ENO2 induce la polarización de macrófagos M2 en las células tumorales, lo que favorece la metástasis hepática del cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) se sitúa como el tercer cáncer más prevalente a nivel mundial, con más de 1,9 millones de nuevos casos anuales y una mortalidad impulsada predominantemente por la metástasis a distancia.^[1] Entre los sitios metastásicos, el hígado es el destino más común y letal, representando más del 70% de las muertes relacionadas con el CCR.^[2] Las terapias sistémicas de primera línea actuales, que incluyen agentes dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico y el factor de crecimiento endotelial vascular, han arrojado beneficios limitados en la supervivencia de pacientes con metástasis hepática de cáncer colorrectal (MCCR), especialmente en la gran mayoría con CCR de microsatélites estables (MSS), que presenta resistencia primaria al bloqueo inmunitario con un solo agente.^[3] A pesar de los avances multimodales, que incluyen la resección quirúrgica, la quimioterapia sistémica y las inmunoterapias emergentes, la supervivencia a 5 años para la MCCR sigue siendo inferior al 20%.^[4],^[5] Este sombrío pronóstico subraya la urgente necesidad de descifrar los factores moleculares que impulsan el tropismo hepático y la evasión inmune, características biológicas clave que permiten el crecimiento metastásico.

El nicho metastásico hepático representa un ecosistema dinámicamente remodelado donde la interacción entre las células cancerosas diseminadas y los componentes del estroma dicta la eficiencia metastásica.^[6],^[7] Los macrófagos asociados al tumor (MAT), en particular el subconjunto M2 polarizado inmunosupresor, son arquitectos críticos de este entorno pro-metastásico.^[8],^[9] Facilitan la angiogénesis, el remodelado de la matriz extracelular y la disfunción de las células T a través de redes de citocinas (por ejemplo, interleucina-10, factor de crecimiento transformante-beta) y la expresión de ligandos de puntos de control.^[10] Los estudios preclínicos han demostrado que la focalización de la repolarización o el agotamiento de los MAT inhibe eficazmente la MCCR, sin embargo, la traslación clínica de las terapias dirigidas a los macrófagos (por ejemplo, inhibidores del receptor del factor estimulante de colonias 1) se ha visto obstaculizada por una eficacia modesta con un solo agente y la falta de biomarcadores predictivos.^[11] Los estudios recientes de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de la MCCR han corroborado el predominio de los macrófagos tipo M2 positivos para el receptor de manosilo tipo C 1 (MRC1⁺) y positivos para el ligando de quimiocina C-C motivo 18 (CCL18⁺) en las lesiones metastásicas, revelando su coordinación espacial con los fibroblastos asociados al cáncer y fenotipos metabólicamente reconfigurados.^[12],^[13] Si bien estos estudios ilustran el punto final inmunosupresor de la progresión de la MCCR, persiste una pregunta fundamental: ¿Qué señales derivadas del tumor inician y sostienen esta reprogramación patológica? En particular, el nicho metastásico hepático exhibe un paisaje mucho más inmunosupresor en comparación con los tumores primarios de CCR, con una infiltración marcadamente mayor de MAT tipo M2 y células T funcionalmente agotadas, lo que se considera ampliamente el principal impulsor del fracaso del tratamiento en la enfermedad metastásica. Identificar las "señales inductoras" de las células cancerosas metastásicas que secuestran las células del estroma sigue siendo una brecha crítica.

Curiosamente, las células cancerosas exhiben plasticidad metabólica durante la metástasis, a menudo acoplando la reprogramación glucolítica con funciones "pleiotrópicas" no metabólicas.^[14] La enolasa 2 (ENO2), una enzima glucolítica que cataliza la conversión de 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato, ejemplifica esta dualidad. Más allá de su función canónica en la generación de adenosín trifosfato (ATP), la ENO2 está desregulada en los tumores neuroendocrinos, el cáncer de pulmón y el CCR, donde se correlaciona con la resistencia a la quimioterapia.^[15],^[16] Mecánicamente, la ENO2 puede regular la transcripción génica a través de la translocación nuclear y la inhibición de la histona desacetilasa (HDAC).^[15] La ENO2 también estabiliza las quinasas oncogénicas a través de interacciones proteína-proteína.^[17] Sin embargo, su potencial como regulador maestro de la interacción microambiente inmunitario en la MCCR no se ha explorado en absoluto. Si la ENO2 coordina la formación del nicho metastásico a través de la interacción directa con los moduladores inmunitarios representa una hipótesis biológica convincente.

Para abordar esto, utilizamos scRNA-seq pareada de tumores primarios de CCR, tejidos adyacentes normales y metástasis hepáticas de pacientes con MCCR en comparación con pacientes no metastásicos. Combinado con la validación funcional, identificamos las células cancerosas ENO2⁺ como impulsores específicos de la metástasis de la transición epitelio-mesenquimal (TEM). Mecánicamente, descubrimos un nuevo complejo proteico ENO2-factor de migración de macrófagos (MIF): la ENO2 se une directamente a la MIF en las células de CCR, estabiliza la MIF al inhibir la ubiquitinación y degradación mediada por CHIP, lo que activa la señalización de la MIF para promover la interacción tumor-macrófago e inducir la polarización M2. Un nuevo complejo proteico ENO2-MIF activa las interacciones tumor-macrófago e induce la polarización M2, mientras que el inhibidor del complejo ENO2-MIF, piritiona, puede intervenir eficazmente en la MCCR. Nuestro trabajo establece la ENO2 como un orquestador pleiotrópico de la MCCR, que conecta la señalización intracelular con la reprogramación inmune a través de la interacción directa de proteínas, lo que reveló una vulnerabilidad que se puede atacar en el CCR metastásico.

Resultados

El atlas de una sola célula revela una mayor malignidad en las lesiones metastásicas hepáticas

Para delinear el ecosistema celular de la MCCR, realizamos scRNA-seq en 15 muestras de tejido obtenidas de 6 pacientes: 3 con CCR no metastásico (CCR-nM) y tres con MCCR. Para los pacientes con MCCR, las muestras pareadas incluyeron tumores colorrectales primarios (CCR), tejidos intestinales adyacentes y metástasis hepáticas (MH). Las características clinicopatológicas de los pacientes se resumen en la Fig. 1a.

En los tres pacientes con MCCR, el agrupamiento no supervisado identificó las células epiteliales como el compartimento dominante dentro de los tejidos tumorales tanto en los sitios primarios como en los metastásicos (Fig. 1b–d), y el subagrupamiento adicional de las células epiteliales reveló un enriquecimiento de las células cancerosas en los tumores en comparación con los tejidos adyacentes (Fig. 1e, f). Fundamentalmente, las células cancerosas de las metástasis hepáticas exhibieron múltiples evidencias de una mayor malignidad en comparación con sus contrapartes en el sitio primario. La mayor inestabilidad genómica se evidenció mediante puntuaciones de variación del número de copias (CNV) significativamente más altas (Fig. 1g), acompañada de una regulación al alza de la transcripción de los impulsores de la proliferación y los genes sensibles a la hipoxia (Fig. 1h). Estas alteraciones moleculares convergieron en fenotipos funcionalmente amplificados, con las células metastásicas que demostraron una capacidad de proliferación y adaptación a la hipoxia marcadamente aumentadas (Fig. 1i, j). En conjunto, nuestro atlas de una sola célula delinea el ecosistema celular de la MCCR y descubre una mayor malignidad, marcada por una mayor inestabilidad genómica, capacidad proliferativa y adaptación hipóxica en las lesiones metastásicas hepáticas en comparación con los tumores primarios.

El descubrimiento basado en módulos de subpoblaciones de células cancerosas preparadas para la metástasis

Para descubrir las subpoblaciones de células cancerosas preparadas para la metástasis, realizamos un análisis basado en módulos sobre los datos de scRNA-seq. La reducción de dimensionalidad UMAP (aproximación uniforme de múltiples proyecciones) de las células tumorales reveló ocho subgrupos mecánicos distintos tanto en las lesiones metastásicas como en las primarias (Fig. 2a, b, Fig. S1a). Estos subgrupos exhibieron diferentes grados de malignidad según la puntuación de CNV (Fig. 2c, Fig. S1b, c).

A continuación, aplicamos un modelo de análisis de módulos para agrupar las células cancerosas y comparamos los resultados con los subgrupos asociados a la metástasis identificados anteriormente. Las células con puntuaciones positivas para el "Módulo 11" se enriquecieron predominantemente en los subgrupos de células cancerosas 1, 2 y 3, que colectivamente exhibieron características de células cancerosas metastásicas (Fig. 2d, Fig. S2). Es importante destacar que varios genes dentro del "Módulo 11" se correlacionaron significativamente con un mal pronóstico en los pacientes con CCR del conjunto de datos de adenocarcinoma de colon (COAD) del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA), según lo determinado por un modelo de regresión de Cox multifactorial (Fig. 2e).

Analizamos además los perfiles de células individuales de las lesiones in situ en pacientes metastásicos y no metastásicos (Fig. S3a–d). Centrándonos en las lesiones primarias, la reducción de dimensionalidad UMAP identificó seis subgrupos, cuya distribución difería entre los pacientes metastásicos y no metastásicos (Fig. 2f, g). La evaluación de las características malignas clásicas en estos subgrupos reveló que el subgrupo de células cancerosas 3 exhibió una marcada firma de transición epitelio-mesenquimal (TEM), lo que sugiere su posible papel en el inicio de la metástasis (Fig. 2h, i). En conjunto, estos hallazgos sugieren que el conjunto de genes del "Módulo 11" se ajusta a las características de expresión de las células de CCR metastásicas y señala una subpoblación distinta de células cancerosas (subgrupo 3) con características de TEM que pueden representar un estado preparado para la metástasis en los tumores primarios.

La ENO2 impulsa la progresión metastásica y sirve como un objetivo terapéutico

Basándonos en la identificación de firmas asociadas a la metástasis, destilamos 10 genes candidatos del "Módulo 11" y los perfiles de las células cancerosas 3 (Fig. 3a, Fig. S4a, b). Entre estos, solo la ENO2 surgió como un determinante pronóstico significativo, con una alta expresión que se correlacionó con una reducción marcada de la supervivencia en los pacientes con CCR (Fig. 3b). La validación clínica en las cohortes de Nanjing y Guangzhou confirmó la regulación al alza concurrente de la ENO2 en los tumores primarios y las metástasis hepáticas en comparación con los tejidos normales (Fig. 3c, Fig. S4c, d), lo que estableció su correlación negativa con la supervivencia del paciente (Fig. 3d). La correlación entre la expresión de la ENO2 y la MCCR se validó utilizando el conjunto de datos GSE41258 y la herramienta en línea TNMplot^[18] (Fig. S5a–c). La interrogación funcional en modelos de ratón C57BL/6 J reveló profundos efectos supresores de la metástasis de la ablación de la ENO2. Los ensayos de xenoinjerto subcutáneo demostraron una atenuación significativa del crecimiento tumoral en los grupos de eliminación de la ENO2, como lo evidenciaron la reducción del volumen y el peso del tumor (Fig. 3e). Fundamentalmente, los modelos de inyección esplénica mostraron una supresión de la colonización hepática en las células deficientes en ENO2, con una reducción de más del 50% en los nódulos metastásicos (Fig. 3f).

La relevancia terapéutica se subrayó aún más mediante la inhibición farmacológica de la ENO2 (ENOblock), que bloqueó eficazmente su función pro-metastásica (Fig. 3g). La inmunofluorescencia multiplex confirmó el vínculo mecanicista entre la ENO2 y la inducción de la TEM, mostrando la característica pérdida de E-caderina y la ganancia de vimentina en los tumores que expresan ENO2 (Fig. 3h). Esto sugiere que la focalización de la ENO2 tiene ciertas perspectivas de aplicación clínica.

La ENO2 orquesta la polarización de los macrófagos M2 a través de la interacción directa con la MIF

Para investigar cómo las células cancerosas moldean el microambiente tumoral (TME), analizamos la comunicación entre células utilizando CellChat. El análisis reveló que las células cancerosas ENO2⁺ eran los principales centros de señalización dentro del TME, con la vía de señalización de la MIF que exhibía señales salientes/entrantes particularmente fuertes y específicas (Fig. 4a, Fig. S6a–d). Centrándonos en las interacciones mediadas por la MIF, encontramos que las células cancerosas ENO2⁺ mostraron una comunicación significativamente mayor con los macrófagos en comparación con las células cancerosas ENO2⁻ (Fig. 4b, c, Fig. S6e, f). Esta predicción computacional se alineó con nuestra observación de que los macrófagos en las lesiones metastásicas exhibieron una mayor tendencia a la polarización M2 que los de los tumores primarios o no metastásicos (Fig. 4d).

Para dilucidar la base mecanicista, identificamos la unión física directa entre ENO2 y MIF mediante co-inmunoprecipitación (Co-IP) acoplada a espectrometría de masas (Fig. 4e, f, Fig. S7a). Esta interacción fue directa, como lo demostró un ensayo de "pull-down" de glutatión S-transferasa (GST) in vitro utilizando proteínas recombinantes purificadas (Fig. 4g). Para definir la interfaz molecular, realizamos simulaciones de acoplamiento molecular, que predijeron un modo de unión específico entre ENO2 y MIF (Fig. 4h). Los experimentos de Co-IP posteriores utilizando mutantes específicos de dominio de ambas proteínas validaron estas predicciones, mostrando que la interrupción de la interfaz predicha abolió por completo su unión (Fig. 4i). Estos resultados establecen una interacción física directa entre ENO2 y MIF en las células cancerosas y sugieren que esta interacción subyace a la señalización mediada por MIF mejorada de las células cancerosas ENO2+ a los macrófagos, promoviendo un nicho inmunosupresor polarizado hacia M2.

ENO2 estabiliza MIF al inhibir la degradación mediada por ubiquitina para activar la señalización pro-metastásica

A continuación, investigamos la consecuencia funcional de la interacción ENO2-MIF. Un ensayo de ligación de proximidad (PLA) confirmó la interacción endógena ENO2-MIF in situ dentro de las células cancerosas (Fig. 5a). Funcionalmente, la inhibición de la expresión de ENO2 en las células DLD-1 condujo a una marcada disminución de los niveles de proteína MIF, mientras que su sobreexpresión en las células HCT-116 aumentó la abundancia de MIF, lo que sugiere que ENO2 regula positivamente los niveles de MIF en estado estacionario (Fig. 5b).

Dado que se sabe que MIF está regulado por la degradación proteasómica mediada por ubiquitina, exploramos si ENO2 estabiliza MIF al interferir con este proceso. El tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 restauró los niveles de MIF en las células con inhibición de ENO2 y los elevó aún más en las células con sobreexpresión de ENO2 (Fig. 5c, Fig. S8). En las células tratadas con MG132, la inhibición de ENO2 mejoró significativamente la poliubiquitinación de MIF, mientras que la sobreexpresión de ENO2 ejerció el efecto opuesto (Fig. 5d).

Los experimentos de mapeo de dominios confirmaron que esta estabilización requiere interfaces de unión intactas, ya que los mutantes del dominio catalítico de ENO2 no lograron proteger a MIF de la ubiquitinación (Fig. 5e, f, Fig. S7b, c). Finalmente, examinamos el impacto en la señalización oncogénica descendente. La modulación de la expresión de ENO2 alteró correspondientemente los niveles de fosforilación de STAT3 y la subunidad P65 de NF-κB (Fig. 5g), dos vías clave activadas por MIF. Estos datos demuestran que ENO2 se une a la proteína MIF y la estabiliza antagonizando la poliubiquitinación mediada por CHIP y la posterior degradación proteasómica, potenciando así la activación dependiente de MIF de la señalización de STAT3 y NF-κB en las células cancerosas.

ENO2 induce la polarización de macrófagos M2 para impulsar la metástasis hepática

Para investigar si el eje ENO2-MIF remodela funcionalmente el microambiente inmunitario tumoral, primero analizamos su relación espacial. El análisis transcriptómico espacial reveló una co-localización significativa entre las células cancerosas ENO2+ y los macrófagos tipo M2 en las lesiones metastásicas (Fig. 6a, Fig. S9a). El análisis de correlación cuantitativa en múltiples muestras ST confirmó una correlación positiva consistente y significativa (todos los P < 0,001) entre estas dos poblaciones (Fig. S9b). Esta asociación espacial nos llevó a probar si las células cancerosas que expresan ENO2 podrían inducir directamente la polarización M2.

Utilizando sistemas de cocultivo in vitro, encontramos que los macrófagos cocultivados con células cancerosas con inhibición de ENO2 mostraron un aumento del marcador M1 (CD86) y una disminución de los marcadores M2 (CD206), mientras que aquellos cocultivados con células con sobreexpresión de ENO2 mostraron la tendencia opuesta (Fig. 6b, Fig. S10a, b). Esta polarización M2 dependiente de ENO2 se reprodujo in vivo, como lo demuestra una mayor proporción de macrófagos CD206+ en los xenoinjertos derivados de células con sobreexpresión de ENO2 en comparación con los controles (Fig. 6c, Fig. S10c). El papel crítico de ENO2 intrínseco a las células cancerosas se confirmó aún más utilizando organoides derivados de pacientes (PDO); los macrófagos cocultivados con PDO con inhibición de ENO2 tenían un fenotipo M2 reducido, mientras que aquellos cocultivados con PDO con sobreexpresión de ENO2 exhibieron una polarización M2 mejorada (Fig. 6d, Fig. S10d, e).

Luego, evaluamos el impacto funcional de este eje en la metástasis in vivo. En un modelo de metástasis hepática por implantación esplénica utilizando ratones C57BL/6 J, la sobreexpresión de ENO2 en las células cancerosas promovió significativamente la formación de metástasis hepáticas (Fig. 6e, f). Es importante destacar que este efecto pro-metastásico se abolió con el tratamiento con el inhibidor de MIF ISO-1 o el inhibidor de la polarización M2 LPS. Por el contrario, la metástasis atenuada resultante de la inhibición de ENO2 se recuperó administrando el agonista M2 IL-4 o forzando la sobreexpresión de MIF en las células cancerosas (Fig. 6e, f), y la inmunohistoquímica confirmó la abundancia de polarización M2 entre los grupos (Fig. S10f, g). Estos resultados demuestran que las células cancerosas ENO2+, a través de la secreción de MIF, impulsan la polarización de macrófagos M2 en el microambiente tumoral, lo que a su vez facilita la formación de metástasis hepáticas.

ENO2 recluta a HSP90 para antagonizar la ubiquitinación y degradación mediada por CHIP de MIF

Para dilucidar aún más cómo ENO2 estabiliza MIF, buscamos identificar sus interacciones moleculares. El análisis de espectrometría de masas de los complejos de ENO2 identificó la proteína de choque térmico 90 (HSP90) como un socio de unión (Fig. 7a), lo que se confirmó mediante la co-inmunoprecipitación recíproca de proteínas endógenas (Fig. 7b, c). Curiosamente, los experimentos de Co-IP revelaron que ENO2 mejoró la asociación física entre HSP90 y MIF, lo que sugiere que ENO2 actúa como un andamio para reclutar a HSP90 a MIF (Fig. 7d).

Dado que se sabe que la ligasa E3 CHIP se dirige a las proteínas cliente de HSP90 para su degradación,^[19] hipotetizamos que ENO2 podría proteger a MIF antagonizando a CHIP. En consonancia con esto, la reducción de los niveles de MIF tras la inhibición de ENO2 se recuperó mediante la depleción concurrente de CHIP (Fig. 7e), mientras que la acumulación de MIF inducida por la sobreexpresión de ENO2 se suprimió mediante la coexpresión de CHIP (Fig. 7f). Mecánicamente, la inhibición de ENO2 mejoró notablemente la poliubiquitinación mediada por CHIP de MIF (Fig. 7g).

Para definir el sitio de ubiquitinación, generamos mutantes de MIF en los que se sustituyeron las lisinas candidatas (K32, K66, K77). Los ensayos de ubiquitinación revelaron que la mutación en K66, pero no en K32 o K77, abolió sustancialmente la poliubiquitinación mediada por CHIP de MIF (Fig. 7h, i), identificando a K66 como el sitio primario. En conjunto, estos resultados demuestran que ENO2 recluta a HSP90 a MIF, formando un complejo tripartito que inhibe competitivamente la ligasa E3 CHIP, suprimiendo así la ubiquitinación mediada por CHIP de MIF en K66 y su posterior degradación proteasómica.

Identificación y validación de piritiona de zinc como inhibidor de la interacción ENO2-MIF y su efecto anti-metastásico in vivo

Para traducir nuestros hallazgos mecanicistas en una posible estrategia terapéutica, buscamos identificar un inhibidor de molécula pequeña que se dirija a la interacción ENO2-MIF mediante un enfoque de cribado in silico. Se filtró secuencialmente una biblioteca de 6723 compuestos a través de la evaluación de absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad (ADME/T), el acoplamiento molecular de varios niveles y la mecánica molecular con el área de superficie de Born generalizada (MM-GBSA) para la puntuación de la energía libre de unión (Fig. 8a). Entre los mejores candidatos, el diclorhidrato de piritiona de zinc exhibió una de las afinidades de unión predichas más favorables (Fig. 8b). En los experimentos de validación, los compuestos seleccionados, incluida la piritiona de zinc, interrumpieron eficazmente la interacción entre ENO2 y MIF en los ensayos de Co-IP y aumentaron la ubiquitinación de MIF (Fig. 8c). El acoplamiento molecular sugirió que la piritiona de zinc se une de forma estable en la interfaz ENO2-MIF (Fig. 8d), una predicción respaldada aún más por perfiles de desviación cuadrática media (RMSD) estables y favorables de fluctuación cuadrática media de residuos (RMSF) en las simulaciones de dinámica molecular (Fig. 8e).

A continuación, evaluamos la eficacia anti-metastásica de la piritiona de zinc in vivo utilizando un modelo de metástasis hepática (Fig. 8f). La administración oral de piritiona de zinc (10 o 20 mg/kg) inhibió significativamente la formación de metástasis hepáticas en comparación con el control vehículo, como lo demuestra una señal bioluminiscente reducida y menos nódulos metastásicos en la superficie del hígado (Fig. 8g). El análisis histológico confirmó una marcada disminución de la carga metastásica dentro del parénquima hepático. En consonancia con el papel del eje ENO2-MIF en la activación de la señalización de STAT3 y NF-κB, los tejidos tumorales de los ratones tratados con piritiona de zinc mostraron niveles reducidos de MIF y una disminución de la fosforilación de STAT3 y P65 (Fig. 8h). Estos resultados identifican la piritiona de zinc como un nuevo inhibidor de la interacción ENO2-MIF y demuestran su potente actividad anti-metastásica in vivo, destacando el potencial terapéutico de dirigirse a esta interfaz proteína-proteína.

En resumen, revelamos un nuevo mecanismo de CRLM: ENO2 se une a MIF, inhibiendo su degradación por ubiquitinación mediada por CHIP, activando así la vía de MIF, induciendo la polarización de macrófagos M2 e impulsando la supresión inmunitaria y la proliferación metastásica. Este mecanismo de metástasis hepática depende de la participación conjunta de las células cancerosas ENO2+ y los macrófagos M2, y un nuevo inhibidor de la interacción ENO2-MIF, la piritiona de zinc, puede intervenir eficazmente en el proceso de metástasis hepática. Este estudio identifica a ENO2 como un objetivo clave para bloquear la CRLM.

El atlas de células individuales revela una mayor malignidad en las lesiones metastásicas hepáticas

Para delinear el ecosistema celular de la CRLM, realizamos secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) en 15 muestras de tejido obtenidas de 6 pacientes: 3 con CRC no metastásico (CRC-nM) y tres con CRLM. Para los pacientes con CRLM, se incluyeron muestras emparejadas que incluían tumores colorrectales primarios (CRC), tejidos intestinales adyacentes y metástasis hepáticas (LM). Las características clinicopatológicas de los pacientes se resumen en la Fig. 1a.

En los tres pacientes con CRLM, la agrupación no supervisada identificó las células epiteliales como el compartimento dominante dentro de los tejidos tumorales tanto en los sitios primarios como en los metastásicos (Fig. 1b-d), y la agrupación secundaria de las células epiteliales reveló un enriquecimiento de células cancerosas en los tumores en comparación con los tejidos adyacentes (Fig. 1e, f). En particular, las células cancerosas de las metástasis hepáticas exhibieron múltiples evidencias de una mayor malignidad en comparación con sus contrapartes del sitio primario. La mayor inestabilidad genómica se evidenció mediante puntuaciones de variación del número de copias (CNV) significativamente más altas (Fig. 1g), acompañada de una regulación ascendente de la transcripción de los impulsores de la proliferación y los genes sensibles a la hipoxia (Fig. 1h). Estas alteraciones moleculares convergieron en fenotipos funcionalmente amplificados, con las células metastásicas que demostraron una capacidad de proliferación y adaptación a la hipoxia marcadamente aumentadas (Fig. 1i, j). En conjunto, nuestro atlas de células individuales delinea el ecosistema celular de la CRLM y descubre una mayor malignidad, marcada por una mayor inestabilidad genómica, capacidad proliferativa y adaptación a la hipoxia en las lesiones metastásicas hepáticas en comparación con los tumores primarios.

Descubrimiento basado en módulos de subpoblaciones de células cancerosas preparadas para la metástasis

Para descubrir las subpoblaciones de células cancerosas preparadas para la metástasis, realizamos un análisis basado en módulos sobre los datos de secuenciación de ARN de células individuales. La reducción de dimensionalidad UMAP (aproximación de Manifold Uniforme) de las células tumorales reveló ocho subgrupos mecánicos distintos tanto en las lesiones metastásicas como en las primarias (Fig. 2a, b, Fig. S1a). Estos subgrupos exhibieron diferentes grados de malignidad según la puntuación de CNV (Fig. 2c, Fig. S1b, c).

A continuación, aplicamos un modelo de análisis de módulos para agrupar las células cancerosas y comparamos los resultados con los subgrupos asociados a la metástasis identificados anteriormente. Las células que obtuvieron una puntuación positiva para el ‘Módulo 11’ se encontraron predominantemente enriquecidas en los subgrupos de células cancerosas 1, 2 y 3, que colectivamente exhibieron características de células cancerosas metastásicas (Fig. 2d, Fig. S2). Es importante destacar que varios genes dentro del ‘Módulo 11’ se correlacionaron significativamente con un mal pronóstico en pacientes con CRC del conjunto de datos del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA) de adenocarcinoma de colon (COAD), según lo determinado por un modelo de regresión de Cox multifactorial (Fig. 2e).

Analizamos además los perfiles de células individuales de lesiones in situ en pacientes metastásicos y no metastásicos (Fig. S3a–d). Centrándonos en las lesiones primarias, la reducción de dimensionalidad UMAP identificó seis subgrupos, cuya distribución difería entre los pacientes metastásicos y no metastásicos (Fig. 2f, g). La evaluación de las características malignas clásicas en estos subgrupos reveló que el subgrupo de células cancerosas 3 presentaba una marcada firma de transición epitelio-mesenquimal (EMT), lo que sugiere su posible papel en el inicio de la metástasis (Fig. 2h, i). En conjunto, estos hallazgos sugieren que el conjunto de genes del ‘Módulo 11’ se ajusta a las características de expresión de las células de CRC metastásicas y señala una población distinta de células cancerosas (subgrupo 3) con características de EMT que pueden representar un estado de predisposición a la metástasis en los tumores primarios.

ENO2 impulsa la progresión metastásica y sirve como un objetivo terapéutico

Basándonos en la identificación de firmas asociadas a la metástasis, seleccionamos 10 genes candidatos del ‘Módulo 11’ y de los perfiles de las células cancerosas 3 (Fig. 3a, Fig. S4a, b). Entre estos, solo ENO2 surgió como un determinante pronóstico significativo, con una alta expresión que se correlacionó con una reducción notable de la supervivencia en pacientes con CRC (Fig. 3b). La validación clínica en las cohortes de Nanjing y Guangzhou confirmó la sobreexpresión concurrente de ENO2 en los tumores primarios y las metástasis hepáticas en comparación con los tejidos normales (Fig. 3c, Fig. S4c, d), lo que estableció su correlación negativa con la supervivencia de los pacientes (Fig. 3d). La correlación entre la expresión de ENO2 y la metástasis hepática de cáncer de colon y recto (CRLMs) se validó utilizando el conjunto de datos GSE41258 y la herramienta en línea TNMplot^[18] (Fig. S5a–c). La investigación funcional en modelos de ratón C57BL/6 J reveló profundos efectos supresores de la metástasis de la ablación de ENO2. Los ensayos de xenoinjerto subcutáneo demostraron una atenuación significativa del crecimiento tumoral en los grupos con depleción de ENO2, como lo evidenciaron la reducción del volumen y el peso tumoral (Fig. 3e). Crucialmente, los modelos de inyección esplénica mostraron una supresión de la colonización hepática en las células deficientes en ENO2, con una reducción de los nódulos metastásicos en más del 50% (Fig. 3f).

La relevancia terapéutica se reforzó aún más mediante la inhibición farmacológica de ENO2 (ENOblock), que bloqueó eficazmente su función pro-metastásica (Fig. 3g). La inmunofluorescencia multiplex confirmó el vínculo mecanicista entre ENO2 y la inducción de EMT, mostrando la característica pérdida de E-caderina y el aumento de vimentina en los tumores que expresan ENO2 (Fig. 3h). Esto sugiere que el direccionamiento de ENO2 tiene ciertas perspectivas de aplicación clínica.

ENO2 orquesta la polarización de macrófagos M2 a través de la interacción directa con MIF

Para investigar cómo las células cancerosas moldean el microambiente tumoral (TME), analizamos la comunicación célula-célula utilizando CellChat. El análisis reveló que las células cancerosas ENO2+ eran los principales centros de señalización dentro del TME, y la vía de señalización de MIF exhibía señales salientes/entrantes particularmente fuertes y específicas (Fig. 4a, Fig. S6a–d). Centrándonos en las interacciones mediadas por MIF, encontramos que las células cancerosas ENO2+ mostraron una comunicación significativamente mejorada con los macrófagos en comparación con las células cancerosas ENO2- (Fig. 4b, c, Fig. S6e, f). Esta predicción computacional se alineó con nuestra observación de que los macrófagos en las lesiones metastásicas exhibieron una mayor tendencia a la polarización M2 que los de los tumores primarios o no metastásicos (Fig. 4d).

Para dilucidar la base mecanicista, identificamos la unión física directa entre ENO2 y MIF mediante la co-inmunoprecipitación (Co-IP) acoplada a la espectrometría de masas (Fig. 4e, f, Fig. S7a). Esta interacción fue directa, como lo demostró un ensayo de extracción con GST in vitro utilizando proteínas recombinantes purificadas (Fig. 4g). Para definir la interfaz molecular, realizamos simulaciones de acoplamiento molecular, que predijeron un modo de unión específico entre ENO2 y MIF (Fig. 4h). Los experimentos de Co-IP posteriores utilizando mutantes específicos de dominio de ambas proteínas validaron estas predicciones, mostrando que la interrupción de la interfaz predicha abolió por completo su unión (Fig. 4i). Estos resultados establecen una interacción física directa entre ENO2 y MIF en las células cancerosas y sugieren que esta interacción sustenta la señalización mediada por MIF mejorada de las células cancerosas ENO2+ a los macrófagos, promoviendo un nicho inmunosupresor polarizado hacia M2.

ENO2 estabiliza MIF al inhibir la degradación mediada por ubiquitina para activar la señalización pro-metastásica

A continuación, investigamos la consecuencia funcional de la interacción ENO2-MIF. Un ensayo de ligación de proximidad (PLA) confirmó la interacción endógena ENO2-MIF in situ dentro de las células cancerosas (Fig. 5a). Funcionalmente, la eliminación de ENO2 en las células DLD-1 condujo a una marcada disminución de los niveles de proteína MIF, mientras que su sobreexpresión en las células HCT-116 aumentó la abundancia de MIF, lo que sugiere que ENO2 regula positivamente los niveles de MIF en estado estacionario (Fig. 5b).

Dado que se sabe que MIF está regulado por la degradación proteasómica mediada por ubiquitina, exploramos si ENO2 estabiliza MIF al interferir con este proceso. El tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 restauró los niveles de MIF en las células con depleción de ENO2 y los elevó aún más en las células con sobreexpresión de ENO2 (Fig. 5c, Fig. S8). En las células tratadas con MG132, la eliminación de ENO2 mejoró significativamente la poliubiquitinación de MIF, mientras que la sobreexpresión de ENO2 ejerció el efecto opuesto (Fig. 5d).

Los experimentos de mapeo de dominios confirmaron que esta estabilización requiere interfaces de unión intactas, ya que los mutantes del dominio catalítico de ENO2 no lograron proteger a MIF de la ubiquitina (Fig. 5e, f, Fig. S7b, c). Finalmente, examinamos el impacto en la señalización oncogénica descendente. La modulación de la expresión de ENO2 alteró correspondientemente los niveles de fosforilación de STAT3 y la subunidad P65 de NF-κB (Fig. 5g), dos vías clave activadas por MIF. Estos datos demuestran que ENO2 se une y estabiliza la proteína MIF al antagonizar la poliubiquitinación mediada por CHIP y la posterior degradación proteasómica, potenciando así la activación dependiente de MIF de la señalización de STAT3 y NF-κB en las células cancerosas.

ENO2 induce la polarización de macrófagos M2 para impulsar la metástasis hepática

Para investigar si el eje ENO2-MIF remodela funcionalmente el microambiente inmunitario tumoral, primero analizamos su relación espacial. El análisis transcriptómico espacial reveló una co-localización significativa entre las células cancerosas ENO2+ y los macrófagos similares a M2 en las lesiones metastásicas (Fig. 6a, Fig. S9a). El análisis de correlación cuantitativa en múltiples muestras ST confirmó una correlación consistente y significativa (todas P < 0,001) entre estas dos poblaciones (Fig. S9b). Esta asociación espacial nos impulsó a probar si las células cancerosas que expresan ENO2 podrían inducir directamente la polarización M2.

Utilizando sistemas de cocultivo in vitro, encontramos que los macrófagos cocultivados con células cancerosas con depleción de ENO2 mostraron un aumento del marcador M1 (CD86) y una disminución de los marcadores M2 (CD206), mientras que aquellos cocultivados con células con sobreexpresión de ENO2 mostraron la tendencia opuesta (Fig. 6b, Fig. S10a, b). Esta polarización M2 dependiente de ENO2 se recapitó in vivo, como lo evidenció una mayor proporción de macrófagos CD206+ en los tumores de xenoinjerto derivados de células con sobreexpresión de ENO2 en comparación con los controles (Fig. 6c, Fig. S10c). El papel crítico de ENO2 intrínseco a las células cancerosas se confirmó aún más utilizando organoides derivados de pacientes (PDO); los macrófagos cocultivados con PDO con depleción de ENO2 tenían un fenotipo M2 reducido, mientras que aquellos cocultivados con PDO con sobreexpresión de ENO2 exhibieron una polarización M2 mejorada (Fig. 6d, Fig. S10d, e).

Luego evaluamos el impacto funcional de este eje en la metástasis in vivo. En un modelo de metástasis hepática por implantación esplénica utilizando ratones C57BL/6 J, la sobreexpresión de ENO2 en las células cancerosas promovió significativamente la formación de metástasis hepáticas (Fig. 6e, f). Es importante destacar que este efecto pro-metastásico se abolió con el tratamiento con el inhibidor de MIF ISO-1 o el inhibidor de la polarización M2 LPS. Por el contrario, la metástasis atenuada resultante de la eliminación de ENO2 se rescató ya sea administrando el agonista M2 IL-4 o forzando la sobreexpresión de MIF en las células cancerosas (Fig. 6e, f), y la inmunohistoquímica confirmó la abundancia de polarización M2 entre los grupos (Fig. S10f, g). Estos resultados demuestran que las células cancerosas ENO2+, a través de la secreción de MIF, impulsan la polarización de macrófagos M2 en el microambiente tumoral, lo que a su vez facilita la formación de metástasis hepáticas.

ENO2 recluta a HSP90 para antagonizar la ubiquitina mediada por CHIP y la degradación de MIF

Para dilucidar aún más cómo ENO2 estabiliza MIF, buscamos identificar sus interactores moleculares. El análisis de espectrometría de masas de los complejos de ENO2 identificó la proteína de choque térmico 90 (HSP90) como un socio de unión (Fig. 7a), lo que se confirmó mediante la co-inmunoprecipitación recíproca de proteínas endógenas (Fig. 7b, c). Curiosamente, los experimentos de Co-IP revelaron que ENO2 mejoró la asociación física entre HSP90 y MIF, lo que sugiere que ENO2 actúa como un andamio para reclutar a HSP90 a MIF (Fig. 7d).

Dado que se sabe que la ligasa E3 CHIP tiene como objetivo las proteínas cliente de HSP90 para su degradación,^[19] hipotetizamos que ENO2 podría proteger a MIF al antagonizar a CHIP. En consonancia con esto, la reducción de los niveles de MIF tras la eliminación de ENO2 se rescató con la depleción concurrente de CHIP (Fig. 7e), mientras que la acumulación de MIF inducida por la sobreexpresión de ENO2 se suprimió al coexpresar CHIP (Fig. 7f). Mecánicamente, la eliminación de ENO2 mejoró notablemente la poliubiquitinación mediada por CHIP de MIF (Fig. 7g).

Para definir el sitio de ubiquitina, generamos mutantes de MIF en los que los lisinas candidatos (K32, K66, K77) se sustituyeron. Los ensayos de ubiquitina revelaron que la mutación en K66, pero no en K32 o K77, abolió sustancialmente la poliubiquitinación mediada por CHIP de MIF (Fig. 7h, i), identificando a K66 como el sitio primario. En conjunto, estos resultados demuestran que ENO2 recluta a HSP90 a MIF, formando un complejo tripartito que inhibe competitivamente la ligasa E3 CHIP, suprimiendo así la poliubiquitinación mediada por CHIP de MIF en K66 y su posterior degradación proteasómica.

Identificación y validación de piritiona de zinc como un inhibidor de la interacción ENO2-MIF y su efecto anti-metastásico in vivo

Para traducir nuestros hallazgos mecanicistas en una posible estrategia terapéutica, buscamos identificar un inhibidor de molécula pequeña que se dirija a la interacción ENO2-MIF a través de un enfoque de detección in silico. Se filtró secuencialmente una biblioteca de 6723 compuestos a través de la evaluación de absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad (ADME/T), el acoplamiento molecular de varios niveles y la mecánica molecular con el área de superficie de Born generalizada (MM-GBSA) para la puntuación de la energía libre de unión (Fig. 8a). Entre los mejores candidatos, la piritiona de zinc mostró una de las afinidades de unión predichas más favorables (Fig. 8b). En los experimentos de validación, los compuestos seleccionados, incluida la piritiona de zinc, interrumpieron eficazmente la interacción entre ENO2 y MIF en los ensayos de Co-IP y aumentaron la ubiquitina de MIF (Fig. 8c). El acoplamiento molecular sugirió que la piritiona de zinc se une de manera estable en la interfaz ENO2-MIF (Fig. 8d), una predicción respaldada aún más por una desviación cuadrática media (RMSD) estable y perfiles de fluctuación cuadrática media (RMSF) favorables en las simulaciones de dinámica molecular (Fig. 8e).

A continuación, evaluamos la eficacia antimetastásica del piritionio in vivo, utilizando un modelo de metástasis hepática (Fig. 8f). La administración oral de piritionio (10 o 20 mg/kg) inhibió significativamente la formación de metástasis hepáticas en comparación con el control vehículo, como lo demuestra una señal bioluminiscente reducida y menos nódulos metastásicos en la superficie del hígado (Fig. 8g). El análisis histológico confirmó una marcada disminución de la carga metastásica dentro del parénquima hepático. En consonancia con el papel del eje ENO2-MIF en la activación de la señalización de STAT3 y NF-κB, los tejidos tumorales de los ratones tratados con piritionio mostraron niveles reducidos de MIF y una disminución de la fosforilación de STAT3 y P65 (Fig. 8h). Estos resultados identifican el piritionio como un nuevo inhibidor de la interacción ENO2-MIF y demuestran su potente actividad antimetastásica in vivo, destacando el potencial terapéutico de dirigir esta interfaz proteína-proteína.

En resumen, revelamos un nuevo mecanismo de CRLM: ENO2 se une a MIF, inhibiendo su degradación por ubiquitinación mediada por CHIP, lo que activa la vía de MIF, induce la polarización de macrófagos M2 y promueve la supresión inmune y la proliferación metastásica. Este mecanismo de metástasis hepática depende de la participación conjunta de las células cancerosas ENO2+ y los macrófagos M2, y un nuevo inhibidor de la interacción ENO2-MIF, el piritionio, puede intervenir eficazmente en el proceso de metástasis hepática. Este estudio identifica a ENO2 como un objetivo clave para bloquear el CRLM.

Discusión

El CRLM sigue siendo un desafío clínico letal, y su mal pronóstico subraya la urgente necesidad de descifrar los factores moleculares que impulsan la progresión metastásica.^[20] Aprovechando el secuenciamiento de ARN de una sola célula de lesiones primarias y metastásicas emparejadas anatómicamente en comparación con tejidos no metastásicos, identificamos a ENO2 como un orquestador central del CRLM. Dado que no observamos un efecto directo de ENO2 en la promoción del CRLM en ratones desnudos, estamos más inclinados a creer que ENO2 promueve la metástasis a través de la reprogramación tumoral intrínseca y la regulación inmune extrínseca. Si bien se reconoce convencionalmente que ENO2 es una enzima glucolítica,^[21] nuestro estudio revela su función "multifacética" no metabólica en la patogénesis del CRLM. Más allá de catalizar la producción de fosfoenolpiruvato,^[15] ENO2 se une físicamente y estabiliza a MIF dentro de las células cancerosas, activando la fosforilación de p65 y STAT3 para amplificar la señalización de MIF. Este mecanismo redefine a ENO2 como un andamio de señalización que conecta la plasticidad de las células tumorales con la evasión inmune. En esencia, la estabilización de MIF impulsada por ENO2 activa la comunicación entre células tumorales y macrófagos, induciendo la polarización inmunosupresora M2, una característica que se correlaciona recientemente con la resistencia a la quimioterapia en estudios de secuenciación de ARN de una sola célula.^[22] Esto sugiere que la inhibición de ENO2 también puede prevenir la recurrencia local al atenuar la EMT y la supresión inmune.

Nuestros hallazgos contextualizan el panorama inmunosupresor del CRLM. Si bien trabajos anteriores establecieron la dominancia de los macrófagos similares a M2 en los nichos metastásicos,^[23],^[24] las señales derivadas del tumor que instruyen su polarización siguen siendo esquivas. Demostramos que las células cancerosas ENO2+ inician esta reprogramación a través de MIF, una citocina pleiotrópica conocida por desencadenar la diferenciación M2 a través de las vías CD74/pERK.^[25] Mecánicamente, revelamos que ENO2 se une directamente a MIF y, además, recluta a HSP90 para formar un complejo tripartito, que inhibe competitivamente la poliubiquitinación del sitio K66 mediada por la ligasa E3 CHIP y la degradación proteasómica de MIF. Esto explica la fuerte interacción entre los grupos de tumores ENO2+ y los macrófagos M2, al tiempo que explica las características inmunosupresoras más amplias, como la supresión de las células NK.^[26] Es importante destacar que nuestro diseño de secuenciación de ARN de una sola célula de sitios emparejados reveló un enriquecimiento específico de la metástasis de ENO2, un patrón indetectable en los análisis a granel, lo que resolvió la paradoja de las diferencias transcriptómicas mínimas entre las células cancerosas primarias y metastásicas.^[27]

Las implicaciones terapéuticas surgen de la naturaleza "fármaco-dirigible" de la interfaz ENO2-MIF. Interrumpir este eje podría dirigirse simultáneamente a la EMT y a la polarización M2, ofreciendo ventajas sobre los inhibidores de una sola vía. Clínicamente, los tumores ENO2+/MIF+ pueden identificar a los pacientes para una terapia personalizada, especialmente aquellos con CRLM resistente a la quimioterapia.^[28] Los inhibidores de MIF existentes muestran eficacia preclínica en otros cánceres^[29]; nuestros datos justifican su priorización para el CRLM. Contrariamente a las suposiciones de uniformidad microambiental, nuestro atlas de secuenciación de ARN de una sola célula confirma el remodelado dinámico del TME durante la colonización hepática.^[30] Esta heterogeneidad requiere estrategias de precisión que se dirijan a los mecanismos de adaptación a la metástasis, como el eje ENO2-MIF. Mientras tanto, se deben tener en cuenta varias limitaciones. Primero, nuestra cohorte de descubrimiento de secuenciación de ARN de una sola célula incluyó solo 6 pacientes, y el valor pronóstico y predictivo de ENO2 debe validarse en grandes cohortes clínicas multicéntricas. En segundo lugar, todos los pacientes incluidos no habían recibido tratamiento previo sin quimiorradioterapia neoadyuvante, por lo que el impacto del tratamiento sistémico en el eje ENO2-MIF sigue sin estar claro, lo que puede afectar su aplicación clínica en pacientes previamente tratados.^[31] En tercer lugar, nuestro estudio se centró exclusivamente en la metástasis hepática, y no se ha explorado el papel del eje ENO2-MIF en otros sitios de metástasis distantes del CRC (por ejemplo, pulmón, peritoneo). Finalmente, la especificidad y la seguridad clínica del inhibidor de la interacción ENO2-MIF, el piritionio, deben optimizarse y validarse aún más en estudios preclínicos.

Si bien nuestro estudio se centra en una función no canónica de ENO2, la función estabilizadora de proteínas, su papel como enzima glucolítica requiere la consideración del contexto metabólico y sistémico más amplio de los pacientes con CRLM.^[32] El flujo glucolítico tumoral, impulsado en parte por enzimas como ENO2, se ve influenciado y contribuye al estado metabólico sistémico, incluida la posible caquexia y la alteración de la disponibilidad de nutrientes en los pacientes con cáncer avanzado. Esta reprogramación metabólica dentro del tumor puede intersectarse con el mecanismo descrito aquí. Además, el estado inmunitario del paciente, que a menudo se modula mediante el metabolismo y la nutrición sistémicos, constituye un telón de fondo crítico para la polarización de los macrófagos. El eje ENO2-MIF que identificamos puede servir, por lo tanto, como un nodo que conecta la actividad glucolítica intrínseca del tumor con la modulación inmune extrínseca dentro del nicho metastásico. Además, identificamos y validamos el piritionio como un nuevo inhibidor de molécula pequeña de la interacción ENO2-MIF, que redujo eficazmente la carga de metástasis hepática en ratones, proporcionando una prueba de concepto preclínica para dirigir este eje en el CRLM, especialmente para los pacientes con CRLM MSS que son insensibles al bloqueo del punto de control inmunitario con un solo fármaco. Para las futuras direcciones de investigación, las áreas de alta prioridad incluyen: la validación en una cohorte multicéntrica a gran escala del valor clínico de ENO2; la optimización de la especificidad y las propiedades farmacocinéticas del piritionio para ensayos clínicos sistemáticos; la exploración de la interacción entre la actividad enzimática glucolítica canónica de ENO2 y su función inmunorreguladora no canónica; la evaluación del impacto de la terapia neoadyuvante en el eje ENO2-MIF; y la investigación del papel de este eje en otros sitios de metástasis del CRC.

En conclusión, revelamos un paradigma patogénico en el que las células cancerosas ENO2+ estabilizan a MIF para inducir la polarización de los macrófagos M2, alimentando un ciclo de refuerzo de la supresión inmune y el crecimiento metastásico. Este trabajo cambia el enfoque de la reactividad de las células del estroma a la señalización instructiva del tumor en el nicho metastásico, e identifica a ENO2 como un regulador dual que conecta la reprogramación metabólica intrínseca de las células tumorales con la remodelación del nicho inmune extrínseca. El eje ENO2-MIF que caracterizamos representa un prometedor biomarcador pronóstico y un objetivo terapéutico factible para interceptar la progresión del CRLM y mejorar los sombríos resultados clínicos de los pacientes con CRC metastásico.

Materiales y métodos

Recolección de muestras

Este estudio incluyó a tres pacientes con CRC no metastásico y tres pacientes con CRLM. Todos los pacientes se sometieron a pruebas de imagen preoperatorias (TC/RM) y colonoscopia, con patología postoperatoria que confirmó el adenocarcinoma colorrectal primario (excluyendo el carcinoma hepatocelular en los casos de CRLM). Ninguno de los pacientes recibió radioterapia o quimioterapia neoadyuvante. Durante las 2 a 3 semanas previas a la hospitalización, se guió a los pacientes en la preparación preoperatoria, incluida una dieta, ejercicio, etc. estandarizados. Esto tenía como objetivo no solo prevenir las complicaciones postoperatorias y mejorar la recuperación postoperatoria, sino también fortalecer objetivamente el equilibrio y la comparabilidad entre los diferentes grupos. De los pacientes no metastásicos, se recolectaron tejidos tumorales y tejidos adyacentes emparejados (n = 6 muestras); de los pacientes con CRLM, se obtuvieron tejido tumoral primario, tejido intestinal adyacente y tejidos hepáticos metastásicos (n = 9 muestras), para un total de 15 muestras para la secuenciación de ARN de una sola célula. Durante el seguimiento postoperatorio, el paciente 2 presentó una recurrencia al mes 18. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes, y el protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing (2022-SRFA-142).

Experimento de mapeo de dominios

El gen ENO2 de longitud completa y sus diferentes truncamientos de dominio se amplificaron por PCR. Los productos de PCR se digirieron con enzimas de restricción (EcoRI y BamHI) y se insertaron en el vector pCMV-HA para construir los vectores recombinantes HA-ENO2 (longitud completa), HA-ENO2-N, HA-ENO2-Cat y HA-ENO2-C. Todos los vectores recombinantes se verificaron mediante secuenciación de ADN. Las células 293T se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10⁵ células/pocillo y se cultivaron durante la noche. Los vectores recombinantes (HA-ENO2 de longitud completa o truncamientos) y el vector pcDNA3.1-MIF se cotransfectaron en las células 293T utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 3000. Las células se cultivaron durante 48 horas. Las células se recolectaron y lisaron, y se realizó un ensayo de co-inmunoprecipitación (Co-IP) utilizando el anticuerpo HA Tag (el mismo que en la Sección 3.2). Se utilizó Western blot para detectar la unión de los truncamientos de ENO2 a MIF (se utilizó el anticuerpo MIF para la detección). El dominio de ENO2 que se une a MIF se identificó según la presencia o ausencia de bandas de MIF en el eluido.

Ensayo de cocultivo in vitro

Las células THP-1 se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) que contenía un 10 % de suero fetal bovino (SFB). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10⁶ células/pocillo, y se añadieron 100 ng/mL de miristato de forbol 12-13-acetato (PMA). Las células se cultivaron en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO₂ durante 24 horas para inducir la diferenciación en macrófagos. Después de la inducción, se descartó el medio y los macrófagos se lavaron dos veces con PBS. Se colocaron cámaras de Transwell (tamaño de poro de 0,4 μm) en placas de 6 pocillos. Las células HCT-116 con sobreexpresión o con eliminación de ENO2 (1 × 10⁵ células/pocillo) se sembraron en la cámara superior (en medio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) que contenía un 10 % de SFB). Los macrófagos THP-1 inducidos (5 × 10⁵ células/pocillo) se sembraron en la cámara inferior (en medio RPMI 1640 que contenía un 10 % de SFB). Las células se cocultivaron a 37 °C en una incubadora al 5 % de CO₂ durante 48 horas. Se estableció un grupo de monocultivo (solo células HCT-116 o solo macrófagos) como grupo de control. Los macrófagos en la cámara inferior se recolectaron, se tiñeron con los anticuerpos CD68 y CD206 y se detectaron mediante citometría de flujo para calcular la tasa de macrófagos M2 positivos.

Análisis estadístico

Las variables continuas se compararon utilizando la prueba t de Student (distribución normal) o la prueba de Mann-Whitney U (distribución no normal). Los datos categóricos/ordinales se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. El análisis de supervivencia utilizó la prueba de rango log con curvas de Kaplan-Meier. Se ajustaron las comparaciones múltiples utilizando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg; se consideró estadísticamente significativo un FDR ajustado de p < 0,05. Los análisis se realizaron en R v4.1.2.

El resto de los materiales y métodos se describen en los Materiales Suplementarios.

Este estudio incluyó a tres pacientes con CRC no metastásico y tres pacientes con CRLM. Todos los pacientes se sometieron a pruebas de imagen preoperatorias (TC/RM) y colonoscopia, y la patología postoperatoria confirmó la presencia de adenocarcinoma colorrectal primario (se excluyó el carcinoma hepatocelular en los casos de CRLM). Ninguno de los pacientes recibió radioterapia o quimioterapia neoadyuvante. Durante las 2 a 3 semanas previas a la hospitalización, se proporcionaron instrucciones a los pacientes sobre la preparación preoperatoria, que incluía una dieta y ejercicio estandarizados, etc. Esto tenía como objetivo no solo prevenir complicaciones postoperatorias y mejorar la recuperación postoperatoria, sino también fortalecer objetivamente el equilibrio y la comparabilidad entre los diferentes grupos. De los pacientes no metastásicos, se recolectaron muestras de tumor y tejidos adyacentes (n = 6 muestras); de los pacientes con CRLM, se obtuvieron muestras de tumor primario, tejido intestinal adyacente y tejidos hepáticos metastásicos (n = 9 muestras), lo que dio un total de 15 muestras para la secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq). Durante el seguimiento postoperatorio, el paciente 2 presentó una recurrencia al octavo mes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes, y el protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing (2022-SRFA-142).

Experimento de mapeo de dominios

El gen ENO2 de longitud completa y sus diferentes truncamientos de dominio se amplificaron mediante PCR. Los productos de PCR se digirieron con enzimas de restricción (EcoRI y BamHI) y se insertaron en el vector pCMV-HA para construir los vectores recombinantes HA-ENO2 (de longitud completa), HA-ENO2-N, HA-ENO2-Cat y HA-ENO2-C. Todos los vectores recombinantes se verificaron mediante secuenciación de ADN. Las células 293T se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10⁵ células/pocillo y se cultivaron durante la noche. Los vectores recombinantes (HA-ENO2 de longitud completa o truncamientos) y el vector pcDNA3.1-MIF se cotransfectaron en las células 293T utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 3000. Las células se cultivaron durante 48 horas. Las células se recolectaron y lisaron, y se realizó un ensayo de co-inmunoprecipitación (Co-IP) utilizando el anticuerpo HA Tag (el mismo que en la Sección 3.2). Se utilizó Western blot para detectar la unión de los truncamientos de ENO2 a MIF (se utilizó el anticuerpo MIF para la detección). El dominio de ENO2 que se une a MIF se identificó según la presencia o ausencia de bandas de MIF en el eluido.

Ensayo de co-cultivo in vitro

Las células THP-1 se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10⁶ células/pocillo, y se añadió 100 ng/mL de 12-O-tetradecanilforbol-13-acetato (PMA). Las células se cultivaron en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 horas para inducir la diferenciación en macrófagos. Después de la inducción, se descartó el medio y los macrófagos se lavaron dos veces con PBS. Se colocaron cámaras de Transwell (tamaño de poro de 0,4 μm) en placas de 6 pocillos. Las células HCT-116 con sobreexpresión o con eliminación de ENO2 (1 × 10⁵ células/pocillo) se sembraron en la cámara superior (en medio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) que contenía un 10% de FBS). Los macrófagos THP-1 inducidos (5 × 10⁵ células/pocillo) se sembraron en la cámara inferior (en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FBS). Las células se co-cultivaron a 37 °C en una incubadora al 5% de CO₂ durante 48 horas. Se estableció un grupo de monocultivo (solo células HCT-116 o solo macrófagos) como grupo de control. Los macrófagos en la cámara inferior se recolectaron, se tiñeron con los anticuerpos CD68 y CD206, y se detectaron mediante citometría de flujo para calcular la tasa de macrófagos M2 positivos.

Análisis estadístico

Las variables continuas se compararon utilizando la prueba t de Student (distribución normal) o la prueba de Mann-Whitney U (distribución no normal). Los datos categóricos/ordinales se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. El análisis de supervivencia empleó la prueba de log-rank con curvas de Kaplan-Meier. Se ajustaron las comparaciones múltiples utilizando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg; se consideró estadísticamente significativo un valor de p ajustado por FDR < 0,05. Los análisis se realizaron en R v4.1.2.

El resto de los materiales y métodos se describen en los Materiales Suplementarios.