Antecedentes: El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo uno de los tumores malignos más comunes y letales a nivel mundial. En particular, solo los pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H) obtienen beneficios clínicos sustanciales del tratamiento con inhibidores de puntos de control inmunitario. Las células γδT, que son células inmunitarias críticas que se infiltran en los tumores, están estrechamente relacionadas con la respuesta terapéutica en pacientes con cáncer colorrectal con inestabilidad de microsatélites (MSI).
Sin embargo, las características heterogéneas de las células γδT en el cáncer colorrectal con diferentes estados de microsatélites y sus funciones específicas en la regulación de las respuestas inmunoterapéuticas siguen sin estar claras. Métodos: Realizamos una reducción de dimensionalidad y un análisis de agrupamiento de las células γδT a partir de un conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula para explorar la diversidad y las características funcionales de los distintos subconjuntos de células γδT.
Al mismo tiempo, se utilizaron datos de transcriptómica a granel para investigar más a fondo la infiltración inmune, las características clínicas y la expresión de moléculas de puntos de control inmunitario en pacientes con CCR estratificados por distintos subconjuntos de células γδT. Resultados: Identificamos cinco subconjuntos de células γδT, entre los cuales el subconjunto de células γδT C4_CXCL13 estaba enriquecido en el CCR con MSI y presentaba un fenotipo de células T agotadas, al tiempo que conservaba una robusta función citotóxica.
Una puntuación de firma basada en estos 17 genes marcadores se asoció con la supervivencia, la infiltración inmune y la respuesta terapéutica, lo que representa un posible factor pronóstico independiente valioso. Conclusiones: El subconjunto de células γδT C4_CXCL13 representa un subconjunto característico en el CCR con MSI y está estrechamente asociado con el pronóstico clínico y el beneficio de la inmunoterapia. Representa un posible marcador clínico para clasificar a los pacientes y estimar la respuesta a la inmunoterapia, lo que ofrece una nueva diana para la inmunoterapia personalizada en el CCR.
El cáncer colorrectal (CCR) ocupa el tercer lugar en incidencia y el segundo en mortalidad entre todos los tumores malignos a nivel mundial [[1]]. El CCR puede clasificarse en dos subtipos moleculares principales: dMMR/MSI-H (aproximadamente el 15% de los pacientes) y MSS/MSI-L, que representa la gran mayoría de los casos (85%) [[2]]. Los ensayos clínicos acumulados para el cáncer colorrectal han demostrado un notable éxito del bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB), con beneficios particularmente pronunciados observados en pacientes MSI o dMMR [[3],[4]]. Aunque el estado MSI-alto se utiliza ampliamente para predecir la respuesta al ICB [[5]], no todos los pacientes MSI-alto logran beneficios clínicos duraderos, y también se han observado respuestas patológicas en algunos tumores de colon MSS [[6]]. Por lo tanto, una disección exhaustiva de la dinámica celular y molecular en el CCR con diferentes estados de microsatélites contribuirá al establecimiento de estrategias innovadoras, beneficiando en última instancia a un grupo más amplio de pacientes con CCR.
Anteriormente, las inmunoterapias para el CCR se dirigían principalmente a las células T αβ, que ejercen citotoxicidad antitumoral a través de una vía dependiente del complejo de histocompatibilidad (MHC) [[7]]. Sin embargo, las células cancerosas con frecuencia reducen o pierden la expresión de MHC, escapando así de la vigilancia y la destrucción inmune mediada por las células T αβ [[8]]. En contraste, las células T γδ muestran citotoxicidad independiente de MHC contra varias células tumorales in vitro, lo que destaca su prometedor potencial para la inmunoterapia contra el cáncer [[9]].
En nuestro estudio, analizamos conjuntamente datos de secuenciación de ARN de una sola célula y datos masivos de pacientes con CCR para clasificar los subconjuntos de células T γδ, dilucidar la diversidad y las características funcionales de las células T γδ en pacientes con CCR con diferentes estados de microsatélites, identificar los subconjuntos de células T γδ con relevancia clínica significativa y explorar sus características clínicas y asociación con la respuesta a la inmunoterapia. Nuestros hallazgos tienen como objetivo identificar nuevos biomarcadores de células T γδ para predecir la respuesta a la inmunoterapia en el cáncer colorrectal y sentar las bases para el desarrollo de intervenciones dirigidas a las células T γδ.
2. Materiales y Métodos
2.1. Recopilación y procesamiento preliminar de datos de secuenciación de ARN de una sola célula
El conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de cáncer colorrectal GSE178341 [[10]] se obtuvo de la base de datos GEO: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (accedido el 20 de enero de 2026), que comprende 29 muestras de tumor de CCR MSI, 35 muestras de tumor de CCR MSS y 36 muestras de tejido adyacente. Los análisis posteriores de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula se llevaron a cabo utilizando Scanpy [[11]] (v1.10.1) dentro del entorno Python (v3.11). Inicialmente, se excluyeron los genes expresados en menos de tres células y se eliminaron las células con menos de 200 genes detectados. La proporción de lecturas mitocondriales se cuantificó identificando los genes cuyos nombres comenzaban con "MT-" mediante la función 'varnames.str.startswith ('MT-')'. Los niveles de expresión génica dentro de cada célula se normalizaron al recuento total de lecturas y, posteriormente, se transformaron logarítmicamente. Después de estos pasos de preprocesamiento, se aplicó un centrado y escalado consciente del lote en todas las muestras utilizando los parámetros predeterminados. Los 2000 genes de alta variabilidad (HVG) principales se identificaron utilizando la función "sc.pp.highlyvariable_genes" y se utilizaron para los análisis posteriores.
2.2. Reducción de dimensionalidad e identificación de clústeres
Se identificaron las particiones celulares utilizando múltiples rondas de agrupamiento iterativo de Leiden mediante la función "scanpy.tl.leiden". Se realizó una incrustación de vecinos estocásticos t-distribuidos (t-SNE) para visualizar los clústeres celulares y validar los efectos de la corrección de lote. Los clústeres celulares se anotaron según la expresión de los genes marcadores canónicos. El objeto AnnData procesado en Python (v3.11) se exportó en formato H5AD y se convirtió en un objeto Seurat en R (v4.2.3) utilizando la función "h5ad2seurat" del paquete schard (v0.0.1). Los genes expresados diferencialmente (DEG) para cada clúster se identificaron utilizando la función "sc.tl.rankgenesgroups" con los parámetros predeterminados y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.
Las células T γδ se identificaron según la expresión de los genes característicos, incluidos CD3D, CD3E, TRDC, TRGC1, TRGC2 [[12],[13]]. La función "FindAllMarkers" implementada en el paquete Seurat [[14]] (v4.2.3) se aplicó para identificar los genes marcadores específicos del clúster.
2.3. Análisis de enriquecimiento funcional
Las investigaciones de enriquecimiento funcional, incluidos los términos de la ontología génica (GO) y las vías de la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG), se implementaron utilizando el paquete clusterProfiler (v4.7.1.3) [[15]]. La significación estadística se determinó para los términos enriquecidos con un valor p < 0,05 mediante las funciones "enrichGO" y "enrichKEGG". La función "GSEA" inherente dentro de clusterProfiler se aplicó para realizar el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes.
2.4. Cálculo de la puntuación de la firma
Los genes expresados diferencialmente de los subconjuntos de células T γδ se identificaron utilizando la función "FindAllMarkers" con los umbrales: avglog2FC > 0,58, p_valadj < 0,05 y pct.1 > 0,3. Luego, se realizaron análisis de regresión de Cox univariados y multivariados, y se aplicó la función "AddModuleScore" (parámetros predeterminados) para calcular las puntuaciones características para la verificación. En última instancia, se identificó un conjunto de genes que consta de 17 genes como un marcador pronóstico. El diagrama de caja de la expresión de la puntuación se generó utilizando la función "geom_boxplot" en el paquete ggplot2.
2.5. Análisis de pseudotiempo
El paquete CytoTRACE [[16]] (v1.0.0) se utilizó para cuantificar la capacidad de diferenciación de los estados celulares individuales y determinar el orden secuencial de las trayectorias celulares. La dinámica del pseudotiempo de las subpoblaciones de células T γδ se investigó mediante el paquete Monocle [[17]] (v2.30.0). Los DEG a lo largo del pseudotiempo durante las transiciones celulares se detectaron con la función "differentialGeneTest" (valor q < 0,1). La función "DDRTree" se adoptó para la reducción de dimensionalidad y se generaron los diagramas de trayectoria utilizando la función "plotcelltrajectory".
2.6. Análisis de variación del número de copias
Las células malignas dentro de la población de células epiteliales se identificaron estimando las variaciones del número de copias (CNV) mediante el algoritmo infercnvpy (https://github.com/icbi-lab/infercnvpy, accedido el 20 de enero de 2026). Los fibroblastos y las células endoteliales se adoptaron como células de control normales durante la ejecución del algoritmo, con todos los parámetros establecidos en los valores predeterminados. Posteriormente, se calcularon las puntuaciones de CNV de una sola célula utilizando la función "infercnvpy.tl.cnv_score".
2.7. Análisis de la comunicación celular
El análisis de las redes de comunicación célula a célula se realizó utilizando el paquete CellChat [[18]] (v1.6.1). La función "createCellChat" se utilizó para construir un objeto CellChat, y la función "identifyOverExpressedInteractions" se adoptó para detectar ligandos y receptores sobreexpresados para el establecimiento de la red de interacción proteína-proteína (PPI). Las probabilidades de comunicación y las redes de comunicación intercelular se predijeron posteriormente utilizando la función "computeCommunProb". Las interacciones celulares y las vías de señalización correspondientes se visualizaron con la función "netVisual_bubble".
2.8. Recopilación y preprocesamiento de datos de secuenciación de ARN
Los perfiles transcriptómicos masivos y la información clinicopatológica relevante del CCR se recopilaron de la base de datos TCGA (http://www.cancer.gov/tcga, accedido el 20 de enero de 2026). Se incluyeron las muestras con estado MSS o MSI confirmado, lo que dio como resultado una matriz de recuento que abarca 425 muestras. El conjunto de datos incluyó una matriz de recuento que comprende 425 muestras. Los datos de variación de nucleótidos simples para el adenocarcinoma de colon se obtuvieron del cBioPortal (https://www.cbioportal.org/datasets, accedido el 20 de enero de 2026). El paquete R MAFtools [[19]] (v2.14.0) se aplicó para calcular los valores de la carga de mutación tumoral (TMB), que se denota como el recuento de mutaciones por megabase. Para la validación externa, se obtuvieron el conjunto de datos GSE39582 [[20]], que incluye 558 tejidos de cáncer de colon, y los datos del grupo IMvigor210 de http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies (accedido el 20 de enero de 2026), con 298 pacientes estratificados por la respuesta a la inmunoterapia. Las puntuaciones de inmunofenotipo (IPS) se obtuvieron de la base de datos TCIA (https://tcia.at/, accedido el 20 de enero de 2026) para evaluar la relación entre las puntuaciones de riesgo y los resultados de la inmunoterapia.
2.9. Análisis de la variación del conjunto de genes
Las puntuaciones de la firma de los 17 genes de células T γδ C4CXCL13 se calcularon utilizando el paquete R GSVA [[21]] (v1.50.0) para cuantificar la abundancia de las células T γδ C4CXCL13 por muestra. Basándose en las puntuaciones de las células T γδ C4_CXCL13, todas las muestras se asignaron a dos grupos distintos.
2.10. Análisis de la infiltración de células inmunitarias
Las puntuaciones estromales, inmunitarias y ESTIMATE se calcularon con el paquete R ESTIMATE para caracterizar el microambiente tumoral (TME) y evaluar la pureza tumoral en los pacientes con COAD [[22]]. Basándose en un panel publicado de 28 subconjuntos de células inmunitarias, los perfiles de infiltración inmune de cada muestra se analizaron posteriormente utilizando el enfoque ssGSEA. El paquete CIBERSORT [[23]] (v0.1.0) se utilizó para estimar las fracciones de 22 células inmunitarias infiltrantes tumorales mediante la deconvolución basada en la matriz de características inmunitarias LM22.
2.11. Análisis estadístico
El paquete survminer (v0.4.9) con su función "survcutpoint" se utilizó para calcular el punto de corte óptimo de la puntuación de la firma [[24]]. Las curvas de supervivencia se trazaron utilizando el enfoque de Kaplan-Meier, y las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba de rango logarítmico. Todos los análisis estadísticos, incluida la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, la prueba de Chi-cuadrado y la prueba de rango logarítmico, se llevaron a cabo en R (v4.1.0) y Python (v3.11). La significación estadística se definió como: p < 0,05 (*), p < 0,01 (), p < 0,001 (*) y p_ < 0,0001 (****).
2.1. Recopilación y procesamiento preliminar de datos de secuenciación de ARN de una sola célula
El conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de cáncer colorrectal GSE178341 [[10]] se obtuvo de la base de datos GEO: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (accedido el 20 de enero de 2026), que comprende 29 muestras de tumor de CCR MSI, 35 muestras de tumor de CCR MSS y 36 muestras de tejido adyacente. Los análisis posteriores de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula se llevaron a cabo utilizando Scanpy [[11]] (v1.10.1) dentro del entorno Python (v3.11). Inicialmente, se excluyeron los genes expresados en menos de tres células y se eliminaron las células con menos de 200 genes detectados. La proporción de lecturas mitocondriales se cuantificó identificando los genes cuyos nombres comenzaban con "MT-" mediante la función 'varnames.str.startswith ('MT-')'. Los niveles de expresión génica dentro de cada célula se normalizaron al recuento total de lecturas y, posteriormente, se transformaron logarítmicamente. Después de estos pasos de preprocesamiento, se aplicó un centrado y escalado consciente del lote en todas las muestras utilizando los parámetros predeterminados. Los 2000 genes de alta variabilidad (HVG) principales se identificaron utilizando la función "sc.pp.highlyvariable_genes" y se utilizaron para los análisis posteriores.
2.2. Reducción de dimensionalidad e identificación de clústeres
Se identificaron las particiones celulares utilizando múltiples rondas de agrupamiento iterativo de Leiden mediante la función "scanpy.tl.leiden". Se realizó una incrustación de vecinos estocásticos t-distribuidos (t-SNE) para visualizar los clústeres celulares y validar los efectos de la corrección de lote. Los clústeres celulares se anotaron según la expresión de los genes marcadores canónicos. El objeto AnnData procesado en Python (v3.11) se exportó en formato H5AD y se convirtió en un objeto Seurat en R (v4.2.3) utilizando la función "h5ad2seurat" del paquete schard (v0.0.1). Los genes expresados diferencialmente (DEG) para cada clúster se identificaron utilizando la función "sc.tl.rankgenesgroups" con los parámetros predeterminados y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.
Las células T γδ se identificaron según la expresión de los genes característicos, incluidos CD3D, CD3E, TRDC, TRGC1, TRGC2 [[12],[13]]. La función "FindAllMarkers" implementada en el paquete Seurat [[14]] (v4.2.3) se aplicó para identificar los genes marcadores específicos del clúster.
Se llevaron a cabo investigaciones de enriquecimiento funcional, que incluyeron términos de Gene Ontology (GO) y vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG), utilizando el paquete clusterProfiler (v4.7.1.3) [[15]]. La significación estadística se determinó para los términos enriquecidos con un valor p < 0,05 mediante las funciones “enrichGO” y “enrichKEGG”. La función “GSEA” inherente dentro de clusterProfiler se aplicó para realizar el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes.
2.4. Cálculo de la puntuación de la firma
Los genes expresados diferencialmente de los subconjuntos de células γδT se identificaron utilizando la función “FindAllMarkers” con los siguientes umbrales: avglog2FC > 0,58, p_valadj < 0,05 y pct.1 > 0,3. Posteriormente, se realizaron análisis de regresión de Cox univariante y multivariante, y se aplicó la función “AddModuleScore” (parámetros predeterminados) para calcular las puntuaciones características para la verificación. En última instancia, se identificó un conjunto de genes que consta de 17 genes como un marcador pronóstico. El diagrama de caja de la expresión de la puntuación se generó utilizando la función “geom_boxplot” en el paquete ggplot2.
2.5. Análisis de pseudotiempo
Se empleó el paquete CytoTRACE [[16]] (v1.0.0) para cuantificar la capacidad de diferenciación de los estados celulares individuales y determinar el orden secuencial de las trayectorias celulares. Las dinámicas de pseudotiempo de las subpoblaciones de células γδT se investigaron mediante el paquete Monocle [[17]] (v2.30.0). Los DEG a lo largo del pseudotiempo durante las transiciones celulares se detectaron con la función “differentialGeneTest” (valor q < 0,1). La función “DDRTree” se adoptó para la reducción de dimensionalidad, y se generaron diagramas de trayectoria utilizando la función “plotcelltrajectory”.
2.6. Análisis de la variación del número de copias
Las células malignas dentro de la población de células epiteliales se identificaron mediante la estimación de las variaciones del número de copias (CNV) a través del algoritmo infercnvpy (https://github.com/icbi-lab/infercnvpy, accedido el 20 de enero de 2026). Los fibroblastos y las células endoteliales se utilizaron como células de control normales durante la ejecución del algoritmo, con todos los parámetros establecidos en los valores predeterminados. Posteriormente, se calcularon las puntuaciones de CNV de una sola célula utilizando la función “infercnvpy.tl.cnv_score”.
2.7. Análisis de la comunicación celular
El análisis de las redes de comunicación célula-célula se realizó utilizando el paquete CellChat [[18]] (v1.6.1). La función “createCellChat” se utilizó para construir un objeto CellChat, y la función “identifyOverExpressedInteractions” se adoptó para identificar ligandos y receptores sobreexpresados para el establecimiento de la red de interacción proteína-proteína (PPI). Las probabilidades de comunicación y las redes de comunicación intercelular se predijeron posteriormente utilizando la función “computeCommunProb”. Las interacciones celulares y las vías de señalización correspondientes se visualizaron con la función “netVisual_bubble”.
2.8. Recopilación y preprocesamiento de datos de RNA-Seq
Los perfiles transcripómicos a granel y la información clinicopatológica relevante del CRC se recopilaron de la base de datos TCGA (http://www.cancer.gov/tcga, accedido el 20 de enero de 2026). Se incluyeron las muestras con estado MSS o MSI confirmado, lo que dio como resultado una matriz de conteo que abarcaba 425 especímenes. El conjunto de datos incluyó una matriz de conteo que comprendía 425 muestras. Los datos de variación de nucleótidos simples para el adenocarcinoma de colon se obtuvieron de cBioPortal (https://www.cbioportal.org/datasets, accedido el 20 de enero de 2026). Se aplicó el paquete R MAFtools [[19]] (v2.14.0) para calcular los valores de la carga mutacional tumoral (TMB), denominados como el recuento de mutaciones por megabase. Para la validación externa, se obtuvieron el conjunto de datos GSE39582 [[20]], que incluye 558 tejidos de cáncer de colon, y los datos del grupo IMvigor210 de http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies (accedido el 20 de enero de 2026), con 298 pacientes estratificados por respuesta a la inmunoterapia. Se obtuvieron las puntuaciones de inmunofenotipo (IPS) de la base de datos TCIA (https://tcia.at/, accedido el 20 de enero de 2026) para evaluar la relación entre las puntuaciones de riesgo y los resultados de la inmunoterapia.
2.9. Análisis de la variación del conjunto de genes
Se calcularon las puntuaciones de la firma para 17 genes asociados con las células γδT C4CXCL13 utilizando el paquete R GSVA [[21]] (v1.50.0) para cuantificar la abundancia de las células γδT C4CXCL13 por muestra. Basándose en las puntuaciones de las células γδT C4_CXCL13, todas las muestras se asignaron a dos grupos distintos.
2.10. Análisis de la infiltración de células inmunitarias
Se calcularon las puntuaciones estromales, inmunitarias y ESTIMATE con el paquete R ESTIMATE para caracterizar el microambiente tumoral (TME) y evaluar la pureza tumoral en pacientes con COAD [[22]]. Basándose en un panel publicado de 28 subconjuntos de células inmunitarias, los perfiles de infiltración inmunitaria de cada muestra se analizaron posteriormente utilizando el enfoque ssGSEA. Se empleó el paquete CIBERSORT [[23]] (v0.1.0) para estimar las fracciones de 22 células inmunitarias infiltrantes tumorales mediante deconvolución basada en la matriz de características inmunitarias LM22.
2.11. Análisis estadístico
Se utilizó el paquete survminer (v0.4.9) con su función “survcutpoint” para calcular el punto de corte óptimo de la puntuación de la firma [[24]]. Se trazaron las curvas de supervivencia utilizando el enfoque de Kaplan-Meier, y las diferencias intergrupales se evaluaron mediante la prueba de rango log. Todos los análisis estadísticos, incluido el test de rango de Wilcoxon, el test de Chi-cuadrado y el test de rango log, se realizaron en R (v4.1.0) y Python (v3.11). La significación estadística se definió como: p < 0,05 (*), p < 0,01 (), p < 0,001 (*) y p_ < 0,0001 (****).
3. Resultados
3.1. Panorama de una sola célula de CRC MSI y MSS
Se realizó un perfilado transcripómico de una sola célula de 100 especímenes de CRC del conjunto de datos GSE178341 para delinear las poblaciones celulares infiltrantes en el CRC MSI y MSS. Los estados de microsatélite de todos los pacientes del grupo se proporcionan en los Materiales Suplementarios, Tabla S1. Tras un estricto control de calidad y la eliminación de las células de baja calidad, se conservaron 360.282 células para el análisis de scRNA-seq (Figura 1A y Figura S1). Utilizando marcadores de tipo celular canónicos, estas células se anotaron en 8 linajes celulares principales: células T/NK (CD3D, CD3E y FCGR3A), células B (CD79A, MS4A1), células plasmáticas (CD79A, MZB1), células mieloides (MS4A6A, LYZ y CD68), fibroblastos (DCN, LUM), células endoteliales (ENG, PECAM1 y CLDN5), células epiteliales (EPCAM, KRT8 y KRT18) y células de mastocitos (TPSAB1, CPA3 y KIT) (Figura 1B). A continuación, evaluamos el estado y la composición de los grupos de células en los tejidos adyacentes, los tejidos de CRC MSI y los tejidos de CRC MSS. Dado la prevalencia de las células inmunitarias en los tumores de CRC y sus capacidades antitumorales, subdividimos aún más las células T/NK y las células mieloides en subconjuntos (Figura 1C, D). Para los subconjuntos de células T/NK, se identificaron y aislaron las células γδT en función de la expresión de los genes marcadores específicos del tipo celular TRDC, TRGC1 y TRGC2, en lugar de los genes marcadores de las células T CD4+ o CD8+. Se emplearon marcadores específicos de tipo celular establecidos para anotar manualmente cada grupo de células (Figura 1E).
3.2. Identificación de un grupo de γδT asociado con tumores
Extrajimos todas las células anotadas como células γδT del conjunto de datos de una sola célula integrado. Las células γδT se agruparon en cinco grupos (Figura 2B). La identidad del grupo se determinó mediante genes de firma de subconjuntos de células T y estados funcionales (Figura 2A, C y Materiales Suplementarios, Tabla S2). El mayor porcentaje del subconjunto de células γδT C0FCER1G efectoras, junto con la expresión elevada de TYROBP, genes relacionados con los receptores de superficie de las células asesinas naturales (KLRC1, KIR2DL4) y moléculas relacionadas con la inmunidad innata (FCER1G [[25]], TMIGD2), se encontraron en el tejido tumoral de pacientes con CRC, lo que indica una mayor expresión de los genes asociados con los linfocitos intraepiteliales (IEL) [[26]]. En las muestras de tejido adyacente, el subconjunto de células γδT C1IL7R mostró niveles de expresión más altos de los genes residentes en el tejido (ITGAE y CD69) [[13]], y dado su abundante expresión de IL7R, este subconjunto se identificó como un posible subconjunto de células γδT de memoria. El subconjunto de células γδT C2CD81 expresó SAMD1, MBD2 y JUND, cuyas proteínas codificadas confieren resistencia al estrés oxidativo, al tiempo que exhiben una alta expresión de múltiples moléculas de adhesión, incluidas ITGB1 y MACF1. El subconjunto de células γδT C3TOP2A se caracterizó por una alta expresión de genes relacionados con la mitosis (TOP2A, UBE2C, MKI67). El subconjunto de células γδT C4CXCL13 mostró una expresión marcadamente elevada de genes citotóxicos (GZMA, GZMB, GZMH, PRF1) y genes relacionados con la presentación de antígenos (HLA-DRA, HLA-DPB1_).
En relación con otros subconjuntos de células γδT, las células γδT C4CXCL13 expresaron específicamente PDCD1 y CXCL13, junto con una regulación al alza distinta de múltiples moléculas de puntos de control inmunitarios, incluidas LAG3, TIGIT y HAVCR2. Además, el subconjunto de células γδT C4CXCL13 exhibió la puntuación de punto de control inmunitario más alta entre todos los subconjuntos (Figura 2D, E). Estas observaciones indican que el subconjunto de células γδT C4CXCL13 exhibe características fenotípicas similares a las de las células T agotadas, pero aún conserva las funciones citotóxicas. Descubrimos que la proporción del subconjunto de células γδT C4CXCL13 era significativamente mayor en el CRC MSI en comparación con el CRC MSS o el tejido adyacente. Además, el subconjunto de células γδT C4CXCL13 era distinto de otros subconjuntos de células γδT, lo que representaba una población única identificada específicamente en el CRC MSI (Figura 2F, G). Para caracterizar exhaustivamente los papeles biológicos de las células γδT C4CXCL13, se realizó un análisis de enriquecimiento. El análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) indica que el subconjunto de células γδT C4_CXCL13 estaba significativamente enriquecido en vías asociadas con la presentación de antígenos, la activación de células T αβ y la citotoxicidad mediada por leucocitos (Figura 2H). Además, el análisis de la vía KEGG demostró además un enriquecimiento prominente en la expresión de PD-L1 tumoral y la vía del punto de control PD-1 (Figura 2I).
3.3. Análisis de trayectoria de los subconjuntos de células γδT en el cáncer colorrectal
Se utilizó el análisis CytoTRACE para evaluar la capacidad de diferenciación de los distintos subconjuntos de células γδT, y los resultados mostraron que el subconjunto de células γδT C3TOP2A exhibió la puntuación CytoTRACE más alta, lo que indica el menor grado de diferenciación (Figura 3A). Analizamos las trayectorias de diferenciación de los subconjuntos de células γδT utilizando el análisis de pseudotiempo y observamos las trayectorias de desarrollo desde las células γδT C3TOP2A en el estado inicial o las células γδT C2CD81 en el estado intermedio hasta las células γδT C4CXCL13 y las células γδT C1IL7R en el estado terminal (Figura 3B, C). Basándose en los cálculos de pseudotiempo, se especuló que el subconjunto de células γδT C3TOP2A de alta proliferación se diferenciaba principalmente en el subconjunto de células γδT C4CXCL13 efectoras y el subconjunto de células γδT C1IL7R de memoria, mientras que las células γδT C0FCER1G se distribuían a lo largo de la trayectoria y el subconjunto de células γδT C2CD81 se ubicaba principalmente en el estado de transición intermedio. Realizamos un análisis de pseudotiempo para investigar los perfiles de expresión dinámica de los genes clave durante la diferenciación de las células γδT. Los genes expresados diferencialmente se agruparon en cuatro grupos con perfiles de expresión temporal similares (Figura 3D). El grupo 4 se ubicó principalmente en la etapa temprana de pseudotiempo, caracterizado por genes marcadores derivados de los subconjuntos de células γδT C3TOP2A y C2CD81. Los grupos 2 y 3 se distribuyeron predominantemente en la etapa terminal, albergando genes marcadores de los subconjuntos de células γδT C1IL7R y C4CXCL13.
3.4. Análisis de la interacción célula-célula de las células γδT C4_CXCL13
Se realizó un análisis de las redes de comunicación célula-célula utilizando el paquete CellChat [[18]] (v1.6.1). La función “createCellChat” se utilizó para construir un objeto CellChat, y la función “identifyOverExpressedInteractions” se adoptó para identificar ligandos y receptores sobreexpresados para el establecimiento de la red de interacción proteína-proteína (PPI). Las probabilidades de comunicación y las redes de comunicación intercelular se predijeron posteriormente utilizando la función “computeCommunProb”. Las interacciones celulares y las vías de señalización correspondientes se visualizaron con la función “netVisual_bubble”.
A continuación, realizamos análisis de comunicación celular para caracterizar las interacciones ligando-receptor entre las células γδT C4CXCL13 y otras células. Para identificar las células epiteliales malignas, incluimos un grupo de fibroblastos y un grupo de células endoteliales en los análisis como células de referencia (Figura 4A). Las células epiteliales se clasificaron posteriormente en células malignas y no malignas en función de distintas firmas de CNV (variación del número de copias). (Figura 4B). A continuación, utilizamos CellChat para analizar la comunicación célula-célula entre las células γδT C4CXCL13 y otros tipos de células en el CRC con MSI, y analizamos los eventos de regulación de la señal celular en los que las células γδT C4CXCL13 participan como emisores y receptores de señal, respectivamente (Figura 4C, D). Los resultados muestran que CD99-CD99 y MIF-(CD74+CXCR4) son las principales vías de interacción intercelular mediadas por las células γδT C4CXCL13. La evidencia acumulada confirma que CD99 se expresa de forma ubicua en múltiples poblaciones celulares, incluidas las células T, las células mieloides, los fibroblastos y las células epiteliales. Sus funciones principales implican la regulación de la adhesión celular, la migración transendotelial y múltiples vías de señalización inmune [[27]]. Además, las células γδT C4CXCL13 pueden interactuar específicamente con las células T CD4+ y las células mieloides a través de moléculas de antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II clásicas, como HLA-DR y HLA-DP, participando en la regulación del microambiente inmune. Mientras tanto, las quimiocinas secretadas por las células γδT C4CXCL13 pueden regular la función de los macrófagos a través de las vías de señalización CCL3-CCR1 y CCL5-CCR1. Estudios posteriores revelaron que las células γδT C4CXCL13 pueden interactuar con las células tumorales a través de pares ligando-receptor implicados en los receptores activados por proteasas (PAR) y las vías de señalización de midquina (MK), incluyendo específicamente MDK-NCL, IFNG-(IFNGR1+IFNGR2), GZMA-PARD3 y GZMA-F2RL1 (p < 0,01). La verificación de los perfiles de expresión de los pares ligando-receptor anteriores en diferentes tipos de células reveló que la molécula F2RL1 se expresa preferentemente en las células tumorales en lugar de otras poblaciones celulares (Figura 4E). En resumen, el eje de señalización GZMA-F2RL1 puede representar una vía de comunicación importante entre las células γδT C4CXCL13 y las células tumorales, con posibles implicaciones regulatorias en el desarrollo del cáncer colorrectal.
3.5. Identificación de genes relacionados con las células γδT C4_CXCL13 en el CRC con MSI y cálculo de la puntuación GSVA
Para caracterizar mejor los genes de las células γδT C4CXCL13, realizamos una selección de genes marcadores utilizando la función FindAllMarkers. Los umbrales de selección se establecieron de la siguiente manera: p_valadj < 0,05, avglog2FC > 0,58 y el porcentaje de células que expresan el gen en el subconjunto de células γδT C4CXCL13 (pct.1) > 0,3. En última instancia, se identificaron 17 genes característicos elegibles (TRGC2, S100A4, CD3D, GZMB, CD3G, LAG3, HLA-DPB1, CD2, HLA-DRA, CCL4, RBPJ, GNLY, HLA-DPA1, CYTOR, IDH2, HLA-DRB1, PTMS), que se expresaron en gran medida en el subconjunto de células γδT C4CXCL13 (Figura 5A). Los resultados confirman que las características genéticas de las células γδT C4CXCL13 tienen una especificidad significativa entre los diferentes subconjuntos de células (Figura 5B). A continuación, realizamos un análisis GSVA para generar una puntuación de firma de células γδT C4CXCL13 en todas las muestras de TCGA-COAD, y las muestras se asignaron a un grupo de alta puntuación o a un grupo de baja puntuación, con 323 casos asignados al grupo de alta puntuación y 102 al grupo de baja puntuación (Figura 5D). Como se muestra en el análisis de Kaplan-Meier, el aumento de las puntuaciones de la firma de células γδT C4CXCL13 se asoció significativamente con una mejora de la supervivencia en la cohorte de TCGA-COAD (Figura 5C). Posteriormente, realizamos análisis de Cox univariante y multivariante basados en la puntuación de las células γδT C4CXCL13 y otros factores clínicos, y descubrimos que la puntuación de las células γδT C4CXCL13 fue un factor pronóstico independiente significativo (p < 0,05, Tabla 1).
3.6. Relación de la firma de células γδT C4_CXCL13 con las características inmunitarias del tumor
Realizamos una selección de DEG (genes diferencialmente expresados) entre el grupo de alta expresión de CXCL13 γδT (H-CXCL13 γδT) y el grupo de baja expresión de CXCL13 γδT (L-CXCL13 γδT) en TCGA-COAD; 457 genes mostraron una expresión elevada en el grupo H-CXCL13 γδT. Se realizó un análisis GSEA para explorar las disparidades funcionales entre los dos grupos, y los genes del grupo H-CXCL13 γδT estuvieron principalmente implicados en procesos biológicos relacionados con la inmunidad, incluida la migración de leucocitos, la respuesta inmune humoral y la activación y regulación de las respuestas inmunitarias adaptativas (Figura 6A). Posteriormente, realizamos un análisis de enriquecimiento KEGG sobre los genes con una expresión significativamente elevada en el grupo de alta puntuación y visualizamos los resultados del enriquecimiento (Figura 6B). Los resultados demostraron que los genes regulados al alza se enriquecieron principalmente en múltiples vías inmunitarias relacionadas con el tumor, incluida la vía de señalización de las citocinas, la vía de señalización del receptor de células T, la vía de control inmunitario PD-L1 y la vía de diferenciación de células Th17. En conjunto, estos resultados indican que los DEG entre los dos grupos de puntuación se localizan principalmente en actividades biológicas relacionadas con la inmunidad, lo que sugiere que el grupo H-CXCL13 γδT puede estar estrechamente asociado con el estado de activación inmune en el cáncer colorrectal.
Los resultados del análisis de infiltración inmune mostraron que las puntuaciones asociadas con la vía de señalización del receptor de quimiocinas C-C (CCR), las puntuaciones de los puntos de control inmunitario y las puntuaciones relacionadas con las moléculas de MHC y las puntuaciones de respuesta de la actividad citotóxica fueron significativamente más altas en el grupo de alta puntuación en comparación con el grupo de baja puntuación (Figura 6D). Además, ssGSEA mostró que el nivel de infiltración de células inmunitarias en el grupo H-CXCL13 γδT fue mayor que en el grupo L-CXCL13 γδT (Figura 6E). Estos resultados destacan que existe una respuesta inmune antitumoral mejorada en el microambiente tumoral de los pacientes con puntuaciones de firma de células γδT C4CXCL13 altas. Para aclarar aún más las diferencias en la composición de las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral entre los dos grupos, analizamos las proporciones relativas de varias células inmunitarias en las muestras de ambos grupos utilizando el algoritmo CIBERSORT. Los resultados sugieren una abundancia relativa significativamente mayor de macrófagos M2, células T CD8+, células T auxiliares foliculares, macrófagos M1, mastocitos en reposo y neutrófilos en el grupo H-CXCL13 γδT en comparación con el grupo L-CXCL13 γδT. Por el contrario, las abundancias relativas de macrófagos M0, células T CD4+ de memoria en reposo y mastocitos activados disminuyeron significativamente (Figura 6F). Además, el grupo H-CXCL13 γδT mostró puntuaciones inmunitarias y ESTIMATE significativamente más altas, lo que apoya que las células γδT C4CXCL13 ejercen un efecto regulador sobre la infiltración de células inmunitarias dentro del microambiente tumoral (TME) (Figura 6C).
3.7. Evaluación de la predicción de la respuesta a la inmunoterapia
A continuación, evaluamos las características relacionadas con la inmunoterapia comparando los perfiles de mutación entre los grupos (Materiales suplementarios, Figura S2). El grupo H-CXCL13 γδT presentó una mayor carga mutacional tumoral (TMB), lo que podría mejorar la generación de neoantígenos y la activación inmune (Figura 7A). En consecuencia, las principales moléculas de los puntos de control inmunitario (PD1, PDL1, PDL2, CTLA4, LAG3, HAVCR2, TIGIT) mostraron niveles de expresión significativamente elevados en el grupo de alta puntuación (Figura 7B). A continuación, evaluamos si la firma de células γδT C4CXCL13 podría predecir la respuesta a la inmunoterapia en pacientes estratificados por el estado de microsatélites (MSI frente a MSS). Para cada grupo, estimamos por separado la abundancia de células inmunitarias infiltrantes y los niveles de expresión de las moléculas de los puntos de control inmunitario en muestras individuales. Nuestro análisis reveló que, tanto en los grupos MSI como en los MSS, los pacientes del grupo H-CXCL13 γδT presentaban una mayor infiltración inmune y expresión de los puntos de control inmunitario, así como una mayor infiltración de células T CD8+ activadas y niveles más altos de interferones de tipo I; estas características se asociaron con mejores respuestas y pronósticos del tratamiento inmunitario (Materiales suplementarios, Figura S3). Posteriormente, buscamos cualquier correlación entre las puntuaciones de la firma de células γδT C4CXCL13 y la respuesta a la inmunoterapia. Realizamos un análisis de la puntuación del fenotipo inmunitario (IPS) para anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en muestras de los grupos de alta y baja puntuación para predecir las respuestas terapéuticas de los pacientes a los dos inhibidores de los puntos de control inmunitario. Los resultados mostraron que los valores de IPS para la positividad de CTLA-4 y la positividad de PD-1 en el grupo H-CXCL13 γδT fueron significativamente más altos que los del grupo de baja puntuación (p < 0,001; Figura 7C). El conjunto de datos IMvigor210 incluyó pacientes con carcinoma urotelial tratados con terapia anti-PD-L1, que se utilizó exclusivamente para la validación exploratoria con el fin de evaluar la relevancia terapéutica y el potencial pronóstico de nuestra firma derivada del cáncer colorrectal. Esta estrategia de validación cruzada de tumores se adopta ampliamente en la investigación de biomarcadores [[28], [29]]. En la cohorte IMvigor210, los pacientes con una puntuación de firma de células γδT C4CXCL13 alta tuvieron un período de supervivencia significativamente más largo que los que tenían una puntuación baja (p = 0,0044; Figura 7D). Mientras tanto, los pacientes del grupo de alta puntuación que se sometieron a tratamiento anti-PD-L1 lograron una tasa de respuesta objetiva notablemente superior en relación con el grupo de baja puntuación (prueba de chi-cuadrado, p = 0,0167; Figura 7E). En consecuencia, el grupo de alta puntuación mostró un porcentaje más alto de respuesta completa y una tasa más baja de enfermedad progresiva (Figura 7F). En conclusión, los resultados demuestran que el grupo H-CXCL13 γδT muestra una respuesta superior a la inmunoterapia en relación con el grupo de baja puntuación, y la puntuación de la firma de células γδT C4CXCL13 se puede utilizar como un factor biológico favorable para predecir el pronóstico de la inmunoterapia.
Para validar externamente las implicaciones clínicas de la firma C4CXCL13, se puntuaron y agruparon 558 muestras de cáncer de colon del conjunto de datos GSE39582 de forma similar a la cohorte de TCGA. Una puntuación de firma de células γδT C4CXCL13 alta se asoció significativamente con una mejora de la supervivencia en relación con una puntuación baja (Figura 8A). Posteriormente, evaluamos la expresión de los puntos de control inmunitario y el grado de infiltración inmune mediante ESTIMATE, ssGSEA y CIBERSORT. Con la excepción de PD1 y CTLA4, todos los demás puntos de control inmunitario se expresaron en gran medida en el grupo H-CXCL13 γδT (Figura 8B). Los perfiles de infiltración de células inmunitarias mostraron una tendencia similar a los observados en TCGA-COAD (Figura 8C, D). Por lo tanto, utilizando GSE39582, verificamos que las puntuaciones de firma de células γδT C4_CXCL13 altas se asocian con un microambiente inmunitario más activo, lo que predice una respuesta más favorable a la inmunoterapia.
3.1. Panorama de células individuales del CRC con MSI y MSS
Se realizó un perfilado transcriptómico de células individuales de 100 muestras de CRC del conjunto de datos GSE178341 para delimitar las poblaciones de células infiltrantes en el CRC con MSI y MSS. El estado de microsatélites de todos los pacientes de la cohorte se proporciona en los Materiales suplementarios, Tabla S1. Tras un control de calidad estricto y la eliminación de las células de baja calidad, se conservaron 360.282 células para el análisis de scRNA-seq (Figura 1A y Figura S1). Utilizando marcadores de tipo celular canónicos, estas células se anotaron en 8 linajes celulares principales: células T/NK (CD3D, CD3E y FCGR3A), células B (CD79A, MS4A1), células plasmáticas (CD79A, MZB1), células mieloides (MS4A6A, LYZ y CD68), fibroblastos (DCN, LUM), células endoteliales (ENG, PECAM1 y CLDN5), células epiteliales (EPCAM, KRT8 y KRT18) y células de mastocitos (TPSAB1, CPA3 y KIT) (Figura 1B). A continuación, evaluamos el estado y la composición de los grupos de células en los tejidos adyacentes, los tejidos de CRC con MSI y los tejidos de CRC con MSS. Dado que las células inmunitarias son abundantes en los tumores de CRC y tienen capacidades antitumorales, subdividimos aún más las células T/NK y las células mieloides en subconjuntos (Figura 1C, D). Para los subconjuntos de células T/NK, se identificaron y aislaron las células γδT en función de la expresión de los genes marcadores específicos del tipo celular TRDC, TRGC1 y TRGC2, en lugar de los genes marcadores de las células T CD4+ o CD8+. Se utilizaron marcadores de tipo celular establecidos para anotar manualmente cada grupo de células (Figura 1E).
3.2. Identificación de un grupo de γδT asociado con tumores
Extrajimos todas las células anotadas como células γδT del conjunto de datos integrado de una sola célula. Las células γδT se agruparon en cinco grupos (Figura 2B). La identidad del grupo se determinó mediante los genes característicos de los subconjuntos de células T y los estados funcionales (Figura 2A, C y Tabla S2 de los Materiales Suplementarios). El mayor porcentaje del subconjunto de células γδT efectoras C0FCER1G, junto con la expresión elevada de TYROBP, genes relacionados con los receptores de superficie de las células asesinas naturales (KLRC1, KIR2DL4) y moléculas relacionadas con la inmunidad innata (FCER1G [[25]], TMIGD2), se encontraron en el tejido tumoral de pacientes con CRC, lo que indica una mayor expresión de los genes asociados con los linfocitos intraepiteliales (IEL) [[26]]. En las muestras de tejido adyacente, el subconjunto de células γδT C1IL7R mostró niveles de expresión más altos de los genes residentes en el tejido (ITGAE y CD69) [[13]], y, dada su abundante expresión de IL7R, este subconjunto se identificó como un posible subconjunto de células γδT de memoria. El subconjunto de células γδT C2CD81 expresó SAMD1, MBD2 y JUND, cuyas proteínas codificadas confieren resistencia al estrés oxidativo, al tiempo que exhibe una alta expresión de múltiples moléculas de adhesión, incluidas ITGB1 y MACF1. El subconjunto de células γδT C3TOP2A se caracterizó por una alta expresión de genes relacionados con la mitosis (TOP2A, UBE2C, MKI67). El subconjunto de células γδT C4CXCL13 mostró una expresión marcadamente elevada de genes citotóxicos (GZMA, GZMB, GZMH, PRF1) y genes relacionados con la presentación de antígenos (HLA-DRA, HLA-DPB1_).
En relación con otros subconjuntos de células γδT, las células γδT C4CXCL13 expresaron específicamente PDCD1 y CXCL13, junto con una regulación al alza distinta de múltiples moléculas de puntos de control inmunitarios, incluidos LAG3, TIGIT y HAVCR2. Además, el subconjunto de células γδT C4CXCL13 exhibió la puntuación de puntos de control inmunitarios más alta entre todos los subconjuntos (Figura 2D, E). Estas observaciones indican que el subconjunto de células γδT C4CXCL13 exhibe características fenotípicas similares a las de las células T agotadas, pero aún conserva funciones citotóxicas. Descubrimos que la proporción del subconjunto de células γδT C4CXCL13 era significativamente mayor en el CRC MSI en comparación con el CRC MSS o el tejido adyacente. Además, el subconjunto de células γδT C4CXCL13 era distinto de otros subconjuntos de células γδT, lo que representa una población única identificada específicamente en el CRC MSI (Figura 2F, G). Para caracterizar de manera integral los roles biológicos de las células γδT C4CXCL13, se realizó un análisis de enriquecimiento. El análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) indica que el subconjunto de células γδT C4_CXCL13 estaba significativamente enriquecido en vías asociadas con la presentación de antígenos, la activación de células T αβ y la citotoxicidad mediada por leucocitos (Figura 2H). Además, el análisis de la vía KEGG demostró además un enriquecimiento prominente en la expresión de PD-L1 tumoral y la vía del punto de control PD-1 (Figura 2I).
3.3. Análisis de la trayectoria de los subconjuntos de células γδT en el cáncer colorrectal
Se utilizó el análisis CytoTRACE para evaluar la capacidad de diferenciación de los distintos subconjuntos de células γδT, y los resultados mostraron que el subconjunto de células γδT C3TOP2A exhibió la puntuación CytoTRACE más alta, lo que indica el menor grado de diferenciación (Figura 3A). Analizamos las trayectorias de diferenciación de los subconjuntos de células γδT utilizando el análisis de pseudotiempo y observamos las trayectorias de desarrollo desde las células γδT C3TOP2A en el estado inicial o las células γδT C2CD81 en el estado intermedio hasta las células γδT C4CXCL13 y las células γδT C1IL7R en el estado terminal (Figura 3B, C). Basado en los cálculos de pseudotiempo, se especuló que el subconjunto de células γδT C3TOP2A de alta proliferación se diferenciaba principalmente en el subconjunto de células γδT efectoras C4CXCL13 y el subconjunto de células γδT de memoria C1IL7R, mientras que las células γδT C0FCER1G se distribuían a lo largo de la trayectoria y el subconjunto de células γδT C2CD81 se ubicaba principalmente en el estado de transición intermedio. Realizamos un análisis de pseudotiempo para investigar los perfiles de expresión dinámica de los genes clave durante la diferenciación de las células γδT. Los genes expresados diferencialmente se agruparon en cuatro grupos con perfiles de expresión temporal similares (Figura 3D). El grupo 4 se ubicó principalmente en la etapa temprana de pseudotiempo, caracterizado por los genes marcadores derivados de los subconjuntos de células γδT C3TOP2A y C2CD81. Los grupos 2 y 3 se distribuyeron predominantemente en la etapa terminal, albergando los genes marcadores de los subconjuntos de células γδT C1IL7R y C4CXCL13.
3.4. Análisis de la interacción célula-célula de las células γδT C4_CXCL13
A continuación, realizamos análisis de comunicación celular para caracterizar las interacciones ligando-receptor entre las células γδT C4CXCL13 y otras células. Para identificar las células epiteliales malignas, incluimos un grupo de fibroblastos y un grupo de células endoteliales en los análisis como células de referencia (Figura 4A). Las células epiteliales se clasificaron posteriormente en células malignas y no malignas en función de las distintas firmas de CNV (Figura 4B). A continuación, utilizamos CellChat para analizar la comunicación célula-célula entre las células γδT C4CXCL13 y otros tipos de células en el CRC MSI y analizamos los eventos de regulación de la señal celular en los que las células γδT C4CXCL13 participan como emisores y receptores de señal, respectivamente (Figura 4C, D). Los resultados muestran que CD99-CD99 y MIF-(CD74+CXCR4) son las principales vías de interacción intercelular mediadas por las células γδT C4CXCL13. La evidencia acumulada confirma que CD99 se expresa de manera ubicua en múltiples poblaciones celulares, incluidas las células T, las células mieloides, los fibroblastos y las células epiteliales. Sus funciones principales implican la regulación de la adhesión celular, la migración transendotelial y múltiples vías de señalización inmunitaria [[27]]. Además, las células γδT C4CXCL13 pueden interactuar específicamente con las células T CD4+ y las células mieloides a través de las moléculas de antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II clásicas, como HLA-DR y HLA-DP, participando en la regulación del microambiente inmunitario. Mientras tanto, las quimiocinas secretadas por las células γδT C4CXCL13 pueden regular la función de los macrófagos a través de las vías de señalización CCL3-CCR1 y CCL5-CCR1. Estudios posteriores encontraron que las células γδT C4CXCL13 pueden interactuar con las células tumorales a través de pares ligando-receptor involucrados en los receptores activados por proteasas (PAR) y las vías de señalización de midkina (MK), que incluyen específicamente MDK-NCL, IFNG-(IFNGR1+IFNGR2), GZMA-PARD3 y GZMA-F2RL1 (p < 0,01). La verificación de los perfiles de expresión de los pares ligando-receptor anteriores en diferentes tipos de células reveló que la molécula F2RL1 se expresa preferentemente en las células tumorales en lugar de otras poblaciones celulares (Figura 4E). En resumen, el eje de señalización GZMA-F2RL1 puede representar una vía de comunicación importante entre las células γδT C4CXCL13 y las células tumorales, con posibles implicaciones regulatorias en el desarrollo del cáncer colorrectal.
3.5. Identificación de genes relacionados con las células γδT C4_CXCL13 en el CRC MSI y cálculo de la puntuación GSVA
Para caracterizar mejor los genes de las células γδT C4CXCL13, realizamos una selección de genes marcadores utilizando la función FindAllMarkers. Los umbrales de selección se establecieron de la siguiente manera: p_valadj < 0,05, avglog2FC > 0,58 y el porcentaje de células que expresan el gen en el subconjunto de células γδT C4CXCL13 (pct.1) > 0,3. En última instancia, se identificaron 17 genes característicos elegibles (TRGC2, S100A4, CD3D, GZMB, CD3G, LAG3, HLA-DPB1, CD2, HLA-DRA, CCL4, RBPJ, GNLY, HLA-DPA1, CYTOR, IDH2, HLA-DRB1, PTMS), que se expresaron en gran medida en el subconjunto de células γδT C4CXCL13 (Figura 5A). Los resultados confirman que las características genéticas de las células γδT C4CXCL13 tienen una especificidad significativa entre los diferentes subconjuntos de células (Figura 5B). A continuación, realizamos un análisis GSVA para generar una puntuación de firma de células γδT C4CXCL13 en todas las muestras de TCGA-COAD, y las muestras se asignaron a un grupo de alta puntuación o a un grupo de baja puntuación, con 323 casos asignados al grupo de alta puntuación y 102 al grupo de baja puntuación (Figura 5D). Como se muestra en el análisis de Kaplan-Meier, el aumento de las puntuaciones de la firma de células γδT C4CXCL13 se asoció significativamente con una mejor supervivencia en la cohorte de TCGA-COAD (Figura 5C). Posteriormente, realizamos análisis de Cox univariante y multivariante basados en la puntuación de las células γδT C4CXCL13 y otros factores clínicos, y encontramos que la puntuación de las células γδT C4CXCL13 fue un factor pronóstico independiente significativo (p < 0,05, Tabla 1).
3.6. Relación de la firma de células γδT C4_CXCL13 con las características inmunitarias tumorales
Realizamos una selección de DEG entre el grupo de alta γδT CXCL13 (H-CXCL13 γδT) y el grupo de baja γδT CXCL13 (L-CXCL13 γδT) en TCGA-COAD; 457 genes mostraron una expresión elevada en el grupo H-CXCL13 γδT. Se realizó un análisis GSEA para explorar las disparidades funcionales entre los dos grupos, y los genes en el grupo H-CXCL13 γδT estuvieron principalmente involucrados en procesos biológicos relacionados con la inmunidad, incluida la migración de leucocitos, la respuesta inmunitaria humoral y la activación y regulación de las respuestas inmunitarias adaptativas (Figura 6A). Posteriormente, realizamos un análisis de enriquecimiento KEGG en los genes con una expresión significativamente elevada en el grupo de alta puntuación y visualizamos los resultados del enriquecimiento (Figura 6B). Los resultados demostraron que los genes regulados al alza se enriquecieron principalmente en múltiples vías inmunitarias anti-tumorales, incluida la vía de señalización de las citocinas, la vía de señalización del receptor de células T y la vía del punto de control PD-L1, y la vía de diferenciación de las células Th17. En conjunto, estos resultados indican que los DEG entre los dos grupos de puntuación se localizan principalmente en actividades biológicas relacionadas con la inmunidad, lo que sugiere que el grupo H-CXCL13 γδT puede estar estrechamente asociado con el estado de activación inmunitaria en el cáncer colorrectal.
Los resultados del análisis de infiltración inmunitaria mostraron que las puntuaciones asociadas con la vía de señalización del receptor de quimiocinas C-C (CCR), las puntuaciones de los puntos de control inmunitarios, las puntuaciones relacionadas con las moléculas de MHC de clase y las puntuaciones de respuesta de la actividad citotóxica fueron significativamente más altas en el grupo de alta puntuación en comparación con el grupo de baja puntuación (Figura 6D). Además, ssGSEA mostró que el nivel de infiltración de células inmunitarias en el grupo H-CXCL13 γδT fue mayor que en el grupo L-CXCL13 γδT (Figura 6E). Estos resultados destacan que existe una respuesta inmunitaria anti-tumoral mejorada en el microambiente tumoral de los pacientes con puntuaciones de firma de células γδT C4CXCL13 altas. Para aclarar aún más las diferencias en la composición de las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral entre los dos grupos, analizamos las proporciones relativas de varios tipos de células inmunitarias en las muestras de ambos grupos utilizando el algoritmo CIBERSORT. Los resultados sugieren una abundancia relativa significativamente mayor de macrófagos M2, células T CD8+, células T auxiliares foliculares, macrófagos M1, mastocitos en reposo y neutrófilos en el grupo H-CXCL13 γδT en comparación con el grupo L-CXCL13 γδT. En contraste, las abundancias relativas de macrófagos M0, células T CD4+ de memoria en reposo y mastocitos activados disminuyeron significativamente (Figura 6F). Además, el grupo H-CXCL13 γδT mostró puntuaciones inmunitarias y ESTIMATE significativamente más altas, lo que apoya que las células γδT C4CXCL13 ejercen un efecto regulador sobre la infiltración de células inmunitarias dentro del TME (Figura 6C).
3.7. Evaluación de la predicción de la respuesta a la inmunoterapia
A continuación, evaluamos las características relacionadas con la inmunoterapia comparando los perfiles de mutación entre los grupos (Material Suplementario, Figura S2). El grupo H-CXCL13 γδT presentó un TMB más alto, lo que podría mejorar la generación de neoantígenos y la activación inmune (Figura 7A). De manera consistente, las principales moléculas de los puntos de control inmunitarios (PD1, PDL1, PDL2, CTLA4, LAG3, HAVCR2, TIGIT) mostraron niveles de expresión significativamente elevados en el grupo de puntuación alta (Figura 7B). A continuación, evaluamos si la firma de células C4CXCL13 γδT podría predecir la respuesta a la inmunoterapia en pacientes estratificados por estado de microsatélites (MSI frente a MSS). Para cada grupo, estimamos por separado la abundancia de células inmunitarias infiltrantes y los niveles de expresión de las moléculas de los puntos de control inmunitarios en muestras individuales. Nuestro análisis reveló que, tanto en los grupos MSI como MSS, los pacientes del grupo H-CXCL13 γδT presentaban una mayor infiltración inmune y expresión de los puntos de control inmunitarios, así como una mayor infiltración de células T CD8+ activadas y niveles más altos de interferones de tipo I; estas características se asociaron con mejores respuestas y pronóstico del tratamiento inmunológico (Material Suplementario, Figura S3). Posteriormente, buscamos cualquier correlación entre las puntuaciones de la firma de células C4CXCL13 γδT y la respuesta inmunoterapéutica. Realizamos un análisis de la puntuación de inmunofenotipo (IPS) para anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en muestras de los grupos de puntuación alta y baja para predecir las respuestas terapéuticas de los pacientes a los dos inhibidores de los puntos de control inmunitarios. Los resultados mostraron que los valores de IPS para la positividad de CTLA-4 y la positividad de PD-1 en el grupo H-CXCL13 γδT fueron significativamente más altos que en el grupo de puntuación baja (p < 0,001; Figura 7C). El conjunto de datos IMvigor210 incluyó pacientes con carcinoma urotelial tratados con terapia anti-PD-L1, que se utilizó exclusivamente para la validación exploratoria con el fin de evaluar la relevancia terapéutica y el potencial pronóstico de nuestra firma derivada del cáncer colorrectal. Esta estrategia de validación entre diferentes tipos de tumores se adopta ampliamente en la investigación de biomarcadores [[28],[29]]. En la cohorte IMvigor210, los pacientes con una puntuación alta de la firma C4CXCL13 γδT tuvieron un período de supervivencia significativamente más largo que aquellos con una puntuación baja (p = 0,0044; Figura 7D). Mientras tanto, los pacientes del grupo de puntuación alta que recibieron tratamiento anti-PD-L1 lograron una tasa de respuesta objetiva notablemente superior en comparación con el grupo de puntuación baja (prueba de Chi-cuadrado, p = 0,0167; Figura 7E). En consecuencia, el grupo de puntuación alta mostró un mayor porcentaje de respuesta completa y una menor tasa de enfermedad progresiva (Figura 7F). En conclusión, los resultados demuestran que el grupo H-CXCL13 γδT muestra una respuesta superior a la inmunoterapia en comparación con el grupo de puntuación baja, y la puntuación de la firma de las células C4CXCL13 γδT se puede utilizar como un factor biológico favorable para predecir el pronóstico de la inmunoterapia.
Para validar externamente las implicaciones clínicas de la firma C4CXCL13, se puntuaron y agruparon 558 muestras de cáncer de colon del conjunto de datos GSE39582 de manera similar a la cohorte TCGA. Una puntuación alta de C4CXCL13 γδT se asoció significativamente con una mejor supervivencia en comparación con una puntuación baja (Figura 8A). Posteriormente, evaluamos la expresión de los puntos de control inmunitarios y el grado de infiltración inmune mediante ESTIMATE, ssGSEA y CIBERSORT. Con la excepción de PD1 y CTLA4, todos los demás puntos de control inmunitarios se expresaron en gran medida en el grupo H-CXCL13 γδT (Figura 8B). Los perfiles de infiltración de células inmunitarias mostraron una tendencia similar a los observados en TCGA-COAD (Figura 8C, D). Por lo tanto, utilizando GSE39582, verificamos que las puntuaciones altas de la firma C4_CXCL13 γδT se asocian con un microambiente inmunitario más activo, lo que predice una respuesta más favorable a la inmunoterapia.
4. Discusión
Las células γδT actúan como un puente entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa, y son particularmente abundantes en las áreas de barrera, como los intestinos [[30]]. La evidencia emergente ha demostrado que las células γδT desempeñan funciones críticas en la regulación de la progresión del CRC; sin embargo, sus funciones precisas son objeto de debate, en gran parte debido a la heterogeneidad del microambiente tumoral (TME) [[31]]. El análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) permite la delineación de subconjuntos únicos de células γδT en el complejo microambiente tumoral, proporcionando así nuevas perspectivas para las intervenciones inmunoterapéuticas. En este estudio, mediante la integración de la secuenciación de ARN de una sola célula, la secuenciación de ARN masiva y las cohortes clínicas, obtuvimos un número considerable de células γδT y caracterizamos sistemáticamente su heterogeneidad dentro del microambiente tumoral del cáncer colorrectal con distintos estados de inestabilidad de microsatélites.
Nuestro análisis revela una extensa heterogeneidad de las células γδT asociadas al tumor, con distintos subconjuntos que exhiben programas transcripcionales divergentes e impactos pronósticos. De manera interesante, se identificó un subconjunto distinto de células C4CXCL13 γδT, que expresa múltiples moléculas de los puntos de control inmunitarios, como PD-1, y que simultáneamente exhibe un fenotipo de células T citotóxicas, caracterizado por una mayor expresión de los genes relacionados con la vía perforina-granzima. El subconjunto C4CXCL13 γδT se enriqueció significativamente en las vías de respuesta inmune, como "procesamiento y presentación de antígenos", "eliminación de células" y "vía de señalización de PD-1". Los resultados del análisis de pseudotiempo sugirieron que el microambiente tumoral del CRC con MSI impulsa a las células γδT a diferenciarse de las células γδT proliferativas C3TOP2A en las células γδT efectoras C4CXCL13 y las células γδT de memoria C1IL7R, acompañado de una mayor función citotóxica y de presentación de antígenos. El agotamiento de las células T es un proceso dinámico y progresivo. Hasta la fecha, no está claro si las células γδT exhiben agotamiento en el microambiente tumoral del cáncer colorrectal y cuáles son las características de estas posibles células agotadas. Sin embargo, con una investigación en profundidad, se ha descubierto que algunos subconjuntos de células T aún pueden mantener sus funciones efectoras incluso cuando muestran un fenotipo de agotamiento. Se ha documentado previamente que el subconjunto Vδ2− de las células γδT en el carcinoma renal humano, aunque fenotípicamente similar a las células T agotadas, aún conserva funciones citotóxicas. Sus características de expresión se correlacionan con la respuesta clínica a los inhibidores de PD-1 [[32]] y podrían utilizarse como un biomarcador predictivo para el bloqueo de los puntos de control inmunitarios. Basándonos en esto, especulamos que el subconjunto C4CXCL13 γδT con características funcionales similares puede ser una de las bases celulares importantes para que los pacientes con CRC con MSI se beneficien de la terapia de bloqueo de los puntos de control inmunitarios. Además, también se han encontrado células γδT infiltrantes tumorales que expresan PD-1 en el neuroblastoma [[33]] y el adenocarcinoma ductal pancreático [[34]]. Además, encontramos que las células C4_CXCL13 γδT están casi ausentes en los tejidos normales del colon y que su proporción es mayor en los pacientes con MSI que en los pacientes con MSS. Por lo tanto, exploramos su papel en la progresión tumoral y la inmunoterapia del CRC con MSI.
Un análisis adicional de la comunicación entre células relacionadas con las células C4CXCL13 γδT reveló que este subconjunto de células interactúa con las células tumorales a través de las vías de señalización IFNG-(IFNGR1 + IFNGR2), GZMA-F2RL1 y GZMA-PARD3, lo que indica que las células C4CXCL13 γδT poseen actividad citotóxica. Entre estas interacciones predichas, el par de señalización GZMA-F2RL1 se identificó como una vía candidata destacada entre las células C4CXCL13 γδT y las células tumorales, y F2RL1 se expresa específicamente en gran medida solo en las células tumorales del CRC, lo que sirve como una molécula importante para la interacción entre las células tumorales y las células C4CXCL13 γδT. El gen F2RL1 codifica la proteína del receptor activado por proteasas 2 (PAR2), que se clasifica como un receptor acoplado a proteína G. Se ha informado que PAR2 se activa de manera anormal en una amplia gama de tipos de tumores malignos, como el cáncer de colon [[35]] y el cáncer de mama [[36]], y desempeña un papel fundamental en la regulación de la migración de las células tumorales, la resistencia a los fármacos, la angiogénesis y otros comportamientos biológicos malignos. PAR2 se expresa en gran medida en las células de cáncer colorrectal y fomenta un microambiente tumoral inmunosupresor al suprimir la señalización del interferón de tipo I, mientras que su inhibición mejora la inmunidad antitumoral, aumenta la infiltración de células T CD8+ en las lesiones metastásicas y se combina con el bloqueo de los puntos de control inmunitarios para suprimir la metástasis hepática [[37]]. Si bien estas interacciones se infieren computacionalmente, dado el papel oncogénico conocido de F2RL1 (PAR2) en el microambiente tumoral, especulamos que la inmunoterapia dirigida a la vía de señalización GZMA-F2RL1 tiene una gran promesa.
Identificamos marcadores de las células C4CXCL13 γδT y, en última instancia, determinamos 17 genes relevantes que exhiben asociaciones con MSI y procesos inmunitarios (TRGC2, S100A4, CD3D, GZMB, CD3G, LAG3, HLA-DPB1, CD2, HLA-DRA, CCL4, RBPJ, GNLY, HLA-DPA1, CYTOR, IDH2, HLA-DRB1, PTMS). Construimos una puntuación de la firma de células C4CXCL13 γδT mediante GSVA y estratificamos las muestras en grupos de γδT de CXCL13 bajo y alto. Los pacientes con una puntuación alta de C4CXCL13 γδT exhibieron un mejor pronóstico, y su valor pronóstico se validó aún más en dos conjuntos de datos independientes adicionales (IMvigor210, GSE39582). Luego, evaluamos las características clínicas y demostramos que la puntuación de C4CXCL13 γδT sirve como un marcador pronóstico independiente. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes reveló que los genes elevados en el grupo de la firma C4_CXCL13 γδT de puntuación alta se enriquecieron notablemente en las vías asociadas con las moléculas del MHC. Además, el análisis de la comunicación entre células reveló la activación de pares de ligandos y receptores involucrados en la presentación de antígenos y el reclutamiento de células inmunitarias durante las interacciones entre las células γδT y otras poblaciones inmunitarias. La evidencia acumulada ha indicado que las células γδT pueden servir como células presentadoras de antígenos (APC). La activación de estas células conduce a un aumento de la expresión de MHC-II y moléculas costimuladoras, lo que en última instancia promueve la activación de las células T αβ y las células B ingenuas [[38],[39]]. En particular, las células γδT pueden promover la activación de los macrófagos, y su función coordinada puede contribuir a los efectos antitumorales sinérgicos [[40]]. Coherente con los resultados anteriores, nuestro análisis demuestra que las células γδT podrían mejorar la acumulación de macrófagos dentro del microambiente tumoral a través de la señalización dependiente de quimiocinas.
Para caracterizar aún más los distintos perfiles funcionales inmunitarios entre los grupos H-CXCL13 γδT y L-CXCL13 γδT, empleamos ESTIMATE, ssGSEA y CIBERSORT. El análisis de ESTIMATE indicó que las puntuaciones estromales, las puntuaciones inmunitarias y las puntuaciones de ESTIMATE estaban significativamente elevadas en el grupo H-CXCL13 γδT. El análisis de ESTIMATE reveló que el grupo H-CXCL13 γδT presenta puntuaciones estromales, puntuaciones inmunitarias y puntuaciones de ESTIMATE significativamente más altas. El análisis posterior de CIBERSORT indica que los porcentajes de células T CD8+ y macrófagos M1 estaban significativamente elevados en el grupo H-CXCL13 γδT en comparación con el grupo L-CXCL13 γδT. Los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) CD8+ contribuyen a la supresión tumoral a través del reconocimiento de antígenos específicos del tumor [[41]]. Los macrófagos M1 también ejercen funciones antitumorales a través de la citotoxicidad directa y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) para erradicar las células tumorales. Estos resultados, en conjunto, sugieren que se observa un aumento de la infiltración inmunitaria, especialmente de células T CD8+ y macrófagos M1, en el grupo H-CXCL13 γδT, lo que puede representar un predictor beneficioso para la respuesta inmunoterapéutica en el CCRC. Esta observación puede atribuirse a la heterogeneidad de los inmunofenotipos tumorales. A la luz de los diversos perfiles de infiltración inmunitaria, los cánceres humanos pueden estratificarse en subtipos inflamados, con exclusión inmunitaria y desérticos inmunológicos [[42]]. Los tumores inflamados generalmente poseen un mayor nivel de infiltración de células inmunitarias, mientras que los tumores desérticos inmunológicos muestran una baja infiltración inmunitaria. Además, los niveles de infiltración de células inmunitarias están positivamente correlacionados en los datos de secuenciación masiva. Por lo tanto, las células C4-CXCL13 γδT pueden infiltrarse en el microambiente tumoral junto con las células T CD8+ y los macrófagos M1, lo que conduce a una correlación entre las altas puntuaciones de H-CXCL13 γδT y el aumento de la infiltración inmunitaria, así como a una mejor respuesta a la inmunoterapia.
Para investigar la asociación de las puntuaciones de C4-CXCL13 γδT con la respuesta inmunoterapéutica, analizamos los perfiles de mutación de los dos grupos. Se calculó la carga mutacional tumoral (TMB) para cada muestra, lo que reveló niveles de TMB marcadamente más altos en el grupo H-CXCL13 γδT en comparación con el grupo bajo. Los neoantígenos surgen de las mutaciones tumorales, y, por lo tanto, una mayor TMB se acompaña de una mayor carga de neoantígenos. Esto no solo facilita el reconocimiento de las células T, sino que también se corresponde con mejores beneficios clínicos de la inmunoterapia [[43]]. A continuación, realizamos un análisis comparativo de la expresión de los puntos de control inmunitarios entre los dos grupos [[44]]. La alta expresión de estos puntos de control inmunitarios proporciona una base adecuada para la utilización de los inhibidores de los puntos de control inmunitarios (ICIs), contribuyendo así a una mejor eficacia clínica en la inmunoterapia [[45]]. El potencial predictivo de la puntuación de C4CXCL13 γδT se evaluó aún más en una cohorte de inmunoterapia. Se encontró que una alta puntuación de H-CXCL13 γδT estaba asociada con una mejor eficacia terapéutica tanto de los inhibidores de los puntos de control inmunitarios CTLA-4 como PD-1. El análisis del conjunto de datos IMvigor210 reveló una mayor tasa de respuesta completa (CR) y una menor tasa de enfermedad progresiva (PD) en el grupo H-CXCL13 γδT que en el grupo L-CXCL13 γδT. Estos hallazgos, en conjunto, demuestran que el grupo H-CXCL13 γδT muestra una respuesta más favorable a la inmunoterapia. Para validar la asociación entre las puntuaciones de C4CXCL13 γδT y la respuesta inmunoterapéutica, las muestras en GSE39582 se clasificaron en dos grupos según las puntuaciones de C4_CXCL13 γδT. Evaluamos además los niveles de expresión de los transcritos de los puntos de control inmunitarios y los patrones de infiltración de células inmunitarias. Nuestro análisis demostró que la mayoría de los puntos de control inmunitarios estaban altamente expresados en el grupo H-CXCL13 γδT. Además, los patrones de infiltración de células inmunitarias fueron coherentes con los observados en la cohorte TCGA-COAD. Por lo tanto, el análisis de la cohorte GSE39582 confirmó que el grupo H-CXCL13 γδT puede exhibir una respuesta inmunoterapéutica superior en comparación con el grupo L-CXCL13 γδT.
Este estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, aunque los valores de corte óptimos específicos de la cohorte identificados mediante la función "surv_cutpoint" se han adoptado ampliamente en estudios anteriores para tener en cuenta la heterogeneidad de los datos, este enfoque puede introducir un sobreajuste y un sesgo optimista, lo que podría conducir a una sobreestimación del rendimiento pronóstico. Por lo tanto, los resultados presentes deben interpretarse con la debida precaución. En segundo lugar, la cohorte IMvigor210 se utilizó únicamente para la validación exploratoria de nuestra firma derivada del cáncer colorrectal. Dada la diferencia inherente en el tejido de origen, se justifica una validación futura en cohortes independientes de inmunoterapia para el CCRC.
5. Conclusiones
En conclusión, nuestro estudio identificó células C4CXCL13 γδT que estaban enriquecidas en pacientes con CCRC con inestabilidad de microsatélites. Además, examinamos 17 genes relacionados con las células C4CXCL13 γδT y establecimos puntuaciones de células C4_CXCL13 γδT que permiten una predicción eficaz de la respuesta a la inmunoterapia en pacientes con COAD. En comparación con el grupo L-CXCL13 γδT, el grupo H-CXCL13 γδT muestra una mayor infiltración inmunitaria, una mayor TMB y una mayor expresión de los puntos de control inmunitarios, y logra mejores resultados inmunoterapéuticos. En conjunto, estas observaciones mejoran nuestra comprensión de la inmunidad tumoral y representan una posible herramienta clínica para optimizar los regímenes de inmunoterapia en COAD.
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