La secuenciación de nueva generación (NGS) dirigida del ADN libre en plasma (cfDNA) permite una caracterización molecular exhaustiva y puede guiar la selección de terapias dirigidas al genotipo.
Sin embargo, la detección de variantes derivadas de la hematopoyesis clonal (CH) es un factor de confusión importante en las biopsias líquidas. Utilizando una cohorte de entrenamiento de 426 variantes identificadas en la NGS de cfDNA de 225 pacientes con tumores sólidos en estadio I a IV, desarrollamos plasma Clonal Hematopoiesis ORigin Detection (plasmaCHORD), un modelo de aprendizaje automático que incluye características a nivel de fragmento, variante y paciente para distinguir entre el origen tumoral y el origen de la CH para cada variante detectada por las biopsias líquidas. El rendimiento del modelo se evaluó mediante la comparación con el origen de referencia de cada variante plasmática determinado a partir de la NGS de células sanguíneas y tumores correspondientes. Tras fijar los parámetros del modelo, aplicamos plasmaCHORD a una cohorte de validación independiente de 1418 variantes plasmáticas detectadas en 114 pacientes con cáncer metastásico, así como a la NGS de cfDNA de pacientes incluidos en un ensayo clínico prospectivo (NCT05585684). plasmaCHORD predijo el origen tumoral frente al origen de la CH en el conjunto de entrenamiento con alta precisión (AUC = 0,94).
En la cohorte de validación independiente, el modelo fijado mantuvo una precisión general similar (AUC = 0,9) y demostró una mejora significativa en la precisión para los genes de importancia clínica. Cuando se aplicó a casos clínicamente desafiantes en el contexto de un ensayo clínico de oncología de precisión, plasmaCHORD determinó con precisión el origen de la variante, evitando errores de concordancia con las terapias dirigidas al genotipo. plasmaCHORD, un modelo de aprendizaje automático multifactorial, puede mejorar significativamente la capacidad de identificar variantes tumorales genuinas en la NGS de rutina basada únicamente en plasma, abordando una necesidad crítica para implementar la terapia guiada por biopsias líquidas al minimizar la interpretación errónea causada por la CH.
El análisis del ADN libre en plasma (cfDNA) en biopsias líquidas ha surgido como un método eficiente y mínimamente invasivo para la elaboración de perfiles genómicos exhaustivos, con el fin de identificar mutaciones que puedan ser objeto de tratamiento ([1]–[5], [6]). Solo una fracción del conjunto de cfDNA proviene de células tumorales, denominada ctDNA, mientras que la mayor parte del cfDNA se origina en tejidos normales y células hematopoyéticas ([7], [8]). La hematopoyesis clonal (HC) es un fenómeno asociado con el envejecimiento y la exposición a toxinas, en el que una célula hematopoyética adquiere mutaciones genéticas que conducen a la propagación del clon de HC ([9], [10]). Estas mutaciones derivadas de la HC se detectan fácilmente mediante biopsias líquidas ([11]–[14]) y, dependiendo de la edad y las comorbilidades del huésped, una proporción considerable de las mutaciones detectadas en el perfil genómico exhaustivo del cfDNA plasmático pueden ser de origen en la HC ([15]). Aunque las mutaciones asociadas con la HC se producen comúnmente en genes canónicos como DNMT3A, también pueden aparecer en genes impulsores clínicamente relevantes para los tumores sólidos, como TP53, ATM o BRCA1/2 ([16], [17]). En consecuencia, la detección de mutaciones derivadas de la HC puede dificultar la interpretación de las biopsias líquidas obtenidas para la elaboración de perfiles genómicos exhaustivos de tumores sólidos, lo que supone un desafío en la toma de decisiones terapéuticas basadas en el genotipo ([4], [18]–[22]).
Un enfoque para superar el ruido biológico causado por la HC en la secuenciación de nueva generación (NGS) del plasma implica la secuenciación profunda del ADN de glóbulos blancos (WBC) correspondientes y la eliminación de las variantes de HC detectadas tanto en el compartimento de cfDNA como en el de WBC ([16], [19]). Alternativamente, la secuenciación de tejido tumoral correspondiente puede utilizarse para identificar las variantes derivadas del tumor en el cfDNA ([23]); sin embargo, este enfoque se ve limitado por la disponibilidad de tejido tumoral y puede ser menos informativo debido a la discordancia entre el cfDNA y el tumor, causada por la heterogeneidad y la evolución del tumor ([24]). Aunque estos métodos distinguen de forma fiable la mayoría de las variantes de HC, el requisito de obtener biopsias adicionales y realizar secuenciación aumenta los costes y limita la viabilidad.
El análisis del fragmentoma del cfDNA está surgiendo como un enfoque potencial para determinar el origen de las variantes sin necesidad de realizar una secuenciación paralela de muestras de tumor o WBC correspondientes ([25]–[27]). Cuando el cfDNA se libera en la circulación, conserva características epigenéticas que reflejan la organización de la cromatina y el linaje del cáncer, junto con la fragmentación diferencial ([27]). Estas características, que incluyen la longitud de los fragmentos, los motivos terminales y la huella de nucleosomas, podrían utilizarse potencialmente para distinguir el cfDNA derivado del tumor del cfDNA derivado de la HC ([28]–[32]). Aunque estas características pueden proporcionar información valiosa sobre las diferencias en las distribuciones de fragmentos, normalmente no son lo suficientemente informativas individualmente como para distinguir con precisión la HC del origen tumoral para una mutación determinada.
En este estudio, hemos desarrollado plasma Clonal Hematopoiesis ORigin Detection (plasmaCHORD), un nuevo modelo de aprendizaje automático para distinguir las variantes derivadas del tumor de las variantes derivadas de la HC en la NGS de una sola muestra de plasma para pacientes con tumores sólidos. Al integrar la información derivada de las características del fragmento, las variantes y el paciente del cfDNA, plasmaCHORD predijo el origen de las variantes del tumor frente a la HC a partir de la secuenciación de solo plasma con alta precisión, en comparación con el estándar de oro de las llamadas de origen celular de la NGS de WBC y tumor correspondientes. Nuestro método para identificar las variantes tumorales bona fide en las biopsias líquidas de uso rutinario tiene el potencial de mejorar la precisión, la utilidad clínica y la viabilidad de los enfoques de biopsia líquida de solo plasma en la práctica clínica.
Materiales y Métodos
Cohortes de la Junta Molecular del Tumor
Para comprender la carga clínica de la contaminación por HC en las biopsias líquidas, realizamos un análisis retrospectivo de los casos de biopsia líquida revisados por la Junta Molecular del Tumor de Johns Hopkins (JH-MTB). La JH-MTB está compuesta por un panel de expertos, que incluye oncólogos, patólogos moleculares, genetistas y científicos de laboratorio, que realizan evaluaciones exhaustivas de los datos moleculares de los casos clínicos para proporcionar recomendaciones de terapia dirigida basadas en el genotipo. Compilamos una cohorte retrospectiva de 45 pacientes con tumores sólidos que se sometieron a biopsias líquidas revisadas por la JH-MTB, para las que se discutió el posible efecto perjudicial de la HC. Más concretamente, consultamos la base de datos de la JH-MTB para identificar los casos revisados desde enero de 2020 hasta mayo de 2025 que incluían una biopsia líquida obtenida como parte de la atención clínica de rutina, con al menos una variante en la que la JH-MTB consideró que el origen de la HC era posible. Durante la revisión de casos en tiempo real por parte de la JH-MTB, el posible origen de cada variante plasmática se determinó mediante un análisis manual de expertos que incorporaba el historial clínico, la frecuencia alélica de la variante (VAF), la comparación con la NGS del tumor (si estaba disponible) y la anotación de la variante utilizando el meta-anotador OpenCRAVAT ([33], [34]). La recopilación y el análisis de la base de datos de la JH-MTB se llevaron a cabo de acuerdo con el IRB00058592, aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de Johns Hopkins.
Para corroborar aún más la utilidad clínica de nuestro enfoque, seleccionamos dos casos ilustrativos del ensayo clínico prospectivo diseñado para evaluar la utilidad clínica de las biopsias líquidas seriadas en pacientes con tumores sólidos avanzados/metastásicos (NCT05585684; ref. [35]). Los pacientes incluidos en este ensayo se sometieron a NGS del plasma, que fue revisada por la JH-MTB en tiempo real para proporcionar recomendaciones de terapia dirigida basadas en el genotipo. De esta cohorte de ensayo clínico de biopsia líquida prospectiva, identificamos dos pacientes con alteraciones potencialmente tratables identificadas en las pruebas de biopsia líquida, para las que el origen de las variantes no estaba claro. Aplicamos el modelo plasmaCHORD bloqueado para predecir el origen de estas variantes. Se realizó una secuenciación asíncrona de NGS del ADN de WBC de alta cobertura para validar la clasificación de plasmaCHORD; sin embargo, no estaba disponible en el momento de la evaluación inicial por parte de la JH-MTB.
Cohortes multicancerosas utilizadas para el desarrollo y la prueba de plasmaCHORD
La cohorte de entrenamiento, utilizada para refinar y probar el modelo de aprendizaje automático, consistió en 225 pacientes con cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de ovario, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y cáncer de pulmón microcítico (CPM), y se reunió a partir de cohortes de pacientes incluidos en ensayos clínicos o en un biobanco aprobado por la IRB, incluido una cohorte de pacientes con cáncer colorrectal como parte del estudio Molecular Early Detection of Colon Cancer (MEDOCC) (Tabla S1 del Material Suplementario; ref. [18], [20], [22], [36]–[40]). Se requería que todos los pacientes tuvieran NGS de WBC (capa de glóbulos blancos) correspondientes, y 152 (67,6 %) de los pacientes también tenían NGS de tejido tumoral correspondientes. Para los pacientes que tenían colecciones de cfDNA seriadas, solo se utilizó la evaluación inicial en la cohorte de entrenamiento. Las características del fragmentoma del cfDNA se seleccionaron, como se describe en detalle a continuación, utilizando una cohorte serial que incluía 29 pacientes con cáncer colorrectal, cáncer de esófago o CPNM en estadio I a III que se sometían a tratamiento como parte de un ensayo clínico (Tabla S2 del Material Suplementario). Los pacientes se incluyeron en la cohorte serial si tenían la(s) misma(s) variante(s) detectadas en dos muestras de plasma separadas en diferentes momentos. Esta cohorte permitió la comparación de la misma variante en momentos individuales y el seguimiento de cualquier fluctuación en las características del fragmentoma durante el tratamiento. Veinte pacientes de la cohorte serial tenían muestras iniciales que también se incluyeron en la cohorte de entrenamiento.
La cohorte de validación independiente consistió en 124 pacientes con cáncer de mama, CPNM o cáncer de próstata en estadio IV que tenían cfDNA, WBC (capa de glóbulos blancos) y tejido tumoral obtenidos como parte de un estudio observacional prospectivo publicado para determinar el origen de las variantes identificadas en el plasma ([16]). Incluimos solo a los pacientes que tenían variantes plasmáticas con orígenes bien caracterizados (clasificadas en la publicación original como “correspondientes a WBC”, “correspondientes a biopsia” o “correspondientes a IMPACT-BAM”, que se refiere a las variantes detectadas en la biopsia de tejido correspondiente por debajo del límite para la llamada de variantes requerida para la notificación clínica) y datos de edad disponibles. En total, se incluyeron 114 pacientes, lo que representa 1418 variantes (507 derivadas del tumor, incluidas las “correspondientes a biopsia” y las “correspondientes a IMPACT-BAM”, y 911 derivadas de la HC; Tabla S3 del Material Suplementario). Todos los pacientes de esta cohorte se sometieron a la extracción de sangre en un plazo de 6 semanas desde la biopsia del tumor. Ninguno de los pacientes de esta cohorte formó parte de ninguno de los seis estudios de la cohorte de entrenamiento, ni se utilizaron datos de la cohorte de validación para informar el desarrollo y la selección de parámetros del modelo.
Secuenciación de corrección de errores dirigida y procesamiento de datos de secuencia
Todas las muestras de cfDNA plasmático y WBC de la capa de glóbulos blancos correspondientes utilizadas para las cohortes de entrenamiento y serial se secuenciaron utilizando la secuenciación de corrección de errores NGS de panel de genes fijos ([23]). La profundidad de cobertura media tanto para el cfDNA como para los WBC fue de 5000×; dependiendo de la cohorte, el panel dirigido incluía entre 63 y 219 genes mutados comúnmente en el cáncer. Se proporcionan más detalles sobre las especificaciones del protocolo, la recolección de muestras, los parámetros de secuenciación y los paneles de genes en publicaciones anteriores ([18], [20], [36]–[39]). Para los pacientes de la subcohorte MEDOCC, se realizó la secuenciación de tejidos utilizando un panel dirigido de genes asociados al cáncer a una profundidad media de 750×. Para los pacientes restantes con tejido tumoral correspondiente disponible, se realizó la secuenciación del exoma completo tanto en el tumor como en el tejido normal a una profundidad media de 100×, como se describió anteriormente ([18], [20], [36]–[39]). Se identificaron un total de 426 variantes con orígenes definidos que cumplieron los criterios para su inclusión en la cohorte de entrenamiento. Cabe destacar que nuestros datos de entrenamiento no incluyeron dos genes canónicos de la HC, TET2 y ASXL1, ya que no se incluyeron en el panel dirigido utilizado para la NGS del plasma. Estos genes se incluyeron en el panel dirigido utilizado en la cohorte de validación.
Para la cohorte de validación independiente, las muestras de plasma y WBC se secuenciaron con un ensayo de cfDNA dirigido utilizando un panel de 508 genes con >60 000× de profundidad (GRAIL), mientras que las muestras de tumor y tejido normal correspondientes se secuenciaron utilizando el ensayo MSK-IMPACT ([16]). Recuperamos los archivos BAM de plasma procesados del European Genome-phenome Archive (número de acceso EGAS00001003755). Las variantes de cfDNA y los orígenes de referencia se extrajeron de la información complementaria incluida en la publicación original ([7]). Solo se incluyeron las mutaciones con orígenes categorizados en la publicación original (clasificadas como “correspondientes a WBC”, “correspondientes a biopsia” o “correspondientes a IMPACT-BAM”); se excluyeron las variantes clasificadas como de origen incierto en la publicación original. Solo se incluyeron las variantes de un solo nucleótido (SNV) y las inserciones/deleciones en el análisis final, excluyendo los polimorfismos de múltiples nucleótidos, lo que resultó en un total de 1418 variantes (Tabla S3 del Material Suplementario).
Para la cohorte de ensayo clínico prospectivo de biopsia líquida (NCT05585684), se realizó la NGS del plasma utilizando un panel dirigido de 33 genes con una cobertura media de corrección de errores y deduplicación de 2638× (Labcorp Plasma Focus, Labcorp, NC). Las muestras de WBC correspondientes se secuenciaron utilizando un panel de 521 genes con una cobertura media de corrección de errores y deduplicación de 1846× (Labcorp Plasma Complete, Labcorp, NC).
Evaluación del origen de la mutación
Para las variantes plasmáticas en las que se había determinado y publicado previamente el origen en comparación con el tejido tumoral, utilizando la comparación con glóbulos blancos (GB) y secuenciación de tejido correspondientes, se utilizó el origen de la variante publicado como origen de referencia ([20], [23]). Para las variantes restantes, el origen de referencia se determinó mediante la comparación con glóbulos blancos y tejido (si estaba disponible) mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Las variantes detectadas en múltiples muestras con frecuencias alélicas consistentes con polimorfismos de un solo nucleótido (PSN) de la línea germinal y que no se clasificaron como puntos calientes del cáncer [definidos como ≥20 entradas en el Catálogo de Mutaciones Somáticas en el Cáncer (COSMIC), RRID: SCR_002260] se excluyeron como de probable origen en la línea germinal ([41]). Para los pacientes con secuenciación de glóbulos blancos y tejido, las variantes detectadas en al menos tres familias de supermutantes en la secuenciación de glóbulos blancos y no detectadas en la secuenciación de tumores correspondientes se clasificaron como de origen en la línea germinal, mientras que las variantes detectadas en el tumor (frecuencia alélica mínima del 10% o identificadas mediante inspección visual utilizando el Visualizador de Genómica Integrativa) y no detectadas en los glóbulos blancos (menor o igual a una familia de supermutantes) se clasificaron como de origen tumoral. Para los pacientes que solo tenían secuenciación de glóbulos blancos, las variantes detectadas en al menos tres familias de supermutantes en la secuenciación de glóbulos blancos se clasificaron como de origen en la línea germinal, mientras que las variantes detectadas en cero familias de supermutantes de glóbulos blancos se clasificaron como de origen tumoral (Figura S1 suplementaria). Para los pacientes que solo tenían secuenciación de glóbulos blancos, la cobertura promedio específica del locus fue de más de 2000 lecturas. Las variantes que no cumplieron con estos criterios se clasificaron como de origen desconocido y no se incluyeron en los análisis posteriores. Para la cohorte de validación independiente, se utilizó el origen de la mutación para cada variante según se describe en el material suplementario de la publicación original ([16]). Solo se incluyeron las mutaciones detectadas en pacientes con cáncer y clasificadas como "fenotipo coincidente con glóbulos blancos", "biopsia coincidente" o "coincidente con IMPACT-BAM", mientras que las variantes de origen incierto se excluyeron. Para nuestros fines, "biopsia coincidente" y "coincidente con IMPACT-BAM" se combinaron como variantes derivadas del tumor.
Evaluación longitudinal de las características del fragmentoma del ADNcf
En la cohorte serial, se identificaron 41 variantes que estuvieron presentes en al menos dos puntos de tiempo separados para un paciente determinado. De estas, 23 variantes que se detectaron en una muestra recolectada en la línea de base también se incluyeron en la cohorte de entrenamiento. Para cada variante y en cada punto de tiempo, se calcularon estadísticas resumidas del fragmentoma del ADNcf en las lecturas del locus dado, incluidas las distribuciones de longitud, los patrones de motivos de los extremos de los fragmentos y las comparaciones estadísticas entre las lecturas mutantes y las lecturas de tipo salvaje (Tablas S4 y S5 suplementarias). Se determinó el origen de la variante mediante la comparación con la secuenciación de glóbulos blancos o tumores correspondientes utilizando nuestros criterios detallados anteriormente; sin embargo, el origen de la variante no se consideró en la evaluación de la estabilidad longitudinal de las estadísticas resumidas del fragmentoma. Después de generar datos para cada punto de tiempo, se evaluó la correlación entre las estadísticas resumidas en los diferentes puntos de tiempo utilizando la correlación del producto-momento de Pearson en muestras emparejadas (Tabla S5 suplementaria). Las pruebas estadísticas en las que la correlación a lo largo del tiempo tuvo un valor de P < 0,05 se incluyeron en el desarrollo del modelo de aprendizaje automático.
Aprendizaje automático
Se proporciona una descripción detallada de cada característica incorporada en el modelo de aprendizaje automático en la Tabla S4 suplementaria. En cada posición que contiene una variante de ctADN, analizamos todos los fragmentos de ADNcf, comparando los fragmentos mutantes y los fragmentos de tipo salvaje para calcular las métricas seleccionadas sobre las longitudes de los fragmentos, los motivos de los extremos de los fragmentos y las ubicaciones de los puntos finales de los fragmentos. Se realizaron comparaciones estadísticas entre las longitudes de los fragmentos utilizando la estadística de Kolmogorov-Smirnov y la estadística de Mann-Whitney U. Además, consideramos la puntuación delta S promedio absoluta, que refleja la diferencia absoluta promedio en la distribución de la longitud de los fragmentos entre los fragmentos mutantes y los fragmentos de tipo salvaje, y la puntuación delta S máxima, que indica la diferencia observada máxima en la distribución de la longitud de los fragmentos ([29]). También calculamos la fracción de lecturas mutadas frente a lecturas de tipo salvaje con longitudes de lectura dentro de conjuntos más cortos o más largos ([31]). Los parámetros de análisis de motivos incluyeron la prueba de rango de Wilcoxon que compara la distribución de los motivos en los puntos de corte ascendente y descendente. Los motivos se determinaron a partir de las cuatro bases en cada extremo del fragmento. También calculamos la estadística de la prueba de rango de Wilcoxon para evaluar la distribución de las ubicaciones de los puntos finales de los fragmentos.
Las características a nivel de variante incluyeron la fracción alélica de la variante en las muestras de plasma, el número total de lecturas distintas, el número de lecturas distintas que contienen la mutación, una fracción alélica de la variante plasmática escalada, el estado del gen impulsor de la mutación, el recuento de variantes COSMIC y la fracción de entradas COSMIC que estaban relacionadas con neoplasias hematológicas o linfoides tanto a nivel de variante como de gen. Toda la anotación de variantes y genes se realizó utilizando OpenCRAVAT ([33]). A las variantes que no tenían entradas en COSMIC se les asignó un valor de característica de -1. El estado del gen impulsor de la mutación fue una variable binaria y se evaluó utilizando CHASMplus, con puntuaciones >0,75 que indican mutaciones impulsoras ([42]). Para las variantes truncantes, en las que las puntuaciones de CHASMplus no se calcularon según el diseño del algoritmo, se consideraron las mutaciones de pérdida de función como impulsoras si ocurrían en supresores tumorales; todos los indels se clasificaron como impulsores. La edad se incluyó como una característica a nivel del paciente. Las características de entrada se preprocesaron con centrado, escalado y transformación de Yeo-Johnson, y todo el preprocesamiento se realizó dentro de cada pliegue de validación cruzada. plasmaCHORD integró todas las características anteriores para calcular una puntuación de 0 a 1 para cada variante. Las puntuaciones de salida se binarizaron en un punto de corte de 0,5 en origen predicho de la línea germinal y tumoral. plasmaCHORD se implementó utilizando XGBoost (versión 1.6.0.1, RRID: SCR021361) y el paquete caret (versión 6.0-92, RRID: SCR021138) en R. El entrenamiento del modelo se realizó utilizando una validación cruzada de 10 pliegues repetida 10 veces, optimizando el área bajo la curva de características operativas del receptor (ROC) (AUC). Aunque no incorporamos la selección de características dentro del marco de validación cruzada, debido al menor número de pacientes con muestras seriales, cualquier sesgo en la evaluación del rendimiento de la validación cruzada derivado de la selección de características del fragmentoma sería limitado dado el pequeño solapamiento (5,4%) entre este subconjunto de variantes y el conjunto de entrenamiento completo. La importancia de las características se extrajo utilizando la función de importancia de características integrada de caret.
Análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se realizaron en R versión 4.2.1 (RRID: SCR_001905). Las estadísticas resumidas del fragmentoma se describen en la Tabla S4 suplementaria. Para la cohorte serial, la correlación entre las estadísticas resumidas en los diferentes puntos de tiempo se determinó utilizando la correlación del producto-momento de Pearson entre muestras emparejadas. En particular, la estadística F para la varianza y la estadística T para la longitud media del fragmento no estaban muy correlacionadas entre la línea de base y los puntos de tiempo de seguimiento y, por lo tanto, no se incluyeron en el modelo. La precisión de la predicción de plasmaCHORD en comparación con la hipótesis nula se evaluó utilizando una prueba binomial de un factor.
Aprobación ética y consentimiento del paciente
Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas éticas reconocidas, incluida la Declaración de Helsinki, las pautas del Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas, el Informe Belmont y la Regla Común de los Estados Unidos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes por los investigadores originales del estudio. El uso de datos de secuenciación derivados de pacientes en la cohorte JH-MTB fue aprobado por el IRB de Johns Hopkins (IRB00058592).
Cohortes de la Junta Molecular del Tumor
Para comprender la carga clínica de la contaminación de la línea germinal en las biopsias líquidas, realizamos un análisis retrospectivo de los casos de biopsias líquidas revisados por la Junta Molecular del Tumor de Johns Hopkins (JH-MTB). La JH-MTB está compuesta por un panel de expertos, incluidos oncólogos, patólogos moleculares, genetistas y científicos de laboratorio, que realizan evaluaciones integrales de los datos moleculares de los casos clínicos para proporcionar recomendaciones de terapia dirigida basadas en el genotipo. Compilamos una cohorte retrospectiva de 45 pacientes con tumores sólidos que tenían biopsias líquidas revisadas por la JH-MTB, para las cuales se discutió el posible efecto de confusión de la línea germinal. Más específicamente, consultamos la base de datos de la JH-MTB para identificar los casos revisados desde enero de 2020 hasta mayo de 2025 que incluían una biopsia líquida obtenida como parte de la atención clínica de rutina, con al menos una variante en la que la JH-MTB consideró que el origen de la línea germinal era posible. Durante la revisión de casos en tiempo real por parte de la JH-MTB, el origen potencial de cada variante plasmática se determinó mediante un análisis de expertos manual que incorporó el historial clínico, la frecuencia alélica de la variante (VAF), la comparación con la secuenciación de NGS del tumor (si estaba disponible) y la anotación de variantes utilizando el meta-anotador OpenCRAVAT ([33], [34]). La recopilación y el análisis de la base de datos de la JH-MTB se llevaron a cabo de acuerdo con IRB00058592, aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Johns Hopkins (IRB).
Para corroborar aún más la utilidad clínica de nuestro enfoque, seleccionamos dos casos ilustrativos del ensayo clínico prospectivo diseñado para evaluar la utilidad clínica de las biopsias líquidas seriales en pacientes con tumores sólidos avanzados/metastásicos (NCT05585684; ref. [35]). Los pacientes inscritos en este ensayo tenían NGS de plasma revisado por la JH-MTB en tiempo real para proporcionar recomendaciones de terapia dirigida basadas en el genotipo. De esta cohorte de ensayo clínico de biopsia líquida prospectiva, identificamos dos pacientes con alteraciones potencialmente tratables identificadas en las pruebas de biopsia líquida, para las cuales el origen de las variantes no estaba claro. Aplicamos el modelo de plasmaCHORD bloqueado para predecir el origen de estas variantes. Se realizó secuenciación de NGS de ADN de glóbulos blancos de alta cobertura de forma asíncrona para validar la clasificación de plasmaCHORD; sin embargo, no estaba disponible en el momento de la evaluación inicial por parte de la JH-MTB.
Cohortes multicancerosas utilizadas para el desarrollo y las pruebas de plasmaCHORD
La cohorte de entrenamiento, utilizada para refinar y probar el modelo de aprendizaje automático, consistió en 225 pacientes con cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) y cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) y se ensambló a partir de cohortes de pacientes inscritos en ensayos clínicos o en un biobanco aprobado por el IRB, incluido una cohorte de pacientes con cáncer colorrectal como parte del estudio de detección temprana molecular del cáncer colorrectal (MEDOCC) (Tabla S1 suplementaria; ref. [18], [20], [22], [36]–[40]). Se requirió que todos los pacientes tuvieran NGS de glóbulos blancos (buffy coat) correspondientes y 152 (67,6%) de los pacientes también tenían NGS de tejido tumoral correspondientes. Para los pacientes que tenían colecciones de ADNcf seriales, solo se utilizó la evaluación de la línea de base en la cohorte de entrenamiento. Las características del fragmentoma del ADNcf se seleccionaron, como se describe en detalle a continuación, utilizando una cohorte serial que incluyó a 29 pacientes con cáncer colorrectal, cáncer de esófago o CPCNP en estadio I a III que se estaban sometiendo a tratamiento como parte de un ensayo clínico (Tabla S2 suplementaria). Los pacientes se incluyeron en la cohorte serial si tenían la(s) misma(s) variante(s) detectada(s) en dos muestras de plasma separadas en diferentes puntos de tiempo. Esta cohorte permitió la comparación de la misma variante en puntos de tiempo individuales y el seguimiento de cualquier fluctuación en las características del fragmentoma durante el tratamiento. Veinte pacientes de la cohorte serial tenían muestras de la línea de base que también se incluyeron en la cohorte de entrenamiento.
La cohorte de validación independiente consistió en 124 pacientes con cáncer de mama en estadio IV, CPNP o cáncer de próstata, a quienes se obtuvieron cfDNA, glóbulos blancos (capa leucocitaria) y tejido tumoral como parte de un estudio observacional prospectivo publicado para determinar el origen de las variantes identificadas en el plasma ([16]). Incluimos solo a los pacientes que presentaban tanto variantes en el plasma con orígenes bien caracterizados (clasificadas en la publicación original como “coincidentes con los glóbulos blancos”, “coincidentes con la biopsia” o “coincidentes con IMPACT-BAM”, lo que se refiere a las variantes detectadas en la biopsia de tejido coincidente por debajo del límite para la llamada de variantes, según lo requerido para la presentación de informes clínicos) como datos de edad disponibles. En total, se incluyeron 114 pacientes, lo que representó 1418 variantes (507 derivadas del tumor, incluidas las “coincidentes con la biopsia” y las “coincidentes con IMPACT-BAM”, y 911 derivadas de los glóbulos blancos; Tabla S3 en el material suplementario). Todos los pacientes de esta cohorte se sometieron a la extracción de sangre dentro de las 6 semanas posteriores a la biopsia del tumor. Ninguno de los pacientes de esta cohorte formó parte de ninguno de los seis estudios de la cohorte de entrenamiento, ni se utilizaron datos de la cohorte de validación para informar el desarrollo del modelo y la selección de parámetros.
Secuenciación de corrección de errores dirigida y procesamiento de datos de secuencia
Todo el cfDNA del plasma y las muestras de glóbulos blancos de la capa leucocitaria coincidentes utilizadas para las cohortes de entrenamiento y seriales se secuenciaron utilizando una captura híbrida de genes fijos y una secuenciación de nueva generación (NGS) de corrección de errores ([23]). La profundidad media de cobertura tanto para el cfDNA como para los glóbulos blancos fue de 5000×; según la cohorte, el panel dirigido incluyó entre 63 y 219 genes que se mutan comúnmente en el cáncer. Se han descrito previamente detalles adicionales sobre las especificaciones del protocolo, la recolección de muestras, los parámetros de secuenciación y los paneles de genes ([18], [20], [36]–[39]). Para los pacientes de la subcohorte MEDOCC, se realizó la secuenciación de tejidos utilizando un panel dirigido de genes asociados al cáncer a una profundidad media de 750×. Para los pacientes restantes con tejido tumoral coincidente disponible, se realizó la secuenciación del exoma completo tanto en el tejido tumoral como en el tejido normal hasta una profundidad media de 100×, como se describió previamente ([18], [20], [36]–[39]). Se identificaron un total de 426 variantes con orígenes definidos y cumplieron con los criterios para su inclusión en la cohorte de entrenamiento. En particular, nuestros datos de entrenamiento no incluyeron dos genes canónicos de los glóbulos blancos, TET2 y ASXL1, ya que no se incluyeron en el panel dirigido utilizado para la NGS del plasma. Estos genes se incluyeron en el panel dirigido utilizado en la cohorte de validación.
Para la cohorte de validación independiente, las muestras de plasma y glóbulos blancos de la capa leucocitaria se secuenciaron con un ensayo dirigido de cfDNA utilizando un panel de 508 genes con una profundidad de >60 000× (GRAIL), mientras que las muestras de tumor y tejido normal coincidentes se secuenciaron utilizando el ensayo MSK-IMPACT ([16]). Recuperamos los archivos bam de plasma procesados del European Genome-phenome Archive (número de acceso EGAS00001003755). Las variantes de cfDNA y los orígenes de referencia se extrajeron de la información complementaria incluida en la publicación original ([7]). Solo se incluyeron las mutaciones con orígenes categorizados en la publicación original (clasificadas como “coincidentes con los glóbulos blancos”, “coincidentes con la biopsia” o “coincidentes con IMPACT-BAM”); se excluyeron las variantes clasificadas como de origen incierto en la publicación original. Solo se incluyeron las variantes de un solo nucleótido (SNV) y las inserciones/deleciones (indels) en el análisis final, excluyendo los polimorfismos multinucleotídicos, lo que resultó en un total de 1418 variantes (Tabla S3 en el material suplementario).
Para la cohorte del ensayo clínico prospectivo de biopsia líquida (NCT05585684), se realizó la NGS del plasma utilizando un panel dirigido de 33 genes con una cobertura de corrección de errores deduplicada media de 2638× (Labcorp Plasma Focus, Labcorp, NC). Las muestras de glóbulos blancos coincidentes se secuenciaron utilizando un panel de 521 genes con una cobertura de corrección de errores deduplicada media de 1846× (Labcorp Plasma Complete, Labcorp, NC).
Evaluación del origen de la mutación
Para las variantes del plasma en las que se había determinado y publicado previamente el origen de los glóbulos blancos frente al tumor, utilizando la comparación con los glóbulos blancos coincidentes ± la secuenciación de tejidos, utilizamos el origen de la variante publicado como el origen de referencia ([20], [23]). Para las variantes restantes, el origen de referencia se determinó mediante la comparación con los glóbulos blancos y los tejidos coincidentes (si estaban disponibles) mediante NGS. Se excluyeron como probablemente de origen germinal las variantes detectadas en múltiples muestras a frecuencias alélicas consistentes con los SNPs de la línea germinal y que no se clasificaron como puntos calientes del cáncer [definidos como ≥20 entradas en el Catálogo de mutaciones somáticas en el cáncer (COSMIC), RRID: SCR_002260] ([41]). Para los pacientes con secuenciación tanto de glóbulos blancos como de tejidos, las variantes detectadas en al menos tres familias de supermutantes en la secuenciación de glóbulos blancos y no detectadas en la secuenciación de tumores coincidentes se clasificaron como de origen en los glóbulos blancos, mientras que las variantes detectadas en el tumor (frecuencia alélica mínima del 10% o identificadas mediante inspección visual utilizando el Integrative Genomics Viewer) y no detectadas en los glóbulos blancos (menor o igual a una familia de supermutantes) se clasificaron como de origen tumoral. Para los pacientes que solo tenían secuenciación de glóbulos blancos, las variantes detectadas en al menos tres familias de supermutantes en la secuenciación de glóbulos blancos se clasificaron como de origen en los glóbulos blancos, mientras que las variantes detectadas en cero familias de supermutantes de los glóbulos blancos se clasificaron como de origen tumoral (Figura S1 en el material suplementario). Para los pacientes que solo tenían secuenciación de glóbulos blancos, la cobertura locus-específica media fue de más de 2000 lecturas. Las variantes que no cumplieron con estos criterios se clasificaron como de origen desconocido y no se incluyeron en los análisis posteriores. Para la cohorte de validación independiente, utilizamos el origen de la mutación para cada variante según se describe en el material suplementario de la publicación original ([16]). Solo se incluyeron las mutaciones detectadas en pacientes con cáncer y clasificadas como “fenotipo coincidente con los glóbulos blancos”, “coincidente con la biopsia” o “coincidente con IMPACT-BAM”, mientras que se excluyeron las variantes de origen incierto. Para nuestros fines, se combinaron “coincidente con la biopsia” y “coincidente con IMPACT-BAM” como variantes derivadas del tumor.
Evaluación longitudinal de las características del fragmentoma del cfDNA
En la cohorte serial, se identificaron 41 variantes que estuvieron presentes en al menos dos puntos temporales separados para un paciente determinado. De estas, 23 variantes que se detectaron en una muestra recolectada en la línea de base también se incluyeron en la cohorte de entrenamiento. Para cada variante y en cada punto temporal, se calcularon estadísticas resumidas del fragmentoma del cfDNA sobre las lecturas en el locus dado, incluidas las distribuciones de longitud, los patrones de los motivos de los extremos de los fragmentos y las comparaciones estadísticas entre las lecturas mutadas y las lecturas de tipo salvaje (Tablas S4 y S5 en el material suplementario). Determinamos el origen de la variante mediante la comparación con la secuenciación coincidente de glóbulos blancos o tumores utilizando nuestros criterios detallados anteriormente; sin embargo, el origen de la variante no se consideró en la evaluación de la estabilidad longitudinal de las estadísticas resumidas del fragmentoma. Después de generar datos para cada punto temporal, se evaluó la correlación entre las estadísticas resumidas en los puntos temporales utilizando la correlación del producto-momento de Pearson en las muestras emparejadas (Tabla S5 en el material suplementario). Las pruebas estadísticas en las que la correlación a lo largo del tiempo tuvo un valor de P < 0,05 se incluyeron en el desarrollo del modelo de aprendizaje automático.
Aprendizaje automático
Se proporciona una descripción detallada de cada característica incorporada en el modelo de aprendizaje automático en la Tabla S4 en el material suplementario. En cada posición que contiene una variante de ctDNA, analizamos todos los fragmentos de cfDNA, comparando los fragmentos mutados y los fragmentos de tipo salvaje para calcular las métricas seleccionadas sobre las longitudes de los fragmentos, los motivos de los extremos de los fragmentos y las ubicaciones de los puntos finales de los fragmentos. Se realizaron comparaciones estadísticas entre las longitudes de los fragmentos utilizando la estadística de Kolmogorov-Smirnov y la estadística de Mann-Whitney U. Además, consideramos la puntuación delta S media absoluta, que refleja la diferencia absoluta media en la distribución de la longitud de los fragmentos entre los fragmentos mutados y los fragmentos de tipo salvaje, y la puntuación delta S máxima, que indica la diferencia observada máxima en la distribución de la longitud de los fragmentos ([29]). También calculamos la fracción de lecturas mutadas frente a lecturas de tipo salvaje con longitudes de lectura dentro de conjuntos más cortos o más largos ([31]). Los parámetros de análisis de motivos incluyeron la prueba de rango de Wilcoxon que compara la distribución de los motivos en los puntos de corte ascendentes y descendentes. Los motivos se determinaron a partir de las cuatro bases en cada extremo del fragmento. También calculamos la estadística de la prueba de rango de Wilcoxon para evaluar la distribución de las ubicaciones de los puntos finales de los fragmentos.
Las características a nivel de variante incluyeron la fracción alélica de la variante en las muestras de plasma, el número total de lecturas distintas, el número de lecturas distintas que contienen la mutación, una fracción alélica de la variante del plasma escalada, el estado del impulsor de la mutación, el recuento de variantes de COSMIC y la fracción de entradas de COSMIC que estaban relacionadas con las neoplasias hematológicas o linfoides tanto a nivel de variante como a nivel de gen. Se realizó todo el análisis de variantes y genes utilizando OpenCRAVAT ([33]). A las variantes que no tenían entradas en COSMIC se les asignó un valor de característica de -1. El estado del impulsor de la mutación fue una variable binaria y se evaluó utilizando CHASMplus, con puntuaciones >0,75 que indican mutaciones impulsoras ([42]). Para las variantes truncantes, en las que no se calcularon las puntuaciones de CHASMplus según el diseño del algoritmo, se consideraron las mutaciones de pérdida de función como impulsoras si ocurrían en supresores de tumores; todas las indels se clasificaron como impulsoras. La edad se incluyó como una característica a nivel del paciente. Las características de entrada se preprocesaron con centrado, escalado y transformación de Yeo-Johnson, y todo el preprocesamiento se realizó dentro de cada pliegue de validación cruzada. plasmaCHORD integró todas las características anteriores para calcular una puntuación de 0 a 1 para cada variante. Las puntuaciones de salida se binarizaron en un corte de 0,5 en el origen predicho de los glóbulos blancos y el tumor. plasmaCHORD se implementó utilizando XGBoost (versión 1.6.0.1, RRID: SCR021361) y el paquete caret (versión 6.0-92, RRID: SCR021138) en R. El entrenamiento del modelo se realizó utilizando una validación cruzada de 10 pliegues repetida 10 veces, optimizando el área bajo la curva de características operativas del receptor (ROC) (AUC). Aunque no incluimos la selección de características dentro del marco de validación cruzada, debido al menor número de pacientes con muestras seriales, cualquier sesgo en la evaluación del rendimiento de la validación cruzada derivado de la selección de características del fragmentoma sería limitado dado el pequeño solapamiento (5,4%) entre este subconjunto de variantes y el conjunto de entrenamiento completo. La importancia de las características se extrajo utilizando la función de importancia de las características integrada de caret.
Análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se realizaron en R versión 4.2.1 (RRID: SCR_001905). Las estadísticas resumidas del fragmentoma se describen en la Tabla S4 en el material suplementario. Para la cohorte serial, la correlación entre las estadísticas resumidas en los puntos temporales se determinó utilizando la correlación del producto-momento de Pearson entre las muestras emparejadas. En particular, la estadística F para la varianza y la estadística T para la longitud media del fragmento no estaban muy correlacionadas entre la línea de base y los puntos temporales de seguimiento y, por lo tanto, no se incluyeron en el modelo. La precisión de la predicción de plasmaCHORD en comparación con la hipótesis nula se evaluó utilizando una prueba binomial de un factor.
Aprobación ética y consentimiento del paciente
Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas reconocidas, incluida la Declaración de Helsinki, las directrices del Consejo de las Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas, el Informe Belmont y la Regla Común de los Estados Unidos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes por parte de los investigadores del estudio original. El uso de datos de secuenciación derivados de pacientes en la cohorte JH-MTB fue aprobado por el IRB de Johns Hopkins (IRB00058592).
Resultados
Evaluación de la frecuencia de la contaminación atribuida a los glóbulos blancos en las biopsias líquidas para la oncología de precisión
Para evaluar el impacto clínico de la contaminación por CH en las biopsias líquidas, realizamos un análisis retrospectivo de pacientes con tumores sólidos a los que se les realizó un perfilado molecular completo de biopsias líquidas como parte de la atención estándar y cuyos resultados fueron revisados por el JH-MTB (“Materiales y métodos”). Como parte del análisis de la utilidad clínica de las variantes, el JH-MTB proporciona una opinión experta sobre el posible origen de las variantes detectadas en la biopsia líquida, utilizando secuenciación NGS ortogonal del tumor, antecedentes clínicos, frecuencia alélica de la variante (VAF) y anotación de la variante (“Materiales y métodos”). Identificamos 45 pacientes con tumores sólidos que se sometieron a pruebas de biopsia líquida con al menos una variante, en las que el JH-MTB discutió un posible origen de la CH. De un total de 667 mutaciones de secuencia detectadas en estos casos, 142 (21,3 %) se caracterizaron como de posible origen de la CH por el JH-MTB (Fig. 1A). Solo 83 (de nuestras 142, 58,5 %) variantes se encontraron en genes que se asocian típicamente con la CH (ASXL1, ATM, CBL, CHEK2, DNMT3A, IDH1, IDH2, JAK2, PPM1D, RUNX1, SF3B1, SRSF2, TET2, U2AF1), lo que sugiere que confiar únicamente en un enfoque basado en reglas genéticas para clasificar las variantes como de origen de la CH puede ser inadecuado. De las variantes clasificadas como de posible origen de la CH, nueve variantes (6,3 %) se encontraron en TP53, un gen que se muta comúnmente tanto en tumores sólidos como hematológicos. Cabe destacar que, además de TP53, nueve variantes adicionales clasificadas como de posible origen de la CH se encontraron en puntos calientes de tumores sólidos en COSMIC (definidos como variantes con ≥ 10 casos reportados en COSMIC en tumores no hematológicos, excluyendo los genes comunes de la CH), incluyendo GNAS p.R201H (n = 3); BRAF p.D594N, p.G469E y p.G466E; y KRAS p.G12V (Fig. 1A; Tabla suplementaria S6). A pesar de que se informaron como puntos calientes en tumores sólidos, estas variantes fueron caracterizadas por el JH-MTB como de posible origen de la CH basándose en el linaje del cáncer y el análisis de la secuenciación NGS del tejido tumoral correspondiente. Aunque estas variantes representan una minoría de los casos, resaltan los desafíos para determinar con precisión el origen celular, lo que no se puede resolver mediante heurísticas comúnmente utilizadas, incluyendo los genes que se alteran canónicamente en linajes específicos y/o las mutaciones impulsoras.
Enfoque general
Para diferenciar las variantes de origen de la CH de las variantes de origen tumoral en la secuenciación NGS solo de plasma, buscamos desarrollar un modelo de aprendizaje automático que prediga el origen de la variante aprovechando la secuenciación solo de plasma. Se utilizaron la secuenciación de glóbulos blancos (WBC) y tumores correspondientes para establecer el origen de referencia para cada variante de plasma, que luego sirvió como la verdad fundamental para entrenar el modelo basándose en las características fragmentómicas del ADNcf, las características de la variante y la edad del paciente (Fig. 1B). Primero, reunimos una cohorte de prueba de 225 pacientes con cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de ovario, CPNP o CPCP en estadio I a IV, a los que se les realizó secuenciación de ADN de plasma, WBC y captura híbrida de corrección de errores de tumores como parte de protocolos clínicos terapéuticos o de biomarcadores (“Materiales y métodos”; referencias [18], [20], [22], [31]–[36]). Para cada variante de ADNcf detectada, determinamos el origen de referencia utilizando la secuenciación NGS de WBC y ADN tumoral correspondientes como estándar de oro (Fig. 1B). El origen de referencia se resolvió para 444 variantes; las variantes con origen no resuelto se excluyeron (“Materiales y métodos”). Se utilizó un subconjunto de la cohorte de entrenamiento que incluía variantes de pacientes con muestras de plasma en serie (41 variantes de 29 pacientes) para evaluar las características fragmentómicas estables del ADNcf para su incorporación en plasmaCHORD, un modelo de aprendizaje automático para la predicción del origen de la CH frente al origen tumoral. La precisión del modelo se determinó mediante la comparación con el origen de referencia utilizando la validación cruzada dentro del conjunto de entrenamiento. Posteriormente, se evaluó un modelo bloqueado y un punto de corte derivados del conjunto de entrenamiento completo en una cohorte independiente de 114 pacientes con cáncer en estadio IV (1418 variantes; “Materiales y métodos”) y en casos seleccionados de un ensayo clínico prospectivo de oncología de precisión (NCT05585684; “Materiales y métodos”).
Selección de características mediante evaluaciones en serie del fragmentoma del ADNcf
Para incorporar las características del fragmentoma del ADNcf en plasmaCHORD, primero identificamos estadísticas resumidas que capturan de manera consistente las diferencias en los patrones de fragmentación entre los fragmentos de ADNcf mutados derivados del tumor y los fragmentos mutados derivados de la CH en comparación con las moléculas de ADNcf de tipo salvaje. Los fragmentos de ADNcf derivados del tumor pueden tener diferentes distribuciones de la longitud de los fragmentos (típicamente más cortas) y ubicaciones desplazadas de los extremos de los fragmentos, mientras que las características de los fragmentos derivados de la CH a menudo son similares a los fragmentos derivados de los WBC ([19], [30]). Sin embargo, estas diferencias no representan patrones universales, y el origen de la variante no se puede resolver basándose en una única evaluación de las longitudes y los extremos de los fragmentos. La distribución de la longitud de los fragmentos mutados puede superponerse a la de los fragmentos de tipo salvaje, y la ubicación de los extremos de los fragmentos en relación con la ubicación de la mutación puede ser similar entre los fragmentos de ADNcf mutados y de tipo salvaje (Fig. S2 suplementaria). Basándonos en estas observaciones, hipotetizamos que la integración de múltiples características basadas en el fragmentoma del ADNcf capturaría de manera más completa las diversas diferencias fragmentómicas entre las moléculas mutadas derivadas del tumor y de la CH.
Razonamos que las estadísticas resumidas de la fragmentación que son más representativas de las diferencias biológicas en la fragmentación del ADNcf entre el cáncer y los tejidos no cancerosos serían estables en el tiempo. Por lo tanto, evaluamos la correlación en el tiempo entre diferentes estadísticas resumidas de la fragmentación en la cohorte en serie (Fig. S2 suplementaria; Tablas S2 y S5 suplementarias; “Materiales y métodos”; referencias [29], [31]). Las estadísticas resumidas de la fragmentación que estaban significativamente correlacionadas entre los puntos de tiempo inicial y de seguimiento (P < 0,05) se incorporaron posteriormente como características en plasmaCHORD y se enumeran en las Tablas S4 y S5 suplementarias (“Materiales y métodos”).
Rendimiento analítico del modelo plasmaCHORD en la cohorte de entrenamiento
Compilamos un conjunto de entrenamiento de 426 variantes identificadas en la secuenciación NGS del plasma de 225 pacientes con CPNP, CPCP, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago y cáncer de ovario en estadio I a IV (Fig. S3 suplementaria). La edad media de los pacientes en esta cohorte fue de 65 años (rango, 19–87), y la mayoría de los pacientes presentaban enfermedad en estadio temprano (22 en estadio I, 101 en estadio II, 48 en estadio III, 53 en estadio IV y 1 en estadio desconocido; Fig. S4 suplementaria). Se realizó secuenciación NGS del tumor correspondiente en 152 (67,6 %) de los casos. Se utilizó la secuenciación de WBC y tumores correspondientes (si estaba disponible) para determinar el origen de referencia de las variantes de ADNcf en la cohorte de entrenamiento, identificando 217 (50,9 %) variantes derivadas de WBC y 209 (49,1 %) variantes derivadas del tumor (Fig. 2A; Tabla S1 suplementaria). Las variantes de origen tumoral presentaban una frecuencia alélica de la variante (VAF) significativamente más alta en comparación con las variantes de origen de la CH (VAF media de 0,084 frente a 0,023, prueba t de dos muestras de Welch P = 4,634e−07; Fig. 2B). Sin embargo, dada la importante superposición en las distribuciones de VAF entre las variantes tumorales y de la CH, solo la VAF pudo distinguir el origen de la variante con un AUC de la curva ROC de 0,61 (intervalo de confianza del 95 %, 0,56–0,67, Fig. 2C).
Luego, combinamos las características a nivel de variante, gen y paciente con las características fragmentómicas del ADNcf; dado que existe una asociación entre la edad y la CH ([10], [13], [43], [44]), incluimos la edad del paciente como una característica a nivel de paciente, junto con las anotaciones de la variante y del gen de las neoplasias hematológicas frente a la frecuencia de tumores sólidos en COSMIC (Fig. 3A; Tabla S4 suplementaria). Las características a nivel de variante incluyeron la cobertura específica del alelo, la VAF, la VAF escalada en relación con todas las demás variantes identificadas en una muestra de plasma determinada, el tipo de mutación, la sustitución de un solo nucleótido y la probabilidad de mutación impulsora (Fig. 3A; Tabla S4 suplementaria). Evaluamos el rendimiento predictivo de cada característica del modelo individualmente y encontramos que las características individuales distinguían el origen de la variante del plasma con un AUC de la curva ROC que oscilaba entre 0,55 y 0,86 (Fig. S5 suplementaria). La característica individual de mejor rendimiento fue la fracción de genes de heme, que es la frecuencia con la que un gen se muta en neoplasias hematológicas frente a todos los tipos de cáncer, según se informa en COSMIC (AUC = 0,86; referencia [34]). Al integrar las características de múltiples niveles utilizando el algoritmo XGBoost, plasmaCHORD mejoró la precisión de la predicción del origen de la variante a un AUC de 0,94 (intervalo de confianza del 95 %, 0,85–1, validación cruzada de 10 veces repetida 10 veces; Fig. 3B). El análisis de la importancia de las características del modelo reveló que las cinco características más importantes para la predicción del origen de la variante incluyeron una característica a nivel de variante (fracción de genes de heme), tres características fragmentómicas del ADNcf (longitud del clúster mutado, prueba de Mann-Whitney U (MWU) de la longitud y longitud del delta S máximo) y la edad del paciente (Fig. 3C). Dada la mayor incertidumbre en las estadísticas que resumen las diferencias fragmentómicas en el contexto de un pequeño número de fragmentos mutados, examinamos el impacto del número de lecturas mutadas en el rendimiento de plasmaCHORD. El rendimiento del modelo fue ligeramente menor cuando se limitó a los fragmentos de ADN mutado con el respaldo de 3 a 5 lecturas mutadas (AUC = 0,84) y aumentó a un AUC de al menos 0,89 para las variantes con el respaldo de > 5 lecturas mutadas (Fig. S6 suplementaria). Después de la optimización del modelo utilizando la cohorte de entrenamiento, plasmaCHORD se bloqueó para su evaluación en una cohorte de validación independiente de 114 pacientes con cáncer en estadio IV (1418 variantes; “Materiales y métodos”) y en casos seleccionados de un ensayo clínico prospectivo de oncología de precisión (NCT05585684; “Materiales y métodos”).
Rendimiento analítico del modelo plasmaCHORD en la cohorte de entrenamiento
Reunimos un conjunto de entrenamiento de 426 variantes identificadas en la secuenciación NGS del plasma de 225 pacientes con CPNP, CPCP y cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago y cáncer de ovario en estadio I a IV (Fig. S3 suplementaria). La edad media de los pacientes en esta cohorte fue de 65 años (rango, 19–87), y la mayoría de los pacientes presentaban enfermedad en estadio temprano (22 en estadio I, 101 en estadio II, 48 en estadio III, 53 en estadio IV y 1 en estadio desconocido; Fig. S4 suplementaria). Se realizó secuenciación NGS del tumor correspondiente en 152 (67,6 %) de los casos. Se utilizó la secuenciación de WBC y tumores correspondientes (si estaba disponible) para determinar el origen de referencia de las variantes de ADNcf en la cohorte de entrenamiento, identificando 217 (50,9 %) variantes derivadas de WBC y 209 (49,1 %) variantes derivadas del tumor (Fig. 2A; Tabla S1 suplementaria). Las variantes de origen tumoral presentaban una frecuencia alélica de la variante (VAF) significativamente más alta en comparación con las variantes de origen de la CH (VAF media de 0,084 frente a 0,023, prueba t de dos muestras de Welch P = 4,634e−07; Fig. 2B). Sin embargo, dada la importante superposición en las distribuciones de VAF entre las variantes tumorales y de la CH, solo la VAF pudo distinguir el origen de la variante con un AUC de la curva ROC de 0,61 (intervalo de confianza del 95 %, 0,56–0,67, Fig. 2C).
Luego, combinamos las características a nivel de variante, gen y paciente con las características fragmentómicas del ADNcf; dado que existe una asociación entre la edad y la CH ([10], [13], [43], [44]), incluimos la edad del paciente como una característica a nivel de paciente, junto con las anotaciones de la variante y del gen de las neoplasias hematológicas frente a la frecuencia de tumores sólidos en COSMIC (Fig. 3A; Tabla S4 suplementaria). Las características a nivel de variante incluyeron la cobertura específica del alelo, la VAF, la VAF escalada en relación con todas las demás variantes identificadas en una muestra de plasma determinada, el tipo de mutación, la sustitución de un solo nucleótido y la probabilidad de mutación impulsora (Fig. 3A; Tabla S4 suplementaria). Evaluamos el rendimiento predictivo de cada característica del modelo individualmente y encontramos que las características individuales distinguían el origen de la variante del plasma con un AUC de la curva ROC que oscilaba entre 0,55 y 0,86 (Fig. S5 suplementaria). La característica individual de mejor rendimiento fue la fracción de genes de heme, que es la frecuencia con la que un gen se muta en neoplasias hematológicas frente a todos los tipos de cáncer, según se informa en COSMIC (AUC = 0,86; referencia [34]). Al integrar las características de múltiples niveles utilizando el algoritmo XGBoost, plasmaCHORD mejoró la precisión de la predicción del origen de la variante a un AUC de 0,94 (intervalo de confianza del 95 %, 0,85–1, validación cruzada de 10 veces repetida 10 veces; Fig. 3B). El análisis de la importancia de las características del modelo reveló que las cinco características más importantes para la predicción del origen de la variante incluyeron una característica a nivel de variante (fracción de genes de heme), tres características fragmentómicas del ADNcf (longitud del clúster mutado, prueba de Mann-Whitney U (MWU) de la longitud y longitud del delta S máximo) y la edad del paciente (Fig. 3C). Dada la mayor incertidumbre en las estadísticas que resumen las diferencias fragmentómicas en el contexto de un pequeño número de fragmentos mutados, examinamos el impacto del número de lecturas mutadas en el rendimiento de plasmaCHORD. El rendimiento del modelo fue ligeramente menor cuando se limitó a los fragmentos de ADN mutado con el respaldo de 3 a 5 lecturas mutadas (AUC = 0,84) y aumentó a un AUC de al menos 0,89 para las variantes con el respaldo de > 5 lecturas mutadas (Fig. S6 suplementaria). Después de la optimización del modelo utilizando la cohorte de entrenamiento, plasmaCHORD se bloqueó para su evaluación en una cohorte de validación independiente de 114 pacientes con cáncer en estadio IV (1418 variantes; “Materiales y métodos”) y en casos seleccionados de un ensayo clínico prospectivo de oncología de precisión (NCT05585684; “Materiales y métodos”).
Precisión de la clasificación del origen de la variante en una cohorte multicéntrica independiente
Utilizando el modelo bloqueado y el punto de corte preespecificado, examinamos el rendimiento de plasmaCHORD en una cohorte de validación independiente de 114 pacientes con cáncer metastásico de mama, CPNP y cáncer de próstata ([16]). Dentro de la cohorte de validación, había 1418 variantes con origen resuelto mediante secuenciación correspondiente (507 derivadas del tumor y 911 derivadas de la CH; Fig. 4A y B; Fig. S7 suplementaria; Tabla S3 suplementaria). Utilizando el punto de corte preespecificado de 0,5, plasmaCHORD predijo el origen de la variante con una sensibilidad del 82 %, una especificidad del 80,3 % y una precisión del 80,2 % (P < 2e−16 en comparación con la tasa de información nula del 0,61; Fig. 4C) y un AUC de 0,902 (Fig. 4D).
A continuación, examinamos el rendimiento de plasmaCHORD por tipo de cáncer y gen en comparación con la suposición nula de que todas las variantes detectadas en el plasma son de origen tumoral. PlasmaCHORD mejoró significativamente la precisión de la predicción del origen de la variante en los diferentes tipos de cáncer en la cohorte de validación, con una precisión del 77,7 % en el cáncer de mama (P = 1,02e−12 en comparación con la tasa de información nula), 82,4 % en el CPNP (P = 2,2e−16 en comparación con la tasa de información nula) y 81,8 % en el cáncer de próstata (P = 3,14e−7 en comparación con la tasa de información nula; Fig. 5A). Cabe destacar que la cohorte de entrenamiento no incluyó a ningún paciente con cáncer de próstata, pero plasmaCHORD funcionó igualmente bien en la predicción del origen de la variante en este subconjunto en la cohorte de validación independiente.
A continuación, evaluamos el rendimiento del modelo por separado para las variantes que afectan a genes clínicamente relevantes, como TP53, así como para los genes que se mutan comúnmente tanto en tumores sólidos como en CH, aunque no se consideren parte de los genes canónicos de CH (es decir, AKT1, BRCA1, BRCA2 y EGFR). Se identificaron sesenta y cuatro mutaciones dentro de este último conjunto de genes, de las cuales 31 (48,4 %) tenían origen tumoral y 33 (51,6 %) tenían origen en CH. PlasmaCHORD predijo el origen de las variantes en este conjunto de genes de origen mixto y clínicamente relevante con una precisión del 82,8 % (prueba binomial unilateral, P = 1,84e−7; Fig. 5B). De manera similar, para TP53, que se muta comúnmente tanto en CH como en tumores sólidos, se identificaron 78 variantes en la cohorte de validación, de las cuales 51 (65,4 %) tenían origen tumoral y 27 (34,6 %) tenían origen en las células sanguíneas blancas (WBC). PlasmaCHORD predijo el origen de las variantes con una precisión del 76,9 % (en comparación con el 65,4 % bajo la hipótesis nula; prueba binomial unilateral, P = 0,019; Fig. 5B). Los valores de VAF y la distribución a lo largo del gen de las mutaciones de TP53 identificadas en la cohorte de validación no muestran un patrón distintivo evidente, lo que destaca los desafíos de determinar el origen celular de las mutaciones de TP53 en la secuenciación de nueva generación (NGS) basada únicamente en plasma (Fig. 5C).
Examinamos además el impacto de aplicar plasmaCHORD a la cohorte de validación, excluyendo todas las variantes en los genes que se consideran típicamente asociados con CH (DNMT3A, TET2, ASXL1, PPM1D, JAK2, IDH1, IDH2, RUNX1, CHEK2, CBL, SF3B1, SRSF2, U2AF1, ATM). En la cohorte de validación, solo el 48 % de las variantes que se encuentran en genes distintos del conjunto típico de CH tenían origen tumoral. Es importante destacar que, si se aplicara un enfoque basado en genes para la clasificación de variantes, todas estas variantes se clasificarían como de origen tumoral, lo que daría lugar a una clasificación errónea del 52 % de las variantes que tienen origen en CH. La aplicación de plasmaCHORD para predecir el origen de las variantes en este conjunto dio como resultado una mejora significativa en la precisión, del 75,7 % (prueba binomial unilateral, P < 2,2e−16; Fig. 5B), lo que demuestra una ventaja sobre las heurísticas basadas en genes. En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que la integración de características del huésped, del gen, de la variante y de la fragmentómica del ADN libre en el plasma en un modelo de aprendizaje automático multifactorial mejora la precisión de las predicciones del origen de las variantes en el plasma en múltiples tipos de tumores y conjuntos de genes clínicamente relevantes.
Aplicación de prueba de concepto a un ensayo clínico prospectivo de biopsia líquida
Como prueba de concepto de la utilidad clínica de este enfoque, aplicamos el modelo bloqueado de plasmaCHORD a las muestras de biopsia líquida obtenidas como parte de un ensayo prospectivo que evalúa la utilidad clínica de las biopsias líquidas en pacientes con tumores sólidos metastásicos (NCT05585684; "Materiales y métodos"). Identificamos dos pacientes que presentaban variantes potencialmente relevantes detectadas mediante biopsias líquidas que, tras su revisión por parte del JH-MTB, se consideraron probablemente de origen en CH y, por lo tanto, no se siguieron terapias dirigidas al genotipo (Fig. 6A y B). En el primer caso, se detectó una mutación ATM p.W3052* en una biopsia líquida de un paciente con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) metastásico con fusión EML-ALK positivo que había progresado con alectinib. Aunque se podría haber recomendado una terapia con inhibidores de PARP para dirigirse a la mutación ATM si tuviera origen tumoral, el JH-MTB determinó que esta variante tenía probablemente origen en CH y, por lo tanto, no recomendó una terapia con inhibidores de PARP. De manera similar, en el segundo caso, se encontró que un paciente con CPNM que había progresado tras una quimioterapia y radioterapia previas presentaba una mutación EZH2 p.R583* en las pruebas de biopsia líquida, que, si tuviera origen tumoral, podría tratarse con tazemetostat. El JH-MTB concluyó que esta variante tenía probablemente origen en CH y no recomendó dirigir el tratamiento a esta alteración. En ambos casos, plasmaCHORD predijo que las variantes ATM y EZH2 tenían origen en CH. La secuenciación ad hoc de las células sanguíneas blancas (WBC) confirmó el origen en CH de ambas variantes, lo que validó de forma independiente la precisión de la clasificación del origen de las variantes por parte de plasmaCHORD. En conjunto, nuestro trabajo apoya la posible utilidad clínica de plasmaCHORD, con el objetivo de prevenir la selección subóptima de terapias dirigidas al genotipo.
Evaluación de la frecuencia de la contaminación atribuida a CH en las biopsias líquidas para la oncología de precisión
Para evaluar el impacto clínico de la contaminación por CH en las biopsias líquidas, realizamos un análisis retrospectivo de pacientes con tumores sólidos a los que se les realizó un perfilado molecular integral de biopsia líquida como parte de la atención estándar y que fue revisado por el JH-MTB ("Materiales y métodos"). Como parte del análisis de la utilidad clínica de las variantes, el JH-MTB proporciona una opinión experta sobre el posible origen de las variantes detectadas en la biopsia líquida, utilizando la secuenciación de NGS del tumor ortogonal, la historia clínica, el VAF y la anotación de las variantes ("Materiales y métodos"). Identificamos 45 pacientes con tumores sólidos que se sometieron a pruebas de biopsia líquida con al menos una variante, en las que el JH-MTB analizó un posible origen en CH. Entre un total de 667 mutaciones de secuencia detectadas en estos casos, 142 (21,3 %) se caracterizaron como de posible origen en CH por el JH-MTB (Fig. 1A). Solo 83 (de nuestras 142, 58,5 %) variantes se encontraron en genes que se asocian típicamente con CH (ASXL1, ATM, CBL, CHEK2, DNMT3A, IDH1, IDH2, JAK2, PPM1D, RUNX1, SF3B1, SRSF2, TET2, U2AF1), lo que sugiere que depender únicamente de un enfoque basado en genes para clasificar las variantes como de origen en CH puede ser inadecuado. De las variantes clasificadas como de posible origen en CH, nueve variantes (6,3 %) se encontraron en TP53, un gen que se muta comúnmente tanto en CH como en neoplasias hematológicas. En particular, además de TP53, nueve variantes adicionales clasificadas como de posible origen en CH se encontraron en puntos calientes de tumores sólidos de COSMIC (definidos como variantes con ≥10 casos informados en COSMIC en neoplasias no hematológicas, excluyendo los genes comunes de CH), que incluyen GNAS p.R201H (n = 3); BRAF p.D594N, p.G469E y p.G466E; y KRAS p.G12V (Fig. 1A; Tabla S6 del suplemento). A pesar de que se informaron como puntos calientes en tumores sólidos, estas variantes se caracterizaron como de posible origen en CH por el JH-MTB basándose en el linaje del cáncer y el análisis de la secuenciación de NGS del tumor correspondiente. Aunque estas variantes representan una minoría de los casos, destacan los desafíos para determinar con precisión el origen celular que no se pueden resolver mediante heurísticas comúnmente utilizadas, incluidos los genes que se alteran de forma canónica en linajes específicos y/o las mutaciones impulsoras.
Enfoque general
Para diferenciar las variantes de origen en CH de las variantes de origen tumoral en la NGS basada únicamente en plasma, buscamos desarrollar un modelo de aprendizaje automático que prediga el origen de las variantes aprovechando la secuenciación basada únicamente en plasma. Se utilizaron la secuenciación correspondiente de las células sanguíneas blancas (WBC) y del tumor para establecer el origen de referencia de cada variante del plasma, que luego sirvió como la verdad fundamental para entrenar el modelo basándose en las características de la fragmentómica del ADN libre en el plasma (cfDNA), las características de la variante y la edad del paciente (Fig. 1B). Primero, ensamblamos una cohorte de prueba de 225 pacientes con cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de ovario, CPNM o cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) en estadio I a IV que se sometieron a secuenciación de captura híbrida de corrección de errores de ADN de plasma, WBC y tumor como parte de protocolos clínicos terapéuticos o de biomarcadores ("Materiales y métodos"; referencias [18], [20], [22], [31]–[36]). Para cada variante de cfDNA detectada, determinamos el origen de referencia utilizando la secuenciación de WBC y ADN de tumor correspondientes como estándar de oro (Fig. 1B). Se resolvió el origen de referencia para 444 variantes; las variantes con origen no resuelto se excluyeron ("Materiales y métodos"). Se utilizó un subconjunto de la cohorte de entrenamiento que incluía variantes de pacientes con muestras de plasma en serie (41 variantes de 29 pacientes) para evaluar las características de la fragmentómica del cfDNA estables para su incorporación en plasmaCHORD, un modelo de aprendizaje automático para la predicción del origen en CH frente al origen tumoral. La precisión del modelo se determinó mediante la comparación con el origen de referencia utilizando la validación cruzada dentro del conjunto de entrenamiento. Un modelo bloqueado y un punto de corte derivados del conjunto de entrenamiento completo se evaluaron posteriormente en una cohorte independiente de 114 pacientes con cáncer en estadio IV (1418 variantes; "Materiales y métodos") y en casos seleccionados de un ensayo clínico prospectivo de biopsia líquida (NCT05585684; "Materiales y métodos").
Selección de características mediante evaluaciones en serie de la fragmentómica del cfDNA
Para incorporar las características de la fragmentómica del cfDNA en plasmaCHORD, primero identificamos las estadísticas resumidas que capturan de forma coherente las diferencias en los patrones de fragmentación entre los fragmentos de cfDNA mutados de origen tumoral y los fragmentos mutados de origen en CH en comparación con las moléculas de cfDNA de tipo salvaje. Los fragmentos de cfDNA de origen tumoral pueden tener diferentes distribuciones de la longitud de los fragmentos (normalmente más cortas) y ubicaciones desplazadas de los extremos de los fragmentos, mientras que las características de los fragmentos de origen en CH a menudo son similares a los fragmentos derivados de las WBC ([19], [30]). Sin embargo, estas diferencias no representan patrones universales, y el origen de las variantes no se puede resolver basándose en una única evaluación de las longitudes y los extremos de los fragmentos. La distribución de la longitud de los fragmentos mutados puede superponerse a la de los fragmentos de tipo salvaje, y la ubicación de los extremos de los fragmentos en relación con la ubicación de la mutación puede ser similar entre los fragmentos de cfDNA mutados y de tipo salvaje (Fig. S2 del suplemento). Basándonos en estas observaciones, hipotetizamos que la integración de múltiples características basadas en la fragmentómica del cfDNA capturaría de forma más completa las diversas diferencias de fragmentómica entre las moléculas mutadas de origen tumoral y de origen en CH.
Razonamos que las estadísticas resumidas de la fragmentación que son más representativas de las diferencias biológicas en la fragmentación del cfDNA entre el cáncer y los tejidos no cancerosos serían estables en el tiempo. Por lo tanto, evaluamos la correlación en el tiempo entre diferentes estadísticas resumidas de la fragmentación en la cohorte en serie (Fig. S2 del suplemento; Tablas S2 y S5 del suplemento; "Materiales y métodos"; referencias [29], [31]). Las estadísticas resumidas de la fragmentación que estaban significativamente correlacionadas entre los puntos de tiempo inicial y de seguimiento (P < 0,05) se incorporaron posteriormente como características en plasmaCHORD y se enumeran en las Tablas S4 y S5 del suplemento ("Materiales y métodos").
Rendimiento analítico del modelo plasmaCHORD en la cohorte de entrenamiento
Compilamos un conjunto de entrenamiento de 426 variantes identificadas en la NGS del plasma de 225 pacientes con CPNM, CPCP y cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago y cáncer de ovario en estadio I a IV (Fig. S3 del suplemento). La edad media de los pacientes en esta cohorte fue de 65 años (rango, 19–87), y la mayoría de los pacientes presentaban enfermedad en estadio temprano (22 en estadio I, 101 en estadio II, 48 en estadio III, 53 en estadio IV y 1 de estadio desconocido; Fig. S4 del suplemento). Se realizó NGS del tumor en 152 (67,6 %) de los casos. Se utilizó la secuenciación correspondiente de WBC y tumor (si estaba disponible) para determinar el origen de referencia de las variantes de cfDNA en la cohorte de entrenamiento, lo que identificó 217 (50,9 %) variantes derivadas de WBC y 209 (49,1 %) variantes derivadas del tumor (Fig. 2A; Tabla S1 del suplemento). Las variantes de origen tumoral presentaban valores de VAF significativamente más altos en comparación con las variantes de origen en CH (VAF medio 0,084 frente a 0,023, prueba t de Welch, P = 4,634e−07; Fig. 2B). Sin embargo, dado que existe una superposición significativa en las distribuciones de VAF entre las variantes de origen tumoral y de origen en CH, solo el VAF pudo distinguir el origen de las variantes con un AUC de la curva ROC de 0,61 (intervalo de confianza del 95 %, 0,56–0,67, Fig. 2C).
A continuación, combinamos las características a nivel de variante, gen y paciente con las características fragmentómicas del ADNcf; dado que existe una asociación entre la edad y la clonalidad hematopoyética (CH) ([10], [13], [43], [44]), incluimos la edad del paciente como una característica a nivel de paciente, junto con las anotaciones de variantes y genes de las neoplasias hematológicas notificadas en comparación con la frecuencia de tumores sólidos en COSMIC (Fig. 3A; Tabla S4 complementaria). Las características a nivel de variante incluyeron la cobertura específica del alelo, la frecuencia alélica de la variante (VAF), la VAF escalada en relación con todas las demás variantes identificadas en una muestra de plasma determinada, el tipo de mutación, la sustitución de un solo nucleótido y la probabilidad de mutación causante (Fig. 3A; Tabla S4 complementaria). Evaluamos el rendimiento predictivo de cada característica del modelo individualmente y descubrimos que las características individuales distinguían el origen de la variante plasmática con un AUC-ROC que oscilaba entre 0,55 y 0,86 (Fig. S5 complementaria). La característica individual con mejor rendimiento fue la fracción génica de hemo, que es la frecuencia con la que un gen está mutado en neoplasias hematológicas en comparación con todos los tipos de cáncer, según se informa en COSMIC (AUC = 0,86; ref. [34]). Al integrar las características de múltiples niveles mediante el algoritmo XGBoost, plasmaCHORD mejoró la precisión de la predicción del origen de la variante hasta un AUC de 0,94 (intervalo de confianza del 95 %, 0,85–1, validación cruzada de 10 pliegues repetida 10 veces; Fig. 3B). El análisis de la importancia de las características del modelo reveló que las cinco características más importantes para la predicción del origen de la variante incluyeron una característica a nivel de variante (fracción génica de hemo), tres características fragmentómicas del ADNcf (clúster de longitud mutante, prueba U de Mann-Whitney (MWU) y delta S máximo de longitud) y la edad del paciente (Fig. 3C). Dado el aumento relativo de la incertidumbre en las estadísticas que resumen las diferencias fragmentómicas en el contexto de un pequeño número de fragmentos mutantes, examinamos el impacto del número de lecturas mutantes en el rendimiento de plasmaCHORD. El rendimiento del modelo fue ligeramente inferior cuando se limitó a los fragmentos de ADN mutante que contaban con 3 a 5 lecturas mutantes (AUC = 0,84) y aumentó hasta un AUC de al menos 0,89 para las variantes que contaban con >5 lecturas mutantes (Fig. S6 complementaria). Después de la optimización del modelo utilizando la cohorte de entrenamiento, plasmaCHORD se bloqueó para su evaluación en una cohorte de validación independiente utilizando una puntuación de 0,5 como umbral para distinguir las variantes de origen tumoral frente a CH (“Materiales y métodos”).
Precisión de la clasificación del origen de la variante en una cohorte multicéntrica independiente
Utilizando el modelo bloqueado y el umbral preespecificado, examinamos el rendimiento de plasmaCHORD en una cohorte de validación independiente de 114 pacientes con cáncer de mama metastásico, CPNM y cáncer de próstata ([16]). Dentro de la cohorte de validación, hubo 1418 variantes con origen resuelto mediante secuenciación emparejada (507 derivadas del tumor y 911 derivadas de CH; Fig. 4A y B; Fig. S7 complementaria; Tabla S3 complementaria). Utilizando el umbral de puntuación preespecificado de 0,5, plasmaCHORD predijo el origen de la variante con una sensibilidad del 82 %, una especificidad del 80,3 % y una precisión del 80,2 % (P < 2e−16 en comparación con la tasa de información nula de 0,61; Fig. 4C) y un AUC de 0,902 (Fig. 4D).
A continuación, examinamos el rendimiento de plasmaCHORD por tipo de cáncer y gen en comparación con la hipótesis nula de que todas las variantes detectadas en el plasma son de origen tumoral. plasmaCHORD mejoró significativamente la precisión de la predicción del origen de la variante en los diferentes tipos de cáncer en la cohorte de validación, con una precisión del 77,7 % en el cáncer de mama (P = 1,02e−12 en comparación con la tasa de información nula), 82,4 % en el CPNM (P = 2,2e−16 en comparación con la tasa de información nula) y 81,8 % en el cáncer de próstata (P = 3,14e−7 en comparación con la tasa de información nula; Fig. 5A). Cabe destacar que la cohorte de entrenamiento no incluyó a ningún paciente con cáncer de próstata, pero plasmaCHORD tuvo un rendimiento igualmente bueno en la predicción del origen de la variante en este subconjunto en la cohorte de validación independiente.
Luego, evaluamos el rendimiento del modelo por separado para las variantes que afectan a los genes clínicamente relevantes, TP53, así como para los genes que se mutan comúnmente tanto en tumores sólidos como en CH, aunque no se consideran parte de los genes canónicos de CH (es decir, AKT1, BRCA1, BRCA2 y EGFR). Sesenta y cuatro mutaciones ocurrieron dentro de este último conjunto de genes, de las cuales 31 (48,4 %) fueron de origen tumoral y 33 (51,6 %) fueron variantes de origen CH. plasmaCHORD predijo el origen de las variantes en este conjunto de genes de origen mixto y clínicamente relevantes con una precisión del 82,8 % (prueba binomial unilateral P = 1,84e−7; Fig. 5B). De manera similar, para TP53, que se muta comúnmente tanto en CH como en tumores sólidos, se identificaron 78 variantes en la cohorte de validación, de las cuales 51 (65,4 %) eran de origen tumoral y 27 (34,6 %) eran de origen de células sanguíneas blancas (WBC). plasmaCHORD predijo el origen de la variante con una precisión del 76,9 % (en comparación con el 65,4 % según la hipótesis nula; prueba binomial unilateral P = 0,019; Fig. 5B). Las VAF y la distribución a lo largo del gen de las mutaciones de TP53 identificadas en la cohorte de validación no muestran un patrón distintivo obvio, lo que destaca los desafíos de determinar el origen celular de las mutaciones de TP53 en la secuenciación de nueva generación (NGS) solo con plasma (Fig. 5C).
Examinamos además el impacto de aplicar plasmaCHORD a la cohorte de validación cuando se excluyen todas las variantes en los genes que se consideran típicamente asociados con CH (DNMT3A, TET2, ASXL1, PPM1D, JAK2, IDH1, IDH2, RUNX1, CHEK2, CBL, SF3B1, SRSF2, U2AF1, ATM). En la cohorte de validación, solo el 48 % de las variantes que ocurren en genes que excluyen el conjunto típico de CH fueron de origen tumoral. Es importante destacar que, si se aplicara un enfoque basado en genes para la clasificación de variantes, todas estas variantes se clasificarían como de origen tumoral, clasificando erróneamente el 52 % de las variantes que son de origen CH. La aplicación de plasmaCHORD para predecir el origen de la variante en este conjunto dio como resultado una mejora significativa en la precisión del 75,7 % (prueba binomial unilateral P < 2,2e−16; Fig. 5B), lo que demuestra una ventaja sobre las heurísticas basadas en genes. En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que la integración de características del huésped, del gen, de la variante y fragmentómicas del ADNcf en un modelo de aprendizaje automático de múltiples características mejora la precisión de las predicciones del origen de la variante plasmática en múltiples tipos de tumores y conjuntos de genes clínicamente relevantes.
Aplicación de prueba de concepto a un ensayo clínico prospectivo de biopsia líquida
Como prueba de concepto de la utilidad clínica de este enfoque, aplicamos el modelo plasmaCHORD bloqueado a las muestras de biopsia líquida obtenidas como parte de un ensayo prospectivo que evalúa la utilidad clínica de las biopsias líquidas en pacientes con tumores sólidos metastásicos (NCT05585684; “Materiales y métodos”). Identificamos dos pacientes que presentaban variantes potencialmente relevantes detectadas mediante biopsias líquidas que, tras su revisión por parte del JH-MTB, se consideraron probablemente de origen CH y, por lo tanto, no se siguieron terapias dirigidas al genotipo (Fig. 6A y B). En el primer caso, se detectó una mutación ATM p.W3052* en una biopsia líquida de un paciente con CPNM EML-ALK positivo metastásico que había progresado con alectinib. Aunque se podría haber recomendado una terapia con inhibidores de PARP para dirigirse a la mutación ATM si fuera de origen tumoral, el JH-MTB determinó que esta variante era probablemente de origen CH y, por lo tanto, no recomendó una terapia con inhibidores de PARP. De manera similar, en el segundo caso, se encontró una mutación EZH2 p.R583* en una prueba de biopsia líquida en un paciente con CPNM que había progresado tras una quimioterapia y radioterapia previas, que, si fuera de origen tumoral, podría tratarse con tazemetostat. El JH-MTB concluyó que esta variante era probablemente de origen CH y no recomendó dirigir esta alteración. En ambos casos, plasmaCHORD predijo que las variantes ATM y EZH2 eran de origen CH. La secuenciación ad hoc de WBC confirmó el origen CH de ambas variantes, validando de forma independiente la precisión de la clasificación del origen de la variante por parte de plasmaCHORD. En conjunto, nuestro trabajo apoya la posible utilidad clínica de plasmaCHORD, con el objetivo de prevenir la selección subóptima de terapias dirigidas al genotipo.
Discusión
Las biopsias líquidas para pacientes con tumores sólidos se ven con frecuencia afectadas por la CH, y este “ruido biológico” representa un desafío que limita la utilidad clínica de la genotipificación del ADNcf ([15], [19], [45], [46]). Los métodos actuales para identificar posibles variantes de origen CH a partir de la secuenciación solo con plasma suelen depender de heurísticas y filtros basados en genes, que tienden a subestimar la frecuencia de las mutaciones de CH en los genes que no están asociados canónicamente con la CH y pueden plantear desafíos importantes en la oncología de precisión. Como se demostró en nuestro análisis retrospectivo de los casos revisados por el JH-MTB, las variantes de biopsia líquida que fueron determinadas por el análisis de expertos como posiblemente de origen CH ocurren comúnmente en genes distintos de los genes asociados canónicamente con la CH e incluso pueden ocurrir en puntos calientes de tumores sólidos o en genes que se asocian comúnmente con tumores sólidos, lo que ejemplifica los desafíos clínicos de utilizar las biopsias líquidas para informar las decisiones de oncología de precisión. Aquí, presentamos el desarrollo y la validación de plasmaCHORD, un modelo de aprendizaje automático que incorpora características fragmentarias, de variantes y a nivel del paciente para distinguir las variantes de origen CH de las variantes de origen tumoral bona fide con alta precisión. plasmaCHORD no requiere secuenciación emparejada de WBC o tumores; el algoritmo se puede aplicar como una capa separada a cualquier ensayo de NGS de panel de genes fijos de captura híbrida solo con plasma, proporcionando una predicción del origen tumoral o CH por variante plasmática detectada. Prevemos que este enfoque es fácilmente aplicable y facilitará la interpretación de la NGS del ADNcf con el fin de identificar variantes clínicamente relevantes y seleccionar opciones de tratamiento dirigidas, lo que permitirá la prestación de atención clínica con precisión.
Cuando el ADNcf se libera en la circulación, sus patrones de fragmentación reflejan los cambios epigenéticos en la estructura de la cromatina, la organización de los nucleosomas y la expresión génica, que difieren entre las células normales y las cancerosas y por el tejido de origen ([27]–[31]). Los estados de cromatina abierta o cerrada y la unión de los factores de transcripción pueden aumentar o disminuir la accesibilidad de la nucleasa, lo que influye en la cobertura del ADNcf, el tamaño del fragmento, la ubicación preferida del punto final y los motivos del punto final ([26], [27], [29], [31], [47]–[49]). Los fragmentos de ADNcf derivados del cáncer tienen con frecuencia una mediana más corta y una distribución de longitud más variable y coordenadas de extremo preferidas en comparación con el ADNcf no derivado del cáncer ([19], [30], [31]). Los fragmentos de ctDNA también tienen motivos de extremo diferencial relacionados con la regulación a la baja de nucleasas específicas en el cáncer ([49]). Por el contrario, los fragmentos de ADNcf derivados de la CH tienden a tener distribuciones de longitud similares al ADNcf derivado de WBC normales, que constituyen la mayor parte del ADNcf ([19], [28], [31]). Además, los cambios epigenéticos específicos del tejido entre las WBC y el tejido de origen de los tumores sólidos también contribuyen a las diferencias en el fragmentoma del ADNcf entre las variantes de origen CH y tumoral. Capturar estas diferencias biológicas en la fragmentación del ADNcf proporciona información adicional más allá de los atributos a nivel de mutación y proporciona el impulso para incluir las características fragmentómicas del ADNcf en plasmaCHORD.
Se ha investigado la frecuencia alélica de las mutaciones en el plasma como un factor diferenciador entre las variantes de origen tumoral y de origen en células hematopoyéticas (CH) ([50]). Sin embargo, como hemos demostrado tanto en las cohortes de entrenamiento como de validación en este estudio, y en informes publicados anteriormente, la frecuencia alélica por sí sola es un predictor relativamente poco fiable del origen, dado el gran solapamiento en las distribuciones de la frecuencia alélica entre las variantes de origen en CH y las de origen tumoral ([4], [19]–[21], [40]). Además, ciertos genes asociados con neoplasias hematológicas, como DNMT3A, TET2 y ASXL1, están predominantemente mutados en CH y se han incluido en heurísticas basadas en genes que ayudan a filtrar dichas mutaciones de las variantes notificadas en la secuenciación de nueva generación (NGS) del plasma ([45], [51]). Aunque estos enfoques basados en listas de genes pueden identificar muchas alteraciones comunes de origen en CH, no permiten distinguir el origen de las mutaciones que se encuentran en genes que se alteran con frecuencia tanto en CH como en tumores sólidos, como TP53 ([36]). Aquí, demostramos que la integración de características de fragmentómica con características de variantes, incluyendo medidas basadas en genes de la frecuencia en neoplasias hematológicas y la edad del paciente, a través del aprendizaje automático, resultó en una mayor precisión para distinguir las variantes de origen en CH de las de origen tumoral. En contraste con los modelos heurísticos basados en genes, plasmaCHORD permite una resolución precisa del origen de las mutaciones que afectan a genes que no están canónicamente asociados con CH y a aquellos de origen mixto, como las mutaciones en TP53.
Además, la aplicación del modelo plasmaCHORD mejoró la precisión de la asignación del origen para genes clínicamente relevantes como ATM y BRCA1/2, que pueden ser de origen en CH y, si se clasifican erróneamente como de origen tumoral, podrían conducir a un uso inapropiado de terapias dirigidas ([9], [12], [52], [53]). La detección de mutaciones de origen en CH en biopsias líquidas de pacientes con tumores sólidos es común, y representa hasta el 50% de las mutaciones detectadas, dependiendo de la edad del paciente, la exposición previa a radiación y/o quimioterapia, y el tipo de secuenciación realizada ([16], [54], [55]). Las variantes relacionadas con CH sirven con frecuencia como factores de confusión y pueden dar lugar a una información errónea sobre el uso de terapias dirigidas. Por ejemplo, aunque es poco frecuente, se han identificado mutaciones de origen en CH en KRAS (incluidas las mutaciones en el punto caliente G12X), confirmadas mediante la secuenciación de glóbulos blancos (WBC) emparejados, en pacientes con cáncer colorrectal y CPNP, y podrían conducir potencialmente a un uso inapropiado de terapias dirigidas a RAS ([17], [46]). De manera similar, en una serie de casos de hombres con cáncer de próstata, el 10% de los pacientes presentaba variantes de origen en CH detectadas en biopsias líquidas en genes utilizados para las indicaciones aprobadas por la FDA para los inhibidores de PARP ([56]). Como prueba de concepto, demostramos la utilidad clínica de aplicar plasmaCHORD a biopsias líquidas de pacientes con CPNP metastásico, en las que se predijo que las variantes potencialmente susceptibles de ser objeto de terapia eran de origen en CH, evitando así una selección subóptima de terapias dirigidas al genotipo. A medida que haya disponibles más terapias dirigidas con una gama más amplia de mutaciones susceptibles de ser objeto de terapia para su uso clínico, se vuelve cada vez más importante discernir qué mutaciones identificadas en las biopsias líquidas son verdaderamente de origen tumoral para evitar el uso involuntario de estas terapias.
El problema del ruido biológico relacionado con CH en las biopsias líquidas puede aliviarse potencialmente mediante la realización de una secuenciación emparejada de tejido tumoral y/o de WBC, que utilizamos aquí para derivar una referencia del origen de la variante ([4], [19], [22], [40]). No obstante, los enfoques basados en el tumor están limitados por el requisito de una muestra de tejido adecuada, el tiempo de respuesta y el coste de la secuenciación, y los desafíos para capturar la heterogeneidad tumoral, especialmente en el contexto de la enfermedad metastásica ([1], [57]). Los enfoques basados en WBC, si bien evitan la necesidad de una biopsia tumoral, aún requieren un tiempo y un coste considerables para procesar, secuenciar y analizar el ADN de los WBC, ya que se requiere una secuenciación profunda con corrección de errores para detectar los subclones de CH ([19], [58], [59]). Reflejando estas consideraciones prácticas, actualmente, la mayoría de los paneles de secuenciación dirigidos comerciales no incluyen la secuenciación emparejada de WBC ([60], [61]), lo que destaca la necesidad de desarrollar enfoques algorítmicos para la caracterización del origen de la variante en los enfoques de biopsia líquida basados únicamente en el plasma. Los nuevos ensayos de biopsia líquida están incorporando enfoques basados en el número de copias o la metilación para calcular la fracción tumoral ([62], [63]), y aunque esto puede mitigar el impacto de las mutaciones de CH en el cálculo erróneo de una fracción tumoral centrada en la frecuencia alélica, es necesario resolver el origen celular de las mutaciones del ADN tumoral circulante (cfDNA) para informar mejor las decisiones de terapia dirigida al genotipo. También se ha explorado el ADN exosomal como un analito alternativo para detectar el ADN de origen tumoral en la biopsia líquida. Aunque las propiedades físicas del ADN exosomal difieren de las del cfDNA, nuestro marco puede proporcionar una prueba de concepto para desarrollar modelos análogos adaptados al ADN exosomal en estudios futuros.
Demostramos aquí que plasmaCHORD es un enfoque clínicamente válido para identificar con precisión el origen de las variantes de cfDNA de la NGS del plasma sin requerir la secuenciación emparejada de WBC o tejido tumoral, utilizando tanto la validación cruzada interna de 10 pliegues en el conjunto de entrenamiento como la validación externa en una cohorte independiente. Nuestro enfoque puede ofrecer una solución escalable y menos invasiva en entornos clínicos donde la secuenciación exhaustiva de múltiples tipos de tejido puede no ser factible. Además, plasmaCHORD puede permitir una evaluación precisa del origen de la variante para el análisis de estudios de investigación retrospectivos que incluyeron cfDNA pero no obtuvieron la secuenciación emparejada de WBC ([64]). El rendimiento analítico de nuestro modelo en el conjunto de datos de validación independiente demostró que plasmaCHORD es generalizable en diferentes plataformas de secuenciación, tipos de cáncer y poblaciones de pacientes. Es importante destacar que se demostró que nuestro enfoque es muy fiable para clasificar el origen de la variante en genes clínicamente desafiantes y potencialmente susceptibles de ser objeto de terapia que se mutan con frecuencia tanto en tumores sólidos como en CH, como AKT1, ATM, BRCA1, BRCA2, TP53 y EGFR. Además, aunque los esfuerzos previos de aprendizaje automático para clasificar las variantes de origen en CH se han centrado en las SNV y tienen un gran peso en la frecuencia alélica, lo que puede dar lugar a una mayor clasificación errónea a bajas frecuencias alélicas ([15]), plasmaCHORD logró un rendimiento constante en un amplio rango de fracciones alélicas de mutantes y tipos de mutación al incorporar características de fragmentoma de cfDNA y reducir la dependencia del modelo en la frecuencia alélica. Además, demostramos el potencial de utilidad clínica de este enfoque a través de ejemplos de un ensayo clínico prospectivo en el que la clasificación de las variantes de la biopsia líquida mediante plasmaCHORD se validó de forma ortogonal mediante la secuenciación de NGS del ADN de WBC emparejado. Actualmente, se están llevando a cabo estudios prospectivos más amplios dentro de JH-MTB para confirmar la utilidad clínica de plasmaCHORD en la toma de decisiones clínicas.
Nuestro estudio tiene varias limitaciones. Nuestro modelo no tuvo en cuenta la variabilidad en la preparación de la biblioteca y los métodos de secuenciación, lo que puede afectar a las características de fragmentoma del cfDNA. Aunque es tranquilizador que no observáramos diferencias significativas en el rendimiento del modelo entre las cohortes de entrenamiento y validación, que utilizaron diferentes métodos de secuenciación, se necesita un trabajo futuro para explorar el rendimiento del modelo en el contexto de varios métodos de secuenciación para garantizar la solidez. Además, aunque todos los casos de nuestro conjunto de entrenamiento tenían una secuenciación emparejada de WBC, la secuenciación de tejido tumoral emparejado solo estaba disponible en un subconjunto de casos, lo que resultó en un subconjunto de variantes con origen tumoral inferido. Aunque es poco probable que estas variantes fueran de origen en WBC y, sin embargo, no se detectaran en la secuenciación profunda del ADN de WBC emparejado, sigue existiendo la posibilidad de que hayan surgido de un mosaicismo somático no maligno ([65], [66]). Otro factor que puede complicar el rendimiento del modelo es la complejidad biológica de las muestras y la dificultad inherente para determinar un origen de referencia verdadero. Un escenario raro pero biológicamente plausible incluye la posible contaminación de la capa de buffy coat utilizada para la extracción de ADN de WBC por células tumorales circulantes. Un fenómeno de este tipo podría conducir a la atribución errónea de variantes de origen tumoral como de origen en WBC. De manera similar, se reconoce cada vez más el fenómeno de la infiltración tumoral en CH y podría conducir potencialmente a la atribución errónea de variantes de origen en CH como de origen tumoral ([67]). Estos desafíos subrayan la necesidad de continuar trabajando en el establecimiento de conjuntos de datos de referencia fiables del origen de la variante del cfDNA. Además, aunque plasmaCHORD mantuvo una alta precisión en un amplio rango de profundidades de lectura, el rendimiento se redujo cuando las variantes estaban respaldadas por muy pocos fragmentos mutantes (≤5 lecturas), lo que subraya la importancia de una profundidad de secuenciación adecuada para una clasificación fiable de las variantes.
A medida que el uso de terapias dirigidas para tumores sólidos y las pruebas de cfDNA para la elaboración de perfiles genómicos tumorales se generalizan cada vez más, existe una necesidad crítica de desarrollar métodos fiables para clasificar las mutaciones de cfDNA por origen. Los enfoques de aprendizaje automático, como plasmaCHORD, pueden reducir eficazmente el riesgo de atribuir erróneamente variantes tumorales como de origen en CH o viceversa, lo que ofrece un paso prometedor hacia una solución precisa, no invasiva y rentable que aproveche la NGS basada únicamente en el plasma que se utiliza habitualmente en la práctica clínica de rutina.
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