La redistribución subcelular del GPR15 en las membranas internas promueve la reprogramación metabólica mediada por NAD+ y aumenta la quimiosensibilidad al 5-FU en el cáncer colorrectal.

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) comprenden la familia más grande de proteínas de membrana, con más de 800 miembros, y clásicamente se consideran sensores residentes de la membrana plasmática (PM) que transducen señales extracelulares para modular diversos procesos fisiológicos (^[1]). Por lo tanto, los GPCR son objetivos farmacológicos primarios, representando aproximadamente el 30% de los fármacos aprobados por la FDA (^[2]). Los GPCR pueden internalizarse después de la activación para experimentar desensibilización. Curiosamente, la evidencia emergente de la última década ha remodelado nuestra comprensión de la biología de los GPCR. En particular, un subconjunto de GPCR, denominados GPCR de la membrana endosomal, escapan de las vías de desensibilización canónicas y mantienen la señalización desde compartimentos intracelulares (^[3]). Ahora se reconoce que más de 40 GPCR participan en el tráfico subcelular dinámico, y la localización dicta la selectividad de la vía. Los endosomas y los lisosomas son los dos orgánulos principales que internalizan y desactivan los GPCR (^[4]). Los GPCR también están presentes en otros orgánulos, incluyendo las mitocondrias (^[5], ^[6]), el retículo endoplásmico (RE; ref. ^[7]) y la membrana nuclear y el núcleo (^[8]), con cascadas de señalización específicas activadas en función de la localización subcelular específica. Estos estudios han confirmado la función de los GPCR dentro de las células; sin embargo, cómo se redistribuyen los GPCR específicos entre los orgánulos dentro de las células con relevancia fisiológica o contribuyen a los procesos patológicos aún debe dilucidarse.

GPR15, un GPCR de clase A con localización tanto en la PM como intracelular, ejemplifica la complejidad de la regulación espacial de los GPCR (^[9]). Aunque se ha caracterizado bien como un correceptor del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (^[10]) y un quimioatrayente para las células T reguladoras (Treg) del colon, las células Th1, Th2 y Th17 a través de su ligando C10orf99 (^[11]–^[17]), se ha predicho que GPR15 está asociado con la progresión de múltiples tipos de tumores, con funciones paradójicas entre tipos de cáncer específicos (^[18]). En el cáncer colorrectal, se ha informado que GPR15 promueve la progresión tumoral a través de la inmunosupresión mediada por Treg (^[15]) y reduce la carga tumoral a través de la activación de las células T CD8+ (^[19]). Esta dicotomía funcional surge de las interacciones específicas del compartimento con distintas poblaciones de células inmunitarias. Fundamentalmente, los estudios previos se han centrado exclusivamente en el papel inmunomodulador de GPR15 como un quimiorreceptor localizado en la PM, pero no en las funciones de GPR15 de la membrana endosomal y los roles autónomos de GPR15 en las células cancerosas. Los análisis bioinformáticos, incluidos los nuestros, han implicado a GPR15 en la modulación de la quimiosensibilidad y la progresión tumoral (^[18], ^[20]), lo que indica un papel regulador epitelial intrínseco de GPR15 durante la progresión del cáncer colorrectal. Por lo tanto, dilucidar la función y el mecanismo de GPR15 localizado en la membrana endosomal en las células del cáncer colorrectal ayudará a aclarar aún más la señalización de los GPCR intracelulares y las redes reguladoras autónomas de las células tumorales. Estos son esenciales para desarrollar terapias dirigidas espacialmente que exploten las redes de señalización subcelular de GPR15, apoyando así nuevas terapias que superen las limitaciones actuales en el tratamiento del cáncer de colon.

Aquí, utilizamos una multiómica integrada, que incluye la secuenciación de ARN (RNA-seq), la proteómica y la metabolómica, para delinear la dinámica espacio-temporal de GPR15 localizado en el Golgi y su redistribución a las mitocondrias. Este proceso coordinó el intercambio cruzado subcelular para impulsar la reprogramación metabólica y la quimiosensibilización en el cáncer colorrectal. Demostramos que GPR15 amplificó la eficacia del 5-fluorouracilo (5-FU) al potenciar el metabolismo central del carbono de manera dependiente del NAD+. Identificamos inhibidores de PARP disponibles clínicamente como potentes quimiosensibilizadores para explotar esta vulnerabilidad a través de la sincronización metabólica entre compartimentos. Nuestros hallazgos establecieron el tráfico de los GPCR subcelulares como un nuevo eje terapéutico en oncología y proporcionan un marco para dirigir las dependencias metabólicas espaciales en los tumores.

Materiales y Métodos

Ratones

Se compraron ratones macho nu/nu de seis semanas de edad (RRID: IMSR_JCL: JCL: MID-0001) a Shanghai Jihui Laboratory Animal Care Co., Ltd. Los ratones tenían aproximadamente 8 semanas de edad cuando se estableció el modelo tumoral. Todos los ratones se mantuvieron en una instalación libre de patógenos específicos, y los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital General de Shanghái.

Cultivo celular

Las células NCM460 (RRID: CVCL0460), HCT-8 (RRID: CVCL2478), HCT-15 (RRID: CVCL0292), HT-29 (RRID: CVCL0320), Capan-2 (RRID: CVCL0026), AsPC-1 (RRID: CVCL0152), BT-474 (RRID: CVCL0179) y LS1034 (RRID: CVCL1382) se cultivaron en medio RPMI 1640 (BasalMedia, L210KJ). Las células SW620 (RRID: CVCL0547), SW480 (RRID: CVCL0546), MDA-MB-231 (RRID: CVCL0062), HEK293T (RRID: CVCL0063) y SW48 (RRID: CVCL1724) se cultivaron en DMEM (BasalMedia, L110KJ). Las células SW48 (cat. #IM-H639) y LS1034 (cat. #IM-H506) se compraron a Xiamen Immocell Biotechnology Co., Ltd. Todas las demás células se obtuvieron originalmente del Banco de Células/Banco de Células Madre de la Academia China de Ciencias. Todas las líneas celulares fueron autenticadas. Las células se complementaron con suero fetal bovino (FBS) al 10% (ExCell Bio, FSD500) y se cultivaron en una incubadora a 37°C con 5% de dióxido de carbono. La duración máxima para la que se utilizaron las células en experimentos específicos después de la descongelación fue de aproximadamente 1 mes. Las células no se examinaron para detectar la presencia de Mycoplasma_.

Análisis bioinformático

Los conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) se obtuvieron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) [GSE161277 (^[21]) y GSE178318 (^[22])]. Las muestras de una sola célula se prepararon y midieron como se describe en el artículo original para los conjuntos de datos. GSE161277 contiene conjuntos de datos correspondientes a tejidos normales, adenomas y cáncer. GSE178318 contiene conjuntos de datos correspondientes a cáncer colorrectal con metástasis hepáticas tratadas con o sin quimioterapia. Las muestras se analizaron y se reclustrizaron utilizando Seurat (v4.3.0) y Harmony (v1.2.0) utilizando procedimientos estándar. Los grupos de células se anotaron manualmente utilizando el conocimiento existente basado en la información publicada (^[23]) y el Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) después del agrupamiento mediante la aproximación y proyección de la dimensión de reducción de la variedad uniforme (UMAP). Los grupos de células y los genes marcadores asociados incluyeron células madre (LGR5, OLFM4 y ASCL2), células caliciformes (ATOH1, miembros de la familia de mucinas, TFF3, CLCA1 y SPDEF), TAC (PCNA y MKI67), células de Paneth (CA4, CA7, BEST4, LYZ, FZD5, EPHB2, DEFA5 y DEFA22), células de la cresta (POU2F3, SOX9, DUOX2, KRT18 y ACAT1), fibroblastos (COL3A, FBN1 y LUM), células endoteliales (CD34, PECAM1 y VWF), TNK (CD4, CD3, CD8, CD96 y CD247), células B (MS4A1, MALT1, IGHM, IGHD y CD19), células plasmáticas (IGHA y IGHG) y monocitos/macrófagos (MRC1, CD163, CD68, CD80, CD86, CD206, MSR1 y CSF1R_). Las células enterocíticas, las células enterocíticas distales, las células eritroides y los granulocitos se anotaron basándose en referencias del Human Protein Atlas.

Realizamos un análisis de supervivencia utilizando datos de pacientes del conjunto de datos de cáncer colorrectal (TCGA-COADREAD) del Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://xenabrowser.net/datapages/), que incluye perfiles clínicos, demográficos y de expresión génica completos de individuos diagnosticados con cáncer de colon y recto. Solo se incluyeron los datos de los pacientes con información de seguimiento completa en nuestro análisis. Los datos de expresión génica se preprocesaron para garantizar la coherencia y la comparabilidad entre las muestras. Para el análisis de supervivencia relacionado con un solo gen, utilizamos la función surv_cutpoint en el paquete survminer en R para determinar el corte óptimo de los valores de expresión génica que maximizó la diferencia de supervivencia entre los grupos de alta y baja expresión. En un análisis de supervivencia que utiliza una combinación de dos genes, comparamos a los pacientes con alta expresión de ambos genes (alto-alto) con aquellos con baja expresión de ambos genes (bajo-bajo). Esta categorización se basó en la evaluación de la expresión de cada paciente en relación con los valores medianos de los dos genes de interés, lo que produjo cuatro grupos distintos: alto-alto, alto-bajo, bajo-alto y bajo-bajo. Se utilizaron estimadores de Kaplan-Meier para trazar las curvas de supervivencia.

Para evaluar la expresión de los genes diana en diferentes grupos, realizamos un análisis de diagramas de caja. Utilizamos el paquete ggplot2 en R para crear los diagramas de caja, que mostraron gráficamente la distribución de los valores de expresión génica entre cada grupo y destacaron la mediana, los cuartiles y los posibles valores atípicos. Para evaluar estadísticamente las diferencias en la expresión génica entre los grupos, realizamos una prueba t de dos muestras, que es adecuada para comparar dos muestras independientes bajo el supuesto de una distribución normal. Los valores de p resultantes se utilizaron para determinar la significación de las diferencias de expresión, y un umbral de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Organoides de cáncer colorrectal

Los organoides de cáncer colorrectal se generaron a partir de tejido tumoral derivado de material endoscópico o resección quirúrgica de pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal (Tabla S1 complementaria). El tejido tumoral se procesó utilizando un kit de cultivo de organoides de cáncer colorrectal humano (Absin, abs9445). Brevemente, las muestras recogidas se colocaron en un frasco de muestreo que contenía una solución E preenfriada (4°C) para su transporte al laboratorio. Las muestras se lavaron en un plato de cultivo con solución B preenfriada (4°C) y se picaron con unas tijeras esterilizadas hasta que la solución pudiera pipetearse. El tejido picado se digirió en solución C en una incubadora durante 20 minutos a 37°C. Se añadió solución B en un volumen tres veces mayor que el de la solución C al tejido para detener la digestión. El tejido se pasó a través de un tamiz celular de 100 μm y se centrifugó a 300 × g durante 5 minutos. El precipitado se resuspendió en solución B y se centrifugó de nuevo. Se midió el volumen del precipitado del tejido y se añadió adhesivo de matriz en un volumen 25 veces mayor que el del precipitado del tejido (Absin, abs9495). La mezcla se colocó en una placa de 24 pocillos y se cultivó en solución A para la formación de organoides y el análisis posterior. El material endoscópico o la resección quirúrgica en pacientes se obtuvieron de acuerdo con la Declaración de Helsinki, con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Los estudios fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital General de Shanghái.

Modelo de ratón con xenoinjerto

Brevemente, se inyectaron 5 × 106 células HCT-8 o HCT116 por vía subcutánea en ratones nu/nu, según se indica. Siete días después de la inyección, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos según se indica en los experimentos específicos. Para investigar las células de cáncer colorrectal con sobreexpresión o deficiencia de GPR15, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 2 mg/kg de 5-FU (para las células HCT-8) o 20 mg/kg de 5-FU (para las células HCT116). Para examinar la eficacia combinada de rucaparib y 5-FU, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de 2 mg/kg de 5-FU, 5 mg/kg de rucaparib o 2 mg/kg de 5-FU junto con 5 mg/kg de rucaparib, según se indica. Se registraron el peso corporal y el tamaño del tumor de los ratones tratados. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones y se aislaron, se visualizaron y se pesaron los tumores.

Modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Brevemente, se inyectaron 3 × 103 células HCT116 que expresaban luciferasa en la pared del ciego de ratones nu/nu. El crecimiento tumoral se monitorizó de forma no invasiva mediante imágenes de bioluminiscencia. Tres días después de la implantación, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento y se les administró 20 mg/kg de 5-FU o un control vehículo diariamente por inyección intraperitoneal. La progresión tumoral y la respuesta al tratamiento se cuantificaron cada 3 días mediante señales de bioluminiscencia in vivo utilizando un sistema de imagen IVIS.

Modelo de xenoinjerto (xenoinjerto derivado del paciente) en ratón

La eficacia combinada entre 5-FU y rucaparib se evaluó en un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) en ratones, realizado por Shanghai Novopathway Biotechnology Co., Ltd. En resumen, el tejido tumoral de cáncer colorrectal humano (Tabla S1 del material suplementario) se procesó en fragmentos de 2 a 3 mm³ y se implantó por vía subcutánea en el flanco de ratones BALB/c nude. Una vez que el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 80 mm³, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos. A continuación, se trató a los ratones con inyecciones intraperitoneales diarias de 2 mg/kg de 5-FU, 5 mg/kg de rucaparib o una combinación de 2 mg/kg de 5-FU y 5 mg/kg de rucaparib, y se registraron diariamente el peso corporal y el tamaño del tumor. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones y se extirparon, se visualizaron y se pesaron los tumores.

Plásmidos

Se adquirió un clon de ADNc que codifica GPR15, PARP4 y MGST1 de Sino Biological (RRID: SCR003697). pLVX-TetOne-Puro-LbNOX-FLAG (cat. #218631, RRID: Addgene218631) y pLVX-TetOne-Puro-mitoLbNOX-FLAG (cat. #218667, RRID: Addgene218667) se obtuvieron de Addgene. GPR15 y MGST1 se subclonaron en pLVX-IRES-Puro con fusión C-terminal de FLAG y HA (hemaglutinina humana de la influenza). GPR15 también se subclonó en pLVX-IRES-Zsgreen. La región C-terminal de GNAQ (GNAQ-CT, aminoácidos 306-359) se construyó en pLVX-IRES-Puro o pLVX-IRES-Zsgreen. El hairpin corto (shRNA) dirigido a GPR15 (5′-GCCCTTCAATACTTTCAAGTT-3′, 5′-GCAACTCCAATTAAACTCATA-3′ y 5′-CCCTCAGCTATTCTTCAGCTT-3′), PARP4 (5′-GCATTCAATCTCTAGGTGTAA-3′, 5′-CCTGGGACTATTGGCTAAGAA-3′ y 5′-GCACTAATTCAAGAGAAAGAA-3′) y MGST1 (5′-GCATTGCCAATATCCTGTATT-3′ y 5′-GCCAATATCCTGTATTCTTGT-3′) se clonaron en PLKO.1 puro. El plásmido pCMV-N-mito-Flag-APEX2_ se adquirió de Beyotime (Beyotime, D3047).

Generación de lentivirus e infección celular

Las células HEK293T sembradas en placas de 6 cm se transfectaron con 1 μg de GPR15, MGST1, GNAQ-CT o shRNA dirigido a GPR15, PARP4 o MGST1, junto con 1 μg de plásmido de empaquetamiento (psPAX2, RRID: Addgene12260) y 1 μg de plásmido de envoltura (pMD2.G, RRID: Addgene12259) utilizando el reactivo de transfección PolyJet (SignaGen Laboratories, SL100688). Dieciséis horas después de la transfección, las células se incubaron con medio de cultivo fresco durante otras 24 horas. El sobrenadante que contenía el lentivirus se recogió para infectar las células indicadas en una placa de 6 pocillos utilizando una proporción de 1:1 de sobrenadante de lentivirus y medio de cultivo completo, con 4 μg/mL de polibreno. Después de 24 horas, las células HCT-8 se seleccionaron añadiendo 10 μg/mL de puromicina. Las células supervivientes se mantuvieron con 2,5 μg/mL de puromicina. Las líneas celulares estables se utilizaron durante no más de 1 mes.

Análisis de la viabilidad celular

La viabilidad celular se midió utilizando un ensayo de sulforodamina B (SRB). Las células se trataron con 5-FU, irinotecán, oxaliplatino o 5-FU junto con los compuestos indicados durante 48 horas o durante el tiempo indicado. Las células tratadas se fijaron en ácido tricloroacético al 10% durante 1 hora a 4°C, se lavaron con agua corriente 5 veces y se tiñeron con 50 μL de SRB al 0,4% (p/v) durante 10 minutos, y se lavaron con 200 μL de ácido acético al 1% 3 veces. Después de secarlas al aire, se añadieron 100 μL de tampón de Tris base 10 mmol/L para disolver el SRB teñido y se midió la absorbancia en un lector de microplacas a una longitud de onda de 515 nm (Thermo Fisher Scientific).

qRT-PCR

El ARN se extrajo según lo descrito anteriormente (^[24]). En resumen, las células se recogieron en reactivo FreeZol (Vazyme Biotech Co., R711-01) y el ARN total se extrajo según las instrucciones del fabricante. El ADNc se generó utilizando un kit HiScript III RT SuperMix (Vazyme Biotech Co., R323-01). La expresión de ARNm de GPR15, PSAT1, PSPH, PHGDH, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, SHMT1, SHMT2 y DHFR se cuantificó semicuantitativamente en un QuantStudio 7 Flex utilizando ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Vazyme Biotech Co., Q411-02). GAPDH o ACTA1 se utilizaron como gen de referencia. Los datos se calcularon utilizando 2[−(Ct gen diana−Ct gen de referencia)]. Las secuencias de los cebadores de PCR se proporcionan en la Tabla S2 del material suplementario.

RNA-seq

Las células se recogieron en reactivo FreeZol (Vazyme Biotech Co., R711-01). Las muestras se procesaron en Shanghai OE Biotech Co., Ltd. En resumen, se extrajo el ARN total y luego se evaluó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific), y la integridad del ARN se evaluó con un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). Las bibliotecas se construyeron utilizando un kit de preparación de muestras TruSeq stranded mRNA LT (Illumina) y se secuenciaron en una plataforma Illumina HiSeq X Ten, generando lecturas emparejadas de 150 pb. Los datos brutos (lecturas) en formato FASTQ se procesaron utilizando Trimmomatic, eliminando las lecturas de baja calidad para obtener lecturas limpias para análisis posteriores. Las lecturas limpias se mapearon al genoma humano (GRCh38) utilizando HISAT2. Los fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas (FPKM) de cada gen se calcularon utilizando Cufflinks, y el recuento de lecturas de cada gen se obtuvo utilizando HTSeq-count. El análisis de expresión diferencial se realizó utilizando el paquete R DESeq (2012), con P < 0,05 y un cambio de pliegue (FC) > 2 o FC < 0,5 como el umbral para una expresión diferencial significativa. Se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico de los genes expresados diferencialmente (DEG) para evaluar los patrones de expresión de los genes en diferentes grupos y muestras. El enriquecimiento de la ontología génica (GO) y el enriquecimiento de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) de los DEG se realizaron utilizando R basándose en una distribución hipergeométrica. Los datos de secuencia brutos informados en este estudio se han depositado en el Genome Sequence Archive (^[25]) en el National Genomics Data Center (^[26]), China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (GSA-Human: HRA012207) y están disponibles públicamente en https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human.

Espectrometría de masas metabólica no dirigida

Para la espectrometría de masas (MS), se recogieron 5 × 10⁶ células en una solución de metanol:agua (4:1 = v:v) y se analizaron en Shanghai OE Biotech Co., Ltd. En resumen, se añadió triclorometano a las células y las muestras se dispersaron utilizando una pipeta. Las células se lisaron utilizando un homogeneizador ultrasónico a 500 W durante 6 minutos y se extrajeron aún más mediante sonicación durante 20 minutos en un baño de hielo. Después de la centrifugación a 13.000 rpm y 4°C durante 10 minutos, el sobrenadante se colocó en un vial de vidrio y se secó en un concentrador centrífugo de evaporación. Las muestras secas se añadieron a una solución de metanol:agua (7:3 = v:v), se agitaron en un vórtice durante 30 segundos, se mantuvieron a 4°C durante 2 minutos y se centrifugaron a 13.000 rpm y 4°C durante 15 minutos. A continuación, el sobrenadante se recogió con jeringas de cristal, se filtró a través de microfiltros de 0,22 μm y se transfirió a viales de cromatografía líquida (LC) listos para el análisis LC/MS.

Las muestras se analizaron en un sistema de cromatografía de gases Agilent 7890B acoplado a un sistema MSD Agilent 5977A (Agilent Technologies Inc.). Se utilizó una columna capilar de sílice fundida DB-5ms (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm, Agilent J & W Scientific) para separar los derivados. Se utilizó helio (>99,999%) como gas portador a un caudal constante de 1 mL/minuto a través de la columna. La temperatura del inyector se mantuvo a 260°C. La temperatura inicial del horno fue de 60°C, que se aumentó a 125°C a una velocidad de 8°C/minuto, luego a 210°C a una velocidad de 5°C/minuto, 270°C a una velocidad de 10°C/minuto, 305°C a una velocidad de 20°C/minuto y, finalmente, se mantuvo a 305°C durante 5 minutos. Las temperaturas del cuádrupolo de MS y de la fuente de iones (impacto electrónico) fueron de 150°C y 230°C, respectivamente. La energía de colisión fue de 70 eV. Los datos de MS se adquirieron en modo de escaneo completo (m/z 50–500).

Análisis de trazadores de 13C

Las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se privaron de glucosa durante 24 horas. Las células privadas de glucosa se resembraron con medio libre de glucosa que contenía 8 mmol/L de glucosa marcada con [U-13C] durante 24 horas, con o sin 2 μmol/L de 5-FU. Las células tratadas se recogieron en una solución de metanol:agua (4:1 = v:v) y se analizaron en Shanghai ProfLeader Biotech Co., Ltd. En resumen, se añadieron 10 μL de 1 mol/L de bicarbonato de amonio a las muestras, que se sometieron a cuatro ciclos de sonicación de 1 minuto a intervalos de 1 minuto en un baño de hielo. Las muestras se dejaron reposar durante 30 minutos a -20°C y se centrifugaron a 15.000 rcf durante 15 minutos. El sobrenadante se evaporó hasta secarse y se reconstituyó en 50 μL de acetonitrilo acuoso al 50% (1:1, v/v) antes del análisis de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC)/MS-MS.

Se realizó un análisis UHPLC/MS-MS en un sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity II acoplado a un espectrómetro de triple cuádrupolo 6470A. Las muestras se inyectaron en una columna de amida UPLC Waters BEH (100 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a un caudal de 0,25 mL/minuto. La fase móvil consistió en agua (fase A) y acetonitrilo/agua (90:10, v/v; fase B), ambas que contenían 10 mmol/L de formiato de amonio (pH = 9). La separación cromatográfica se realizó utilizando un programa de elución en gradiente de la siguiente manera: 0 minutos, 95% B; 2 minutos, 95% B; 4 minutos, 85% B; 12 minutos, 75% B; 15 minutos, 65% B; 15,2 minutos, 50% B; 16,9 minutos, 50% B; 17 minutos, 95% B; y 20 minutos, 95% B. La temperatura de la columna se mantuvo a 40°C. Los analitos eluidos se ionizaron utilizando ionización por electrospray en modo positivo (ESI+). Las temperaturas de la fuente de secado y del gas de envoltura ESI+ fueron de 300°C, con caudales de 5 y 11 L/minuto, respectivamente. La presión del nebulizador fue de 45 psi y el voltaje capilar fue de 4000 V. Se utilizó el monitoreo de reacciones múltiples dinámicas para adquirir datos en transiciones de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) optimizadas (precursor → producto). El tiempo total de escaneo por ciclo fue de 300 milisegundos. El software Agilent MassHunter (versión B.08.00) se utilizó para operar los instrumentos y adquirir datos.

Los datos brutos se procesaron utilizando el software Agilent MassHunter Workstation (versión B.08.00) con parámetros predeterminados e inspección manual para garantizar la precisión cualitativa y cuantitativa de cada compuesto. Las áreas de los picos de los compuestos diana se integraron y se analizaron utilizando IsoCorrection.

Análisis del flujo metabólico de Seahorse

Los análisis de la tasa de acidificación extracelular (ECAR; mpH/minuto) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR; pmol/minuto) se realizaron utilizando un kit de prueba de glicólisis Agilent Seahorse XF (#103020-100, Agilent Technologies) y un kit de prueba de estrés mitocondrial Agilent Seahorse XF (#103015-100, Agilent Technologies), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, las células HCT-8 con la infección o transfección indicada se sembraron en un analizador XFe96 (Agilent Technologies). Para el análisis de ECAR, las células sembradas se lavaron 24 horas después y se incubaron con medio de ensayo que contenía medio base XF y 2 mmol/L de glutamina (volumen total, 180 μL por pocillo) durante 1 hora a 37°C sin dióxido de carbono. A continuación, las células se trataron secuencialmente con 10 mmol/L de glucosa, 2 μmol/L de oligomicina y 50 mmol/L de 2-desoxi-D-glucosa para calcular la ECAR. Para el análisis de OCR, las células adheridas se lavaron 24 horas después de la siembra y se incubaron con medio de ensayo que contenía medio base XF, 1 mmol/L de piruvato, 2 mmol/L de glutamina y 10 mmol/L de glucosa (volumen total, 180 μL por pocillo) durante 1 hora a 37°C sin dióxido de carbono. A continuación, las células se trataron secuencialmente con 2 μmol/L de oligomicina, 0,5 μmol/L de FCCP y 0,5 μmol/L de rotenona y antimicina A. Tanto la ECAR como la OCR se monitorearon y se analizaron utilizando un analizador Agilent Seahorse XFe96 (Agilent Technologies).

Análisis citométrico de flujo

Para el análisis de C16-BODIPY, las células HCT-8 que contenían un vector vacío (EV) o que sobreexpresaban GPR15 se sembraron en una placa de 12 pocillos. Después de la adhesión, las células se trataron con 2 μmol/L de C16-BODIPY (Invitrogen, D3821) durante 15 minutos, se recogieron y se resuspendieron en tampón FACS (PBS que contiene 1% de FBS) para el análisis de FACS utilizando el canal FITC de un citómetro de flujo FACScan (BD LSRFortessa).

Para el análisis del ciclo celular, las células HCT-8 que sobreexpresan EV o GPR15 se sembraron en una placa de 12 pocillos y se mantuvieron en un medio de cultivo libre de suero fetal bovino (SFB) durante 24 horas. Las células privadas de suero se trataron luego con o sin 2 μmol/L de 5-FU durante 12 o 24 horas adicionales, se recogieron y se fijaron en etanol al 70% frío a 4°C durante la noche. Las células fijadas se incubaron con 50 μg/mL de yoduro de propidio (IP) y 1 mg/mL de RNasa en un tampón FACS en la oscuridad a 37°C durante 30 minutos. Las células teñidas se lavaron, se resuspendieron en un tampón FACS y se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACScan (BD LSRFortessa).

Para el análisis de la apoptosis, las células HCT-8 que sobreexpresan EV o GPR15 se sembraron en una placa de 12 pocillos y se trataron con 2 μmol/L de 5-FU durante 48 horas, se recogieron y se sometieron a la tinción con anexina V/IP utilizando un kit de tinción con anexina V (BD Pharmingen, 556547). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACScan (BD LSRFortessa).

Medición de NAD y NADP

Las células que sobreexpresan EV o GPR15 se sembraron en una placa de 24 pocillos y se trataron con o sin 2 μmol/L de 5-FU durante 48 horas. Las células se recogieron para medir NAD, NADH, NADP y NADPH utilizando kits de medición de NAD+/NADH y NADP+/NADPH (Beyotime, S0175 o S0179) según las instrucciones del fabricante. Las señales se midieron en un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm (Thermo Fisher Scientific).

Perfil de proteínas

Para identificar posibles proteínas asociadas con GPR15, las células HCT-8 que sobreexpresan EV y GPR15-FLAG se lisaron en un tampón RIPA (Beyotime, P0013D) con inhibidores de proteasas (Roche, 04693124001). El lisado se inmunoprecipitó luego utilizando perlas FLAG-M2 (Abmart, M20018S), y la proteína se sometió a SDS-PAGE. El gel de PAGE se tiñó con azul de Coomassie brillante, y las regiones de interés se aislaron y se enviaron a PTM BIO para un análisis adicional. En detalle, los fragmentos de gel se descoloraron en 50% de acetonitrilo (v/v) que contenía 50 mmol/L de NH4HCO3, se deshidrataron en 100 μL de 100% de acetonitrilo durante 5 minutos, se rehidrataron en 10 mmol/L de ditiotreitol y se incubaron a 56°C durante 60 minutos. Los fragmentos de gel se deshidrataron nuevamente en 100% de acetonitrilo, se rehidrataron con 55 mmol/L de yodoacetamida y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 minutos. Los fragmentos de gel se lavaron luego con 50 mmol/L de NH4HCO3, se deshidrataron en 100% de acetonitrilo, se incubaron en 50 mmol/L de NH4HCO3 que contenía 10 ng/μL de tripsina sobre hielo durante 1 hora y se digirieron aún más a 37°C durante la noche. Los péptidos se extrajeron con 50% de acetonitrilo/5% de ácido fórmico, seguido de 100% de acetonitrilo.

Los péptidos trípticos se disolvieron en 0,1% de ácido fórmico (solvente A) y se cargaron directamente en una columna analítica de fase inversa hecha en casa (15 cm de longitud, 75 μm de diámetro interno). El gradiente fue el siguiente (solvente B, 0,1% de ácido fórmico en 98% de acetonitrilo): el solvente B aumentó del 6% al 23% en 16 minutos; del 23% al 35% en 8 minutos; al 80% en 3 minutos; y se mantuvo al 80% durante los últimos 3 minutos. Se utilizó una velocidad de flujo constante de 400 nL/minuto en un sistema UPLC EASY-nLC 1000. Los péptidos se sometieron a una fuente de electrospray nanoflujo (NSI) seguida de MS/MS en tándem utilizando un Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) acoplado en línea al UPLC. El voltaje de electrospray aplicado fue de 2 kV. El rango de exploración m/z fue de 350 a 1800 para el escaneo completo, y los péptidos intactos se detectaron en el Orbitrap a una resolución de 70 000. Los péptidos se seleccionaron para MS/MS utilizando una configuración de energía de colisión normalizada (NCE) de 28, y los fragmentos se detectaron en el Orbitrap a una resolución de 17 500. Los datos de MS/MS resultantes se procesaron utilizando Proteome Discoverer 1.3. La confianza del péptido se estableció en alta, con una puntuación de iones de péptidos >20.

Análisis de Western blot

Para analizar las enzimas metabólicas, las células que sobreexpresan EV o GPR15 se trataron con o sin 2 μmol/L de 5-FU durante 24 horas. Para analizar la estabilidad de MGST1, las células que sobreexpresan EV o GPR15 se trataron con 100 μg/mL de cicloheximida (CHX) sola durante 0, 3, 6 y 9 horas o con 100 μg/mL de CHX y 10 μmol/L de MG132, 20 μmol/L de cloroquina o 100 μmol/L de leupeptina durante 6 horas. Las células tratadas se lisaron en un tampón RIPA frío (Beyotime, P0013D), y la concentración de proteína se midió utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). Las muestras se sometieron luego a SDS-PAGE. Los anticuerpos primarios utilizados en los experimentos incluyeron anti-PSAT1 (Affinity, DF12132, 1:2000, RRID: AB2844937), anti-PSPH (Affinity, DF12711, 1:2000, RRID: AB2845672), anti-PHGDH (Affinity, DF12220, 1:2000, RRID: AB2845025), anti-MTHFD1 (Affinity, DF13159, 1:2000, RRID: AB2846119), anti-MTHFD1L (Affinity, DF12425, 1:2000, RRID: AB2845230), anti-MTHFD2 (Affinity, DF12213, 1:2000, RRID: AB2845018), anti-SHMT1 (Affinity, DF12474, 1:2000, RRID: AB2845279), anti-SHMT2 (Affinity, DF6347, 1:2000, RRID: AB2838311), anti-DHFR (Affinity, DF6495, 1:2000, RRID: AB2838457), anti-GAPDH (Affinity, AF7021, 1:2000, RRID: AB2839421), anti-MGST1 (Affinity, DF4161, 1:2000, RRID: AB2836526), anti-actina (Affinity, AF7018, 1:2000, RRID: AB2839420), anti-FLAG (Affinity, T0053, 1:5000, RRID: AB2843447), anti-PARP4 (Abcam, ab133745, 1:3000, RRID: AB3675484), anti-mono-ADP ribosilación (MARilación, Millipore, MABE1076, 1:2000, RRID: AB2665469), anti-NDUFA13 (Affinity, DF7330, 1:5000, RRID: AB2839268), anti-NDUFA3 (Affinity, DF4210, 1:5000, RRID: AB2836561), anti-MGST1 (Thermo Fisher Scientific, MA5-34942, 1:2000, RRID: AB2848848), anti-Golgi-97 (Cell Signaling Technology, 13192S, 1:3000, RRID: AB2798144), anti-COX4 (Cell Signaling Technology, 4850S, 1:3000, RRID: AB2085424), anti-tubulina (Affinity, AF7011, 1:5000, RRID: AB3665037), anti-GPR15 (Invitrogen, PA5-19912, 1:3000, RRID: AB11157430).

Inmunofluorescencia

Las células transfectadas o infectadas, según corresponda, se sembraron en portaobjetos de vidrio en una placa de 24 pocillos durante 24 horas. Las células adheridas se trataron con PBS, 2 μmol/L de 5-FU o 100 nmol/L de brefeldina A (BFA) o se colocaron a 4°C durante 40 minutos, según se indique. Las células se fijaron luego en 4% de paraformaldehído durante 10 minutos, se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 (Biosharp, BS100) durante 6 minutos, se bloquearon con 0,2% de BSA en PBS durante 30 minutos y se incubaron con los anticuerpos primarios y secundarios indicados durante 1 hora cada uno a temperatura ambiente. Las señales fluorescentes se registraron mediante un microscopio confocal de escaneo láser (Lecia TCS SP8). Los anticuerpos primarios incluyeron anti-FLAG (Affinity, T0053, 1:1000, RRID: AB2843447), anti-FLAG (Proteintech, 66008-3-Ig, 1:200, RRID: AB2749837), anti-Golgi-97 (Cell Signaling Technology, 13192S, 1:100, RRID: AB2798144), anti-GORASP2 (Proteintech, 10598-1-AP, 1:200, RRID: AB2113473), anti-COX4 (Cell Signaling Technology, 4850S, 1:200, RRID: AB2085424), anti-calnexina (Beyotime, AF2425, 1:200, RRID: AB3718063), anti-LAMP1 (Cell Signaling Technology, 9091T, 1:200, RRID: AB2687579), anti-PARP4 (Abcam, ab133745, 1:200, RRID: AB3675484), anti-MGST1 (Thermo Fisher Scientific, MA5-34942, 1:200, RRID: AB2848848) y anti-EEA1 (Affinity, DF8248, 1:200, RRID: AB2841542). Los anticuerpos secundarios incluyeron anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, A32723, 1:2000, RRID: AB2633275), anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific, A32740, 1:2000, RRID: AB2762824) y anticuerpo secundario de cabra anti-rata conjugado con Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific, A21247, 1:2000, RRID: AB_141778).

Ensayo de gen reportero

Las células que sobreexpresan EV y GPR15 se sembraron en una placa de 24 pocillos y se transfectaron utilizando el reactivo de transfección PolyJet (SignaGen Laboratories, SL100688) con 0,2 μg de luciferasa CRE-, SRE, NFAT o SRF, junto con 0,02 μg de plásmidos Renilla. Dieciséis horas después de la transfección, se renovó el medio de cultivo de las células y se incubaron durante otras 24 horas. Las células se lisaron luego y se sometieron a un análisis de gen reportero de luciferasa utilizando un kit de ensayo de reportero de luciferasa dual (Vazyme, DL101-01). Las señales de luciferasa y Renilla se midieron utilizando un luminómetro (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific). Los datos se presentaron como la relación entre la luminiscencia de la luciferasa y la luminiscencia de Renilla.

Inmunoprecipitación

Las células se lisaron en un tampón RIPA frío (Beyotime, P0013D) con inhibidores de proteasas (Roche, 04693124001). La concentración de proteína se midió utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). Para la inmunoprecipitación de GPR15-FLAG, se incubaron de 500 a 700 μg de proteína con perlas FLAG-M2 (Abmart, M20018S, 20 μL/muestra) durante 3 horas a 4°C en un agitador rotatorio. Las posibles proteínas de unión (500-700 μg) se incubaron con 1 μg de los anticuerpos indicados durante la noche en un agitador rotatorio a 4°C, seguido de una incubación de 3 horas con perlas de proteína A/G (Santa Cruz Biotechnology, SC-2003, 10 μL/muestra). Las muestras se lavaron 3 veces con PBS y se sometieron a un análisis de Western blot utilizando los anticuerpos indicados.

Análisis de Mito-APEX2

Las células HEK293T se sembraron en placas de 6 cm y se transfectaron con 0,5 μg de EV, ARNs de interferencia dirigidos a MGST1 o plásmidos de MGST1, junto con 0,5 μg de plásmidos GPR15-FLAG y 0,5 μg de plásmidos Mito-APEX2, utilizando el reactivo de transfección PolyJet (SignaGen Laboratories, SL100688). Doce horas después de la transfección, se renovó el medio de cultivo de las células y se incubaron durante 36 horas. Las células transfectadas se trataron luego con 0,1 mmol/L de biotina-aminofenol durante 30 minutos, se estimularon con 1 mmol/L de H2O2 durante 1 minuto y luego se lavaron dos veces con un tampón de extinción (10 mmol/L de ascorbato, 10 mmol/L de azida de sodio y 5 mmol/L de trolox en PBS). Las células se lavaron luego con PBS, se lisaron con un tampón RIPA frío que contenía un inhibidor de proteasomas y se sometieron a un análisis de inmunoprecipitación (IP) utilizando perlas de estreptavidina (EMD Millipore Co., 16-126, 15 μL/muestra). Específicamente, se incubaron de 500 μg de proteína con perlas de estreptavidina a 4°C durante 2 horas. Las perlas se lavaron 3 veces con PBS y se sometieron a un análisis de Western blot utilizando los anticuerpos indicados.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± DE o media ± EE, según se indique en cada experimento. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas para analizar la significación estadística entre dos grupos, y se utilizó ANOVA de una o dos vías para analizar múltiples comparaciones. Se utilizaron estimadores de Kaplan-Meier para trazar las curvas de supervivencia, y se realizó una prueba de log-rank para comparar las curvas. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Ratones

Los ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad se alojaron en condiciones estándar con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y acceso libre a agua y comida. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de [Nombre de la Universidad].

Células

Las células [Tipo de célula] se cultivaron en un medio de cultivo [Tipo de medio] suplementado con 10% de SFB, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2.

Transfección

Las células se transfectaron con [Cantidad] de [Plásmido] utilizando [Reactivo de transfección] de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, las células se recogieron para un análisis posterior.

Inmunoblot

Las células se lisaron en un tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó con leche seca (5%) en TBST (tampón tris-salino con 0,1% de Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se incubó con anticuerpos primarios diluidos en TBST durante la noche a 4°C. Después de tres lavados con TBST, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales se visualizaron mediante quimioluminiscencia y se cuantificaron utilizando un sistema de imágenes.

Inmunocitoquímica

Las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1

Las células NCM460 (RRID: CVCL0460), HCT-8 (RRID: CVCL2478), HCT-15 (RRID: CVCL0292), HT-29 (RRID: CVCL0320), Capan-2 (RRID: CVCL0026), AsPC-1 (RRID: CVCL0152), BT-474 (RRID: CVCL0179) y LS1034 (RRID: CVCL1382) se cultivaron en medio RPMI 1640 (BasalMedia, L210KJ). Las células SW620 (RRID: CVCL0547), SW480 (RRID: CVCL0546), MDA-MB-231 (RRID: CVCL0062), HEK293T (RRID: CVCL0063) y SW48 (RRID: CVCL1724) se cultivaron en DMEM (BasalMedia, L110KJ). Las células SW48 (cat. #IM-H639) y LS1034 (cat. #IM-H506) se adquirieron de Xiamen Immocell Biotechnology Co., Ltd. El resto de las células se obtuvieron originalmente del Cell Bank/Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. Todas las líneas celulares fueron autenticadas. Las células se suplementaron con un 10% de suero fetal bovino (FBS, ExCell Bio, FSD500) y se cultivaron en una incubadora a 37 °C con un 5% de dióxido de carbono. La duración máxima durante la cual se utilizaron las células en experimentos específicos después de la descongelación fue de aproximadamente 1 mes. No se examinaron las células para detectar la presencia de Mycoplasma_.

Análisis bioinformático

Los conjuntos de datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) se obtuvieron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) [GSE161277 (^[21]) y GSE178318 (^[22])]. Las muestras de célula única se prepararon y se midieron según se describe en el artículo original para los conjuntos de datos. GSE161277 contiene conjuntos de datos correspondientes a tejidos normales, adenoma y cáncer. GSE178318 contiene conjuntos de datos correspondientes a cáncer colorrectal con metástasis hepática tratado con o sin quimioterapia. Las muestras se analizaron y se reclustrizaron utilizando Seurat (v4.3.0) y Harmony (v1.2.0) utilizando procedimientos estándar. Los grupos de células se anotaron manualmente utilizando el conocimiento existente basado en información publicada (^[23]) y The Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) después del agrupamiento mediante Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction (UMAP). Los grupos de células y los genes marcadores asociados incluyeron células madre (LGR5, OLFM4 y ASCL2), células caliciformes (ATOH1, miembros de la familia de mucinas, TFF3, CLCA1 y SPDEF), TAC (PCNA y MKI67), células de Paneth (CA4, CA7, BEST4, LYZ, FZD5, EPHB2, DEFA5 y DEFA22), células en copa (POU2F3, SOX9, DUOX2, KRT18 y ACAT1), fibroblastos (COL3A, FBN1 y LUM), células endoteliales (CD34, PECAM1 y VWF), TNK (CD4, CD3, CD8, CD96 y CD247), células B (MS4A1, MALT1, IGHM, IGHD y CD19), células plasmáticas (IGHA y IGHG) y monocitos/macrófagos (MRC1, CD163, CD68, CD80, CD86, CD206, MSR1 y CSF1R_). Los enterocitos, los enterocitos distales, las células eritroides y los granulocitos se anotaron basándose en referencias de The Human Protein Atlas.

Realizamos un análisis de supervivencia utilizando datos de pacientes del conjunto de datos TCGA Colon and Rectal Cancer (TCGA-COADREAD) (https://xenabrowser.net/datapages/), que incluye perfiles clínicos, demográficos y de expresión génica completos de individuos diagnosticados con cáncer de colon y recto. Solo se incluyeron en nuestro análisis los datos de pacientes con información completa de seguimiento. Los datos de expresión génica se preprocesaron para garantizar la coherencia y la comparabilidad entre las muestras. Para el análisis de supervivencia relacionado con un solo gen, utilizamos la función surv_cutpoint en el paquete survminer en R para determinar el valor de corte óptimo de los valores de expresión génica que maximizara la diferencia de supervivencia entre los grupos de alta y baja expresión. En un análisis de supervivencia que utiliza una combinación de dos genes, comparamos a los pacientes con alta expresión de ambos genes (alto-alto) con aquellos con baja expresión de ambos genes (bajo-bajo). Esta categorización se basó en la evaluación de la expresión de cada gen del paciente en relación con los valores medianos de los dos genes de interés, lo que produjo cuatro grupos distintos: alto-alto, alto-bajo, bajo-alto y bajo-bajo. Se utilizaron estimadores de Kaplan-Meier para trazar las curvas de supervivencia.

Para evaluar la expresión de los genes diana en diferentes grupos, realizamos un análisis de diagramas de caja. Utilizamos el paquete ggplot2 en R para crear los diagramas de caja, que mostraron gráficamente la distribución de los valores de expresión génica entre cada grupo y destacaron la mediana, los cuartiles y los posibles valores atípicos. Para evaluar estadísticamente las diferencias en la expresión génica entre los grupos, realizamos una prueba t de dos muestras, que es adecuada para comparar dos muestras independientes bajo el supuesto de una distribución normal. Los valores de P resultantes se utilizaron para determinar la significación de las diferencias de expresión, y se consideró estadísticamente significativo un umbral de P < 0,05.

Organoides de cáncer colorrectal

Los organoides de cáncer colorrectal se generaron a partir de tejido tumoral derivado de material endoscópico o de resección quirúrgica de pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal (Tabla S1 complementaria). El tejido tumoral se procesó utilizando un kit de cultivo de organoides de cáncer colorrectal humano (Absin, abs9445). Brevemente, las muestras recogidas se colocaron en un frasco de muestreo que contenía una solución E preenfriada (4 °C) para su transporte al laboratorio. Las muestras se lavaron en una placa de cultivo con una solución B preenfriada (4 °C) y se picaron con unas tijeras esterilizadas hasta que la solución pudiera ser pipeteada. El tejido picado se digirió en la solución C en una incubadora durante 20 minutos a 37 °C. Se añadió la solución B en un volumen tres veces mayor que el de la solución C al tejido para detener la digestión. El tejido se pasó a través de un filtro celular de 100 μm y se centrifugó a 300 × g durante 5 minutos. El precipitado se resuspendió en la solución B y se centrifugó de nuevo. Se midió el volumen del precipitado de tejido y se añadió un adhesivo de matriz en un volumen 25 veces mayor que el del precipitado de tejido (Absin, abs9495). La mezcla se colocó en una placa de 24 pocillos y se cultivó en la solución A para la formación de organoides y el análisis posterior. El material endoscópico o la resección quirúrgica en pacientes se obtuvieron de acuerdo con la Declaración de Helsinki, con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Los estudios fueron aprobados por el Comité de Ética del Shanghai General Hospital.

Modelo de xenoinjerto en ratones

Brevemente, se inyectaron por vía subcutánea 5 × 106 células HCT-8 o HCT116 en ratones nu/nu, según se indica. Siete días después de la inyección, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos, según se indica en los experimentos específicos. Para investigar las células de cáncer colorrectal con sobreexpresión o deficiencia de GPR15, se inyectaron por vía intraperitoneal en los ratones 2 mg/kg de 5-FU (para las células HCT-8) o 20 mg/kg de 5-FU (para las células HCT116). Para examinar la eficacia combinada de rucaparib y 5-FU, se inyectaron por vía intraperitoneal en los ratones diariamente 2 mg/kg de 5-FU, 5 mg/kg de rucaparib o 2 mg/kg de 5-FU junto con 5 mg/kg de rucaparib, según se indica. Se registraron el peso corporal y el tamaño del tumor de los ratones tratados. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones y se aislaron, se visualizaron y se pesaron los tumores.

Modelo ortotópico de ratón de cáncer colorrectal

Brevemente, se inyectaron quirúrgicamente 3 × 103 células HCT116 que expresan luciferasa en la pared del ciego de ratones nu/nu. El crecimiento tumoral se controló de forma no invasiva mediante imagenología de bioluminiscencia. Tres días después de la implantación, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento y se les administró 20 mg/kg de 5-FU o un control vehículo diariamente por vía intraperitoneal. La progresión tumoral y la respuesta al tratamiento se cuantificaron cada 3 días mediante señales de bioluminiscencia in vivo utilizando un sistema de imagenología IVIS.

Modelo de xenoinjerto (xenoinjerto derivado del paciente) en ratones

La eficacia combinada entre 5-FU y rucaparib se examinó en un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) en ratones por Shanghai Novopathway Biotechnology Co., Ltd. Brevemente, el tejido tumoral de cáncer colorrectal humano (Tabla S1 complementaria) se procesó en fragmentos de 2 a 3 mm3 y se implantó por vía subcutánea en el flanco de ratones BALB/c desnudos. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 80 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos. A continuación, se trató a los ratones con inyecciones intraperitoneales diarias de 2 mg/kg de 5-FU, 5 mg/kg de rucaparib o 2 mg/kg de 5-FU y 5 mg/kg de rucaparib, y se registraron diariamente el peso corporal y el tamaño del tumor. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones y se extirparon, se visualizaron y se pesaron los tumores.

Plásmidos

Se adquirió un clon de ADNc que codifica GPR15, PARP4 y MGST1 de Sino Biological (RRID: SCR003697). pLVX-TetOne-Puro-LbNOX-FLAG (cat. #218631, RRID: Addgene218631) y pLVX-TetOne-Puro-mitoLbNOX-FLAG (cat. #218667, RRID: Addgene218667) se obtuvieron de Addgene. GPR15 y MGST1 se subclonalizaron en pLVX-IRES-Puro con fusión C-terminal de FLAG y HA (hemaglutinina humana). GPR15 también se subclonalizó en pLVX-IRES-Zsgreen. La región C-terminal de GNAQ (GNAQ-CT, aminoácidos 306-359) se construyó en pLVX-IRES-Puro o pLVX-IRES-Zsgreen. El hairpin corto (shRNA) dirigido a GPR15 (5′-GCCCTTCAATACTTTCAAGTT-3′, 5′-GCAACTCCAATTAAACTCATA-3′ y 5′-CCCTCAGCTATTCTTCAGCTT-3′), PARP4 (5′-GCATTCAATCTCTAGGTGTAA-3′, 5′-CCTGGGACTATTGGCTAAGAA-3′ y 5′-GCACTAATTCAAGAGAAAGAA-3′) y MGST1_ (5′-GCATTGCCAATATCCTGTATT-3′ y 5′-GCCAATATCCTGTATTCTTGT-3′) se clonaron en PLKO.1 puro. El plásmido pCMV-N-mito-Flag-APEX2 se adquirió de Beyotime (Beyotime, D3047).

Generación de lentivirus e infección celular

Las células HEK293T colocadas en placas de 6 cm se transfectaron con 1 μg de GPR15, MGST1, GNAQ-CT o shRNA dirigido a GPR15, PARP4 o MGST1, junto con 1 μg de plásmido de empaquetamiento (psPAX2, RRID: Addgene12260) y 1 μg de plásmido de envoltura (pMD2.G, RRID: Addgene12259) utilizando el reactivo de transfección PolyJet (SignaGen Laboratories, SL100688). Dieciséis horas después de la transfección, las células se incubaron con medio de cultivo fresco durante otras 24 horas. El sobrenadante que contenía el lentivirus se recogió para infectar las células indicadas en una placa de 6 pocillos utilizando una relación de 1:1 de sobrenadante de lentivirus y medio de cultivo completo, con 4 μg/mL de polibreno. Después de 24 horas, las células HCT-8 se seleccionaron añadiendo 10 μg/mL de puromicina. Las células supervivientes se mantuvieron con 2,5 μg/mL de puromicina. Las líneas celulares estables se utilizaron durante no más de 1 mes.

Análisis de viabilidad celular

La viabilidad celular se midió utilizando un ensayo de sulforodamina B (SRB). Las células se trataron con 5-FU, irinotecán, oxaliplatino o 5-FU junto con los compuestos indicados durante 48 horas o el tiempo indicado. Las células tratadas se fijaron en ácido tricloroacético al 10% durante 1 hora a 4 °C, se lavaron con agua corriente 5 veces y se tiñeron con 50 μL de SRB al 0,4% (p/p) durante 10 minutos, y se lavaron con 200 μL de ácido acético al 1% 3 veces. Después de secarlas al aire, se añadieron 100 μL de tampón de Tris base al 10 mmol/L para disolver el SRB teñido y se midió la absorbancia en un lector de microplacas a una longitud de onda de 515 nm (Thermo Fisher Scientific).

qRT-PCR

El ARN se extrajo según se informó anteriormente (^[24]). Brevemente, las células se recogieron en el reactivo FreeZol (Vazyme Biotech Co., R711-01) y el ARN total se extrajo según las instrucciones del fabricante. El ADNc se generó utilizando un kit HiScript III RT SuperMix (Vazyme Biotech Co., R323-01). La expresión de ARNm de GPR15, PSAT1, PSPH, PHGDH, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, SHMT1, SHMT2 y DHFR se cuantificó semicuantitativamente en un QuantStudio 7 Flex utilizando el master mix de qPCR ChamQ SYBR Color (Vazyme Biotech Co., Q411-02). GAPDH o ACTA1 se utilizaron como gen de referencia. Los datos se calcularon utilizando 2[−(Ct gen diana−Ct gen de referencia)]. Las secuencias de los cebadores de PCR se proporcionan en la Tabla S2 complementaria.

RNA-seq

Se recolectaron las células en el reactivo FreeZol (Vazyme Biotech Co., R711-01). Las muestras se procesaron en Shanghai OE Biotech Co., Ltd. Brevemente, se extrajo el ARN total y luego se evaluó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific), y la integridad del ARN se evaluó con un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). Las bibliotecas se construyeron utilizando un kit de preparación de muestras TruSeq stranded mRNA LT (Illumina) y se secuenciaron en una plataforma Illumina HiSeq X Ten, generando lecturas pareadas de 150 pares de bases. Los datos brutos (lecturas brutas) en formato FASTQ se procesaron utilizando Trimmomatic, eliminando las lecturas de baja calidad para obtener lecturas limpias para análisis posteriores. Las lecturas limpias se mapearon al genoma humano (GRCh38) utilizando HISAT2. Se calculó el número de fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas (FPKM) de cada gen utilizando Cufflinks, y se obtuvo el recuento de lecturas de cada gen utilizando HTSeq-count. Se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando el paquete R DESeq (2012), con P < 0,05 y un cambio de pliegue (FC) > 2 o FC < 0,5 como el umbral para una expresión diferencial significativa. Se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico de los genes expresados diferencialmente (DEG) para evaluar los patrones de expresión de los genes en diferentes grupos y muestras. Se realizaron análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y de la vía de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) de los DEG utilizando R basado en una distribución hipergeométrica. Los datos de secuencia brutos informados en este estudio se han depositado en el Genome Sequence Archive (^[25]) en el National Genomics Data Center (^[26]), China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (GSA-Human: HRA012207), y están disponibles públicamente en https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human.

Espectrometría de masas metabólica no dirigida

Para la espectrometría de masas (MS), se recolectaron 5 × 106 células en una solución de metanol:agua (4:1 = v:v) y se analizaron en Shanghai OE Biotech Co., Ltd. Brevemente, se añadió triclorometano a las células y las muestras se dispersaron utilizando una pipeta. Las células se lisaron utilizando un homogeneizador ultrasónico a 500 W durante 6 minutos y se extrajeron aún más mediante sonicación durante 20 minutos en un baño de hielo y agua. Después de la centrifugación a 13.000 rpm y 4 °C durante 10 minutos, el sobrenadante se colocó en un vial de vidrio y se secó en un liofilizador centrífugo. Las muestras secas se añadieron luego a una solución de metanol:agua (7:3 = v:v), se agitaron en un vórtice durante 30 segundos, se mantuvieron a 4 °C durante 2 minutos y se centrifugaron a 13.000 rpm y 4 °C durante 15 minutos. El sobrenadante se recogió luego con jeringas de cristal, se filtró a través de microfiltros de 0,22 μm y se transfirió a viales de cromatografía líquida (LC) listos para el análisis LC/MS.

Las muestras se analizaron en un sistema de cromatografía de gases Agilent 7890B acoplado a un sistema Agilent 5977A MSD (Agilent Technologies Inc.). Se utilizó una columna capilar de sílice fundida DB-5ms (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm, Agilent J & W Scientific) para separar los derivados. Se utilizó helio (>99,999%) como gas portador a un caudal constante de 1 mL/minuto a través de la columna. La temperatura del inyector se mantuvo a 260 °C. La temperatura inicial del horno fue de 60 °C, que se aumentó a 125 °C a una velocidad de 8 °C/minuto, luego a 210 °C a una velocidad de 5 °C/minuto, 270 °C a una velocidad de 10 °C/minuto, 305 °C a una velocidad de 20 °C/minuto y, finalmente, se mantuvo a 305 °C durante 5 minutos. Las temperaturas del cuadrupolo del MS y de la fuente de iones (impacto de electrones) fueron de 150 °C y 230 °C, respectivamente. La energía de colisión fue de 70 eV. Los datos de MS se adquirieron en modo de barrido completo (m/z 50–500).

Análisis de trazadores de 13C

Las células se sembraron en una placa de seis pocillos y se privaron de glucosa en un medio libre de glucosa durante 24 horas. Las células privadas de glucosa se resembraron con un medio libre de glucosa que contenía 8 mmol/L de glucosa marcada con [U-13C] durante 24 horas, con o sin 2 μmol/L de 5-FU. Las células tratadas se recolectaron luego en una solución de metanol:agua (4:1 = v:v) y se analizaron en Shanghai ProfLeader Biotech Co., Ltd. Brevemente, se añadieron 10 μL de 1 mol/L de bicarbonato de amonio a las muestras, que se sometieron a cuatro ciclos de sonicación de 1 minuto a intervalos de 1 minuto en un baño de hielo y agua. Las muestras se dejaron luego durante 30 minutos a -20 °C y se centrifugaron a 15.000 rcf durante 15 minutos. El sobrenadante se evaporó hasta que se secó y se reconstituyó en 50 μL de acetonitrilo acuoso al 50% (1:1, v/v) antes del análisis UHPLC/MS-MS.

Se realizó un análisis UHPLC/MS-MS en un sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity II acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6470A. Las muestras se inyectaron en una columna Waters UPLC BEH amida (100 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a un caudal de 0,25 mL/minuto. La fase móvil consistió en agua (fase A) y acetonitrilo/agua (90:10, v/v; fase B), ambos de los cuales contenían 10 mmol/L de formiato de amonio (pH = 9). La separación cromatográfica se llevó a cabo utilizando un programa de elución en gradiente de la siguiente manera: 0 minutos, 95% B; 2 minutos, 95% B; 4 minutos, 85% B; 12 minutos, 75% B; 15 minutos, 65% B; 15,2 minutos, 50% B; 16,9 minutos, 50% B; 17 minutos, 95% B; y 20 minutos, 95% B. La temperatura de la columna se mantuvo a 40 °C. Los analitos eluidos se ionizaron utilizando ionización por electrospray en modo positivo (ESI+). Las temperaturas de la fuente de gas de secado ESI+ y del gas de envoltura fueron de 300 °C, con caudales de 5 y 11 L/minuto, respectivamente. La presión del nebulizador fue de 45 psi y el voltaje capilar fue de 4.000 V. Se utilizó un monitoreo de reacción múltiple dinámico para adquirir datos en transiciones de monitoreo de reacción múltiple (MRM) optimizadas (precursor -> producto). El tiempo total de escaneo por ciclo fue de 300 milisegundos. El software Agilent MassHunter (versión B.08.00) se utilizó para operar los instrumentos y adquirir datos.

Los datos brutos se procesaron luego utilizando el software Agilent MassHunter Workstation (versión B.08.00) con parámetros predeterminados e inspección manual para garantizar la precisión cualitativa y cuantitativa de cada compuesto. Las áreas de los picos de los compuestos objetivo se integraron y se analizaron utilizando IsoCorrection.

Análisis del flujo metabólico de Seahorse

Los análisis de la tasa de acidificación extracelular (ECAR; mpH/minuto) y de la tasa de consumo de oxígeno (OCR; pmol/minuto) se realizaron utilizando un kit de prueba de glicólisis Agilent Seahorse XF (#103020-100, Agilent Technologies) y un kit de prueba de estrés mitocondrial Agilent Seahorse XF (#103015-100, Agilent Technologies), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células HCT-8 con la infección o transfección indicada se sembraron en un analizador XFe96 (Agilent Technologies). Para el análisis de ECAR, las células sembradas se lavaron 24 horas después y se incubaron con un medio de ensayo que contenía un medio base XF y 2 mmol/L de glutamina (volumen total, 180 μL por pocillo) durante 1 hora a 37 °C sin dióxido de carbono. Las células se trataron secuencialmente con 10 mmol/L de glucosa, 2 μmol/L de oligomicina y 50 mmol/L de 2-desoxi-D-glucosa para calcular la ECAR. Para el análisis de OCR, las células adheridas se lavaron 24 horas después de la siembra y se incubaron con un medio de ensayo que contenía un medio base XF, 1 mmol/L de piruvato, 2 mmol/L de glutamina y 10 mmol/L de glucosa (volumen total, 180 μL por pocillo) durante 1 hora a 37 °C sin dióxido de carbono. Las células se trataron secuencialmente con 2 μmol/L de oligomicina, 0,5 μmol/L de FCCP y 0,5 μmol/L de rotenona y antimicina A. Tanto la ECAR como la OCR se monitorearon y se analizaron utilizando un analizador Agilent Seahorse XFe96 (Agilent Technologies).

Análisis citométrico de flujo

Para el análisis de C16-BODIPY, las células HCT-8 que contenían un vector vacío (EV) o que sobreexpresaban GPR15 se sembraron en una placa de 12 pocillos. Después de la adhesión, las células se trataron con 2 μmol/L de C16-BODIPY (Invitrogen, D3821) durante 15 minutos, se recolectaron y se resuspendieron en un tampón FACS (PBS que contiene 1% de FBS) para el análisis FACS utilizando el canal FITC de un citómetro de flujo FACScan (BD LSRFortessa).

Para el análisis del ciclo celular, las células EV o que sobreexpresaban GPR15 HCT-8 se sembraron en una placa de 12 pocillos y se privaron de nutrientes en un medio de cultivo sin FBS durante 24 horas. Las células privadas de nutrientes se trataron luego con o sin 2 μmol/L de 5-FU durante 12 o 24 horas adicionales, se recolectaron y se fijaron en etanol al 70% frío a 4 °C durante la noche. Las células fijadas se incubaron con 50 μg/mL de yoduro de propidio (PI) y 1 mg/mL de RNasa en un tampón FACS en la oscuridad a 37 °C durante 30 minutos. Las células teñidas se lavaron luego, se resuspendieron en un tampón FACS y se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACScan (BD LSRFortessa).

Para el análisis de apoptosis, las células EV o que sobreexpresaban GPR15 HCT-8 se sembraron en una placa de 12 pocillos y se trataron con 2 μmol/L de 5-FU durante 48 horas, se recolectaron y se sometieron a tinción con anexina V/PI utilizando un kit de tinción con anexina V (BD Pharmingen, 556547). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACScan (BD LSRFortessa).

Mediciones de NAD y NADP

Las células EV o que sobreexpresaban GPR15 se sembraron en una placa de 24 pocillos y se trataron con o sin 2 μmol/L de 5-FU durante 48 horas. Las células se recolectaron luego para medir NAD, NADH, NADP y NADPH utilizando kits de medición de NAD+/NADH y NADP+/NADPH (Beyotime, S0175 o S0179) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las señales se midieron en un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm (Thermo Fisher Scientific).

Perfil de proteínas

Para identificar posibles proteínas asociadas con GPR15, las células HCT-8 que contenían EV y las células HCT-8 que sobreexpresaban GPR15-FLAG se lisaron en un tampón RIPA (Beyotime, P0013D) con inhibidores de proteasas (Roche, 04693124001). El lisado se inmunoprecipitó luego utilizando cuentas FLAG-M2 (Abmart, M20018S) y la proteína se sometió a SDS-PAGE. El gel PAGE se tiñó con azul brillante de Coomassie y las regiones de interés se aislaron y se enviaron a PTM BIO para un análisis posterior. En detalle, los trozos de gel se destiñeron en acetonitrilo al 50% (v/v) que contenía 50 mmol/L de NH4HCO3, se deshidrataron en 100 μL de acetonitrilo al 100% durante 5 minutos, se rehidrataron en 10 mmol/L de ditiotreitol y se incubaron a 56 °C durante 60 minutos. Los trozos de gel se deshidrataron nuevamente en acetonitrilo al 100%, se rehidrataron con 55 mmol/L de yodoacetamida y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 minutos. Los trozos de gel se lavaron luego con 50 mmol/L de NH4HCO3, se deshidrataron en acetonitrilo al 100%, se incubaron en 50 mmol/L de NH4HCO3 que contenía 10 ng/μL de tripsina sobre hielo durante 1 hora y luego se digirieron a 37 °C durante la noche. Los péptidos se extrajeron con acetonitrilo/ácido fórmico al 50% seguido de acetonitrilo al 100%.

Los péptidos tripsínicos se disolvieron en ácido fórmico al 0,1% (solvente A) y se cargaron directamente en una columna analítica de fase inversa hecha en casa (15 cm de longitud, 75 μm de diámetro). El gradiente fue el siguiente (solvente B, ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo al 98%): el solvente B aumentó del 6% al 23% en 16 minutos; del 23% al 35% en 8 minutos; al 80% en 3 minutos; y se mantuvo al 80% durante los últimos 3 minutos. Se utilizó un caudal constante de 400 nL/minuto en un sistema UPLC EASY-nLC 1000. Los péptidos se sometieron a una fuente de ionización por electrospray nanoflujo (NSI) seguida de MS-MS en tándem utilizando un Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) acoplado en línea al UPLC. El voltaje de electrospray aplicado fue de 2 kV. El rango de escaneo m/z fue de 350 a 1.800 para el escaneo completo, y los péptidos intactos se detectaron en la trampa de iones Orbitrap a una resolución de 70.000. Los péptidos se seleccionaron para MS-MS utilizando una configuración de energía de colisión normalizada (NCE) de 28, y los fragmentos se detectaron en la trampa de iones Orbitrap a una resolución de 17.500. Los datos de MS-MS resultantes se procesaron utilizando Proteome Discoverer 1.3. La confianza del péptido se estableció en alta, con una puntuación de iones de péptidos >20.

Análisis de Western blot

Para analizar las enzimas metabólicas, las células EV o GPR15-sobreexpresoras se trataron o no con 2 μmol/L de 5-FU durante 24 horas. Para analizar la estabilidad de MGST1, las células EV o GPR15-sobreexpresoras se trataron con 100 μg/mL de cicloheximida (CHX) sola durante 0, 3, 6 y 9 horas o con 100 μg/mL de CHX y 10 μmol/L de MG132, 20 μmol/L de cloroquina o 100 μmol/L de leupeptina durante 6 horas. Las células tratadas se lisaron en tampón RIPA frío (Beyotime, P0013D) y se midió la concentración de proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). Las muestras se sometieron entonces a SDS-PAGE. Los anticuerpos primarios utilizados en los experimentos incluyeron anti-PSAT1 (Affinity, DF12132, 1:2.000, RRID: AB2844937), anti-PSPH (Affinity, DF12711, 1:2.000, RRID: AB2845672), anti-PHGDH (Affinity, DF12220, 1:2.000, RRID: AB2845025), anti-MTHFD1 (Affinity, DF13159, 1:2.000, RRID: AB2846119), anti-MTHFD1L (Affinity, DF12425, 1:2.000, RRID: AB2845230), anti-MTHFD2 (Affinity, DF12213, 1:2.000, RRID: AB2845018), anti-SHMT1 (Affinity, DF12474, 1:2.000, RRID: AB2845279), anti-SHMT2 (Affinity, DF6347, 1:2.000, RRID: AB2838311), anti-DHFR (Affinity, DF6495, 1:2.000, RRID: AB2838457), anti-GAPDH (Affinity, AF7021, 1:2.000, RRID: AB2839421), anti-MGST1 (Affinity, DF4161, 1:2.000, RRID: AB2836526), anti-actina (Affinity, AF7018, 1:2.000, RRID: AB2839420), anti-FLAG (Affinity, T0053, 1:5.000, RRID: AB2843447), anti-PARP4 (Abcam, ab133745, 1:3.000, RRID: AB3675484), anti-mono-ADP ribosilación (MARilación, Millipore, MABE1076, 1:2.000, RRID: AB2665469), anti-NDUFA13 (Affinity, DF7330, 1:5.000, RRID: AB2839268), anti-NDUFA3 (Affinity, DF4210, 1:5.000, RRID: AB2836561), anti-MGST1 (Thermo Fisher Scientific, MA5-34942, 1:2.000, RRID: AB2848848), anti-Golgi-97 (Cell Signaling Technology, 13192S, 1:3.000, RRID: AB2798144), anti-COX4 (Cell Signaling Technology, 4850S, 1:3.000, RRID: AB2085424), anti-tubulina (Affinity, AF7011, 1:5.000, RRID: AB3665037), anti-GPR15 (Invitrogen, PA5-19912, 1:3.000, RRID: AB11157430).

Inmunofluorescencia

Las células transfectadas o infectadas, según se indique, se sembraron en portaobjetos de vidrio en una placa de 24 pocillos durante 24 horas. Las células adheridas se trataron con PBS, 2 μmol/L de 5-FU o 100 nmol/L de brefeldina A (BFA) o se colocaron a 4 °C durante 40 minutos, según se indique. Las células se fijaron en un 4% de paraformaldehído durante 10 minutos, se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 (Biosharp, BS100) durante 6 minutos, se bloquearon con 0,2% de ASB en PBS durante 30 minutos y se incubaron con los anticuerpos primarios y secundarios indicados durante 1 hora cada uno a temperatura ambiente. Las señales fluorescentes se registraron mediante un microscopio confocal de barrido láser (Lecia TCS SP8). Los anticuerpos primarios incluyeron anti-FLAG (Affinity, T0053, 1:1.000, RRID: AB2843447), anti-FLAG (Proteintech, 66008-3-Ig, 1:200, RRID: AB2749837), anti-Golgi-97 (Cell Signaling Technology, 13192S, 1:100, RRID: AB2798144), anti-GORASP2 (Proteintech, 10598-1-AP, 1:200, RRID: AB2113473), anti-COX4 (Cell Signaling Technology, 4850S, 1:200, RRID: AB2085424), anti-calnexina (Beyotime, AF2425, 1:200, RRID: AB3718063), anti-LAMP1 (Cell Signaling Technology, 9091T, 1:200, RRID: AB2687579), anti-PARP4 (Abcam, ab133745, 1:200, RRID: AB3675484), anti-MGST1 (Thermo Fisher Scientific, MA5-34942, 1:200, RRID: AB2848848) y anti-EEA1 (Affinity, DF8248, 1:200, RRID: AB2841542). Los anticuerpos secundarios incluyeron anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, A32723, 1:2.000, RRID: AB2633275), anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific, A32740, 1:2.000, RRID: AB2762824) y anticuerpo secundario anti-rata conjugado con Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific, A21247, 1:2.000, RRID: AB_141778).

Ensayo de gen reportero

Las células EV y GPR15-sobreexpresoras se sembraron en una placa de 24 pocillos y se transfectaron utilizando el reactivo de transfección PolyJet (SignaGen Laboratories, SL100688) con 0,2 μg de luciferasa CRE-, SRE, NFAT o SRF, junto con 0,02 μg de plásmidos Renilla. Dieciséis horas después de la transfección, se renovó el medio de cultivo de las células y se incubaron durante otras 24 horas. Las células se lisaron y se sometieron a un análisis de gen reportero de luciferasa utilizando un kit de ensayo de reportero de luciferasa dual (Vazyme, DL101-01). Las señales de luciferasa y Renilla se midieron utilizando un luminómetro (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific). Los datos se presentaron como la relación entre la luminiscencia de la luciferasa y la luminiscencia de Renilla.

Inmunoprecipitación

Las células se lisaron en tampón RIPA frío (Beyotime, P0013D) con inhibidores de proteasas (Roche, 04693124001). Se midió la concentración de proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). Para la inmunoprecipitación de GPR15-FLAG, se incubaron de 500 a 700 μg de proteína con perlas FLAG-M2 (Abmart, M20018S, 20 μL/muestra) durante 3 horas a 4 °C en un agitador rotatorio. Las posibles proteínas de unión (500-700 μg) se incubaron con 1 μg de los anticuerpos indicados durante la noche en un agitador rotatorio a 4 °C, seguido de una incubación de 3 horas con perlas de proteína A/G (Santa Cruz Biotechnology, SC-2003, 10 μL/muestra). Las muestras se lavaron 3 veces con PBS y se sometieron a un análisis de Western blot utilizando los anticuerpos indicados.

Análisis de Mito-APEX2

Las células HEK293T se sembraron en placas de 6 cm y se transfectaron con 0,5 μg de EV, ARNs de interferencia dirigidos a MGST1 o plásmidos MGST1, junto con 0,5 μg de plásmidos GPR15-FLAG y 0,5 μg de plásmidos Mito-APEX2, utilizando el reactivo de transfección PolyJet (SignaGen Laboratories, SL100688). Doce horas después de la transfección, se renovó el medio de cultivo de las células y se incubaron durante 36 horas. Las células transfectadas se trataron con 0,1 mmol/L de biotina-aminofenol durante 30 minutos, se estimularon con 1 mmol/L de H2O2 durante 1 minuto y luego se lavaron dos veces con tampón de extinción (10 mmol/L de ascorbato, 10 mmol/L de azida de sodio y 5 mmol/L de trolox en PBS). Las células se lavaron con PBS, se lisaron con tampón RIPA frío que contenía un inhibidor de proteasomas y se sometieron a un análisis de inmunoprecipitación (IP) utilizando perlas de estreptavidina (EMD Millipore Co., 16-126, 15 μL/muestra). Específicamente, se incubaron de 500 μg de proteína con perlas de estreptavidina a 4 °C durante 2 horas. Las perlas se lavaron 3 veces con PBS y se sometieron a un análisis de Western blot utilizando los anticuerpos indicados.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± DE o media ± EE, según se indique en cada experimento. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas para analizar la significación estadística entre dos grupos y se utilizó ANOVA de una o dos vías para analizar múltiples comparaciones. Se utilizaron estimadores de Kaplan-Meier para trazar curvas de supervivencia, y las diferencias en la supervivencia entre los grupos se evaluaron utilizando una prueba de rango logarítmico. La significación pronóstica de los diferentes grupos de expresión génica se evaluó utilizando modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox univariados y multivariados, y se consideró estadísticamente significativo un valor de P inferior a 0,05: *, P < 0,05; , P < 0,01; *, P < 0,001. Como mínimo, se utilizaron réplicas biológicas o triplicados técnicos en todos los experimentos.

Resultados

GPR15 se localiza principalmente en el aparato de Golgi y aumenta la quimiosensibilización a 5-FU en el cáncer colorrectal

Un análisis de inmunofluorescencia (IF) de las células GPR15-sobreexpresoras HCT-8 reveló que GPR15 se localizaba predominantemente dentro del aparato de Golgi, con una distribución mínima en las mitocondrias y el RE y sin asociación detectable con los lisosomas (Fig. 1A; Fig. S1A-S1D suplementaria). Se observó un patrón de distribución similar para GPR15 endógeno en las células SW48, en las que se introdujo una etiqueta FLAG en el extremo C-terminal mediante la edición mediada por CRISPR (Fig. S1E suplementaria). Estas células exhiben una expresión relativamente alta de GPR15 endógeno según la Enciclopedia de Líneas de Células Cancerosas. En particular, excepto el aparato de Golgi, la localización mitocondrial de GPR15 también fue claramente detectable en las células SW48 (Fig. S1F-S1I suplementaria), lo que sugiere que el aparato de Golgi y las mitocondrias son dos orgánulos principales en los que GPR15 funciona en las células de cáncer colorrectal. Los estudios de correlación clínica han demostrado una disminución progresiva de GPR15 durante la progresión del cáncer colorrectal, lo que se validó en tejidos derivados de pacientes y líneas celulares de cáncer colorrectal (Fig. 1B; Fig. S2A-S2C suplementaria). En particular, la reducción de la expresión de GPR15 se correlacionó con una disminución de la supervivencia general (OS) en pacientes con cáncer colorrectal (Fig. 1C). Curiosamente, la sobreexpresión de GPR15 ejerció efectos pro-proliferativos marginales en las células tumorales (Fig. S2D-S2F suplementaria), mientras que la deficiencia de GPR15 alteró significativamente la viabilidad celular de las células LS1034 y SW48, dos líneas celulares de cáncer colorrectal con alta expresión endógena de GPR15 (Fig. S2G y S2H suplementarias). De manera consistente, un análisis de ARN-seq de los organoides derivados de pacientes (PDO) GPR15-sobreexpresores reveló que los procesos biológicos relacionados con la biogénesis de ribosomas se regularon al alza (Fig. 1D) y que se activaron múltiples vías metabólicas (Fig. 1E). Estas observaciones en conjunto indicaron un papel regulador intrínseco de GPR15 en las células de cáncer colorrectal que mejoró el pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal.

El 5-FU, el oxaliplatino y el irinotecán son los pilares de los regímenes de quimioterapia de primera línea para el cáncer colorrectal, siendo el 5-FU típicamente la base de las terapias combinadas (^[27]). Luego, examinamos diferentes agentes quimioterapéuticos e identificamos que GPR15 aumentó específicamente la quimiosensibilidad al 5-FU, pero no al oxaliplatino o al irinotecán (Fig. 1F; Fig. S2I y S2J suplementarias). De manera consistente, la deficiencia de GPR15 atenuó la eficacia del 5-FU (Fig. 1G; Fig. S2K suplementaria). Confirmamos además que GPR15 aumentó la quimiosensibilidad al 5-FU de los PDO (Fig. 1H). Además, el perfilaje transcripcional demostró que GPR15 moduló bidireccionalmente la biogénesis de ribosomas al aumentar la síntesis de proteínas mediada por ribosomas de referencia y suprimir selectivamente esta vía en presencia de tratamiento con 5-FU (Fig. 1I). Esta regulación paradójica coincidió con la atenuación de la señalización de la respuesta al estrés integrado en los PDO tratados con 5-FU. Estos hallazgos sugirieron que GPR15 redirigió las células tumorales hacia la vulnerabilidad a la quimioterapia, lo que se confirmó en células no cancerosas, pero no en células de cáncer de páncreas (Fig. S2L-S2Q suplementaria).

El perfilaje transcripcional reveló que el aumento de la quimiosensibilidad al 5-FU mediado por GPR15 suprimió significativamente la proliferación de las células tumorales. Aunque GPR15 potenció la muerte celular apoptótica inducida por 5-FU (Fig. S3A suplementaria), el arresto del ciclo celular fue su mecanismo antiproliferativo predominante (Fig. S3B-S3D suplementaria); estos dos mecanismos inhibieron sinérgicamente el crecimiento. En particular, la sobreexpresión de GPR15 con el tratamiento con 5-FU reguló al alza las vías de reparación del daño del ADN (Fig. 1J), lo que sugiere un aumento del estrés quimioterapéutico que superó la capacidad de adaptación del tumor. Esta sinergia mecanicista se tradujo en una eficacia in vivo, como lo demuestra la regresión tumoral superior en xenoinjertos GPR15-sobreexpresores (Fig. 1K-M) y el modelo de implantación ortotópica (Fig. 1N y O) tratados con 5-FU. Curiosamente, la deficiencia de GPR15 aceleró el crecimiento tumoral específicamente bajo el tratamiento con 5-FU (Fig. S3E-S3G suplementaria), lo que indica que GPR15 endógeno es esencial para la supresión del cáncer colorrectal mediada por 5-FU. En conjunto, estas observaciones establecieron que GPR15 potencia selectivamente el 5-FU, mejorando su eficacia terapéutica.

La redistribución de GPR15 en las mitocondrias es esencial para la quimiosensibilización al 5-FU

Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la quimiosensibilización al 5-FU mediada por GPR15, realizamos un análisis de proteómica comparativa en células HCT116 GPR15-sobreexpresoras y células de control. Descubrimos que GPR15 se localizaba predominantemente en el aparato de Golgi en condiciones basales, pero que se redistribuía a las mitocondrias después del tratamiento con 5-FU (Fig. 2A). Para confirmar este hallazgo, realizamos experimentos de co-localización mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica. Los resultados mostraron que GPR15 se co-localizaba con la proteína mitocondrial TOMM20 en las células tratadas con 5-FU (Fig. 2B). Además, la tinción de mitocondrias con MitoTracker reveló que GPR15 se translocaba a las mitocondrias en respuesta al tratamiento con 5-FU (Fig. 2C).

Para investigar el papel de la translocación de GPR15 a las mitocondrias en la quimiosensibilización al 5-FU, generamos una línea celular HCT116 GPR15-sobreexpresora en la que se había eliminado el dominio de translocación mitocondrial (MTD) de GPR15. Descubrimos que la eliminación del MTD impidió la translocación de GPR15 a las mitocondrias después del tratamiento con 5-FU (Fig. 2D). En consecuencia, las células HCT116 GPR15-sobreexpresoras con el MTD eliminado mostraron una resistencia reducida al 5-FU en comparación con las células de control (Fig. 2E). Estos hallazgos sugieren que la translocación de GPR15 a las mitocondrias es esencial para la quimiosensibilización al 5-FU.

Para identificar las proteínas mitocondriales que interactúan con GPR15, realizamos un experimento de co-inmunoprecipitación seguido de espectrometría de masas. Descubrimos que GPR15 interactuaba con varias proteínas mitocondriales, incluidas las subunidades de la cadena respiratoria, las proteínas de transporte de electrones y las proteínas de la matriz mitocondrial (Fig. 2F). En particular, descubrimos que GPR15 interactuaba fuertemente con

Para dilucidar la relevancia funcional de la dinámica subcelular de GPR15 en la quimiosensibilización con 5-FU, investigamos su redistribución espacial bajo estrés terapéutico. La alteración farmacológica con 5-FU mejoró la dispersión selectiva de GPR15 desde los compartimentos residentes en el Golgi, en contraste con la localización estable de la proteína de la matriz del Golgi, GORASP2 (Fig. 2A; Fig. S4A y S4B suplementarias). Esta plasticidad compartimental se correlacionó con una mayor eficacia quimioterapéutica, como se evidenció en los experimentos de desensamblaje del Golgi mediados por BFA, en los que BFA interrumpió la organización espacial de GPR15 (Fig. S4C suplementaria) y abolió su actividad potenciadora de 5-FU (Fig. 2B). En conjunto, estos hallazgos establecieron que la translocación dinámica de GPR15 fue un requisito previo para su función de quimiosensibilización, lo que implica que el tráfico específico de orgánulos es un nuevo eje regulador que modula las respuestas a la quimioterapia.

Para analizar la dinámica espacio-temporal de la redistribución de GPR15, examinamos el seguimiento subcelular modulado por la temperatura. El tratamiento con 5-FU indujo la translocación de GPR15 a las mitocondrias y al retículo endoplásmico, y la redistribución observada a 4 °C fue mayor que a 37 °C (Fig. 2C y D; Fig. S4D suplementaria), lo que sugiere que GPR15 se redistribuyó dinámicamente a estos dos orgánulos. El análisis IP identificó 64 posibles interacciones, entre las que cinco proteínas mitocondriales, MTHFD1, GAPDH, NDUFA13, NDUFS3 y MGST1, surgieron como posibles reguladores espaciales (Fig. S5A suplementaria). Las células con sobreexpresión de GPR15 o que expresan un alelo de GPR15 marcado con FLAG de forma endógena confirmaron de forma consistente una interacción robusta entre GPR15 y MGST1 mediante experimentos de co-inmunoprecipitación (co-IP) (Fig. 2E-H), una enzima bifuncional localizada en las mitocondrias, el RE y los endosomas (Fig. S5B-S5F suplementarias; ref. ^[28]). Un análisis de inmunofluorescencia (IF) reveló que la colocalización de GPR15 y MGST1 era distinta de los compartimentos residentes en el Golgi y se atenuó a 4 °C (Fig. 2I). La arquitectura del Golgi se alteró farmacológicamente utilizando BFA, lo que disminuyó parcialmente la interacción GPR15-MGST1 (Fig. 2I y J). El fraccionamiento subcelular mostró que los complejos GPR15-MGST1 se localizaron predominantemente en las mitocondrias y, en segundo lugar, en los endosomas (Fig. 2K). Una investigación funcional reveló una relación de estabilización mutua, en la que GPR15 prolongó la estabilidad de la proteína MGST1 al suprimir su degradación lisosomal (Fig. 2L y M), mientras que MGST1 mantuvo recíprocamente la localización de GPR15 en las mitocondrias, como lo demuestra una deficiencia de MGST1 en la que la localización subcelular de GPR15 se volvió desordenada (Fig. 2N). A través del etiquetado de proximidad APEX2 mitocondrial, se demostró que MGST1 enriqueció GPR15 en las mitocondrias, y el grupo de sobreexpresión saturó la ocupación mitocondrial (Fig. 2O). En conjunto, estos datos establecieron MGST1 como un navegador espacio-temporal que dirige GPR15 a las mitocondrias y, por lo tanto, acopla la localización subcelular de GPR15 con la eficacia de la quimiosensibilización a través de redes de estabilización de proteínas específicas de orgánulos.

La interdependencia funcional de GPR15 y MGST1 se validó aún más mediante análisis de correlación genética y clínica. La pérdida de MGST1 abolió la quimiosensibilidad mejorada por GPR15 con 5-FU (Fig. 2P) y confirmó que MGST1 es un cofactor no redundante. Aunque los datos de TCGA no revelaron una asociación significativa entre la expresión de MGST1 por sí sola y la supervivencia del cáncer colorrectal (Fig. S5G suplementaria), una estratificación combinatoria demostró el valor pronóstico de la alta expresión de GPR15 y MGST1, que mostró una mejor supervivencia general en comparación con las cohortes de baja expresión (Fig. 2Q, izquierda). Sorprendentemente, dentro de la población de MGST1 alta, la elevada expresión de GPR15 marcó un subgrupo distinto con resultados de supervivencia significativamente mejorados (Fig. 2Q, derecha), lo que subraya el papel de MGST1 en la determinación de los efectos moduladores del tratamiento de GPR15. Estas observaciones identificaron a MGST1 como un mediador esencial de la quimiosensibilización impulsada por GPR15.

GPR15 promueve la actividad de la red metabólica basada en el metabolismo central del carbono

A continuación, nos preguntamos cómo la GPR15 subcelular modulaba la eficacia del 5-FU. El 5-FU es un fármaco antimetabolito (^[29]). Realizamos un perfilado metabolómico no dirigido, que confirmó que el 5-FU indujo una supresión metabólica global en las células de cáncer colorrectal (Fig. S6A suplementaria). Esta supresión se revirtió con la sobreexpresión de GPR15, como lo demuestra el aumento de los niveles de los grupos de metabolitos (Fig. S6B suplementaria). Un mapa de calor ilustró aún más estas alteraciones metabólicas (Fig. S6C suplementaria). El enriquecimiento de la vía KEGG reveló que la sobreexpresión de GPR15 activó fuertemente el metabolismo central del carbono (Fig. 3A; Fig. S6D suplementaria). Esta remodelación metabólica amplificó específicamente el metabolismo del carbono impulsado por la serina y las vías de biosíntesis de purinas (Fig. 3A; Fig. S6E-S6J suplementarias) y, por lo tanto, fue una vulnerabilidad terapéuticamente explotable. Por el contrario, la deficiencia de GPR15 indujo los cambios metabólicos opuestos, en los que el metabolismo central del carbono, la vía de las pentosas fosfato y el metabolismo del alanina, aspartato y glutamato se redujeron de forma estable (Fig. S7A y S7B suplementarias). Las vías reguladas al alza por la sobreexpresión de GPR15 apoyaron colectivamente la producción de nucleótidos. Por lo tanto, asumimos que al regular la activación secuencial de los nodos metabólicos, incluido el metabolismo central del carbono, el metabolismo de la serina, el metabolismo del folato y el metabolismo de las purinas, GPR15 saturó los objetivos moleculares del 5-FU con intermedios de nucleótidos excesivos, mejorando así la eficacia del 5-FU (Fig. S7C suplementaria).

Las alteraciones farmacológicas y metabólicas revelaron que el aumento de la eficacia del 5-FU dependiente de GPR15 dependía críticamente de un metabolismo central del carbono intacto, como lo demuestra la disminución de la quimiosensibilización con el tratamiento con metotrexato y la privación de glucosa (Fig. 3B y C). El rastreo isotópico con glucosa universalmente marcada con 13C demostró que la sobreexpresión de GPR15 dirigió preferentemente los carbonos derivados de la glucosa hacia las vías metabólicas de la serina y el carbono, lo que se evidenció por un aumento de la fracción m3 incorporada en los intermedios clave y la disminución concomitante de las especies no marcadas (m0) (Fig. 3D y E; Fig. S8A suplementaria). En particular, el 2-fosfoglicerato marcado corroboró que el metabolismo glucolítico acelerado se alimentó en los procesos anabólicos posteriores (Fig. 3F). Esta remodelación metabólica amplificó selectivamente la biosíntesis de purinas, y se observó una aceleración metabólica en los grupos de AMP, ADP, ATP, adenosina e inosina monofosfato (IMP) (Fig. 3G; Fig. S8B suplementaria), aunque el metabolismo de las guaninas nucleótidas no se vio afectado (Fig. S8C y S8D suplementarias). Estos hallazgos delinearon un mecanismo regulador específico del punto de ramificación en el que GPR15 aceleró la utilización de glucosa mediante el metabolismo de la serina y el carbono, lo que promovió la síntesis de IMP y evitó la producción de nucleótidos de guanina. GPR15, al canalizar metabólicamente los carbonos de la glucosa hacia este eje, creó una vulnerabilidad terapéutica que mejoró la actividad antimetabolito del 5-FU contra la biosíntesis de nucleótidos.

GPR15 modula específicamente la abundancia de NAD+/NADH, la acumulación de NAD+ mitocondrial y la reprogramación metabólica

Aunque GPR15 activó el metabolismo de la serina y el carbono, una cuantificación dirigida de las enzimas metabólicas asociadas no reveló una regulación al alza significativa (Fig. S8E y S8F suplementarias), lo que sugiere que la regulación postraduccional más que el control transcripcional causó el aumento de los niveles. Una reevaluación metabolómica integral reveló una remodelación metabólica de amplio espectro, junto con una mayor glucólisis, fosforilación oxidativa y acumulación de lípidos, lo que se validó mediante un análisis de flujo extracelular de Seahorse y una tinción con BODIPY-C16 (Fig. 3H e I). Estas adaptaciones coordinadas sugirieron que un nodo regulador unificado orquestó estos cambios metabólicos. Dada la función central de los pares redox NAD(H)/NADP(H) en la integración metabólica (^[30], ^[31]), identificamos que los niveles de nicotinamida, un precursor de NAD(P), se elevaron notablemente en las células con sobreexpresión de GPR15 (Fig. S9A suplementaria). El perfil redox demostró que la relación NAD+/NADH se amplificó selectivamente mediante la acumulación de NAD+ y el agotamiento de NADH mediados por GPR15, independientemente de los grupos NADP(H) (Fig. 3J; Fig. S9B-S9E suplementarias). En esencia, el fraccionamiento subcelular confirmó además que GPR15 enriqueció el NAD+ mitocondrial, similar al NAD+ citosólico (Fig. 3K), lo que es consistente con el origen citosólico conocido del NAD+ mitocondrial (^[32]). En particular, el método LbNOX de aumento de la abundancia intracelular de NAD+ reveló que el NAD+ mitocondrial acumulado mejoró específicamente la eficacia del 5-FU, suprimiendo la viabilidad de las células de cáncer colorrectal, de manera similar a los efectos de GPR15 (Fig. 3L). En conjunto, estos hallazgos identificaron a GPR15 como un reóstato redox que remodeló el metabolismo central del carbono controlando espacialmente la homeostasis del NAD+, evitando la regulación clásica de los niveles de enzimas para crear un estado metabólicamente preparado explotable por la actividad antimetabolito del 5-FU.

El vínculo entre la dinámica subcelular de GPR15 y la reprogramación metabólica mediada por NAD+ se analizó aún más mediante perturbaciones espaciales y genéticas. Tanto la alteración farmacológica del Golgi (BFA) como la deficiencia de MGST1 abolieron la acumulación mitocondrial de NAD+ impulsada por GPR15 (Fig. 4A y B; Fig. S9F y S9G suplementarias). Por lo tanto, se demostró que el tráfico restringido a orgánulos es un requisito previo para la acumulación de NAD+ mitocondrial. MGST1, una glutatión transferasa y peroxidasa bifuncional que regula la capacidad oxidativa mitocondrial (^[33]), se identificó como un regulador metabólico crítico, y su deficiencia produjo un colapso metabólico global (Fig. S10A-S10C suplementarias). Aunque GPR15 aún activó parcialmente el metabolismo del carbono citosólico en las células deficientes en MGST1, los niveles metabólicos mitocondriales, en particular los de los intermedios del ciclo del ácido tricarboxílico, se redujeron selectivamente (Fig. 4C; Fig. S10D y S10E suplementarias). Un análisis de diagrama de dispersión de las alteraciones metabólicas reveló que la deficiencia de MGST1 revirtió la redirección del metabolismo de la glucosa mediada por GPR15, normalizando el metabolismo de los carbohidratos al tiempo que preservaba los precursores anabólicos derivados de la glucosa (Fig. 4D-F). En consecuencia, la deficiencia de MGST1 revirtió la glucólisis, la fosforilación oxidativa y el almacenamiento de lípidos mejorados por GPR15 (Fig. 4G y H). En conjunto, estas observaciones sugirieron que MGST1 es un amplificador espacial de los efectos metabólicos mediados por GPR15, acoplando la redistribución subcelular de GPR15 al flujo de NAD+ mitocondrial a través de la regulación específica del compartimento de la utilización de glucosa y el metabolismo oxidativo.

GPR15 se asocia con PARP4 y restringe su actividad enzimática para acumular NAD+ para la reprogramación metabólica

A continuación, nos preguntamos cómo GPR15 aumentó los niveles de NAD+ citosólico para la reprogramación metabólica posterior. El NAD+ se sintetiza o utiliza mediante varias vías intracelulares (^[31], ^[34]). Nuestro análisis IP-MS identificó a PARP4 como la única enzima moduladora de NAD+ que los miembros de la familia PARP utilizan para la ADP-ribosilación de proteínas (^[35], 36). Los ensayos de co-IP validaron la asociación entre GPR15 y PARP4 (Fig. 5A-C; Fig. S11A suplementaria), mientras que un análisis de compartimentación subcelular reveló que los grupos de PARP4 citosólicos se colocalizaron parcialmente con GPR15 anclado en el Golgi (Fig. 5D; Fig. S11B suplementaria). Estos hallazgos indicaron que PARP4 es un reóstato de NAD+ restringido espacialmente, en el que su interacción proximal al Golgi con GPR15 regula localmente la disponibilidad de NAD+.

Se ha predicho que PARP4 consume NAD+ en la reacción de MARilación (^[36]). Descubrimos que la deficiencia de PARP4 elevó los niveles de NAD+ citosólico al tiempo que redujo los niveles de NADH, aumentando así la relación NAD+/NADH (Figura S11C del material suplementario). De manera consistente, la deficiencia de PARP4 promovió la remodelación metabólica, y un análisis de la vía KEGG indicó que el metabolismo central del carbono estaba altamente enriquecido (Figura S11D y S11E del material suplementario). Es importante destacar que la deficiencia de PARP4 mejoró la eficacia del 5-FU, como lo demuestra la reducción de la viabilidad de las células de cáncer colorrectal (Figura S11F del material suplementario). Estos fenotipos se asemejaron estrechamente a los efectos metabólicos y de quimiosensibilización de la sobreexpresión de GPR15. Sorprendentemente, la acumulación de NAD+ y el agotamiento de NADH impulsados por GPR15 se invirtieron por completo mediante la complementación de PARP4 (Figura 5E), lo que reveló que GPR15 es un regulador negativo de la actividad enzimática de PARP4. Una validación bioquímica demostró que la MARilación global se atenuó en las células con sobreexpresión de GPR15 (Figura 5F), y los ensayos de inmunoprecipitación (IP) específicos de PARP4 confirmaron la reducción de la ribosilación del sustrato (Figura 5G). Los experimentos de rescate establecieron además que la sobreexpresión de PARP4 contrarrestó la supresión de la MARilación inducida por GPR15 (Figura 5H). En conjunto, estos resultados establecieron un antagonismo funcional, en el que el complejo GPR15-PARP4 obstaculizó la actividad catalítica de PARP4, secuestrando así el NAD+ y previniendo su MARilación para impulsar la reprogramación metabólica.

El perfilado metabolómico no dirigido estableció aún más el papel fundamental de PARP4 en la remodelación metabólica impulsada por GPR15. Un análisis de diagrama de dispersión (volcano plot) demostró que la sobreexpresión de PARP4 revirtió ampliamente los cambios metabólicos inducidos por GPR15 (Figura 5I) y que las vías del metabolismo central del carbono y de las purinas, que se enriquecieron con la sobreexpresión de GPR15, disminuyeron por debajo de las 20 vías principales (Figura 5J y K). Una validación funcional basada en un análisis del flujo extracelular confirmó que GPR15 normalizado con PARP4 mejoró la glucólisis y la fosforilación oxidativa (Figura 5L). Esta dependencia funcional se extendió a los resultados terapéuticos, en los que la sobreexpresión de PARP4 atenuó parcial pero significativamente la quimiosensibilidad potenciada por GPR15 al 5-FU (Figura 5M). Los análisis de correlación clínica revelaron implicaciones pronósticas matizadas que sugirieron que la alta expresión tanto de GPR15 como de PARP4 se correlacionó con mejores resultados de supervivencia en comparación con las cohortes con baja expresión de GPR15 y PARP4, aunque PARP4 solo exhibió asociaciones de supervivencia dependientes del contexto (Figura 5N; Figura S11G del material suplementario). En conjunto, estos hallazgos identificaron a PARP4 como un regulador metabólico clave en la quimiosensibilización mediada por GPR15, que opera a través de la regulación centrada en el NAD+ del flujo anabólico.

La maquinaria proteica basada en GPR15 y la posterior reprogramación metabólica dependen de Gαq

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) endomembranosos se regulan clásicamente a través de interacciones con subunidades Gα específicas, en particular Gαi (^[37]–^[39]). Se ha informado que GPR15 activa la señalización del calcio a través de las vías Gαi y Gαq (^[17], ^[40]). Un ensayo de reportero de luciferasa indicó que GPR15 se asoció con Gαi y Gαq en las células de cáncer colorrectal (Figura 6A; Figura S12A del material suplementario); sin embargo, la inhibición de Gαq, pero no de Gαi u otras proteínas G, revirtió la eficacia mejorada del 5-FU por GPR15 (Figura 6B; Figura S12B del material suplementario). La actividad de Gαq se abolió mediante una forma truncada en el extremo C de Gαq (Gαq-CT; ref. ^[41]), lo que interrumpió la localización de GPR15 en el Golgi (Figura 6C) e inestabilizó su interactoma, con GPR15 disociándose de MGST1 (Figura 6D). Esto revirtió la estabilización de MGST1 mediada por GPR15 (Figura 6E) y normalizó la acumulación de NAD+ mitocondrial (Figura 6F). Concomitantemente, Gαq-CT restauró la MARilación mediada por PARP4 (Figura 6G) y abolió el desequilibrio NAD+/NADH impulsado por GPR15 (Figura 6H). Estas observaciones confirmaron que Gαq es un organizador espacial del eje GPR15-PARP4-MGST1, cuyo anclaje dependiente de Gαq en el Golgi promovió la redistribución del flujo de NAD+ a través de interacciones proteicas compartimentalizadas.

Para dilucidar el papel de Gαq en la reprogramación metabólica mediada por GPR15, la actividad de Gαq se inhibió mediante el constructo Gαq-CT, lo que produjo perturbaciones metabólicas de amplio espectro, incluida la supresión del metabolismo central del carbono (Figura S12C del material suplementario). Un análisis de la vía KEGG reveló una atenuación profunda de la reprogramación metabólica impulsada por GPR15 tras la inhibición de Gαq, con reducciones marcadas en el metabolismo central del carbono y las vías de salvamento del nicotinamida (Figura 6I y J; Figura S12D del material suplementario). Un análisis detallado del cambio en los metabolitos reveló que la inhibición de Gαq normalizó los niveles de 33 metabolitos elevados por GPR15 (Figura 6K), incluidos el metabolismo de los ácidos grasos, las cascadas de glucólisis y fosforilación aeróbica, y los ciclos de serina, metionina y glicina, todos nodos clave de la red metabólica de GPR15. Sorprendentemente, la agrupación jerárquica demostró que Gαq fue el integrador central de los efectos metabólicos de GPR15 al coordinar la redistribución del flujo de carbono a través del metabolismo de un carbono impulsado por la serina. En conjunto, estos hallazgos establecieron que la reprogramación metabólica impulsada por GPCR endomembranosos, iniciada por la amplificación del flujo de NAD+ mediada por Gαq, impulsó la sinergia de quimiosensibilización entre GPR15 y 5-FU en el cáncer colorrectal.

Rucaparib, un inhibidor de PARP disponible clínicamente, exhibió efectos sinérgicos con 5-FU en la reprogramación metabólica y el tratamiento del cáncer colorrectal

Basándonos en estas perspectivas mecanísticas sobre GPR15 endomembrano, exploramos estrategias traslacionales para explotar el potencial de quimiosensibilización de GPR15. Un análisis de minería de scRNA-seq de pacientes con cáncer colorrectal reveló el agotamiento selectivo de las células epiteliales GPR15+ tras la quimioterapia (Figura S13A y S13B del material suplementario). Un análisis de qPCR de tejido tumoral de pacientes, no tratado previamente (biopsia) y postratamiento (resección quirúrgica), tras la quimioterapia basada en 5-FU también mostró una regulación a la baja significativa de GPR15 en los tres pacientes examinados (Figura S13C del material suplementario). Esta observación sugirió que las poblaciones GPR15+ exhibieron una mayor sensibilidad al 5-FU in vivo. Esta observación clínica se alineó con nuestros hallazgos in vitro y nos motivó a evaluar la suplementación con NAD+ como terapia de combinación para amplificar la eficacia del 5-FU. Dado que GPR15 mejoró la quimiosensibilidad a través de la reprogramación metabólica dependiente de NAD+, hipotetizamos que el aumento farmacológico de los niveles de NAD+ tendría efectos similares a los de la activación de GPR15, lo que ofrecería un medio alternativo para tratar tumores con deficiencia intrínseca de GPR15.

Para evaluar los efectos terapéuticos de la promoción de la quimiosensibilización mediada por NAD+, examinamos el precursor de NAD+, mononucleótido de nicotinamida (NMN) y los inhibidores de PARP aprobados clínicamente, incluidos niraparib, rucaparib y olaparib (^[42]), en combinación con 5-FU. Aunque NMN no exhibió una citotoxicidad discernible, los inhibidores de PARP suprimieron la viabilidad de las células de cáncer colorrectal de manera dependiente de la dosis, y rucaparib y olaparib demostraron una mayor potencia en los modelos con sobreexpresión de MGST1 (Figura S14A del material suplementario). Excepto por NMN, el cotratamiento a corto plazo (48 horas) reveló una modesta sinergia entre los inhibidores de PARP y 5-FU (Figura S14B del material suplementario). Sorprendentemente, tras una exposición prolongada, rucaparib mostró una robusta sinergia, manteniendo una quimiopotenciación sostenida de 5-FU independientemente del estado de MGST1 (Figura S14C del material suplementario). Esta interacción sinérgica se validó aún más cuantitativamente mediante el análisis de CompuSyn (Figura S14D del material suplementario). La sinergia terapéutica entre rucaparib y 5-FU se observó de manera consistente en múltiples modelos preclínicos, incluidos los organoides derivados de pacientes (PDO) (Figura 7A), los xenoinjertos de HCT-8 (Figura 7B–D) y un modelo PDX (Figura 7E–G). Estos hallazgos establecieron la inhibición de PARP como un medio viable para amplificar la eficacia del 5-FU en el cáncer colorrectal, y rucaparib surgió como un candidato principal para la traslación clínica.

El perfilado transcriptómico de los tumores tratados reveló distintas respuestas adaptativas. La monoterapia con 5-FU indujo cambios transcriptómicos profundos, mientras que rucaparib solo provocó solo cambios sutiles, a pesar de la modesta pero significativa reducción del volumen tumoral lograda con su uso. Sorprendentemente, el tratamiento combinado con 5-FU y rucaparib desencadenó una remodelación transcriptómica sinérgica, con firmas de expresión génica únicas distintas de cualquier monoterapia, lo que sugirió que rucaparib amplificó selectivamente los efectos moleculares de 5-FU en lugar de ejercer su propia actividad (Figura 7H). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes demostró además que la terapia de combinación suprimió tanto la biogénesis de ribosomas como las vías metabólicas mitocondriales (Figura 7I), lo que recapitula la firma de vulnerabilidad metabólica observada en los PDO con sobreexpresión de GPR15 cuando se trataron con 5-FU. Esta observación contrastó marcadamente con los patrones de resistencia adquirida en los tumores tratados crónicamente con 5-FU, en los que la aparición de la reactivación adaptativa de la síntesis de proteínas ribosomales y el metabolismo mitocondrial indicó una adaptación farmacológica (Figura S14E y S14F del material suplementario). La dicotomía entre la sinergia aguda y la resistencia crónica subrayó la necesidad de una terapia de combinación con 5-FU y rucaparib para prevenir el desarrollo de vías de supervivencia adaptativas con mecanismos de promoción tumoral compensatorios.

La mejora del metabolismo central del carbono y la reprogramación metabólica asociada (Figura 3) impulsada por GPR15 se correlacionó con la activación de la biogénesis de ribosomas (Figura 1D), mientras que la monoterapia con 5-FU en tumores resistentes a los fármacos implicó predominantemente la fosforilación oxidativa mitocondrial (Figura S14F del material suplementario). Esta dicotomía sugirió que la eficacia sinérgica del tratamiento combinado surgió de la participación de vías metabólicas distintas en lugar de efectos de monoterapia superpuestos. Un análisis KEGG reveló que el metabolismo de un carbono mediado por folato se enriqueció de manera única en la terapia de combinación en comparación con 5-FU solo (Figura 7J), lo que indica un estado metabólico reprogramado (Figura S14G del material suplementario). El perfilado metabolómico no dirigido demostró que, aunque las monoterapia con 5-FU y rucaparib indujeron diferentes respuestas transcripcionales, sus perturbaciones metabólicas convergieron en vías compartidas (Figura S15A–S15D del material suplementario). En esencia, la terapia de combinación identificó 18 metabolitos enriquecidos en el flujo de glucosa, la serina y el metabolismo de un carbono, y las vías de biosíntesis de purinas (Figura S15E del material suplementario) que estaban ausentes en los grupos de monoterapia. Un análisis de vías jerárquicas confirmó que el metabolismo central del carbono fue la vía enriquecida de mayor rango exclusivamente en los tumores tratados con la combinación (Figura 7K; Figura S15B y S15C del material suplementario), lo que es consistente con la firma metabólica mediada por GPR15. Estos datos establecieron que la preparación metabólica al amplificar el flujo central del carbono, ya sea a través de la intervención genética (GPR15) o farmacológica (rucaparib), fue un determinante crítico de la respuesta al 5-FU. En conjunto, estos hallazgos posicionaron a los inhibidores de PARP aprobados clínicamente, en particular rucaparib, como potentes quimiosensibilizadores que pueden superar la resistencia intrínseca y adaptativa al 5-FU en el cáncer colorrectal.

GPR15 se localiza principalmente en el aparato de Golgi y aumenta la quimiosensibilización al 5-FU en el cáncer colorrectal.

Un análisis de inmunofluorescencia (IF) de células HCT-8 que sobreexpresan GPR15 reveló que GPR15 se localiza predominantemente en el aparato de Golgi, con una distribución mínima en las mitocondrias y el retículo endoplásmico, y sin asociación detectable con los lisosomas (Fig. 1A; Fig. S1A-S1D suplementaria). Se observó un patrón de distribución similar para GPR15 endógeno en células SW48, en las que se introdujo una etiqueta FLAG en el extremo C-terminal mediante la inactivación mediada por CRISPR (Fig. S1E suplementaria). Estas células exhiben una expresión endógena de GPR15 relativamente alta, según la Enciclopedia de Líneas Celulares del Cáncer. Cabe destacar que, a excepción del aparato de Golgi, la localización mitocondrial de GPR15 también fue claramente detectable en las células SW48 (Fig. S1F-S1I suplementaria), lo que sugiere que el aparato de Golgi y las mitocondrias son dos orgánulos principales en los que GPR15 funciona en las células de cáncer colorrectal. Los estudios de correlación clínica han demostrado una disminución progresiva de GPR15 durante la progresión del cáncer colorrectal, lo que se validó en tejidos derivados de pacientes y en líneas celulares de cáncer colorrectal (Fig. 1B; Fig. S2A-S2C suplementaria). Cabe destacar que la expresión reducida de GPR15 se correlacionó con una disminución de la supervivencia global (OS) en pacientes con cáncer colorrectal (Fig. 1C). Curiosamente, la sobreexpresión de GPR15 ejerció efectos proliferativos marginales en las células tumorales (Fig. S2D-S2F suplementaria), mientras que la deficiencia de GPR15 alteró significativamente la viabilidad celular de LS1034 y SW48, dos líneas celulares de cáncer colorrectal con alta expresión endógena de GPR15 (Fig. S2G y S2H suplementaria). De manera consistente, un análisis de ARN-seq de orgánoides derivados de pacientes (GPR15-sobreexpresantes) reveló que los procesos biológicos relacionados con la biogénesis de ribosomas se regularon al alza (Fig. 1D) y se activaron múltiples vías metabólicas (Fig. 1E). En conjunto, estas observaciones indicaron un papel regulador intrínseco de GPR15 en las células de cáncer colorrectal que mejoró el pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal.

5-FU, oxaliplatino e irinotecán son los pilares de los regímenes de quimioterapia de primera línea para el cáncer colorrectal, siendo el 5-FU típicamente la base de las terapias combinadas (^[27]). Luego, examinamos diferentes agentes quimioterapéuticos e identificamos que GPR15 aumentó específicamente la quimiosensibilidad al 5-FU, pero no al oxaliplatino o al irinotecán (Fig. 1F; Fig. S2I y S2J suplementaria). De manera consistente, la deficiencia de GPR15 atenuó la eficacia del 5-FU (Fig. 1G; Fig. S2K suplementaria). Confirmamos además que GPR15 aumentó la quimiosensibilidad al 5-FU de los orgánoides (Fig. 1H). Además, el perfilado transcriptómico demostró que GPR15 moduló bidireccionalmente la biogénesis de ribosomas al aumentar la síntesis de proteínas mediada por ribosomas en condiciones basales y suprimir selectivamente esta vía en presencia de tratamiento con 5-FU (Fig. 1I). Esta regulación paradójica coincidió con la atenuación de la señalización de la respuesta al estrés integrado en los orgánoides tratados con 5-FU. Estos hallazgos sugirieron que GPR15 redirigió las células tumorales hacia la vulnerabilidad a la quimioterapia, lo que se confirmó en células no colorrectales, pero no en células de cáncer de páncreas (Fig. S2L-S2Q suplementaria).

El perfilado transcriptómico reveló que la mejora de la quimiosensibilidad al 5-FU mediada por GPR15 suprimió significativamente la proliferación de las células tumorales. Aunque GPR15 potenció la muerte celular apoptótica inducida por 5-FU (Fig. S3A suplementaria), el arresto del ciclo celular fue su mecanismo antiproliferativo predominante (Fig. S3B-S3D suplementaria); estos dos mecanismos inhibieron sinérgicamente el crecimiento. Cabe destacar que la sobreexpresión de GPR15 con el tratamiento con 5-FU reguló al alza las vías de reparación del daño del ADN (Fig. 1J), lo que sugiere un aumento del estrés quimioterapéutico que superó la capacidad de adaptación del tumor. Esta sinergia mecanicista se tradujo en eficacia in vivo, como lo demuestra la regresión tumoral superior en xenoinjertos que sobreexpresan GPR15 (Fig. 1K-M) y en el modelo de implantación ortotópica (Fig. 1N y O) tratados con 5-FU. Interesantemente, la deficiencia de GPR15 aceleró el crecimiento tumoral específicamente bajo el tratamiento con 5-FU (Fig. S3E-S3G suplementaria), lo que indica que GPR15 endógeno es esencial para la supresión de la progresión del cáncer colorrectal mediada por 5-FU. En conjunto, estas observaciones establecieron que GPR15 potencia selectivamente el 5-FU, mejorando su eficacia terapéutica.

La redistribución subsellular de GPR15 a las mitocondrias a través de la interacción con MGST1 es esencial para la quimiosensibilización al 5-FU

Para dilucidar la relevancia funcional de la dinámica subsellular de GPR15 en la quimiosensibilización al 5-FU, investigamos su redistribución espacial bajo estrés terapéutico. La perturbación farmacológica con 5-FU mejoró la dispersión selectiva de GPR15 a partir de los compartimentos residentes en el Golgi, en contraste con la localización estable de la proteína de la matriz del Golgi, GORASP2 (Fig. 2A; Fig. S4A y S4B suplementaria). Esta plasticidad compartimental se correlacionó con una mayor eficacia quimioterapéutica, como lo evidencian los experimentos de desensamblaje del Golgi mediados por BFA, en los que BFA interrumpió la organización espacial de GPR15 (Fig. S4C suplementaria) y abolió su actividad potenciadora del 5-FU (Fig. 2B). En conjunto, estos hallazgos establecieron que la translocación dinámica de GPR15 fue un requisito previo para su función de quimiosensibilización, lo que implica que el tráfico organelar específico es un nuevo eje regulador que modula las respuestas a la quimioterapia.

Para diseccionar la dinámica espacio-temporal de la redistribución de GPR15, examinamos el seguimiento subsellular modulado por la temperatura. El tratamiento con 5-FU indujo la translocación de GPR15 a las mitocondrias y al retículo endoplásmico, y la redistribución observada a 4 °C fue mayor que a 37 °C (Fig. 2C y D; Fig. S4D suplementaria), lo que sugiere que GPR15 se redistribuyó dinámicamente a estos dos orgánulos. IP identificó 64 interacciones candidatas, entre las cuales, cinco proteínas mitocondriales, MTHFD1, GAPDH, NDUFA13, NDUFS3 y MGST1, surgieron como posibles reguladores espaciales (Fig. S5A suplementaria). Las células con sobreexpresión de GPR15 o que expresan un alelo FLAG-etiquetado endógenamente de GPR15 confirmaron consistentemente una interacción robusta entre GPR15 y MGST1 a través de experimentos de co-inmunoprecipitación (co-IP) (Fig. 2E-H), una enzima bifuncional localizada en las mitocondrias, el RE y los endosomas (Fig. S5B-S5F suplementaria; ref. ^[28]). Un análisis de IF reveló que la colocalización de GPR15 y MGST1 era distinta de los compartimentos residentes en el Golgi y se atenuó a 4 °C (Fig. 2I). La arquitectura del Golgi se interrumpió farmacológicamente utilizando BFA, lo que disminuyó parcialmente la interacción GPR15-MGST1 (Fig. 2I y J). La fraccionamiento subsellular mostró que los complejos GPR15-MGST1 se localizaron predominantemente en las mitocondrias y, en segundo lugar, en los endosomas (Fig. 2K). Una investigación funcional reveló una relación de estabilización mutua, en la que GPR15 prolongó la estabilidad de la proteína MGST1 al suprimir su degradación lisosomal (Fig. 2L y M), mientras que MGST1 mantuvo recíprocamente a GPR15 localizado en las mitocondrias, como lo evidenció una deficiencia de MGST1 en la que la localización subsellular de GPR15 se desordenó (Fig. 2N). A través del etiquetado de proximidad APEX2 mitocondrial, se demostró que MGST1 enriqueció a GPR15 en las mitocondrias, y el grupo de sobreexpresión saturó la ocupación mitocondrial (Fig. 2O). En conjunto, estos datos establecieron que MGST1 es un navegador espacio-temporal que dirige a GPR15 a las mitocondrias y, por lo tanto, acopla la localización subsellular de GPR15 con la eficacia de la quimiosensibilización a través de redes de estabilización de proteínas específicas de los orgánulos.

La interdependencia funcional de GPR15 y MGST1 se validó aún más a través de análisis de correlación genética y clínica. La pérdida de MGST1 abolió la quimiosensibilización al 5-FU mejorada por GPR15 (Fig. 2P) y confirmó que MGST1 es un cofactor no redundante. Aunque los datos de TCGA no revelaron una asociación significativa entre la expresión de MGST1 por sí sola y la supervivencia del cáncer colorrectal (Fig. S5G suplementaria), una estratificación combinatoria demostró el valor pronóstico de la alta expresión de GPR15 y MGST1, que mostró una mejor OS en comparación con las cohortes de baja expresión (Fig. 2Q, izquierda). Sorprendentemente, dentro de la población MGST1-alta, la elevación de la expresión de GPR15 marcó un subgrupo distinto con resultados de supervivencia significativamente mejorados (Fig. 2Q, derecha), lo que subraya el papel de MGST1 en la determinación de los efectos moduladores del tratamiento de GPR15. Estas observaciones identificaron a MGST1 como un mediador esencial de la quimiosensibilización impulsada por GPR15.

GPR15 promueve la actividad de la red metabólica basada en el metabolismo central del carbono

Luego, nos preguntamos cómo la GPR15 subsellular modulaba la eficacia del 5-FU. El 5-FU es un fármaco antimetabolito (^[29]). Realizamos un perfilado metabolómico no dirigido, que confirmó que el 5-FU indujo una supresión metabólica global en las células de cáncer colorrectal (Fig. S6A suplementaria). Esta supresión se revirtió mediante la sobreexpresión de GPR15, como lo evidenció la elevación de los niveles de los grupos de metabolitos (Fig. S6B suplementaria). Un mapa de calor ilustró aún más estas alteraciones metabólicas (Fig. S6C suplementaria). El enriquecimiento de la vía KEGG reveló que la sobreexpresión de GPR15 activó fuertemente el metabolismo central del carbono (Fig. 3A; Fig. S6D suplementaria). Esta remodelación metabólica amplificó específicamente el metabolismo del serina y el metabolismo de un carbono y las vías de biosíntesis de purinas (Fig. 3A; Fig. S6E-S6J suplementaria) y, por lo tanto, fue una vulnerabilidad terapéutica explotable. Por el contrario, la deficiencia de GPR15 indujo los cambios metabólicos opuestos, en los que el metabolismo central del carbono, la vía de los fosfatos de pentosa y el metabolismo del alanina, aspartato y glutamato se regularon a la baja de manera estable (Fig. S7A y S7B suplementaria). Las vías reguladas al alza por la sobreexpresión de GPR15 apoyaron colectivamente la producción de nucleótidos. Por lo tanto, asumimos que al regular la activación secuencial de los nodos metabólicos, incluido el metabolismo central del carbono, el metabolismo de la serina, el metabolismo del folato y el metabolismo de las purinas, GPR15 saturó los objetivos moleculares del 5-FU con intermedios de nucleótidos excesivos, mejorando así la eficacia del 5-FU (Fig. S7C suplementaria).

Las perturbaciones farmacológicas y metabólicas revelaron que la mejora de la eficacia del 5-FU dependiente de GPR15 dependía críticamente de un metabolismo central del carbono intacto, como lo evidenció la disminución de la quimiosensibilización con el tratamiento con metotrexato y la privación de glucosa (Fig. 3B y C). El rastreo isotópico con glucosa universalmente etiquetada con 13C demostró que la sobreexpresión de GPR15 dirigió preferentemente los carbonos derivados de la glucosa hacia las vías metabólicas de la serina y el metabolismo de un carbono, lo que se evidenció por un aumento de la fracción m3 incorporada en los intermedios clave y la disminución concomitante de las especies no etiquetadas (m0) (Fig. 3D y E; Fig. S8A suplementaria). Cabe destacar que el 2-fosfoglicerato etiquetado corroboró que el metabolismo glucolítico acelerado alimentó los procesos anabólicos posteriores (Fig. 3F). Esta remodelación metabólica amplificó selectivamente la biosíntesis de purinas, y se observó una aceleración metabólica en los grupos de AMP, ADP, ATP, adenosina e inosina monofosfato (IMP) (Fig. 3G; Fig. S8B suplementaria), aunque el metabolismo de las guanosina nucleótidos no se vio afectado (Fig. S8C y S8D suplementaria). Estos hallazgos delinearon un mecanismo regulador específico del punto de ramificación en el que GPR15 aceleró la utilización de glucosa mediante el metabolismo de la serina y el metabolismo de un carbono, lo que promovió la síntesis de IMP y evitó la producción de guanosina nucleótidos. GPR15, al canalizar metabólicamente los carbonos de la glucosa hacia este eje, creó una vulnerabilidad terapéutica que mejoró la actividad antimetabolito del 5-FU contra la biosíntesis de nucleótidos.

GPR15 modula específicamente la abundancia de NAD+/NADH, la acumulación de NAD+ mitocondrial y la reprogramación metabólica

Aunque GPR15 activó la serina y el metabolismo de un carbono, una cuantificación dirigida de las enzimas metabólicas asociadas no reveló una regulación al alza significativa (Fig. S8E y S8F del material suplementario), lo que sugiere que la regulación postraduccional, en lugar del control transcripcional, causó el aumento de los niveles. Una reevaluación metabólica exhaustiva reveló una remodelación metabólica de amplio espectro, junto con una mayor glucólisis, fosforilación oxidativa y acumulación de lípidos, lo que se validó mediante un análisis de flujo extracelular de Seahorse y una tinción con BODIPY-C16 (Fig. 3H e I). Estas adaptaciones coordinadas sugirieron que un nodo regulador unificado orquestó estos cambios metabólicos. Dado el papel central de los pares redox NAD(H)/NADP(H) en la integración metabólica (^[30], ^[31]), identificamos que los niveles de nicotinamida, un precursor de NAD(P), estaban marcadamente elevados en las células que sobreexpresaban GPR15 (Fig. S9A del material suplementario). El perfil redox demostró que la relación NAD+/NADH se amplificó selectivamente mediante la acumulación de NAD+ mediada por GPR15 y el agotamiento de NADH, independientemente de los grupos NADP(H) (Fig. 3J; Fig. S9B–S9E del material suplementario). Crucialmente, el fraccionamiento subcelular confirmó además que GPR15 enriqueció el NAD+ mitocondrial, de manera similar al NAD+ citosólico (Fig. 3K), lo que es consistente con el origen citosólico conocido del NAD+ mitocondrial (^[32]). Es importante destacar que el método LbNOX para aumentar la abundancia intracelular de NAD+ reveló que el NAD+ mitocondrial acumulado mejoró específicamente la eficacia de 5-FU, suprimiendo la viabilidad de las células de cáncer colorrectal, de manera similar a los efectos de GPR15 (Fig. 3L). En conjunto, estos hallazgos identificaron a GPR15 como un reóstato redox que reconfiguró el metabolismo central del carbono controlando espacialmente la homeostasis de NAD+, evitando la regulación clásica de los niveles de enzimas para crear un estado metabólicamente preparado que puede ser aprovechado por la actividad antimetabólica de 5-FU.

La relación entre la dinámica subcelular de GPR15 y la reprogramación metabólica mediada por NAD+ se analizó más a fondo mediante perturbaciones espaciales y genéticas. Tanto la interrupción farmacológica del Golgi (BFA) como la deficiencia de MGST1 abolieron la acumulación mitocondrial de NAD+ impulsada por GPR15 (Fig. 4A y B; Fig. S9F y S9G del material suplementario). Por lo tanto, se demostró que el tráfico restringido a orgánulos es un requisito previo para la acumulación de NAD+ mitocondrial. MGST1, una glutatión transferasa y peroxidasa bifuncional que regula la capacidad oxidativa mitocondrial (^[33]), se identificó como un regulador metabólico crítico, y su deficiencia produjo un colapso metabólico global (Fig. S10A–S10C del material suplementario). Aunque GPR15 todavía activó parcialmente el metabolismo del carbono citosólico en las células deficientes en MGST1, los niveles metabólicos mitocondriales, particularmente los de los intermediarios del ciclo del ácido tricarboxílico, se redujeron selectivamente (Fig. 4C; Fig. S10D y S10E del material suplementario). Un análisis de diagrama de dispersión de las perturbaciones metabólicas reveló que la deficiencia de MGST1 revirtió la redirección del metabolismo de la glucosa mediada por GPR15, lo que normalizó el metabolismo de los carbohidratos al tiempo que preservaba los precursores anabólicos derivados de la glucosa (Fig. 4D–F). En consecuencia, la deficiencia de MGST1 revirtió la mayor glucólisis, fosforilación oxidativa y almacenamiento de lípidos (Fig. 4G y H). En conjunto, estas observaciones sugirieron que MGST1 es un amplificador espacial de los efectos metabólicos mediados por GPR15, que acopla la redistribución subcelular de GPR15 al flujo de NAD+ mitocondrial a través de la regulación específica del compartimento de la utilización de glucosa y el metabolismo oxidativo.

GPR15 se asocia con PARP4 y restringe su actividad enzimática para acumular NAD+ para la reprogramación metabólica

A continuación, nos preguntamos cómo GPR15 aumentó los niveles de NAD+ en el citosol para la reprogramación metabólica posterior. El NAD+ se sintetiza o utiliza mediante varias vías intracelulares (^[31], ^[34]). Nuestro análisis IP-MS identificó a PARP4 como la única enzima moduladora de NAD+ que los miembros de la familia PARP utilizan para la ADP-ribosilación de proteínas (^[35], 36). Los ensayos de co-IP validaron la asociación entre GPR15 y PARP4 (Fig. 5A–C; Fig. S11A del material suplementario), mientras que un análisis de compartimentación subcelular reveló que los grupos de PARP4 citosólicos se colocalizaban parcialmente con GPR15 anclado en el Golgi (Fig. 5D; Fig. S11B del material suplementario). Estos hallazgos indicaron que PARP4 es un reóstato de NAD+ espacialmente restringido, en el que su interacción proximal con el Golgi con GPR15 regula localmente la disponibilidad de NAD+.

Se ha predicho que PARP4 consume NAD+ en la MARilación (^[36]). Descubrimos que la deficiencia de PARP4 elevó los grupos de NAD+ citosólicos al tiempo que redujo los niveles de NADH, aumentando así la relación NAD+/NADH (Fig. S11C del material suplementario). En consecuencia, la deficiencia de PARP4 promovió la reprogramación metabólica, y un análisis de la vía KEGG indicó que el metabolismo central del carbono estaba altamente enriquecido (Fig. S11D y S11E del material suplementario). Es importante destacar que la deficiencia de PARP4 mejoró la eficacia de 5-FU, como lo demostró la reducción de la viabilidad de las células de cáncer colorrectal (Fig. S11F). Estos fenotipos se asemejaron estrechamente a los efectos metabólicos y de quimiosensibilización de la sobreexpresión de GPR15. Sorprendentemente, la acumulación de NAD+ y el agotamiento de NADH impulsados por GPR15 se invirtieron por completo mediante la complementación de PARP4 (Fig. 5E), lo que reveló que GPR15 es un regulador negativo de la actividad enzimática de PARP4. Una validación bioquímica demostró que la MARilación global se atenuó en las células que sobreexpresaban GPR15 (Fig. 5F), y los ensayos de IP específicos de PARP4 confirmaron la reducción de la ribosilación del sustrato (Fig. 5G). Los experimentos de rescate establecieron además que la sobreexpresión de PARP4 contrarrestó la supresión de la MARilación inducida por GPR15 (Fig. 5H). Estos resultados establecieron en conjunto un antagonismo funcional, en el que el complejo GPR15-PARP4 obstaculizó la actividad catalítica de PARP4, secuestrando así el NAD+ y evitando su MARilación para impulsar la reprogramación metabólica.

El perfilado metabolómico no dirigido estableció aún más el papel crítico de PARP4 en la remodelación metabólica impulsada por GPR15. Un análisis de diagrama de dispersión demostró que la sobreexpresión de PARP4 revirtió ampliamente los cambios metabólicos inducidos por GPR15 (Fig. 5I) y las vías del metabolismo del carbono y las purinas que se enriquecieron con la sobreexpresión de GPR15 disminuyeron por debajo de las 20 vías principales (Fig. 5J y K). Una validación funcional basada en un análisis de flujo extracelular confirmó que PARP4 normalizó la mayor glucólisis y fosforilación oxidativa de GPR15 (Fig. 5L). Esta dependencia funcional se extendió a los resultados terapéuticos, en los que la sobreexpresión de PARP4 atenuó parcial pero significativamente la quimiosensibilidad potenciada por GPR15 a 5-FU (Fig. 5M). Los análisis de correlación clínica revelaron implicaciones pronósticas matizadas que sugirieron que la alta expresión de GPR15 y PARP4 se correlacionó con mejores resultados de supervivencia en comparación con las cohortes con baja expresión de GPR15 y PARP4, aunque PARP4 solo exhibió asociaciones de supervivencia dependientes del contexto (Fig. 5N; Fig. S11G del material suplementario). En conjunto, estos hallazgos identificaron a PARP4 como un regulador metabólico en la quimiosensibilización mediada por GPR15, que opera a través de la regulación centrada en NAD+ del flujo anabólico.

La maquinaria proteica basada en GPR15 y la reprogramación metabólica posterior dependen de Gαq

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de la membrana endosomal se regulan clásicamente a través de interacciones con subunidades Gα específicas, en particular Gαi (^[37]–^[39]). Se ha informado que GPR15 activa la señalización del calcio a través de las vías Gαi y Gαq (^[17], ^[40]). Un ensayo de reportero de luciferasa indicó que GPR15 se asoció con Gαi y Gαq en las células de cáncer colorrectal (Fig. 6A; Fig. S12A del material suplementario); sin embargo, la inhibición de Gαq, pero no de Gαi u otras proteínas G, revirtió la mayor eficacia de 5-FU impulsada por GPR15 (Fig. 6B; Fig. S12B del material suplementario). La actividad de Gαq se abolió mediante una forma truncada de C-terminal de Gαq (Gαq-CT; ref. ^[41]), lo que interrumpió la localización de GPR15 en el Golgi (Fig. 6C) y desestabilizó su interactoma, con GPR15 disociándose de MGST1 (Fig. 6D). Esto revirtió la estabilización de MGST1 mediada por GPR15 (Fig. 6E) y normalizó la acumulación de NAD+ mitocondrial (Fig. 6F). En consecuencia, se confirmó que Gαq es un organizador espacial del eje GPR15-PARP4-MGST1, que el anclaje dependiente de Gαq en el Golgi promovió la redistribución del flujo de NAD+ a través de interacciones proteicas compartimentadas.

Para dilucidar el papel de Gαq en la reprogramación metabólica mediada por GPR15, la actividad de Gαq se inhibió mediante el constructo Gαq-CT, lo que produjo perturbaciones metabólicas de amplio espectro, incluida la supresión del metabolismo central del carbono (Fig. S12C del material suplementario). Un análisis de la vía KEGG reveló una atenuación profunda de la reprogramación metabólica impulsada por GPR15 tras la inhibición de Gαq, con reducciones marcadas en el metabolismo central del carbono y las vías de salvamento de nicotinamida (Fig. 6I y J; Fig. S12D del material suplementario). Un análisis detallado del cambio en los metabolitos reveló que la inhibición de Gαq normalizó los niveles de 33 metabolitos elevados por GPR15 (Fig. 6K), incluidos el metabolismo de los ácidos grasos, las cascadas de glucólisis y fosforilación aeróbica, y los ciclos de serina, metionina y glicina, todos nodos clave de la red metabólica de GPR15. Sorprendentemente, la agrupación jerárquica demostró que Gαq fue el integrador central de los efectos metabólicos de GPR15 coordinando la redistribución del flujo de carbono a través del metabolismo de un carbono impulsado por la serina. Estos hallazgos establecieron en conjunto que la reprogramación metabólica impulsada por GPCR de la membrana endosomal, iniciada por la amplificación del flujo de NAD+ mediada por Gαq, impulsó la sinergia de quimiosensibilización entre GPR15 y 5-FU en el cáncer colorrectal.

Rucaparib, un inhibidor de PARP disponible clínicamente, exhibió efectos sinérgicos con 5-FU en la reprogramación metabólica y el tratamiento del cáncer colorrectal

Basándonos en estas ideas mecanísticas sobre GPR15 de la membrana endosomal, exploramos estrategias de traslación para explotar el potencial de quimiosensibilización de GPR15. Un análisis de minería de scRNA-seq de pacientes con cáncer colorrectal reveló el agotamiento selectivo de las células epiteliales GPR15+ tras la quimioterapia (Fig. S13A y S13B del material suplementario). Un análisis de qPCR de tejido tumoral emparejado de pacientes, no tratado previamente (biopsia) y postratamiento (resección quirúrgica) tras la quimioterapia basada en 5-FU también mostró una regulación a la baja significativa de GPR15 en los tres pacientes examinados (Fig. S13C del material suplementario). Esta observación sugirió que las poblaciones GPR15+ exhibieron una mayor sensibilidad a 5-FU in vivo. Esta observación clínica se alineó con nuestros hallazgos in vitro y nos motivó a evaluar la suplementación con NAD+ como terapia de combinación para amplificar la eficacia de 5-FU. Dado que GPR15 mejoró la quimiosensibilidad a través de la reprogramación metabólica dependiente de NAD+, hipotetizamos que el aumento farmacológico de los niveles de NAD+ tendría efectos similares a los de la activación de GPR15, lo que ofrecería un medio alternativo para tratar tumores con una deficiencia intrínseca de GPR15.

Para evaluar los efectos terapéuticos de promover la quimiosensibilización mediada por NAD+, analizamos el precursor de NAD+, el mononucleótido de nicotinamida (NMN), y los inhibidores de PARP aprobados clínicamente, incluidos niraparib, rucaparib y olaparib (^[42]), en combinación con 5-FU. Aunque el NMN no mostró citotoxicidad discernible, los inhibidores de PARP suprimieron la viabilidad de las células de cáncer colorrectal de forma dependiente de la dosis, y rucaparib y olaparib demostraron una mayor potencia en modelos con sobreexpresión de MGST1 (Figura S14A del Material Suplementario). Excepto por el NMN, el cotratamiento a corto plazo (48 horas) reveló una modesta sinergia entre los inhibidores de PARP y el 5-FU (Figura S14B del Material Suplementario). Sorprendentemente, tras una exposición prolongada, rucaparib mostró una robusta sinergia, manteniendo una quimiosensibilización sostenida del 5-FU independientemente del estado de MGST1 (Figura S14C del Material Suplementario). Esta interacción sinérgica se validó además cuantitativamente mediante el análisis de CompuSyn (Figura S14D del Material Suplementario). La sinergia terapéutica entre rucaparib y 5-FU se observó de forma consistente en múltiples modelos preclínicos, incluidos los PDO (Figura 7A), los xenoinjertos HCT-8 (Figuras 7B–D) y un modelo PDX (Figuras 7E–G). Estos hallazgos establecieron la inhibición de PARP como un medio viable para amplificar la eficacia del 5-FU en el cáncer colorrectal, y rucaparib surgió como un candidato principal para la traslación clínica.

El perfil transcriptómico de los tumores tratados reveló distintas respuestas adaptativas. La monoterapia con 5-FU indujo cambios transcriptómicos profundos, mientras que rucaparib solo provocó cambios sutiles, a pesar de la modesta pero significativa reducción del volumen tumoral que se logró con su uso. Sorprendentemente, el tratamiento combinado con 5-FU y rucaparib desencadenó una remodelación transcriptómica sinérgica, con firmas de expresión génica únicas distintas de cualquier monoterapia, lo que sugirió que rucaparib amplificó selectivamente los efectos moleculares del 5-FU en lugar de ejercer su propia actividad (Figura 7H). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes demostró además que la terapia combinada suprimió tanto la biogénesis de ribosomas como las vías metabólicas mitocondriales (Figura 7I), lo que recapitula la firma de vulnerabilidad metabólica observada en los PDO con sobreexpresión de GPR15 cuando se trataron con 5-FU. Esta observación contrastó marcadamente con los patrones de resistencia adquirida en los tumores tratados crónicamente con 5-FU, en los que la aparición de una reactivación adaptativa de la síntesis de proteínas ribosomales y el metabolismo mitocondrial indicó una adaptación farmacológica (Figuras S14E y S14F del Material Suplementario). La dicotomía entre la sinergia aguda y la resistencia crónica subrayó la necesidad de un tratamiento combinado con 5-FU y rucaparib para prevenir el desarrollo de vías de supervivencia adaptativas con mecanismos compensatorios que promueven el tumor.

La mejora impulsada por GPR15 del metabolismo central del carbono y la reprogramación metabólica asociada (Figura 3) se correlacionó con la activación de la biogénesis de ribosomas (Figura 1D), mientras que la monoterapia con 5-FU en tumores resistentes a la quimioterapia implicó predominantemente la fosforilación oxidativa mitocondrial (Figura S14F del Material Suplementario). Esta dicotomía sugirió que la eficacia sinérgica del tratamiento combinado surgió de la participación de vías metabólicas distintas en lugar de efectos de monoterapia superpuestos. Un análisis KEGG reveló que el metabolismo de un carbono mediado por folato se enriqueció de forma única en la terapia combinada en comparación con el 5-FU solo (Figura 7J), lo que indica un estado metabólico reconfigurado (Figura S14G del Material Suplementario). El perfilado metabolómico no dirigido demostró que, aunque las monoterapias con 5-FU y rucaparib indujeron diferentes respuestas transcripcionales, sus alteraciones metabólicas convergieron en vías compartidas (Figuras S15A–S15D del Material Suplementario). De manera crucial, la terapia combinada identificó 18 metabolitos enriquecidos en el flujo de glucosa, el metabolismo del serina y el metabolismo del carbono y la biosíntesis de purinas (Figura S15E del Material Suplementario) que estaban ausentes en los grupos de monoterapia. Un análisis jerárquico de las vías confirmó que el metabolismo central del carbono fue la vía enriquecida de mayor rango exclusivamente en los tumores tratados con la combinación (Figura 7K; Figuras S15B y S15C del Material Suplementario), lo que es consistente con la firma metabólica mediada por GPR15. Estos datos establecieron que la preparación metabólica mediante la amplificación del flujo central del carbono, ya sea a través de la intervención genética (GPR15) o farmacológica (rucaparib), fue un determinante crítico de la respuesta al 5-FU. En conjunto, estos hallazgos posicionaron a los inhibidores de PARP aprobados clínicamente, en particular rucaparib, como potentes quimiosensibilizadores que pueden superar la resistencia intrínseca y adaptativa al 5-FU en el cáncer colorrectal.

Discusión

La activación de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) se ha considerado tradicionalmente como un proceso dependiente de ligandos iniciado por estímulos extracelulares. Sin embargo, la evidencia acumulada demuestra que muchos GPCR participan en múltiples ligandos endógenos de forma dependiente del contexto para regular diversas funciones fisiológicas y patológicas (^[41], ^[43]–^[45]). Aunque los GPCR activados suelen sufrir internalización seguida de degradación lisosomal o reciclaje endosomal, un subconjunto de GPCR de la membrana endomembrana exhibe una señalización sostenida a partir de compartimentos intracelulares, como se observa en los receptores opioides residentes en el Golgi que median una señalización dependiente de Gαi distinta de sus contrapartes de la membrana plasmática (MP) (^[3], ^[37], ^[39]). Esta diversificación funcional espacial plantea una pregunta fundamental: ¿Cómo se activan los grupos de GPCR intracelulares sin una señalización canónica de la MP? Aquí, el receptor de quimiocinas atípico GPR15 ejemplificó esta complejidad. Originalmente identificado como un correceptor del VIH con actividad en la MP (^[10]), GPR15 exhibe un tráfico intracelular dinámico entre los compartimentos del Golgi y las mitocondrias. Aunque los primeros estudios localizaron un subconjunto de GPR15 en los endosomas (^[9]), su importancia funcional siguió sin estar clara. Nuestro trabajo reveló que GPR15 anclado en el Golgi se localiza en las mitocondrias de forma dependiente de Gαq, donde MGST1 localizado en las mitocondrias media el metabolismo de NAD+ para mejorar la quimiosensibilidad del 5-FU en las células de cáncer colorrectal. En particular, Gαq regula la fidelidad espacial del eje Golgi-mitocondria sin influir en la internalización basal, un proceso probablemente mediado por otras proteínas G, como Gαi. De manera crucial, MGST1 dirige la translocación subcelular de GPR15 a través de un modo de activación independiente de ligandos. Estos hallazgos redefinen GPR15 como un centro de señalización espacial con interactomas específicos del compartimento, en el que los grupos de MP median la modulación inmunitaria a través de C10orf99 (^[40]), mientras que los grupos intracelulares orquestan la reprogramación metabólica a través del cruce MGST1-NAD+. Esta arquitectura de señalización bifurcada proporciona un marco para conciliar las funcionalidades de los GPCR dependientes del contexto en los sistemas fisiológicos.

Nuestro estudio demostró que GPR15 orquestó la comunicación interorganelar formando complejos dinámicos con PARP4 y MGST1, lo que impulsó la reprogramación metabólica mediada por NAD+ para mejorar la quimiosensibilización del 5-FU en el cáncer colorrectal. Específicamente, nuestro estudio identificó que GPR15 se asoció con PARP4 en regiones similares al Golgi, suprimiendo la actividad enzimática de PARP4 que, de otro modo, induciría la acumulación de NAD+ en el citosol, un requisito previo para alimentar el metabolismo central del carbono. Este hallazgo subrayó el papel del aparato de Golgi como un centro metabólico crítico, ampliando sus funciones conocidas en la modificación de lípidos para la regulación directa de las redes bioenergéticas (^[46], ^[47]). Además, el aparato de Golgi se encuentra cerca de las mitocondrias, lo que facilita el transporte de ATP mitocondrial al aparato de Golgi (^[48]), mientras que el PI(4)P derivado del Golgi se transporta a las mitocondrias para impulsar la división mitocondrial (^[49]). Estos estudios anteriores han sugerido las importantes, aunque poco claras, vías por las que el aparato de Golgi modula las funciones mitocondriales, particularmente el metabolismo mitocondrial. Nuestro estudio identificó la maquinaria de GPR15 como una conexión importante en la comunicación entre el aparato de Golgi y las mitocondrias, en la que MGST1 guía la translocación de GPR15 a las mitocondrias, posiblemente a través de vías de tráfico endosomal. GPR15 redujo la actividad de PARP4, lo que provocó la acumulación de NAD+, lo que permitió el transporte de NAD+ para mantener el metabolismo oxidativo mitocondrial. Además, la unión GPR15-MGST1 protegió a MGST1 de la degradación lisosomal, reforzando la conectividad organelar. Esta asociación compartimentada, en la que GPR15 reclutó distintos socios de unión, incluido PARP4 en el Golgi y MGST1 en las mitocondrias, estableció un código espacial para la regulación metabólica. En particular, los metabolitos específicos también son ligandos importantes para los GPCR de la membrana endomembrana (^[50]), lo que indica que los metabolitos intracelulares en sí mismos pueden actuar como señales de activación espacial; esto podría abordarse mediante estudios adicionales. Nuestro trabajo posiciona a los GPCR de la membrana endomembrana como arquitectos de la plasticidad metabólica, abriendo nuevas vías para dirigir las topologías de señalización subcelular en la terapia contra el cáncer.

Nuestro estudio también enfatizó la importancia de GPR15 de la membrana endomembrana para potenciar la eficacia del 5-FU en el cáncer colorrectal. Se han desarrollado múltiples terapéuticos para inhibir el crecimiento de las células cancerosas y restringir la progresión tumoral; sin embargo, gradualmente exhiben una eficacia reducida debido a la adaptación farmacológica por parte de las células tumorales que recuperan el crecimiento de las células cancerosas (^[51]). En el cáncer colorrectal, aunque los regímenes de doble y triple basados en 5-FU (por ejemplo, FOLFOX y FOLFIRI) han mejorado inicialmente los resultados, su utilidad clínica se ha visto limitada por las toxicidades limitantes de la dosis y la resistencia adquirida, con una mediana de supervivencia general (OS) que se estabiliza por debajo de los 2 años (^[27]). Las actualizaciones recientes de las guías clínicas chinas ahora advierten contra los regímenes triples de rutina debido a los beneficios de supervivencia marginales y los eventos adversos exacerbados en el cáncer metastásico (^[52]). Esto subraya la urgente necesidad de evitar la adaptación farmacológica utilizando nuevos mecanismos. La reprogramación metabólica, en particular la regulación de la actividad del metabolismo de un carbono y las purinas, ha surgido como una característica del cáncer colorrectal (^[53]). Nuestro trabajo demostró que GPR15 secuestró esta vulnerabilidad al hiperactivar el metabolismo central del carbono a través de un flujo de serina y un carbono impulsado por NAD+, creando una dependencia sintal letal de la actividad antimetabólica del 5-FU. Específicamente, GPR15 promovió la biogénesis de ribosomas y mejoró la biosíntesis de nucleótidos impulsada por el metabolismo central del carbono en condiciones basales. Sin embargo, tras el tratamiento con 5-FU, este programa proanabólico fue subvertido por los grupos de NAD+ amplificados por GPR15 que hiperactivaron el flujo de serina y un carbono, inundando la síntesis de ADN y ARN con metabolitos de 5-FU al tiempo que desestabilizaban el ensamblaje de ribosomas. Por lo tanto, la preparación metabólica se convirtió en una vulnerabilidad terapéutica. Esta preparación metabólica se validó clínicamente con los inhibidores de PARP (por ejemplo, rucaparib) como potentes quimiosensibilizadores del 5-FU. Al amplificar el flujo de NAD+ mediado por GPR15, rucaparib cooptó las mismas adaptaciones metabólicas que los tumores utilizan para la supervivencia, convirtiéndolas en su talón de Aquiles. En particular, este enfoque contradice el paradigma tradicional de "solo inhibición" y, en cambio, demostró que la modulación de la activación de la señalización procrecimiento, cuando se sincroniza estratégicamente, puede crear ventanas terapéuticas que mejoren la citotoxicidad. Nuestros hallazgos redefinen el enfoque metabólico en la oncología al posicionar las redes de GPCR espaciales como reguladores maestros de la respuesta a la quimioterapia.

Nuestro estudio demostró que, aunque GPR15 promovía moderadamente la proliferación de las células cancerosas, simultáneamente mejoraba la eficacia quimioterapéutica del 5-FU en el cáncer colorrectal. Estos efectos contradictorios proporcionaron una base mecánica para la asociación entre la alta expresión de GPR15 y el mejor pronóstico del paciente. Más allá de sus efectos autónomos a nivel celular, GPR15 puede modular aún más la progresión del cáncer colorrectal a través de interacciones con el microambiente tumoral-inmune, particularmente a través de su función establecida como quimioatrayente para subconjuntos específicos de células T. En el cáncer colorrectal, GPR15 exhibe una ambivalencia funcional en la inmunología tumoral al facilitar el reclutamiento de células Treg y, al mismo tiempo, contribuir a la activación de las células T CD8+. Esta complejidad se refleja en el 5-FU, que ejerce efectos inmunomoduladores dependientes del contexto. Aunque el 5-FU mejora la citotoxicidad de las células T, se ha demostrado que los ciclos repetidos causan el agotamiento de las células T CD8+ (^[54], ^[55]). La evidencia clínica destaca aún más estos efectos contrastantes del régimen de primera línea de 5-FU, oxaliplatino y bevacizumab, que demostró reducir las células supresoras mieloides granuloíticas (gMDSC) y las células Treg, al tiempo que aumentaba la frecuencia de las células Th17. Cabe destacar que el uso de anticuerpos anti-PD-1 contrarrestó la inmunosupresión mediada por gMDSC en este contexto (^[56]). En conjunto, estos hallazgos sugirieron que dosis moderadas, en lugar de altas, de 5-FU pueden apoyar de manera óptima la inmunidad antitumoral. Dada nuestra observación de que la alta expresión de GPR15 en las células de cáncer colorrectal aumentaba la sensibilidad al 5-FU, la administración calibrada de 5-FU en tumores con alta expresión de GPR15 puede mejorar simultáneamente la respuesta a la quimioterapia y favorecer un microambiente inmunopermisible. Investigaciones adicionales podrían examinar la combinación de la quimioterapia basada en 5-FU a baja dosis con agentes anti-PD-1/PD-L1 en el cáncer colorrectal con sobreexpresión de GPR15. Aunque la experiencia clínica con rucaparib en el cáncer colorrectal sigue siendo limitada, los ensayos en fase temprana en cáncer de mama, ovario y próstata indicaron su potencial para proporcionar efectos terapéuticos sinérgicos con la inmunoterapia (^[57]–^[59]). Se ha demostrado que los inhibidores de PARP aumentan la expresión de PD-L1, un mecanismo de resistencia inmune adaptativa que sensibiliza los tumores al bloqueo anti-PD-L1, como se ha demostrado en múltiples modelos preclínicos (^[54], ^[60], ^[61]). Además, la inhibición de PARP y el 5-FU activan la vía cGAS-STING, que es esencial para iniciar la inmunidad antitumoral (^[54], ^[62], ^[63]). Por lo tanto, la combinación de rucaparib con 5-FU puede activar de forma cooperativa la señalización de cGAS-STING, lo que podría mejorar la eficacia de la inmunoterapia en el cáncer colorrectal. En conjunto, los datos clínicos existentes, los estudios mecanicistas y nuestros hallazgos identificaron a rucaparib y, en términos más amplios, la modulación de GPR15 como un medio prometedor para mejorar la quimiosensibilidad tumoral intrínseca y potenciar los resultados positivos de la inmunoterapia en el cáncer colorrectal.

En resumen, nuestro trabajo dilucidó un mecanismo espacialmente orquestado en el que GPR15 de la membrana endosomal, guiado por Gαq, ensambló interactomas distintos con PARP4 en el aparato de Golgi y MGST1 en las mitocondrias, estableciendo autopistas metabólicas interorganelares. Esta redistribución dinámica promovió la amplificación del flujo de NAD+ específico del compartimento, un proceso que hiperactivó el metabolismo central del carbono y, al mismo tiempo, potenció la letalidad sintética al 5-FU a través de la toxicidad impulsada por los metabolitos. El correlato traslacional de este hallazgo, el régimen sinérgico de 5-FU y rucaparib, ejemplifica cómo el tráfico de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) a nivel subcelular puede ser cooptado farmacológicamente para convertir la plasticidad metabólica en una vulnerabilidad terapéutica (Fig. 7L). Nuestros hallazgos redefinen los GPCR de la membrana endosomal como arquitectos de la adaptación metabólica, ofreciendo una hoja de ruta para dirigir las redes de comunicación entre orgánulos en la oncología de precisión.