Correlación entre el reconocimiento de organoides tumorales autólogos por los linfocitos infiltrantes tumorales procedentes de cánceres epiteliales metastásicos y la respuesta clínica.

La transferencia adoptiva de células de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) tiene la capacidad de reducir el tamaño de los tumores en pacientes seleccionados con cánceres epiteliales comunes.^[1][3] Si bien el tratamiento con TIL ha demostrado ser exitoso en pacientes con melanoma metastásico, con tasas de respuesta objetiva del 50-70%,^[4] la tasa de respuesta en pacientes con cánceres gastrointestinales es menor, del 7-23%.^[5] Una de las principales tareas en el desarrollo de la terapia con TIL ha sido la identificación de células T que reconozcan antígenos tumores específicos seguros. Los datos de pacientes con cáncer tratados con inhibidores de puntos de control o transferencia adoptiva de células T han establecido la importancia de los productos de las mutaciones tumorales específicas como antígenos en la respuesta inmune a los cánceres humanos.^[6][8] Destacando este descubrimiento está el hecho de que los cánceres con alta carga mutacional, como el melanoma y todos los tumores con deficiencias en la reparación del ADN, tienen las tasas de respuesta más altas a las inmunoterapias basadas en células T. La disponibilidad del secuenciamiento completo del exoma (WES) ha revelado la enorme heterogeneidad de los perfiles de mutación tumoral, con muy pocas mutaciones compartidas entre los tumores, incluso del mismo tipo histológico. Además de esto, nuestro estudio de las respuestas de las células T a las proteínas mutadas específicas del tumor mostró que solo el 1-2% de las proteínas aberrantes codificadas por una mutación tumoral no sinónima podrían generar una respuesta de células T documentada y realmente considerarse un "neoantígeno".^[9] Entre 75 pacientes con cánceres gastrointestinales cuyos linfocitos infiltrantes tumorales fueron analizados para la reactividad de neoantígenos, se descubrieron 124 respuestas de células T. Todos los antígenos eran únicos de un paciente individual, con dos excepciones: las mutaciones de KRAS y p53 generaron respuestas de células T en más de un paciente con TIL, aunque la mayoría fueron contra diferentes sustituciones de aminoácidos o utilizaron diferentes restricciones del antígeno leucocitario humano (HLA). Estos datos ilustran el extremo grado de personalización en las respuestas de las células T a los cánceres de los pacientes. Dada esta situación, tener el tumor autólogo de un paciente como reactivo de laboratorio sería extremadamente valioso en el análisis de las respuestas de las células T. Aunque los melanomas se pueden establecer con cierta frecuencia como cultivos de células tumorales bidimensionales (contribuyendo a gran parte de nuestra comprensión inicial de las respuestas de las células T humanas al cáncer), esto no es cierto para la mayoría de los cánceres epiteliales comunes. Una solución a esto ha sido el uso de cultivos de organoides tridimensionales para estos cánceres.^[10]

Los organoides tumorales derivados del paciente (PDTO) son líneas de células cancerosas tridimensionales cultivadas a partir de tumores resecados quirúrgicamente, que conservan las características histopatológicas y genómicas del tumor original.[11 12] Los PDTO se pueden cultivar con éxito a partir de múltiples histologías, incluidos los cánceres de colon, mama, páncreas, hígado y ovario, y se han utilizado para estudiar la biología tumoral, pero se han explorado menos como reactivos inmunológicos. Estos representan reactivos ex vivo ideales para probar la inmunorreactividad, ya que muestran fielmente la mayoría del perfil de mutación del tumor de origen y pueden conservar importantes problemas específicos del tumor con el procesamiento y la presentación de antígenos, que se enmascaran cuando se utilizan células presentadoras de antígenos normales y profesionales en lugar del tumor autólogo. Además, los organoides suelen tener poca contaminación de tejido normal,^[12] lo que mejora su capacidad para identificar problemas como la pérdida de HLA con mayor precisión que el secuenciamiento del tumor fresco. Los usos actuales de los PDTO en inmunoterapia incluyen cocultivos para generar células tumorales reactivas,[13 14] cocultivos para probar la eficacia de las células T con receptores quiméricos de antígenos (CAR-T)[15 16] y cribado de fármacos para evaluar los inhibidores de los puntos de control inmunitario.[17 18] Anteriormente, hemos demostrado que los PDTO se pueden utilizar para identificar células T específicas de neoantígenos para la transferencia adoptiva de células,^[12], pero existen pocos datos que evalúen la correlación entre la respuesta clínica y el reconocimiento de organoides autólogos por las células TIL específicas de neoantígenos transferidas de forma adoptiva. También buscamos utilizar organoides autólogos para determinar si la expresión tumoral del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y clase II, especialmente bajo la estimulación del interferón gamma (IFN-γ), tenía influencia en la probabilidad de respuesta a la terapia con TIL. Se predice que el reconocimiento directo de los antígenos intrínsecos presentados por el MHC de clase I a las células TIL CD8 se evaluará bien mediante pruebas directas con organoides tumorales, mientras que los antígenos extrínsecos presentados por el MHC de clase II requerirían que los organoides actuaran como células presentadoras de antígenos y expresaran la clase II. Este mismo paradigma se ha observado al analizar las células TIL para la reactividad de neoantígenos utilizando células dendríticas (DC). La electroporación de minigenes que codifican neoantígenos en las DC (lo que lleva a la producción citoplasmática de antígenos) ha sido superior para detectar la reactividad de las células CD8, mientras que la adición exógena de péptidos largos mutados ha sido más sensible para detectar la reactividad de las células TIL CD4.^[9] Los mecanismos de eliminación tumoral por las células T restringidas por el MHC de clase I y clase II parecen ser diferentes. Las células T CD8+ reconocen directamente los complejos péptido-MHC en sus células diana e inducen la muerte mediante apoptosis mediada por receptores o un proceso de exocitosis dependiente de la perforina y la granzima. Este paradigma está respaldado por la evidencia clínica de que la pérdida del MHC de clase I a través de la pérdida de B2M se encuentra en algunos tumores que escapan a la inmunoterapia.^[19] Esta pérdida bialélica es poco común, pero los datos recientes muestran que para el ataque inmunitario específico de CD8+, la pérdida del alelo único que codifica la cadena pesada de la clase I relevante también ocurre y es probablemente más común.^[20] Los datos de ratones de múltiples investigadores y nuestros propios datos no publicados muestran que la deleción completa de los genes de la clase II del tumor B16 no altera su respuesta in vivo a la transferencia adoptiva de células T utilizando células CD4 del ratón transgénico del receptor de células T (TCR) anti-TRP1.^[21] Deseábamos utilizar los PDTO para comprender los papeles relativos de las células CD8 y CD4 en el rechazo tumoral y determinar el impacto de la expresión del MHC tumoral. La esperanza es que la evaluación de las células TIL mediante el reconocimiento de los PDTO autólogos conduzca a una mejor comprensión de las células T que participan en el rechazo del cáncer y revele mecanismos específicos del tumor que beneficien o prevengan la respuesta clínica.

Métodos

Diseño del estudio

El objetivo de este estudio fue explorar si existe una correlación entre la reactividad de las células TIL contra el organoide tumoral autólogo del paciente y los resultados clínicos del paciente después del tratamiento con TIL. Después del tratamiento, se cocultivaron muestras del producto de infusión de células TIL del paciente con el organoide tumoral autólogo que se cultivó en el momento de la metastectomía para la recolección de TIL. Las muestras de PDTO y TIL se obtuvieron de los participantes del estudio que se registraron en ensayos clínicos en curso para recolectar células (NCT00068003) y someterse a un tratamiento con TIL (NCT01174121).

Establecimiento de organoides tumorales derivados del paciente

Los PDTO se establecieron según métodos publicados anteriormente.^[12] Brevemente, se obtuvieron muestras frescas de las reseciones de tumores sólidos y se digirieron mecánicamente y enzimáticamente (Miltenyi Biotec). Después del procesamiento de las células tumorales, se suspendieron en un 80% de Matrigel (Corning) y un 20% de medios específicos de histología. Las suspensiones de células tumorales se colocaron en los bordes de los matraces T75 o T175 y se colocaron en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2. Una vez que el Matrigel se solidificó, se añadió medio específico de histología calentado a los matraces, que se colocaron de nuevo en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2. Si se recolectaron tumores lo suficientemente grandes, se cultivaron múltiples organoides de diferentes áreas del tumor para las investigaciones de la heterogeneidad tumoral.

A medida que los cultivos de organoides crecían hasta la confluencia o se formaban agregados, las líneas de PDTO se pasaron, normalmente cada 2 semanas. En resumen, para pasar las líneas, se trataron con Dispase II (Gibco) a una concentración final de 1 mg/mL durante 2 horas a 37 °C. Las células pelletizadas se trataron luego con 1 mL de TrypLE Express (Gibco) durante 5 minutos. Después de lavar con Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (*Gibco), las células se replantaron en Matrigel y medio y se colocaron de nuevo en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2.

Generación y selección de células TIL para el tratamiento

Las células TIL se cultivaron según lo descrito anteriormente.^[22] Las lesiones metastásicas resecadas de los pacientes se dividieron en múltiples fragmentos de 2-3 mm3 en condiciones estériles y luego se cultivaron por separado en un medio de células T suplementado con 6000 UI/mL de interleucina (IL)-2 recombinante para permitir el crecimiento de los linfocitos. Después de 2-4 semanas de crecimiento, lo que permite una expansión adecuada (cuatro pocillos de 24 pocillos; aproximadamente 8E6 células/fragmento), las células TIL se crioconservaron para su uso clínico futuro y se probaron para el reconocimiento de neoantígenos específicos del paciente según protocolos publicados anteriormente.^[9] En resumen, las muestras de cada fragmento se cultivaron durante 24 horas con células presentadoras de antígenos autólogas del paciente que se habían incubado con grupos de péptidos sintéticos de 25 aminoácidos (PP) que comprenden mutaciones encontradas en el secuenciamiento del exoma completo o se electroporaron con ARN mensajero transcrito in vitro a partir de minigenes tándem (TMG) que codifican las mismas mutaciones específicas del paciente. Cuando los PDTO autólogos estaban disponibles, se incluyeron como objetivo en el cribado de los cultivos de fragmentos de células TIL, junto con un control de PDTO alogénico. Los fragmentos para el tratamiento del paciente se seleccionaron en función de la liberación de IFN-γ en ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISpot) y la regulación ascendente del 4-1BB% mediante citometría de flujo. Todos los pacientes que se sometieron a terapia celular adoptiva debían tener un reconocimiento claro de los neoantígenos autólogos por los cultivos de fragmentos de células TIL cocultivados con sus DC que expresaban sus TMG o péptidos largos sintéticos, según lo descrito anteriormente.^[5] Los fragmentos reactivos que exhibieron una fuerte reactividad a los neoantígenos específicos del paciente mediante IFN-γ y/o 4-1BB se descongelaron y se expandieron rápidamente con anti-CD3, células presentadoras de antígenos irradiadas e IL-2 para el tratamiento del paciente. Los pacientes elegibles recibieron una infusión de células TIL después de someterse a un régimen de quimioterapia no mieloablativa que redujo el número de linfocitos, que consistió en ciclofosfamida y fludarabina en dosis altas, junto con pembrolizumab e IL-2 en dosis altas.^[5] La dosis celular (tabla 1) varió debido a las limitaciones de la iniciación de la quimioterapia y la programación de expansión rápida concurrente y osciló entre 2,5 y 15 E10 células.

Ensayos de cocultivo in vitro que utilizan PDTO y TIL

Para realizar ensayos de cocultivo, los PDTO se recogieron según lo descrito anteriormente, 24 horas antes del ensayo. Se trataron con 10 ng/mL de IFN-γ y se dejaron reposar en placas de 24 pocillos con ultra baja adherencia a 37 °C. En promedio, los organoides utilizados en los cocultivos se habían pasado seis veces, con un rango de 2 a 14; cuando se presentaron múltiples números de pasajes, se utilizó el pasaje más temprano. El día del cocultivo, los organoides se lavaron tres veces en DMEM enriquecido y luego se transfirieron a la placa de ensayo a 4 x 10^4 células por pocillo en 100 µL de medio para células T. Se descongelaron alícuotas de los productos de infusión de TIL crioconservados recibidos por los pacientes 24 horas antes del cocultivo y se incubaron durante la noche en medio para células T Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% de suero humano AB y antibiótico-antimicótico) que contenía 300 U/mL de IL-2, en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a 37 °C. Las células T CD8+ se seleccionaron de los productos de infusión utilizando el kit de enriquecimiento de células T CD8+ humanas EasySep (STEMCELL Technologies). Se agregaron células T a los pocillos que contenían organoides a 4 x 10^4 células por pocillo en 100 µL de medio para células T. Se utilizaron organoides alogénicos como control negativo, y las células T se trataron con 12-phorbol 13-miristato (PMA)/ionomicina como control positivo. El cocultivo se realizó durante 18 a 20 horas a 37 °C y 5% de CO2. La reactividad de los TIL de los organoides se determinó mediante la liberación de IFN-γ por ELISpot y el aumento del 4-1BB% mediante citometría de flujo realizada en el analizador Attune CytPix (Thermo Fisher) y analizada utilizando FlowJo (V.10.10.0, TreeStar). La reactividad de las células T se basó principalmente en el porcentaje de células 4-1BB+ en comparación con los controles negativos, y la reactividad se definió como el doble de los controles de fondo y >3% (con la sustracción de PDTO alogénicos). Se muestra un ejemplo de la estrategia de clasificación en la figura suplementaria en línea 1. Los ensayos ELISpot de IFN-γ se utilizaron como confirmación cualitativa de los datos de 4-1BB debido a la alta variabilidad intraensayo en el tamaño y la densidad de los puntos positivos. Los ensayos de reactividad de los PDTO en los productos de infusión se realizaron al menos dos veces con resultados concordantes en 28 de 30 duplicados. Los dos pacientes restantes repitieron su ensayo una tercera y una cuarta vez, con acuerdo en 2 de 3 y 3 de 4 réplicas.

Evaluación de la respuesta

La respuesta de los pacientes a la terapia con TIL se midió utilizando los Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST) V.1.0, con la primera imagen realizada de 4 a 6 semanas después de la infusión de TIL, seguida de imágenes cada 8 a 12 semanas hasta la progresión de la enfermedad. Los pacientes deben presentar una reducción >30% en la suma de los diámetros más largos de los tumores medidos en dos visitas consecutivas para ser considerados respondedores objetivos. Este grupo de pacientes es un subconjunto de los tratados en el ensayo NCT01174121. Los resultados del ensayo de fase 2 en curso se han informado recientemente;^[5] sin embargo, este análisis incluye pacientes con histologías adicionales además de los cánceres gastrointestinales.

Anticuerpos para citometría de flujo

Después del cocultivo nocturno, las células T se tiñeron con los siguientes anticuerpos utilizando la concentración sugerida por el fabricante (BD Biosciences): CD8-Alexa Fluor700 (clon RPA-T8), CD3-FITC (clon SK7), CD4-PE (clon SK3), CD137-APC (clon 4B4-1). Para evaluar la expresión de MHC, los organoides (con o sin pretratamiento con IFN-γ durante 48 horas) se tiñeron con anti-humano HLA-A, B, C-FITC (clon W6/32, BioLegend) y anti-humano HLA-DR-PE (clon LN3, BioLegend).

Análisis estadístico

Todo el análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism V.10.1.1 para Windows (GraphPad Software). Los grupos se compararon utilizando la prueba exacta de Fisher para variables categóricas y la prueba de Mann-Whitney para variables continuas no paramétricas. Se consideró significativo un valor de P