Las neuronas entéricas modulan el ciclo celular de las células del cáncer colorrectal a través de un eje PCSK1 - metionina-encefalina.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo un importante desafío para la salud mundial, y se clasifica como el tercer cáncer más diagnosticado y la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo [^[1], ^[2]]. A pesar de los importantes avances en la detección temprana y el tratamiento, la naturaleza compleja y heterogénea de la progresión del CCR continúa limitando la eficacia terapéutica y los resultados en los pacientes [^[3]]. Tradicionalmente, se ha considerado una enfermedad impulsada principalmente por la transformación epitelial, pero las pruebas cada vez mayores subrayan el papel crucial del microambiente tumoral (MET) en la configuración de las características distintivas del CCR [^[4]].

El MET del CCR es heterogéneo a nivel celular y, dada su ubicación en el tejido cólico, está ricamente inervado tanto por neuronas extrínsecas de las vías simpáticas y espinales como por las neuronas del sistema nervioso entérico (SNE) [^[5]]. El SNE es la mayor colección de neuronas heterogéneas y células gliales fuera del cerebro y, por lo tanto, proporciona la mayor parte de la inervación a varias células del tracto gastrointestinal (GI) para regular diversas funciones del GI [^[6]]. Las neuronas del SNE inervan las células epiteliales intestinales y regulan sus funciones vitales, incluida la proliferación saludable de las células madre intestinales [^[6]–^[8]]. Esta interacción entre las neuronas del SNE y las células de la mucosa se extiende desde la salud hasta las condiciones oncológicas, ya que informes anteriores detallan la interacción anatómica y molecular entre las neuronas del SNE y las células del cáncer colorrectal (CCR) [^[9], ^[10]]. Esta interacción SNE-CCR permite la propagación del CCR al permitir que las células del CCR migren a lo largo de las fibras neuronales del SNE y promueve la proliferación de las células del CCR de forma dependiente de la serotonina [^[9], ^[10]]. Sin embargo, si bien los estudios existentes se centran principalmente en cómo el SNE, ya sea en estados saludables o desregulados (como a través de la sobreexpresión de serotonina), promueve la patología del CCR, se sabe poco sobre los mecanismos en estado estacionario a través de los cuales el SNE puede restringir la proliferación del CCR, incluso después de que hayan surgido las mutaciones genéticas iniciadoras del CCR. Identificar estas vías moleculares es vital para comprender cómo las neuronas del SNE saludables suprimen naturalmente la proliferación del CCR, cómo las disfunciones en estas vías pueden liberar el freno mediado por el SNE sobre la proliferación del CCR y cómo se pueden emplear estrategias terapéuticas específicas para reforzar este freno y detener la progresión del cáncer.

En este informe, identificamos un nuevo mecanismo a través del cual las neuronas del SNE suprimen la proliferación de las células del CCR murino que portan diversas mutaciones impulsoras. Caracterizamos una población distinta de neuronas del SNE que expresan la convertasa de prohormonas 1/3 (PC1/3; PCSK1), que cataliza la conversión de la proenquefalina (PENK) en metionina-enquefalina (M-ENK) [^[11]], un ligando para el receptor del factor de crecimiento opioide (OGFr) expresado por las células epiteliales intestinales y sobreexpresado por las células del CCR [^[12]]. Descubrimos que el SNE, a través de este mecanismo PCSK1 – M-ENK, suprime la proliferación de las células del CCR murino. Además, encontramos que, si bien un aumento en la señalización del receptor de glucocorticoides (GR), una vía de señalización endocrina importante inducida por el estrés [^[13], ^[14]], suprime la expresión de PCSK1, la estimulación de la vía del receptor del péptido similar al glucagón 1 (GLP1R) mejoró la expresión de PCSK1 en el plexo mientérico del colon murino adulto. Por lo tanto, la identificación de esta vía no solo nos permite comprender cómo un SNE saludable suprime la proliferación del CCR y cómo las vías mediadas por el estrés pueden desregular esta vía para aumentar el riesgo de CCR, sino que también nos ayuda a comprender cómo los agonistas del GLP1R contribuyen a disminuir el riesgo de desarrollar CCR.

Es importante destacar que nuestros datos revelan que los efectos antiproliferativos de esta vía no son uniformes en los diferentes contextos genéticos, sino que, en cambio, exhiben una sensibilidad dependiente de la mutación a la regulación neuropéptídica, con organoides mutados en KrasG12D que siguen siendo sensibles, mientras que los organoides mutados en KrasG12V muestran resistencia. Estos hallazgos identifican una capa previamente no reconocida de regulación específica del genotipo dentro del microambiente tumoral, en la que la señalización neuronal entérica ejerce un control diferencial sobre la proliferación de las células del cáncer colorrectal.

Materiales y métodos:

Análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula de las células del cáncer colorrectal (CCR) humano:

Analizamos datos de secuenciación de ARN de una sola célula disponibles públicamente de 168 672 células epiteliales (no malignas y malignas) de tumores primarios no tratados de 34 individuos con deficiencia de reparación de errores de emparejamiento (MMRd) y 28 individuos con reparación de errores de emparejamiento competente (MMRp) (con una lesión adicional recolectada para 2 individuos), así como tejido del colon normal adyacente de 36 de los individuos, generados por el grupo de Hacohen [^[15]] y depositados en el portal de datos de una sola célula de Broad (https://singlecell.broadinstitute.org/singlecell/study/SCP1162/human-colon-cancer-atlas-c295?genes=APC&cluster=Epithelial%20cells%20%28tSNE%29&spatialGroups=--&annotation=ClusterFull--group--cluster&subsample=all&tab=distribution). Este portal web se utilizó para consultar la expresión de los genes Ogfr, Kras, Mki67 y Lgr5_ en varias poblaciones de células epiteliales de tejidos tumorales y sanos.

Análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula de las neuronas entéricas del colon murino:

Analizamos datos de secuenciación de ARN de una sola célula/núcleo disponibles públicamente, generados mediante la combinación de datos de neuronas del SNE juveniles y adultas por el laboratorio de Southard-Smith para este estudio [^[16]]. La compilación de datos ha sido puesta a disposición del público por el laboratorio de Southard-Smith en https://zenodo.org/records/17420912. Solo se utilizaron datos de neuronas del plexo mientérico del colon para evaluar la expresión de Pcsk1, Penk y otros genes en varias subpoblaciones neuronales. Los gráficos se crearon utilizando la representación UMAP de los datos con Cellxgene.

Cultivo de tejidos de montaje completo ex vivo con 500 nM de liraglutida:

Los fragmentos de tejido del colon preparados se incubaron en condiciones estándar de cultivo de tejidos (37 °C, 5 % de CO2) en placas de 12 pocillos estériles que contenían medio para células madre (SCM). El SCM consistió en medio neurobasal que contenía L-glutamina (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen) y antibiótico-antimicótico (Invitrogen), albúmina sérica bovina (Sigma) y primocina (Invitrogen). Los tejidos de control se cultivaron en SCM solo, mientras que los tejidos experimentales se trataron con 500 nM de liraglutida durante 12 horas. Después de la incubación, los tejidos se lavaron en PBS frío. Los tejidos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a −80 °C antes de un análisis experimental posterior.

Cultivo celular y cultivo de organoides:

Se establecieron organoides de cáncer colorrectal murino que albergaban mutaciones de tipo salvaje (Kras WT) o Kras G12D mediante el cruce de alelos mutantes condicionales de Apc (Apclox/+) y Kras (Kras_LSL-G12V/+, KrasLSL-G12D/+) con animales que portan un transgén de Cre específico del epitelio del colon (Fabp1_-Cre). Los organoides se mantuvieron en una matriz de Matrigel® (Corning, Corning, NY, EE. UU.) dentro de un medio de organoides completo compuesto por 47,5 ml de DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific), complementado con 1000 μl de B27, 500 μl de HEPES, 500 μl de Glutamax, 500 μl de N2 (X100), 100 μl de primocina, 100 μl de N-acetilcisteína, 12,5 μl de EGF y 50 μl de nogina (Thermo Fisher Scientific o R&D Systems).

Los cultivos de organoides se pasaron cada 3-5 días utilizando el siguiente protocolo: los organoides que contienen Matrigel se descongelaron y se añadió 55 μl de Dispase (Thermo Fisher Scientific) por pocillo. Después de 2 horas de incubación, el contenido de cada pocillo se pipeteó y se transfirió a un tubo cónico de 15 ml. La suspensión se centrifugó a 400 g durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Luego, el sedimento se resuspendió en 1 ml de TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific) y se incubó en un baño de cuentas a 37 °C durante 3 minutos. Después de la incubación, se añadió 1 ml de DMEM con 10 % de FBS o medio fresco para organoides y la suspensión se centrifugó nuevamente a 400 g durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y este paso de lavado con TrypLE/DMEM+FBS se repitió dos veces más para garantizar una disociación completa. Finalmente, los organoides disociados se resuspendieron en medio fresco para organoides, se mezclaron con Matrigel nuevo y se colocaron para continuar el cultivo.

Cultivo de células del SNE:

Se cultivaron neuronas entéricas adultas murinas a partir de ratones C57BL/6 de 2 meses de edad. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se sacrificaron por dislocación cervical. Se realizó una laparotomía y se extirpó el intestino delgado y se lavó con PBS que contenía penicilina-estreptomicina (PS; Thermo Fisher Scientific), luego se cortó en segmentos de 2 cm de largo y se colocó sobre una varilla de plástico estéril. Se realizó una incisión longitudinal superficial en la superficie serosa y el músculo longitudinal que contiene el plexo mientérico (LM-MP) se peló del tejido subyacente utilizando un hisopo de algodón estéril húmedo y se colocó en un medio Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) que contenía PenStrep (Thermo Fisher Scientific). Para los experimentos de cocultivo, el LM-MP se disoció utilizando un tampón de digestión que comprendía medio M199 (Thermo Fisher Scientific) que contenía 0,1 % de BSA, 1 mM de CaCl2, 20 mM de Hepes, 150 μM de P188, 50 U/ml de DNasa I (Worthington) y 1,1 mg/ml de colagenasa (Sigma) durante 40 min a 37 °C y 5 % de CO2. Las células disociadas se cultivaron luego en medio para células madre (SCM, que comprende medio neurobasal, B27, BSA y β-mercaptoetanol) que contiene factor de crecimiento de fibroblastos-β (FGFb), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF, todos 20 ng/ml, Peprotech) durante 5 días para generar neuroesferas que contienen neuronas diferenciadas y células progenitoras neurales, como se realizó anteriormente [^[17]]. Las neuroesferas se cocultivaron luego con organoides de CCR murino en SCM sin factores de crecimiento a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 durante 48 horas.

Para los experimentos que involucran el tratamiento con dexametasona, las neuronas se trataron con vehículo (10 % de DMSO en solución salina) o dexametasona (5 μM en 10 % de DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Para los experimentos que involucran el tratamiento con agonista del receptor de GLP-1, las neuronas del SNE se trataron con liraglutida (MedChemExpress, catálogo HY-P1535), que se preparó como solución madre en agua estéril y se diluyó en medio de cultivo hasta una concentración final de 500 nM. Las células se expusieron a liraglutida durante 12 horas en condiciones estándar de cultivo (37 °C, 5 % de CO2).

Ensayo de proliferación celular:

La proliferación celular se cuantificó utilizando el ensayo de incorporación de EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina), basado en el kit de ensayo de proliferación celular Click-iT™ (Thermo Fisher Scientific). Para los ensayos de proliferación de organoides, los organoides se disociaron en pequeños grupos y se colocaron en cubetas en una densidad de aproximadamente 10 000 células/grupos por pocillo en placas de 24 pocillos, incrustados en Matrigel. Se permitió que los organoides se establecieran durante 2-3 días antes del tratamiento.

Para los tratamientos con un solo agente, las células/organoides se trataron con metionina-enquefalina (M-ENK) recombinante (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) o naloxona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a concentraciones definidas. Para los experimentos de cocultivo de organoides, los organoides se cultivaron con neuronas entéricas murinas primarias durante 48 horas. Durante este período de cocultivo, se realizó una modulación farmacológica de la actividad de PCSK1 utilizando el inhibidor de PCSK1, decanoil-RVKR-CMK (Tocris Bioscience, Cat. No. 3501) y PCSK1 humano recombinante (OriGene, Cat. No. TP303494). Se utilizó decanoil-RVKR-CMK a una concentración final de 50 μM, que sirvió como la concentración de trabajo estándar para todos los experimentos que se informan en los Resultados; en experimentos seleccionados, también se probó un rango de dosis de 25 a 100 μM para evaluar la dependencia de la dosis. Se utilizó PCSK1 humano recombinante a una concentración final de 10 nM y se diluyó en tampón de ensayo que contenía 25 mM de MES y 5 mM de CaCl2 (pH 6,0) para mantener la estabilidad enzimática. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo en condiciones que garantizaban una cinética de escisión de sustrato lineal durante el período de incubación.

Tras el tratamiento, las células/organoides se incubaron con EdU a una concentración final de 10 μM durante 2 horas a 37°C. A continuación, las células/organoides se fijaron con un 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos y se permeabilizaron con un 0,5% de Triton X-100 durante 30 minutos. La detección de EdU se realizó según las instrucciones del fabricante, utilizando el cóctel de reacción Click-iT que contiene azida de Alexa Fluor 488. Los núcleos se contrateñeron con Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos. Para la visualización de las neuronas en los cocultivos, las células se teñieron adicionalmente con el anticuerpo PGP9.5 durante la noche a 4°C, seguido de la incubación con el anticuerpo secundario apropiado, según se describe a continuación.

Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal Leica Stellaris 5. La proliferación se cuantificó contando el porcentaje de núcleos EdU-positivos en relación con el total de núcleos teñidos con Hoechst en al menos 20-30 organoides seleccionados aleatoriamente por condición. El análisis de las imágenes se realizó utilizando el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.) o scripts de Python personalizados, que se basan principalmente en la biblioteca scikit-image (skimage) para el procesamiento y la segmentación de imágenes, junto con NumPy y SciPy para operaciones numéricas y la manipulación de datos.

Preparación de tejidos:

Los ratones se anestesiaron con isoflurano antes de la eutanasia por dislocación cervical. Para el aislamiento del tejido del intestino delgado, se realizó una laparotomía. A continuación, se extrajo cuidadosamente todo el intestino delgado, se enjuagó a fondo con PBS que contenía penicilina-estreptomicina (PS; Invitrogen) y, posteriormente, se cortó en segmentos de 2 cm de longitud, asegurándose de que las secciones del duodeno, el yeyuno y el íleon se mantuvieran separadas. A continuación, estos segmentos de tejido se colocaron sobre una varilla de plástico estéril. Se realizó una incisión longitudinal superficial a lo largo de la superficie serosa, y el músculo longitudinal-plexo mientérico (LM-MP) se desprendió suavemente del tejido subyacente utilizando un hisopo de algodón estéril húmedo. A continuación, el LM-MP aislado se colocó en un medio Opti-MEM (Invitrogen) que contenía Pen-Strep. A continuación, el tejido se extendió y se fijó con una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% recién preparada y fría durante 4-5 minutos en la oscuridad. Después de la fijación, el tejido se almacenó en PBS estéril frío con Pen-Strep para su posterior tinción de inmunofluorescencia y microscopía.

Inmunohistoquímica:

Para el tejido murino, el tejido del músculo longitudinal-plexo mientérico (LM-MP) fijado se sometió a una serie de lavados e incubaciones. Primero, el tejido se lavó dos veces en PBS en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, se incubó en un tampón de bloqueo-permeabilización (BPB; 3% de BSA con TBST) durante 1 hora. A continuación, se incubó durante 24 horas a 16°C en la oscuridad con agitación a 55 rpm, utilizando los anticuerpos primarios que se indican en la Tabla 1.

Después de la incubación con el anticuerpo primario, los tejidos se lavaron tres veces (15 minutos por lavado) en PBS a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados (anti-humano 488 y anti-conejo 647; ambos a 1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se colocaban en un agitador rotatorio (65 rpm). Los tejidos se lavaron de nuevo tres veces en PBS a temperatura ambiente, se contrateñeron con DAPI para visualizar los núcleos, se recubrieron con un medio de montaje ProLong Antifade Gold, se colocó una cubierta y, finalmente, se obtuvieron imágenes. La información sobre los anticuerpos secundarios se indica en la Tabla 1.

Inmunofluorescencia de secciones de tumores murinos fijados en formalina y embebidos en parafina (FFPE):

Los tejidos tumorales murinos fijados en formalina y embebidos en parafina (FFPE) se cortaron en secciones de 4 μm de espesor. Las secciones se desparafinaron en xileno y se rehidrataron a través de soluciones de etanol graduadas hasta agua destilada. Se realizó una recuperación de antígenos mediada por calor utilizando un tampón de citrato (10 mM de citrato de sodio, pH 6.0). Las secciones se dejaron enfriar a temperatura ambiente, se lavaron en PBS y se incubaron en un tampón de bloqueo-permeabilización (3% de BSA en TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente.

A continuación, las secciones se incubaron durante la noche a 4°C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-βIII-tubulina (1:500) y anti-PCSK1 (1:100) (Tabla 1). Después del lavado en PBS, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con fluoróforos durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Los núcleos se contrateñeron con DAPI. Las secciones se montaron utilizando un medio de montaje ProLong™ Gold Antifade, se colocó una cubierta y se obtuvieron imágenes. La información sobre los anticuerpos secundarios se indica en la Tabla 1.

Aislamiento de proteínas y análisis de Western blot:

Se evaluó la expresión de proteínas de PCSK1 y Met-encefalina (M-ENK) mediante Western blot. Para la extracción de proteínas, se utilizó tejido LM-MP aislado y congelado rápidamente. Los tejidos se pesaron y se colocaron en tubos de microcentrífuga de bloqueo de 1,5 ml que contenían de 6 a 8 cuentas de silicona. Se añadió a cada tubo una solución de lisis que consistía en un tampón RIPA 1X suplementado con el cóctel de inhibidores de proteasas Halt™ (Thermo Fisher Scientific) y los cócteles de inhibidores de fosfatasas 2 y 3 (Sigma-Aldrich). El tejido se homogeneizó sobre hielo utilizando un homogeneizador de cuentas durante 5 minutos en una cámara fría. Tras la homogeneización, las muestras se incubaron en un agitador durante 30 minutos a 4°C para garantizar una lisis completa. A continuación, los lisados se aclararon mediante centrifugación a 12 000 g durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante, que contenía el extracto de proteína total, se recogió cuidadosamente, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80°C hasta su uso. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo BCA (Thermo Fisher Scientific). Para la detección de M-ENK, las muestras se manipularon con cuidado para preservar la integridad del péptido, incluyendo la adición directa de los tejidos al tampón RIPA con inhibidores de proteasas y la congelación rápida inmediata. Para el Western blot, se cargaron 30 μg de proteína en geles SDS-PAGE al 15%. Para una separación y detección óptimas de M-ENK, se utilizó un gel Tris-Tricina al 16-20%. A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon en 5% de BSA en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios: anticuerpo anti-PCSK1 (1:1000), anticuerpo anti-M-ENK (1:1000) y anticuerpo anti-GAPDH (1:1000) (Tabla 1). Tras la incubación, las membranas se lavaron tres veces durante 5 minutos cada una con tampón TBST. A continuación, se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con IRDye (por ejemplo, IRDye 800CW anti-conejo e IRDye 680RD anti-ratón, LI-COR Biosciences; Tabla 1) en 5% de BSA en TBST durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Después de tres lavados finales con TBST, las bandas de proteína se visualizaron y se cuantificaron utilizando un sistema de imagen LI-COR Odyssey M. Se realizó un análisis densitométrico utilizando el software ImageStudioLite, y las intensidades de las bandas se normalizaron con respecto al control de carga.

Extracción de ARN, síntesis de ADNc y PCR cuantitativa:

Se aisló el ARN total de los tejidos murinos LM-MP utilizando el kit Direct-zol MiniPrep (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante. La concentración y la pureza del ARN se evaluaron espectrofotométricamente. Se utilizó 1 microgramo de ARN total para la transcripción inversa utilizando la transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen) en un volumen de reacción de 20 μl. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando el SYBR Green Master Mix en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (Applied Biosystems). Las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 10 μl bajo las siguientes condiciones de ciclaje: desnaturalización inicial a 95°C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de 95°C durante 10 segundos, 60°C durante 10 segundos y 72°C durante 40 segundos. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt. Los niveles de expresión se normalizaron con respecto al gen doméstico murino Hprt. Las secuencias de los cebadores se detallan en la Tabla 1.

Análisis de imágenes:

El análisis de imágenes se realizó utilizando una línea de comandos de Python personalizada basada principalmente en scikit-image. Las imágenes DAPI se preprocesaron con suavizado gaussiano y sustracción del fondo con bola rodante, y los núcleos se segmentaron utilizando el umbral local de Sauvola, el filtrado de tamaño y la separación basada en cuencas hidrográficas de objetos adyacentes. Las regiones de los organoides se identificaron por separado utilizando máscaras de imagen suavizadas con filtrado de tamaño mínimo. Los núcleos EdU-positivos se cuantificaron a partir del canal EdU dentro de los núcleos segmentados. La cuantificación se realizó en todos los organoides dentro de cada imagen, y los valores se promediaron por imagen antes del análisis estadístico. El código utilizado para el análisis está disponible en https://github.com/klab-ens/imageanalyses_seika.

Análisis estadístico:

Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) de al menos tres réplicas independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 10.0, GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Las diferencias entre dos grupos se analizaron utilizando una prueba t de Student no pareada o una prueba t de Welch (varianza desigual), según corresponda. Para las comparaciones que involucran tres o más grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Se consideró que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo. Las pruebas estadísticas específicas utilizadas para cada experimento se indican en las leyendas de las figuras.

Análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula de las células de cáncer colorrectal humano (CRC):

Analizamos datos de secuenciación de ARN de una sola célula disponibles públicamente de 168 672 células epiteliales (no malignas y malignas) de tumores primarios no tratados de 34 individuos con deficiencia de reparación de errores de emparejamiento (MMRd) y 28 individuos con reparación de errores de emparejamiento competente (MMRp) (con una lesión adicional recogida para 2 individuos), así como de tejido colónico normal adyacente de 36 de los individuos, generados por el grupo Hacohen [^[15]] y depositados en el portal de datos de una sola célula de Broad (https://singlecell.broadinstitute.org/singlecell/study/SCP1162/human-colon-cancer-atlas-c295?genes=APC&cluster=Epithelial%20cells%20%28tSNE%29&spatialGroups=--&annotation=ClusterFull--group--cluster&subsample=all&tab=distribution). Este portal web se utilizó para consultar la expresión de los genes Ogfr, Kras, Mki67 y Lgr5_ en varias poblaciones de células epiteliales de tejidos tumorales y sanos.

Análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula de neuronas entéricas colónicas murinas:

Analizamos datos de secuenciación de ARN de una sola célula/núcleo disponibles públicamente, generados mediante la combinación de datos de neuronas ENS juveniles y adultas por el laboratorio de Southard-Smith para este estudio [^[16]]. La compilación de datos ha sido publicada por el laboratorio de Southard-Smith en https://zenodo.org/records/17420912. Solo se utilizaron datos de neuronas mientéricas colónicas para evaluar la expresión de Pcsk1, Penk y otros genes en varias subpoblaciones neuronales. Los gráficos se crearon utilizando la representación UMAP de los datos con Cellxgene.

Cultivo ex vivo de tejidos enteros con 500 nM de liraglutida:

Los fragmentos de tejido colónico preparados se incubaron en condiciones estándar de cultivo de tejidos (37°C, 5% de CO2) en placas de 12 pocillos estériles que contenían medio para células madre (SCM). El SCM consistía en medio neurobasal que contenía L-glutamina (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen) y antibiótico-antimicótico (Invitrogen), albúmina sérica bovina (Sigma) y Primocina (Invitrogen). Los tejidos de control se cultivaron en SCM solo, mientras que los tejidos experimentales se trataron con 500 nM de liraglutida durante 12 horas. Tras la incubación, los tejidos se lavaron en PBS frío. Los tejidos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C antes de su posterior análisis experimental.

Cultivo celular y cultivo de organoides:

Se establecieron organoides de cáncer colorrectal murino que albergaban mutaciones Kras de tipo salvaje (WT) o Kras G12D mediante el cruce de alelos mutantes condicionales de Apc (Apclox/+) y Kras (Kras_LSL-G12V/+, KrasLSL-G12D/+) con animales que portaban un transgén de Cre específico del epitelio colónico (Fabp1_-Cre). Los organoides se mantuvieron en una matriz de Matrigel® (Corning, Corning, NY, EE. UU.) dentro de un medio de organoides completo compuesto por 47,5 ml de DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific), suplementado con 1000 μl de B27, 500 μl de HEPES, 500 μl de Glutamax, 500 μl de N2 (X100), 100 μl de Primocina, 100 μl de N-acetilcisteína, 12,5 μl de EGF y 50 μl de Noggin (Thermo Fisher Scientific o R&D Systems).

Se realizaron pases de cultivos de organoides cada 3 a 5 días utilizando el siguiente protocolo: los organoides contenidos en Matrigel se descongelaron y se añadieron 55 μl de Dispase (Thermo Fisher Scientific) por pocillo. Después de 2 horas de incubación, el contenido de cada pocillo se pipeteó y se transfirió a un tubo cónico de 15 ml. La suspensión se centrifugó a 400 g durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado. A continuación, el precipitado se resuspendió en 1 ml de TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific) y se incubó en un baño de perlas a 37 °C durante 3 minutos. Después de la incubación, se añadió 1 ml de DMEM con 10 % de FBS o medio fresco para organoides, y la suspensión se centrifugó de nuevo a 400 g durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y se repitió este paso de lavado con TrypLE/DMEM+FBS dos veces más para garantizar una disociación completa. Finalmente, los organoides disociados se resuspendieron en medio fresco para organoides, se mezclaron con Matrigel nuevo y se colocaron para continuar el cultivo.

Cultivo de células ENS:

Se cultivaron neuronas entéricas murinas adultas a partir de ratones C57BL/6 de 2 meses de edad. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se sacrificaron por dislocación cervical. Se realizó una laparotomía y se extirpó el intestino delgado, que se lavó con PBS que contenía penicilina-estreptomicina (PS; Thermo Fisher Scientific), y luego se cortó en segmentos de 2 cm de longitud y se colocó sobre una varilla de plástico estéril. Se realizó una incisión longitudinal superficial a lo largo de la superficie serosa y el músculo longitudinal que contiene el plexo mientérico (LM-MP) se desprendió del tejido subyacente utilizando un hisopo de algodón estéril húmedo y se colocó en medio Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) que contenía PenStrep (Thermo Fisher Scientific). Para los experimentos de cocultivo, el LM-MP se disoció utilizando un tampón de digestión que contenía medio M199 (Thermo Fisher Scientific) que contenía 0,1 % de BSA, 1 mM de CaCl2, 20 mM de Hepes, 150 μM de P188, 50 U/ml de DNasa I (Worthington) y 1,1 mg/ml de colagenasa (Sigma) durante 40 min a 37 °C y 5 % de CO2. Las células disociadas se cultivaron a continuación en medio para células madre (SCM, que comprende medio Neurobasal, B27, BSA y β-mercaptoetanol) que contiene factor de crecimiento de fibroblastos-β (FGFb), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF, todos a 20 ng/ml, Peprotech) durante 5 días para generar neuroesferas que contienen tanto neuronas diferenciadas como células progenitoras neurales, como se ha hecho anteriormente [^[17]]. A continuación, las neuroesferas se cocultivaron con organoides de CRC murinos en SCM sin factores de crecimiento a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 durante 48 horas.

Para los experimentos que involucran el tratamiento con dexametasona, las neuronas se trataron con vehículo (10 % de DMSO en solución salina) o dexametasona (5 μM en 10 % de DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Para los experimentos que involucran el tratamiento con un agonista del receptor de GLP-1, las neuronas ENS se trataron con liraglutida (MedChemExpress, catálogo HY-P1535), preparada como solución madre en agua estéril y diluida en el medio de cultivo hasta una concentración final de 500 nM. Las células se expusieron a liraglutida durante 12 horas en condiciones estándar de cultivo (37 °C, 5 % de CO2).

Ensayo de proliferación celular:

La proliferación celular se cuantificó utilizando el ensayo de incorporación de EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina), basado en el kit de ensayo de proliferación celular Click-iT™ EdU (Thermo Fisher Scientific). Para los ensayos de proliferación de organoides, los organoides se disociaron en pequeños grupos y se colocaron en una densidad de aproximadamente 10 000 células/grupos por pocillo en portaobjetos en placas de 24 pocillos, incrustados en Matrigel. Se permitió que los organoides se establecieran durante 2 a 3 días antes del tratamiento.

Para los tratamientos con un solo agente, las células/organoides se trataron con met-encefalina recombinante (M-ENK) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) o naloxona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a concentraciones definidas. Para los experimentos de cocultivo de organoides y neuronas entéricas, los organoides se cultivaron con neuronas entéricas murinas primarias durante 48 horas. Durante este período de cocultivo, se realizó una modulación farmacológica de la actividad de PCSK1 utilizando el inhibidor de PCSK1, decanoil-RVKR-CMK (Tocris Bioscience, n.º de catálogo 3501) y PCSK1 humano recombinante (OriGene, n.º de catálogo TP303494). Se utilizó decanoil-RVKR-CMK a una concentración final de 50 μM, que sirvió como concentración de trabajo estándar para todos los experimentos que se informan en los Resultados; en experimentos seleccionados, también se probó un rango de dosis de 25 a 100 μM para evaluar la dependencia de la dosis. Se utilizó PCSK1 humano recombinante a una concentración final de 10 nM y se diluyó en tampón de ensayo que contenía 25 mM de MES y 5 mM de CaCl2 (pH 6,0) para mantener la estabilidad enzimática. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo en condiciones que garantizaban una cinética lineal de escisión del sustrato durante el período de incubación.

Después del tratamiento, las células/organoides se incubaron con EdU a una concentración final de 10 μM durante 2 horas a 37 °C. A continuación, las células/organoides se fijaron con 4 % de paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos y se permeabilizaron con 0,5 % de Triton X-100 durante 30 minutos. La detección de EdU se realizó según las instrucciones del fabricante utilizando el cóctel de reacción Click-iT que contenía azida de Alexa Fluor 488. Los núcleos se contracolorearon con Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos. Para la visualización de neuronas en cocultivos, las células se tiñeron adicionalmente con el anticuerpo PGP9.5 durante la noche a 4 °C, seguido de la incubación con el anticuerpo secundario apropiado, como se describe a continuación.

Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal Leica Stellaris 5. La proliferación se cuantificó contando el porcentaje de núcleos positivos para EdU en relación con el total de núcleos teñidos con Hoechst en al menos 20 a 30 organoides seleccionados aleatoriamente por condición. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.) o scripts de Python personalizados que aprovechan principalmente la biblioteca scikit-image (skimage) para el procesamiento y la segmentación de imágenes, junto con NumPy y SciPy para operaciones numéricas y la manipulación de datos.

Preparación de tejidos:

Los ratones se anestesiaron con isoflurano antes del sacrificio por dislocación cervical. Para el aislamiento del tejido del intestino delgado, se realizó una laparotomía. A continuación, se extirpó todo el intestino delgado, se enjuagó a fondo con PBS que contenía penicilina-estreptomicina (PS; Invitrogen) y, posteriormente, se cortó en segmentos de 2 cm de longitud, asegurándose de que las secciones del duodeno, el yeyuno y el íleon se mantuvieran separadas. A continuación, estos segmentos de tejido se colocaron sobre una varilla de plástico estéril. Se realizó una incisión longitudinal superficial a lo largo de la superficie serosa y el músculo longitudinal-plexo mientérico (LM-MP) se desprendió suavemente del tejido subyacente utilizando un hisopo de algodón estéril húmedo. El LM-MP aislado se colocó a continuación en medio Opti-MEM (Invitrogen) que contenía Pen-Strep. A continuación, el tejido se extendió y se fijó con solución de paraformaldehído (PFA) recién preparada y fría al 4 % durante 4 a 5 minutos en la oscuridad. Después de la fijación, el tejido se almacenó en PBS estéril frío con Pen-Strep para la tinción de inmunofluorescencia y la microscopía posteriores.

Inmunohistoquímica:

Para el tejido murino, el tejido del músculo longitudinal-plexo mientérico (LM-MP) fijado se sometió a una serie de lavados e incubaciones. Primero, el tejido se lavó dos veces en PBS en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, se incubó en un tampón de bloqueo-permeabilización (BPB; 3 % de BSA con TBST) durante 1 hora. A continuación, se incubó durante 24 horas a 16 °C en la oscuridad con agitación a 55 rpm, utilizando los anticuerpos primarios que se indican en la tabla 1.

Después de la incubación con el anticuerpo primario, los tejidos se lavaron tres veces (15 minutos cada lavado) en PBS a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados (anti-humano 488 y anti-conejo 647; ambos a 1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se agitaban en un agitador rotatorio (65 rpm). Los tejidos se lavaron de nuevo tres veces en PBS a temperatura ambiente, se contracolorearon con DAPI para visualizar los núcleos, se recubrieron con medio de montaje ProLong Antifade Gold, se colocó un cubreobjetos y, finalmente, se visualizaron. La información del anticuerpo secundario se indica en la tabla 1.

Inmunofluorescencia de secciones de tumores murinos FFPE:

Los tejidos tumorales murinos fijados en formalina y embebidos en parafina (FFPE) se seccionaron con un grosor de 4 μm. Las secciones se desparafinaron en xileno y se rehidrataron a través de soluciones de etanol graduadas hasta agua destilada. Se realizó una recuperación de antígenos mediada por calor utilizando tampón de citrato (10 mM de citrato de sodio, pH 6,0). Las secciones se dejaron enfriar a temperatura ambiente, se lavaron en PBS y se incubaron en un tampón de bloqueo-permeabilización (3 % de BSA en TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente.

A continuación, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-βIII-tubulina (1:500) y anti-PCSK1 (1:100) (tabla 1). Después del lavado en PBS, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con fluoróforos durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Los núcleos se contracolorearon con DAPI. Las secciones se montaron utilizando medio de montaje ProLong™ Gold Antifade, se colocó un cubreobjetos y se visualizaron.

Aislamiento de proteínas y análisis de Western blot:

Se evaluó la expresión de proteínas de PCSK1 y met-encefalina (M-ENK) mediante Western blot. Para la extracción de proteínas, se utilizó tejido LM-MP aislado y congelado previamente. Los tejidos se pesaron y se colocaron en tubos de microcentrífuga de bloqueo de 1,5 ml que contenían de 6 a 8 cuentas de silicona. Se añadió una solución de lisis que consistía en 1X de tampón RIPA suplementado con cóctel de inhibidores de proteasas Halt™ (Thermo Fisher Scientific) y cócteles de inhibidores de fosfatasas 2 y 3 (Sigma-Aldrich) a cada tubo. El tejido se homogeneizó sobre hielo utilizando un homogeneizador de cuentas durante 5 minutos en una cámara fría. Después de la homogeneización, las muestras se incubaron en un agitador durante 30 minutos a 4 °C para garantizar una lisis completa. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 12 000 g durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante resultante, que contenía el extracto de proteína total, se recogió cuidadosamente, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo BCA (Thermo Fisher Scientific). Para la detección de M-ENK, las muestras se manipularon con cuidado para preservar la integridad del péptido, incluido el añadido de los tejidos directamente al tampón RIPA con inhibidores de proteasas y la congelación inmediata. Para el Western blot, se cargaron 30 μg de proteína en geles SDS-PAGE al 15 %. Para una separación y detección óptimas de M-ENK, se utilizó un gel Tris-Tricina al 16-20 %. A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon en 5 % de BSA en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios: anticuerpo anti-PCSK1 (1:1000), anticuerpo anti-M-ENK (1:1000) y anticuerpo anti-GAPDH (1:1000) (tabla 1). Después de la incubación, las membranas se lavaron tres veces durante 5 minutos cada una con tampón TBST. A continuación, se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con IRDye (por ejemplo, anti-conejo IRDye 800CW y anti-ratón IRDye 680RD, LI-COR Biosciences; tabla 1) en 5 % de BSA en TBST durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Después de tres lavados finales con TBST, las bandas de proteína se visualizaron y se cuantificaron utilizando un sistema de imágenes LI-COR Odyssey M. El análisis densitométrico se realizó utilizando el software ImageStudioLite y las intensidades de las bandas se normalizaron con el control de carga.

Extracción de ARN, síntesis de ADNc y PCR cuantitativa:

Se aisló ARN total de tejidos murinos LM-MP utilizando el kit Direct-zol MiniPrep (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante. Se evaluó la concentración y pureza del ARN por espectrofotometría. Se realizó la transcripción inversa de 1 microgramo de ARN total utilizando la ARN polimerasa inversa SuperScript III (Invitrogen) en un volumen de reacción de 20 μl. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando SYBR Green Master Mix en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (Applied Biosystems). Las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 10 μl bajo las siguientes condiciones de ciclado: desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 40 segundos. Se calculó la expresión génica relativa utilizando el método 2−ΔΔCt. Se normalizaron los niveles de expresión al gen doméstico murino Hprt. Los detalles de las secuencias de los cebadores se encuentran en la Tabla 1.

Análisis de imágenes:

El análisis de imágenes se realizó utilizando una herramienta de Python personalizada basada principalmente en scikit-image. Las imágenes DAPI se preprocesaron con suavizado gaussiano y sustracción del fondo mediante el método de la bola rodante, y los núcleos se segmentaron utilizando el umbral local de Sauvola, el filtrado de tamaño y la separación basada en cuencas hidrográficas de objetos adyacentes. Las regiones de organoides se identificaron por separado utilizando máscaras de imagen suavizadas con filtrado de tamaño mínimo. Los núcleos EdU-positivos se cuantificaron a partir del canal EdU dentro de los núcleos segmentados. La cuantificación se realizó en todos los organoides dentro de cada imagen, y los valores se promediaron por imagen antes del análisis estadístico. El código utilizado para el análisis está disponible en https://github.com/klab-ens/imageanalyses_seika.

Análisis estadístico:

Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) de al menos tres réplicas independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 10.0, GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Las diferencias entre dos grupos se analizaron utilizando una prueba t de Student de dos colas o la prueba t de Welch (varianza desigual) cuando fue apropiado. Para las comparaciones que involucran tres o más grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p inferior a 0,05. Las pruebas estadísticas específicas utilizadas para cada experimento se indican en las leyendas de las figuras.

Resultados

La expresión del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) está aumentada en las células de cáncer colorrectal (CCR) humanas.

Primero, probamos si (a) OGFR (que codifica el receptor del factor de crecimiento opioide OGFr) se expresa en las células de CCR, (b) si su expresión en las células derivadas del tumor se incrementa en contraste con su expresión en las células sanas, y (c) si la expresión de OGFR se correlaciona con los genes marcadores conocidos de la troncalidad, la proliferación y los genes en los que las mutaciones se asocian con el CCR. Nuestros análisis muestran que la expresión de OGFR se detectó en todas las células tumorales de CCR, y que su expresión se incrementó en las células derivadas del tumor en relación con las células de control (Fig. 1A). Además, la expresión de OGFR en las células derivadas del tumor fue mayor en las células que expresaban el gen de troncalidad LGR5 y MKI67, que codifica para Ki67, un marcador de las células proliferantes (Fig. 1A). La expresión de OGFR también fue mayor en las células que expresaban KRAS, cuyas mutaciones impulsoras se sabe que están asociadas con el CCR y son un objetivo terapéutico [^[18]] (Fig. 1A). A continuación, observamos que la expresión de OGFR se correlacionó mejor con la de MKI67 y con KRAS en las células tumorales que en las células de los controles sanos (Fig. 1B, C), lo que sugiere que OGFR es un marcador clínicamente relevante para las células de CCR.

Los nervios ENS expresan la convertasa de proproteína subtilisina/kexina tipo 1 (PCSK1) para generar metionina-encefalina (M-ENK).

OGFr es un receptor nuclear que se une a un pentapéptido opioide endógeno (OGF), también conocido como metionina-encefalina (M-ENK) [^[19], ^[20]]. Los pentapéptidos encefalinas, como M-ENK (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) y leucina-encefalina (L-ENK; Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu), se generan por la escisión de la proencefalina (PENK), que es expresada por los nervios ENS, así como por otras células del tracto gastrointestinal, como los fibroblastos [^[21], ^[22]]. M-ENK, específicamente, se genera por la escisión de PENK por la enzima PCSK1 [^[23]]. A continuación, probamos si los nervios ENS expresan PCSK1 para regular la generación de M-ENK a partir de PENK. Utilizamos un anticuerpo anti-PCSK1 específico y un anticuerpo anti-M-ENK junto con antisueros anti-Hu (ANNA1) para realizar la inmunotinción de los nervios mientéricos colónicos murinos adultos y encontramos que la inmunorreactividad de PCSK1 y M-ENK se observó en subpoblaciones de nervios colónicos (Fig. 2A, B). Enumeramos la abundancia de los nervios mientéricos inmunorreactivos a PCSK1 en el colon proximal y distal y no encontramos diferencias significativas en la abundancia de los nervios inmunorreactivos a PCSK1 entre las dos regiones del colon (n = 3 ratones; números totales de ganglios por ratón enumerados en el colon proximal: 20; media ± SEM del porcentaje de nervios PCSK1+/ganglio en el colon proximal 16,8 ± 1,6%; números totales de ganglios enumerados por ratón en el colon distal: 15; media ± SEM del porcentaje de nervios PCSK1+/ganglio en el colon distal 19,9 ± 1,4%; p = 0,974; prueba t de Welch (varianza desigual); Fig. 2C). Es importante destacar que no detectamos inmunorreactividad de PCSK1 en ningún otro tipo de célula en el tejido del músculo longitudinal – plexo mientérico (LM-MP) del colon murino adulto. En paralelo, hemos observado que se observa una fuerte inmunorreactividad de PCSK1 en las células del ENS humano [^[24]]. Además, analizamos datos de secuenciación de ARN de células/núcleos únicos disponibles públicamente sobre el ENS del colon murino [^[16]] y encontramos que las poblaciones neuronales mientéricas Pcsk1+ del colon comprenden diferentes subconjuntos neuronales, incluidos aquellos que (a) coexpresan Vip y Nos1, (b) Slc17a6 (vGLUT2)+
Calcb (CGRP)+
Avil (Advilin)+ nervios que pueden o no expresar Glp1r, y (c) nervios que expresan Tac1 (Fig. S1). Es interesante destacar que observamos que los nervios que expresan Penk son un subconjunto de los nervios Pcsk1+ del colon y que un subconjunto de los nervios que coexpresan Penk y Pcsk1 también expresan Glp1r y los marcadores neuronales sensoriales Avil y Calcb. Dado que Calcb y Avil son marcadores de las neuronas aferentes primarias intrínsecas que se proyectan hacia la mucosa [^[25]], lo que sugiere que estos nervios Pcsk1+
Penk+
Glp1r+
Calcb+
Avil+ del colon son neuronas aferentes primarias intrínsecas (Fig. S1). Estos datos sugieren que los nervios entéricos del colon son una fuente de M-ENK, que se produce por la escisión de PENK por PCSK1 expresada neuronalmente, y que los nervios PCSK1+ que liberan M-ENK pueden proyectarse hacia la mucosa del colon.

Los nervios que expresan PCSK1 se proyectan hacia los tumores de cáncer colorrectal (CCR).

Para examinar las proyecciones neuronales dentro de los tumores colorrectales, utilizamos el modelo de ratón genéticamente modificado Fabp1-Cre:Apclox14/+; KrasG12D/+, en el que la recombinación mediada por Cre induce simultáneamente la pérdida de Apc en el epitelio y la activación fisiológica de KrasG12D endógeno en el epitelio del colon, lo que da como resultado un adenocarcinoma invasivo que recapitula las características clave del CCR humano [^[26]]. Al analizar secciones fijadas con formalina y embebidas en parafina utilizando anticuerpos contra el marcador de fibras neuronales βIII-tubulina (TUJ1) y PCSK1, encontramos que las fibras nerviosas que expresan PCSK1 están presentes cerca del sitio del tumor de CCR y, por lo tanto, la PCSK1 derivada de los nervios y, por extensión, la M-ENK constituyen una parte del microambiente tumoral (MET) (Fig. 2D).

M-ENK suprime la proliferación de las células de CCR en función de la dosis y la mutación.

Dado que M-ENK/OGF es un ligando para OGFr, y OGFr se expresa en las células de CCR proliferantes, a continuación, probamos si M-ENK afectaba la proliferación de las células de CCR. Para ello, probamos si M-ENK alteraba la proliferación celular en los organoides de CCR murinos, que se generaron después de introducir alteraciones oncogénicas específicas en las células epiteliales del colon. Las células KrasWT conservan Kras de tipo salvaje, pero albergan otros impulsores oncogénicos que son suficientes para conferir un fenotipo de cáncer colorrectal, en particular la desregulación de la vía Wnt/β-catenina, como se observa comúnmente mediante la pérdida de la función de APC. Por el contrario, las células que albergan mutaciones KrasG12D y KrasG12V tienen mutaciones puntuales activadoras G12D y G12V, respectivamente, en el gen Kras. Cultivamos organoides murinos de KrasWT, KrasG12D y KrasG12V en un medio de cultivo de organoides completo que contiene EdU. Cada línea celular se trató con tres concentraciones de M-ENK (10, 50 o 100 μM), dos concentraciones del ligando OGFr naloxona (1 o 10 μM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) o vehículo solo como control. Después de cultivar durante 24 horas en condiciones estándar de cultivo celular, retiramos el medio y fijamos las células. Después de realizar la reacción Click-iT EdU para identificar las células EdU+ (en proliferación) (Fig. 3A), calculamos las proporciones de células EdU+ sobre todas las células nucleadas.

Comparamos la proporción de células EdU+ por tratamiento con ligando con el control utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett (cada concentración frente al control). En los organoides KrasWT, si bien el tratamiento con 10 μM o 50 μM de M-ENK no alteró la proliferación, 100 μM de M-ENK redujo significativamente las proporciones de células EdU+ en los organoides (n = 19 control, n = 12 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 14,3 ± 2,2; 10 μM: 17,4 ± 2,0, p = 0,67; 50 μM: 11,0 ± 2,5, p = 0,67; 100 μM: 3,5 ± 1,5, p = 0,0055; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett; Fig. 3B). De manera similar, la naloxona redujo significativamente las proporciones de células EdU+ en los organoides a una dosis de 1 μM. Es interesante destacar que la naloxona a 10 μM no tuvo un efecto significativo en las proporciones de células EdU+ en los organoides (n = 19 control, n = 12 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 14,3 ± 2,2; 1 μM: 3,4 ± 0,9, p = 0,0037; 10 μM: 8,4 ± 1,9, p = 0,22; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett; Fig. 3B).

En los organoides mutantes de KrasG12D, las proporciones de células EdU+ en los organoides en la línea de base (controles, sin ningún tratamiento) fueron (media ± SEM de células EdU+) 24,3 ± 3,7%. En estas células, la naloxona redujo significativamente las proporciones de células EdU+ (n = 10 control, n = 10 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 24,3 ± 3,7; 1 μM: 10,6 ± 2,4, p = 0,020; 10 μM: 13,3 ± 2,0, p = 0,034; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control; Fig. 3C). La exposición a M-ENK también redujo significativamente las proporciones de células EdU+ en los organoides a dosis intermedias, mientras que la dosis más alta no alcanzó la significación estadística (n = 10 control, n = 12 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 24,3 ± 3,7; 10 μM: 8,9 ± 3,2, p = 0,020; 50 μM: 8,6 ± 1,8, p = 0,003; 100 μM: 15,1 ± 3,0, p = 0,063; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett; Fig. 3C).

Es interesante destacar que, en contraste con las células que no albergan mutaciones en el gen Kras o con mutaciones KrasG12D, los organoides que albergan mutaciones KrasG12V tenían (media ± SEM) 12,9 ± 2,0% de células EdU+ en condiciones de control. En estas células, la naloxona no alteró significativamente las proporciones de células EdU+ en los organoides (n = 20 control, n = 12 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 12,9 ± 2,0; 1 μM: 22,5 ± 4,3, p = 0,14; 10 μM: 19,7 ± 3,2, p = 0,20; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control; Fig. 3D). De manera similar, la exposición a M-ENK no afectó significativamente la proliferación en ninguna de las concentraciones probadas (n = 20 control, n = 14–12–11 por grupo de tratamiento (10–50–100 μM, respectivamente); media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 12,9 ± 2,0; 10 μM: 21,2 ± 3,9, p = 0,20; 50 μM: 9,5 ± 2,1, p = 0,26; 100 μM: 18,9 ± 3,8, p = 0,26; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control; Fig. 3D).

Los nervios ENS modulan la proliferación de las células de organoides de CCR de forma dependiente de PCSK1.

Dado que encontramos que M-ENK, cuya expresión está regulada por PCSK1 de origen neuronal, reduce significativamente la proliferación de células de CRC murinas, investigamos a continuación si la presencia de neuronas del SNE (sistema nervioso entérico) ejerce un freno sobre la proliferación de las células de CRC y, en caso afirmativo, si el efecto se manifiesta de forma dependiente de PCSK1.

Para ello, cultivamos organoides de CRC KrasG12D en 4 condiciones en un medio que contiene EdU (medio completo para el cultivo de organoides): cultivados solos sin ningún tratamiento adicional (grupo control), cocultivados con células del SNE murino, cultivados solos en un medio que contiene PCSK1 recombinante (10 nM) y cocultivados con células del SNE murino en un medio que contiene PCSK1 recombinante (10 nM). Los organoides se cultivaron durante 24 horas en condiciones estándar de cultivo celular, tras lo cual se retiró el medio, se fijaron las células y se realizó la reacción Click-iT EdU para etiquetar las células en ciclo EdU+ (Fig. 4A). A continuación, cuantificamos el porcentaje de células EdU+ sobre el total de células nucleadas.

Mediante la realización de un ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al grupo control, encontramos que, en comparación con los organoides control, la proliferación de los organoides de CRC se redujo significativamente en presencia de células del SNE (Control vs. SNE: p = 0,0042) y, sobre todo, en condiciones combinadas de SNE + PCSK1 (Control vs. SNE + PCSK1: p < 0,0001), mientras que el PCSK1 recombinante solo no redujo significativamente la proliferación (Control vs. PCSK1: p = 0,1166). El cocultivo con SNE y la exposición a PCSK1 redujeron cada una la proliferación, siendo la supresión más pronunciada la observada en condiciones combinadas (n = 13 para el grupo control, n = 12 para el grupo SNE, n = 7 para el grupo PCSK1, n = 14 para el grupo SNE + PCSK1; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 15,4 ± 3,5; SNE: 1,84 ± 0,60; PCSK1: 3,72 ± 2,00; SNE + PCSK1: 0,32 ± 0,17; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control; Fig. 4B).

Estos hallazgos demuestran que el PCSK1 recombinante contribuye al efecto antiproliferativo del cocultivo con SNE, lo que sugiere que la supresión de la proliferación de CRC mediada por el SNE se produce, al menos en parte, a través de mecanismos dependientes de PCSK1.

Para probar directamente esta dependencia, realizamos un experimento independiente en el que los organoides de CRC KrasG12D cocultivados con SNE se trataron con el inhibidor de PCSK1 Decanoil-RVKR-CMK (50 μM) durante 24 horas (Fig. 4C). La significación estadística se evaluó utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas. La inhibición de PCSK1 aumentó significativamente las proporciones de células EdU+ en comparación con el control, lo que demuestra que la supresión del crecimiento mediada por el SNE requiere la actividad de PCSK1. Estos datos muestran que el PCSK1 de origen neuronal es un regulador importante de la proliferación de las células de CRC (n = 15 para el grupo control, n = 13 para el grupo inhibidor de PCSK1; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 33,9 ± 2,8; Inhibidor de PCSK1: 45,2 ± 3,9, p = 0,009; prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 4D).

La señalización del receptor de glucocorticoides regula la expresión de PCSK1 del SNE y reduce la M-ENK.

Se ha demostrado que el aumento de la señalización de los glucocorticoides, impulsado por el aumento de la liberación de cortisol, es una característica de la señalización endocrina inducida por el estrés en la periferia, y que esta señalización afecta al SNE [^[13], ^[14]]. Se sabe que el estrés aumenta el riesgo de desarrollar cánceres, incluido el CRC [^[27]]. El aumento del cortisol inducido por el estrés activa el receptor de glucocorticoides, y el aumento de la señalización del receptor de glucocorticoides (GR) inducido por el estrés facilita el efecto del estrés a nivel celular [^[28]]. Utilizando nuestro sistema in vitro suplementado con un agonista del GR, la dexametasona, para imitar el efecto de la señalización de los glucocorticoides inducida por el estrés en los organoides de CRC del SNE, probamos si el aumento de la señalización del GR inducido por la dexametasona altera la vía neuronal PCSK1 – M-ENK. Después de cultivar tejido de músculo longitudinal y plexo mientérico (LM-MP) colónico murino adulto con o sin dexametasona (5 μM) durante 24 horas en un medio Neurobasal que contiene B27 y BSA [^[14]], se aisló la proteína total y se evaluó la abundancia relativa de PCSK1 mediante análisis de Western blot, normalizada con la proteína de mantenimiento GAPDH. La comparación de los niveles de proteína PCSK1 entre los grupos de tratamiento reveló un efecto específico de la región de la exposición a la dexametasona. Si bien la abundancia de PCSK1 en el tejido LM-MP del colon proximal no se alteró significativamente (n = 3/grupo; media ± SEM de unidades arbitrarias: Control: 14.086 ± 729; Dexametasona: 11.402 ± 2.815; p = 0,44, prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 5A), el tratamiento con dexametasona redujo significativamente los niveles de PCSK1 en el tejido LM-MP del colon distal (n = 3/grupo; media ± SEM de unidades arbitrarias: Control: 22.323 ± 1.648; Dexametasona: 15.104 ± 597; p = 0,036, prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 5B).

A continuación, evaluamos si la supresión de PCSK1 inducida por la dexametasona se acompañó de una reducción correspondiente de los niveles de metionina-encefalina (M-ENK). La cuantificación de Western blot de M-ENK, normalizada con GAPDH, demostró que el tratamiento con dexametasona redujo significativamente la abundancia de M-ENK en ambas regiones (LM-MP del colon proximal: (n = 3/grupo; media ± SEM de unidades arbitrarias: Control: 94,7 ± 5,8; Dexametasona: 64,7 ± 5,3, p = 0,019; prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 4A, 4C). LM-MP del colon distal: (n = 3/grupo; media ± SEM de unidades arbitrarias: Control: 57,1 ± 2,2; Dexametasona: 21,5 ± 8,1, p = 0,040; prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 5C).

En conjunto, estos datos establecen que la señalización del GR regula negativamente el eje neuronal PCSK1-M-ENK, lo que sugiere un posible vínculo mecanicista entre la señalización psicológica y sistémica del estrés y la alteración de la biología de PCSK1-M-ENK en el eje neuro-oncológico relevante para el riesgo de CRC.

La señalización del receptor GLP-1 regula la expresión de PCSK1 neuronal.

Estudios recientes han identificado un papel protector de los fármacos agonistas del receptor del péptido similar al glucagón-1 (GLP-1R) en el CRC [^[29]–^[31]]. Dado que el receptor GLP-1 se expresa en las neuronas del SNE colónico [^[32]], hipotetizamos que este efecto protector de los agonistas del GLP-1R contra el CRC se media, al menos en parte, por la regulación ascendente dependiente del GLP-1R de la biología PCSK1-M-ENK en las neuronas del SNE colónico. Para probar esto, se cultivaron nuevamente tejidos de LM-MP colónico proximal y distal murino adulto en un medio completamente definido sin (control) y con el agonista del GLP-1R, liraglutida (500 nM), durante 12 horas. Después de recolectar los tejidos, se utilizó el ARN total y el cDNA generado para realizar una PCR cuantitativa en tiempo real con cebadores contra Hprt (gen de mantenimiento) y Pcsk1. Encontramos que, si bien la expresión de Pcsk1 en el tejido LM-MP del colon proximal no se alteró significativamente con la exposición a liraglutida (n = 3/grupo; media ± SEM del cambio en la abundancia relativa del transcrito Pcsk1: Control: 1,13 ± 0,32; Liraglutida: 1,30 ± 0,18; p = 0,67, prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 5D), la liraglutida aumentó significativamente la expresión de Pcsk1 en el tejido LM-MP del colon distal (n = 3/grupo; media ± SEM del cambio en la abundancia relativa del transcrito Pcsk1: Control: 1,36 ± 0,41; Liraglutida: 4,68 ± 1,19; p = 0,0497, prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 5E). Dado que hemos demostrado que la modulación de la abundancia de PCSK1 regula la abundancia de M-ENK, inferimos que el agonismo del GLP-1R regula al alza el eje neuronal PCSK1-M-ENK, lo que, según nuestros datos anteriores, actuaría sobre OGFr en las células tumorales del CRC para suprimir su proliferación.

Expresión del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) está regulada al alza en las células de cáncer colorrectal (CRC) humano.

Primero, probamos si (a) OGFR (que codifica el receptor del factor de crecimiento opioide OGFr) se expresa en las células de CRC, (b) si su expresión en las células derivadas del tumor se mejoró en contraste con su expresión en las células sanas y (c) si la expresión de OGFR se correlacionó con los genes marcadores conocidos de la troncalidad, la proliferación y los genes en los que las mutaciones se asociaron con el CRC. Nuestros análisis mostraron que la expresión de OGFR se detectó en todas las células tumorales de CRC, y que su expresión se mejoró en las células derivadas del tumor en relación con las células de control (Fig. 1A). Además, la expresión de OGFR en las células derivadas del tumor fue mayor en las células que expresaban el gen de troncalidad LGR5 y MKI67, que codifica para Ki67, un marcador de las células proliferantes (Fig. 1A). La expresión de OGFR también fue mayor en las células que expresaban KRAS, cuyas mutaciones impulsoras se sabe que están asociadas con el CRC y son un objetivo terapéutico [^[18]] (Fig. 1A). A continuación, observamos que la expresión de OGFR se correlacionó mejor con la de MKI67 y con KRAS en las células tumorales que en las células de los controles sanos (Fig. 1B, C), lo que sugiere que OGFR es un marcador clínicamente relevante para las células de CRC.

Las neuronas del SNE expresan la convertasa de proproteína subtilisina/kexina tipo 1 (PCSK1) para generar metionina-encefalina (M-ENK).

OGFr es un receptor nuclear que se une a un pentapéptido endógeno del factor de crecimiento opioide (OGF), también conocido como metionina-encefalina (M-ENK) [^[19], ^[20]]. Los pentapéptidos encefalinas, como la M-ENK (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) y la leucina-encefalina (L-ENK; Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu), se generan por la escisión de la proencefalina (PENK), que se expresa en las neuronas del SNE, así como en otras células del tracto gastrointestinal, como los fibroblastos [^[21], ^[22]]. La M-ENK, específicamente, se genera por la escisión de PENK por la enzima PCSK1 [^[23]]. A continuación, probamos si las neuronas del SNE expresan PCSK1 para regular la generación de M-ENK a partir de PENK. Utilizamos un anticuerpo anti-PCSK1 específico y un anticuerpo anti-M-ENK junto con antisueros anti-Hu (ANNA1) para realizar una tinción inmunohistoquímica de las neuronas mientéricas colónicas murinas adultas y encontramos que la inmunorreactividad de PCSK1 y M-ENK se observó en subpoblaciones de neuronas colónicas (Fig. 2A, B). Enumeramos la abundancia de neuronas mientéricas inmunorreactivas a PCSK1 en el colon proximal y distal y no encontramos diferencias significativas en la abundancia de neuronas inmunorreactivas a PCSK1 entre las dos regiones colónicas (n = 3 ratones; números totales de ganglios/ratón enumerados en el colon proximal: 20; media ± SEM del porcentaje de neuronas PCSK1+/ganglio en el colon proximal 16,8 ± 1,6%; números totales de ganglios enumerados/ratón en el colon distal: 15; media ± SEM del porcentaje de neuronas PCSK1+/ganglio en el colon distal 19,9 ± 1,4%; p = 0,974; prueba t de Welch (varianza desigual); Fig. 2C). Es importante destacar que no detectamos inmunorreactividad de PCSK1 en ningún otro tipo de célula en el tejido de músculo longitudinal y plexo mientérico (LM-MP) colónico murino adulto. En paralelo, hemos observado que se observa una fuerte inmunorreactividad de PCSK1 en las células del SNE humano [^[24]]. Además, analizamos datos de secuenciación de ARN de células/núcleos disponibles públicamente sobre el SNE colónico murino [^[16]] y encontramos que las poblaciones neuronales mientéricas Pcsk1+ del colon comprenden diferentes subconjuntos neuronales, incluidos aquellos que (a) coexpresan Vip y Nos1, (b) Slc17a6 (vGLUT2)+ Calcb (CGRP)+ Avil (Advilina)+ neuronas que pueden o no expresar Glp1r, y (c) neuronas que expresan Tac1 (Fig. S1). Es interesante destacar que observamos que las neuronas que expresan Penk son un subconjunto de neuronas Pcsk1+ del colon y que un subconjunto de neuronas que coexpresan Penk y Pcsk1 también expresan Glp1r y los marcadores neuronales sensoriales Avil y Calcb. Dado que Calcb y Avil son marcadores de las neuronas aferentes primarias intrínsecas (IPAN) que se proyectan hacia la mucosa [^[25]], lo que sugiere que estas neuronas Pcsk1+ Penk+ Glp1r+ Calcb+ Avil+ del colon son IPAN (Fig. S1). Estos datos sugieren que las neuronas entéricas colónicas son una fuente de M-ENK, que se produce por la escisión de PENK por PCSK1 expresado por las neuronas, y que las neuronas que liberan PCSK1+ M-ENK pueden proyectarse hacia la mucosa colónica.

Las neuronas que expresan PCSK1 se proyectan hacia los tumores de cáncer colorrectal (CRC).

Para examinar las proyecciones neuronales dentro de los tumores colorrectales, empleamos el modelo de ratón genéticamente modificado Fabp1-Cre:Apclox14/+; KrasG12D/+, en el que la recombinación mediada por Cre induce simultáneamente la pérdida de Apc en el epitelio y la activación fisiológica del oncogén endógeno KrasG12D en el epitelio cólico, lo que resulta en un adenocarcinoma invasivo que recapitula las características clave del CRC humano [^[26]]. Al analizar secciones fijadas en formalina e incluidas en parafina utilizando anticuerpos contra el marcador de fibras neuronales βIII-tubulina (TUJ1) y PCSK1, encontramos que las fibras nerviosas que expresan PCSK1 están presentes cerca del sitio tumoral del CRC y, por lo tanto, el PCSK1 de origen neuronal y, por extensión, la M-ENK, constituyen una parte del microambiente tumoral (TME) (Fig. 2D).

La M-ENK suprime la proliferación de las células de CRC de forma dependiente de la dosis y la mutación.

Dado que la M-ENK/OGF es un ligando para OGFr, y OGFr se expresa en las células de CRC proliferantes, a continuación, probamos si la M-ENK afectaba la proliferación de las células de CRC. Para ello, investigamos si la M-ENK alteraba la proliferación celular en los organoides de CRC murinos, que se generaron después de introducir alteraciones oncogénicas específicas en las células epiteliales colorrectales. Las células de CRC KrasWT conservan el Kras de tipo salvaje, pero albergan otros factores oncogénicos que son suficientes para conferir un fenotipo de cáncer colorrectal, siendo la desregulación de la vía Wnt/β-catenina la más notable, como se observa comúnmente mediante la pérdida de la función de APC. Por el contrario, las células que albergan mutaciones KrasG12D y KrasG12V portan mutaciones puntuales activadoras G12D y G12V, respectivamente, en el gen Kras. Cultivamos organoides de CRC murinos KrasWT, KrasG12D y KrasG12V en un medio de cultivo de organoides completo que contenía EdU. Cada línea celular se trató con tres concentraciones de M-ENK (10, 50 o 100 μM), dos concentraciones del ligando OGFr naloxona (1 o 10 μM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) o solo el vehículo como control. Después de cultivar durante 24 horas en condiciones estándar de cultivo celular, retiramos el medio y fijamos las células. Después de realizar la reacción Click-iT EdU para identificar las células EdU+ (en ciclo), (Fig. 3A) calculamos las proporciones de células EdU+ sobre todas las células nucleadas.

Comparamos la proporción de células EdU+ por tratamiento con ligandos con el control utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett (cada concentración frente al control). En los organoides KrasWT, si bien el tratamiento con 10 μM o 50 μM de M-ENK no alteró la proliferación, 100 μM de M-ENK redujo significativamente las proporciones de células EdU+ en los organoides (n = 19 control, n = 12 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 14,3 ± 2,2; 10 μM: 17,4 ± 2,0, p = 0,67; 50 μM: 11,0 ± 2,5, p = 0,67; 100 μM: 3,5 ± 1,5, p = 0,0055; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett; Fig. 3B). De manera similar, la naloxona redujo significativamente las proporciones de células EdU+ en los organoides a una dosis de 1 μM. Curiosamente, la naloxona a 10 μM no tuvo un efecto significativo en las proporciones de células EdU+ en los organoides (n = 19 control, n = 12 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 14,3 ± 2,2; 1 μM: 3,4 ± 0,9, p = 0,0037; 10 μM: 8,4 ± 1,9, p = 0,22; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett; Fig. 3B).

En los organoides mutantes KrasG12D, las proporciones de células EdU+ en los organoides en la línea de base (controles, sin ningún tratamiento) fueron (media ± SEM de células EdU+) 24,3 ± 3,7%. En estas células, la naloxona redujo significativamente las proporciones de células EdU+ (n = 10 control, n = 10 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 24,3 ± 3,7; 1 μM: 10,6 ± 2,4, p = 0,020; 10 μM: 13,3 ± 2,0, p = 0,034; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control; Fig. 3C). La exposición a M-ENK también redujo significativamente las proporciones de células EdU+ en los organoides a dosis intermedias, mientras que la dosis más alta no alcanzó una significación estadística (n = 10 control, n = 12 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 24,3 ± 3,7; 10 μM: 8,9 ± 3,2, p = 0,020; 50 μM: 8,6 ± 1,8, p = 0,003; 100 μM: 15,1 ± 3,0, p = 0,063; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett; Fig. 3C).

Curiosamente, en contraste con las células que no albergan mutaciones en el gen Kras o con mutaciones KrasG12D, los organoides que albergan mutaciones KrasG12V tenían (media ± SEM) 12,9 ± 2,0% de células EdU+ en condiciones de control. En estas células, la naloxona no alteró significativamente las proporciones de células EdU+ en los organoides (n = 20 control, n = 12 por grupo de tratamiento; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 12,9 ± 2,0; 1 μM: 22,5 ± 4,3, p = 0,14; 10 μM: 19,7 ± 3,2, p = 0,20; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control; Fig. 3D). De manera similar, la exposición a M-ENK no afectó significativamente la proliferación en ninguna de las concentraciones probadas (n = 20 control, n = 14–12–11 por grupo de tratamiento (10–50–100 μM, respectivamente); media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 12,9 ± 2,0; 10 μM: 21,2 ± 3,9, p = 0,20; 50 μM: 9,5 ± 2,1, p = 0,26; 100 μM: 18,9 ± 3,8, p = 0,26; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control; Fig. 3D).

Las neuronas del SNE modulan la proliferación de las células de organoides de CRC de forma dependiente de PCSK1.

Dado que encontramos que la M-ENK, cuya expresión está regulada por el PCSK1 de origen neuronal, reduce significativamente la proliferación de las células de CRC murinas, a continuación, investigamos si la presencia de neuronas del SNE ejerce un freno sobre la proliferación de las células de CRC y, de ser así, si el efecto se manifiesta de forma dependiente de PCSK1.

Para ello, cultivamos organoides de CRC KrasG12D en 4 condiciones en un medio que contenía EdU (medio de cultivo de organoides completo): cultivados solos sin ningún tratamiento adicional (grupo de control), cocultivados con células del SNE murino, cultivados solos en un medio que contenía PCSK1 recombinante (10 nM) y cocultivados con células del SNE murino en un medio que contenía PCSK1 recombinante (10 nM). Los organoides se cultivaron durante 24 horas en condiciones estándar de cultivo celular, después de lo cual se retiró el medio, se fijaron las células y se realizó la reacción Click-iT EdU para etiquetar las células EdU+ en ciclo (Fig. 4A). A continuación, enumeramos el porcentaje de células EdU+ sobre todas las células nucleadas.

Al realizar ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control, encontramos que, en comparación con los organoides de control, la proliferación de los organoides de CRC se redujo significativamente en presencia de células del SNE (Control frente a SNE: p = 0,0042) y, sobre todo, en condiciones combinadas de SNE + PCSK1 (Control frente a SNE + PCSK1: p < 0,0001), mientras que el PCSK1 recombinante solo no redujo significativamente la proliferación (Control frente a PCSK1: p = 0,1166). El cocultivo del SNE y la exposición al PCSK1 redujeron cada uno la proliferación, y la supresión más fuerte se observó en condiciones combinadas (n = 13 para el grupo de control, n = 12 para el grupo de SNE, n = 7 para el grupo de PCSK1, n = 14 para el grupo de SNE + PCSK1; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 15,4 ± 3,5; SNE: 1,84 ± 0,60; PCSK1: 3,72 ± 2,00; SNE + PCSK1: 0,32 ± 0,17; ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett frente al control; Fig. 4B).

Estos hallazgos demuestran que el PCSK1 recombinante contribuye al efecto antiproliferativo del cocultivo del SNE, lo que sugiere que la supresión de la proliferación de las células de CRC mediada por el SNE se produce, al menos en parte, a través de mecanismos dependientes de PCSK1.

Para probar directamente esta dependencia, realizamos un experimento independiente en el que los organoides de CRC KrasG12D cocultivados con el SNE se trataron con el inhibidor de PCSK1 Decanoil-RVKR-CMK (50 μM) durante 24 horas (Fig. 4C). La significación estadística se evaluó utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas. La inhibición de PCSK1 aumentó significativamente las proporciones de células EdU+ en comparación con el control, lo que demuestra que la supresión del crecimiento mediada por el SNE requiere la actividad de PCSK1. Estos datos muestran que el PCSK1 de origen neuronal es un regulador importante de la proliferación de las células de CRC (n = 15 para el grupo de control, n = 13 para el grupo de inhibidor de PCSK1; media ± SEM de células EdU+ (%): Control: 33,9 ± 2,8; Inhibidor de PCSK1: 45,2 ± 3,9, p = 0,009; Prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 4D).

La señalización del receptor de GLP-1 regula la expresión de PCSK1 neuronal.

Estudios recientes han identificado un papel protector de los fármacos agonistas del receptor del péptido similar al glucagón-1 (GLP-1R) en el CCRC [^[29]–^[31]]. Dado que el receptor de GLP-1 se expresa en las neuronas del sistema nervioso entérico (SNE) del colon [^[32]], planteamos la hipótesis de que este efecto protector de los agonistas del GLP-1R contra el CCRC está mediado, al menos en parte, por la regulación al alza dependiente del GLP-1R de la biología de PCSK1 – M-ENK en las neuronas del SNE del colon. Para probar esto, se cultivaron nuevamente tejidos de la lámina propia y la muscular lisa (LM-MP) proximal y distal del colon murino adulto en un medio completamente definido, con y sin el agonista del GLP-1R, liraglutida (500 nM), durante 12 horas. Después de la recolección de los tejidos, el ARN total y el ADNc generado se utilizaron para realizar una RT-PCR cuantitativa con cebadores contra Hprt (gen de referencia) y Pcsk1. Descubrimos que, si bien la expresión de Pcsk1 en el tejido de la LM-MP del colon proximal no se alteró significativamente por la exposición a liraglutida (n=3/grupo; media ± EE del cambio en la abundancia relativa del transcrito de Pcsk1: Control: 1,13 ± 0,32; Liraglutida: 1,30 ± 0,18; p = 0,67, prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 5D), la liraglutida aumentó significativamente la expresión de Pcsk1 en el tejido de la LM-MP del colon distal (n=3/grupo; media ± EE del cambio en la abundancia relativa del transcrito de Pcsk1: Control: 1,36 ± 0,41; Liraglutida: 4,68 ± 1,19; p = 0,0497, prueba t de Student no pareada de dos colas; Fig. 5E). Dado que hemos demostrado que la modulación de la abundancia de PCSK1 regula la abundancia de M-ENK, inferimos que el agonismo del GLP-1R aumenta el eje neuronal PCSK1–M-ENK, que, según nuestros datos anteriores, actuaría sobre OGFr en las células tumorales del CCRC para suprimir su proliferación.

Discusión

Nuestro estudio identifica un mecanismo neuro-oncogénico previamente no reconocido mediado por el eje PCSK1 - Met-encefalina (M-ENK/OGF) – OGFr, a través del cual las neuronas del SNE ejercen un freno sobre la proliferación de las células del CCRC y, por lo tanto, sobre el crecimiento tumoral. Si bien estudios anteriores propusieron un papel pro-oncogénico de las neuronas del SNE en el CCRC [^[9], ^[10]], el nuestro es el primer informe que destaca un mecanismo neuro-oncológico supresor de tumores entre las neuronas del SNE y el CCRC. Nuestro estudio establece el receptor del factor de crecimiento opioide (OGFr) como un marcador clínicamente relevante para las células del CCRC y muestra que la enzima convertasa de proteínas 1/3 derivada de las neuronas (PCSK1) es una biomolécula clave que regula la abundancia de OGF/M-ENK, que actúa sobre OGFr para reducir la proliferación de las células del CCRC. Además, demostramos que este mecanismo neuronal supresor de tumores es sensible al estrés, donde la señalización del glucocorticoide inducida por el estrés suprime y la señalización del GLP-1R mejora este mecanismo supresor de tumores en el colon distal. Estos datos sugieren cómo el SNE sano suprime la proliferación del CCRC y cómo el estrés fisiológico y psicológico puede promover la proliferación de las células del CCRC de forma dependiente del SNE. También observamos que la señalización del GLP-1R promueve la expresión de PCSK1 a partir de las neuronas del SNE del colon distal, lo que sugiere que aumentaría los niveles de M-ENK/OGF para suprimir la proliferación de las células del CCRC de forma dependiente de OGFr. Dado que se sabe que la liberación de GLP-1 de las células enteroendocrinas del colon se produce en respuesta a los ácidos grasos de cadena corta derivados de los microbios [^[33]], estos datos proporcionan un posible mecanismo a través del cual la microbiota intestinal saludable suprime la tumorigénesis en el colon [^[34]].

En este estudio, al analizar datos transcriptómicos de una sola célula disponibles públicamente sobre células humanas del CCRC, primero demostramos que OGFr es un marcador clínicamente relevante en las células del CCRC, ya que su expresión se mejora en las células tumorales en relación con las células sanas de control, y su expresión se correlaciona positivamente con la expresión del marcador del ciclo celular Mki67 (que codifica para Ki67) y la expresión del oncogén relevante para el CCRC Kras. Además, dado que se ha demostrado que la señalización de OGFr restringe la proliferación celular en otros cánceres [^[35]], su relevancia para el CCRC era importante de probar. Dado que OGF/M-ENK, cuya biología es significativa para el SNE [^[36]], planteamos la hipótesis y probamos que M-ENK se generaba de hecho en el SNE, y que las neuronas mielénicas que expresan coexpresan Penk y Pcsk1 (y, por lo tanto, liberan M-ENK) y se proyectan hacia la mucosa del colon. Al identificar un subconjunto de neuronas que expresan la enzima PC1/3 PCSK1 que regula la conversión de proencefalina (PENK, que es expresada tanto por las neuronas del SNE como por los fibroblastos intestinales) [^[22]] y que estas neuronas se proyectan hacia el microambiente tumoral, demostramos que las neuronas del SNE desempeñan un papel crucial en la regulación de la biología del CCRC a través de la señalización PCSK1 – OGF – OGFr.

Utilizando el cultivo in vitro de organoides de células del CCRC murino que albergan mutaciones relevantes para el CCRC en los genes Apc y Kras, nuestro estudio establece cómo el aumento de la señalización de OGFr a través de los ligandos de OGFr conocidos, M-ENK y naloxona, suprime la proliferación de las células del CCRC. Establecimos además una plataforma de cocultivo de CCRC – SNE a través de la cual investigamos el efecto de las células del SNE sobre la proliferación de las células del CCRC. Observamos que la presencia de células del SNE suprime la proliferación de las células del CCRC, un efecto que se mejora al complementar este sistema de cocultivo con la proteína PCSK1. Observamos además que la adición de un inhibidor de PCSK1 debilitó este freno sobre la proliferación de las células del CCRC. Por lo tanto, estos datos establecen que la PCSK1 derivada de las neuronas es una molécula reguladora clave en la supresión de la proliferación del CCRC.

Es importante destacar que observamos que, si bien la señalización de OGFr ejerció un freno sobre la proliferación celular en ausencia de mutaciones de Kras y en presencia de mutaciones de KrasG12D, las células del CCRC que albergan mutaciones de KrasG12V son resistentes al freno mediado por OGFr sobre la proliferación celular. A la luz de los datos clínicos que muestran que los pacientes con CCRC con mutaciones de KrasG12V tienen una supervivencia general significativamente peor [^[37]] y los datos preclínicos de nuestro grupo que muestran que los fenotipos moleculares de las mutaciones de KrasG12D y KrasG12V son únicos [^[38]], la resistencia de las células del CCRC con mutaciones de KrasG12V a la señalización de OGFr puede ayudar a explicar el mal pronóstico de los pacientes con mutaciones de KrasG12V.

El conocimiento ampliado de la regulación neuronal de la biología del CCRC también nos ayuda a estudiar cómo los factores que se sabe que aumentan o disminuyen el riesgo de CCRC pueden ejercer sus efectos. En este contexto, nuestros datos sobre el aumento de la señalización del receptor de glucocorticoides (GR) en el SNE, que hemos demostrado que se produce como resultado del aumento del estrés psicológico [^[14]], sobre la reducción de la abundancia de PCSK1 y M-ENK pueden ayudar a explicar mecánicamente cómo el estrés aumenta el riesgo de tumorigénesis colorrectal [^[39]]. De manera similar, nuestros datos sobre el efecto de la liraglutida para aumentar la expresión de Pcsk1 pueden ayudar a explicar el mecanismo a través del cual se observa el efecto protector del agonista del GLP-1R contra la tumorigénesis del CCRC [^[29], ^[30]]. Curiosamente, el efecto de la dexametasona y de la liraglutida sobre la modulación de PCSK1 se produce solo en el colon distal y no en el colon proximal, lo que sugiere diferencias significativas en las poblaciones neuronales que expresan PCSK1 en las dos regiones del colon. Sin embargo, actualmente no tenemos claridad sobre las diferencias en la taxonomía molecular de las neuronas mielénicas que expresan PCSK1 en el colon proximal frente al colon distal; esto será una importante línea de investigación para comprender mejor la importancia traslacional de esta vía.

Otra observación clave es la superposición parcial de la expresión de PCSK1 y M-ENK dentro de un subconjunto de neuronas mielénicas en el colon murino. Esto sugiere una asociación funcional, pero la falta de colocalización completa impide la asignación definitiva de la secreción de M-ENK a las neuronas que expresan PCSK1. Además, dado que el precursor de M-ENK, la proencefalina (PENK), también es expresado por los fibroblastos, sugiere que la PCSK1 restringida a las neuronas es el paso limitante de la velocidad en la génesis de M-ENK y en el freno neuronal sobre la proliferación de las células del CCRC.

Una pregunta importante que queda por resolver es que, si la señalización de OGFr restringe la proliferación de las células del CCRC, ¿por qué la expresión de OGFr se mejora en las células del CCRC? Una posible explicación es que el aumento de la expresión de OGFr en las células del CCRC cambia la estequiometría de la señalización M-ENK/OGF – OGFr a favor de OGFr y, por lo tanto, las cantidades en estado estacionario de M-ENK/OGF son insuficientes para seguir ejerciendo el freno sobre la proliferación de las células del CCRC. En este escenario, las intervenciones terapéuticas que aumentan los niveles de M-ENK/OGF en el tejido del colon servirían como base de nuevas intervenciones para atacar el CCRC.

A pesar de estas ideas, varias limitaciones merecen consideración. Primero, la mayoría de los experimentos funcionales se realizaron in vitro utilizando organoides murinos y sistemas de cocultivo, que no pueden recapitular completamente la complejidad del microambiente tumoral in vivo, incluidas las interacciones inmunitarias, del estroma y vasculares. En consecuencia, el alcance en el que el eje neuronal PCSK1–M-ENK modula el crecimiento tumoral in vivo aún está por establecerse.

Segundo, si bien nuestros datos respaldan un papel de la señalización mediada por M-ENK en la regulación de la proliferación del CCRC, los mecanismos de receptor precisos permanecen incompletos. Si bien nos centramos en OGFr como un mediador candidato, no podemos descartar las contribuciones de los receptores opioides clásicos u otras vías de señalización, particularmente dado los efectos farmacológicos observados con la naloxona.

Tercero, los mecanismos ascendentes que gobiernan la liberación de PCSK1 de las neuronas entéricas y las vías intracelulares descendentes activadas por la señalización de OGFr en las células del CCRC aún están por dilucidar. Abordar estas preguntas será esencial para definir completamente el potencial terapéutico de este eje neuropeptídico. Nuestro trabajo futuro buscará validar estos hallazgos en modelos murinos in vivo y con células humanas, para determinar el efecto neto de esta vía sobre el crecimiento y la metástasis del tumor. Además, aún no se ha dilucidado cómo la generación y liberación de GLP-1 se alteran en las células L del colon y cómo estos mecanismos se relacionan con el aumento del potencial oncogénico en los tejidos colorrectales.

En resumen, describimos un nuevo circuito regulador neuro-oncogénico en el CCRC, en el que las neuronas entéricas, a través de PCSK1, modulan la proliferación tumoral a través de la señalización de M-ENK y OGFr. Estos hallazgos proporcionan un marco mecanicista para comprender los efectos dependientes del contexto de PCSK1, revelan una posible función supresora de tumores del SNE y sugieren que la modulación terapéutica del eje neuronal PCSK1-M-ENK-OGFr puede representar una estrategia previamente no apreciada para el tratamiento del CCRC.

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