sintetizan y secretan activamente por todos los tipos de células (revisado en Teng y Fussenegger ^[2020]). Contienen una carga bioactiva compuesta por lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y otras moléculas, desempeñando así un papel clave en la comunicación intercelular (revisado en Kumar et al. ^[2024]). Basándose en su biogénesis, los VE se clasifican en categorías que incluyen los "exosomas" (derivados de cuerpos multivesiculares) y las "microvesículas" (formadas a partir de la membrana plasmática) (revisado en Teng y Fussenegger ^[2020]). Una vez en circulación, estos VE funcionan como mensajeros intercelulares, influyendo tanto en los procesos biológicos locales como distantes, con importantes implicaciones para la biología del cáncer (revisado en Fyfe et al. ^[2023]; Liu y Wang ^[2023]). En el contexto tumoral, los VE median en la carcinogénesis, la angiogénesis y la metástasis al contribuir a la formación de un microambiente tumoral favorable y al establecimiento de nichos premetastásicos en sitios distantes. Las células cancerosas pueden transmitir señales a través de los VE a las células receptoras malignas y no malignas, modificando su comportamiento para apoyar el crecimiento y la propagación del tumor (Abdouh et al. ^[2019], ^[2017]; Al-Nedawi et al. ^[2008]; Fischer et al. ^[2016]). Esta red de comunicación intercelular extiende la influencia de las células cancerosas más allá de su microentorno inmediato, permitiendo efectos sistémicos que facilitan la progresión de la enfermedad (revisado en Kumar et al. ^[2024]; Lopez et al. ^[2023]). Estos estudios destacan el potencial terapéutico de dirigir los VE. Además, la presencia de VE en varios fluidos biológicos (sangre, orina, saliva y leche materna) los convierte en fuentes accesibles para el cribado de biomarcadores basado en biopsias líquidas, ofreciendo enfoques no invasivos para la detección y el seguimiento del cáncer (revisado en Rayamajhi et al. ^[2024]).

El desarrollo de enfoques lipídómicos basados en la espectrometría de masas ha avanzado significativamente nuestra comprensión de la composición de los VE, revelando perfiles lipídicos específicos de cada tipo de célula y firmas asociadas a enfermedades que antes eran inaccesibles (Brzozowski et al. ^[2018]; Chen et al. ^[2019]; Haraszti et al. ^[2016]). La importancia funcional de los VE derivados del cáncer está intrínsecamente ligada a su composición lipídica distintiva, que no solo estructura su bicapa de membrana, sino que también participa activamente en su biogénesis y funciones biológicas. Los estudios han identificado patrones de enriquecimiento lipídico conservados en los VE, incluido el aumento de los esfingolípidos, el colesterol y las especies de fosfatidilserina (PS) en comparación con las células progenitoras (Brzozowski et al. ^[2018]; Llorente et al. ^[2013]; Yuyama et al. ^[2014]). Los glicosfingolípidos y el colesterol facilitan la formación y secreción de los VE (Skotland et al. ^[2017]), mientras que el enriquecimiento de especies lipídicas específicas crea propiedades de membrana únicas que influyen en la estabilidad, la captación celular y la actividad biológica de estas vesículas. Los enfoques lipídómicos dirigidos y no dirigidos han revelado firmas de VE específicas del cáncer, como el aumento del ceramida en los VE del cáncer colorrectal metastásico (Elmallah et al. ^[2022]) y el enriquecimiento de esfingolípidos/glicerofosfolípidos en los VE del cáncer de mama (Dorado et al. ^[2024]). Los avances en el perfilado lipídico han revelado firmas lipídicas específicas asociadas con varios tipos de cáncer, con implicaciones tanto funcionales como diagnósticas (revisado en Perrotti et al. ^[2016]). Por ejemplo, los liposomas enriquecidos con PS pueden inhibir la activación de las células T dentro del microentorno del cáncer de ovario (Kelleher et al. ^[2015]), mientras que las firmas lipídicas de los exosomas plasmáticos pueden distinguir con precisión a los individuos sanos de aquellos con cáncer de pulmón en estadio temprano o tardío (Fan et al. ^[2018]). Es importante destacar que, si bien los VE derivados de las células cancerosas a menudo reflejan los perfiles lipídicos de sus células progenitoras, también exhiben características únicas que refuerzan su papel en la progresión del tumor. Por ejemplo, los VE del cáncer de próstata muestran niveles más altos de lípidos esteroles y esfingolípidos en comparación con los VE de las células no tumorales, lo que refleja los cambios que se producen durante la progresión del cáncer (Brzozowski et al. ^[2018]). Por lo tanto, el estudio en profundidad de los lípidos en los VE abre nuevas perspectivas para comprender mejor su papel en el cáncer y ofrece un prometedor potencial clínico para el desarrollo de biomarcadores basados en biopsias líquidas.

Dados estos conocimientos emergentes sobre el papel fundamental de los lípidos en la biología del cáncer y la función de los VE, y basándonos en los recientes avances basados en la espectrometría de masas en la lipídómica de los VE, diseñamos este estudio para caracterizar las clases/familias de lípidos (donde "familia" se refiere aquí a las subclases de LIPID MAPS (Sud et al. ^[2007]), por ejemplo, la fosfatidilcolina como familia dentro de la clase de los fosfolípidos, o la esfingomielina como familia dentro de la clase de los esfingolípidos), los niveles de saturación y las especies únicas o compartidas entre las células cancerosas y sus VE. Nuestro enfoque sistemático incluye: (1) caracterización de los VE aislados de líneas celulares humanas cancerosas y no cancerosas; (2) perfilado lipídico individual de las células y sus VE; (3) comparación de los perfiles lipídicos de las células y sus VE; (4) comparación global de los perfiles lipídicos en todas las muestras; (5) análisis comparativo de los perfiles de cáncer frente a los perfiles no cancerosos (abarca la distribución de las familias de lípidos y los patrones de saturación, los perfiles de ácidos grasos, la composición de las balsas lipídicas, las firmas lipídicas únicas, la identificación de biomarcadores, los análisis comparativos entre las células cancerosas y sus VE derivados, así como entre los tumores primarios y los perfiles metastásicos, y las implicaciones de las firmas lipídicas específicas del cáncer) y (6) implicaciones terapéuticas. Al dilucidar la compleja relación entre el metabolismo lipídico celular y la composición de los VE en el cáncer, nuestro estudio tiene como objetivo mejorar la comprensión de cómo las alteraciones lipídicas contribuyen a la malignidad y cómo podrían aprovecharse para beneficio clínico, contribuyendo en última instancia a mejorar las estrategias de diagnóstico y tratamiento del cáncer.

Resultados

Caracterización de los VE aislados de líneas celulares humanas cancerosas y no cancerosas

Se analizaron seis modelos celulares humanos biológicamente distintos (Figura 1A): cuatro líneas celulares cancerosas (células de melanoma uveal MP41, líneas primarias/metastásicas de melanoma uveal MEL270/OMM2.5 (de un mismo donante, siendo OMM2.5 el representante de las metástasis hepáticas) y adenocarcinoma de colon HT29) y dos líneas celulares no cancerosas (fibroblastos de colon normales CCD-18Co y fibroblastos de piel normales BJ). Este panel abarca una amplia gama de contextos celulares, incluidos los tumores y las células del estroma, los modelos primarios y metastásicos y los diferentes orígenes tisulares (melanoma ocular y sistemas gastrointestinales). Por lo tanto, siguiendo las pautas establecidas por la Sociedad Internacional de Vehículos Extracelulares (ISEV) en 2018 (Théry et al. ^[2018]) y actualizadas en MISEV2023, los VE se aislaron de estas líneas mediante ultracentrifugación, como se realiza habitualmente en nuestro laboratorio (Pessuti et al. ^[2022]; Tsering et al. ^[2020]) y luego se caracterizaron. Se realizó microscopía electrónica de transmisión (MET) para visualizar los VE, proporcionando imágenes de alta resolución de su morfología y estructura. En la Figura 1B se presentan ejemplos de imágenes de MET de VE derivados de líneas celulares primarias (MP41), metastásicas (OMM2.5) y no cancerosas (BJ), que muestran su tamaño a nanoescala. Se analizó la distribución del tamaño de los VE para cada línea celular (Figura 1C), lo que confirmó que todas las muestras contenían vesículas dentro del rango esperado para los VE pequeños. El tamaño medio de los VE, medido mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Figura 1D), osciló entre aproximadamente 130 y 160 nm, lo que apoya aún más su clasificación como VE pequeños según las pautas de MISEV. El potencial zeta (Figura 1E), relacionado con la carga superficial y los iones de la solución tampón, fue negativo para todas las muestras de VE, como se esperaba. El Western blot confirmó la expresión del marcador de VE sintenina (Figura 1F y Figura S1). Estos resultados informan colectivamente sobre las propiedades fisicoquímicas típicas de los VE y proporcionan una base para caracterizar su lipídoma.

Perfilado lipídico individual de las células y sus VE

Comenzamos generando una caracterización descriptiva del perfil lipídico para cada muestra individual, células y VE (Figura 2A). En primer lugar, el análisis lipídico exhaustivo reveló diversas familias de lípidos (subclases) (Tabla S1) en todas las muestras (células y VE), incluidos los lisofosfolípidos, los fosfolípidos, los esfingolípidos y los esteroles, con diferentes niveles de saturación, lo que refleja la complejidad y riqueza del lipídoma celular (revisado en Casares et al. ^[2019]). A continuación, mostramos que cada tipo de célula exhibió una firma lipídica característica (Figura 2B-D), en concordancia con estudios lipídicos comparativos previos (Llorente et al. ^[2013]; Marien et al. ^[2015]). Si bien los fosfolípidos fueron la clase de lípidos predominante en todas las muestras (61%-80% en las células; 65%-75% en los VE) (Figura 2B), los lisofosfolípidos fueron más abundantes en las células no cancerosas (20%-24%) que en las células cancerosas (12%-20%). Además, un análisis detallado revela perfiles distintos a nivel de las especies lipídicas individuales (Tablas S2 y S3).

Los gráficos de distribución de frecuencia (Figura 2C) revelan patrones distintos de las familias de lípidos en las líneas celulares y sus VE. En MP41 (melanoma uveal), el éster de colesterol (CE) muestra bajas frecuencias en la línea celular MP41 (3,83%) pero está notablemente enriquecido en los VE (10,29%). La lisofosfatidilcolina (LPC) mantiene frecuencias moderadas constantes (∼5%) tanto en las células como en los VE. MEL270 (melanoma uveal) muestra un patrón diferente en el que la LPC está presente en las células (9,76%) pero casi ausente en los VE (0,88%). A diferencia de MP41 y MEL270, en OMM2.5 (metástasis hepática), los niveles de ácido fosfatídico (PA) son comparables en las células (4,08%) y los VE (5,26%). HT29 (adenocarcinoma de colon) muestra un perfil distinto con frecuencias más bajas de fosfatidiletanolamina (PE) que en otras muestras cancerosas, especialmente en las células (∼10% frente a ∼20% en otras muestras). Por el contrario, el PA es más alto en las células HT29 (9,71%) que en otras células cancerosas (∼2%-5%). Las líneas celulares no cancerosas muestran patrones característicos: CCD-18Co muestra diferencias notables en las distribuciones de lisofosfatidilinositol (LPI), con frecuencias más altas en las células (8,08%) que en los VE (1,51%). Las células BJ presentan diferencias significativas en los niveles de PE, mostrando bajas frecuencias en los VE (11,8%) pero frecuencias elevadas en las células (18%). La fosfatidilinositol (PI) muestra frecuencias elevadas en las células (13,85% en las células CCD-18Co y 11,14% en las células BJ) pero está menos presente en los VE (7,04% en los VE de CCD-18Co y 5,62% en los VE de BJ). Es interesante destacar que la fosfatidilcolina (PC) mostró constantemente la mayor abundancia relativa en todas las muestras, tanto para las células como para los VE.

El análisis de saturación (Figura 2D) revela una predominancia de lípidos poliinsaturados (66%–71%) en todas las muestras. Las células cancerosas muestran un contenido de lípidos saturados potencialmente ligeramente mayor (11%–17%) en comparación con los niveles consistentemente más bajos observados en las células no cancerosas (12%–13%). Para evaluar la reproducibilidad de la detección de especies lipídicas en muestras independientes, comparamos los perfiles lipídicos del estudio principal y réplicas biológicas adicionales. La superposición y la robustez de estos hallazgos se ilustran en la Figura S2.

Comparación del perfil lipídico de las células y sus vesículas extracelulares (VE)

A continuación, para comprender mejor los mecanismos de regulación lipídica, comparamos los perfiles lipídicos de las células y sus VE correspondientes (Figura 3A) para identificar las especies lipídicas reguladas de forma diferencial entre estas dos entidades biológicas. Nuestro análisis reveló que el 44,7%–50,5% de las especies lipídicas totales se comparten entre las VE y las membranas celulares, dependiendo de la línea celular (Figura 3B). Se observaron patrones distintos de enriquecimiento y depleción en las VE derivadas de células cancerosas en comparación con sus células progenitoras, lo que destaca mecanismos específicos de regulación lipídica (Figura 3C). Estas variaciones subrayan la complejidad de los procesos de clasificación de lípidos durante la biogénesis de las VE, lo que diferencia la composición de las VE de la de sus células de origen.

Más concretamente, entre las células cancerosas, las VE de MP41 muestran los cambios más diversos, con un enriquecimiento sustancial en esfingomielina (SM) (+8,74%), PC (+6,28%) y CE (+6,45%), al tiempo que presentan una pérdida significativa de varias especies lipídicas: PE (−5,74%), PI (−4,60%) y PA (−3,79%). Las VE de MEL270 exhiben un enriquecimiento equilibrado en varias especies, incluido el PA (+5,93%), el fosfatidilglicerol (PG) (+5,05%) y la SM (+5,00), pero muestran la mayor depleción en LPC (−8,85%) entre todas las muestras. Las VE de OMM2.5 presentan un patrón único con un marcado enriquecimiento en PC (+5,91%) y SM (+6,78%), junto con una depleción moderada en LPC (−5,31%) y PE (−5,38%). Las VE de HT29 tienen un perfil con menos variación que otras muestras, caracterizado por un enriquecimiento en esteroles, fosfolípidos y SM, y pérdidas en todos los lisofosfolípidos. Las VE derivadas de células no cancerosas muestran patrones distintos en comparación con las VE derivadas de células cancerosas: las VE de CCD-18Co exhiben notables aumentos en PC (+7,17%) y SM (+5,20), al tiempo que muestran reducciones significativas en LPI (−6,57%) y PI (−6,81%). Las VE de BJ muestran los mayores enriquecimientos en PC y SM (+9,27% y +8,92%, respectivamente) entre todas las muestras, junto con un enriquecimiento sustancial en CE (+5,82%). Las VE de BJ también exhiben una depleción significativa en PE (−6,20%) y PI (−5,52%).

Tras establecer las principales diferencias en la ocurrencia y distribución de lípidos, buscamos cuantificar aún más estos patrones a nivel de la abundancia de lípidos individuales. A continuación, el análisis de diagrama de dispersión de lípidos regulados de forma significativa (log2FC > 2 y log2FC < -2, p < 0,05) confirmó estos distintos perfiles lipídicos entre las células y sus VE (Figura 3D, E y Tabla S4), proporcionando información más profunda sobre los patrones específicos de regulación lipídica en los diferentes tipos de células. Las células MP41 (melanoma uveal) y HT29 (adenocarcinoma colorrectal) exhiben diferencias notables en la expresión de lípidos, tanto dentro de las propias células como en sus VE. En las células MP41, la mayor expresión se observa para PS 38:4, con un aumento de 41,94 veces en comparación con las VE de MP41, mientras que la menor expresión es la de PC 42:1, reducida a 0,06 veces. Por el contrario, en las células HT29, PS 40:5 muestra una sobreexpresión que alcanza las 69,42 veces en comparación con las VE de HT29, mientras que PS 40:4 está subexpresado a 0,11 veces. Las líneas celulares no cancerosas exhibieron patrones de regulación de cambio de pliegue extremos en términos de expresión de lípidos. Para las células BJ, los lípidos sobreexpresados alcanzaron cambios de pliegue tan altos como 596,08 (PS 36:2), mientras que los lípidos subexpresados disminuyeron hasta 0,001 (PS 36:1 y PS 36:2). De manera similar, las células CCD-18Co mostraron cambios de pliegue de hasta 933,97 para los lípidos sobreexpresados, como PS 36:1, en contraste con los lípidos subexpresados que alcanzaron cambios de pliegue tan bajos como 0,001 (PE 34:1 y PS 36:1).

El análisis de las clases de lípidos y la saturación de los lípidos sobreexpresados en cada muestra (Figura 3F, G) revela una predominancia de fosfolípidos con la mayoría de los lípidos que exhiben un carácter insaturado. HT29 difiere claramente de las otras muestras, con una proporción del 18% de esteroles en las células y un 25% de esfingolípidos en las VE. Aunque los perfiles lipídicos de los lípidos sobreexpresados en las diferentes muestras muestran tendencias comparables, no son idénticos; estas diferencias revelan firmas lipídicas específicas únicas para cada tipo de muestra, lo que destaca las distintas adaptaciones metabólicas adaptadas a los roles biológicos de las células y sus VE individuales.

Además, estas observaciones son consistentes con estudios comparativos previos del contenido de lípidos en células y VE, que sugieren procesos de clasificación sofisticados que regulan finamente la composición de las vesículas (Vestad et al. ^[2017]) (revisado en Becker et al. ^[2016]). Estos hallazgos destacan las diferencias clave entre las VE derivadas del cáncer y sus células progenitoras: el enriquecimiento de SM y CE junto con la depleción de PE y LPC, así como un mayor contenido de lípidos saturados en comparación con las muestras no cancerosas.

Comparación global de los perfiles lipídicos en todas las muestras

Para el análisis comparativo de todas las muestras (Figura 4A), el análisis de componentes principales (PCA) demostró una agrupación distinta de las muestras en función de su perfil lipídico general, con las células y las VE agrupadas por separado (Figura 4B). Además, para el análisis comparativo de las células (Figura 4C), y luego de las VE (Figura 4I), el PCA demostró una clara separación entre las células cancerosas y las no cancerosas (Figura 4D) y entre las VE derivadas de células cancerosas y las VE derivadas de células no cancerosas (Figura 4J). El análisis de superposición de especies lipídicas (Figura 4E) reveló además que, si bien 111 especies lipídicas se comparten en todos los tipos de células, cada línea celular exhibe firmas lipídicas únicas en proporciones variables: MP41 (melanoma uveal, 39 especies), MEL270 (melanoma uveal, 11 especies), OMM2.5 (metástasis hepática, 65 especies), HT29 (adenocarcinoma colorrectal, 6 especies), CCD-18Co (línea no cancerosa, 10 especies) y BJ (línea no cancerosa, 5 especies). Un patrón similar emerge en las VE derivadas de las células, donde las firmas lipídicas únicas varían significativamente: VE de MP41 (16 especies), VE de MEL270 (33 especies), VE de OMM2.5 (34 especies), VE de HT29 (10 especies), VE de CCD-18Co (9 especies) y VE de BJ (2 especies) (Figura 4K).

El análisis del perfil de expresión de los lípidos compartidos en todas las líneas celulares revela patrones de abundancia distintivos característicos de cada tipo de célula (Figura 4F). Los datos del mapa de calor demuestran patrones de expresión de lípidos compartidos, con ciertas especies lipídicas que muestran una expresión consistente en las células cancerosas, mientras que otras exhiben un enriquecimiento específico del cáncer. Por ejemplo, PC 30:0 se expresó en gran medida en las células MP41, MEL270 y OMM2.5, pero se detectó débilmente en las células HT29. Por el contrario, PE 38:4 mostró niveles de expresión relativamente consistentes en las líneas celulares. Estos hallazgos sugieren una regulación diferencial del metabolismo lipídico adaptada a los requisitos funcionales y las identidades biológicas de los tipos de células individuales. Aunque algunas especies lipídicas mantienen patrones de abundancia similares entre las células y sus VE, el mapa de calor de las VE (Figura 4L) revela que cada tipo de célula exhibe un enriquecimiento o depleción selectiva de especies lipídicas específicas en sus VE, lo que indica que operan mecanismos de clasificación lipídica distintos durante la biogénesis de las VE.

Basándose en el análisis de los perfiles lipídicos compartidos en todas las muestras, el examen detallado de las líneas celulares individuales y sus VE revela firmas lipídicas únicas y proporciones distintas de clases de lípidos y niveles de saturación (Figura 4G (células) y Figura 4M (VE)), lo que enfatiza aún más las adaptaciones lipídicas específicas del tipo de célula. Entre las células cancerosas, MP41 (melanoma uveal) exhibe predominantemente fosfolípidos (82%) con un alto contenido de poliinsaturados (74%), mientras que MEL270 (melanoma uveal) muestra una distribución única con fosfolípidos (55%), lisofosfolípidos (27%) y es la única línea celular cancerosa que contiene esteroles significativos (18%). OMM2.5 (metástasis hepática) mantiene altos niveles de fosfolípidos (81%) con el mayor contenido de poliinsaturados (85%) entre las células cancerosas, mientras que HT29 (adenocarcinoma colorrectal) muestra el menor contenido de fosfolípidos (48%) con una presencia significativa de lisofosfolípidos (37%). Las VE (Figura 4M) demuestran patrones de clasificación notablemente distintos: las VE de MP41 muestran un perfil único con una distribución equitativa entre fosfolípidos y lisofosfolípidos (40% cada uno) y son las únicas VE cancerosas que contienen tanto esfingolípidos (10%) como esteroles (10%). Por el contrario, las VE de MEL270 muestran un marcado enriquecimiento de fosfolípidos (94%) con un contenido mínimo de lisofosfolípidos (6%), mientras que las VE de OMM2.5 están compuestas exclusivamente por fosfolípidos (100%). Las VE de HT29 mantienen un alto contenido de fosfolípidos (79%) con niveles moderados de lisofosfolípidos (21%). Los perfiles de saturación revelan patrones específicos del cáncer: si bien las células cancerosas generalmente prefieren las especies poliinsaturadas (60%–85%), sus VE muestran cambios drásticos en los niveles de saturación. Las VE de MP41 exhiben de forma única un alto contenido de monoinsaturados (70%) con un contenido mínimo de especies poliinsaturadas (10%), mientras que las VE de MEL270 y OMM2.5 muestran patrones de saturación idénticos con lípidos predominantemente poliinsaturados (81%). Las listas de lípidos únicos de las células y las VE se especifican en la Figura 4H (células) y la Figura 4N (VE).

Análisis comparativo de los perfiles cancerosos frente a los no cancerosos: identificación de firmas específicas del cáncer

Esta sección explora las diferencias fundamentales entre los perfiles lipídicos de las células cancerosas y no cancerosas (Figura 5A), así como sus VE (Figura 5K). Al combinar un análisis sistemático de las clases/familias de lípidos, los perfiles de ácidos grasos y las composiciones de las balsas lipídicas, destacamos las firmas específicas del cáncer.

Distribución de las familias de lípidos y patrones de saturación

La distribución de las clases de lípidos revela que los fosfolípidos constituyen las principales especies lipídicas tanto en las muestras cancerosas como en las no cancerosas (74% en las células cancerosas, 67% en las células no cancerosas; 71% en las VE derivadas de células cancerosas, 68% en las VE derivadas de células no cancerosas) (Figura 5B, L), mientras que el análisis de saturación muestra patrones similares, con aproximadamente un 15% de lípidos saturados, un 20% de lípidos monoinsaturados y un 65% de lípidos poliinsaturados (Figura 5C, M).

Los perfiles de ácidos grasos revelan la remodelación específica del cáncer

Para analizar los patrones de AG en las células cancerosas y no cancerosas, nos centramos en clases de lípidos específicas que contienen cadenas de AG definidas: lisofosfolípidos (ácido lisofosfatídico (LPA), LPC, lisofosfatidiletanolamina (LPE), LPI, lisofosfatidilserina (LPS) y lisofosfatidilglicerol (LPG); cadena de AG única) y ácido fosfatídico (PA; dos cadenas de AG) (revisado en Szlasa et al. ^[2020]). Estas especies lipídicas son particularmente relevantes, ya que contienen fragmentos de AG bien caracterizados y desempeñan un papel crucial en la señalización de las células cancerosas y la organización de las membranas (Emoto et al. ^[2017]) (revisado en Gomez-Larrauri et al. ^[2023]; Kaffe et al. ^[2024]; Koundouros y Poulogiannis ^[2020]; Nagarajan et al. ^[2021]). La distribución general de lípidos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados se comparó entre las células y las VE cancerosas y no cancerosas (Figura 2D), lo que proporcionó la base para una investigación más detallada de los patrones de AG dentro de las familias de lípidos específicas (Tabla S5).

En las células cancerosas (MP41, MEL270, OMM2.5 y HT29), la proporción de ácidos grasos saturados (11,8%–16,7%) fue consistentemente mayor que en las células no cancerosas (9,6%–11,5%), en línea con los hallazgos previos sobre la composición de la membrana de las células cancerosas (revisado en Szlasa et al. ^[2020]). Curiosamente, esta tendencia se amplificó aún más en las VE derivadas del cáncer, donde los AG saturados alcanzaron hasta el 29,2% en las VE de MP41 (melanoma uveal) en comparación con su contenido celular (11,8%), un fenómeno que se informó previamente en las vesículas derivadas del cáncer (revisado en Skotland et al. ^[2017]). Por el contrario, las células no cancerosas y sus VE mantuvieron perfiles de AG más equilibrados, con las VE de BJ que mostraron la mayor proporción de especies poliinsaturadas (82,6%), lo que respalda los estudios previos sobre la homeostasis de la membrana de las células no cancerosas (revisado en Rog y Vattulainen ^[2014]).

Además, el número total de especies que contienen ácidos grasos (FA) varió significativamente entre las células (51–60 especies) y las vesículas extracelulares (EVs) (15–47 especies), lo que indica un empaquetamiento selectivo de especies lipídicas específicas en las EVs.

Composición de las balsas lipídicas: alteraciones relacionadas con la progresión tumoral

En las células cancerosas, las balsas lipídicas sufren alteraciones significativas, incluido un aumento del contenido de colesterol y una composición alterada de esfingolípidos, lo que contribuye a la progresión y metástasis tumoral al afectar la fluidez de la membrana, la transducción de señales, la migración celular, la invasión y la formación de EVs (Murai ^[2012]) (revisado en Mollinedo y Gajate ^[2015]). En este contexto, nuestro análisis lipídico reveló patrones distintos en la distribución de los componentes de las balsas lipídicas entre las células y sus EVs correspondientes (Tabla S6).

En resumen, las células cancerosas muestran niveles variables de componentes de las balsas lipídicas: el colesterol éster (CE) oscila entre el 3,83% en MP41 (melanoma uveal) y el 6,90% en OMM2.5 (metástasis hepática), el esfingomielina (SM) varía del 3,51% en MP41 al 6,15% en HT29 (adenocarcinoma colorrectal) y la ceramida (Cer) muestra niveles notablemente bajos (0,31%–1,05%). Las células no cancerosas mantienen niveles más consistentes de estos componentes (CE: 4,86%–5,77%; SM: 3,85%–4,00%; Cer: 0,86%–1,15%). Esta variabilidad en los lípidos que forman las balsas en las células cancerosas sugiere una alteración de la organización de la membrana, lo que podría afectar las plataformas de señalización cruciales para la progresión tumoral. Las EVs demuestran un enriquecimiento significativo en la mayoría de los componentes de las balsas, con un CE que muestra una abundancia relativa 2–3 veces mayor (7,11%–10,29% en las EVs cancerosas frente a 8,54%–10,67% en las EVs no cancerosas) y un SM que muestra un enriquecimiento aún mayor (8,89%–12,25% en las EVs cancerosas y 9,05%–12,92% en las EVs no cancerosas). Sin embargo, los niveles de Cer siguen siendo bajos en las EVs (0,44%–0,98% en las EVs cancerosas; 0,50%–1,69% en las EVs no cancerosas), lo que sugiere una clasificación selectiva de componentes específicos de las balsas durante la formación de las EVs.

Firmas lipídicas únicas

El análisis de superposición de especies lipídicas que compara las células cancerosas con las células no cancerosas (Figura 5D) y las EVs derivadas de células cancerosas con las EVs derivadas de células no cancerosas (Figura 5N) identificó firmas lipídicas específicas. Lo más importante es que el análisis de las especies lipídicas únicas en las células cancerosas revela una predominancia de fosfolípidos (95%) con una baja proporción de esteroles (5%), caracterizados por un 32% de lípidos monoinsaturados y un 68% de lípidos poliinsaturados (Figura 5F). Las EVs derivadas de células cancerosas muestran un perfil distinto con un 83% de fosfolípidos y un 17% de esfingolípidos, que comprenden un 13% de lípidos saturados, un 22% de lípidos monoinsaturados y un 65% de lípidos poliinsaturados (Figura 5P). Los perfiles de expresión (Figura 5E (células) y Figura 5O (EVs)) muestran picos distintos para diferentes familias de lípidos, incluido la sobreexpresión de PI, PE y PS tanto en las células cancerosas como en las EVs, y una fuerte expresión de SM solo en las EVs cancerosas. Encontramos 19 especies lipídicas únicas de las células cancerosas (CE 30:1 + NH4, PA 34:1, PA 36:2, PC 36:1 + AcO, PE 34:2, PE 40:8, PE 40:8 + AcO, PE 44:6, PI 24:5, PI 26:5, PI 28:3, PI 32:3, PI 34:2, PI 34:8, PI 34:9, PS 32:1, PS 40:1, PS 40:7 y PS 42:1) (detalles en la Figura 5G) y 23 especies lipídicas únicas de las EVs cancerosas (PA 34:1, PC 28:6, PC 34:2, PC 36:0, PE 34:1 + AcO, PE 36:1 + AcO, PE 38:0 + AcO, PE 38:1, PI 28:4, PI 36:4, PI 36:7, PI 38:10, PI 38:4, PI 38:6, PI 38:7, PS 34:1, PS 36:2, PS 40:8, PS 42:7, SM 32:2;3, SM 40:0;3, SM 40:4;3 y SM 42:3;2) (detalles en la Figura 5Q) en comparación con las muestras no cancerosas. De manera notable, tras una extensa revisión de la literatura utilizando múltiples bases de datos científicas, descubrimos que ninguna de estas especies lipídicas específicas se ha notificado previamente en estudios sobre el cáncer. Si bien muchas publicaciones han descrito diferencias en la expresión de lípidos a nivel de familia/clase en el cáncer, nuestro estudio proporciona información clave adicional al especificar/identificar las especies moleculares precisas.

Lípidos expresados diferencialmente como biomarcadores

El análisis de abundancia diferencial utilizando gráficos de dispersión (log2FC > 2 y log2FC < -2, p < 0,05) revela patrones de regulación distintos entre las muestras cancerosas y no cancerosas (Figura 5H (células) y Figura 5R (EVs)). Como sugieren otros, los lípidos expresados diferencialmente pueden representar actores clave en las vías metabólicas desreguladas en las células cancerosas, o posibles mediadores de la comunicación intercelular tumoral a través de las EVs (Deep y Schlaepfer ^[2016]; Huang y Freter ^[2015]). Para identificar firmas lipídicas con una relevancia más amplia más allá de los efectos específicos del tejido, analizamos un panel de líneas celulares cancerosas y no cancerosas que abarcan múltiples orígenes tisulares (ocular, colorrectal y dérmico). Este enfoque multilineal permite la identificación de alteraciones lipídicas que se asocian de forma consistente con la malignidad en diversos contextos celulares, diferenciándolas de las variaciones específicas del tejido.

En este contexto, identificamos varias especies lipídicas de fosfolípidos como posibles biomarcadores diagnósticos y terapéuticos (Figura 5I–J (células), Figura 5S–T (EVs) y Tabla S7). Estos candidatos (PE 32:0, PE 32:1, PE 38:2 y PG 34:1 en las células cancerosas; y PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2 y PS 36:1 en las EVs derivadas de células cancerosas) prometen como marcadores diagnósticos debido a su sobreexpresión consistente en múltiples líneas celulares cancerosas en comparación con las células no cancerosas, y como objetivos terapéuticos debido a su participación en procesos celulares clave (revisado en Fu et al. ^[2020]).

Validación cruzada con lipidomas del plasma de pacientes

Para evaluar la relevancia traslacional, comparamos nuestros perfiles con la lipidómica del plasma de cinco tipos de cáncer (Lee et al. ^[2019]). El análisis del diagrama de Venn (Figura S3) identificó 11 especies lipídicas compartidas entre los tres conjuntos de datos: el de Lee et al. (n = 50 lípidos), nuestras células cancerosas (n = 130) y nuestras EVs derivadas de células cancerosas (n = 129): PC 34:2, PC 36:2, PC 36:3, PC 36:4, PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2, PE 38:4, PE 38:5, PE 40:5 y PE 40:6. En particular, los principales candidatos de las EVs, PE 34:1, PE 36:1 y PE 36:2 (Figura 5T), se conservan, lo que vincula las firmas de las EVs celulares con los biomarcadores del cáncer circulante.

Validación ortogonal en diferentes plataformas analíticas

Para fortalecer la reproducibilidad y abordar posibles sesgos específicos de la plataforma, examinamos estudios lipídicos publicados que emplean técnicas ortogonales (Tabla S8). Nuestros datos de LC-MS/MS que muestran un enriquecimiento consistente de PE, PC, PG y PS en las EVs cancerosas en comparación con las células parentales/controles se alinean con los hallazgos de GC-MS, RMN, TLC-MS y MS de imagen en diversos modelos de cáncer (células, plasma y tejido). Esta convergencia entre plataformas valida la relevancia biológica de las firmas lipídicas observadas más allá de la metodología de LC-MS/MS.

Comparación de lípidos comunes en células cancerosas frente a EVs derivadas de células cancerosas

El análisis comparativo entre los lípidos comunes de las líneas celulares cancerosas incluidas en este estudio y los de sus EVs (Figura 5U) reveló patrones distintos de tráfico lipídico, coherentes con una biogénesis alterada y una carga lipídica de las EVs tumorales potencialmente relacionada con la progresión del cáncer (Cheng et al. ^[2018]; Corn et al. ^[2020]). El diagrama de Venn identifica 77 lípidos comunes, con 53 lípidos únicos de las células cancerosas y 52 de las EVs (Figura 5V). Además, las EVs exhibieron un aumento notable en las esfingomielinas (SM, +10,89%) y los fosfatidilcolinas (PC, +3,29), así como un ligero aumento en los ésteres de colesterol (CE, +2,39) y los fosfatidilgliceroles (PG, +2,34) (Figura 5W). Por el contrario, se observaron pérdidas significativas de las lisofosfatidilcolinas (LPC, -9,99%), los fosfatidiletanolaminas (PE, -3,73%) y los fosfatidilserinas (PS, -2,96%). El análisis de expresión diferencial reveló una sobreexpresión significativa (log2FC > 2, p < 0,05) de 12 fosfolípidos (PC 32:1, PE 34:0, PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2, PE 38:1, PE 38:2, PS 36:2, PS 36:3, PS 38:0 + NH4, PS 38:3 y PS 38:4) en las células cancerosas (Figura 5X, Z) y de 2 PC en las EVs derivadas de células cancerosas (PC 42:1 y PC 40:0) (Figura 5Y, Z). Los perfiles de saturación de los lípidos sobreexpresados (Figura 5Z) también difieren entre las células y las EVs: las células cancerosas muestran una predominancia de lípidos poliinsaturados (50%) en comparación con los saturados (17%) y los monoinsaturados (33%), mientras que las EVs derivadas de células cancerosas muestran una distribución equilibrada entre los lípidos saturados (50%) y los monoinsaturados (50%), pero no muestran lípidos poliinsaturados.

Análisis comparativo de los perfiles del tumor primario y metastásico

Nuestro análisis de las muestras emparejadas MEL270 (melanoma uveal primario) y OMM2.5 (metástasis hepática) (Figura 6A) reveló una conservación sustancial del perfil lipídico durante la progresión metastásica. Las células comparten 228 especies lipídicas, mientras que 59 especies son únicas de MEL270 y 91 de las células OMM2.5 (Figura 6B). De manera similar, sus EVs exhibieron una superposición significativa, con 180 especies lipídicas compartidas, mientras que 47 eran únicas de las EVs MEL270 y 29 de las EVs OMM2.5 (Figura 6B). El análisis completo del diagrama de Venn (Figura 6B) reveló relaciones complejas entre estas muestras, con 117 especies lipídicas compartidas entre los cuatro tipos de muestras (Figura 6C), mientras que se identificaron varias especies únicas en cada tipo de muestra (Figura 6D). Esta preservación parcial de la composición lipídica durante el proceso metastásico se alinea con los hallazgos de otros estudios que comparan el lipidoma de los tumores primarios y sus metástasis (Ye et al. ^[2018]) (revisado en Bianco et al. ^[2017]). La distribución de las clases de lípidos se mantiene notablemente consistente entre las muestras primarias y metastásicas, con los fosfolípidos que constituyen aproximadamente el 73% del total de los lípidos en ambos tipos de células y sus EVs (Figura 6E). Los esfingolípidos mantienen proporciones similares (~13%) en ambos tipos de células y sus EVs. El análisis de saturación confirmó que los lípidos saturados (~13%), los lípidos monoinsaturados (~16%) y los lípidos poliinsaturados (~71%) se distribuyen de manera similar en todas las muestras (Figura 6F). El análisis de abundancia diferencial (log2FC > 2 y log2FC < -2, p < 0,05) entre las células primarias y metastásicas (Figura 6G–J) reveló que, si bien las células mostraron algunas especies significativamente moduladas, sus EVs no mostraron diferencias significativas en la abundancia de lípidos.

Implicaciones de las firmas lipídicas específicas del cáncer

En conjunto, los resultados obtenidos para el análisis comparativo de los perfiles de cáncer frente a no cáncer resaltan los mecanismos de clasificación lipídica específicos del tipo de cáncer y las adaptaciones a los distintos requisitos celulares, como lo demuestran los perfiles lipídicos únicos observados en las células cancerosas y sus EVs derivadas. Es importante destacar que muchas de estas especies lipídicas representan hallazgos novedosos en la investigación del cáncer, lo que proporciona detalles moleculares sin precedentes más allá de los análisis a nivel de familia/clase de lípidos que se informan habitualmente en la literatura. Estos resultados enfatizan el papel fundamental de la regulación lipídica en la progresión del cáncer, en particular en el empaquetamiento selectivo de lípidos en las EVs, lo que puede influir en la comunicación intercelular y el desarrollo tumoral. Al identificar firmas lipídicas moleculares específicas, nuestro trabajo abre nuevas vías para explorar los biomarcadores diagnósticos y los objetivos terapéuticos en la lipidómica del cáncer. Es importante señalar que la "clasificación lipídica específica del cáncer" mencionada aquí se refiere a las tendencias generales que distinguen las células cancerosas de las células no cancerosas, en lugar de implicar perfiles lipídicos idénticos en todos los tipos de cáncer. Si bien ciertos cambios lipídicos son recurrentes en múltiples modelos de cáncer, cada línea celular cancerosa conserva características lipídicas únicas dictadas por su tejido de origen, su trasfondo genético y sus requisitos funcionales, como lo ilustran las diferencias observadas entre las líneas celulares de melanoma uveal en la Figura 4F.

Validación funcional de los liposomas derivados de las EVs

El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común a nivel mundial (1,9 millones de nuevos casos en 2022) y presenta un alto potencial metastásico mediado por vesículas extracelulares (VE) (Bray et al. ^[2024]; Siegel et al. ^[2024]). Para validar las consecuencias funcionales de la clasificación lipídica en las VE, generamos liposomas a partir de lípidos de células HT29 y lípidos de VE de HT29, lo que permitió una comparación directa de la composición celular parental frente a la composición enriquecida en VE empaquetada selectivamente en un modelo de adenocarcinoma controlado. Los liposomas DMPC-Chol (1:1) sirvieron como control sintético. De manera crucial, la reconstitución de lípidos nativos produjo liposomas de alta eficiencia (>10^10 partículas/mL) con fidelidad físico-química a las VE de origen (Figura 7A-C), lo que demuestra la traducción exitosa de los datos lipídicos en nanopartículas sintéticas que imitan las VE. A continuación, la cinética de captación (Figura 7D) destacó aún más la influencia de la composición lipídica en la internalización celular. Más concretamente, las VE HT29 nativas y los liposomas de lípidos de células HT29, a pesar de tener una confluencia inicial similar (∼30%, Figura 7E), mostraron que los liposomas de lípidos de células HT29 tenían una captación moderadamente menor, lo que sugiere la contribución de lípidos únicos de las VE, proteínas de membrana y curvatura a nanoescala. En contraste, los liposomas de lípidos de VE HT29 superaron a los controles DMPC-Chol (1:1) a pesar de tener una confluencia baja equivalente (∼20%), lo que confirma la funcionalidad superior de los lípidos nativos sobre los fosfolípidos sintéticos. La cinética de captación (Figura 7D) demostró que las VE nativas mostraron la mayor captación celular, y los liposomas cargados con lípidos de células y lípidos de VE también mostraron una captación significativamente mejor que los liposomas DMPC:colesterol (1:1), lo que confirma la funcionalidad superior de los lípidos nativos sobre los fosfolípidos sintéticos.

Implicaciones terapéuticas

Como nuestro grupo ha destacado recientemente (Chen et al. ^[2025]), las VE han surgido como herramientas terapéuticas prometedoras, particularmente como sistemas de administración de fármacos y para el direccionamiento de células cancerosas, debido a su biocompatibilidad natural y su capacidad para transportar diversos agentes terapéuticos (Chen et al. ^[2025]). En este contexto, para comprender mejor el potencial de los lípidos específicos del cáncer identificados en nuestro estudio para informar el diseño de vehículos terapéuticos, primero realizamos una revisión sistemática de la literatura sobre la aplicación de la lipidómica al estudio del cáncer y el desarrollo de nanopartículas lipídicas para el tratamiento del cáncer (Figura 8). Al buscar en las bases de datos CINAHL, Cochrane Library, Embase, Medline y Web of Science, identificamos 97 artículos relevantes, incluidos 54 estudios originales y 43 revisiones. Los estudios originales se centraron en varios tipos de cáncer, incluidos el de mama, próstata, glioma, colon y pulmón, e informaron sobre alteraciones recurrentes de ciertas clases de lípidos, como los fosfolípidos, esfingolípidos y ácidos grasos, en las células tumorales y sus VE. Curiosamente, 15 estudios utilizaron datos de lipidómica para diseñar nanopartículas lipídicas (liposomas, LNPs) adecuadas para dirigir las células cancerosas o administrar fármacos anticancerígenos. Estos resultados destacan el potencial de los lípidos específicos del cáncer para el desarrollo de nuevos vehículos terapéuticos.

A continuación, realizamos un análisis comparativo entre nuestros datos y los lípidos que se utilizan actualmente en aplicaciones terapéuticas (Tabla 1). Este análisis reveló varias características interesantes de nuestros lípidos específicos del cáncer que podrían mejorar los sistemas de administración de fármacos. Estudios recientes han demostrado que los esfingolípidos modificados pueden mejorar la administración terapéutica y la eficiencia del direccionamiento tumoral (Wang et al. ^[2024]). Las especies lipídicas únicas identificadas en nuestro estudio (incluidos PE 40:8 + AcO y PE 44:6 (Figura 4D; células), SM 32:2;3, SM 40:0;3, SM 40:4;3, PS 40:8 y PS 42:7 (Figura 4K; VE)) muestran características estructurales distintas en comparación con los lípidos terapéuticos convencionales (como la dioleoilfosfatidilserina (DOPS)). Estas características estructurales, en particular sus diversas longitudes de cadena y modificaciones específicas, podrían mejorar potencialmente su utilidad en aplicaciones de administración de fármacos, ya que los sistemas de administración basados en esfingolípidos han surgido como un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer (revisado en Tea et al. ^[2020]).

Además, basándonos en nuestro análisis de lipidómica que muestra distribuciones lipídicas únicas en las células cancerosas y sus VE (Figura 4H, N y 5G, Q), estos lípidos representan candidatos prometedores para el desarrollo de LNPs biomiméticas (revisado en Chen et al. ^[2025]). Los perfiles lipídicos del par isogénico MEL270/OMM2.5, que representan respectivamente un tumor primario y su metástasis hepática derivados del mismo paciente, ofrecen perspectivas particularmente interesantes. De hecho, la notable conservación del perfil lipídico en las VE metastásicas (OMM2.5), que mantienen el 81% de los lípidos poliinsaturados de la línea primaria y, al mismo tiempo, presentan un enriquecimiento específico en esfingomielinas (+5% en las VE MEL270 y +6,78% en las VE OMM2.5), sugiere un mecanismo de clasificación lipídica esencial para la diseminación hepática característica del melanoma uveal. Esta distintiva firma lipídica podría aprovecharse para diseñar sistemas de administración de fármacos dirigidos específicamente a las metástasis hepáticas, una necesidad clínica urgente dada la tropismo hepático y la letalidad de las metástasis del melanoma uveal (Karlsson et al. ^[2020]; Tsering et al. ^[2020]).

Caracterización de las VE aisladas de líneas celulares humanas cancerosas y no cancerosas

Se analizaron seis modelos celulares humanos biológicamente distintos (Figura 1A): cuatro líneas celulares cancerosas (melanoma uveal MP41, líneas de melanoma uveal primario/metastásico emparejadas MEL270/OMM2.5 (de un mismo donante, con OMM2.5 que representa metástasis hepáticas) y adenocarcinoma colorrectal HT29), y dos líneas celulares no cancerosas (fibroblastos de colon normales CCD-18Co y fibroblastos de piel normal BJ). Este panel abarca una amplia gama de contextos celulares, incluidas las células tumorales y del estroma, los modelos primarios y metastásicos y los diferentes orígenes tisulares (melanoma ocular y sistemas gastrointestinales). Por lo tanto, siguiendo las pautas establecidas por la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) de 2018 (Théry et al. ^[2018]) y actualizadas en MISEV2023, las VE se aislaron de estas líneas mediante ultracentrifugación, como se realiza habitualmente en nuestro laboratorio (Pessuti et al. ^[2022]; Tsering et al. ^[2020]) y luego se caracterizaron. Se realizó microscopía electrónica de transmisión (MET) para visualizar las VE, proporcionando imágenes de alta resolución de su morfología y estructura. Los ejemplos de imágenes de MET de las VE derivadas de líneas celulares primarias (MP41), metastásicas (OMM2.5) y no cancerosas (BJ) se presentan en la Figura 1B, lo que muestra su tamaño a nanoescala. Se analizó la distribución del tamaño de las VE para cada línea celular (Figura 1C), lo que confirmó que todas las muestras contenían vesículas dentro del rango esperado para las VE pequeñas. El tamaño medio de las VE, medido mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Figura 1D), osciló entre aproximadamente 130 y 160 nm, lo que apoya aún más su clasificación como VE pequeñas según las pautas MISEV. El potencial zeta (Figura 1E), relacionado con la carga superficial y los iones en la solución tampón, fue negativo para todas las muestras de VE, como se esperaba. El Western blot confirmó la expresión del marcador de VE sintenina (Figura 1F y Figura S1). Estos resultados informan colectivamente sobre las propiedades fisicoquímicas típicas de las VE y proporcionan una base para caracterizar su lipidoma.

Perfil lipídico individual de células y sus VE

Comenzamos generando una caracterización descriptiva del perfil lipídico para cada muestra individual, células y VE (Figura 2A). Primero, el análisis lipídico completo reveló diversas familias de lípidos (subclases) (Tabla S1) en todas las muestras (células y VE), incluidos los lisofosfolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos y esteroles, con diferentes niveles de saturación, lo que refleja la complejidad y riqueza del lipidoma celular (revisado en Casares et al. ^[2019]). Luego, mostramos que cada tipo de célula mostró una firma lipídica característica (Figura 2B-D), en concordancia con estudios de lipidómica comparativa anteriores (Llorente et al. ^[2013]; Marien et al. ^[2015]). Si bien los fosfolípidos fueron la clase de lípidos predominante en todas las muestras (61%-80% en las células; 65%-75% en las VE) (Figura 2B), los lisofosfolípidos fueron más abundantes en las células no cancerosas (20%-24%) que en las células cancerosas (12%-20%). Además, un análisis detallado revela perfiles distintos a nivel de las especies lipídicas individuales (Tablas S2 y S3).

Los gráficos de distribución de frecuencia (Figura 2C) revelan patrones distintos de la familia de lípidos en las líneas celulares y sus VE. En MP41 (melanoma uveal), el éster de colesterol (CE) muestra bajas frecuencias en la línea celular MP41 (3,83%) pero está notablemente enriquecido en las VE (10,29%). La lisofosfatidilcolina (LPC) mantiene frecuencias moderadas constantes (∼5%) tanto en las células como en las VE. MEL270 (melanoma uveal) muestra un patrón diferente en el que LPC estaba presente en las células (9,76%) mientras que estaba casi ausente en las VE (0,88%). A diferencia de MP41 y MEL270, en OMM2.5 (metástasis hepática), los niveles de ácido fosfatídico (PA) son comparables en las células (4,08%) y las VE (5,26%). HT29 (adenocarcinoma colorrectal) muestra un perfil distinto con frecuencias más bajas de fosfatidiletanolamina (PE) que en otras muestras cancerosas, especialmente en las células (∼10% frente a ∼20% en otras muestras). Por el contrario, PA es más alto en las células HT29 (9,71%) que en otras células cancerosas (∼2%-5%). Las líneas celulares no cancerosas muestran patrones característicos: CCD-18Co muestra diferencias notables en las distribuciones de lisofosfatidilinositol (LPI), con frecuencias más altas en las células (8,08%) que en las VE (1,51%). Las células BJ presentan diferencias significativas en los niveles de PE, mostrando bajas frecuencias en las VE (11,8%) pero frecuencias elevadas en las células (18%). La fosfatidilinositol (PI) muestra frecuencias elevadas en las células (13,85% en las células CCD-18Co y 11,14% en las células BJ) pero está menos presente en las VE (7,04% en las VE CCD-18Co y 5,62% en las VE BJ). Curiosamente, la fosfatidilcolina (PC) mostró constantemente la mayor abundancia relativa en todas las muestras, tanto para las células como para las VE.

El análisis de saturación (Figura 2D) revela una predominancia de lípidos poliinsaturados (66%-71%) en todas las muestras. Las células cancerosas muestran potencialmente un contenido ligeramente mayor de lípidos saturados (11%-17%) que los niveles consistentemente más bajos en las células no cancerosas (12%-13%). Para evaluar la reproducibilidad de la detección de especies lipídicas en muestras independientes, comparamos los perfiles lipídicos del estudio principal y réplicas biológicas adicionales. El solapamiento y la solidez de estos hallazgos se ilustran en la Figura S2.

Comparación del perfil lipídico de células y sus VE

Luego, para comprender mejor los mecanismos de regulación lipídica, comparamos los perfiles lipídicos de las células y sus VE correspondientes (Figura 3A) para identificar las especies lipídicas reguladas de manera diferente entre estas dos entidades biológicas. Nuestro análisis reveló que el 44,7%-50,5% del total de las especies lipídicas se comparten entre las VE y las membranas celulares, según la línea celular (Figura 3B). Se observaron patrones distintos de enriquecimiento y agotamiento en las VE derivadas de células cancerosas en comparación con sus células parentales, lo que destaca los mecanismos de regulación lipídica específicos (Figura 3C). Estas variaciones subrayan la complejidad de los procesos de clasificación lipídica durante la biogénesis de las VE, que diferencian la composición de las VE de la de sus células de origen.

Más concretamente, entre las células cancerosas, los exosomas MP41 muestran los cambios más diversos, con un enriquecimiento notable en esfingomielina (EM) (+8,74%), PC (+6,28%) y CE (+6,45%), al tiempo que presentan una pérdida significativa de varias especies de lípidos: PE (−5,74%), PI (−4,60%) y PA (−3,79%). Los exosomas MEL270 exhiben un enriquecimiento equilibrado en varias especies, incluyendo PA (+5,93%), fosfatidilglicerol (PG) (+5,05%) y EM (+5,00%), pero muestran el agotamiento más pronunciado en LPC (−8,85%) entre todas las muestras. Los exosomas OMM2.5 presentan un patrón único con un enriquecimiento marcado en PC (+5,91%) y EM (+6,78%), junto con un agotamiento moderado en LPC (−5,31%) y PE (−5,38%). Los exosomas HT29 tienen un perfil con menos variación que otras muestras, caracterizado por un enriquecimiento en esteroles, fosfolípidos y EM, y pérdidas en todos los lisofosfolípidos. Los exosomas derivados de células no cancerosas muestran patrones distintos en comparación con los exosomas derivados de células cancerosas: los exosomas CCD-18Co exhiben notables aumentos en PC (+7,17%) y EM (+5,20), al tiempo que muestran reducciones significativas en LPI (−6,57%) y PI (−6,81%). Los exosomas BJ muestran los mayores enriquecimientos en PC y EM (+9,27% y +8,92%, respectivamente) entre todas las muestras, junto con un enriquecimiento sustancial en CE (+5,82%). Los exosomas BJ también exhiben un agotamiento significativo en PE (−6,20%) y PI (−5,52%).

Tras establecer las principales diferencias en la presencia y distribución de lípidos, buscamos cuantificar aún más estos patrones a nivel de la abundancia de lípidos individuales. A continuación, el análisis de diagrama de dispersión de lípidos regulados significativamente (log2FC > 2 y log2FC < -2, p < 0,05) confirmó estos distintos perfiles lipídicos entre las células y sus exosomas (Figura 3D, E y Tabla S4), proporcionando información más detallada sobre los patrones específicos de regulación de lípidos en los diferentes tipos de células. Las células MP41 (melanoma uveal) y HT29 (adenocarcinoma colorrectal) exhiben diferencias notables en la expresión de lípidos, tanto dentro de las propias células como en sus exosomas. En las células MP41, la mayor expresión se observa para PS 38:4, con un aumento de 41,94 veces en comparación con los exosomas MP41, mientras que la menor expresión es la de PC 42:1, reducida a 0,06 veces. Por el contrario, en las células HT29, PS 40:5 muestra una sobreexpresión que alcanza las 69,42 veces en comparación con los exosomas HT29, mientras que PS 40:4 está subexpresado a 0,11 veces. Las líneas celulares no cancerosas exhibieron patrones de regulación de cambio de pliegue extremos en términos de expresión de lípidos. Para las células BJ, los lípidos sobreexpresados alcanzaron cambios de pliegue de hasta 596,08 (PS 36:2), mientras que los lípidos subexpresados disminuyeron hasta 0,001 (PS 36:1 y PS 36:2). De manera similar, las células CCD-18Co mostraron cambios de pliegue de hasta 933,97 para los lípidos sobreexpresados, como PS 36:1, en contraste con los lípidos subexpresados que alcanzaron cambios de pliegue tan bajos como 0,001 (PE 34:1 y PS 36:1).

El análisis de las clases de lípidos y la saturación de los lípidos sobreexpresados en cada muestra (Figura 3F, G) revela una predominancia de fosfolípidos, con la mayoría de los lípidos que exhiben un carácter insaturado. HT29 difiere claramente de las otras muestras, con una proporción del 18% de esteroles en las células y un 25% de esfingolípidos en los exosomas. Aunque los perfiles lipídicos de los lípidos sobreexpresados en las diferentes muestras muestran tendencias comparables, no son idénticos; estas diferencias revelan firmas lipídicas específicas únicas para cada tipo de muestra, destacando distintas adaptaciones metabólicas adaptadas a los roles biológicos de las células individuales y sus exosomas.

Además, estas observaciones son consistentes con estudios comparativos previos del contenido de lípidos en células y exosomas, que sugieren procesos de clasificación sofisticados que regulan finamente la composición de las vesículas (Vestad et al. ^[2017]) (revisado en Becker et al. ^[2016]). Estos hallazgos destacan las diferencias clave entre los exosomas derivados del cáncer y sus células parentales: enriquecimiento de EM y CE junto con el agotamiento de PE y LPC, así como un mayor contenido de lípidos saturados en comparación con las muestras no cancerosas.

Comparación global de los perfiles lipídicos en todas las muestras

Para el análisis comparativo de todas las muestras (Figura 4A), el análisis de componentes principales (PCA) demostró una agrupación distinta de las muestras en función de su perfil lipídico general, con las células y los exosomas agrupados por separado (Figura 4B). Además, para el análisis comparativo de las células (Figura 4C), y luego de los exosomas (Figura 4I), el PCA demostró una clara separación entre las células cancerosas y las no cancerosas (Figura 4D) y entre los exosomas derivados de células cancerosas y los exosomas derivados de células no cancerosas (Figura 4J). El análisis de superposición de especies de lípidos (Figura 4E) reveló además que, si bien 111 especies de lípidos se comparten entre todos los tipos de células, cada línea celular exhibe firmas lipídicas únicas en proporciones variables: MP41 (melanoma uveal, 39 especies), MEL270 (melanoma uveal, 11 especies), OMM2.5 (metástasis hepática, 65 especies), HT29 (adenocarcinoma colorrectal, 6 especies), CCD-18Co (línea no cancerosa, 10 especies) y BJ (línea no cancerosa, 5 especies). Un patrón similar emerge en los exosomas derivados de las células, donde las firmas lipídicas únicas varían significativamente: exosomas MP41 (16 especies), exosomas MEL270 (33 especies), exosomas OMM2.5 (34 especies), exosomas HT29 (10 especies), exosomas CCD-18Co (9 especies) y exosomas BJ (2 especies) (Figura 4K).

El análisis del perfil de expresión de los lípidos compartidos en todas las líneas celulares revela patrones de abundancia distintivos característicos de cada tipo de célula (Figura 4F). Los datos del mapa de calor demuestran patrones de expresión de lípidos compartidos, con ciertas especies de lípidos que muestran una expresión consistente en las células cancerosas, mientras que otras exhiben un enriquecimiento específico del cáncer. Por ejemplo, PC 30:0 se expresó en gran medida en las células MP41, MEL270 y OMM2.5, pero se detectó débilmente en las células HT29. Por el contrario, PE 38:4 mostró niveles de expresión relativamente consistentes en las líneas celulares. Estos hallazgos sugieren una regulación diferencial del metabolismo de los lípidos adaptada a los requisitos funcionales y las identidades biológicas de los tipos de células individuales. Aunque algunas especies de lípidos mantienen patrones de abundancia similares entre las células y sus exosomas, el mapa de calor de los exosomas (Figura 4L) revela que cada tipo de célula exhibe un enriquecimiento o agotamiento selectivo de especies de lípidos específicas en sus exosomas, lo que indica que operan distintos mecanismos de clasificación de lípidos durante la biogénesis de los exosomas.

Basándose en el análisis de los perfiles lipídicos compartidos en todas las muestras, el examen detallado de las líneas celulares individuales y sus exosomas revela firmas lipídicas únicas y proporciones distintas de clases de lípidos y niveles de saturación (Figura 4G (células) y Figura 4M (exosomas)), lo que enfatiza aún más las adaptaciones lipídicas específicas del tipo de célula. Entre las células cancerosas, MP41 (melanoma uveal) exhibe predominantemente fosfolípidos (82%) con un alto contenido de poliinsaturados (74%), mientras que MEL270 (melanoma uveal) muestra una distribución única con fosfolípidos (55%), lisofosfolípidos (27%) y es la única línea celular cancerosa que contiene esteroles significativos (18%). OMM2.5 (metástasis hepática) mantiene altos niveles de fosfolípidos (81%) con el mayor contenido de poliinsaturados (85%) entre las células cancerosas, mientras que HT29 (adenocarcinoma colorrectal) muestra el menor contenido de fosfolípidos (48%) con una presencia significativa de lisofosfolípidos (37%). Los exosomas (Figura 4M) demuestran patrones de clasificación notablemente distintos: los exosomas MP41 muestran un perfil único con una distribución equitativa entre fosfolípidos y lisofosfolípidos (40% cada uno) y son los únicos exosomas cancerosos que contienen tanto esfingolípidos (10%) como esteroles (10%). Por el contrario, los exosomas MEL270 muestran un marcado enriquecimiento de fosfolípidos (94%) con un contenido mínimo de lisofosfolípidos (6%), mientras que los exosomas OMM2.5 están compuestos exclusivamente por fosfolípidos (100%). Los exosomas HT29 mantienen un alto contenido de fosfolípidos (79%) con niveles moderados de lisofosfolípidos (21%). Los perfiles de saturación revelan patrones específicos del cáncer: si bien las células cancerosas generalmente prefieren las especies poliinsaturadas (60%-85%), sus exosomas muestran cambios drásticos en los niveles de saturación. Los exosomas MP41 exhiben de manera única un alto contenido de monoinsaturados (70%) con un contenido mínimo de especies poliinsaturadas (10%), mientras que los exosomas MEL270 y OMM2.5 muestran patrones de saturación idénticos con lípidos predominantemente poliinsaturados (81%). Las listas de lípidos únicos de las células y los exosomas se especifican en la Figura 4H (células) y la Figura 4N (exosomas).

Análisis comparativo de los perfiles del cáncer frente a los perfiles no cancerosos: identificación de firmas específicas del cáncer

Esta sección explora las diferencias fundamentales entre los perfiles lipídicos de las células cancerosas y las no cancerosas (Figura 5A), así como sus exosomas (Figura 5K). Al combinar un análisis sistemático de las clases de lípidos/familias, los perfiles de ácidos grasos y las composiciones de las balsas lipídicas, destacamos las firmas específicas del cáncer.

Distribución de la familia de lípidos y patrones de saturación

La distribución de las clases de lípidos revela que los fosfolípidos constituyen las principales especies de lípidos tanto en las muestras cancerosas como en las no cancerosas (74% en las células cancerosas, 67% en las células no cancerosas; 71% en los exosomas derivados de células cancerosas, 68% en los exosomas derivados de células no cancerosas) (Figura 5B, L), mientras que el análisis de saturación muestra patrones similares, con aproximadamente un 15% de lípidos saturados, un 20% de lípidos monoinsaturados y un 65% de lípidos poliinsaturados (Figura 5C, M).

Los perfiles de ácidos grasos revelan la remodelación específica del cáncer

Para analizar los patrones de FA en las células cancerosas y no cancerosas, nos centramos en clases de lípidos específicas que contienen cadenas de FA definidas: lisofosfolípidos (ácido lisofosfatídico (LPA), LPC, lisofosfatidiletanolamina (LPE), LPI, lisofosfatidilserina (LPS) y lisofosfatidilglicerol (LPG); cadena de FA única) y ácido fosfatídico (PA; dos cadenas de FA) (revisado en Szlasa et al. ^[2020]). Estas especies de lípidos son particularmente relevantes, ya que contienen restos de FA bien caracterizados y desempeñan un papel crucial en la señalización de las células cancerosas y la organización de las membranas (Emoto et al. ^[2017]) (revisado en Gomez-Larrauri et al. ^[2023]; Kaffe et al. ^[2024]; Koundouros y Poulogiannis ^[2020]; Nagarajan et al. ^[2021]). La distribución general de lípidos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados se comparó entre las células cancerosas y no cancerosas/exosomas (Figura 2D), proporcionando la base para una investigación más detallada de los patrones de FA dentro de familias de lípidos específicas (Tabla S5).

En las células cancerosas (MP41, MEL270, OMM2.5 y HT29), la proporción de ácidos grasos saturados (11,8%-16,7%) fue consistentemente mayor que en las células no cancerosas (9,6%-11,5%), en línea con los hallazgos previos sobre la composición de la membrana de las células cancerosas (revisado en Szlasa et al. ^[2020]). Curiosamente, esta tendencia se amplificó aún más en los exosomas derivados del cáncer, donde los FA saturados alcanzaron hasta el 29,2% en los exosomas MP41 (melanoma uveal) en comparación con su contenido celular (11,8%), un fenómeno que se informó previamente en las vesículas derivadas del cáncer (revisado en Skotland et al. ^[2017]). Por el contrario, las células no cancerosas y sus exosomas mantuvieron perfiles de FA más equilibrados, con los exosomas BJ que mostraron la mayor proporción de especies poliinsaturadas (82,6%), lo que respalda estudios previos sobre la homeostasis de la membrana de las células no cancerosas (revisado en Rog y Vattulainen ^[2014]).

Además, el número total de especies que contienen FA varió significativamente entre las células (51-60 especies) y los exosomas (15-47 especies), lo que indica un empaquetamiento selectivo de especies de lípidos específicas en los exosomas.

Composición de las balsas lipídicas: alteraciones relacionadas con la progresión tumoral

En las células cancerosas, las balsas lipídicas sufren alteraciones significativas, incluido el aumento del contenido de colesterol y la alteración de la composición de los esfingolípidos, lo que contribuye a la progresión tumoral y la metástasis al afectar la fluidez de la membrana, la transducción de señales, la migración celular, la invasión y la formación de exosomas (Murai ^[2012]) (revisado en Mollinedo y Gajate ^[2015]). En este contexto, nuestro análisis lipídico reveló patrones distintos en la distribución de los componentes de las balsas lipídicas entre las células y sus exosomas correspondientes (Tabla S6).

En resumen, las células cancerosas presentan niveles variables de componentes de las balsas lipídicas: el colesterol éster (CE) oscila entre el 3,83 % en MP41 (melanoma uveal) y el 6,90 % en OMM2.5 (metástasis hepática), el esfingomielina (SM) varía del 3,51 % en MP41 al 6,15 % en HT29 (adenocarcinoma colorrectal) y la ceramida (Cer) muestra niveles notablemente bajos (0,31 %–1,05 %). Las células no cancerosas mantienen niveles más consistentes de estos componentes (CE: 4,86 %–5,77 %; SM: 3,85 %–4,00 %; Cer: 0,86 %–1,15 %). Esta variabilidad en los lípidos formadores de balsas en las células cancerosas sugiere una alteración de la organización de la membrana, lo que podría afectar a las plataformas de señalización cruciales para la progresión tumoral. Los exosomas (EV) muestran un enriquecimiento significativo en la mayoría de los componentes de las balsas, con un CE que presenta una abundancia relativa 2 a 3 veces mayor (7,11 %–10,29 % en los EV cancerosos frente a 8,54 %–10,67 % en los EV no cancerosos) y el SM que presenta un enriquecimiento aún mayor (8,89 %–12,25 % en los EV cancerosos y 9,05 %–12,92 % en los EV no cancerosos). Sin embargo, los niveles de Cer siguen siendo bajos en los EV (0,44 %–0,98 % en los EV cancerosos; 0,50 %–1,69 % en los EV no cancerosos), lo que sugiere una clasificación selectiva de componentes específicos de las balsas durante la formación de los EV.

Firmas lipídicas únicas

El análisis de superposición de especies lipídicas que compara las células cancerosas con las células no cancerosas (Figura 5D) y los EV derivados de células cancerosas con los EV derivados de células no cancerosas (Figura 5N) identificó firmas lipídicas específicas. Lo más importante es que el análisis de especies lipídicas únicas en las células cancerosas revela una predominancia de fosfolípidos (95 %) con una baja proporción de esteroles (5 %), caracterizado por un 32 % de lípidos monoinsaturados y un 68 % de lípidos poliinsaturados (Figura 5F). Los EV derivados de células cancerosas muestran un perfil distinto con un 83 % de fosfolípidos y un 17 % de esfingolípidos, que comprenden un 13 % de lípidos saturados, un 22 % de lípidos monoinsaturados y un 65 % de lípidos poliinsaturados (Figura 5P). Los perfiles de expresión (Figura 5E (células) y Figura 5O (EV)) muestran picos distintos para diferentes familias de lípidos, incluido la sobreexpresión de PI, PE y PS tanto en las células cancerosas como en los EV, y una fuerte expresión de SM solo en los EV cancerosos. Encontramos 19 especies lipídicas únicas de las células cancerosas (CE 30:1 + NH4, PA 34:1, PA 36:2, PC 36:1 + AcO, PE 34:2, PE 40:8, PE 40:8 + AcO, PE 44:6, PI 24:5, PI 26:5, PI 28:3, PI 32:3, PI 34:2, PI 34:8, PI 34:9, PS 32:1, PS 40:1, PS 40:7 y PS 42:1) (detalles en la Figura 5G) y 23 especies lipídicas únicas de los EV cancerosos (PA 34:1, PC 28:6, PC 34:2, PC 36:0, PE 34:1 + AcO, PE 36:1 + AcO, PE 38:0 + AcO, PE 38:1, PI 28:4, PI 36:4, PI 36:7, PI 38:10, PI 38:4, PI 38:6, PI 38:7, PS 34:1, PS 36:2, PS 40:8, PS 42:7, SM 32:2;3, SM 40:0;3, SM 40:4;3 y SM 42:3;2) (detalles en la Figura 5Q) en comparación con las muestras no cancerosas. En particular, tras una extensa revisión de la literatura utilizando múltiples bases de datos científicas, descubrimos que ninguna de estas especies lipídicas específicas se ha notificado previamente en estudios sobre el cáncer. Si bien muchas publicaciones han descrito diferencias en la expresión de lípidos a nivel de familia/clase en el cáncer, nuestro estudio proporciona información clave adicional al especificar/identificar las especies moleculares precisas.

Lípidos expresados diferencialmente como biomarcadores

El análisis de abundancia diferencial utilizando gráficos de volcán (log2FC > 2 y log2FC < -2, p < 0,05) revela patrones de regulación distintos entre las muestras cancerosas y no cancerosas (Figura 5H (células) y Figura 5R (EV)). Como sugieren otros, los lípidos expresados diferencialmente pueden representar actores clave en las vías metabólicas desreguladas en las células cancerosas, o posibles mediadores de la comunicación intercelular tumoral a través de los EV (Deep y Schlaepfer ^[2016]; Huang y Freter ^[2015]). Para identificar firmas lipídicas con una relevancia más amplia más allá de los efectos específicos del tejido, analizamos un panel de líneas celulares cancerosas y no cancerosas que abarcan múltiples orígenes tisulares (ocular, colorrectal y dérmico). Este enfoque multilineal permite la identificación de alteraciones lipídicas que se asocian de forma consistente con la malignidad en diversos contextos celulares, diferenciándolas de las variaciones específicas del tejido.

En este contexto, identificamos varias especies lipídicas de fosfolípidos como posibles biomarcadores diagnósticos y terapéuticos (Figura 5I-J (células), Figura 5S-T (EV) y Tabla S7). Estos candidatos (PE 32:0, PE 32:1, PE 38:2 y PG 34:1 en las células cancerosas; y PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2 y PS 36:1 en los EV derivados de células cancerosas) prometen como marcadores diagnósticos debido a su sobreexpresión consistente en múltiples líneas celulares cancerosas en comparación con las células no cancerosas, y como objetivos terapéuticos debido a su participación en procesos celulares clave (revisado en Fu et al. ^[2020]).

Validación cruzada con lipidomas del plasma de pacientes

Para evaluar la relevancia traslacional, comparamos nuestros perfiles con la lipidómica del plasma de cinco tipos de cáncer (Lee et al. ^[2019]). El análisis del diagrama de Venn (Figura S3) identificó 11 especies lipídicas compartidas entre los tres conjuntos de datos: el de Lee et al. (n = 50 lípidos), nuestras células cancerosas (n = 130) y nuestros EV derivados de células cancerosas (n = 129): PC 34:2, PC 36:2, PC 36:3, PC 36:4, PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2, PE 38:4, PE 38:5, PE 40:5 y PE 40:6. En particular, los principales candidatos de EV, PE 34:1, PE 36:1 y PE 36:2 (Figura 5T), se conservan, lo que vincula las firmas de EV celulares con los biomarcadores del cáncer circulantes.

Validación ortogonal en diferentes plataformas analíticas

Para fortalecer la reproducibilidad y abordar posibles sesgos específicos de la plataforma, analizamos estudios de lipidómica publicados que emplean técnicas ortogonales (Tabla S8). Nuestros datos de LC-MS/MS que muestran un enriquecimiento consistente de PE, PC, PG y PS en los EV cancerosos en comparación con las células/controles parentales se alinean con los hallazgos de GC-MS, RMN, TLC-MS y MS de imagen en diversos modelos de cáncer (células, plasma y tejido). Esta convergencia entre plataformas valida la relevancia biológica de las firmas lipídicas observadas más allá de la metodología de LC-MS/MS.

Comparación de lípidos comunes en células cancerosas frente a EV derivados de células cancerosas

El análisis comparativo entre los lípidos comunes de las líneas celulares cancerosas incluidas en este estudio y los de sus EV (Figura 5U) reveló patrones de tráfico lipídico distintos, lo que es consistente con una biogénesis alterada y una carga lipídica de los EV tumorales que podrían estar relacionadas con la progresión del cáncer (Cheng et al. ^[2018]; Corn et al. ^[2020]). El diagrama de Venn identifica 77 lípidos comunes, con 53 lípidos únicos de las células cancerosas y 52 de los EV (Figura 5V). Además, los EV exhibieron un aumento notable de las esfingomielinas (SM, +10,89 %) y los fosfatidilcolinas (PC, +3,29 %), así como un ligero aumento de los esteroles (CE, +2,39 %) y los fosfatidilgliceroles (PG, +2,34 %) (Figura 5W). Por el contrario, se observaron pérdidas significativas de las lisofosfatidilcolinas (LPC, -9,99 %), las fosfatidiletanolaminas (PE, -3,73 %) y las fosfatidilserinas (PS, -2,96 %). El análisis de expresión diferencial reveló una sobreexpresión significativa (log2FC > 2, p < 0,05) de 12 fosfolípidos (PC 32:1, PE 34:0, PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2, PE 38:1, PE 38:2, PS 36:2, PS 36:3, PS 38:0 + NH4, PS 38:3 y PS 38:4) en las células cancerosas (Figura 5X, Z) y de 2 PC en los EV derivados de células cancerosas (PC 42:1 y PC 40:0) (Figura 5Y, Z). Los perfiles de saturación de los lípidos sobreexpresados (Figura 5Z) también difieren entre las células y los EV: las células cancerosas muestran una predominancia de lípidos poliinsaturados (50 %) en comparación con los saturados (17 %) y los monoinsaturados (33 %), mientras que los EV derivados de células cancerosas muestran una distribución equilibrada entre los lípidos saturados (50 %) y los monoinsaturados (50 %) pero no presentan lípidos poliinsaturados.

Análisis comparativo de los perfiles del tumor primario y metastásico

Nuestro análisis de las muestras MEL270 (melanoma uveal primario) y OMM2.5 (metástasis hepática) emparejadas (Figura 6A) reveló una conservación sustancial del perfil lipídico durante la progresión metastásica. Las células comparten 228 especies lipídicas, mientras que 59 especies son únicas de MEL270 y 91 de las células OMM2.5 (Figura 6B). De manera similar, sus EV exhibieron una superposición significativa, con 180 especies lipídicas compartidas, mientras que 47 eran únicas de los EV MEL270 y 29 de los EV OMM2.5 (Figura 6B). Un análisis exhaustivo del diagrama de Venn (Figura 6B) reveló relaciones complejas entre estas muestras, con 117 especies lipídicas compartidas entre los cuatro tipos de muestras (Figura 6C), mientras que se identificaron varias especies únicas en cada tipo de muestra (Figura 6D). Esta preservación parcial de la composición lipídica durante el proceso metastásico se alinea con los hallazgos de otros estudios que comparan el lipidoma de los tumores primarios y sus metástasis (Ye et al. ^[2018]) (revisado en Bianco et al. ^[2017]). La distribución de las clases de lípidos se mantiene notablemente consistente entre las muestras primarias y metastásicas, con los fosfolípidos que constituyen aproximadamente el 73 % del total de los lípidos en ambos tipos de células y sus EV (Figura 6E). Los esfingolípidos mantienen proporciones similares (~13 %) en ambos tipos de células y sus EV. El análisis de saturación confirmó que los lípidos saturados (~13 %), los lípidos monoinsaturados (~16 %) y los lípidos poliinsaturados (~71 %) se distribuyen de manera similar en todas las muestras (Figura 6F). El análisis de abundancia diferencial (log2FC > 2 y log2FC < -2, p < 0,05) entre las células primarias y metastásicas (Figura 6G-J) reveló que, si bien las células mostraron algunas especies significativamente moduladas, sus EV no mostraron diferencias significativas en la abundancia de lípidos.

Implicaciones de las firmas lipídicas específicas del cáncer

En conjunto, los resultados obtenidos para el análisis comparativo de los perfiles de cáncer frente a los perfiles no cancerosos destacan los mecanismos de clasificación lipídica específicos del tipo de cáncer y las adaptaciones a los distintos requisitos celulares, como lo demuestran los perfiles lipídicos únicos observados en las células cancerosas y sus EV derivados. En particular, muchas de estas especies lipídicas representan hallazgos novedosos en la investigación del cáncer, lo que proporciona detalles moleculares sin precedentes más allá de los análisis de nivel de familia/clase de lípidos que se informan habitualmente en la literatura. Estos resultados enfatizan el papel fundamental de la regulación de los lípidos en la progresión del cáncer, en particular en el empaquetamiento selectivo de los lípidos en los EV, lo que puede influir en la comunicación intercelular y el desarrollo tumoral. Al identificar firmas lipídicas moleculares específicas, nuestro trabajo abre nuevas vías para explorar los biomarcadores diagnósticos y los objetivos terapéuticos en la lipidómica del cáncer. Es importante señalar que la "clasificación lipídica específica del cáncer" mencionada aquí se refiere a las tendencias generales que distinguen las células cancerosas de las células no cancerosas, en lugar de implicar perfiles lipídicos idénticos en todos los tipos de cáncer. Si bien ciertos cambios lipídicos son recurrentes en múltiples modelos de cáncer, cada línea celular cancerosa conserva características lipídicas únicas dictadas por su tejido de origen, su trasfondo genético y sus requisitos funcionales, como lo ilustran las diferencias observadas entre las líneas celulares de melanoma uveal en la Figura 4F.

Distribución de la familia de lípidos y patrones de saturación

La distribución de las clases de lípidos revela que los fosfolípidos constituyen las principales especies lipídicas tanto en las muestras cancerosas como en las no cancerosas (74 % en las células cancerosas, 67 % en las células no cancerosas; 71 % en los EV derivados de células cancerosas, 68 % en los EV no cancerosos) (Figura 5B, L), mientras que el análisis de saturación muestra patrones similares, con aproximadamente un 15 % de lípidos saturados, un 20 % de lípidos monoinsaturados y un 65 % de lípidos poliinsaturados (Figura 5C, M).

Los perfiles de ácidos grasos revelan una remodelación específica del cáncer

Para analizar los patrones de AG en las células cancerosas y no cancerosas, nos centramos en clases de lípidos específicas que contienen cadenas de AG definidas: lisofosfolípidos (ácido lisofosfatídico (LPA), LPC, lisofosfatidiletanolamina (LPE), LPI, lisofosfatidilserina (LPS) y lisofosfatidilglicerol (LPG); cadena de AG única) y ácido fosfatídico (PA; dos cadenas de AG) (revisado en Szlasa et al. ^[2020]). Estas especies lipídicas son particularmente relevantes, ya que contienen restos de AG bien caracterizados y desempeñan un papel crucial en la señalización de las células cancerosas y la organización de la membrana (Emoto et al. ^[2017]) (revisado en Gomez-Larrauri et al. ^[2023]; Kaffe et al. ^[2024]; Koundouros y Poulogiannis ^[2020]; Nagarajan et al. ^[2021]). Se comparó la distribución general de lípidos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados entre las células y los EV cancerosos y no cancerosos (Figura 2D), lo que proporcionó la base para una investigación más detallada de los patrones de AG dentro de familias lipídicas específicas (Tabla S5).

En las células cancerosas (MP41, MEL270, OMM2.5 y HT29), la proporción de ácidos grasos saturados (11,8%–16,7%) fue consistentemente mayor que en las células no cancerosas (9,6%–11,5%), lo que coincide con hallazgos previos sobre la composición de la membrana de las células cancerosas (revisado en Szlasa et al. ^[2020]). Curiosamente, esta tendencia se amplificó aún más en los exosomas derivados del cáncer, donde los ácidos grasos saturados alcanzaron hasta el 29,2% en los exosomas de MP41 (melanoma uveal) en comparación con su contenido celular (11,8%), un fenómeno que se ha informado previamente en vesículas derivadas del cáncer (revisado en Skotland et al. ^[2017]). Por el contrario, las células no cancerosas y sus exosomas mantuvieron perfiles de ácidos grasos más equilibrados, con los exosomas de BJ que mostraron la mayor proporción de especies poliinsaturadas (82,6%), lo que respalda estudios previos sobre la homeostasis de la membrana de las células no cancerosas (revisado en Rog y Vattulainen ^[2014]).

Además, el número total de especies que contienen ácidos grasos varió significativamente entre las células (51–60 especies) y los exosomas (15–47 especies), lo que indica un empaquetamiento selectivo de especies lipídicas específicas en los exosomas.

Composición de las balsas lipídicas: alteraciones relacionadas con la progresión tumoral

En las células cancerosas, las balsas lipídicas experimentan alteraciones significativas, incluido un aumento del contenido de colesterol y una alteración de la composición de los esfingolípidos, lo que contribuye a la progresión y metástasis del tumor al afectar la fluidez de la membrana, la transducción de señales, la migración celular, la invasión y la formación de exosomas (Murai ^[2012]) (revisado en Mollinedo y Gajate ^[2015]). En este contexto, nuestro análisis lipídico reveló patrones distintos en la distribución de los componentes de las balsas lipídicas entre las células y sus exosomas correspondientes (Tabla S6).

En resumen, las células cancerosas muestran niveles variables de los componentes de las balsas lipídicas: el CE varía del 3,83% en MP41 (melanoma uveal) al 6,90% en OMM2.5 (metástasis hepática), el SM varía del 3,51% en MP41 al 6,15% en HT29 (adenocarcinoma colorrectal) y el Cer muestra niveles notablemente bajos (0,31%–1,05%). Las células no cancerosas mantienen niveles más consistentes de estos componentes (CE: 4,86%–5,77%; SM: 3,85%–4,00%; Cer: 0,86%–1,15%). Esta variabilidad en los lípidos que forman las balsas en las células cancerosas sugiere una alteración de la organización de la membrana, lo que podría afectar las plataformas de señalización cruciales para la progresión tumoral. Los exosomas demuestran un enriquecimiento significativo en la mayoría de los componentes de las balsas, con el CE que muestra una abundancia relativa 2–3 veces mayor (7,11%–10,29% en los exosomas de cáncer frente a 8,54%–10,67% en los exosomas no cancerosos) y el SM que muestra un enriquecimiento aún mayor (8,89%–12,25% en los exosomas de cáncer y 9,05%–12,92% en los exosomas no cancerosos). Sin embargo, los niveles de Cer siguen siendo bajos en los exosomas (0,44%–0,98% en los exosomas de cáncer; 0,50%–1,69% en los exosomas no cancerosos), lo que sugiere una clasificación selectiva de componentes específicos de las balsas durante la formación de exosomas.

Firmas lipídicas únicas

El análisis de superposición de especies lipídicas que compara las células cancerosas con las células no cancerosas (Figura 5D) y los exosomas derivados de células cancerosas con los exosomas derivados de células no cancerosas (Figura 5N) identificó firmas lipídicas específicas. Lo más importante es que el análisis de las especies lipídicas únicas en las células cancerosas revela una predominancia de fosfolípidos (95%) con una baja proporción de esteroles (5%), caracterizado por un 32% de lípidos monoinsaturados y un 68% de lípidos poliinsaturados (Figura 5F). Los exosomas derivados de células cancerosas muestran un perfil distinto con un 83% de fosfolípidos y un 17% de esfingolípidos, que comprenden un 13% de lípidos saturados, un 22% de lípidos monoinsaturados y un 65% de lípidos poliinsaturados (Figura 5P). Los perfiles de expresión (Figura 5E (células) y 5O (exosomas)) muestran picos distintos para diferentes familias de lípidos, incluido la sobreexpresión de PI, PE y PS tanto en las células cancerosas como en los exosomas, y una fuerte expresión de SM solo en los exosomas de cáncer. Encontramos 19 especies lipídicas únicas de las células cancerosas (CE 30:1 + NH4, PA 34:1, PA 36:2, PC 36:1 + AcO, PE 34:2, PE 40:8, PE 40:8 + AcO, PE 44:6, PI 24:5, PI 26:5, PI 28:3, PI 32:3, PI 34:2, PI 34:8, PI 34:9, PS 32:1, PS 40:1, PS 40:7 y PS 42:1) (detalles en la Figura 5G) y 23 especies lipídicas únicas de los exosomas de cáncer (PA 34:1, PC 28:6, PC 34:2, PC 36:0, PE 34:1 + AcO, PE 36:1 + AcO, PE 38:0 + AcO, PE 38:1, PI 28:4, PI 36:4, PI 36:7, PI 38:10, PI 38:4, PI 38:6, PI 38:7, PS 34:1, PS 36:2, PS 40:8, PS 42:7, SM 32:2;3, SM 40:0;3, SM 40:4;3 y SM 42:3;2) (detalles en la Figura 5Q) en comparación con las muestras no cancerosas. En particular, tras una extensa revisión de la literatura utilizando múltiples bases de datos científicas, descubrimos que ninguna de estas especies lipídicas específicas se ha informado previamente en estudios de cáncer. Si bien muchas publicaciones han descrito diferencias en la expresión de lípidos a nivel de familia/clase en el cáncer, nuestro estudio proporciona información clave adicional al especificar/identificar las especies moleculares precisas.

Lípidos expresados diferencialmente como biomarcadores

El análisis de abundancia diferencial utilizando diagramas de dispersión (log2FC > 2 y log2FC < -2, p < 0,05) revela patrones de regulación distintos entre las muestras de cáncer y las muestras no cancerosas (Figura 5H (células) y 5R (exosomas)). Como han sugerido otros, los lípidos expresados diferencialmente pueden representar actores clave en las vías metabólicas desreguladas en las células cancerosas, o posibles mediadores de la comunicación intercelular del tumor a través de los exosomas (Deep y Schlaepfer ^[2016]; Huang y Freter ^[2015]). Para identificar firmas lipídicas con una relevancia más amplia más allá de los efectos específicos del tejido, analizamos un panel de líneas celulares de cáncer y no cáncer que abarcan múltiples orígenes de tejido (ocular, colorrectal y dérmico). Este enfoque multilineal permite la identificación de alteraciones lipídicas que se asocian de manera consistente con la malignidad en diversos contextos celulares, lo que las distingue de las variaciones específicas del tejido.

En este contexto, identificamos varias especies lipídicas de fosfolípidos como posibles biomarcadores diagnósticos y terapéuticos (Figura 5I–J (células), Figura 5S–T (exosomas) y Tabla S7). Estos candidatos (PE 32:0, PE 32:1, PE 38:2 y PG 34:1 en las células cancerosas; y PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2 y PS 36:1 en los exosomas derivados de células cancerosas) prometen como marcadores diagnósticos debido a su sobreexpresión consistente en múltiples líneas celulares de cáncer en comparación con las células no cancerosas, y como objetivos terapéuticos debido a su participación en procesos celulares clave (revisado en Fu et al. ^[2020]).

Validación cruzada con lipidomas del plasma de pacientes

Para evaluar la relevancia traslacional, comparamos nuestros perfiles con la lipidómica del plasma de cinco tipos de cáncer (Lee et al. ^[2019]). El análisis del diagrama de Venn (Figura S3) identificó 11 especies lipídicas compartidas entre los tres conjuntos de datos: el de Lee et al. (n = 50 lípidos), nuestras células de cáncer (n = 130) y nuestros exosomas derivados de células cancerosas (n = 129): PC 34:2, PC 36:2, PC 36:3, PC 36:4, PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2, PE 38:4, PE 38:5, PE 40:5 y PE 40:6. En particular, los principales candidatos de exosomas PE 34:1, PE 36:1 y PE 36:2 (Figura 5T) se conservan, lo que vincula las firmas de exosomas celulares con los biomarcadores de cáncer circulantes.

Validación ortogonal en diferentes plataformas analíticas

Para fortalecer la reproducibilidad y abordar posibles sesgos específicos de la plataforma, examinamos estudios de lipidómica publicados que emplean técnicas ortogonales (Tabla S8). Nuestros datos de LC-MS/MS que muestran un enriquecimiento consistente de PE, PC, PG y PS en los exosomas de cáncer frente a las células/controles parentales se alinean con los hallazgos de GC-MS, RMN, TLC-MS y MS de imagen en diversos modelos de cáncer (células, plasma y tejido). Esta convergencia entre plataformas valida la relevancia biológica de nuestras firmas lipídicas observadas más allá de la metodología de LC-MS/MS.

Comparación de lípidos comunes en células cancerosas frente a exosomas derivados de células cancerosas

El análisis comparativo entre los lípidos comunes de las líneas celulares de cáncer incluidas en este estudio y los de sus exosomas (Figura 5U) reveló patrones distintos de tráfico de lípidos, lo que es consistente con una biogénesis alterada y una carga lipídica de los exosomas tumorales que podrían estar relacionadas con la progresión del cáncer (Cheng et al. ^[2018]; Corn et al. ^[2020]). El diagrama de Venn identifica 77 lípidos comunes, con 53 lípidos únicos de las células cancerosas y 52 de los exosomas (Figura 5V). Además, los exosomas exhibieron un notable aumento en las esfingomielinas (SM, +10,89%) y los fosfatidilcolinas (PC, +3,29), así como un ligero aumento en los esteroles (CE, +2,39) y los fosfatidilgliceroles (PG, +2,34) (Figura 5W). Por el contrario, se observaron pérdidas significativas de las lisofosfatidilcolinas (LPC, −9,99%), las fosfatidiletanolaminas (PE, −3,73%) y los fosfatidilserinas (PS, −2,96%). El análisis de expresión diferencial reveló una sobreexpresión significativa (log2FC > 2, p < 0,05) de 12 fosfolípidos (PC 32:1, PE 34:0, PE 34:1, PE 36:1, PE 36:2, PE 38:1, PE 38:2, PS 36:2, PS 36:3, PS 38:0 + NH4, PS 38:3 y PS 38:4) en las células cancerosas (Figura 5X, Z) y de 2 PC en los exosomas derivados de células cancerosas (PC 42:1 y PC 40:0) (Figura 5Y, Z). Los perfiles de saturación de los lípidos sobreexpresados (Figura 5Z) también difieren entre las células y los exosomas: las células cancerosas muestran una predominancia de lípidos poliinsaturados (50%) en comparación con los saturados (17%) y los monoinsaturados (33%), mientras que los exosomas derivados de células cancerosas muestran una distribución equilibrada entre los lípidos saturados (50%) y los monoinsaturados (50%), pero no muestran lípidos poliinsaturados.

Análisis comparativo de los perfiles del tumor primario y los perfiles metastásicos

Nuestro análisis de las muestras de MEL270 (melanoma uveal primario) y OMM2.5 (metástasis hepática) (Figura 6A) reveló una conservación sustancial del perfil lipídico durante la progresión metastásica. Las células comparten 228 especies lipídicas, mientras que 59 especies son únicas de MEL270 y 91 de las células OMM2.5 (Figura 6B). De manera similar, sus exosomas exhibieron una superposición significativa, con 180 especies lipídicas compartidas, mientras que 47 fueron únicas de los exosomas de MEL270 y 29 de los exosomas de OMM2.5 (Figura 6B). Un análisis exhaustivo del diagrama de Venn (Figura 6B) reveló relaciones complejas entre estas muestras, con 117 especies lipídicas compartidas entre los cuatro tipos de muestras (Figura 6C), mientras que se identificaron varias especies únicas en cada tipo de muestra (Figura 6D). Esta preservación parcial de la composición lipídica durante el proceso metastásico se alinea con los hallazgos de otros estudios que comparan el lipidoma de los tumores primarios y sus metástasis (Ye et al. ^[2018]) (revisado en Bianco et al. ^[2017]). La distribución de las clases de lípidos se mantiene notablemente consistente entre las muestras primarias y metastásicas, con los fosfolípidos que constituyen aproximadamente el 73% del total de los lípidos en ambos tipos de células y sus exosomas (Figura 6E). Los esfingolípidos mantienen proporciones similares (∼13%) en ambos tipos de células y sus exosomas. El análisis de saturación confirmó que los lípidos saturados (∼13%), los lípidos monoinsaturados (∼16%) y los lípidos poliinsaturados (∼71%) se distribuyen de manera similar en todas las muestras (Figura 6F). El análisis de abundancia diferencial (log2FC > 2 y log2FC < -2, p < 0,05) entre las células primarias y metastásicas (Figura 6G–J) reveló que, si bien las células mostraron algunas especies significativamente moduladas, sus exosomas no mostraron diferencias significativas en la abundancia de lípidos.

Implicaciones de las firmas lipídicas específicas del cáncer

En conjunto, los resultados obtenidos para el análisis comparativo de perfiles de cáncer frente a perfiles no cancerosos ponen de manifiesto mecanismos de clasificación lipídica específicos del tipo de cáncer y adaptaciones a distintos requisitos celulares, como se evidencia en los perfiles lipídicos únicos observados en las células cancerosas y sus EVs derivados. Es importante destacar que muchas de estas especies lipídicas representan hallazgos novedosos en la investigación del cáncer, proporcionando detalles moleculares sin precedentes más allá de los análisis a nivel de familias lipídicas que se suelen informar en la literatura. Estos resultados enfatizan el papel fundamental de la regulación lipídica en la progresión del cáncer, particularmente en el empaquetamiento selectivo de lípidos en los EVs, lo que puede influir en la comunicación intercelular y el desarrollo tumoral. Al identificar firmas lipídicas moleculares específicas, nuestro trabajo abre nuevas vías para explorar biomarcadores diagnósticos y dianas terapéuticas en la lipidómica del cáncer. Es importante señalar que la "clasificación lipídica específica del cáncer" mencionada aquí se refiere a las tendencias generales que distinguen las células cancerosas de las no cancerosas, en lugar de implicar perfiles lipídicos idénticos en todos los tipos de cáncer. Si bien ciertos cambios lipídicos son recurrentes en múltiples modelos de cáncer, cada línea celular cancerosa conserva características lipídicas únicas dictadas por su tejido de origen, su trasfondo genético y sus requisitos funcionales, como se ilustra en las diferencias observadas entre las líneas celulares de melanoma uveal en la Figura 4F.

Validación funcional de liposomas derivados de EVs

El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común a nivel mundial (1,9 millones de nuevos casos en 2022) y presenta un alto potencial metastásico mediado por EVs (Bray et al. ^[2024]; Siegel et al. ^[2024]). Para validar las consecuencias funcionales de la clasificación lipídica de los EVs, generamos liposomas a partir de lípidos de células HT29 y lípidos de EVs de HT29, lo que permitió una comparación directa de la composición celular parental frente a la composición enriquecida en EVs empaquetada selectivamente en un modelo de adenocarcinoma controlado. Los liposomas DMPC-Chol (1:1) sirvieron como control sintético. Fundamentalmente, la reconstitución de lípidos nativos produjo liposomas de alta eficiencia (>1010 partículas/mL) con fidelidad físico-química a los EVs de origen (Figura 7A-C), lo que demuestra una traducción exitosa de los datos lipidómicos en nanopartículas sintéticas que imitan los EVs. A continuación, la cinética de captación (Figura 7D) destacó aún más la influencia de la composición lipídica en la internalización celular. Más concretamente, los EVs HT29 naturales y los liposomas de lípidos de células HT29, a pesar de tener una confluencia inicial similar (∼30%, Figura 7E), mostraron que los liposomas de lípidos de células HT29 tenían una captación moderadamente menor, lo que sugiere la contribución de lípidos únicos de los EVs, proteínas de membrana y curvatura a nanoescala. En contraste, los liposomas de lípidos de EVs HT29 superaron a los controles DMPC-Chol (1:1) a pesar de tener una confluencia baja equivalente (∼20%), lo que confirmó la funcionalidad superior de los lípidos nativos sobre los fosfolípidos sintéticos. La cinética de captación (Figura 7D) demostró que los EVs naturales mostraron la mayor captación celular, y los liposomas cargados con lípidos celulares y lípidos de EVs también mostraron una captación significativamente mejor que los liposomas DMPC:colesterol (1:1), lo que confirmó la funcionalidad superior de los lípidos nativos sobre los fosfolípidos sintéticos.

Implicaciones terapéuticas

Como nuestro grupo ha destacado recientemente (Chen et al. ^[2025]), los EVs han surgido como herramientas terapéuticas prometedoras, particularmente como sistemas de administración de fármacos y para el direccionamiento de células cancerosas, debido a su biocompatibilidad natural y su capacidad para transportar diversos agentes terapéuticos (Chen et al. ^[2025]). En este contexto, para comprender mejor el potencial de los lípidos específicos del cáncer identificados en nuestro estudio para informar el diseño de vehículos terapéuticos, primero realizamos una revisión sistemática de la literatura sobre la aplicación de la lipidómica al estudio del cáncer y el desarrollo de nanopartículas lipídicas para el tratamiento del cáncer (Figura 8). Al buscar en las bases de datos CINAHL, Cochrane Library, Embase, Medline y Web of Science, identificamos 97 artículos relevantes, incluidos 54 estudios originales y 43 revisiones. Los estudios originales se centraron en varios tipos de cáncer, incluidos el de mama, próstata, glioma, colon y pulmón, e informaron sobre alteraciones recurrentes de ciertas clases de lípidos, como los fosfolípidos, esfingolípidos y ácidos grasos, en las células tumorales y sus EVs. Curiosamente, 15 estudios utilizaron datos de lipidómica para diseñar nanopartículas lipídicas (liposomas, LNPs) adecuadas para dirigir las células cancerosas o administrar fármacos anticancerígenos. Estos resultados destacan el potencial de los lípidos específicos del cáncer para el desarrollo de nuevos vehículos terapéuticos.

A continuación, realizamos un análisis comparativo entre nuestros datos y los lípidos que se utilizan actualmente en aplicaciones terapéuticas (Tabla 1). Este análisis reveló varias características interesantes de nuestros lípidos específicos del cáncer que podrían mejorar los sistemas de administración de fármacos. Estudios recientes han demostrado que los esfingolípidos modificados pueden mejorar la administración terapéutica y la eficiencia del direccionamiento tumoral (Wang et al. ^[2024]). Las especies lipídicas únicas identificadas en nuestro estudio (incluidos PE 40:8 + AcO y PE 44:6 (Figura 4D; células), SM 32:2;3, SM 40:0;3, SM 40:4;3, PS 40:8 y PS 42:7 (Figura 4K; EVs)) muestran características estructurales distintas en comparación con los lípidos terapéuticos convencionales (como la dioleoilfosfatidilserina (DOPS)). Estas características estructurales, particularmente sus diversas longitudes de cadena y modificaciones específicas, podrían mejorar potencialmente su utilidad en aplicaciones de administración de fármacos, ya que los sistemas de administración basados en esfingolípidos han surgido como un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer (revisado en Tea et al. ^[2020]).

Además, basándonos en nuestro análisis lipidómico que muestra distribuciones lipídicas únicas en las células cancerosas y sus EVs (Figura 4H, N y 5G, Q), estos lípidos representan candidatos prometedores para el desarrollo de LNPs biomiméticos (revisado en Chen et al. ^[2025]). Los perfiles lipídicos del par isogénico MEL270/OMM2.5, que representan respectivamente un tumor primario y su metástasis hepática derivados del mismo paciente, ofrecen perspectivas particularmente interesantes. De hecho, la notable conservación del perfil lipídico en los EVs metastásicos (OMM2.5), que mantienen el 81% de los lípidos poliinsaturados de la línea primaria y al mismo tiempo presentan un enriquecimiento específico en esfingomielinas (+5% en los EVs MEL270 y +6,78% en los EVs OMM2.5), sugiere un mecanismo de clasificación lipídica esencial para la diseminación hepática característica del melanoma uveal. Esta distintiva firma lipídica podría aprovecharse para diseñar sistemas de administración de fármacos dirigidos específicamente a las metástasis hepáticas, una necesidad clínica urgente dada la tropismo hepático y la letalidad de las metástasis del melanoma uveal (Karlsson et al. ^[2020]; Tsering et al. ^[2020]).

Discusión

Nuestro estudio presenta un análisis lipidómico en profundidad de diferentes líneas celulares cancerosas y sus EVs secretados, revelando firmas lipídicas únicas y posibles biomarcadores para la biología del cáncer. Un aspecto importante de nuestro trabajo radica en la caracterización físico-química de los EVs aislados de células cancerosas y no cancerosas. Nuestros resultados demuestran que los EVs exhiben propiedades distintas según su origen celular. Por ejemplo, los EVs de las células cancerosas exhiben un potencial zeta más negativo que los de las células no cancerosas, lo que podría reflejar diferencias en su composición y estabilidad de la membrana. Estos hallazgos se alinean con estudios previos que muestran que la composición lipídica de las membranas de los EVs influye en su captación por las células receptoras y en su capacidad para entregar su carga, modulando así su impacto funcional (revisado en Skotland et al. ^[2019]).

Nuestro análisis reveló firmas lipídicas únicas específicas de cada tipo de cáncer, lo que corrobora estudios comparativos de lipidómica previos, que muestran la existencia de perfiles lipídicos característicos de diferentes tipos de tumores (Guo et al. ^[2014]) (revisado en Perrotti et al. ^[2016]). Observamos marcadas diferencias en la distribución de las clases de lípidos y los niveles de saturación entre las líneas celulares, lo que sugiere adaptaciones específicas del metabolismo lipídico relacionadas con el origen tisular y el fenotipo tumoral de las células (revisado en Luo et al. ^[2017]). Estas adaptaciones probablemente implican alteraciones en la expresión y la actividad de las enzimas metabolizadoras de lípidos, que se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la progresión y la metástasis del cáncer (revisado en Guo et al. ^[2023]; Igal ^[2016]; Rohrig y Schulze ^[2016]).

Es importante destacar que encontramos que los EVs exhiben perfiles lipídicos parcialmente distintos de sus células de origen, lo que proporciona una sólida evidencia de la clasificación selectiva durante la biogénesis. Debido a la metodología basada en ultracentrifugación que utilizamos para aislar los EVs, es importante señalar que estos vesículas son predominantemente "similares a los exosomas", lo que representa poblaciones dinámicas que se originan en los MVB en lugar de directamente de la membrana plasmática, por lo que estas observaciones. Este enriquecimiento selectivo de especies lipídicas específicas en los EVs probablemente esté relacionado con sus funciones en la comunicación intercelular y la remodelación del microambiente tumoral (revisado en Skotland et al. ^[2017]). Estudios recientes han destacado la importancia de los lípidos en la regulación de la formación, la composición y la actividad biológica de los EVs (revisado en Record et al. ^[2018]; Skotland et al. ^[2020]). Por ejemplo, se ha demostrado que el enriquecimiento de ciertas especies lipídicas, como el colesterol y la esfingomielina, en las membranas de los EVs influye en sus propiedades físicas, su resistencia a la degradación y su capacidad para fusionarse con las células receptoras (revisado en Record et al. ^[2018]).

El papel de la organización de la membrana surgió como un factor crucial en la biogénesis y la función de los EVs. Las balsas lipídicas (microdominios de membrana enriquecidos en colesterol y esfingolípidos) desempeñan un papel crucial en estos mecanismos, así como en la señalización celular y la comunicación intercelular. En el contexto del cáncer, se ha demostrado que las células tumorales exhiben una mayor formación de balsas lipídicas, lo que promueve la señalización oncogénica y la resistencia al tratamiento (revisado en Mollinedo y Gajate ^[2020]). Nuestro estudio destaca un enriquecimiento específico de ciertas especies lipídicas, como la SM y la PE, dentro de los EVs derivados del cáncer en comparación con los EVs no cancerosos. Estos lípidos son componentes principales de las balsas lipídicas, lo que sugiere que estos microdominios de membrana podrían estar involucrados en la biogénesis y las funciones de los EVs tumorales. De hecho, se ha demostrado que las balsas lipídicas son sitios preferenciales para la formación y la gemación de los EVs (de Gassart et al. ^[2003]) (revisado en Pfrieger y Vitale ^[2018]).

Un análisis comparativo de los perfiles lipídicos de las células cancerosas y no cancerosas, así como de sus EVs, reveló alteraciones significativas del lipidoma en las células tumorales en comparación con las células no cancerosas, con una sobreexpresión de SM y PE. En particular, observamos alteraciones significativas en la composición de los ácidos grasos, y las células cancerosas mostraron niveles más altos de especies poliinsaturadas. Esta modificación de la saturación lipídica de la membrana podría contribuir a una mayor fluidez de la membrana y resistencia al estrés, características clave de las células cancerosas agresivas (Pohl y Jovanovic ^[2019]; XinRan Quan ^[2021]). El análisis de la composición lipídica revela además el enriquecimiento de componentes específicos de las balsas lipídicas, lo que indica una reorganización de estos microdominios de membrana que podría facilitar la señalización oncogénica (Mollinedo y Gajate ^[2020]; Skotland et al. ^[2020]).

Estas alteraciones se reflejan en los exosomas (EV) derivados del cáncer, lo que proporciona información sobre cómo las células cancerosas modulan su microentorno. Específicamente, el enriquecimiento de PE en los EV del cáncer parece reflejar su función en la promoción de la proliferación y supervivencia celular, así como su posible participación en la biogénesis de los EV y la clasificación de su contenido (Guo et al. ^[2014]; Skotland et al. ^[2019]). Además, el empaquetamiento selectivo de ciertas especies de lípidos en los EV del cáncer indica su impacto funcional en las células receptoras, como la promoción de la angiogénesis, la inmunomodulación o la reprogramación metabólica (revisado en Record et al. ^[2018]; Skotland et al. ^[2019]). Por ejemplo, los EV derivados de las células de cáncer de páncreas AsPC-1 transportan ácido araquidónico a los macrófagos, lo que induce un aumento de la producción de PGE2. Este mecanismo específico promueve la polarización de los macrófagos hacia un fenotipo M2 inmunosupresor, contribuyendo así al establecimiento de un microentorno pro-tumoral (Tian et al. ^[2023]; Vecchi et al. ^[2021]).

Para comprender mejor la dinámica del lipidoma durante la progresión del cáncer, analizamos la dinámica del lipidoma durante la progresión del melanoma uveal, comparando muestras del tumor primario (MEL270) y las metástasis hepáticas (OMM2.5) del mismo paciente (Figura 6). Este análisis comparativo de sus EV revela diferencias significativas en su composición lipídica, particularmente en las especies asociadas a las balsas lipídicas (SM, CE y Cer). Estas variaciones composicionales indican una reorganización de las balsas lipídicas durante la progresión metastásica, lo que contribuye a las propiedades pro-invasivas y pro-angiogénicas de los EV tumorales (revisado en Kholia et al. ^[2016]). La aparición de firmas moleculares distintivas durante la metástasis destaca la adaptación del metabolismo de los lípidos como un factor clave que permite a las células cancerosas diseminarse y colonizar órganos distantes (Pascual et al. ^[2017]). Los esfingolípidos, por ejemplo, son particularmente significativos, ya que desempeñan un papel clave en la supervivencia, proliferación e invasividad de las células cancerosas. Nuestros datos mostraron una presencia constante de esfingolípidos (∼11%) tanto en los EV primarios como en los metastásicos. Este mantenimiento de los esfingolípidos durante la transición metastásica, a pesar de los cambios en el entorno tisular, sugiere su importancia funcional crítica, y su enriquecimiento en los EV derivados de la metástasis indica su contribución al establecimiento de un nicho pre-metastásico en el hígado (revisado en Peinado et al. ^[2017]).

Nuestro perfil lipídico exhaustivo reveló una notable diversidad en las firmas lipídicas entre los diferentes tipos de cáncer. El empaquetamiento selectivo de especies lipídicas específicas en los EV refleja el estado metabólico y el potencial maligno de las células. Esto permite el análisis de los lipidomas de los EV circulantes para la detección y el seguimiento no invasivos del cáncer, así como la estratificación de pacientes basada en perfiles moleculares (Cheng et al. ^[2020]). Este enfoque podría mejorar significativamente la precisión del manejo del cáncer al permitir la identificación temprana de individuos de alto riesgo, la selección óptima de la terapia y la evaluación en tiempo real de la respuesta al tratamiento.

Curiosamente, nuestros datos también revelan que, si bien ciertas firmas lipídicas se conservan dentro de un tipo de tumor, existen diferencias notables entre las diferentes líneas celulares, incluso entre las líneas derivadas del mismo tipo de cáncer, como el melanoma uveal (MP41 vs. MEL270). Esta observación es consistente con estudios lipidómicos previos que demuestran que el lipidoma está determinado no solo por la identidad del tipo de tumor, sino también por el origen celular, el trasfondo genético y la adaptación a las condiciones de cultivo in vitro (Eiriksson et al. ^[2020]; Odenkirk et al. ^[2025]). Por ejemplo, el uso de un par isogénico (MEL270/OMM2.5) derivado del mismo paciente nos permitió distinguir entre los efectos del tipo de tumor y del tipo de célula, revelando características lipídicas tanto conservadas como únicas. Esta complejidad subraya la importancia de emplear múltiples modelos e, idealmente, muestras derivadas de pacientes para definir firmas lipídicas tumorales robustas. Este enfoque es esencial para tener en cuenta la heterogeneidad intratumoral y garantizar la relevancia traslacional de los biomarcadores lipidómicos en el cáncer. Además, la superposición observada de nuestros principales candidatos a biomarcadores de EV (por ejemplo, PE 34:1, PE 36:1 y PE 36:2) con los lipidomas plasmáticos de los pacientes en múltiples tipos de tumores (Lee et al. ^[2019]; Anal. Chim. Acta 2019 Sercombe et al. ^[2015]) proporciona evidencia preliminar que relaciona nuestros hallazgos celulares con la circulación clínica, al tiempo que enfatiza la necesidad de una validación directa con muestras de pacientes. Además, la robustez de nuestras firmas PE/PC/PG/PS se confirma de forma independiente en diferentes plataformas analíticas (Tabla S8), con una desregulación asociada al cáncer consistente informada por estudios de GC-MS, RMN, TLC-MS y espectrometría de masas por imagen, lo que refuerza la confianza en su relevancia biológica más allá de la metodología LC-MS/MS.

Estos hallazgos subrayan el potencial de los lípidos de los EV como biomarcadores para el diagnóstico y el seguimiento del cáncer. Los perfiles de las balsas lipídicas pueden discriminar entre tejidos sanos y tumorales, evaluar el grado y la etapa del tumor y servir como objetivos terapéuticos (Murai ^[2015]). Por ejemplo, la inhibición de enzimas clave involucradas en la síntesis de lípidos sobreexpresados, como las esfingomielinasas o las fosfolipasas, altera selectivamente el crecimiento de las células cancerosas, al tiempo que preserva los tejidos normales (Kosaka et al. ^[2013]). Además, las nanopartículas basadas en lípidos que imitan la composición de los EV del cáncer mejoran la administración dirigida de agentes terapéuticos a los sitios tumorales, al tiempo que minimizan los efectos fuera del objetivo (Beloribi-Djefaflia et al. ^[2015]). Además, nuestros hallazgos sobre la composición alterada de los ácidos grasos en las células cancerosas y los EV (con las células cancerosas que muestran entre el 11,8% y el 16,7% de ácidos grasos saturados frente al 9,6%-11,5% en las células no cancerosas, y hasta el 29,2% en los EV de MP41) sugieren que el metabolismo de los ácidos grasos podría servir como un objetivo terapéutico. Esto está respaldado por estudios recientes que demuestran que la focalización de las vías de síntesis o oxidación de ácidos grasos puede inhibir el crecimiento y la progresión del tumor en varios tipos de cáncer (revisado en Ao Du et al. ^[2023]; Koundouros y Poulogiannis ^[2020]; Ping et al. ^[2023]). En general, nuestro estudio enfatiza el papel fundamental de los lípidos en la progresión tumoral y su potencial para la explotación terapéutica. Si bien nuestros hallazgos se basan en líneas celulares seleccionadas, alteraciones lipídicas similares informadas en cánceres de mama y hematológicos (Shahnazari et al. ^[2024]) y revisadas en Carmona et al. (^[2024]) y Zhang et al. (^[2022]) sugieren que estos mecanismos pueden tener una aplicabilidad más amplia a varios tipos de cáncer.

El análisis de los perfiles lipídicos en los diferentes tipos de cáncer revela una heterogeneidad sustancial, con solo el 5% de las especies lipídicas identificadas en las células (total = 2220 especies lipídicas) que son comunes a todas las líneas celulares (111 especies lipídicas compartidas), mientras que el 30%-40% son específicas de cada tipo de célula. Este patrón es aún más pronunciado en los EV, con solo el 3% de los lípidos compartidos y el 40%-50% de las especies específicas de cada tipo de EV (total = 2567 especies lipídicas; 77 especies lipídicas compartidas). Además, el análisis de las familias de lípidos revela que las células MP41 (melanoma uveal) exhiben una alta proporción de especies únicas que pertenecen a la familia PE (40%) y que son poliinsaturadas (50%), mientras que las líneas HT29 (adenocarcinoma colorrectal) y CCD-18Co (no cancerosas) se caracterizan por una predominancia de PC (45%) con cadenas predominantemente saturadas o monoinsaturadas (70%). Estas diferencias composicionales reflejan adaptaciones específicas del metabolismo de los lípidos, particularmente evidentes en el enriquecimiento de las especies de PE poliinsaturadas en las células MP41, lo que puede conferir una mayor fluidez de la membrana y resistencia al estrés oxidativo, que son características clave de las células cancerosas agresivas (Rysman et al. ^[2010]). La alta proporción de especies de PC saturadas y monoinsaturadas en las células HT29 refleja sus adaptaciones metabólicas específicas a las condiciones hipóxicas.

Las firmas lipídicas únicas identificadas en nuestro estudio presentan prometedoras oportunidades para el desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos. Los perfiles lipídicos específicos del cáncer pueden guiar el diseño racional de liposomas o LNP, mejorando su capacidad para dirigirse a las células tumorales y administrar agentes terapéuticos con alta precisión. Por ejemplo, se ha demostrado que la incorporación de lípidos específicos en los liposomas aumenta la captación celular y la citotoxicidad de los fármacos quimioterapéuticos encapsulados en varios modelos de cáncer (Zhu et al. ^[2012]). Nuestros hallazgos destacan el potencial de la lipidómica no solo para identificar estas especies lipídicas específicas del cáncer, sino también para permitir el desarrollo de nanopartículas biomiméticas inspiradas en las propiedades naturales de los EV, aprovechando así su capacidad inherente para interactuar con las células diana y administrar su carga (revisado en van Dommelen et al. ^[2012]). Estos LNP inspirados en los EV ya han demostrado resultados prometedores para la administración de moléculas terapéuticas, como los siRNA, en la terapia del cáncer (Lamichhane y Jay, 1831).

Las características estructurales de las firmas lipídicas del cáncer, incluida la longitud de la cadena, el grado de insaturación y las modificaciones específicas, influyen significativamente en sus propiedades fisicoquímicas y en sus interacciones con las membranas celulares (revisado en Skotland et al. ^[2019]). Por ejemplo, los liposomas compuestos de esfingomielina y colesterol exhiben una estabilidad significativamente mayor que los compuestos de distearoilfosfatidilcolina (DSPC) y colesterol, reteniendo el 25% de su contenido después de 72 horas en comparación con solo el 5%. Esta mayor estabilidad da como resultado niveles plasmáticos 7 veces mayores y una mayor acumulación tumoral. Nuestro estudio identificó varios lípidos, como PE 40:8 + AcO, PE 44:6, SM 32:2;3, SM 40:0;3, SM 40:4;3, PS 40:8 y PS 42:7, que representan candidatos particularmente prometedores para optimizar los nanovectores lipídicos, debido a sus características estructurales únicas y su enriquecimiento en los EV del cáncer. Además, las 19 especies lipídicas específicas de las células cancerosas y las 23 especies lipídicas específicas de los EV que identificamos representan posibles objetivos terapéuticos directos, ya que estudios recientes han demostrado el potencial terapéutico de la focalización de vías específicas del metabolismo de los lípidos en el cáncer.

La validación funcional de los liposomas derivados de los EV proporciona un sólido respaldo a la relevancia biológica de la clasificación selectiva de lípidos en los EV en el cáncer colorrectal. Al reconstituir liposomas a partir de lípidos de células HT29 frente a lípidos de EV de HT29, demostramos que las células cancerosas no solo reprograman su lipidoma global, sino que también remodelan activamente la composición lipídica de los EV secretados, lo que da como resultado vesículas cuyas firmas lipídicas confieren una mayor interacción celular. El hecho de que los liposomas de lípidos de EV de HT29 muestren una captación superior en comparación con las formulaciones sintéticas de DMPC-Chol, a pesar de tener un tamaño y una composición superficial similares a nivel macroscópico, sugiere que las especies lipídicas enriquecidas en los EV, como las especies específicas de PE, SM y PS identificadas en nuestro perfil lipídico, desempeñan un papel determinante en la mediación del reconocimiento y la internalización de las nanopartículas por las células. Esta ventaja funcional apoya aún más el concepto de que los EV actúan como portadores de lípidos optimizados de forma natural, cuya composición está determinada por las adaptaciones metabólicas específicas del cáncer en lugar de por la difusión pasiva desde la membrana plasmática.

En el contexto del cáncer colorrectal, donde se ha demostrado que los exosomas (EV) participan en la promoción de la metástasis y la progresión tumoral, el mejor rendimiento de los liposomas miméticos de EV sugiere que las características lipídicas específicas de los EV podrían aprovecharse no solo para obtener resultados diagnósticos, sino también para la administración terapéutica. Al replicar el enriquecimiento selectivo de especies asociadas a balsas lipídicas (por ejemplo, SM, PE y colesterol) que se observa en los EV cancerosos, los liposomas derivados de EV podrían imitar de manera más fiel los mecanismos naturales de interacción EV-célula, mejorando así la focalización y la captación en los entornos tumorales. Estos hallazgos refuerzan la idea de que la lipidómica puede guiar el diseño de nanopartículas biomiméticas cuya composición refleje la arquitectura lipídica funcional de los EV nativos, en lugar de basarse en mezclas lipídicas sintéticas genéricas. Este enfoque representa un siguiente paso lógico hacia el desarrollo de nanoterapias inspiradas en EV que aprovechen la capacidad de comunicación inherente de las vesículas derivadas de tumores.

Al aprovechar el enriquecimiento selectivo de los componentes de las balsas lipídicas en los EV cancerosos (por ejemplo, CE: 7,73 %–11,29 %; SM: 9,66 %–13,44 %), estos perfiles lipidómicos proporcionan un modelo para diseñar nanopartículas lipídicas (LNP) con mayor estabilidad, biocompatibilidad y capacidad de focalización tumoral. Específicamente, la incorporación de colesterol y fosfolípidos específicos mejora significativamente el tiempo de circulación y reduce la toxicidad de los liposomas (Sato et al. ^[2016]) (revisado en Bozzuto y Molinari ^[2015]). La integración avanzada de datos lipidómicos con enfoques de modelado computacional podría permitir aún más la selección y optimización virtual de las composiciones de LNP/liposomas con propiedades personalizadas para tipos de cáncer específicos. Esta integración acelera considerablemente el desarrollo de nanomedicamentos personalizados que explotan las vulnerabilidades únicas del tumor de cada paciente.

A pesar de estos avances, persisten desafíos en cuanto a la estandarización de los métodos y los altos costos asociados con el desarrollo de nanomedicamentos (revisado en Wicki et al. ^[2015]). No obstante, el diseño racional de nanopartículas basadas en lípidos inspiradas en los EV cancerosos ofrece grandes promesas para la oncología de precisión. A través de una caracterización exhaustiva de los perfiles lipídicos y la identificación de especies lipídicas únicas, hemos establecido componentes valiosos para desarrollar nanoterapias innovadoras. Sin embargo, la traducción clínica inmediata de estos hallazgos aún está por demostrar. La validación de los posibles biomarcadores lipídicos en muestras derivadas de pacientes es un siguiente paso crucial para establecer su valor diagnóstico y pronóstico en entornos del mundo real. La fortaleza de nuestro enfoque radica en las perspectivas mecanísticas y la solidez obtenidas a partir de modelos de líneas celulares bien controlados; sin embargo, se requerirán estudios futuros que incorporen grandes cohortes clínicas bien anotadas para confirmar la utilidad y la universalidad de estos biomarcadores en el contexto clínico. Por lo tanto, el presente trabajo proporciona un marco mecanístico y molecular esencial para la próxima investigación traslacional sobre muestras derivadas de pacientes.

En conclusión, nuestro estudio destaca el potencial transformador de la lipidómica en la investigación del cáncer. Al descubrir características lipídicas distintas tanto en las células cancerosas como en los EV, proporcionamos información crítica sobre la biología tumoral que puede informar directamente las estrategias terapéuticas. La identificación de los mecanismos de enriquecimiento lipídico selectivo no solo allana el camino para el desarrollo de nanopartículas biomiméticas, sino que también establece una base para biomarcadores no invasivos que podrían revolucionar el diagnóstico y el seguimiento del cáncer. Estos hallazgos subrayan la importancia de integrar la lipidómica en la oncología de precisión para desarrollar tratamientos más eficaces y personalizados para pacientes en todo el mundo. Además, nuestra validación funcional de los liposomas miméticos de EV demuestra que las características lipídicas selectivas de los EV pueden traducirse en nanopartículas sintéticas con interacciones celulares mejoradas, lo que refuerza el potencial del diseño de nanovectores biomiméticos guiado por la lipidómica para la terapia del cáncer.

Perspectivas futuras

Nuestro estudio proporciona una caracterización exhaustiva de las características lipídicas en las células cancerosas y sus EV, pero será esencial validar aún más funcionalmente el impacto de estos mecanismos de clasificación lipídica selectiva dentro del microambiente tumoral. Los estudios futuros deberían explorar los efectos de los EV derivados del tumor en las células estromales o inmunitarias primarias utilizando modelos de cocultivo. Estos enfoques se han utilizado con éxito en investigaciones recientes para demostrar cómo los EV tumorales pueden reprogramar los fibroblastos, las células inmunitarias o las células endoteliales, promoviendo así la progresión tumoral, la resistencia a la terapia o la evasión inmunitaria. Por ejemplo, el cocultivo de fibroblastos primarios o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con EV derivados de células cancerosas podría ayudar a dilucidar cómo los cargos lipídicos específicos modulan el fenotipo, la señalización o el estado metabólico de las células receptoras. Estos ensayos funcionales proporcionarían evidencia directa de las consecuencias biológicas del empaquetamiento lipídico selectivo en los EV y aclararían su papel en la configuración del microambiente tumoral.

Será de particular interés la comparación de los liposomas derivados de EV en diferentes tipos de cáncer y con distintos orígenes celulares. En el presente estudio, ya hemos demostrado que los liposomas miméticos de EV reconstituidos a partir de lípidos derivados de tumores pueden generarse con alta eficiencia y que replican las propiedades fisicoquímicas y funcionales clave de los EV nativos, incluido el aumento de la captación celular en comparación con los controles de fosfolípidos sintéticos. Esto proporciona una sólida prueba de concepto de que las características lipídicas específicas de los EV pueden traducirse en nanopartículas biomiméticas funcionales. Sin embargo, aún está por determinar si estas ventajas son generalizables en diferentes subpoblaciones de EV, líneas celulares y tipos de células receptoras. Los análisis sistemáticos de los liposomas derivados de EV en el contexto de distintos microambientes tumorales, con diferentes poblaciones de células estromales e inmunitarias, serán fundamentales para definir la universalidad y la especificidad de los efectos miméticos de los EV. En última instancia, la integración de estos modelos sintéticos con sistemas de cocultivo o xenoinjerto in vivo, y la combinación del perfilado lipidómico y fenotípico, permitirá la identificación de liposomas optimizados en su composición y adaptados a subtipos de cáncer específicos y aplicaciones terapéuticas. Esto perfeccionará aún más la traducción de las características lipídicas de los EV en nanomedicina de precisión.

Limitaciones

Nuestro estudio tiene algunas limitaciones que deben mencionarse. En primer lugar, aunque hemos identificado lípidos de interés potencial, se necesitarán estudios funcionales en profundidad para descifrar los mecanismos por los cuales estas especies moleculares influyen en el comportamiento de las células cancerosas y contribuyen a la progresión tumoral. Además, como se ha comentado anteriormente, la ausencia de muestras clínicas derivadas de pacientes limita actualmente el potencial de traducción directa de nuestros hallazgos; se requerirá una validación futura en cohortes de pacientes más grandes y bien anotadas para evaluar el valor diagnóstico y pronóstico de estos posibles biomarcadores lipídicos. En conjunto, estos aspectos subrayan la necesidad de extender nuestros hallazgos a muestras de pacientes en estudios posteriores para confirmar su relevancia clínica. No obstante, el marco molecular integral proporcionado por nuestro estudio establece una base sólida para futuras investigaciones traslacionales y funcionales, y estos resultados ayudarán a guiar el diseño de estrategias de validación clínica eficaces.

Materiales y métodos

Cultivo celular

Se utilizó un panel de células cancerosas humanas de diferentes orígenes (carcinoma, melanoma). La línea celular de melanoma uveal humano (UM) MP41 (CRL-3297) se compró en ATCC (Manassas, Va, EE. UU.). MEL270 y OMM2.5 fueron amablemente proporcionadas por la Dra. Vanessa Morales (Universidad de Tennessee). Las células BJ fueron proporcionadas por el Dr. Carlos Telleria (Universidad McGill). Se utilizaron líneas celulares de fibroblastos humanos (BJ y CCD-18Co) como línea celular de referencia no cancerosa. Las células CCD-18Co fueron proporcionadas por el Dr. Ferri Lab (Universidad McGill). Todas las células se cultivaron a 37 °C y en una atmósfera de 5 % de CO2. Los detalles sobre las líneas celulares y los protocolos de cultivo se pueden encontrar en las tablas 2 y 3, respectivamente.

Aislamiento y caracterización de EV

Las células se cultivaron en matraces de T-175 hasta alcanzar una confluencia mínima del 80 %. El medio de cultivo se reemplazó luego con un medio que contenía FBS empobrecido en EV, preparado por ultracentrifugación a 120 000 g durante 18 h a 4 °C. Las células se incubaron con el medio empobrecido en EV durante 24 h, después de lo cual se recogió el medio acondicionado y se registró el número de células en cada matraz antes del aislamiento de EV. El medio recogido se sometió a pasos de centrifugación secuenciales: primero a 500 g durante 10 min para eliminar las células y los desechos grandes, seguido de 2000 g durante 20 min a 4 °C para eliminar los cuerpos apoptóticos y las partículas más grandes. El sobrenadante resultante se concentró utilizando unidades de filtración por centrifugación Amicon Ultra-15 con un punto de corte de peso molecular de 100 kDa (Millipore Sigma), centrifugado a 4000 g durante 20 min a 4 °C. Se descartó el filtrado y el retentado se lavó dos veces con PBS filtrado doblemente con 0,22 µm de polisulfuro de éter (PES). Luego, las muestras se purificaron aún más mediante ultracentrifugación a 120 000 g durante 70 min, seguida de un lavado en PBS filtrado doblemente con 0,22 µm de PES. Los gránulos se resuspendieron en su volumen original en PBS y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis.

La ultracentrifugación se seleccionó en función de su amplia aceptación y estandarización, según lo recomendado por las directrices MISEV2023 para el aislamiento de EV a partir de sobrenadantes de cultivo celular; sin embargo, no se puede excluir por completo el riesgo de aislar contaminantes no EV mediante este método, aunque el uso de medios empobrecidos en EV y libres de suero limita en gran medida esta posibilidad. Para tener en cuenta específicamente esta posible (aunque muy baja) contaminación, realizamos una caracterización fisicoquímica y molecular exhaustiva de los EV aislados, incluido NTA, potencial zeta, TEM y Western blot para los marcadores específicos de EV, de acuerdo con las recomendaciones actuales.

Para aplicaciones posteriores, cada muestra se dividió en dos alícuotas para permitir el procesamiento paralelo. Se asignó una alícuota de 100 µL para la extracción de lípidos y el análisis lipidómico, mientras que el volumen restante se utilizó para la caracterización fisicoquímica y otros ensayos. Todas las alícuotas se procesaron en paralelo en condiciones idénticas para minimizar la variabilidad técnica entre los análisis. Para la caracterización de EV, se realizó NTA en un NanoSight NS300 (Malvern Panalytical, Canadá) para evaluar la distribución del tamaño y la concentración de EV. Todas las mediciones se realizaron en PBS filtrado doblemente con 0,22 µm de PES. El potencial zeta se midió mediante dispersión de luz dinámica (DLS), a través de la movilidad electroforética utilizando celdas capilares desechables plegadas (DTS1070).

Western blot

El análisis de EV y células se realizó después de su lisis con tampón RIPA (PI89900, Thermo Fisher) complementado con un cóctel de inhibidores de proteasas. La cuantificación total de proteínas de lisados celulares y EV se realizó mediante micro-BCA (23235, Thermo Fisher). Las muestras de proteínas (10 µg para EV y 20 µg para lisados celulares) se separaron en geles Mini-PROTEAN TGX Stain-Free de 4 % a 12 % (4568094, Biorad). Luego, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (BioRad). Se realizó un paso de bloqueo de 1 hora con un 5 % de leche descremada diluida en TBST (tampón salino con Tris, Tween-20, 0,05 %). La detección de los marcadores de EV se realizó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti-Sintenin (ab19903, abcam, 1:1000). Después de cinco lavados de 10 minutos en TBST, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a peroxidasa (7074S, Cell signalling, 1:10000). La revelación se realizó utilizando el sistema ECL prime (GE Healthcare) y la visualización de la señal se realizó utilizando el sistema ChemiDocTM XRS + (Biorad, Hercules, CA, EE. UU.).

TEM

Se aplicó cuidadosamente una alícuota de 20 µL de EVs sobre láminas de carbono de 200 mallas de rejillas TEM de cobre (Agar Scientific) que habían sido tratadas recientemente con una descarga de plasma negativo. Se permitió que las EVs se adsorbieran sobre las rejillas durante 30 minutos. Posteriormente, se tiñeron utilizando una solución acuosa al 2% de acetato de uranilo durante 3 minutos y, a continuación, se visualizaron utilizando un TEM criogénico FEI Tecnai G2 Spirit BioTwin que funcionaba a 120 kV. Las imágenes se adquirieron con aumentos de 17.500x, 25.000x y 28.500x.

Experimento de lipidómica

Los lípidos se extrajeron de las muestras (células y sus EVs) utilizando éter metil-terc-butílico (MTBE) (Matyash et al. ^[2008]). Este método permite una recuperación de lípidos limpia y más rápida sin el uso de disolventes halogenados. Para las muestras celulares, las células se tomaron directamente del almacenamiento a -80 °C (al menos 1 × 106 células). Todos los pasos posteriores se realizaron utilizando tubos de borosilicato. Las células se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos y, a continuación, se descartó el sobrenadante. Para las EVs, se utilizaron 100 µL de muestra para la extracción de lípidos. Se añadieron 1000 µL de MTBE: MeOH (10:3) al sedimento celular o a las EVs. Los tubos se agitaron en un vórtice durante 10 segundos y se incubaron en un agitador orbital durante 1 hora a temperatura ambiente. Para inducir la separación de fases, se utilizaron 280 µL de agua de grado HPLC. A continuación, las muestras se incubaron durante 10 minutos adicionales. Finalmente, las muestras se centrifugaron a 1000 g durante 10 minutos. Se recogió la fase superior. Se descartó la fase acuosa inferior que contenía proteínas, aminoácidos, etc. Las muestras se secaron en una centrífuga al vacío y se resuspendieron en un disolvente de infusión (diclorometano-metanol (1:2 v/v) con 5 mM de acetato de amonio) para obtener una concentración final estimada de 0,4 µM. Las muestras se inyectaron y se perfundieron a 10 µL/min durante 10 minutos en el sistema de análisis de espectrometría de masas (SCIEX TripleTOF 5600) utilizando el método MSMSall (Simons et al. ^[2012]). Este método de espectrometría de masas no dirigida permite evaluar las clases/familias de lípidos y las especies de lípidos. Los datos se analizaron utilizando el software LipidView v1.2 (SCIEX). Se retuvo el porcentaje normalizado de las clases/familias y especies de lípidos.

Análisis de lipidómica

Los datos se procesaron cuidadosamente promediando los triplicados, filtrando los lípidos inconsistentes y categorizando sistemáticamente las especies de lípidos en función de la clase, la familia y los niveles de saturación. Se consideraron significativamente diferentes las especies de lípidos con p < 0,05 y al menos un cambio de dos veces. Se identificaron tanto los lípidos comunes como los únicos, se realizaron cálculos de cambio para determinar los lípidos expresados de forma diferencial y se generaron curvas de características operativas del receptor (ROC) para resaltar los posibles biomarcadores lipídicos en las células cancerosas y las EVs. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) en dos etapas: primero, se aplicó un PCA no ponderado con escalado de Pareto a todas las muestras para identificar y eliminar los valores atípicos; luego, se repitió el PCA utilizando solo los lípidos discriminantes para visualizar la separación entre los grupos. Además, se realizó un examen exhaustivo de las balsas lipídicas y las composiciones de ácidos grasos para obtener información más detallada sobre la distribución y la función de los lípidos. Los datos se organizaron meticulosamente en hojas de cálculo estructuradas de Excel que comparaban diversas condiciones, incluidas las células cancerosas frente a las no cancerosas, las células frente a las EVs y los tumores primarios frente a los tumores metastásicos. Se identificaron las especies y familias de lípidos únicas asociadas a cada línea celular, EVs y estado de la enfermedad para su posterior interpretación e integración con otros datos ómicos.

Preparación de liposomas y caracterización funcional

Los lípidos nativos se extrajeron de las células cancerosas HT29 y las EVs derivadas de las células cancerosas HT29 utilizando el mismo protocolo de lipidómica basado en MTBE descrito anteriormente. Los liposomas se formularon de novo mediante mezcla microfluídica en una relación de fase acuosa a lípidos de 3:1, lo que dio como resultado pequeñas vesículas unilamelares con composiciones lipídicas nativas de las EVs. Las suspensiones de liposomas se purificaron mediante ultracentrifugación (120.000 × g, 70 min, 4 °C) para eliminar el material no incorporado. Para los estudios de captación, los liposomas purificados se etiquetaron fluorescentemente con SP-DiIC18 (1 mol%) mediante incubación durante 30 minutos a 37 °C. El tinte libre se eliminó mediante un segundo paso de ultracentrifugación (120.000 × g, 70 min, 4 °C) y los gránulos se resuspendieron en PBS. Las propiedades fisicoquímicas de los liposomas se caracterizaron mediante NTA. La captación celular se evaluó utilizando hepatocitos humanos inmortalizados (células IHH, 1,0 × 105 liposomas/célula) sembrados en placas de 96 pocillos. Se realizó una imagen en tiempo real durante 72 horas utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte (canal de contraste de fase y fluorescencia, objetivo de 10×, 37 °C, 5% de CO2), cuantificando la intensidad de fluorescencia integrada como un indicador de la internalización de los liposomas.

Terminología utilizada para la clasificación de lípidos

La clasificación de los lípidos en este estudio sigue el sistema jerárquico establecido por la base de datos LIPID MAPS (Sud et al. ^[2007]), que define los lípidos en ocho clases principales (por ejemplo, glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles), subdivididas en subclases (por ejemplo, PC y PE) y especies moleculares (por ejemplo, PC 34:1) en función de la composición de la cadena de acilo. Si bien LIPID MAPS categoriza formalmente PC/PE/PS como una subclase de glicerofosfolípidos, adoptamos el término "familia de lípidos" aquí para evitar confusiones entre las clases de lípidos más amplias (por ejemplo, glicerofosfolípidos) y sus subclases (por ejemplo, PC y PE). Esta terminología se alinea con estudios recientes que describen la diversidad de lípidos a través de jerarquías de clase-familia-especie (Krokidis et al. ^[2024]). Al integrar estos marcos estandarizados, nuestro estudio mantiene la alineación con las directrices internacionales de lipidómica al tiempo que prioriza la claridad para las audiencias interdisciplinarias.

Herramientas gráficas y de visualización

Todas las representaciones gráficas se crearon utilizando GraphPad Prism (https://www.graphpad.com/). Los diagramas de Venn se construyeron utilizando una herramienta en línea (Heberle et al. ^[2015]). Los mapas de lípidos se crearon utilizando la plataforma LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/). BioRender (https://www.biorender.com/) se utilizó para algunas representaciones esquemáticas.

Cultivo celular

Se utilizó un panel de células cancerosas humanas de diferentes orígenes (carcinoma, melanoma). La línea celular de melanoma uveal humano (UM) MP41 (CRL-3297) se compró en ATCC (Manassas, Va, EE. UU.). MEL270 y OMM2.5 fueron amablemente proporcionadas por la Dra. Vanessa Morales (Universidad de Tennessee). Las células BJ fueron proporcionadas por el Dr. Carlos Telleria (Universidad McGill). Se utilizaron líneas celulares de fibroblastos humanos (BJ y CCD-18Co) como línea celular de referencia no cancerosa. Las células CCD-18Co fueron proporcionadas por el Dr. Ferri Lab (Universidad McGill). Todas las células se cultivaron a 37 °C y en una atmósfera de 5% de CO2. Los detalles sobre las líneas celulares y los protocolos de cultivo se pueden encontrar en las tablas 2 y 3, respectivamente.

Aislamiento y caracterización de EVs

Las células se cultivaron en matraces de T-175 hasta alcanzar una confluencia mínima del 80%. A continuación, el medio de cultivo se reemplazó por un medio que contenía FBS empobrecido en EVs, preparado mediante ultracentrifugación a 120.000 g durante 18 horas a 4 °C. Las células se incubaron con el medio empobrecido en EVs durante 24 horas, tras lo cual se recogió el medio acondicionado y se registró el número de células en cada matraz antes del aislamiento de las EVs. El medio recogido se sometió a pasos de centrifugación secuenciales: primero a 500 g durante 10 minutos para eliminar las células y los residuos grandes, seguido de 2000 g durante 20 minutos a 4 °C para eliminar los cuerpos apoptóticos y las partículas más grandes. El sobrenadante resultante se concentró utilizando unidades de filtración centrífuga Amicon Ultra-15 con un punto de corte de peso molecular de 100 kDa (Millipore Sigma), centrifugando a 4000 g durante 20 minutos a 4 °C. El filtrado se descartó y el retenido se lavó dos veces con PBS doblemente filtrado de 0,22 µm. A continuación, las muestras se purificaron aún más mediante ultracentrifugación a 120.000 g durante 70 minutos, seguida de un lavado con PBS doblemente filtrado de 0,22 µm. Los gránulos se resuspendieron en su volumen original en PBS y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis.

La ultracentrifugación se seleccionó en función de su amplia aceptación y estandarización, según lo recomendado por las directrices MISEV2023 para el aislamiento de EVs del sobrenadante del cultivo celular; sin embargo, no se puede excluir por completo el riesgo de coaislar contaminantes no EV mediante este método, aunque el uso de medios empobrecidos en EVs y libres de suero limita en gran medida esta posibilidad. Para tener en cuenta específicamente esta posible (aunque muy baja) contaminación, realizamos una caracterización físico-química y molecular exhaustiva de las EVs aisladas, incluido el NTA, el potencial zeta, el TEM y el western blot para los marcadores específicos de las EVs, de acuerdo con las recomendaciones actuales.

Para las aplicaciones posteriores, cada muestra se dividió en dos alícuotas para permitir el procesamiento paralelo. Se asignó una alícuota de 100 µL para la extracción de lípidos y el análisis de lipidómica, mientras que el volumen restante se utilizó para la caracterización físico-química y otros ensayos. Todas las alícuotas se procesaron en paralelo en condiciones idénticas para minimizar la variabilidad técnica entre los análisis. Para la caracterización de las EVs, se realizó NTA en un NanoSight NS300 (Malvern Panalytical, Canadá) para evaluar la distribución del tamaño y la concentración de las EVs. Todas las mediciones se realizaron en PBS doblemente filtrado de 0,22 µm. El potencial zeta se midió mediante dispersión de luz dinámica (DLS), mediante movilidad electroforética utilizando celdas capilares desechables plegables (DTS1070).

Western blot

El análisis de las EVs y las células se realizó después de su lisis con tampón RIPA (PI89900, Thermo Fisher) complementado con un cóctel de inhibidores de proteasas. La cuantificación del total de proteínas de los lisados celulares y las EVs se realizó mediante micro-BCA (23235, Thermo Fisher). Las muestras de proteínas (10 µg para las EVs y 20 µg para los lisados celulares) se separaron en geles Mini-PROTEAN TGX Stain-Free de 4-12% (4568094, Biorad). A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (BioRad). Se realizó un paso de bloqueo de 1 hora con un 5% de leche descremada diluida en TBST (tampón salino con Tris, Tween-20, 0,05%). La detección de los marcadores de las EVs se realizó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti-Sintenin (ab19903, abcam, 1:1000). Después de cinco lavados de 10 minutos en TBST, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa (7074S, Cell signalling, 1:10000). La revelación se realizó utilizando el sistema ECL prime (GE Healthcare) y la visualización de la señal se realizó utilizando el sistema ChemiDocTM XRS + (Biorad, Hercules, CA, EE. UU.).

TEM

Se aplicó cuidadosamente una alícuota de 20 µL de EVs sobre láminas de carbono de 200 mallas de rejillas TEM de cobre (Agar Scientific) que habían sido tratadas recientemente con una descarga de plasma negativo. Se permitió que las EVs se adsorbieran sobre las rejillas durante 30 minutos. A continuación, se tiñeron utilizando una solución acuosa al 2% de acetato de uranilo durante 3 minutos y, a continuación, se visualizaron utilizando un TEM criogénico FEI Tecnai G2 Spirit BioTwin que funcionaba a 120 kV. Las imágenes se adquirieron con aumentos de 17.500x, 25.000x y 28.500x.

Experimento de lipidómica

Se extrajeron lípidos de las muestras (células y sus vesículas extracelulares, o EVs) utilizando éter metil-terc-butílico (MTBE) (Matyash et al. ^[2008]). Este método permite una recuperación de lípidos limpia y más rápida sin el uso de disolventes halogenados. Para las muestras celulares, se tomaron las células directamente del almacenamiento a -80 °C (al menos 1 × 106 células). Todos los pasos posteriores se realizaron utilizando tubos de borosilicato. Las células se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos y luego se descartó el sobrenadante. Para las EVs, se utilizaron 100 µL de muestra para la extracción de lípidos. Se añadieron 1000 µL de MTBE: MeOH (10:3) al sedimento celular o a las EVs. Los tubos se agitaron en un vórtice durante 10 segundos y se incubaron en un agitador orbital durante 1 hora a temperatura ambiente. Para inducir la separación de fases, se utilizaron 280 µL de agua de grado HPLC. Luego, las muestras se incubaron durante 10 minutos adicionales. Finalmente, las muestras se centrifugaron a 1000 g durante 10 minutos. Se recogió la fase superior. La fase acuosa inferior que contenía proteínas, aminoácidos, etc., se descartó. Las muestras se secaron en una centrífuga al vacío y se resuspendieron en un disolvente de infusión (diclorometano-metanol (1:2 v/v) con 5 mM de acetato de amonio) para obtener una concentración final estimada de 0,4 µM. Las muestras se inyectaron e infundieron a 10 µL/min durante 10 minutos en el sistema de análisis de espectrometría de masas (SCIEX TripleTOF 5600) utilizando el método MSMSall (Simons et al. ^[2012]). Este método de espectrometría de masas no dirigida permite evaluar las clases/familias de lípidos y las especies de lípidos. Los datos se analizaron utilizando el software LipidView v1.2 (SCIEX). Se retuvo el porcentaje normalizado de las clases/familias y especies de lípidos.

Análisis Lipídico

Los datos se procesaron cuidadosamente promediando los triplicados, eliminando los lípidos inconsistentes y categorizando sistemáticamente las especies de lípidos en función de la clase, la familia y los niveles de saturación. Se consideraron significativamente diferentes las especies de lípidos con p < 0,05 y al menos un cambio de dos veces. Se identificaron tanto los lípidos comunes como los únicos, se realizaron cálculos de cambio para determinar los lípidos expresados diferencialmente y se generaron curvas de características operativas del receptor (ROC) para resaltar los posibles biomarcadores lipídicos en las células cancerosas y las EVs. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) en dos etapas: primero, se aplicó un PCA no ponderado con escalado de Pareto a todas las muestras para identificar y eliminar los valores atípicos; luego, se repitió el PCA utilizando solo los lípidos discriminantes para visualizar la separación entre los grupos. Además, se realizó un examen exhaustivo de las balsas lipídicas y las composiciones de ácidos grasos para obtener información más detallada sobre la distribución y la función de los lípidos. Los datos se organizaron meticulosamente en hojas de cálculo estructuradas de Excel, comparando diversas condiciones, incluidas las células cancerosas frente a las no cancerosas, las células frente a las EVs y los tumores primarios frente a los metastásicos. Se identificaron especies y familias de lípidos únicas asociadas con cada línea celular, EVs y estado de la enfermedad para su posterior interpretación e integración con otros datos ómicos.

Preparación de liposomas y caracterización funcional

Se extrajeron lípidos nativos de las células cancerosas HT29 y las EVs derivadas de las células cancerosas HT29 utilizando el mismo protocolo lipídico basado en MTBE descrito anteriormente. Los liposomas se formularon de novo mediante mezcla microfluídica a una relación de fase acuosa a lípidos de 3:1, lo que produjo pequeñas vesículas unilamelares con composiciones lipídicas nativas de las EVs. Las suspensiones de liposomas se purificaron mediante ultracentrifugación (120.000 × g, 70 min, 4 °C) para eliminar el material no incorporado. Para los estudios de captación, los liposomas purificados se etiquetaron fluorescentemente con SP-DiIC18 (1 mol%) mediante incubación durante 30 minutos a 37 °C. El tinte libre se eliminó mediante un segundo paso de ultracentrifugación (120.000 × g, 70 min, 4 °C), y los gránulos se resuspendieron en PBS. Las propiedades fisicoquímicas de los liposomas se caracterizaron mediante NTA. La captación celular se evaluó utilizando hepatocitos humanos inmortalizados (células IHH, 1,0 × 105 liposomas/célula) sembrados en placas de 96 pocillos. Se realizó una imagen en tiempo real durante 72 horas utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte (contraste de fase y canales de fluorescencia, objetivo de 10×, 37 °C, 5% de CO2), cuantificando la intensidad de fluorescencia integrada como un indicador de la internalización de los liposomas.

Terminología utilizada para la clasificación de lípidos

La clasificación de los lípidos en este estudio sigue el sistema jerárquico establecido por la base de datos LIPID MAPS (Sud et al. ^[2007]), que define los lípidos en ocho clases principales (por ejemplo, glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles), subdivididas en subclase (por ejemplo, PC y PE) y especies moleculares (por ejemplo, PC 34:1) en función de la composición de la cadena de acilo. Si bien LIPID MAPS categoriza formalmente PC/PE/PS como una subclase de glicerofosfolípidos, aquí adoptamos el término "familia de lípidos" para evitar confusiones entre las clases de lípidos más amplias (por ejemplo, glicerofosfolípidos) y sus subclases (por ejemplo, PC y PE). Esta terminología se alinea con estudios recientes que describen la diversidad de lípidos a través de jerarquías de clase-familia-especie (Krokidis et al. ^[2024]). Al integrar estos marcos estandarizados, nuestro estudio mantiene la alineación con las directrices internacionales de lipídómica al tiempo que prioriza la claridad para audiencias interdisciplinarias.

Herramientas gráficas y de visualización

Todas las representaciones gráficas se crearon utilizando GraphPad Prism (https://www.graphpad.com/). Los diagramas de Venn se construyeron utilizando una herramienta en línea (Heberle et al. ^[2015]). Los mapas de lípidos se crearon utilizando la plataforma LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/). BioRender (https://www.biorender.com/) se utilizó para algunas representaciones esquemáticas.

Contribuciones de los autores

Noélie Douanne: curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, visualización, validación, redacción del borrador original, revisión y edición de la redacción. Yousra Benslimane: curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, validación, redacción del borrador original, revisión y edición de la redacción. Rubén R. López: conceptualización, curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, redacción del borrador original, revisión y edición de la redacción. Prisca Bustamante: investigación, metodología. Thupten Tsering: análisis formal, investigación, metodología, visualización, redacción, revisión y edición de la redacción. Yunxi Chen: análisis formal, investigación, metodología, redacción, revisión y edición de la redacción. Laura Kienzle: metodología, investigación, administración del proyecto, visualización, redacción, revisión y edición de la redacción. Masoud Ghasemi: curación de datos, análisis formal, investigación, redacción, revisión y edición de la redacción. Lorne Taylor: curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, recursos, redacción, revisión y edición de la redacción. Yuning Chen: investigación. Anaïs Toreja Boutin: investigación. David Juncker: supervisión, redacción, revisión y edición de la redacción. Catherine Mounier: conceptualización, análisis formal, supervisión, validación, redacción, revisión y edición de la redacción. Vahé Nerguizian: conceptualización, análisis formal, adquisición de financiación, administración del proyecto, supervisión, visualización, redacción del borrador original, revisión y edición de la redacción. Julia V. Burnier: conceptualización, análisis formal, adquisición de financiación, supervisión, metodología, administración del proyecto, recursos, redacción del borrador original, validación, visualización, revisión y edición de la redacción.

Financiación

El estudio también contó con el apoyo de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (a J.V.B. [#190179]) y del Consejo Nacional de Ciencias e Ingeniería de Canadá (NSERC) (a VN [#177808]). J.V.B. recibió el apoyo de una beca de Investigador Junior 1 del Fonds de Recherche du Québec en Santé (FRQS) (#312831).

Conflictos de intereses

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.