Las estatinas lipofílicas reducen los niveles de GPX4 para promover la ferroptosis y sensibilizar las células cancerosas al bloqueo de los puntos de control inmunitario.

Las estatinas inhiben la etapa limitante de la vía de síntesis del colesterol: la conversión de β-hidroxi-β-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) en mevalonato mediante la HMG-CoA reductasa (HMGCR). Además de su función como fármacos ampliamente prescritos y aprobados por la FDA para reducir el colesterol, las estatinas también se han investigado como agentes anticancerígenos. El mevalonato y sus metabolitos posteriores pueden promover el crecimiento tumoral, y se ha demostrado que las estatinas inducen la muerte de las células tumorales, reducen el riesgo de cáncer, disminuyen el grado y la etapa del cáncer en el momento del diagnóstico y reducen el riesgo de recurrencia [^[1]–^[6]]. A través de un cribado combinatorio de fármacos de alto rendimiento y selectivo por genotipo, identificamos previamente la simvastatina como un candidato terapéutico para los melanomas con mutaciones en RAS [^[7]]. También demostramos que la simvastatina actúa de forma sinérgica con la inhibición de la vía MAPK en los melanomas al inhibir la isoprenilación y la señalización de AKT y Hippo dependiente de RAS [^[8]]. Sin embargo, otros informes sobre la actividad anticancerígena de las estatinas varían entre los diferentes tipos de cáncer y las estatinas específicas, por lo que sigue siendo necesario obtener más información sobre los mecanismos por los cuales las estatinas atacan a los tumores y a sus microambientes.

La ferroptosis es una modalidad de muerte celular regulada dependiente del hierro y de la peroxidación de lípidos que es morfológica, bioquímica y genéticamente distinta de la apoptosis y otras formas de necrosis programada [^[9]]. Desde el descubrimiento de la ferroptosis, algunos estudios han demostrado que las estatinas la inducen en las células cancerosas, mientras que otros informan lo contrario [^[10]–^[14]]. Se han propuesto múltiples mecanismos para la regulación de la ferroptosis por las estatinas, tanto en estados cancerosos como no cancerosos, incluido el aumento de los niveles de GSH, GPX4 y SLC7A11 (antiporter de cistina/glutamato xCT) [^[15]]. Para definir mejor la actividad anticancerígena de las estatinas, investigamos la capacidad de las siete estatinas más comúnmente prescritas para inducir la muerte celular y la ferroptosis en líneas celulares de melanoma y cáncer colorrectal.

Demostramos que, en el melanoma humano, la disminución de la expresión de los genes de la vía del mevalonato se correlaciona con una mayor infiltración de células T CD8+ y una mejor respuesta a la inmunoterapia. Mostramos que las estatinas lipofílicas promueven uniformemente la ferroptosis al disminuir GPX4, el principal supresor enzimático de la ferroptosis, de forma dependiente del mevalonato. GPX4 es una proteína que contiene selenocisteína y su síntesis depende de la isopentilación del tRNA [Ser]Sec derivada del mevalonato por TRIT1 [^[16]–^[17]]. En consecuencia, los perfiles transcripcionales de las células cancerosas tratadas con estatinas y el inductor de ferroptosis RSL3, que inhibe GPX4, muestran una notable superposición. En modelos murinos de melanoma y cáncer colorrectal, la simvastatina estimula las respuestas inmunitarias antitumorales por sí sola y mejora las respuestas a la inmunoterapia con α-PD1, acompañado de un aumento de la peroxidación de lípidos intratumoral. En conjunto, estos hallazgos amplían nuestra comprensión de la base molecular de la actividad anticancerígena de las estatinas e identifican a las estatinas como una clase de medicamentos existente con el potencial de aumentar las respuestas a la inmunoterapia.

Materiales y métodos

Cultivo celular

La línea celular de melanoma murino YUMMER1.7 (YR1.7) (RRID: CVCLA2AX) se estableció en nuestro laboratorio según lo descrito previamente en 2017 [^[18]]. Las líneas celulares de melanoma derivadas de pacientes YUSIK (RRID: CVCLB487), YUCOT (RRID: CVCLJ066) y YUGASP (RRID: CVCLJ520) se establecieron según lo descrito previamente y fueron un regalo de la Dra. Ruth Halaban y Antonietta Bacchiocchi (Universidad de Yale, 2022) [^[19]]. La línea celular de cáncer colorrectal murino MC38 (RRID: CVCLB288) se obtuvo del repositorio de tumores NIH NCI DCTD en 2018. Todas las líneas celulares resultaron negativas para la contaminación por micoplasma y se utilizaron dentro de las 15 pases después de la descongelación. Las líneas celulares no se autenticaron. YUSIK se estableció a partir de una lesión metastásica en etapa IV en el muslo derecho de una paciente de 49 años y YUCOT se estableció a partir de una lesión metastásica en etapa IV en el cuello derecho de una paciente de 33 años, ambas con mutaciones en BRAF. YUGASP se estableció a partir de una lesión metastásica en etapa IV en la región pretibial derecha de la pierna de una paciente de 88 años con una mutación en RAS_. Las muestras de tumor se recolectaron con el consentimiento informado por escrito del paciente de acuerdo con las regulaciones de la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico (HIPAA) y el protocolo del Comité de Investigación Humana. Todos los estudios que involucran tejido humano se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas éticas reconocidas, incluida la Declaración de Helsinki, CIOMS, el Informe Belmont y la Regla Común de los EE. UU., y fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB #0609001869) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yale. Las líneas celulares murinas se cultivaron en DMEM/F12 (ThermoFisher, #A4192001), mientras que las líneas celulares derivadas de pacientes se cultivaron en OptiMEM (ThermoFisher, #31985070). Ambos se complementaron con 10% de FBS, 1% de aminoácidos no esenciales MEM (ThermoFisher, #11140050) y 1% de penicilina/estreptomicina (ThermoFisher, #15140163) y se mantuvieron en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.

Viabilidad celular

Las células se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 80% y luego se recolectaron mediante tripsinización y se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos a una densidad de 10 000 células por pocillo y se dejaron adherir durante al menos 6 horas antes del tratamiento. Después de 24 horas de tratamiento, las células se incubaron durante 4 horas a 37 °C con Aquabluer (Boca Scientific, #6015) y la intensidad de la fluorescencia se midió a 540ex/590em mediante un lector de microplacas de la serie SpectraMax y se normalizó con el promedio de los pocillos de control. Los siguientes tratamientos se utilizaron a lo largo del estudio: atorvastatina, según se indica o IC50 determinado experimentalmente (YR1.7: 200 μM, MC38: 100 μM; Cayman Chemical, #10493), fluvastatina, según se indica o IC50 (YR1.7: 250 μM, MC38: 50 μM; Cayman Chemical, #10010334), lovastatina, según se indica o IC50 (YR1.7: 750 μM, MC38: 500 μM; Cayman Chemical, #10010338), pitavastatina, según se indica o IC50 (YR1.7: 500 μM, MC38: 250 μM; Cayman Chemical, #15414), pravastatina, según se indica (Cayman Chemical, #10010342), rosuvastatina, según se indica (Cayman Chemical, #12029), simvastatina, según se indica o IC50 (YR1.7: 75 μM, MC38: 50 μM; Cayman Chemical, #10010344), ferrostatin-1, 50 μM (Cayman Chemical, #17729), liproxstatin-1, 2 μM (Cayman Chemical, #17730), α-tocoferol vitamina E, 50 μM (Cayman Chemical, #25985), necrostatin-1, 50 μM (Cayman Chemical, #11658), Z-VAD(OMe)-FMK, 50 μM (Cayman Chemical, #14463), cloroquina, 50 μM (Cayman Chemical, #14194), 4-fenilbutirato, 1,5 mM (Cayman Chemical #11323), MVA, 500 μM (Sigma Aldrich, #50838), CoQ10, 50 μM (Cayman Chemical, #11506), escualeno, 50 μM (Cayman Chemical, #27058), colesterol, 50 μM (Cayman Chemical, #9003100), 7DHC, 50 μM (Cayman Chemical, #14612), pioglitazona, 50 μM (Cayman Chemical, #71745) y RSL3, 10 μM o según se indica (Cayman Chemical, #19288). MVA, CoQ10, escualeno, colesterol, 7DHC y pioglitazona se administraron como pretratamientos durante 12 horas antes del tratamiento con estatinas.

Citometría de flujo

Las células se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 80% y luego se recolectaron mediante tripsinización y se sembraron en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos y se dejaron adherir durante al menos 6 horas antes del tratamiento. Después de 18 horas de tratamiento, las células se recolectaron y se resuspendieron en PBS estéril antes de someterse a la siguiente tinción con 10 μM de Liperfluo (Dojindo, #L-248-10) durante 30 minutos a 37 °C. Después de la tinción, las células se lavaron 3 veces con PBS, se analizaron en el canal FITC de un citómetro de flujo LSRII y se normalizaron con la intensidad de fluorescencia media de las muestras de control. Los tumores se recolectaron 12 días después del inicio del desafío tumoral y se disociaron en tampón de disociación, rotando a 37 °C durante 30 minutos, se pasaron a través de un filtro de 70 μM, se trataron con tampón de lisis ACK (ThermoFisher, #A1049201), se apagaron con RPMI y 10% de FBS y se lavaron en PBS estéril. El tampón de disociación consistió en RPMI (ThermoFisher, #11875101), colagenasa (Sigma-Aldrich, #C5138) y 1x DNasa (Qiagen, #79254). Luego, las células se tiñeron con CD45 (Biolegend, #103155) y Liperfluo (descrito anteriormente) durante 30 minutos a 37 °C, se lavaron 3 veces con PBS, se analizaron en un citómetro de flujo LSRII utilizando la población CD45− como un indicador de las células tumorales y se normalizaron con la intensidad de fluorescencia media de las muestras de control.

Cuantificación de metabolitos

El contenido de glutatión (Cayman Chemical, #600360) y hierro (BioAssay Systems, #DIFE-250) en aproximadamente 1,2 × 106 células por muestra se midió utilizando kits de detección basados en células según los protocolos del fabricante. El contenido de MDA en células y tumores se midió utilizando un kit de ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) (Cayman Chemical, #10009055). Aproximadamente 1,2 × 106 células o 25 mg de tejido tumoral (recolectado 12 días después del inicio del desafío tumoral) se homogeneizaron en 250 μL de tampón RIPA que contiene inhibidores de proteasas. Los homogenados de tejido se centrifugaron a 1600 g durante 10 minutos y se utilizaron 100 μL de sobrenadante para el análisis de MDA. Para la cuantificación in vitro de glutatión, hierro y MDA, las estatinas se administraron a una dosis de 50 μM durante 18 horas.

Experimentos con ratones

Todos los protocolos de los experimentos con animales se siguieron de acuerdo con las pautas del Comité de Apoyo a la Investigación de Animales de la Universidad de Yale. Se compraron ratones machos C57BL/6J de 7 semanas (IMSR_JAX:000664) en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se les permitió aclimatarse durante al menos una semana antes de su uso. Para el desafío tumoral, las células YR1.7 y MC38 se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 80%, se recolectaron mediante tripsinización, se lavaron en PBS estéril y se contaron. Se inyectaron 500 000 células en 100 μL de PBS estéril en el flanco posterior afeitado de cada ratón utilizando una aguja de 27G. Las mediciones del tumor mediante calibradores digitales comenzaron 7 días después del desafío tumoral y se repitieron cada 3 a 4 días. Se registraron las mediciones de longitud, ancho y altura, y se calculó el volumen tumoral como 0,5233 × longitud × ancho × altura. Los ratones se sacrificaron cuando su tumor alcanzó los 1000 mm3 o se ulceró. Las jaulas se asignaron aleatoriamente al grupo de tratamiento después del desafío tumoral. Se administraron 10 mg/kg de α-PD1 (RMP1–14, Bio X Cell, #BE0146) o anticuerpo de control de isotipo ratón IgG2a (Bio X Cell, #BE0089) mediante inyección intraperitoneal (IP) cada 3 a 4 días, comenzando 7 días después del desafío tumoral inicial. Se administraron 10 mg/kg de simvastatina diariamente mediante inyección IP durante 14 días, comenzando 7 días después del desafío tumoral inicial.

Secuenciación de ARN masivo

Aproximadamente 8 × 106 células por muestra se trataron con 10 μM de RSL3 o 100 μM de simvastatina durante 18 horas. Luego, las células se recolectaron mediante tripsinización, se lavaron y se aisló el ARN utilizando el kit RNeasy, complementado con QIAshredder y tratamiento con DNasa (Qiagen). La concentración y el tamaño de los fragmentos de ARN se evaluaron para el control de calidad utilizando BioAnalyzer o Agilent TapeStation, luego se realizó la preparación de la biblioteca y se secuenció utilizando Ilumina 97 HiSeq4000 por el Centro de Genómica de Células Madre de Yale. Las lecturas se alinearon utilizando STAR244 (v2.7.9) a mm10. Brevemente, los recuentos se normalizaron al tamaño de la biblioteca utilizando cpm() y el análisis de expresión diferencial se calculó mediante la estadística del test exacto utilizando exactTest() de forma por pares. Se realizó la normalización de la media recortada de los valores M (TMM) durante el análisis de expresión diferencial con edgeR (v4.36.0). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó utilizando software de escritorio (v4.2.3) en listas preclasificadas, calculadas por sign (logFC) * −log10(pval); y los conjuntos de genes HALLMARK de MSigDB (v2022.1) [^[20]–^[21]].

Análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq)

Analizamos los datos publicados de secuenciación de ARN de una sola célula obtenidos de muestras de tumores de melanoma humano, correspondientes al estudio de Pozniak et al. [^[22]]. El conjunto de datos incluyó tumores disociados, junto con su microambiente inmunitario, de pacientes tratados con bloqueo de puntos de control inmunitario, muestreados antes del tratamiento (BT) y durante el tratamiento (OT), y estratificados según el estado de respuesta (respondedores frente a no respondedores). Los datos se procesaron utilizando Seurat v5.3.0 en R v4.4.1 (RStudio v2023.06.0+421) [^[23]]. Para evaluar la expresión de los genes de la vía del mevalonato, calculamos una puntuación de módulo utilizando los genes clave de la vía: MVK, MVD, FDPS y FDFT1. Los valores de expresión génica se escalaron restando la media y dividiendo por la desviación estándar para cada gen en todas las células, y la puntuación de expresión compuesta de la vía del mevalonato para cada célula se definió como la media de estos valores escalados. Las células tumorales de melanoma se identificaron utilizando un panel de marcadores establecidos (MITF, PMEL, TYR, DCT, MLANA, S100B), y se calculó una puntuación de melanoma de manera similar para cada célula. Las células en el percentil superior del 20% de las puntuaciones de melanoma se clasificaron como células tumorales, lo que arrojó 11.834 células para el análisis posterior. Las diferencias en la puntuación de expresión compuesta de la vía del mevalonato entre las muestras BT y OT se evaluaron dentro de los grupos de respondedores y no respondedores utilizando pruebas de suma de rangos de Wilcoxon. Se generaron gráficos de violín con diagramas de caja superpuestos (que muestran las medianas y los rangos intercuartílicos) utilizando ggplot2 v3.5.2. Todos los análisis se realizaron utilizando Seurat (v5.3.0), dplyr (v1.1.4), tidyr (v1.3.1) y patchwork (v1.3.0) en R v4.4.1 [^[23]].

Análisis estadístico

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Para los experimentos basados en células, se utilizó un mínimo de tres réplicas biológicas. Para los experimentos con animales, se utilizó un mínimo de 5 ratones por condición. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando las versiones 8, 9 o 10 de GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.). Los datos se evaluaron para determinar la normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizaron pruebas t de dos colas no pareadas para los datos distribuidos normalmente, y se aplicaron las pruebas U de Mann-Whitney cuando no se cumplieron los supuestos de normalidad. Para las comparaciones que involucran más de dos grupos, se realizó una ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Para las curvas de supervivencia tumoral, se utilizaron las pruebas de rango logarítmico (Mantel-Cox), seguidas de la corrección de comparación múltiple de Benjamini-Hochberg.

Análisis de TCGA

Se utilizó el análisis interactivo de perfiles de expresión génica (GEPIA) para generar curvas de supervivencia general de Kaplan-Meier para tumores de melanoma cutáneo (SKCM) con alta y baja expresión de MVK, MVD, FDPS y FDFT1 por cuartil, basándose en los datos de secuenciación del TCGA. Los valores p de las pruebas de rango logarítmico asociadas se muestran en los paneles de la figura. GEPIA también se utilizó para evaluar la correlación entre la expresión de GPX4, CD8 y varios genes de la vía del mevalonato. Se utilizaron el portal web TIMER2.0 y EPIC para evaluar las correlaciones entre los genes de la vía del mevalonato y la infiltración de células T CD8+ [^[22], ^[24]].

Western blots

Las células YR1.7 y MC38 se trataron con 50 μM de estatinas durante 18 horas, se recolectaron mediante tripsinización, se lavaron en PBS estéril frío y se lisaron en tampón de lisis 1× RIPA (ThermoFisher, #89900) con 1× cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas (ThermoFisher, #78440). Los lisados se incubaron en hielo durante 30 minutos y se aclararon mediante centrifugación a 15.000 g durante 20 minutos. La concentración de proteína se cuantificó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (ThermoFisher, #23225). Se mezclaron 15 μg de proteína total con tampón de muestra (Thermo Fisher, B0007) y se desnaturalizaron a 95 °C durante 10 minutos. La muestra se separó mediante gel de proteínas Criterion TGX Stain-Free (Bio-Rad, #5678085) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, #P1620112). Las membranas se bloquearon con 5% p/v de leche descremada y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C y con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Cell Signaling Technology (CST) Danvers, MA) durante 1 hora a temperatura ambiente. La señal se detectó utilizando los sustratos Clarity y Clarity Max Western ECL Blotting (Bio-Rad) y se capturó utilizando el sistema de imagen ChemiDoc (Bio-Rad). Los anticuerpos utilizados fueron: conejo anti-ACSL4 (1:1000) (ThermoFisher, #PA5-27137, RRID: AB2544613), anti-GAPDH (1:1000) (Cell Signaling, #5174, RRID: AB10622025) y anti-GPX4 (1:1000) (ThermoFisher, #MA5-32827, RRID: AB_2810103). El análisis densitométrico se realizó utilizando ImageJ (v1.54, NIH); las intensidades de las bandas se normalizaron primero a GAPDH para cada muestra y luego al control de DMSO para calcular los valores de expresión relativa de GPX4.

IHC

Los tumores YR1.7 tratados con simvastatina y los tumores de control YR1.7 se recolectaron para los análisis de IHC. Los tumores se fijaron en formaldehído tamponado con neutro al 10% durante 24 horas y luego se incluyeron en parafina. Para la IHC de GPX4, se utilizaron testículos y estómago de ratón como controles positivos. El tinte de GPX4 (anticuerpo monoclonal de conejo (EPNCIR144), 1:100) (Abcam # ab125066, RRID: AB_10973901) se realizó manualmente, con una recuperación de antígeno basada en calor de 40 minutos, una incubación nocturna a 4 °C y anticuerpos secundarios basados en peroxidasa de rábano picante. Las láminas de H&E e IHC se escanearon con un aumento de 40X con el Hamamatsu NanoZoomer y se visualizaron con el software NDP.View2Plus para el recuento de células mediante microscopía de campo claro. Para la cuantificación de GPX4, se utilizó la puntuación H, que combina la intensidad del tinte y el número de células teñidas, para la puntuación manual por parte de patólogos certificados (SFR y MWB).

Disponibilidad de datos

Los datos de secuenciación de ARN a granel de ratón generados en este estudio están disponibles públicamente en el NCBI Sequence Read Archive (PRJNA1346137). Los datos de expresión humana se han publicado previamente [^[22]], y los datos están disponibles en https://rdr.kuleuven.be/dataset.xhtml?persistentId=doi:10.48804/GSAXBN. Todos los demás datos brutos generados en este estudio están disponibles a petición de los autores correspondientes.

Cultivo celular

La línea celular de melanoma murino YUMMER1.7 (YR1.7) (RRID: CVCLA2AX) se estableció en nuestro laboratorio como se describió previamente en 2017 [^[18]]. Las líneas celulares de melanoma derivadas de pacientes YUSIK (RRID: CVCLB487), YUCOT (RRID: CVCLJ066) y YUGASP (RRID: CVCLJ520) se establecieron como se describió previamente y fueron un regalo de la Dra. Ruth Halaban y Antonietta Bacchiocchi (Universidad de Yale, 2022) [^[19]]. La línea celular de cáncer colorrectal murino MC38 (RRID: CVCLB288) se obtuvo del repositorio de tumores NIH NCI DCTD en 2018. Todas las líneas celulares resultaron negativas para la contaminación por micoplasma y se utilizaron dentro de las 15 pases después del descongelamiento. Las líneas celulares no se autenticaron. YUSIK se estableció a partir de una lesión metastásica en etapa IV en el muslo derecho de una paciente de 49 años y YUCOT se estableció a partir de una lesión metastásica en etapa IV en el cuello derecho de una paciente de 33 años, ambas con mutaciones en BRAF. YUGASP se estableció a partir de una lesión metastásica en etapa IV en la región pretibial derecha de la pierna de una paciente de 88 años con una mutación en RAS_. Las muestras de tumor se recolectaron con el consentimiento informado por escrito del paciente de acuerdo con las regulaciones de la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico (HIPAA) y el protocolo del Comité de Investigación Humana. Todos los estudios que involucran tejido humano se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas éticas reconocidas, incluido la Declaración de Helsinki, CIOMS, el Informe Belmont y la Regla Común de los EE. UU., y fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yale (IRB #0609001869). Las líneas celulares murinas se cultivaron en DMEM/F12 (ThermoFisher, #A4192001), mientras que las líneas celulares derivadas de pacientes se cultivaron en OptiMEM (ThermoFisher, #31985070). Ambos se complementaron con 10% de FBS, 1% de aminoácidos no esenciales MEM (ThermoFisher, #11140050) y 1% de penicilina/estreptomicina (ThermoFisher, #15140163) y se mantuvieron en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.

Viabilidad celular

Las células se cultivaron hasta alcanzar aproximadamente un 80% de confluencia y luego se recolectaron mediante tripsinización y se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo y se dejaron adherir durante al menos 6 horas antes del tratamiento. Después de 24 horas de tratamiento, las células se incubaron durante 4 horas a 37 °C con Aquabluer (Boca Scientific, #6015) y la intensidad de la fluorescencia se midió a 540ex/590em mediante un lector de microplacas de la serie SpectraMax y se normalizó al promedio de los pocillos de control. Los siguientes tratamientos se utilizaron a lo largo del estudio: atorvastatina, según se indica o IC50 determinado experimentalmente (YR1.7: 200 μM, MC38: 100 μM; Cayman Chemical, #10493), fluvastatina, según se indica o IC50 (YR1.7: 250 μM, MC38: 50 μM; Cayman Chemical, #10010334), lovastatina, según se indica o IC50 (YR1.7: 750 μM, MC38: 500 μM; Cayman Chemical, #10010338), pitavastatina, según se indica o IC50 (YR1.7: 500 μM, MC38: 250 μM; Cayman Chemical, #15414), pravastatina, según se indica (Cayman Chemical, #10010342), rosuvastatina, según se indica (Cayman Chemical, #12029), simvastatina, según se indica o IC50 (YR1.7: 75 μM, MC38: 50 μM; Cayman Chemical, #10010344), ferrostatin-1, 50 μM (Cayman Chemical, #17729), liproxstatin-1, 2 μM (Cayman Chemical, #17730), α-tocoferol vitamina E, 50 μM (Cayman Chemical, #25985), necrostatin-1, 50 μM (Cayman Chemical, #11658), Z-VAD(OMe)-FMK, 50 μM (Cayman Chemical, #14463), cloroquina, 50 μM (Cayman Chemical, #14194), 4-fenilbutirato, 1,5 mM (Cayman Chemical #11323), MVA, 500 μM (Sigma Aldrich, #50838), CoQ10, 50 μM (Cayman Chemical, #11506), escualeno, 50 μM (Cayman Chemical, #27058), colesterol, 50 μM (Cayman Chemical, #9003100), 7DHC, 50 μM (Cayman Chemical, #14612), pioglitazona, 50 μM (Cayman Chemical, #71745) y RSL3, 10 μM o según se indica (Cayman Chemical, #19288). MVA, CoQ10, escualeno, colesterol, 7DHC y pioglitazona se administraron como pretratamientos durante 12 horas antes del tratamiento con estatinas.

Citometría de flujo

Las células se cultivaron hasta alcanzar aproximadamente un 80% de confluencia y luego se recolectaron mediante tripsinización y se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos y se dejaron adherir durante al menos 6 horas antes del tratamiento. Después de 18 horas de tratamiento, las células se recolectaron y se resuspendieron en PBS estéril antes de someterse al siguiente tinte con 10 μM de Liperfluo (Dojindo, #L-248-10) durante 30 minutos a 37 °C. Después del tinte, las células se lavaron 3 veces con PBS, se analizaron en el canal FITC de un citómetro de flujo LSRII y se normalizaron a la intensidad de fluorescencia media de las muestras de control. Los tumores se recolectaron 12 días después del desafío tumoral inicial y se disociaron en tampón de disociación, rotando a 37 °C durante 30 minutos, se pasaron a través de un filtro de 70 μM, se trataron con tampón de lisis ACK (ThermoFisher, #A1049201), se apagaron con RPMI y 10% de FBS y se lavaron en PBS estéril. El tampón de disociación consistió en RPMI (ThermoFisher, #11875101), colagenasa (Sigma-Aldrich, #C5138) y 1× DNasa (Qiagen, #79254). Luego, las células se tiñeron con CD45 (Biolegend, #103155) y Liperfluo (descrito anteriormente) durante 30 minutos a 37 °C, se lavaron 3 veces con PBS, se analizaron en un citómetro de flujo LSRII utilizando la población CD45− como un indicador de las células tumorales y se normalizaron a la intensidad de fluorescencia media de las muestras de control.

Cuantificación de metabolitos

El glutatión (Cayman Chemical, #600360) y el contenido de hierro (BioAssay Systems, #DIFE-250) en aproximadamente 1,2 × 106 células por muestra se midieron utilizando kits de detección basados en células de acuerdo con los protocolos del fabricante. El contenido de MDA en células y tumores se midió utilizando un kit de ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) (Cayman Chemical, #10009055). Aproximadamente 1,2 × 106 células o 25 mg de tejido tumoral (recolectado 12 días después del desafío tumoral inicial) se homogeneizaron en 250 μL de tampón de lisis RIPA que contiene inhibidores de proteasas. Los homogenados de tejido se centrifugaron a 1.600 g durante 10 minutos y se utilizaron 100 μL de sobrenadante para el análisis de MDA. Para la cuantificación in vitro de glutatión, hierro y MDA, las estatinas se administraron a una dosis de 50 μM durante 18 horas.

Experimentos con ratones

Se siguieron todos los protocolos de experimentación animal de acuerdo con las directrices del Comité de Apoyo a la Investigación con Animales de la Universidad de Yale. Se adquirieron ratones macho C57BL/6J de 7 semanas de edad (IMSR_JAX:000664) del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y se les permitió aclimatarse durante al menos una semana antes de su uso. Para el desafío tumoral, las células YR1.7 y MC38 se cultivaron hasta alcanzar aproximadamente un 80% de confluencia, se recolectaron mediante tripsinización, se lavaron en PBS estéril y se contaron. Se inyectaron 500.000 células en 100 μL de PBS estéril en el flanco posterior afeitado de cada ratón, utilizando una aguja de 27G. Las mediciones del tumor mediante calibradores digitales se iniciaron 7 días después del desafío tumoral y se repitieron cada 3 o 4 días. Se registraron las mediciones de longitud, anchura y altura, y se calculó el volumen tumoral como 0,5233 × longitud × anchura × altura. Los ratones fueron sacrificados cuando su tumor alcanzó los 1000 mm3 o presentó ulceración. Las jaulas se asignaron aleatoriamente al grupo de tratamiento después del desafío tumoral. Se administró 10 mg/kg de α-PD1 (RMP1–14, Bio X Cell, #BE0146) o un control de isotipo ratón IgG2a (Bio X Cell, #BE0089) mediante inyección intraperitoneal (IP) cada 3 o 4 días, comenzando 7 días después del desafío tumoral inicial. Se administró 10 mg/kg de simvastatina diariamente mediante inyección IP durante 14 días, comenzando 7 días después del desafío tumoral inicial.

Secuenciación masiva de ARN

Aproximadamente 8 × 106 células por muestra se trataron con 10 μM de RSL3 o 100 μM de simvastatina durante 18 horas. Luego, las células se recolectaron mediante tripsinización, se lavaron y se aisló el ARN utilizando el kit RNeasy, complementado con QIAshredder y tratamiento con DNasa (Qiagen). Se evaluó la concentración de ARN y el tamaño de los fragmentos para el control de calidad utilizando BioAnalyzer o Agilent TapeStation, y luego se realizó la preparación de la biblioteca y se secuenció utilizando Ilumina 97 HiSeq4000 por el Centro de Genómica de Células Madre de Yale. Las lecturas se alinearon utilizando STAR244 (v2.7.9) a mm10. Brevemente, los recuentos se normalizaron al tamaño de la biblioteca utilizando cpm() y se calculó el análisis de expresión diferencial mediante la estadística de la prueba exacta utilizando exactTest() de forma pareada. Se realizó la normalización de la media recortada de los valores M (TMM) durante el análisis de expresión diferencial con edgeR (v4.36.0). Se realizó el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes utilizando software de escritorio (v4.2.3) en listas preclasificadas, calculadas por sign (logFC) * −log10(pval); y los conjuntos de genes HALLMARK de MSigDB (v2022.1) [^[20]–^[21]].

Análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq)

Analizamos datos de secuenciación de ARN de célula única publicados de muestras de tumores de melanoma humano obtenidos de Pozniak et al. [^[22]]. El conjunto de datos incluyó tumores disociados, junto con su microambiente inmunitario, de pacientes tratados con bloqueo de puntos de control inmunitario, muestreados antes del tratamiento (BT) y durante el tratamiento (OT), y estratificados por estado de respuesta (respondedores frente a no respondedores). Los datos se procesaron utilizando Seurat v5.3.0 en R v4.4.1 (RStudio v2023.06.0+421) [^[23]]. Para evaluar la expresión de los genes de la vía del mevalonato, calculamos una puntuación de módulo utilizando los genes clave de la vía: MVK, MVD, FDPS y FDFT1. Los valores de expresión génica se escalaron restando la media y dividiendo por la desviación estándar para cada gen en todas las células, y la puntuación de expresión compuesta de la vía del mevalonato para cada célula se definió como la media de estos valores escalados. Las células tumorales de melanoma se identificaron utilizando un panel de marcadores establecidos (MITF, PMEL, TYR, DCT, MLANA, S100B), y se calculó una puntuación de melanoma de manera similar para cada célula. Las células en el percentil superior del 20% de las puntuaciones de melanoma se clasificaron como células tumorales, lo que resultó en 11.834 células para el análisis posterior. Las diferencias en la puntuación de expresión compuesta de la vía del mevalonato entre las muestras BT y OT se evaluaron dentro de los grupos de respondedores y no respondedores utilizando pruebas de rango-suma de Wilcoxon. Se generaron diagramas de violín con diagramas de caja superpuestos (que muestran las medianas y los rangos intercuartílicos) utilizando ggplot2 v3.5.2. Todos los análisis se realizaron utilizando Seurat (v5.3.0), dplyr (v1.1.4), tidyr (v1.3.1) y patchwork (v1.3.0) en R v4.4.1 [^[23]].

Análisis estadístico

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Para los experimentos con células, se utilizó un mínimo de tres réplicas biológicas. Para los experimentos con animales, se utilizó un mínimo de 5 ratones por condición. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando las versiones 8, 9 o 10 de GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.). Se evaluó la normalidad de los datos utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizaron pruebas t de dos colas no pareadas para los datos distribuidos normalmente, y se aplicaron las pruebas U de Mann-Whitney cuando no se cumplieron los supuestos de normalidad. Para las comparaciones que involucran más de dos grupos, se realizó una ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Para las curvas de supervivencia tumoral, se utilizaron las pruebas de rango log (Mantel-Cox), seguidas de la corrección de comparación múltiple de Benjamini-Hochberg.

Análisis de TCGA

Se utilizó el análisis interactivo de perfiles de expresión génica (GEPIA) para generar curvas de supervivencia general de Kaplan-Meier para tumores de melanoma cutáneo (SKCM) con alta y baja expresión de MVK, MVD, FDPS y FDFT1 por cuartil, en función de los datos de secuenciación de TCGA. Los valores p de las pruebas de rango log asociadas se muestran en los paneles de la figura. GEPIA también se utilizó para evaluar la correlación entre la expresión de GPX4, CD8 y varios genes de la vía del mevalonato. El portal web TIMER2.0 y EPIC se utilizaron para evaluar las correlaciones entre los genes de la vía del mevalonato y la infiltración de células T CD8+ [^[22], ^[24]].

Western blots

Las células YR1.7 y MC38 se trataron con 50 μM de estatinas durante 18 horas, se recolectaron mediante tripsinización, se lavaron en PBS estéril frío y se lisaron en tampón de lisis RIPA 1× (ThermoFisher, #89900) con cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas 1× (ThermoFisher, #78440). Los lisados se incubaron en hielo durante 30 minutos y se aclararon mediante centrifugación a 15.000 g durante 20 minutos. La concentración de proteína se cuantificó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (ThermoFisher, #23225). Se mezclaron 15 μg de proteína total con tampón de muestra (Thermo Fisher, B0007) y se desnaturalizaron a 95 °C durante 10 minutos. La muestra se separó mediante gel de proteínas Criterion TGX Stain-Free (Bio-Rad, #5678085) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, #P1620112). Las membranas se bloquearon con leche seca descremada al 5% p/v y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C y con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Cell Signaling Technology (CST) Danvers, MA) durante 1 hora a temperatura ambiente. La señal se detectó utilizando los sustratos Clarity y Clarity Max Western ECL Blotting (Bio-Rad) y se capturó utilizando el sistema de imagen ChemiDoc (Bio-Rad). Los anticuerpos utilizados fueron: conejo anti-ACSL4 (1:1000) (ThermoFisher, #PA5–27137, RRID: AB2544613), anti-GAPDH (1:1000) (Cell Signaling, #5174, RRID: AB10622025) y anti-GPX4 (1:1000) (ThermoFisher, #MA5–32827, RRID: AB_2810103). El análisis densitométrico se realizó utilizando ImageJ (v1.54, NIH); las intensidades de las bandas se normalizaron primero a GAPDH para cada muestra y luego al control DMSO para calcular los valores de expresión relativa de GPX4.

IHC

Los tumores YR1.7 tratados con simvastatina y los tumores de control YR1.7 se recolectaron para los análisis de IHC. Los tumores se fijaron en formaldehído tamponado con neutro al 10% durante 24 horas y luego se incluyeron en parafina. Para la IHC de GPX4, se utilizaron testículos y estómago de ratón como controles positivos. El tinte de GPX4 (anticuerpo monoclonal de conejo (EPNCIR144), 1:100) (Abcam # ab125066, RRID: AB_10973901) se realizó manualmente, con recuperación de antígeno basada en calor durante 40 minutos, incubación nocturna a 4 °C y anticuerpos secundarios basados en peroxidasa de rábano picante. Las láminas de H&E e IHC se escanearon con un aumento de 40X con el NanoZoomer de Hamamatsu y se visualizaron con el software NDP.View2Plus para el recuento de células mediante microscopía de campo claro. Para la cuantificación de GPX4, se utilizó la puntuación H, que combina la intensidad del tinte y el número de células teñidas, para la puntuación manual por parte de patólogos certificados (SFR y MWB).

Disponibilidad de datos

Los datos de secuenciación de ARN masiva de ratón generados en este estudio están disponibles públicamente en el Archivo de lecturas de secuencias de NCBI (PRJNA1346137). Los datos de expresión humana se han publicado previamente [^[22]], y los datos están disponibles en https://rdr.kuleuven.be/dataset.xhtml?persistentId=doi:10.48804/GSAXBN. Todos los demás datos brutos generados en este estudio están disponibles a petición de los autores correspondientes.

Resultados

La expresión de los genes de la vía del mevalonato es un factor pronóstico y predictivo de las respuestas a la inmunoterapia en el melanoma

Mediante un cribado de fármacos combinatorios de alto rendimiento y selectivo por genotipo, habíamos identificado previamente la simvastatina como una opción terapéutica para los melanomas con mutación RAS [^[7]]. Luego, nos propusimos evaluar la importancia de HMGCR en las células cancerosas de una manera más amplia utilizando el portal DepMap [^[25]]. DepMap es un recurso integral que contiene cribados de CRISPR-Cas9 y shRNA a nivel del genoma en más de 1000 líneas celulares y calcula la puntuación del efecto génico para genes individuales en cada línea celular. Una puntuación del efecto génico de -1 es la puntuación mediana para todos los genes panesenciales, mientras que una puntuación de 0 indica que un gen no es esencial. La puntuación mediana del efecto génico para HMGCR en las 1078 líneas celulares contenidas en DepMap fue de -1,14, y la puntuación del efecto génico para todas menos 1 línea celular fue inferior a 0 (Figura 1A, Tabla S1). Estos hallazgos sugieren que la dependencia de HMGCR es una característica relativamente universal de las células cancerosas. A continuación, probamos si cinco estatinas de uso común, todas las cuales inhiben HMGCR, inducen la muerte celular en múltiples líneas de melanoma derivadas de pacientes. La atorvastatina, la fluvastatina, la lovastatina, la pitavastatina y la simvastatina indujeron la muerte celular dependiente de la dosis en las tres líneas probadas (Figura 1B). Basándonos en la sensibilidad observada de las líneas de melanoma al tratamiento con estatinas, investigamos a continuación si la expresión endógena de los genes de la vía del mevalonato podría predecir los resultados del tratamiento en el melanoma humano. Utilizando datos de secuenciación de ARN masiva, encontramos que una menor expresión de la mevalonato descarboxilasa (MVD), la mevalonato quinasa (MVK), la farnesil difosfato sintasa (FDPS) y la farnesil difosfato farnesiltransferasa 1 (FDFT1) se asoció de forma independiente con una mejor supervivencia (Figura 1C–D). Cada uno de estos genes, junto con HMGCR, se correlacionó negativamente con la expresión de CD8, y el análisis EPIC confirmó una asociación negativa entre la infiltración de células T CD8+ para MVD y MVK (Figura S1A–B) [^[26]–^[27]]. Para evaluar si los cambios en la expresión de los genes de la vía del mevalonato responden a la inmunoterapia, reanalizamos los datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) de tumores de melanoma recolectados antes y después del bloqueo de puntos de control inmunitario (Pozniak et al.) [^[22]]. El análisis de aproximación y proyección uniforme de múltiples (UMAP) reveló una agrupación distinta de las células tumorales pretratamiento y postratamiento (Figura 1E). Entre los pacientes que respondieron a la inmunoterapia, la puntuación compuesta media de la vía del mevalonato (calculada utilizando la expresión de MVK, MVD, FDPS y FDFT1) disminuyó de 0,409 (± 0,636 DE) antes del tratamiento a 0,127 (± 0,546 DE) durante el tratamiento (p = 8,27 × 10−¹⁸, prueba U de Mann-Whitney; Figura 1F). En contraste, los no respondedores mostraron un patrón opuesto, con puntuaciones que aumentaron de 0,213 (± 0,648 DE) a 0,421 (± 0,776 DE) durante el tratamiento (p = 6,80 × 10−⁴⁹, prueba U de Mann-Whitney; Figura 1F). En particular, esta divergencia fue evidente en la línea de base: las puntuaciones del mevalonato fueron significativamente más altas en los respondedores finales que en los no respondedores (0,409 frente a 0,213), lo que sugiere que los tumores con una mayor expresión basal de los genes de la vía del mevalonato pueden ser más sensibles al bloqueo de puntos de control inmunitario.

Las estatinas lipofílicas inducen la muerte celular de forma dependiente de la dosis y del tiempo, lo que es consistente con la ferroptosis

Dado que las puntuaciones de expresión reducida de la vía del mevalonato se correlacionaron con respuestas favorables a la inmunoterapia, y teniendo en cuenta que varias estatinas indujeron la muerte celular en líneas de melanoma derivadas de pacientes, a continuación, buscamos determinar qué características farmacológicas distinguen a las estatinas con efectos anticancerígenos. Para abordar esto, probamos si cada una de las siete estatinas más recetadas induce la muerte celular en las líneas celulares de melanoma YUMMER1.7 (YR1.7) y de cáncer colorrectal MC38. Descubrimos que atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina y simvastatina indujeron la muerte celular de manera dependiente de la dosis y del tiempo, pero pravastatina y rosuvastatina no lo hicieron (Figura 2A, S2A). Esta discrepancia no pudo explicarse por su IC50 reportada para HMGCR, su capacidad para reducir el colesterol en los pacientes o clasificándolas como estatinas de tipo 1, que se unen a HMGCR mediante una estructura de anillo de decalin, y estatinas de tipo 2, que se unen mediante su grupo fluorofenilo (Figura S2B–C). En cambio, observamos que la atorvastatina, la fluvastatina, la lovastatina, la pitavastatina y la simvastatina son estatinas lipofílicas, mientras que la pravastatina y la rosuvastatina son hidrofílicas (Figura 2B). Razonamos que la naturaleza hidrofílica de la pravastatina y la rosuvastatina altera las propiedades farmacocinéticas, incluidas las concentraciones intracelulares del fármaco en algunos tipos de células. Después de establecer que las estatinas lipofílicas inducen la muerte celular en YR1.7 y MC38, a continuación, evaluamos la muerte celular inducida por las estatinas en busca de características de la ferroptosis. Descubrimos que el tratamiento de YR1.7 y MC38 con estatinas aumentó los niveles de peróxidos de lípidos y el intermedio de peróxido de lípidos malondialdehído (MDA) (Figuras 2C–D). También descubrimos que el tratamiento de YR1.7 y MC38 con estatinas disminuye el glutatión reducido celular y el hierro ferroso, de acuerdo con otros inductores de la ferroptosis (Figuras 2E–F). Dado que la muerte celular inducida por estatinas exhibió múltiples características de la ferroptosis, a continuación, probamos si los inhibidores de la ferroptosis podrían rescatar las células YR1.7 o MC38 de este proceso. Descubrimos que los inhibidores de la ferroptosis, ferrostatin-1 y liproxstatin-1, rescataron la muerte celular en las líneas celulares YR1.7 y MC38 de un subconjunto de estatinas, incluidas la mayoría de las estatinas lipofílicas probadas (Figuras 2G–H). El inhibidor de la apoptosis Z-VAD-FMK, los inhibidores de la necroptosis, necrostatin-1, el inhibidor de la autofagia, cloroquina, y el inhibidor del estrés del retículo endoplásmico, 4-fenilbutirato, tampoco previnieron la muerte celular en ninguna de las líneas celulares (Figuras S2D–E).

Las estatinas alteran la expresión génica en varias vías relacionadas con la ferroptosis

Dado que los inhibidores específicos de varias formas de muerte celular regulada no lograron rescatar la muerte celular inducida por estatinas, realizamos una secuenciación de ARN en las células YR1.7 y MC38 tratadas con simvastatina para obtener información adicional sobre cómo las estatinas podrían provocar la muerte celular. Dado que la muerte celular inducida por estatinas presentaba múltiples características de la ferroptosis, también realizamos una secuenciación de ARN en las mismas líneas celulares tratadas con RSL3 para determinar los cambios transcripcionales asociados con la inducción de la ferroptosis en estas células. Cuando analizamos los genes expresados diferencialmente (DEG) entre las células de control y cada condición de tratamiento, identificamos una superposición sustancial entre los DEG en cada condición y 64 DEG que estaban presentes en ambas condiciones en ambas líneas celulares (Figura 3A). Estos incluyeron PTGS2, un marcador establecido de la ferroptosis, SLC7A11, que codifica una subunidad del supresor clave de la ferroptosis, el sistema Xc−, PLA2G4A, una fosfolipasa A2 citosólica responsable de la escisión del ácido araquidónico de la membrana, y varios otros genes relacionados con la ferroptosis. A continuación, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para cada una de estas condiciones. De los 20 principales conjuntos de genes enriquecidos en cada condición, 9 conjuntos de genes, incluido "Metabolismo de la hema" y "Vía de las ROS", fueron comunes a las 4 condiciones y 3 conjuntos de genes adicionales, incluido "Síntesis de colesterol", se enriquecieron en 3 de las 4 condiciones (Figura 3B, S3A–B). Esto nos llevó a evaluar los cambios en los genes relacionados con la ferroptosis después del tratamiento con simvastatina con más detalle utilizando la base de datos FerrDb. Al hacerlo, detectamos cambios extensos relacionados con la síntesis de glutatión (GCLC, GCLM, GLUL, GLS2, SLC3A2, SLC7A11), la regulación del hierro (FTH1, FTL1, TFRC), el metabolismo de los lípidos (ACSL1, ACSL3, ACSL4, AGPAT3, CARS, SQSTM1), la homeostasis redox (DHODH, KEAP1, POR, AIFM2, GCH1, NFE2l2, NQO1 y TXNRD1) y otras vías relacionadas con la ferroptosis en YR1.7 y MC38 después del tratamiento con simvastatina (Figura 3C). Los cambios coordinados en la expresión de los genes clave involucrados en otras formas de muerte celular regulada, como la piroptosis, la necroptosis y la apoptosis, fueron notablemente ausentes (Figura S3C–E).

Las estatinas agotan la expresión de GPX4 y el mevalonato rescata la muerte celular inducida por estatinas

La notable superposición entre los cambios transcripcionales inducidos por RSL3 y simvastatina en YR1.7 y MC38 nos llevó a preguntarnos si las estatinas también podrían actuar sobre GPX4 para promover la ferroptosis. Otros han informado que el metabolito aguas abajo del mevalonato, el isopentenil pirofosfato (IPP), es necesario para la isopentenilación del ARNt de la selenocisteína (Sec), que es necesario para la síntesis de selenoproteínas como GPX4 [^[28]–^[29]]. Por lo tanto, hipotetizamos que las estatinas podrían promover la ferroptosis al inhibir la síntesis de GPX4. Para probar esto, comparamos los niveles de proteína GPX4 en las células YR1.7 tratadas con estatinas con el control y descubrimos que las estatinas reducen la abundancia de GPX4 (Figura 4A). La cuantificación densitométrica, normalizada a GAPDH, confirmó una disminución reproducible después del tratamiento con estatinas (Figura 4B). A continuación, para determinar si este efecto se extiende in vivo, evaluamos la expresión de GPX4 mediante inmunohistoquímica (IHC) en los tumores YR1.7 tratados con simvastatina y observamos una marcada reducción, lo que demuestra que el tratamiento con estatinas suprime la expresión de GPX4 también in vivo (Figura 4D–E). Tanto los tumores tratados como los no tratados mostraron una histología de H&E comparable, que incluía melanocitos epitelioides y fusiformes pobremente diferenciados con infiltrados inflamatorios mixtos, mitosis y restos apoptóticos (Figura 4D). En el melanoma humano, el análisis de los datos de secuenciación de ARN a granel del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA) mostró que la expresión de GPX4 se correlacionó positivamente con MVK, MVD y FDPS (Figura S4A). Curiosamente, también existieron correlaciones negativas significativas entre GPX4 y HMGCR y FDFT1 (Figura S4B). Estos resultados sugieren que la regulación de la vía del mevalonato de la expresión de GPX4 también puede ocurrir en los tumores de los pacientes, lo que plantea la posibilidad de que la restauración de la actividad de la vía del mevalonato pueda revertir los efectos del tratamiento con estatinas. Coherente con esto, la adición de mevalonato a las células YR1.7 tratadas con estatinas rescató la muerte celular, lo que respaldó nuestra hipótesis (Figura 4F). El mevalonato también rescató la muerte celular inducida por estatinas en las células MC38 (Figura 4G). Cabe destacar que el mevalonato no rescató la muerte celular inducida por RSL3, lo que sugiere que se dirige específicamente al mecanismo de muerte celular inducida por estatinas en lugar de actuar como un inhibidor de la ferroptosis de amplio espectro (Figura S4C). Varios productos aguas abajo de la vía del mevalonato más allá del IPP han demostrado tener un impacto en la ferroptosis, sin embargo, y esto no descartó la posibilidad de que el mevalonato rescate la muerte celular inducida por estatinas al aumentar ellos en lugar de IPP y GPX4. La coenzima Q10 (CoQ10) es un antioxidante que atrapa radicales utilizado por la proteína supresora de la ferroptosis 1 (FSP1) para prevenir la ferroptosis [^[30]–^[31]], se ha informado que el escualeno altera el metabolismo lipídico celular y protege a las células de la ferroptosis en un modelo de linfoma anaplásico de células grandes [^[32]], y el 7-dehidrocolesterol (7-DHC) se descubrió recientemente que suprime la ferroptosis en una línea celular de linfoma de Burkitt [^[33]]. También se ha demostrado que la inhibición de la captación de colesterol induce la ferroptosis en las células de linfoma, y se ha demostrado que el propio colesterol actúa como un supresor endógeno de la ferroptosis [^[34]–^[36]]. A pesar de estos hallazgos, la suplementación con CoQ10, escualeno, 7DHC o colesterol no logró rescatar la muerte celular inducida por estatinas (Figura S4D–F). También observamos que las estatinas aumentan los niveles de la proteína promotora de la ferroptosis ACSL4 (Figura 4A, 4C). Sin embargo, la inhibición de ACSL4 con la tiazolidinediona pioglitazona fue insuficiente para prevenir la muerte celular inducida por estatinas (Figura S4G).

Las estatinas mejoran las respuestas al bloqueo del punto de control α-PD1 y promueven la ferroptosis in vivo

Múltiples estudios han demostrado que el aumento de la ferroptosis intratumoral aumenta el efecto del bloqueo del punto de control inmunitario [^[37]–^[44]]. Con esto en mente, especulamos que las estatinas podrían mejorar las respuestas al bloqueo del punto de control inmunitario al promover la ferroptosis. Para evaluar esto, probamos los efectos de α-PD1 y simvastatina solos y en combinación sobre el crecimiento tumoral de YR1.7 y MC38 in vivo. Por sí solos, α-PD1 y simvastatina promovieron la eliminación tumoral y prolongaron la supervivencia en el 20% al 60% de los ratones (Figura 5A–D). Sin embargo, cuando administramos α-PD1 y simvastatina juntos, este resultado aumentó a casi el 100% de los ratones (Figura 5A–D). Esta respuesta mejorada correspondió con un aumento de los peróxidos de lípidos intratumorales y el MDA, lo que sugiere que la ferroptosis es el mecanismo de muerte celular responsable de la eliminación tumoral in vivo (Figura 5E–F).

La expresión de los genes de la vía del mevalonato es pronóstica y predictiva de las respuestas a la inmunoterapia en el melanoma

Mediante un cribado combinatorio de fármacos de alto rendimiento y selectivo por genotipo, habíamos identificado previamente la simvastatina como una opción terapéutica para los melanomas con mutaciones en los genes RAS [^[7]]. A continuación, nos propusimos evaluar la importancia de HMGCR en las células cancerosas de forma más amplia, utilizando el portal DepMap [^[25]]. DepMap es un recurso exhaustivo que contiene cribados de CRISPR-Cas9 y shRNA a nivel del genoma en más de 1.000 líneas celulares y calcula la puntuación del efecto génico para genes individuales en cada línea celular. Una puntuación del efecto génico de -1 es la puntuación mediana para todos los genes esenciales, mientras que una puntuación de 0 indica que un gen no es esencial. La puntuación mediana del efecto génico para HMGCR en las 1.078 líneas celulares contenidas en DepMap fue de -1,14, y la puntuación del efecto génico para todas las líneas celulares, excepto una, fue inferior a 0 (Figura 1A, Tabla S1). Estos hallazgos sugieren que la dependencia de HMGCR es una característica relativamente universal de las células cancerosas. A continuación, probamos si cinco estatinas de uso común, todas ellas inhibidoras de HMGCR, inducen la muerte celular en múltiples líneas de melanoma derivadas de pacientes. La atorvastatina, la fluvastatina, la lovastatina, la pitavastatina y la simvastatina indujeron, cada una de ellas, la muerte celular dependiente de la dosis en las tres líneas probadas (Figura 1B). Basándonos en la sensibilidad observada de las líneas de melanoma al tratamiento con estatinas, investigamos a continuación si la expresión génica endógena de la vía del mevalonato podría predecir los resultados del tratamiento en el melanoma humano. Utilizando datos de secuenciación de ARN masiva, descubrimos que una menor expresión de la mevalonato descarboxilasa (MVD), la mevalonato quinasa (MVK), la farnesil difosfato sintasa (FDPS) y la farnesil difosfato farnesiltransferasa 1 (FDFT1) se asoció de forma independiente con una mejor supervivencia (Figura 1C-D). Cada uno de estos genes, junto con HMGCR, se correlacionó negativamente con la expresión de CD8, y el análisis EPIC confirmó una asociación negativa entre la infiltración de células T CD8+ para MVD y MVK (Figura S1A-B) [^[26]-^[27]]. Para evaluar si los cambios en la expresión génica del mevalonato en respuesta a la inmunoterapia, reanalizamos los datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de tumores de melanoma recogidos antes y después del bloqueo de los puntos de control inmunitarios (Pozniak et al.) [^[22]]. El análisis de aproximación y proyección uniforme del múltiple (UMAP) reveló una agrupación distinta de las células tumorales pretratamiento y postratamiento (Figura 1E). Entre los pacientes que respondieron a la inmunoterapia, la puntuación compuesta media de la expresión de la vía del mevalonato (calculada utilizando la expresión de MVK, MVD, FDPS y FDFT1) disminuyó de 0,409 (± 0,636 DE) antes del tratamiento a 0,127 (± 0,546 DE) después del tratamiento (p = 8,27 × 10−¹⁸, prueba U de Mann-Whitney; Figura 1F). En cambio, los no respondedores mostraron el patrón opuesto, con puntuaciones que aumentaron de 0,213 (± 0,648 DE) a 0,421 (± 0,776 DE) después del tratamiento (p = 6,80 × 10−⁴⁹, prueba U de Mann-Whitney; Figura 1F). Cabe destacar que esta divergencia era evidente en la línea de base: las puntuaciones de mevalonato fueron significativamente más altas en los respondedores que en los no respondedores (0,409 frente a 0,213), lo que sugiere que los tumores con una mayor expresión basal de los genes de la vía del mevalonato pueden ser más sensibles al bloqueo de los puntos de control inmunitarios.

Las estatinas lipofílicas inducen la muerte celular de forma dependiente de la dosis y del tiempo, de acuerdo con la ferroptosis

Dado que las puntuaciones de expresión más bajas de la vía del mevalonato se correlacionaron con respuestas favorables a la inmunoterapia, y dado que varias estatinas indujeron la muerte celular en las líneas de melanoma derivadas de pacientes, a continuación, tratamos de determinar qué características farmacológicas distinguen a las estatinas con efectos anticancerígenos. Para ello, probamos si cada una de las siete estatinas más prescritas inducen la muerte celular en las líneas de melanoma YUMMER1.7 (YR1.7) y las líneas de cáncer colorrectal MC38. Descubrimos que la atorvastatina, la fluvastatina, la lovastatina, la pitavastatina y la simvastatina indujeron la muerte celular de forma dependiente de la dosis y del tiempo, pero la pravastatina y la rosuvastatina no lo hicieron (Figura 2A, S2A). Esta discrepancia no pudo explicarse por su IC50 informada para HMGCR, su capacidad para reducir el colesterol en los pacientes o por clasificarlas como estatinas de tipo 1, que se unen a HMGCR mediante una estructura de anillo de decalin, y estatinas de tipo 2, que se unen mediante su grupo fluorofenilo (Figura S2B-C). En cambio, observamos que la atorvastatina, la fluvastatina, la lovastatina, la pitavastatina y la simvastatina son estatinas lipofílicas, mientras que la pravastatina y la rosuvastatina son hidrofílicas (Figura 2B). Razonamos que la naturaleza hidrofílica de la pravastatina y la rosuvastatina altera las propiedades farmacocinéticas, incluidas las concentraciones intracelulares del fármaco en algunos tipos de células. Tras establecer que las estatinas lipofílicas inducen la muerte celular en YR1.7 y MC38, a continuación, evaluamos la muerte celular inducida por estatinas en busca de signos distintivos de la ferroptosis. Descubrimos que el tratamiento de YR1.7 y MC38 con estatinas aumentó los niveles de lípidos peroxidados y el intermedio de lípidos peroxidados, el malondialdehído (MDA) (Figuras 2C-D). También descubrimos que el tratamiento de YR1.7 y MC38 con estatinas disminuye el glutatión reducido celular y el hierro ferroso, de acuerdo con otros inductores de la ferroptosis (Figuras 2E-F). Dado que la muerte celular inducida por estatinas exhibió múltiples signos distintivos de la ferroptosis, a continuación, probamos si los inhibidores de la ferroptosis podrían rescatar las células YR1.7 o MC38 de este proceso. Descubrimos que los inhibidores de la ferroptosis, la ferrostatin-1 y la liproxstatin-1, rescataron la muerte celular en las líneas celulares YR1.7 y MC38 de un subconjunto de estatinas, incluidas la mayoría de las estatinas lipofílicas probadas (Figuras 2G-H). El inhibidor de la apoptosis Z-VAD-FMK, los inhibidores de la necroptosis, la necrostatin-1, el inhibidor de la autofagia, la cloroquina, y el inhibidor del estrés del retículo endoplásmico, el 4-fenilbutirato, tampoco previnieron la muerte celular en ninguna de las dos líneas celulares (Figuras S2D-E).

Las estatinas alteran la expresión génica en varias vías relacionadas con la ferroptosis

Dado que los inhibidores específicos de varias formas de muerte celular regulada no lograron rescatar la muerte celular inducida por estatinas, realizamos una secuenciación de ARN en las células YR1.7 y MC38 tratadas con simvastatina para obtener más información sobre cómo las estatinas podrían provocar la muerte celular. Dado que la muerte celular inducida por estatinas presentaba múltiples signos distintivos de la ferroptosis, también realizamos una secuenciación de ARN en las mismas líneas celulares tratadas con RSL3 para determinar los cambios transcripcionales asociados con la inducción de la ferroptosis en estas células. Cuando analizamos los genes expresados diferencialmente (DEG) entre las células de control y cada condición de tratamiento, identificamos una superposición sustancial entre los DEG en cada condición y 64 DEG que estaban presentes en ambas condiciones en ambas líneas celulares (Figura 3A). Estos incluyeron PTGS2, un marcador establecido de la ferroptosis, SLC7A11, que codifica una subunidad del supresor clave de la ferroptosis, el sistema Xc−, PLA2G4A, una fosfolipasa A2 citosólica responsable de la escisión del ácido araquidónico de la membrana, y varios otros genes relacionados con la ferroptosis. A continuación, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para cada una de estas condiciones. De los 20 principales conjuntos de genes enriquecidos en cada condición, 9 conjuntos de genes, incluido el "metabolismo de la hemo" y la "vía de las ROS", fueron comunes a las 4 condiciones, y 3 conjuntos de genes adicionales, incluido el "síntesis de colesterol", se enriquecieron en 3 de las 4 condiciones (Figura 3B, S3A-B). Esto nos llevó a evaluar los cambios en los genes relacionados con la ferroptosis tras el tratamiento con simvastatina con más detalle utilizando la base de datos FerrDb. Al hacerlo, detectamos cambios extensos relacionados con la síntesis de glutatión (GCLC, GCLM, GLUL, GLS2, SLC3A2, SLC7A11), la regulación del hierro (FTH1, FTL1, TFRC), el metabolismo de los lípidos (ACSL1, ACSL3, ACSL4, AGPAT3, CARS, SQSTM1), la homeostasis redox (DHODH, KEAP1, POR, AIFM2, GCH1, NFE2l2, NQO1 y TXNRD1) y otras vías relacionadas con la ferroptosis en YR1.7 y MC38 tras el tratamiento con simvastatina (Figura 3C). Los cambios coordinados en la expresión de los genes clave implicados en otras formas de muerte celular regulada, como la piroptosis, la necroptosis y la apoptosis, fueron notablemente ausentes (Figura S3C-E).

Las estatinas agotan la expresión de GPX4 y el mevalonato rescata la muerte celular inducida por estatinas

El notable solapamiento entre los cambios transcripcionales inducidos por RSL3 y la simvastatina en YR1.7 y MC38 nos llevó a preguntarnos si las estatinas también podrían actuar sobre GPX4 para promover la ferroptosis. Otros han informado de que el metabolito aguas abajo del mevalonato, el isopentenil pirofosfato (IPP), es necesario para la isopentenilación del ARNt de la selenocisteína (Sec), que es necesaria para la síntesis de selenoproteínas como GPX4 [^[28]-^[29]]. Por lo tanto, hipotetizamos que las estatinas podrían promover la ferroptosis al inhibir la síntesis de GPX4. Para probar esto, comparamos los niveles de proteína GPX4 en las células YR1.7 tratadas con estatinas con los de las células de control y descubrimos que las estatinas reducen la abundancia de GPX4 (Figura 4A). La cuantificación densitométrica, normalizada a GAPDH, confirmó una disminución reproducible tras el tratamiento con estatinas (Figura 4B). A continuación, para determinar si este efecto se extiende in vivo, evaluamos la expresión de GPX4 mediante inmunohistoquímica (IHC) en los tumores YR1.7 tratados con simvastatina y observamos una marcada reducción, lo que demuestra que el tratamiento con estatinas suprime la expresión de GPX4 también in vivo (Figura 4D-E). Tanto los tumores tratados como los no tratados mostraron una histología H&E comparable, que incluía melanocitos epiteloideos y fusiformes pobremente diferenciados con infiltrados inflamatorios mixtos, mitosis y restos apoptóticos (Figura 4D). En el melanoma humano, el análisis de los datos de secuenciación de ARN masiva del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA) mostró que la expresión de GPX4 se correlacionó positivamente con MVK, MVD y FDPS (Figura S4A). Curiosamente, también existieron correlaciones negativas significativas entre GPX4 y HMGCR y FDFT1 (Figura S4B). Estos resultados sugieren que la regulación de la vía del mevalonato de la expresión de GPX4 también puede producirse en los tumores de los pacientes, lo que sugiere que la restauración de la actividad de la vía del mevalonato podría revertir los efectos del tratamiento con estatinas. De acuerdo con esto, la adición de mevalonato a las células YR1.7 tratadas con estatinas rescató la muerte celular, lo que apoya nuestra hipótesis (Figura 4F). El mevalonato también rescató la muerte celular inducida por estatinas en las células MC38 (Figura 4G). Cabe destacar que el mevalonato no rescató la muerte celular inducida por RSL3, lo que sugiere que se dirige específicamente al mecanismo de muerte celular inducida por estatinas en lugar de actuar como un inhibidor de la ferroptosis de amplio espectro (Figura S4C). Varios productos aguas abajo de la vía del mevalonato más allá del IPP han demostrado tener un impacto en la ferroptosis, sin embargo, y esto no descartó la posibilidad de que el mevalonato rescate la muerte celular inducida por estatinas aumentando ellos en lugar de IPP y GPX4. La coenzima Q10 (CoQ10) es un antioxidante que atrapa radicales utilizado por la proteína supresora de la ferroptosis 1 (FSP1) para prevenir la ferroptosis [^[30]-^[31]], se ha informado de que el escualeno altera el metabolismo lipídico celular y protege a las células de la ferroptosis en un modelo de linfoma anaplásico de células grandes [^[32]], y el 7-deshidrocolesterol (7-DHC) se descubrió recientemente que suprime la ferroptosis en una línea celular de linfoma de Burkitt [^[33]]. También se ha demostrado que la inhibición de la captación de colesterol induce la ferroptosis en las células de linfoma, y se ha demostrado que el propio colesterol actúa como un supresor endógeno de la ferroptosis [^[34]-^[36]]. A pesar de estos hallazgos, la suplementación con CoQ10, escualeno, 7DHC o colesterol no logró rescatar la muerte celular inducida por estatinas (Figura S4D-F). También observamos que las estatinas aumentan los niveles de la proteína promotora de la ferroptosis ACSL4 (Figura 4A, 4C). Sin embargo, la inhibición de ACSL4 con la tiazolidinediona pioglitazona fue insuficiente para prevenir la muerte celular inducida por estatinas (Figura S4G).

Las estatinas mejoran las respuestas al bloqueo del punto de control α-PD1 y promueven la ferroptosis in vivo

Múltiples estudios han demostrado que el aumento de la ferroptosis intratumoral potencia el efecto del bloqueo de los puntos de control inmunitario [^[37]–^[44]]. Teniendo esto en cuenta, especulamos que las estatinas podrían mejorar las respuestas al bloqueo de los puntos de control inmunitario al promover la ferroptosis. Para evaluar esto, probamos los efectos de α-PD1 y simvastatina, por separado y en combinación, sobre el crecimiento tumoral de YR1.7 y MC38 in vivo. Por sí solas, α-PD1 y simvastatina promovieron la eliminación del tumor y prolongaron la supervivencia en el 20% al 60% de los ratones (Figura 5A–D). Sin embargo, cuando administramos α-PD1 y simvastatina juntas, este resultado aumentó a casi el 100% de los ratones (Figura 5A–D). Esta mejor respuesta se correspondió con un aumento de los lípidos peroxidados intratumorales y la MDA, lo que sugiere que la ferroptosis es el mecanismo de muerte celular responsable de la eliminación del tumor in vivo (Figura 5E–F).

Discusión

El potencial terapéutico de las estatinas en el cáncer ha sido documentado en una variedad de modelos, y se le han atribuido varios mecanismos [^[15]]. Comenzamos demostrando que las estatinas inducen la muerte celular en líneas celulares de melanoma derivadas de pacientes y que una menor expresión de los genes de la vía del mevalonato se correlaciona con mejores resultados en el melanoma humano. Basándonos en estos hallazgos, combinamos evaluaciones funcionales y fenotípicas de la muerte celular, datos transcriptómicos y modelos tumorales sinérgicos en líneas celulares de melanoma murino y cáncer colorrectal para demostrar que las estatinas lipofílicas promueven uniformemente la ferroptosis al agotar GPX4 y que la ferroptosis inducida por estatinas potencia las respuestas inmunitarias antitumorales tras el bloqueo del punto de control α-PD1.

En este estudio, encontramos que la muerte celular inducida por estatinas en YR1.7 y MC38 exhibió características clave de la ferroptosis, incluida la disminución de GPX4 y podría ser revertida por inhibidores de la ferroptosis (ferrostatin-1 y liproxstatin-1) para la mayoría de las estatinas lipofílicas. Estos resultados son consistentes con estudios previos que muestran que las estatinas inhiben la síntesis de selenoproteínas y que la muerte celular inducida por estatinas presenta características de la ferroptosis y puede ser revertida por inhibidores de la ferroptosis, aunque esto no es universal para todas las estatinas [^[11], ^[45]–^[47]]. En línea con nuestros hallazgos, otros informes sobre la muerte celular inducida por estatinas in vitro se limitan principalmente a las estatinas lipofílicas, y el efecto se ha atribuido a la generación de especies reactivas de oxígeno y al agotamiento de metabolitos como el mevalonato y el IPP, que son críticos para la isopentenilación y el mantenimiento de la abundancia de GPX4 [^[48]–^[52]]. Otros informes muestran que las estatinas inducen e inhiben la apoptosis y la piroptosis en una variedad de contextos [^[53]–^[56]]. Por lo tanto, sigue siendo probable que la modalidad de muerte celular en la que participan las estatinas sea principalmente la ferroptosis, pero también puede depender del contexto. Esto es evidente en otras áreas de la biología, como la lesión renal isquémica, por ejemplo, donde la ferroptosis, la necroptosis y la piroptosis parecen desempeñar funciones superpuestas en la lesión tisular y la inflamación [^[57]–^[58]].

Los vínculos entre la síntesis de colesterol, las estatinas y la ferroptosis no se limitan a los estudios sobre la muerte celular inducida por estatinas. Como se discutió anteriormente, se ha demostrado que los metabolitos del mevalonato aguas abajo, CoQ10, escualeno, 7-DHC y colesterol, previenen la ferroptosis en varios contextos [^[29]–^[35]]. Las estatinas también pueden inhibir la síntesis de CoQ10, un inhibidor de la ferroptosis, pero nuestros estudios no mostraron una reversión de la muerte celular inducida por estatinas mediante la administración de CoQ10. Además, en las células de cáncer colorrectal derivadas de pacientes, se identificó la síntesis de colesterol como un regulador de la "stemness" y la resistencia a los fármacos [^[59]]. El mismo estudio demostró que la pérdida de HMGCR o FDPS conduce a la regulación al alza del metabolismo del ácido araquidónico, lo que promueve la ferroptosis, y nuestro análisis transcriptómico replicó este hallazgo en YR1.7 y MC38 [^[60]]. La represión de la vía del mevalonato y la inducción de la ferroptosis también se han identificado de forma independiente como mecanismos de la supresión tumoral mediada por p53 [^[61]–^[62]]. Si bien estos dos mecanismos aún no se han relacionado, es posible que cooperen para restringir la tumorigénesis. Además, la HMG-CoA aumenta después del tratamiento con estatinas y puede modificar directamente el sitio activo de la sintasa de ácidos grasos, que sintetiza ácidos grasos de cadena larga [^[62]]. No se ha evaluado si esta alteración influye en la dinámica lipídica celular y la sensibilidad a la ferroptosis.

Algunos estudios han demostrado un papel de la ferroptosis tumoral en las respuestas inmunoterapéuticas [^[36]–^[43]]. Aquí, mostramos que la simvastatina promueve la ferroptosis para estimular las respuestas inmunitarias antitumorales, tanto por sí sola como en combinación con α-PD1. Esto se basa en trabajos previos que muestran que la simvastatina tiene un efecto sinérgico con la inmunoterapia en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y el carcinoma de células claras de ovario, y la lovastatina tiene el mismo efecto en el cáncer de pulmón de células no pequeñas [^[56], ^[63]–^[65]], aunque estos estudios no dilucidaron el papel de la ferroptosis en esta respuesta inmunitaria antitumoral. Se ha demostrado que el colesterol limita la proliferación, induce el agotamiento y disminuye la formación de memoria en las células T CD8+ [^[66]–^[68]]. Sin embargo, las estatinas no reducen significativamente el colesterol sérico en los ratones, por lo que es poco probable que una reducción del colesterol pueda explicar los efectos antitumorales que observamos. Más allá de los tumores primarios, dos grupos también han demostrado que las estatinas suprimen la metástasis del cáncer por sí solas y en combinación con otros agentes [^[49], ^[69]]. Aunque ninguno de ellos evaluó específicamente la ferroptosis como un mecanismo de este efecto, representa un contribuyente probable y otra área interesante para futuras investigaciones, dado que se ha demostrado que la desregulación de la homeostasis del colesterol promueve la resistencia a la ferroptosis y la metástasis en múltiples líneas celulares de cáncer de mama y melanoma [^[70]].

Finalmente, nuestra línea celular de melanoma derivada de pacientes y nuestros datos de expresión génica subrayan el potencial terapéutico de dirigir la vía del mevalonato en pacientes con melanoma. Aunque algunos estudios retrospectivos han mostrado un beneficio general en la supervivencia asociado con el uso de estatinas en el melanoma [^[71]–^[73]], y más de 95 ensayos clínicos están investigando actualmente los efectos anticancerígenos de las estatinas, hay muy pocos datos clínicos prospectivos publicados disponibles. Actualmente, se está llevando a cabo un ensayo clínico de fase II (NCT06157099, finalización prevista el 1 de septiembre de 2029) para evaluar si la atorvastatina administrada a pacientes con melanoma de alto riesgo en estadio IIA, IIB o IIIA, tras la resección, puede prevenir las tasas de metástasis, ya que las estatinas también son inhibidores de la formación de nuevos vasos linfáticos. Sin embargo, hasta donde sabemos, ningún estudio ha examinado el impacto del uso de estatinas en la supervivencia específicamente para pacientes con melanoma que reciben inmunoterapia [^[71]–^[73]], que ahora son el tratamiento más prometedor y el estándar de atención para muchos cánceres. De hecho, el ensayo NCT05636592 es un estudio observacional prospectivo activo (no está reclutando actualmente) diseñado para evaluar la seguridad y la eficacia de los inhibidores de los puntos de control inmunitario en combinación con estatinas en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico avanzado. Dado que muchos pacientes no responden en absoluto a los inhibidores de los puntos de control inmunitario o sufren una recaída después de una respuesta inicial, continuar identificando y probando opciones de tratamiento, como las estatinas, con el potencial de mejorar las respuestas a la inmunoterapia sigue siendo un área crítica para futuras investigaciones.