Secuenciación del exoma completo para identificar neoantígenos personales con alta inmunogenicidad en pacientes con cáncer colorrectal avanzado con estabilidad de microsatélites (MSS).

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado y una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo [^[1]]. Aunque los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICIs) han revolucionado el tratamiento del cáncer, su eficacia en el CCR se limita en gran medida a la minoría de pacientes con tumores con inestabilidad de microsatélites (MSI-H), que representan menos del 5% de los casos avanzados de CCR [^[2], ^[3]]. La terapia celular adoptiva tradicional y las vacunas antitumorales a menudo utilizan antígenos tumorales no específicos, que también se expresan en los tejidos normales, lo que conduce a una eficacia subóptima y efectos secundarios significativos debido a la tolerancia central [^[4], ^[5]].

Con la llegada de la secuenciación de última generación, los neoantígenos específicos del paciente han surgido como objetivos ideales para la inmunoterapia personalizada. Los neoantígenos son verdaderos antígenos específicos del tumor que solo son presentados por las células cancerosas, lo que permite que el sistema inmunitario distinga entre el tejido maligno y el sano y minimice los eventos adversos [^[6]]. La probabilidad de formación de neoantígenos se correlaciona con la frecuencia de mutaciones [^[7]]. El CCR exhibe una densidad de mutaciones promedio de ~10 mutaciones/Mb [^[8]], y se han observado respuestas inmunitarias antitumorales específicas de neoantígenos efectivas en el CCR MSI-H, que se asocia con una alta carga de mutaciones tumorales [^[9]]. Sin embargo, la mayoría de los pacientes con CCR con estabilidad de microsatélites (MSS) no se benefician de los ICIs [^[10]]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar métodos para identificar neoantígenos en el CCR MSS y facilitar las opciones de tratamiento personalizadas para este subtipo.

En el presente estudio, se reclutaron cuatro pacientes con CCR MSS para evaluar el potencial de la inmunoterapia basada en neoantígenos. Se recolectaron muestras de tejido tumoral y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para la identificación de neoantígenos, y se evaluó su inmunogenicidad y sus efectos antitumorales. Nuestros hallazgos sugieren que el desarrollo de inmunoterapias personalizadas basadas en neoantígenos puede ser factible en el CCR MSS.

2. Materiales y Métodos

2.1. Recolección de tejido tumoral y preparación de PBMC

Los pacientes fueron incluidos en función de los siguientes criterios de inclusión: (1) diagnóstico de CCR, con estadios TNM de IIIb-IV; (2) hombres o mujeres de entre 18 y 75 años, con al menos una lesión radiográficamente medible; y (3) pacientes que no habían recibido ningún tratamiento previo. Recolectamos muestras de tejido tumoral de un total de cuatro pacientes que cumplieron con los criterios anteriores del Hospital Oncológico de la Provincia de Yunnan, afiliado a la Universidad Médica de Kunming. Para proteger la privacidad de los pacientes, los pacientes fueron codificados aleatoriamente como Paciente 1 (P1), Paciente 2 (P2), Paciente 3 (P3) y Paciente 4 (P4). Las características clínicas de los cuatro pacientes se enumeran en la Tabla 1.

Las muestras de tumor de pacientes con CCR se obtuvieron de especímenes de biopsia. Un fragmento de cada muestra se fijó en formalina y se incluyó en parafina. El tejido restante se congeló rápidamente en isopentano y se almacenó en nitrógeno líquido en fase vapor.

Se recolectaron PBMC para el monitoreo inmunológico o para obtener muestras. Estas células se separaron mediante centrifugación de gradiente de densidad utilizando la solución Ficoll-Paque (Amersham, Cytiva) y se recolectaron de muestras de sangre periférica de pacientes con CCR, lo que resultó en la generación de células dendríticas inmaduras (DC).

2.2. Secuenciación del ADN y ARN del exoma completo (RNA-seq)

El ADN extraído del tejido tumoral fresco, previo al tratamiento, y de las muestras de sangre correspondientes se purificó y se sometió a hibridación utilizando el kit Agilent SureSelect Target Enrichment System (Tiangen Biotech Co., Ltd.), según las instrucciones del fabricante, y se realizó una secuenciación multiplex de las muestras en la plataforma de secuenciación Illumina NovaSeq 6000. Fastp (v0.23.2) se utilizó para controlar la calidad de los datos de secuenciación brutos y filtrar los datos de baja calidad. Los datos limpios filtrados se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh37/hg19 utilizando el Burrows-Wheeler Aligner (BWA-0.7.12), generando un archivo de Alineación de Secuencia/Mapa (SAM). Los datos de alineación se convirtieron, ordenaron e indexaron utilizando SAMtools (v1.3). Los duplicados se marcaron con SAMBLASTER (0.1.22) para reducir el sesgo. Las variaciones en los resultados de la secuenciación de ADN se eliminaron utilizando GATK (v.4.1.3.0).

RNA-seq genera resultados de lectura de formato FASTQ (extremo de lectura, 150 pb) en la plataforma de secuenciación Illumina NovaSeq 6000. Fastp (v0.23.2) se utilizó para controlar la calidad de los datos de RNA-seq y filtrar los datos de baja calidad. Los datos limpios filtrados se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38/hg38 utilizando el software STAR (versión 2.6.0a), creando un archivo SAM. Basándose en SAMtools (v1.3), el archivo SAM se convirtió en un archivo BAM y se indexó. GATK (v.4.1.3.0) se utilizó para detectar diferencias en los resultados de RNA-seq.

2.3. Identificación y anotación de mutaciones somáticas

VarDict (versión 1.7.0) se utilizó para detectar mutaciones somáticas, que incluyen variantes de un solo nucleótido (SNV) e inserciones y deleciones (indels). Posteriormente, las mutaciones se anotaron utilizando el software Ensembl Variant Effect Predictor (v97). La carga de mutaciones tumorales (TMB) se definió como el número de todas las mutaciones no sinónimas e indels detectadas por Mb del genoma.

2.4. Tipificación del antígeno leucocitario humano (HLA)

El genotipo HLA de los pacientes se evaluó utilizando Polysolver (1.0) [^[11]] y BWA-HLA (1.3) basándose en los datos de secuenciación de ADN. Si Polysolver identificó el mismo genotipo tanto en las muestras tumorales como en las normales, el resultado de Polysolver se adoptó como el genotipo HLA. Cuando este no fue el caso, se utilizó el resultado de BWA-HLA. Si BWA-HLA identificó un genotipo consistente en ambos tipos de muestras, se utilizó su resultado. Cuando ninguno de los dos métodos identificó un acuerdo, se consideraron los resultados de Polysolver y BWA-HLA. Si ambos métodos identificaron el mismo genotipo en la muestra normal, este resultado se utilizó para el genotipo HLA. Las discrepancias entre Polysolver y BWA-HLA resultaron en la adopción del resultado de la muestra normal de Polysolver como el genotipo HLA, aunque se marcó como de baja confianza. Los genotipos HLA de los pacientes se enumeran en la Tabla S1.

2.5. Identificación de neoantígenos

Utilizando una tubería especializada para la detección de neoantígenos llamada TruNeo (YuceBio) [^[12]], se analizaron las mutaciones somáticas no sinónimas, como las SNV, los indels y los cambios de marco de lectura, para predecir los posibles neoantígenos. Primero, se generaron péptidos mutantes que miden entre 8 y 11 y entre 12 y 15 aminoácidos para las predicciones de neoantígenos restringidos por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y clase II, respectivamente. La afinidad de unión de los péptidos a los HLA se predijo utilizando NetMHCpan 3.0 y NetMHCIIpan 3.2 [^[13]]. Los niveles de expresión de los genes mutados se derivaron de los datos de RNA-seq, medidos en transcripciones por millón. Cada péptido se priorizó en función de la afinidad de unión a HLA, el nivel de expresión, la similitud con los péptidos propios y la frecuencia alélica de la mutación. Se seleccionaron como candidatos a neoantígenos los péptidos con una puntuación de prioridad de > 0, y los valores de %rank de < 0,5 indicaron péptidos con una fuerte unión, mientras que los valores de > 0,5 se consideraron de unión débil.

2.6. Análisis del estado de inestabilidad de microsatélites (MSI)

El estado de MSI de una muestra se analizó utilizando el software MSI sensor. Al extraer las lecturas en la región de la cama de microsatélites (MS) de la muestra, se contó la distribución de la longitud de cada MS (es decir, la distribución alélica de cada locus de MS) y se comparó con los datos internos de la distribución alélica del locus de MS del software. El estado MSS (estable) y el estado MSI (inestable) de los loci de MS se juzgaron a partir del nivel de la línea germinal, y se realizó un análisis estadístico de la distribución de MS en la muestra. La proporción de loci MSI al total de loci MS se utilizó para determinar el estado de MS de la muestra. Cuando la puntuación de MSI fue ≥ 20, la muestra se consideró MSI-positiva (MSI-H). El estado de MSI de los cuatro pacientes se enumera en la Tabla 1.

2.7. Síntesis de péptidos candidatos y preparación de vacunas

Los péptidos candidatos fueron sintetizados por GL Biochem (Shanghai) Ltd. con una pureza de ≥ 98% y se confirmaron mediante espectrometría de masas. El polipéptido midió 29 aminoácidos, centrado en el sitio de mutación, con 14 aminoácidos añadidos antes y después del polipéptido, respectivamente. Los péptidos liofilizados se almacenaron como isocianatos a -80 °C. Los neoantígenos de P1 para la inmunoterapia de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) en ratón (ZNF169-A275S y CDH4-V456M) se mezclaron, respectivamente, con 0,5 mg de ácido poliinosínico:policitidílico (poli I:C) (Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.).

2.8. Plásmidos recombinantes de minigenes-pcDNA3.1

Se construyeron minigenes que codifican el aminoácido mutado junto con las secuencias nativas adyacentes (longitud total, 29 aminoácidos) para cada mutación de interés. Se dispusieron múltiples minigenes en tándem sin secuencias de enlace adicionales y se sintetizaron (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai). Cada construcción de minigenes en tándem se insertó en el vector pcDNA3.1 utilizando los sitios de restricción EcoRI y BamHI para generar plásmidos de minigenes-pcDNA3.1. El procedimiento se realizó siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante.

2.9. Establecimiento de transfectantes estables de SW480

Las células SW480 en la fase de crecimiento logarítmico se transfectaron de forma estable con plásmidos de minigenes-pcDNA3.1 utilizando Lipofectamine y PLUS reagent (Invitrogen, San Diego, California, Estados Unidos) según las instrucciones del fabricante. G418 (Invitrogen, San Diego, California, Estados Unidos) se utilizó para seleccionar las células transfectadas positivamente. La eficiencia de la transfección se confirmó mediante RT-PCR.

2.10. Inducción de células T reactivas a neoantígenos (NRT) in vitro

Se aislaron PBMC de pacientes con CCR y se generaron células dendríticas derivadas de monocitos como se describió anteriormente. Las NRT se generaron con modificaciones menores. Después de 7 días de cocultivo con DC autólogas pulsadas con péptidos, los linfocitos se restimularon con DC autólogas pulsadas con péptidos en un medio que contiene 10 ng/mL de IL-7, seguido de la adición de 50 UI/mL de rhIL-2 (Thermo Fisher) 72 h después. Los linfocitos se restimularon a intervalos de 7 días de la misma manera. La mitad del medio se reemplazó cada 3 días con medio fresco que contiene 50 UI/mL de rhIL-2. Después de tres rondas de estimulación, se evaluaron las respuestas de las células T mediante el ensayo de inmunoensayo con puntos de enzimas (ELISpot) de interferón gamma (IFN-γ) y los ensayos de citotoxicidad. Para validar aún más la especificidad del péptido y el procesamiento endógeno, las células T cebadas con péptidos sintéticos se cocultivaron con células SW480 que expresan de forma estable minigenes en tándem. La activación de las células T se evaluó mediante el ensayo ELISpot de IFN-γ y los ensayos de citotoxicidad CCK-8 como se describe a continuación.

2.11. Ensayo ELISpot

IFN-γ en las células T específicas para neoantígenos se detectó utilizando un kit ELISpot (Mabtech) [^[14]]. Las células dendríticas (DCs) se cultivaron según lo descrito previamente [^[15]]. La estimulación de las células T aisladas de las PBMCs con DCs autólogas cargadas con péptidos de neoantígenos individuales (10 μg/mL) e IL-7 (10 ng/mL, PeproTech, Inc.) se realizó en una placa de 24 pocillos. El día 3, se añadió IL-2 (5 μg/mL, PeproTech). Se reemplazó la mitad del medio y se añadieron citocinas cada 3 días, siguiendo el procedimiento descrito en un estudio previo [^[16]]. Después de 10 días, se evaluó la respuesta de IFN-γ de las células T preestimuladas contra los neoantígenos utilizando ensayos ELISpot con un kit ELISpot de IFN-γ humano (Mabtech). Las placas ELISpot se lavaron cinco veces con PBS. Las células T preestimuladas, combinadas con las DCs, que habían sido cargadas con péptidos de neoantígenos, se colocaron en pocillos separados de las placas y se dejaron incubar a 37 °C durante 18-24 h en condiciones de 5% de CO2. Después de otros cinco lavados con PBS, las placas se trataron con 100 μL/pocillo de anti-IFN-γ humano (7-B6-ALP) y se incubaron durante 2 h más a 37 °C. Las placas se lavaron cinco veces con PBS y se incubaron con sustrato BCIP/NBT-plus a temperatura ambiente. Las placas se escanearon posteriormente utilizando un lector ELISpot CTL (Cellular Technology, Inc.). Los datos se analizaron utilizando el software ELISpot (AID). La reactividad de las células T se consideró positiva para los puntos que eran más del doble del tamaño de los del control sin péptido (solo medio).

2.12. Secuenciación del receptor de células T (TCR) y análisis de los clones de TCR específicos para neoantígenos

La sangre periférica postratada recolectada de P1 se incubó con los péptidos positivos para ELISpot del paciente. Las células se recolectaron después de una incubación de 2 semanas para la extracción de ARN. La biblioteca de TCR, ensamblada utilizando cDNA transcrita inversamente a partir de muestras de ARN individuales, se sometió a secuenciación de alto rendimiento. En consecuencia, la diversidad clonal madura, la frecuencia clonal promedio, la convergencia de TCR y los clones enriquecidos se utilizaron para analizar la región de determinación de complementariedad 3 (CDR3) de la cadena beta del receptor de células T (TCR-β).

2.13. Implantación de tumores en ratones y vacunación con neoantígenos

Todos los procedimientos experimentales y los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Colegio Médico del Norte de Sichuan (Nanchong, China) y cumplieron con todas las regulaciones éticas pertinentes (Número de emisión del IACUC: 2022-0038). Todos los procedimientos se diseñaron de acuerdo con los estándares éticos del Consejo Nacional de Investigación para minimizar el sufrimiento animal y el número de animales utilizados. Los animales utilizados en este estudio se obtuvieron del Centro de Animales del Colegio Médico del Norte de Sichuan (SCXK(川)2018-18). Los ratones (n = 10 por grupo) se mantuvieron a una temperatura de 20 ± 2 °C, con un nivel de humedad del 55% ± 10%. Se expusieron a una intensidad de luz de 350 lux (a nivel del banco) y a un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h. Todos los ratones tuvieron acceso a una dieta estándar para roedores y agua ad libitum. Durante el período de alimentación, se controló la salud de los animales dos veces al día y no se observaron eventos adversos.

Se estableció PDX como se describió previamente [^[17], ^[18]]. En resumen, los fragmentos de tumor (20-30 mg) de P1 se implantaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones NOD scid gamma (NSG) de 8 semanas de edad utilizando un trócar. Después del crecimiento del tumor primario, los tumores se recolectaron, se digirieron en solución de colagenasa/hialuronidasa y se inyectaron por vía subcutánea en ratones NSG en Matrigel. Para los experimentos de crecimiento tumoral, se implantaron 3 × 106 células PDX digeridas por vía subcutánea en 100 μL de Matrigel en el flanco derecho de ratones NSG. Una vez establecidos los tumores, los ratones recibieron 3 × 106 PBMCs autólogas por vía intravenosa. Después de 3 días, se inyectaron los ratones por vía subcutánea con la vacuna (0,3 mg de ZNF169-A275S o CDH4-V456M mezclados con 0,5 mg de poli I:C) dos veces por semana durante 3 semanas. Las tasas de crecimiento tumoral se controlaron midiendo la longitud (L) y el ancho (W) del tumor con un calibrador digital tres veces por semana. El volumen se calculó de la siguiente manera: 0,50 × W2 × L. El conjunto de puntos finales humanitarios utilizados para determinar si un animal necesitaba ser sacrificado inmediatamente antes del punto final experimental programado se enumera a continuación: indicadores fisiológicos, como pérdida de peso significativa, dolor persistente, infección grave, insuficiencia orgánica, etc.; cambios de comportamiento, como falta de apetito, actividad reducida, postura anormal, lamido o mordisqueo excesivo, etc.; progreso experimental: si el experimento ha alcanzado sus objetivos esperados o no puede continuar, también se debe considerar la posibilidad de finalizar el experimento; y síntomas relacionados con el tumor: (1) úlceras y necrosis: las úlceras o las áreas necróticas en la superficie del tumor pueden causar dolor e infección; (2) deterioro funcional: si el tumor causa parálisis, dificultad para moverse u otros deterioros funcionales en el ratón, se debe considerar la posibilidad de finalizar el experimento; y (3) síntomas de compresión: la compresión de los tejidos u órganos circundantes por el tumor puede provocar síntomas como dificultad para respirar o problemas de micción. Durante el curso del experimento, ningún animal experimental presentó las condiciones mencionadas anteriormente. Los ratones fueron sacrificados el día 80 después de la inoculación del tumor. La tasa de supervivencia se calculó como el porcentaje de ratones vivos el día 80. En el experimento, todos los ratones se anestesiaron inicialmente con pentobarbital sódico (60 mg/kg, inyección intraperitoneal), seguido de eutanasia mediante dislocación cervical.

2.14. Ensayo de citotoxicidad de células T in vitro

La actividad citotóxica de las células T específicas para neoantígenos se evaluó utilizando el ensayo CCK-8. Las células diana incluyeron células T2 cargadas con péptidos mutados (20 μM) y células SW480 que expresaban de forma estable minigenes. Las células efectoras se cocultivaron con las células diana en las proporciones indicadas. El porcentaje de lisis específica se calculó de la siguiente manera: citotoxicidad celular (%) = [1 − (Ae − Ab)/(Ac − Ab)] × 100, donde Ae es la absorbancia del grupo experimental, Ac es la absorbancia del grupo de control y Ab es la absorbancia de los pocillos en blanco.

2.15. Restimulación ex vivo de células T y evaluación funcional

Para evaluar la especificidad y la función efectora de las células T inducidas por la vacuna, se recolectaron esplenocitos y linfocitos infiltrantes tumorales (TILs) de ratones que presentaban regresión tumoral. Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de los bazo por disociación mecánica y lisis de glóbulos rojos. Los tumores se picaron y se digirieron en solución de colagenasa/hialuronidasa para obtener TILs. Las células se restimularon ex vivo durante 7 días con DCs autólogas cargadas con el péptido de vacuna correspondiente (ZNF169-A275S o CDH4-V456M), con el péptido de control irrelevante o con células SW480 que expresaban de forma estable el minigene tándem que codifica el epítopo mutado. La producción de IFN-γ se midió mediante ELISpot, y la actividad citotóxica contra las células T2 cargadas con péptidos o las células SW480 transfectadas con minigenes se evaluó utilizando el ensayo CCK-8 como se describió anteriormente.

2.16. Análisis estadístico

En el presente estudio, se utilizó el software GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.) para realizar el análisis estadístico. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas para confirmar la significación de las diferencias en las medias. Se compararon los tamaños de los tumores entre los grupos utilizando la prueba de Mann-Whitney U. El análisis de supervivencia se realizó mediante curvas de Kaplan-Meier. Se consideró que un valor de p < 0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.

2.1. Recolección de tejido tumoral y preparación de PBMCs

Los pacientes se incluyeron en función de los siguientes criterios de inclusión: (1) diagnóstico de CRC, con estadios TNM de IIIb-IV; (2) hombres o mujeres de entre 18 y 75 años, con al menos una lesión radiográficamente medible; y (3) pacientes que no habían recibido ningún tratamiento previo. Recolectamos muestras de tejido tumoral de un total de cuatro pacientes que cumplieron con los criterios anteriores del Hospital Oncológico de Yunnan, afiliado a la Universidad Médica de Kunming. Para proteger la privacidad de los pacientes, se codificaron aleatoriamente como Paciente 1 (P1), Paciente 2 (P2), Paciente 3 (P3) y Paciente 4 (P4). Las características clínicas de los cuatro pacientes se enumeran en la Tabla 1.

Las muestras de tumor de pacientes con CRC se obtuvieron de biopsias. Un fragmento de cada muestra se fijó en formalina y se incluyó en parafina. El tejido restante se congeló rápidamente en isopentano y se almacenó en nitrógeno líquido en fase vapor.

Se recolectaron PBMCs para el control inmunológico o para obtener muestras. Estas células se separaron mediante centrifugación de gradiente de densidad utilizando la solución Ficoll-Paque (Amersham, Cytiva) y se recolectaron a partir de muestras de sangre periférica de pacientes con CRC, lo que resultó en la generación de células dendríticas inmaduras (DCs).

2.2. Secuenciación de ADN y ARN de todo el exoma (RNA-seq)

El ADN extraído del tejido tumoral fresco pretratamiento y de las muestras de sangre correspondientes se purificó y se sometió a hibridación utilizando el kit de enriquecimiento de objetivos Agilent SureSelect (Tiangen Biotech Co., Ltd.), según las instrucciones del fabricante, y se realizó una secuenciación multiplex de las muestras de extremo a extremo en la plataforma de secuenciación Illumina NovaSeq 6000. Se utilizó Fastp (v0.23.2) para controlar la calidad de los datos de secuenciación sin procesar y filtrar los datos de baja calidad. Los datos limpios filtrados se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh37/hg19 utilizando el alineador de Burrows-Wheeler (BWA-0.7.12), generando un archivo de alineación/mapa de secuencia (SAM). Los datos de alineación se convirtieron, ordenaron e indexaron utilizando SAMtools (v1.3). Los duplicados se marcaron con SAMBLASTER (0.1.22) para reducir el sesgo. Las variaciones en los resultados de la secuenciación de ADN se eliminaron utilizando GATK (v4.1.3.0).

RNA-seq genera resultados de lectura de formato FASTQ (extremo a extremo, 150 pb) en la plataforma de secuenciación Illumina NovaSeq 6000. Se utilizó Fastp (v0.23.2) para controlar la calidad de los datos de RNA-seq y filtrar los datos de baja calidad. Los datos limpios filtrados se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38/hg38 utilizando el software STAR (versión 2.6.0a), creando así un archivo SAM. Basándose en SAMtools (v1.3), el archivo SAM se convirtió en un archivo BAM y se indexó. Se utilizó GATK (v4.1.3.0) para detectar diferencias en los resultados de RNA-seq.

2.3. Identificación y anotación de mutaciones somáticas

Se utilizó VarDict (versión 1.7.0) para detectar mutaciones somáticas, que incluyen variantes de un solo nucleótido (SNVs) e inserciones y deleciones (indels). Posteriormente, las mutaciones se anotaron utilizando el software Ensembl Variant Effect Predictor (v97). La carga de mutación tumoral (TMB) se definió como el número de todas las mutaciones no sinónimas e indels detectadas por Mb del genoma.

2.4. Tipificación del antígeno leucocitario humano (HLA)

El genotipo HLA de los pacientes se evaluó utilizando Polysolver (1.0) [^[11]] y BWA-HLA (1.3) basándose en los datos de secuenciación de ADN. Si Polysolver identificó el mismo genotipo tanto en las muestras de tumor como en las normales, el resultado de Polysolver se adoptó como el genotipo HLA. Cuando esto no fue así, se consultó el resultado de BWA-HLA. Si BWA-HLA identificó un genotipo consistente en ambos tipos de muestras, se utilizó su resultado. Cuando ninguno de los dos métodos identificó un acuerdo, se consideraron los resultados de Polysolver y BWA-HLA. Si ambos métodos identificaron el mismo genotipo en la muestra normal, este resultado se utilizó para el genotipo HLA. Las discrepancias entre Polysolver y BWA-HLA dieron como resultado la adopción del resultado de la muestra normal de Polysolver como el genotipo HLA, aunque se marcó como de baja confianza. Los genotipos HLA de los pacientes se enumeran en la Tabla S1.

2.5. Identificación de neoantígenos

Utilizando una plataforma especializada para la detección de neoantígenos denominada TruNeo (YuceBio) [^[12]], se analizaron las mutaciones somáticas no sinónimas, como las SNVs, los indels y los cambios de marco de lectura, para predecir posibles neoantígenos. En primer lugar, se generaron péptidos mutantes de 8 a 11 y de 12 a 15 aminoácidos para la predicción de neoantígenos restringidos al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de Clase I y Clase II, respectivamente. La afinidad de unión de los péptidos a los HLA se predijo utilizando NetMHCpan 3.0 y NetMHCIIpan 3.2 [^[13]]. Los niveles de expresión de los genes mutados se obtuvieron a partir de datos de RNA-seq, medidos en transcritos por millón. Cada péptido se priorizó en función de la afinidad de unión a HLA, el nivel de expresión, la similitud con péptidos propios y la frecuencia alélica de la mutación. Se seleccionaron como candidatos a neoantígenos los péptidos con una puntuación de prioridad > 0, y los valores de %rank < 0,5 indicaron una fuerte unión de los péptidos, mientras que los valores > 0,5 se consideraron uniones débiles.

2.6. Análisis del estado de inestabilidad de microsatélites (MSI)

El estado de MSI de una muestra se analizó utilizando el software MSI sensor. Al extraer las lecturas en la región del lecho de microsatélites (MS) de la muestra, se contó y comparó la distribución de la longitud de cada MS (es decir, la distribución alélica de cada locus de MS) con los datos internos de la distribución alélica del locus MS del software. El estado MSS (tipo estable) y el estado MSI (tipo inestable) de los loci MS se determinaron a partir del nivel de la línea germinal, y se realizó un análisis estadístico de la distribución de MS en la muestra. La proporción de loci MSI con respecto al total de loci MS se utilizó para determinar el estado de MS de la muestra. Cuando la puntuación de MSI fue ≥ 20, la muestra se consideró MSI-positiva (MSI-H). El estado de MSI de los cuatro pacientes se muestra en la Tabla 1.

2.7. Síntesis de péptidos candidatos y preparación de vacunas

Los péptidos candidatos fueron sintetizados por GL Biochem (Shanghai) Ltd. con una pureza de ≥ 98% y se confirmaron mediante espectrometría de masas. El polipéptido medía 29 aminoácidos, centrado en el sitio de la mutación, con 14 aminoácidos añadidos antes y después del polipéptido, respectivamente. Los péptidos liofilizados se almacenaron como isocianatos a -80 °C. Los neoantígenos de P1 para la inmunoterapia con xenoinjertos derivados del paciente (PDX) en ratones se mezclaron, respectivamente, con 0,5 mg de ácido poliinosínico:policitidílico (poli I:C) (Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.).

2.8. Plásmidos recombinantes de minigenes-pcDNA3.1

Se construyeron minigenes que codifican el aminoácido mutado junto con las secuencias nativas flanqueantes ascendentes y descendentes (longitud total, 29 aminoácidos) para cada mutación de interés. Se dispusieron varios minigenes en tándem sin secuencias de enlace adicionales y se sintetizaron (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai). Cada construcción de minigenes en tándem se insertó en el vector pcDNA3.1 utilizando los sitios de restricción EcoRI y BamHI para generar plásmidos de minigenes-pcDNA3.1. El procedimiento se realizó siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante.

2.9. Establecimiento de transfectantes estables de SW480

Las células SW480 en la fase de crecimiento logarítmico se transfectaron de forma estable con plásmidos de minigenes-pcDNA3.1 utilizando Lipofectamine y el reactivo PLUS (Invitrogen, San Diego, California, Estados Unidos) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó G418 (Invitrogen, San Diego, California, Estados Unidos) para seleccionar las células transfectadas positivamente. La eficiencia de la transfección se confirmó mediante RT-PCR.

2.10. Inducción de células T reactivas a neoantígenos (NRT) in vitro

Se aislaron las PBMCs de pacientes con CRC y se generaron las células dendríticas derivadas de monocitos según se describió anteriormente. Las NRT se generaron con modificaciones menores. Después de 7 días de cocultivo con células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos, los linfocitos se reestimularon con células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos en un medio que contenía 10 ng/mL de IL-7, seguido de la adición de 50 UI/mL de rhIL-2 (Thermo Fisher) 72 h después. Los linfocitos se reestimularon a intervalos de 7 días de la misma manera. La mitad del medio se reemplazó cada 3 días con medio fresco que contenía 50 UI/mL de rhIL-2. Después de tres rondas de estimulación, se evaluaron las respuestas de las células T mediante el ensayo de inmunoensayo enzimático ligado (ELISpot) de la interferona gamma (IFN-γ) y los ensayos de citotoxicidad. Para validar aún más la especificidad del péptido y el procesamiento endógeno, las células T cebadas con péptidos sintéticos se cocultivaron con células SW480 que expresaban de forma estable minigenes en tándem. La activación de las células T se evaluó mediante el ensayo ELISpot de IFN-γ y los ensayos de citotoxicidad CCK-8 según se describe a continuación.

2.11. Ensayo ELISpot

La IFN-γ en las células T específicas de neoantígenos se detectó utilizando un kit ELISpot (Mabtech) [^[14]]. Las células dendríticas se cultivaron según se describió anteriormente [^[15]]. La estimulación de las células T aisladas de las PBMCs con células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos de neoantígenos individuales (10 μg/mL) e IL-7 (10 ng/mL, PeproTech, Inc.) se realizó en una placa de 24 pocillos. El día 3, se añadió IL-2 (5 μg/mL, PeproTech). La mitad del medio se reemplazó y se añadieron citocinas cada 3 días, siguiendo el procedimiento descrito en un estudio anterior [^[16]]. Después de 10 días, se evaluó la respuesta de IFN-γ de las células T preestimuladas frente a los neoantígenos utilizando ensayos ELISpot con un kit ELISpot de IFN-γ humano (Mabtech). Las placas ELISpot se lavaron cinco veces con PBS. Las células T preestimuladas combinadas con las células dendríticas, que habían sido pulsadas con péptidos de neoantígenos, se colocaron en pocillos separados de las placas y se incubaron a 37 °C durante 18 a 24 h en condiciones de 5 % de CO2. Después de otros cinco lavados con PBS, las placas se trataron con 100 μL/pocillo de anti-IFN-γ humano (7-B6-ALP) para una incubación adicional de 2 h a 37 °C. Las placas se lavaron cinco veces con PBS y se incubaron con sustrato BCIP/NBT-plus a temperatura ambiente. Las placas se escanearon posteriormente utilizando un lector ELISpot CTL (Cellular Technology, Inc.). Los datos se analizaron utilizando el software ELISpot (AID). Se consideró que la reactividad de las células T era positiva para los puntos que eran más del doble del tamaño de los de los controles sin péptido (solo medio).

2.12. Secuenciación del receptor de células T (TCR) y análisis de los clones de TCR específicos de neoantígenos

Se incubaron las muestras de sangre periférica postratada obtenidas de P1 con los péptidos positivos en ELISpot del paciente. Las células se recogieron después de una incubación de 2 semanas para la extracción de ARN. La biblioteca de TCR, ensamblada utilizando cDNA obtenida por transcripción inversa a partir de muestras de ARN individuales, se sometió a secuenciación de alto rendimiento. En consecuencia, se emplearon la diversidad clonal madura, la frecuencia clonal media, la convergencia de TCR y los clones enriquecidos para analizar la región de determinación de la complementariedad 3 (CDR3) de la cadena beta del receptor de células T (TCR-β).

2.13. Implantación de tumores en ratones y vacunación con neoantígenos

Todos los procedimientos experimentales y los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Sichuan Norte (Nanchong, China) y cumplieron con todas las normas éticas pertinentes (Número de aprobación del IACUC: 2022-0038). Todos los procedimientos se diseñaron de acuerdo con los principios éticos del Consejo Nacional de Investigación para minimizar el sufrimiento animal y el número de animales utilizados. Los animales utilizados en este estudio se obtuvieron del Centro de Animales de la Facultad de Medicina de Sichuan Norte (SCXK(川)2018-18). Los ratones (n = 10 por grupo) se mantuvieron a una temperatura de 20 ± 2 °C, con un nivel de humedad del 55 ± 10 %. Se expusieron a una intensidad de luz de 350 lux (a nivel del banco) y a un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h. Todos los ratones tuvieron acceso a una dieta estándar para roedores y agua ad libitum. Durante el período de alimentación, se controló la salud de los animales dos veces al día y no se observaron eventos adversos.

El PDX se estableció según se describió anteriormente [^[17], ^[18]]. En resumen, los fragmentos de tumor (20-30 mg) de P1 se implantaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones NSG machos de 8 semanas de edad utilizando un trócar. Después del crecimiento del tumor primario, los tumores se recogieron, se digirieron en solución de colagenasa/hialuronidasa y se inyectaron por vía subcutánea en ratones NSG en Matrigel. Para los experimentos de crecimiento tumoral, se implantaron por vía subcutánea 3 × 106 células de PDX digeridas en 100 μL de Matrigel en el flanco derecho de ratones NSG. Una vez establecidos los tumores, los ratones recibieron 3 × 106 PBMCs autólogas por vía intravenosa. Después de 3 días, se inyectaron por vía subcutánea en los ratones la vacuna (0,3 mg de ZNF169-A275S o CDH4-V456M mezclados con 0,5 mg de poli I:C) dos veces por semana durante 3 semanas. Las tasas de crecimiento tumoral se controlaron midiendo la longitud (L) y el ancho (W) del tumor con un calibrador digital tres veces por semana. El volumen se calculó de la siguiente manera: 0,50 × W2 × L. El conjunto de puntos finales humanitarios utilizados para determinar si un animal necesitaba ser sacrificado inmediatamente antes del punto final experimental programado se indica a continuación: indicadores fisiológicos, como pérdida de peso significativa, dolor persistente, infección grave, insuficiencia orgánica, etc.; cambios de comportamiento, como falta de apetito, actividad reducida, postura anormal, lamido o mordisqueo excesivo, etc.; progreso experimental: si el experimento ha alcanzado sus objetivos previstos o no puede continuar, también se debe considerar la posibilidad de finalizar el experimento; y síntomas relacionados con el tumor: (1) úlceras y necrosis: las úlceras o las áreas necróticas en la superficie del tumor pueden causar dolor e infección; (2) deterioro funcional: si el tumor causa parálisis, dificultad para moverse u otros deterioros funcionales en el ratón, se debe considerar la posibilidad de finalizar el experimento; y (3) síntomas de compresión: la compresión de los tejidos u órganos circundantes por el tumor puede provocar síntomas como dificultad para respirar o problemas de micción. Durante el transcurso del experimento, ningún animal experimental presentó las condiciones mencionadas anteriormente. Los ratones fueron sacrificados el día 80 después de la inoculación del tumor. La tasa de supervivencia se calculó como el porcentaje de ratones que sobrevivieron hasta el día 80. En el experimento, todos los ratones se anestesiaron inicialmente con pentobarbital sódico (60 mg/kg, inyección intraperitoneal), seguido de la eutanasia por dislocación cervical.

2.14. Ensayo de citotoxicidad de células T in vitro

La actividad citotóxica de las células T específicas de neoantígenos se evaluó utilizando el ensayo CCK-8. Las células diana incluían células T2 pulsadas con péptidos mutados (20 μM) y células SW480 que expresaban de forma estable minigenes. Las células efectoras se cocultivaron con las células diana en las proporciones indicadas. El porcentaje de lisis específica se calculó de la siguiente manera: citotoxicidad celular (%) = [1 − (Ae − Ab)/(Ac − Ab)] × 100, donde Ae es la absorbancia del grupo experimental, Ac es la absorbancia del grupo de control y Ab es la absorbancia de los pocillos en blanco.

2.15. Reestimulación ex vivo de células T y evaluación funcional

Para evaluar la especificidad y la función efectora de las células T inducidas por la vacuna, se recogieron esplenocitos y linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) de ratones que presentaban regresión tumoral. Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de los bazo por disociación mecánica y lisis de glóbulos rojos. Los tumores se picaron y se digirieron en solución de colagenasa/hialuronidasa para obtener los TIL. Las células se reestimularon ex vivo durante 7 días con células dendríticas autólogas pulsadas con el péptido de vacuna correspondiente (ZNF169-A275S o CDH4-V456M), con el péptido de control irrelevante o con células SW480 que expresaban de forma estable el minigene en tándem que codifica el epítopo mutado. La producción de IFN-γ se midió mediante ELISpot y la actividad citotóxica frente a las células T2 pulsadas con péptidos o a las células SW480 transfectadas con minigenes se evaluó utilizando el ensayo CCK-8 según se describe anteriormente.

2.16. Análisis estadístico

En el presente estudio, se utilizó el software GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.) para realizar el análisis estadístico. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas para confirmar la significación de las diferencias en las medias. Se compararon los tamaños de los tumores entre los grupos utilizando la prueba de Mann-Whitney U. El análisis de supervivencia se realizó mediante curvas de Kaplan-Meier. Se consideró que un valor de p < 0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.

3. Resultados

3.1. Detección de mutaciones somáticas y predicción de neoantígenos

Cuatro pacientes diagnosticados con CRC avanzado fueron incluidos en el presente estudio. De cada participante, se obtuvieron muestras de tejido tumoral y células sanguíneas periféricas para realizar secuenciación del exoma completo y análisis de RNA-seq. A través de estos métodos, se identificó un promedio de 142 (rango, 106–175) mutaciones somáticas no sinónimas por paciente (Figura 1A, Figura S1A). Estas mutaciones se analizaron posteriormente para predecir posibles neoantígenos que pudieran unirse a las moléculas MHC de Clase I o II. La Figura 1A y la Figura S1A muestran el número total de mutaciones no sinónimas encontradas dentro de las regiones exónicas del tumor de cada paciente. A partir de estos datos, se predijeron 93, 112, 78 y 126 neoantígenos restringidos a MHC de Clase I de P1, P2, P3 y P4, respectivamente. Además, se identificaron 37, 46, 28 y 49 neoantígenos restringidos a MHC de Clase II de P1, P2, P3 y P4, respectivamente (Tabla S2).

Entre los neoantígenos predichos, un promedio de 19 se clasificó como fuertes, exhibiendo un valor de %rank > 0,5, lo que indica una mayor probabilidad de unión a las moléculas MHC. Por el contrario, un promedio de 123 neoantígenos se clasificó como más débiles, mostrando un valor de %rank > 0,5 (Figura 1B, Figura S1B). Esta información es crucial para comprender la posible respuesta inmune provocada por estos neoantígenos y puede guiar futuras estrategias inmunoterapéuticas. De cada paciente, se seleccionaron 10 péptidos largos (29 aminoácidos de longitud) que están potencialmente asociados con mutaciones y exhiben una fuerte afinidad de unión a HLA. Estos péptidos se sintetizaron químicamente (Tabla 2).

3.2. Los neoantígenos inducen respuestas NRT mejoradas in vitro en pacientes con CRC

Las PBMCs de P1, P2, P3 y P4 se utilizaron para identificar neoantígenos que exhiben una alta inmunogenicidad. De cada paciente, se seleccionaron 10 péptidos largos (29 aminoácidos de longitud) asociados con mutaciones hipotéticas y que demuestran una fuerte afinidad HLA para su síntesis química. La inmunogenicidad de estos péptidos en pacientes con cáncer se determinó utilizando un método sencillo y rápido, que se ajustó ligeramente. La evaluación de la inmunogenicidad de cada polipéptido sintético se realizó utilizando las PBMCs derivadas del respectivo paciente. Los resultados del ensayo ELISpot indicaron que, en comparación con el medio (sin péptido) o el péptido no relacionado VSV-NP43-69 (STKVALNDLRAYVYQGIKSGNPSILHI), los candidatos a neoantígenos SOX9-V144M, ZNF169-A275S, CDH4-V456M, NIM1K-T66M y MAP3K9-R1008Q de P1 (Figura 2); CTDP1-R216Q, SUGT1-P282T, IMMP2L-P114L, ADGRG7-K663E, FBXO41-R577Q y ARFGEF2-W1135R de P2; ASTN1-L297V, CENPI-S306F, AGK-Y30H, CCTBL2-T112K, CDC6-R469C, XPNPEP3-L282H y OPRL1-R341W de P3; y PKHD1-Q3331K, PLXNB2-T922M, CDH12-V199I, OR52K2-I247M y IRF2BP2-P398L de P4 indujeron respuestas de células T específicas de péptidos, como se muestra en el ensayo ELISpot (Figura S2A–C). En particular, SOX9-V144M, ZNF169-A275S, CDH4-V456M y MAP3K9-R1008Q de P1; CTDP1-R216Q, SUGT1-P282T y FBXO41-R577Q de P2; ASTN1-L297V, CENPI-S306F y CDC6-R469C de P3; y PKHD1-Q3331K y OR52K2-I247M de P4 manifestaron distintas respuestas de células T específicas de péptidos (Figura 2, Figura S2A–C).

3.3. Los péptidos mutados elicitan una respuesta NRT mejorada en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje (WT)

Aunque se reclutaron cuatro pacientes para la identificación de neoantígenos, el tejido tumoral y las muestras de sangre obtenidas solo de P1 fueron suficientes para evaluar la capacidad de las NRT para reaccionar tanto con péptidos mutados como con péptidos de tipo salvaje, y para la evaluación de la vacuna. Se utilizaron DCs autólogas de P1 para evaluar la capacidad de las NRT para reaccionar tanto con péptidos mutados como con péptidos de tipo salvaje. Estas DCs se cargaron con uno de los siguientes péptidos mutados: SOX9-V144M, ZNF169-A275S, CDH4-V456M, NIM1K-T66M o MAP3K9-R1008Q. El propósito fue estimular las PBMCs para generar NRT in vitro. Luego, se realizaron específicamente ensayos NRT para los péptidos mutados in vitro. Las respuestas inmunes desencadenadas por estos péptidos mutados se compararon posteriormente con las elicitadas por sus correspondientes péptidos de tipo salvaje. El análisis ELISpot reveló que, tras la estimulación con péptidos mutados, las NRT liberaron cantidades elevadas de IFN-γ, en comparación con los niveles producidos en respuesta a la estimulación con los péptidos de tipo salvaje análogos (Figura 3A).

Para evaluar aún más la citotoxicidad de las NRT, utilizamos células T2 cargadas con polipéptidos mutantes y células SW480 transfectadas con minigenes mutantes correspondientes como células diana. Como se muestra en la Figura 3B–F, las NRT masivas que se dirigen a SOX9-V144M, NIM1K-T66M y MAP3K9-R1008Q, particularmente aquellas contra ZNF169-A275S y CDH4-V456M, mataron eficazmente las células diana que expresan los antígenos mutantes correspondientes en un rango de relaciones efector-diána (E:T). Por el contrario, las NRT no mostraron una citotoxicidad significativa contra las células T2 de control (sin cargar o cargadas con el péptido irrelevante VSV-NP43-69) o contra las células SW480 que no expresaban el péptido mutante. Además, se observó una notable reducción en la diversidad clonal de TCR, un aumento en la frecuencia promedio de los clones y una mayor convergencia de TCR después de la incubación con péptidos mutados. Estos hallazgos sugieren una influencia significativa de los neoantígenos en las características de TCR (Figura S3A–C).

3.4. Los neoantígenos pueden inducir NRT en los ratones PDX in vivo

Para evaluar la inmunogenicidad in vivo de los péptidos candidatos, seleccionamos ZNF169-A275S y CDH4-V456M de P1, cuya inmunogenicidad se había confirmado previamente in vitro, para la inmunización en ratones PDX. Los días 0 y 7, se administró por vía subcutánea una mezcla de ZNF169-A275S y CDH4-V456M (100 μg cada uno) y 50 μg de poli I:C para la inmunización. Los esplenocitos se recolectaron 7 días después de la última inmunización. Una porción de los esplenocitos se utilizó para el ensayo ELISpot de IFN-γ, mientras que las células restantes se cultivaron durante 7 días adicionales con sus péptidos correspondientes, seguido de la separación de células T para la evaluación de la citotoxicidad.

Los resultados del ELISpot demostraron que las NRT específicas de ZNF169-A275S y CDH4-V456M de los ratones PDX inmunizados elicitaron una respuesta de IFN-γ más fuerte tras la estimulación con sus péptidos cognados en comparación con el péptido de tipo salvaje. Por el contrario, la estimulación con medio solo, el péptido no relacionado VSV-NP43-69 o RPS6KA2-P709L indujo solo una secreción a nivel de fondo (Figura 4A). En los ensayos de citotoxicidad, las NRT, particularmente las inducidas por ZNF169-A275S y CDH4-V456M, exhibieron una actividad de eliminación significativa contra las células T2 cargadas con los péptidos mutantes correspondientes y las células SW480-minigene que los expresan. No se observó una citotoxicidad significativa contra las células T2 de control (sin cargar o cargadas con VSV-NP43-69) o las células SW480 que carecían del péptido mutante (Figura 4B, C). Durante todo el experimento, no se observaron reacciones adversas en los ratones.

3.5. Las vacunas de neoantígenos pueden inducir respuestas antitumorales eficaces en un modelo de ratón humano autólogo

Para determinar el potencial de los neoantígenos como una vacuna potente para inhibir el crecimiento tumoral in vivo, se seleccionaron dos polipéptidos mutantes, ZNF169-A275S y CDH4-V456M, de P1. Estos polipéptidos se habían identificado previamente como altamente inmunogénicos in vitro. Luego, se inmunizaron ratones humanos autólogos con estos polipéptidos. Los resultados mostraron que los ratones vacunados con el polipéptido ZNF169-A275S o CDH4-V456M exhibieron un retraso significativo en el crecimiento tumoral (Figura 5A). Además, 8 de 10 ratones vacunados con ZNF169-A275S y 7 de 10 ratones vacunados con CDH4-V456M demostraron una notable supervivencia a largo plazo que superó los 80 días desde la inoculación del tumor (Figura 5B). Por el contrario, todos los ratones del grupo de control sucumbieron entre los días 20 y 40. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la inmunización con los péptidos ZNF169-A275S y CDH4-V456M desencadenó una respuesta antitumoral eficaz in vivo. Los neoantígenos tumorales son antígenos específicos del paciente, que son producidos por mutaciones únicas en los genes del tumor de un paciente. La vacuna de neoantígenos personalizada solo puede activar específicamente las propias células T del paciente para matar las células cancerosas. Por lo tanto, las vacunas preparadas a partir de péptidos de mutación producidos por mutaciones específicas en P1 solo deberían ser eficaces para P1 y deberían ser ineficaces para otros pacientes. No se observaron efectos secundarios adversos en los ratones durante todo el experimento.

Aunque se reclutaron cuatro pacientes para la identificación de neoantígenos, el tejido tumoral y las muestras de sangre recogidas de solo P1 fueron suficientes para evaluar la capacidad de las NRT (células T neoantígeno-reactivas) para reaccionar tanto con péptidos mutados como con péptidos de tipo salvaje (WT, wild-type) y para la evaluación de la vacuna. Se utilizaron DCs (células dendríticas) autólogas de P1 para evaluar la capacidad de las NRT para reaccionar tanto con péptidos mutados como con péptidos de tipo salvaje. Estas DCs se cargaron con uno de los siguientes péptidos mutados: SOX9-V144M, ZNF169-A275S, CDH4-V456M, NIM1K-T66M o MAP3K9-R1008Q. El objetivo era estimular las PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) para generar NRT in vitro. A continuación, se realizaron específicamente ensayos de NRT para los péptidos mutados in vitro. Las respuestas inmunitarias desencadenadas por estos péptidos mutados se compararon posteriormente con las elicitadas por sus correspondientes péptidos de tipo salvaje. El análisis ELISpot reveló que, tras la estimulación con péptidos mutados, las NRT liberaron cantidades elevadas de IFN-γ, en comparación con los niveles producidos en respuesta a la estimulación con los péptidos de tipo salvaje análogos (Figura 3A).

Para evaluar aún más la citotoxicidad de las NRT, utilizamos células T2 cargadas con polipéptidos mutantes y células SW480 transfectadas con los correspondientes minigenes mutantes como células diana. Como se muestra en la Figura 3B-F, las NRT masivas dirigidas contra SOX9-V144M, NIM1K-T66M y MAP3K9-R1008Q, y particularmente aquellas dirigidas contra ZNF169-A275S y CDH4-V456M, mataron eficazmente las células diana que expresaban los correspondientes antígenos mutantes en un rango de relaciones efector/diana (E:T). En contraste, las NRT no mostraron citotoxicidad significativa contra las células T2 de control (sin cargar o cargadas con el péptido irrelevante VSV-NP43-69) o contra las células SW480 que no expresaban el péptido mutante. Además, se observó una notable reducción en la diversidad clonal de los TCR (receptores de células T), un aumento en la frecuencia media de los clones y una mayor convergencia de los TCR tras la incubación con péptidos mutados. Estos hallazgos sugirieron una influencia significativa de los neoantígenos en las características de los TCR (Figura S3A-C).

3.4. Los neoantígenos pueden inducir NRT en los ratones PDX in vivo

Para evaluar la inmunogenicidad in vivo de los péptidos candidatos, seleccionamos ZNF169-A275S y CDH4-V456M de P1, cuya inmunogenicidad se había confirmado previamente in vitro, para la inmunización en ratones PDX. Los días 0 y 7, se administró por vía subcutánea una mezcla de ZNF169-A275S y CDH4-V456M (100 μg cada uno) y 50 μg de poli I:C para la inmunización. Se recolectaron esplenocitos 7 días después de la última inmunización. Una porción de los esplenocitos se utilizó para el ensayo ELISpot de IFN-γ, mientras que las células restantes se cultivaron durante 7 días adicionales con sus péptidos correspondientes, seguido de la separación de células T para la evaluación de la citotoxicidad.

Los resultados del ELISpot demostraron que las NRT específicas para ZNF169-A275S y CDH4-V456M de los ratones PDX inmunizados elicitaron una respuesta de IFN-γ más fuerte tras la estimulación con sus péptidos cognatos en comparación con el péptido de tipo salvaje. En contraste, la estimulación con medio solo, el péptido no relacionado VSV-NP43-69 o RPS6KA2-P709L indujo solo una secreción a nivel de fondo (Figura 4A). En los ensayos de citotoxicidad, las NRT, particularmente aquellas inducidas por ZNF169-A275S y CDH4-V456M, exhibieron una actividad citotóxica significativa contra las células T2 cargadas con los péptidos mutantes correspondientes y las células SW480-minigene que los expresaban. No se observó citotoxicidad significativa contra las células T2 de control (sin cargar o cargadas con VSV-NP43-69) o las células SW480 que carecían del péptido mutante (Figura 4B, C). A lo largo del experimento, no se observaron reacciones adversas en los ratones.

3.5. Las vacunas de neoantígenos pueden inducir respuestas antitumorales eficaces en un modelo de ratón humanizado autólogo

Para determinar el potencial de los neoantígenos como una vacuna potente para inhibir el crecimiento tumoral in vivo, se seleccionaron dos polipéptidos mutantes, ZNF169-A275S y CDH4-V456M, de P1. Estos polipéptidos se habían identificado previamente como altamente inmunogénicos in vitro. A continuación, se inmunizaron ratones humanizados autólogos con estos polipéptidos. Los resultados mostraron que los ratones vacunados con el polipéptido ZNF169-A275S o CDH4-V456M exhibieron un retraso significativo en el crecimiento tumoral (Figura 5A). Además, 8 de 10 ratones vacunados con ZNF169-A275S y 7 de 10 ratones vacunados con CDH4-V456M demostraron una notable supervivencia a largo plazo que superó los 80 días desde la inoculación del tumor (Figura 5B). En contraste, todos los ratones del grupo de control sucumbieron entre los días 20 y 40. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la inmunización con los péptidos ZNF169-A275S y CDH4-V456M desencadenó una respuesta antitumoral eficaz in vivo. Los neoantígenos tumorales son antígenos específicos del paciente, que se producen por mutaciones únicas en los genes del tumor de un paciente. La vacuna de neoantígenos personalizada solo puede activar específicamente las propias células T del paciente para matar las células cancerosas. Por lo tanto, las vacunas preparadas a partir de péptidos de mutación producidos por mutaciones específicas en P1 solo deberían ser eficaces para P1 y deberían ser ineficaces para otros pacientes. No se observaron efectos secundarios adversos en los ratones durante el experimento.

4. Discusión

En el campo de la inmunoterapia en rápida evolución, numerosos estudios se han centrado en el desarrollo de vacunas contra el cáncer. Los neoantígenos, caracterizados por su alta inmunogenicidad, no están sujetos a la tolerancia central tímica [^[19]]. Varios ensayos clínicos de fase I exitosos han aumentado sustancialmente el interés en el desarrollo de vacunas de neoantígenos personalizadas [^[16], ^[20]–^[22]]. Ding et al. [^[23]] informaron que una vacuna de DCs autólogas cargadas con péptidos de neoantígenos personalizados era segura y eficaz en pacientes con cáncer de pulmón avanzado, lo que elicitaba respuestas de células T dirigidas y promovía la inmunidad antitumoral. Estos hallazgos sugieren que las vacunas de neoantígenos personalizadas representan un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores sólidos.

Aunque los ICIs (inhibidores de puntos de control inmunitario) han mejorado los resultados para los pacientes con CRC avanzado MSI-H, aquellos con CRC MSS, que se caracteriza por bajas tasas de mutación y MSs estables, no suelen responder a estas terapias. Las estrategias de inmunoterapia basadas en neoantígenos tienen como objetivo eliminar las células tumorales mejorando las respuestas de las células T del huésped. Los neoantígenos con alta inmunogenicidad tienden a inducir respuestas inmunitarias más fuertes y se han asociado con un mejor pronóstico [^[24], ^[25]], lo que ofrece una vía terapéutica potencial para el CRC MSS.

En este estudio, propusimos un flujo de trabajo para predecir y evaluar los neoantígenos en pacientes con CRC MSS. Se identificaron neoantígenos para cuatro pacientes y se evaluó su inmunogenicidad. Aproximadamente la mitad de los neoantígenos predichos elicitaron respuestas de células T en las PBMCs de los pacientes. Para P1, comparamos aún más la capacidad de respuesta de las NRT a los péptidos mutados frente a los péptidos de tipo salvaje y descubrimos que los péptidos mutados inducían respuestas de células T más eficaces.

La predicción computacional de neoantígenos sigue siendo un desafío, ya que muchos de los candidatos predichos muestran baja inmunogenicidad. Los enfoques tradicionales basados únicamente en la afinidad de unión péptido-MHC tienen una precisión predictiva limitada. En este estudio, utilizamos TruNeo, una herramienta computacional que integra múltiples procesos biológicos más allá de la afinidad de unión, proporcionando una clasificación de los candidatos con una mayor probabilidad de inmunogenicidad [^[12]]. Coherente con las observaciones previas, aproximadamente la mitad de los neoantígenos predichos indujeron una reactividad detectable de las células T in vitro.

Aunque los pacientes con CRC MSS a menudo se consideran inadecuados para la inmunoterapia debido a la baja carga de mutación tumoral, los estudios han demostrado que aún pueden albergar neoantígenos inmunogénicos [^[26]]. Un estudio clínico preliminar de vacunas de neoantígenos personalizadas en CRC MSS sugirió que este enfoque es seguro, factible y capaz de inducir respuestas inmunitarias, lo que podría ofrecer beneficios clínicos [^[10]]. Nuestros hallazgos respaldan la viabilidad de identificar neoantígenos funcionales en CRC MSS utilizando la secuenciación del exoma completo y las predicciones computacionales.

Para evaluar la eficacia in vivo de las vacunas de neoantígenos, utilizamos modelos de ratón humanizados autólogos PDX, que se consideran plataformas preclínicas relevantes para la evaluación de inmunoterapias [^[17], ^[18], ^[27], ^[28]]. Al injertar PDX autólogos emparejados y PBMCs, establecimos modelos de ratón humanizados de CRC completamente autólogos que recapitularon el crecimiento tumoral sin enfermedad de injerto contra huésped y capturaron la variabilidad entre pacientes. En estos modelos, la vacunación con neoantígenos redujo significativamente la carga tumoral, lo que respalda el potencial terapéutico de este enfoque.

Nuestros resultados demuestran una expresión sostenida de neoantígenos y respuestas inmunitarias específicas robustas en los ratones inmunizados, acompañadas de una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con los controles. Estos hallazgos sugieren que la inmunoterapia basada en neoantígenos personalizados puede ser una estrategia eficaz para el manejo del CRC MSS.

4.1. Limitaciones del estudio

Este estudio tiene varias limitaciones. El tamaño de la muestra fue pequeño, con solo cuatro pacientes que cumplieron los criterios de selección para la identificación de neoantígenos. Además, solo se dispuso de tejido tumoral y muestras de sangre suficientes de un paciente para evaluar las respuestas de las células T a los péptidos mutados y de tipo salvaje, así como la evaluación de la vacuna. Debido a la heterogeneidad de los tumores y la naturaleza específica del paciente de los neoantígenos, estos antígenos no se pueden compartir entre los pacientes. Además, aunque se realizó la tipificación HLA para los pacientes, no se evaluó la tipificación HLA de las DCs. Se justifican estudios futuros con tamaños de muestra más grandes, inclusión de la tipificación HLA de las DCs y una validación más completa de los efectos antitumorales tanto en modelos animales como en entornos clínicos.

4.1. Limitaciones del estudio

Este estudio tiene varias limitaciones. El tamaño de la muestra fue pequeño, con solo cuatro pacientes que cumplieron los criterios de selección para la identificación de neoantígenos. Además, solo se dispuso de tejido tumoral y muestras de sangre suficientes de un paciente para evaluar las respuestas de las células T a los péptidos mutados y de tipo salvaje, así como la evaluación de la vacuna. Debido a la heterogeneidad de los tumores y la naturaleza específica del paciente de los neoantígenos, estos antígenos no se pueden compartir entre los pacientes. Además, aunque se realizó la tipificación HLA para los pacientes, no se evaluó la tipificación HLA de las DCs. Se justifican estudios futuros con tamaños de muestra más grandes, inclusión de la tipificación HLA de las DCs y una validación más completa de los efectos antitumorales tanto en modelos animales como en entornos clínicos.

Contribuciones de los autores

Xinqiang Yin y Jingchao Hao diseñaron el experimento, redactaron el manuscrito, supervisaron este estudio y revisaron y editaron el manuscrito. Wenjing Shen y Xinrong He recolectaron y analizaron los datos y revisaron el manuscrito. Dajiang Li, Hongmei Liu, Xiao Tan y Siyu Yang realizaron el ensayo ELISpot. Todos los autores participaron en la redacción del artículo o en su revisión crítica para obtener información relevante. Dajiang Li y Wenjing Shen contribuyeron por igual a este trabajo.

Financiación

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2022JDRCO0149), el Proyecto de Investigación Científica Cooperativa de la Ciudad de Nanchong y la Universidad Médica del Norte de Sichuan (22SXZRKX0014), el Proyecto de Calidad de la Enseñanza e Innovación de Posgrado de la Universidad Médica del Norte de Sichuan 2026 (PGJC2026034), el Proyecto de Ingeniería de Enseñanza Internacional de Estudiantes de la Universidad Médica del Norte de Sichuan 2026 (ISJG2026-13), el Programa de Formación de Innovación para Estudiantes de Pregrado (S202310634095, XJ202410634150, XJ202410634181 y XJ202410634158), el Proyecto de Investigación Básica de la Provincia de Yunnan (202401AY070001-074), el Proyecto de Construcción del Equipo de Innovación de la Universidad Médica de Kunming (CXTD202203) y el Proyecto de Investigación sobre la Reforma de la Enseñanza y la Educación de Pregrado en la Provincia de Yunnan (JG2023001).

Declaración de divulgación

Todos los autores aprobaron la versión final para su publicación.

Declaración ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica del Norte de Sichuan (Nanchong, China; Aprobación No. 1043). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica del Norte de Sichuan (Nanchong, China; Número de emisión del IACUC 2022-0038).

Consentimiento

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes para la publicación del presente artículo.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Material complementario

Se puede encontrar información complementaria en línea, en la sección de Material complementario.