Alteración de la interacción entre el lipopolisacárido bacteriano y las células inmunitarias en el cáncer colorrectal, en comparación con el tejido intestinal adyacente.

El microbioma intestinal humano, así como las bacterias intratumorales, desempeñan un papel fundamental en el desarrollo y la progresión del cáncer.^[1-7] Las interacciones entre la microbiota y las células inmunitarias en el intestino requieren tanto tolerancia a las bacterias comensales como mecanismos de defensa contra los patógenos dañinos. En condiciones homeostáticas, varios mecanismos de defensa controlan y separan las bacterias intestinales en la capa de moco que recubre el epitelio intestinal.^[8] Además de las barreras epiteliales y mucosas, tanto los mecanismos inmunitarios innatos como los adaptativos contribuyen a la regulación de la composición microbiana. Por ejemplo, las células dendríticas (DCs) muestrean y presentan continuamente antígenos bacterianos para estimular las respuestas de las células T específicas del antígeno. Las células caliciformes en el epitelio pueden translocar el contenido luminal intestinal, incluidos los antígenos bacterianos, lo que resulta en tolerancia mediada por células T específica del antígeno.^[9] En contraste, las células B/plasmáticas contribuyen a la homeostasis intestinal a través de la producción de IgA secretora.^[10]

Sin embargo, en pacientes con cáncer, el microbioma intestinal se caracteriza con frecuencia por alteraciones en la composición y la función bacteriana.^[11] Estas alteraciones afectan la barrera intestinal y las respuestas de las células inmunitarias.^[11-13] Además, se encontró que ciertas especies bacterianas estaban presentes en cantidades particularmente grandes dentro del tejido del cáncer colorrectal (CRC).^[3],^[14],^[15] Aunque aún no está claro cómo las bacterias infiltran los tejidos cancerosos, algunos informes sugieren que la bacteria asociada al CRC, Fusobacterium nucleatum, puede translocarse a través de una vía hematológica hacia los tumores de CRC.^[16],^[17] Particularmente en el CRC, un origen aparente de las bacterias detectables dentro del microambiente tumoral (TME) es el lumen intestinal, desde donde probablemente se origina la translocación bacteriana.^[18] Las alteraciones en el TME y la interrupción de la barrera epitelial y mucosa, como se observa típicamente en el CRC, pueden favorecer el enriquecimiento de bacterias seleccionadas en los sitios tumorales.^[19] Cabe destacar que se han demostrado tanto efectos pro-tumorales como anti-tumorales de las bacterias en modelos animales y estudios en humanos.^[5],^[20],^[21] Sin embargo, las interacciones específicas entre las bacterias y el sistema inmunitario en el tumor y el tejido adyacente al tumor, así como la ubicación espacial de las bacterias en los tumores, no están bien caracterizadas. Se ha descrito que las bacterias se encuentran principalmente de forma intracelular en las células cancerosas y las células inmunitarias dentro del tejido tumoral, pero también extracelularmente en el tejido canceroso de varios tipos de tumores.^[22-25] En el CRC, se han detectado bacterias dentro de las células epiteliales en el sitio del tumor primario y en la lesión metastásica en el hígado.^[3],^[25] Además, se han encontrado formaciones de biopelículas, es decir, grandes agregados de bacterias, tanto en el colon adyacente no afectado como en el tejido de CRC.^[3],^[26-28] En nuestro estudio actual, analizamos tejido de CRC emparejado y tejido intestinal adyacente del mismo paciente. Nos centramos en el lipopolisacárido bacteriano (LPS) como un marcador general para las bacterias gramnegativas, como Fusobacterium nucleatum o Bacteroides fragilis, para evaluar las alteraciones localizadas en las interacciones microbiota-sistema inmunitario en pacientes con CRC. Una mejor caracterización y, en particular, la comprensión de las interacciones entre las bacterias y las células inmunitarias en el tejido derivado del paciente no solo ayudará a mejorar nuestra comprensión de las regiones pobladas por bacterias en los tumores de CRC, sino que también proporcionará información importante sobre los efectos mecanicistas de las bacterias en la patogénesis del CRC, lo que a su vez podría contribuir a nuestra comprensión de las terapias contra el cáncer basadas en bacterias.

Resultados

La imagen tridimensional demuestra agregados de LPS bacteriano y colocalización con células inmunitarias en el tejido de CRC

Para obtener una visión general de la localización de las bacterias y las células inmunitarias dentro del tejido intestinal adyacente al CRC y el tejido de CRC, aplicamos la aclaración de tejidos basada en disolventes orgánicos y el marcaje inmunológico a muestras de tejido derivadas del paciente de aproximadamente 5 mm³. Utilizamos LPS bacteriano como marcador de bacterias gramnegativas, CD45 como marcador general de células inmunitarias y PVALP como marcador del sistema vascular. En total, se incluyeron seis pacientes con CRC en el análisis, que comprendieron seis muestras de tejido intestinal adyacente al CRC y cinco muestras de CRC emparejadas del mismo paciente (los detalles del paciente se describen en la Tabla S1). En el tejido intestinal adyacente al CRC, se detectó LPS bacteriano principalmente en la capa de células epiteliales, probablemente derivado de restos de moco ricos en bacterias (Figura 1A, S1, S2A, B, Video Suplementario 1). Además, en 3/6 muestras de tejido intestinal adyacente al CRC, observamos la translocación de LPS bacteriano a las capas subepiteliales/submucosas (Figura S1). En contraste, en los tejidos de CRC, observamos regiones selectivas de LPS, indicativas de la abundancia bacteriana, en lugar de una distribución uniforme en todo el tejido (Figura 1B, S3A, B, Video Suplementario 2). La comparación entre los tejidos de CRC emparejados y los tejidos intestinales adyacentes al CRC reveló un aumento en la concentración de LPS bacteriano por volumen (mm³) en 4/5 tejidos de CRC (Figura 1C). Sin embargo, la magnitud del aumento varió sustancialmente entre los pacientes, lo que indica una alta variabilidad interpaciente en la acumulación de LPS. Cabe destacar que solo una pequeña proporción de las señales de LPS bacteriano se colocalizó con los vasos sanguíneos (Figura 1D). La colocalización media de LPS bacteriano con PVALP, indicativo de los vasos sanguíneos, fue de 0,3 ± 0,05% DE en el tejido de CRC y ligeramente inferior (0,2 ± 0,07% DE) en el tejido intestinal adyacente al CRC. Además, nuestros resultados indicaron un mayor número de vasos sanguíneos por mm³ en el tejido tumoral (5817 ± 2839 DE) que en los tejidos intestinales adyacentes al CRC (2602 ± 1163 DE) (Figura S4A, B). En todas las muestras, obtuvimos altos porcentajes de colocalización de LPS bacteriano con células inmunitarias CD45+ (Figura 1E, Figura S4C, D). La media de la colocalización de LPS-CD45 fue del 90% en las muestras de tejido intestinal adyacente al CRC y del 80% en las muestras de tejido de CRC. En general, nuestro tinte tridimensional reveló un aumento del LPS bacteriano dentro del tejido de CRC, que se colocaliza con las células inmunitarias.

El análisis de transcriptómica espacial detecta células epiteliales inflamadas en mayor cantidad en el tejido de CRC emparejado en comparación con el tejido intestinal adyacente

Para obtener una visión general del panorama de las células inmunitarias en el tejido de CRC y el tejido intestinal adyacente emparejado del mismo paciente, aplicamos la transcriptómica espacial a los tejidos de tres pacientes con CRC (la Figura S5A muestra la tinción histopatológica (H&E) de estos pacientes). Detectamos 10 tipos diferentes de grupos de células dentro de los datos de transcriptómica espacial tanto del tejido intestinal adyacente al CRC como del tejido de CRC (Figura 2A, B, C, Figura S5B) para los genes expresados dentro de estos grupos de células. En particular, se detectó un mayor número de células relacionadas con el grupo de células epiteliales inflamadas en el tejido de CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC. Este grupo de células expresó algunos marcadores de células epiteliales, pero también varios marcadores asociados a neutrófilos, como S100A8 y S100A9, IL1B y MMP9, junto con la quimiocina que recluta neutrófilos CXCL8. Se han descrito previamente dichos grupos en el tejido intestinal.^[29] Además, las muestras de tejido de CRC exhibieron una mayor abundancia de macrófagos en comparación con sus tejidos intestinales adyacentes emparejados.

La citometría de masas de imagen detecta una disminución de las células presentadoras de antígenos, acompañada de un aumento de los neutrófilos en el tejido de CRC en comparación con el tejido adyacente

Para comprender qué células inmunitarias interactúan con el LPS bacteriano en el tejido intestinal adyacente al CRC y en el tejido de CRC, aplicamos la citometría de masas de imagen (IMC) utilizando un panel con 31 marcadores diferentes de células inmunitarias, así como LPS bacteriano (Tabla Suplementaria S2). Se analizaron dos regiones (cada una de 600 µm × 600 µm) por tejido intestinal adyacente al CRC (Figura 2D, E) y tejido de CRC (Figura 2F, G) de nueve pacientes, incluidos los pacientes con CRC estudiados anteriormente (los detalles del paciente se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria S1 y la tinción H&E de las muestras de tejido se muestra en la Figura Suplementaria S6). El recuento medio de células por imagen fue menor en las muestras de tejido intestinal adyacente al CRC (2447 ± 321 DE) que en las muestras de tumor (3140 ± 703 DE) (Figura S7A). En general, se identificaron 44.053 células en todos los tejidos adyacentes y 56.522 células en todos los tejidos de CRC (Figura S7B). Para definir los tipos de células en los tejidos intestinales adyacentes al CRC y los tejidos de CRC, aplicamos un enfoque de agrupamiento no supervisado utilizando FlowSOM, determinando los tipos de células en función de los niveles de expresión de marcadores similares que se encuentran dentro de un grupo de células (Tabla Suplementaria S3, Figuras S8, S9). Las frecuencias de los tipos de células de cada una de las dos regiones escaneadas por paciente y tejido se visualizan para el tejido adyacente al CRC y el tejido de CRC en la Figura Suplementaria S10A y B, respectivamente (Figura S10A). Las poblaciones celulares más abundantes fueron las células epiteliales tanto en los tejidos intestinales adyacentes al CRC como en los tejidos de CRC, con un promedio de 36,8% ± 1,12 SEM y 48,2% ± 8,1 SEM, respectivamente (Figura 2H, Figura S10A). Hubo frecuencias comparables de macrófagos CD68+ (9,7 ± 0,9% SEM y 10,3 ± 1,69% SEM), células T CD4+ (1,7 ± 0,4% SEM y 2,2 ± 0,3% SEM) y células T CD8+ (2,1 ± 0,5 y 3,7 ± 1,02% SEM) tanto en los tejidos intestinales adyacentes al CRC como en los tejidos de CRC. Además, detectamos una población distinta de macrófagos CD68+, que era positiva para CD163. CD163 es una glicoproteína de membrana plasmática y miembro de la superfamilia de receptores de barrido ricos en cisteína (SRCR) de clase B, que se expresa altamente en los macrófagos residentes en los tejidos.^[30] Aquí, la población de macrófagos CD163+ fue significativamente más abundante en el tejido intestinal adyacente al CRC (3,6 ± 0,8% SEM) en comparación con el tejido de CRC (0,5% ± 0,1 SEM). Las células B CD20+ disminuyeron en el tejido de CRC (0,4% ± 0,1 SEM) en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC (4,3% ± 2,1 SEM), y de manera similar, las células del estroma αSMA+ y CD31+ se encontraron en una proporción significativamente menor en el tejido de CRC (22,8% ± 4,1) que en el tejido intestinal adyacente al CRC (37,2% ± 2,2 SEM). Las células dendríticas CD11c+ (1,6% ± 0,4 SEM) fueron el tipo de célula menos abundante en el tejido intestinal adyacente al CRC. En particular, había muy pocas células dendríticas CD11c+ en el tejido de CRC para formar un tipo de grupo de células, lo que resultó en la ausencia de este tipo de célula en el tejido de CRC en función de los marcadores específicos utilizados en IMC. En contraste, los neutrófilos CD15+ aumentaron significativamente en el CRC (7,7% ± 1,8 SEM) en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC (0,6% ± 0,1 SEM). Es interesante destacar que estos neutrófilos también expresaron Granzima B. Confirmando nuestros hallazgos, nuestros datos de transcriptómica espacial e IMC revelaron poblaciones celulares superpuestas, con células B, células epiteliales y epitelio inflamado que mostraron tendencias consistentes en ambos enfoques, aunque se detectaron tipos de células adicionales de forma única por cada método (Figuras S11A y S11B).

Interacciones distintas entre el LPS bacteriano y las células inmunitarias en el tejido intestinal adyacente al CRC en comparación con el tejido de CRC

Habiendo identificado los tipos de células en los tejidos intestinales adyacentes al CRC y los tejidos de CRC, investigamos a continuación las posibles interacciones entre los distintos tipos de células del huésped humano y el LPS bacteriano. Definimos una célula como asociada con el LPS bacteriano (LPS+) si la expresión del marcador de LPS bacteriano dentro de una célula excedía un corte del percentil 90. Por lo tanto, elegimos un corte estricto para minimizar cualquier posible fondo o desbordamiento de diferentes canales. Entre las células clasificadas como asociadas con el LPS bacteriano, observamos una mayor expresión relativa de los marcadores de activación, incluidos CD25 en las células B, CD69 en las células T CD4+ y CD8+, así como CD163 en los macrófagos (Figura S12).

Por IMC, observamos que las señales de LPS aparecían como puntos aislados en los tejidos intestinales adyacentes al CRC, en contraste con una señal más difusa en los tejidos de CRC (Figura 3A, B).

Para evaluar la distribución del LPS en el CRC y en el tejido intestinal adyacente al CRC, comparamos tanto la abundancia absoluta como la frecuencia relativa de las células LPS+ en muestras emparejadas de los pacientes (n = 9). Observamos una diferencia significativa (p-valor = 0,003) entre el número relativo de células LPS+ en relación con el total de células por paciente en el tejido intestinal adyacente al CRC y en el tejido del CRC (Figura 3C). Curiosamente, el recuento absoluto de células LPS+ por paciente se mantuvo comparable entre el CRC y el tejido intestinal adyacente al CRC (p-valor = 0,16) (Figura S13). Posteriormente, investigamos la relación entre la abundancia de células bacterianas LPS+ y la proporción de células inmunitarias (Figuras 3D, S14B). La correlación de rangos de Spearman de las muestras tumorales reveló una relación positiva entre la proporción de células LPS+ y células inmunitarias en relación con el total de células (rho = 0,75, p-valor = 0,02), lo que indica una tendencia hacia un aumento de la infiltración de células inmunitarias con un mayor recuento total de células inmunitarias LPS+ en el tejido del CRC. En contraste, esta asociación no se observó en el tejido intestinal adyacente al CRC (rho = 0,15, p-valor = 0,70), lo que indica una interacción específica del tumor. Curiosamente, para el número de células epiteliales, encontramos una relación inversa con el número de células LPS+ (Figura S14A, C, D).

Estos hallazgos sugieren que proporciones más altas de células LPS+ en los tumores de CRC pueden coincidir con un aumento de la infiltración de células inmunitarias en el tejido del CRC. Finalmente, evaluamos con qué frecuencia los diferentes tipos de células se asociaban con el LPS bacteriano. Dentro del tejido intestinal adyacente al CRC, la mayoría de las células dendríticas se asociaron con el LPS bacteriano (74% ± 0,06 SEM) (Figura 3E). De manera similar, en promedio, el 34% ± 0,08 SEM de todos los neutrófilos y el 35% ± 0,06 SEM de todos los macrófagos CD163+ en el tejido intestinal adyacente al CRC fueron LPS+. Para estos tres tipos de células, la prueba de Kruskal-Wallis mostró diferencias significativas en comparación con otros tipos de células. Para el tejido del CRC, la proporción más alta de células LPS+ por tipo de célula fue del 21% ± 0,1 SEM en los macrófagos CD163+, 11% ± 0,02 SEM en los neutrófilos CD15+ y 13% ± 0,02 SEM en las células epiteliales (Figura 3F). El análisis de Kruskal-Wallis no mostró diferencias significativas entre ninguno de los tipos de células dentro del tejido del CRC.

Además, investigamos la composición de los tipos de células entre todas las células LPS+ en el tejido intestinal adyacente al CRC en comparación con el tejido del CRC para determinar qué tipos de células inmunitarias estaban más representados entre ellas. Entre todas las células LPS+ por imagen, la fracción de células dendríticas y macrófagos CD163+ fue mayor en el tejido intestinal adyacente al CRC (Figura 3G) en comparación con el tejido del CRC (Figura 3H). Además, se detectó una mayor proporción de células epiteliales y neutrófilos entre las células LPS+ por imagen en el CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC. Los macrófagos CD163+ y las células dendríticas CD11c+ difirieron significativamente entre las células LPS+ por imagen del CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC.

Para respaldar nuestros hallazgos, filtramos y reexaminamos los datos metagenómicos de los nueve pacientes con CRC analizados en este estudio a partir de nuestro conjunto de datos previamente publicado más amplio.^[18] Las muestras de tejido intestinal adyacente al CRC y tejido del CRC del mismo paciente no mostraron diferencias significativas en la composición general de los géneros bacterianos (Figura S15A). Sin embargo, detectamos un aumento de la abundancia de Fusobacterium nucleatum, asociado al CRC, en el tejido del CRC, lo que coincide con varios hallazgos previos, y esta tendencia no alcanzó la significación estadística en nuestro estudio (Figura S15B). En particular, Lachnoclostridium sp. YL32 fue la única especie que mostró una diferencia estadísticamente significativa en la abundancia relativa entre el CRC y el tejido intestinal adyacente al CRC (Figura S15C). Este hallazgo es consistente con informes previos que indican un enriquecimiento de Lachnoclostridium sp. YL32 en pacientes con adenomas colorrectales en comparación con los controles sanos.^[31] A pesar de este cambio taxonómico, la abundancia relativa de Lachnoclostridium sp. YL32 no se correlacionó significativamente con los niveles de LPS detectados mediante IMC (Figura S15D). Además, no encontramos una correlación significativa entre el número total de especies grampositivas o gramnegativas identificadas en el conjunto de datos metagenómicos y la cantidad de LPS detectada mediante el IMC (Figura S16). Sin embargo, algunas especies específicas mostraron una correlación con los niveles de LPS detectados por IMC, incluyendo Anaerostipes caccae, Collinsella aerofaciens y Lachrimispora saccharoltytica, junto con seis especies adicionales en el tejido intestinal adyacente al CRC, así como Subdoligranulum variabile y Lachrimispora saccharoltytica en el tejido del CRC (Figura S17).

Un contexto espacial distinto de las células inmunitarias asociadas a LPS diferencia el tejido intestinal adyacente al CRC del tejido del CRC emparejado

Observamos diferencias en las proporciones de tipos de células específicos en el tejido del CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC y, en consecuencia, cambios en las interacciones del LPS bacteriano con las células inmunitarias dentro del tejido del CRC. A continuación, investigamos el contexto espacial circundante de las células asociadas con el LPS bacteriano en el tejido intestinal adyacente al CRC y en el tejido del CRC. Todos los tipos de células mostraron interacciones propias, lo que sugiere un agrupamiento espacial. Las células epiteliales estaban compartimentadas en el tejido intestinal adyacente al CRC y en el tejido del CRC y no se encontraron en proximidad espacial con otros tipos de células. En el tejido intestinal adyacente al CRC, los neutrófilos LPS+ CD15+ se encontraron en proximidad espacial con las células T LPS+ CD4+, las células dendríticas LPS+ CD11c+ y los macrófagos LPS+ CD163+ (Figura 4A). En el tejido del CRC, los neutrófilos LPS+ CD15+ también se ubicaron en estrecha proximidad con las células T LPS+ CD8+ y los macrófagos LPS+ y LPS- CD68+ y los macrófagos CD163+. Además, los neutrófilos LPS+ sugieren un agrupamiento espacial más fuerte en el tejido del CRC que en el tejido intestinal adyacente al CRC.

Los macrófagos LPS+ CD163+ se encontraron en proximidad espacial con las células T LPS+ y LPS- CD4+ y las células T CD8+, así como con los neutrófilos LPS+ CD15+ y los macrófagos LPS+ y LPS- CD68+ en el tejido intestinal adyacente al CRC. En contraste, hubo una falta de proximidad espacial entre los macrófagos LPS+ CD163+ y las células T LPS+ y LPS- CD4+ y CD8+ en el tejido del CRC (Figura 4B), pero una mayor proximidad espacial de los macrófagos LPS+ CD163+ a los neutrófilos CD15+. Sin embargo, la proximidad celular entre los neutrófilos LPS+ CD15+ y las células T LPS+ CD8+ y CD4+ se encontró con menos frecuencia en el tejido intestinal adyacente al CRC (Figura 4C, D) en comparación con el tejido del CRC (Figura 4C, E).

En general, la principal distinción de la proximidad de las células LPS+ que se encontró entre el tejido intestinal adyacente al CRC y el tejido del CRC fue la pérdida de la proximidad espacial de los macrófagos LPS+ CD163+ y las células dendríticas a las células T, mientras que, en contraste, se encontró una mayor proximidad espacial de los neutrófilos LPS+ a las células T en el tejido del CRC.

En general, observamos alteraciones en la composición de las células inmunitarias LPS+ y en el contexto espacial, mientras que no se detectaron diferencias significativas en los perfiles bacterianos entre los tejidos del CRC y el tejido intestinal adyacente al CRC emparejados.

La imagen tridimensional demuestra agregados de LPS bacteriano y colocalización con células inmunitarias en el tejido del CRC

Para obtener una visión general de la localización de las bacterias y las células inmunitarias dentro del tejido intestinal adyacente al CRC y el tejido del CRC, aplicamos la aclaración de tejidos basada en disolventes orgánicos y el marcaje inmunológico a muestras de tejido derivadas del paciente de aproximadamente 5 mm³. Aplicamos el LPS bacteriano como marcador de bacterias gramnegativas, CD45 como marcador general de células inmunitarias y PVALP como marcador de los vasos sanguíneos. En total, se incluyeron seis pacientes con CRC en el análisis, que comprendieron seis muestras de tejido intestinal adyacente al CRC y cinco muestras emparejadas del CRC del mismo paciente (los detalles del paciente se describen en la Tabla S1). En el tejido intestinal adyacente al CRC, se detectó el LPS bacteriano principalmente en la capa de células epiteliales, probablemente derivado de restos de moco ricos en bacterias (Figura 1A, S1, S2A, B, Video Suplementario 1). Además, en 3/6 muestras de tejido intestinal adyacente al CRC, observamos la translocación del LPS bacteriano en las capas subepiteliales/submucosas (Figura S1). En contraste, en los tejidos del CRC, observamos regiones selectivas de LPS, indicativas de la abundancia bacteriana, en lugar de una distribución uniforme en todo el tejido (Figura 1B, S3A, B, Video Suplementario 2). La comparación entre los tejidos del CRC emparejados y los tejidos intestinales adyacentes al CRC reveló un aumento de la concentración de LPS bacteriano por volumen (mm³) en 4/5 tejidos del CRC (Figura 1C). Sin embargo, la magnitud del aumento varió sustancialmente entre los pacientes, lo que indica una alta variabilidad interpaciente en la acumulación de LPS. En particular, solo una pequeña parte de las señales de LPS bacteriano se colocalizó con los vasos sanguíneos (Figura 1D). La colocalización media del LPS bacteriano con PVALP, indicativo de los vasos sanguíneos, fue de 0,3 ± 0,05% DE en el tejido del CRC y ligeramente inferior (0,2 ± 0,07% DE) en el tejido intestinal adyacente al CRC. Además, nuestros resultados indicaron un mayor número de vasos sanguíneos por mm³ en el tejido tumoral (5817 ± 2839 DE) que en los tejidos intestinales adyacentes al CRC (2602 ± 1163 DE) (Figura S4A, B). En todas las muestras, obtuvimos altos porcentajes de colocalización del LPS bacteriano con las células inmunitarias CD45+ (Figura 1E, Figura S4C, D). La media de la colocalización de LPS-CD45 fue del 90% en las muestras de tejido intestinal adyacente al CRC y del 80% en las muestras de tejido del CRC. En general, nuestro tinte 3D reveló un aumento del LPS bacteriano dentro del tejido del CRC, que se colocalizó con las células inmunitarias.

El análisis de la transcriptómica espacial detecta un aumento de las células epiteliales inflamadas en el tejido del CRC emparejado en comparación con el tejido intestinal adyacente

Para obtener una visión general del panorama de las células inmunitarias en el tejido del CRC y el tejido intestinal adyacente emparejado del mismo paciente, aplicamos la transcriptómica espacial a los tejidos de tres pacientes con CRC (la Figura S5A muestra la tinción histopatológica (H&E) de estos pacientes). Detectamos 10 tipos diferentes de grupos de células dentro de los datos de transcriptómica espacial tanto del tejido intestinal adyacente al CRC como del tejido del CRC (Figura 2A, B, C, Figura S5B) para los genes expresados dentro de estos grupos de células. En particular, se detectó un mayor número de células relacionadas con el grupo de células epiteliales inflamadas en el tejido del CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC. Este grupo de células expresó algunos marcadores de células epiteliales, pero también varios marcadores asociados a neutrófilos, como S100A8 y S100A9, IL1B y MMP9, junto con la quimiocina que recluta neutrófilos CXCL8. Se han descrito previamente estos grupos en el tejido intestinal.^[29] Además, las muestras de tejido del CRC exhibieron una mayor abundancia de macrófagos en comparación con sus tejidos intestinales adyacentes emparejados.

La citometría de masas de imagen detecta una disminución de las células presentadoras de antígenos, acompañada de un aumento de los neutrófilos en el tejido del CRC en comparación con el tejido adyacente.

Para comprender qué células inmunitarias interactúan con el LPS bacteriano en el tejido intestinal adyacente al CRC y en el tejido tumoral del CRC, aplicamos citometría de masas por imagen (IMC) utilizando un panel con 31 diferentes marcadores de células inmunitarias, así como LPS bacteriano (Tabla S2 del Material Suplementario). Se analizaron dos regiones (cada una de 600 µm × 600 µm) por tejido intestinal adyacente al CRC (Figura 2D, E), así como tejido tumoral del CRC (Figura 2F, G) de nueve pacientes, incluidos los pacientes con CRC estudiados anteriormente (los detalles del paciente se pueden encontrar en la Tabla S1 del Material Suplementario y la tinción con H&E de las muestras de tejido se muestra en la Figura S6 del Material Suplementario). El recuento medio de células por imagen fue menor en las muestras de tejido intestinal adyacente al CRC (2447 ± 321 DE) que en las muestras tumorales (3140 ± 703 DE) (Figura S7A). En general, se identificaron 44.053 células en todos los tejidos adyacentes y 56.522 células en todos los tejidos del CRC (Figura S7B). Para definir los tipos de células en los tejidos intestinales adyacentes al CRC y en los tejidos del CRC, aplicamos un enfoque de agrupamiento no supervisado utilizando FlowSOM, determinando los tipos de células en función de los niveles de expresión de marcadores similares que se encuentran dentro de un grupo de células (Tabla S3 del Material Suplementario, Figuras S8, S9). Las frecuencias de los tipos de células de cada una de las dos regiones escaneadas por paciente y tejido se visualizan para el tejido adyacente al CRC y el tejido del CRC en la Figura S10A y B del Material Suplementario, respectivamente (Figura S10A). Las poblaciones celulares más abundantes fueron las células epiteliales tanto en los tejidos intestinales adyacentes al CRC como en los tejidos del CRC, con un promedio de 36,8 % ± 1,12 SEM y 48,2 % ± 8,1 SEM, respectivamente (Figura 2H, Figura S10A). Hubo frecuencias comparables de macrófagos CD68+ (9,7 ± 0,9 % SEM y 10,3 ± 1,69 % SEM), células T CD4+ (1,7 ± 0,4 % SEM y 2,2 ± 0,3 % SEM) y células T CD8+ (2,1 ± 0,5 % y 3,7 ± 1,02 % SEM) tanto en los tejidos intestinales adyacentes al CRC como en los tejidos del CRC. Además, detectamos una población distinta de macrófagos CD68+, que resultó positiva para CD163. CD163 es una glicoproteína de la membrana plasmática y miembro de la superfamilia de receptores de eliminación de lípidos rica en cisteína (SRCR) de clase B, que se expresa altamente en los macrófagos residentes en el tejido.^[30] Aquí, la población de macrófagos CD163+ fue significativamente más abundante en el tejido intestinal adyacente al CRC (3,6 ± 0,8 % SEM) en comparación con el tejido del CRC (0,5 % ± 0,1 SEM). Las células B CD20+ disminuyeron en el tejido del CRC (0,4 % ± 0,1 SEM) en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC (4,3 % ± 2,1 SEM), y de manera similar, las células del estroma αSMA+ y CD31+ se encontraron en una proporción significativamente menor en el tejido del CRC (22,8 % ± 4,1) que en el tejido intestinal adyacente al CRC (37,2 % ± 2,2 SEM). Las células dendríticas CD11c+ (1,6 % ± 0,4 SEM) fueron el tipo de célula menos abundante en el tejido intestinal adyacente al CRC. Cabe destacar que había muy pocas células dendríticas CD11c+ en el tejido del CRC para formar un tipo de célula en grupo, lo que resultó en la ausencia de este tipo de célula en el tejido del CRC en función de los marcadores específicos utilizados en IMC. En contraste, los neutrófilos CD15+ se incrementaron significativamente en el CRC (7,7 % ± 1,8 SEM) en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC (0,6 % ± 0,1 SEM). Curiosamente, estos neutrófilos también expresaron Granzima B. Confirmando nuestros hallazgos, nuestros datos de transcriptómica espacial e IMC revelaron poblaciones celulares superpuestas, con células B, células epiteliales y epitelio inflamado que mostraron tendencias consistentes en ambos enfoques, aunque se detectaron tipos de células adicionales de forma exclusiva por cada método (Figuras S11A y S11B).

Interacción distinta del LPS bacteriano con las células inmunitarias en el tejido intestinal adyacente al CRC en comparación con el tejido del CRC

Habiendo identificado los tipos de células en los tejidos intestinales adyacentes al CRC y en los tejidos del CRC, a continuación, investigamos las posibles interacciones entre los distintos tipos de células del huésped humano y el LPS bacteriano. Definimos una célula como asociada con el LPS bacteriano (LPS+) si la expresión del marcador de LPS bacteriano dentro de una célula excedía un valor límite del percentil 90. Por lo tanto, elegimos un valor límite estricto para minimizar cualquier posible fondo o desbordamiento de diferentes canales. Entre las células clasificadas como asociadas con el LPS bacteriano, observamos una mayor expresión relativa de los marcadores de activación, incluido CD25 en las células B, CD69 en las células T CD4+ y CD8+, así como CD163 en los macrófagos (Figura S12).

Por IMC, observamos que las señales de LPS aparecían como puntos aislados en los tejidos intestinales adyacentes al CRC, en contraste con una señal más difusa en los tejidos del CRC (Figura 3A, B).

Para evaluar la distribución del LPS en el CRC y el tejido intestinal adyacente al CRC, comparamos tanto la abundancia absoluta como la frecuencia relativa de las células LPS+ en muestras emparejadas de los pacientes (n = 9). Observamos una diferencia significativa (p-valor = 0,003) entre el número relativo de células LPS+ en relación con todas las células por paciente en el tejido intestinal adyacente al CRC y el tejido del CRC (Figura 3C). Curiosamente, el recuento absoluto de células LPS+ por paciente se mantuvo comparable entre el CRC y el tejido intestinal adyacente al CRC (p-valor = 0,16) (Figura S13). Posteriormente, investigamos la relación entre la abundancia de células LPS+ y la proporción de células inmunitarias (Figuras 3D, S14B). La correlación de rango de Spearman de las muestras tumorales reveló una relación positiva entre la proporción de células LPS+ y las células inmunitarias en relación con todas las células (rho = 0,75, p-valor = 0,02), lo que indica una tendencia hacia un aumento de la infiltración de células inmunitarias con un mayor recuento total de células inmunitarias LPS+ en el tejido del CRC. En contraste, esta asociación no se observó en el tejido intestinal adyacente al CRC (rho = 0,15, p-valor = 0,70), lo que indica una interacción específica del tumor. Curiosamente, para el número de células epiteliales, encontramos una relación inversa con el número de células LPS+ (Figura S14A, C, D).

Estos hallazgos sugieren que las mayores proporciones de células LPS+ en los tumores del CRC pueden coincidir con un aumento de la infiltración de células inmunitarias en el tejido del CRC. Finalmente, evaluamos con qué frecuencia los tipos de células individuales estaban asociados con el LPS bacteriano. Dentro del tejido intestinal adyacente al CRC, la mayoría de las células dendríticas estaban asociadas con el LPS bacteriano (74 % ± 0,06 SEM) (Figura 3E). De manera similar, en promedio, el 34 % ± 0,08 SEM de todos los neutrófilos y el 35 % ± 0,06 SEM de todos los macrófagos CD163+ en el tejido intestinal adyacente al CRC fueron LPS+. Para estos tres tipos de células, la prueba de Kruskal-Wallis mostró diferencias significativas en comparación con otros tipos de células. Para el tejido del CRC, la proporción más alta de células LPS+ por tipo de célula fue del 21 % ± 0,1 SEM en los macrófagos CD163+, 11 % ± 0,02 SEM en los neutrófilos CD15+ y 13 % ± 0,02 SEM en las células epiteliales (Figura 3F). El análisis de Kruskal-Wallis no mostró diferencias significativas entre ninguno de los tipos de células dentro del tejido del CRC.

Además, investigamos la composición del tipo de célula entre todas las células LPS+ en el tejido intestinal adyacente al CRC en comparación con el tejido del CRC para determinar qué tipos de células inmunitarias estaban más representadas entre ellas. Entre todas las células LPS+ por imagen, la fracción de células dendríticas y macrófagos CD163+ fue mayor en el tejido intestinal adyacente al CRC (Figura 3G) en comparación con el tejido del CRC (Figura 3H). Además, se detectó una mayor proporción de células epiteliales y neutrófilos entre las células LPS+ por imagen en el CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC. Los macrófagos CD163+ y las células dendríticas CD11c+ difirieron significativamente entre las células LPS+ por imagen del CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC.

Para respaldar nuestros hallazgos, filtramos y reexaminamos los datos metagenómicos de los nueve pacientes con CRC analizados en este estudio a partir de nuestro conjunto de datos previamente publicado.^[18] Las muestras de tejido intestinal adyacente al CRC y tejido del CRC de los mismos pacientes no mostraron diferencias significativas en la composición general de los géneros bacterianos (Figura S15A). Sin embargo, detectamos una mayor abundancia de Fusobacterium nucleatum, asociado al CRC, en el tejido del CRC, lo que coincide con varios hallazgos previos, y esta tendencia no alcanzó la significación estadística en nuestro estudio (Figura S15B). Cabe destacar que Lachnoclostridium sp. YL32 fue la única especie que mostró una diferencia estadísticamente significativa en la abundancia relativa entre el CRC y el tejido intestinal adyacente al CRC (Figura S15C). Este hallazgo es consistente con informes previos que indican un enriquecimiento de Lachnoclostridium sp. YL32 en pacientes con adenomas colorrectales en comparación con los controles sanos.^[31] A pesar de este cambio taxonómico, la abundancia relativa de Lachnoclostridium sp. YL32 no se correlacionó significativamente con los niveles de LPS detectados por IMC (Figura S15D). Además, no encontramos una correlación significativa entre el número total de especies grampositivas o gramnegativas identificadas en el conjunto de datos metagenómicos y la cantidad de LPS detectado por el IMC (Figura S16). Curiosamente, sin embargo, algunas especies mostraron una correlación con los niveles de LPS detectados por IMC, incluidos Anaerostipes caccae, Collinsella aerofaciens y Lachrimispora saccharoltytica, junto con seis especies adicionales en el tejido intestinal adyacente al CRC, así como Subdoligranulum variabile y Lachrimispora saccharoltytica en el tejido del CRC (Figura S17).

Un contexto espacial distinto de las células inmunitarias asociadas con LPS+ diferencia el tejido intestinal adyacente al CRC del tejido del CRC emparejado

Observamos diferencias en las proporciones de tipos de células específicos en el tejido del CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC y, en consecuencia, cambios en las interacciones del LPS bacteriano con las células inmunitarias dentro del tejido del CRC. A continuación, investigamos el contexto espacial circundante de las células asociadas con el LPS bacteriano en el tejido intestinal adyacente al CRC y el tejido del CRC. Todos los tipos de células mostraron interacciones propias, lo que sugiere un agrupamiento espacial. Las células epiteliales estaban compartimentalizadas en el tejido intestinal adyacente al CRC y en el tejido del CRC y no se encontraron en proximidad espacial con otros tipos de células. En el tejido intestinal adyacente al CRC, los neutrófilos CD15+ LPS+ se encontraron en proximidad espacial con las células T CD4+ LPS+, las células dendríticas CD11c+ LPS+ y los macrófagos CD163+ LPS+ (Figura 4A). En el tejido del CRC, los neutrófilos CD15+ LPS+ también se ubicaron en estrecha proximidad con las células T CD8+ LPS+ y los macrófagos CD68+ LPS+ y CD163+ LPS+. Además, los neutrófilos LPS+ sugieren un agrupamiento espacial más fuerte en el tejido del CRC que en el tejido intestinal adyacente al CRC.

Los macrófagos CD163+ LPS+ se encontraron en proximidad espacial con las células T CD4+ LPS+ y CD8+ y con los neutrófilos CD15+ LPS+ y los macrófagos CD68+ LPS+ y CD163+ en el tejido intestinal adyacente al CRC. En contraste, no hubo proximidad espacial entre los macrófagos CD163+ LPS+ y las células T CD4+ y CD8+ LPS+ en el tejido del CRC (Figura 4B), pero sí una mayor proximidad espacial de los macrófagos CD163+ LPS+ a los neutrófilos CD15+. Sin embargo, la proximidad celular entre los neutrófilos CD15+ LPS+ y las células T CD8+ y CD4+ LPS+ se encontró con menos frecuencia en el tejido intestinal adyacente al CRC (Figura 4C, D) en comparación con el tejido del CRC (Figura 4C, E).

En general, la principal distinción de la proximidad de las células LPS+ que se encontró entre el tejido intestinal adyacente al CRC y el tejido del CRC fue la pérdida de la proximidad espacial de los macrófagos CD163+ LPS+ y las células dendríticas a las células T, mientras que, en contraste, se encontró una mayor proximidad espacial de los neutrófilos LPS+ a las células T en el tejido del CRC.

En general, observamos alteraciones en la composición de las células LPS-inmunitarias y en el contexto espacial, mientras que no se detectaron diferencias significativas en los perfiles bacterianos entre los tejidos del CRC y los tejidos intestinales adyacentes al CRC emparejados.

Discusión

Nuestro estudio proporciona evidencia de cambios en la ubicación del LPS de origen bacteriano y en las interacciones entre bacterias y células inmunitarias, desde el tejido intestinal adyacente al CRC hasta el microambiente tumoral (TME) del CRC. Utilizando histología tridimensional de tejidos de aproximadamente 5 mm³, demostramos que el LPS de origen bacteriano puede encontrarse translocado al tejido subepitelial/submucoso, tanto en el tumor como en el tejido intestinal adyacente al CRC. La abundancia regional del LPS bacteriano fue característica del tejido del CRC. Además, observamos una mayor biomasa bacteriana general por mm³ en el tejido del CRC en comparación con el tejido intestinal adyacente al CRC. Este hallazgo coincide con datos recientes en los que se detectó una mayor biomasa bacteriana en el tejido del CRC en comparación con los tejidos normales y sanos emparejados.^[27],^[32] Sin embargo, no detectamos una cantidad significativamente mayor de LPS bacteriano en el tejido del CRC en el conjunto de datos de inmunohistoquímica multiplex (IMC), lo que destaca la distribución heterogénea del LPS de origen bacteriano en los tumores. Los parches localizados de bacterias, como se observa en nuestros datos de imagen tridimensional, enfatizan la importancia del análisis de biopsias/resecciones de tejido completas para los estudios del microbioma. Por lo tanto, la histología estándar en 2D de secciones de tejido fijado en formalina y embebido en parafina (FFPE) de 5 µm de grosor podría no detectar la presencia de bacterias en las muestras tumorales a menos que se analicen múltiples secciones seriadas.

En los datos histológicos tridimensionales, observamos un alto nivel de colocalización del LPS bacteriano con las células inmunitarias. En línea con estos hallazgos, encontramos una relación significativa entre el número de células inmunitarias que se infiltran en el tejido tumoral y el número de células LPS+ en el tejido del CRC utilizando IMC. Curiosamente, el número de células epiteliales mostró una relación inversa con el número de células LPS+, lo que es consistente con hallazgos recientes que muestran que las regiones ricas en bacterias en el CRC se caracterizan por una densidad y proliferación reducidas de las células epiteliales cancerosas.^[33]

La investigación de los tipos de células inmunitarias mediante transcriptómica espacial e IMC mostró alteraciones en el número de células inmunitarias específicas en el tejido del CRC. En primer lugar, las células dendríticas CD11c+ se asocian con frecuencia con el LPS en el tejido intestinal adyacente al CRC; sin embargo, este subtipo específico de células dendríticas no se detectó dentro de las muestras tumorales, lo que podría deberse al impacto de los factores secretados por el tumor en el desarrollo y el número de este subtipo de células dendríticas dentro de los tumores.^[18] Además, observamos una menor cantidad de macrófagos CD163+ en el tejido tumoral en comparación con el tejido del colon adyacente emparejado, lo que coincide con los hallazgos de la literatura.^[22] Curiosamente, se encontraron macrófagos que expresan CD163+ en mayor número en el tejido inflamado; por ejemplo, se encontró una sobreexpresión de CD163 en áreas de inflamación activa en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), y la expresión tanto del ARN como de la proteína CD163 aumentó en la EII en comparación con los controles normales.^[23] Aquí, encontramos que en las muestras de tejido intestinal adyacente al CRC, los macrófagos CD163+ se asociaron con frecuencia con el LPS bacteriano. En línea con esta asociación con LPS+, el CD163 puede funcionar como un receptor de macrófagos para las bacterias, actuando como un inductor de la inflamación local durante la infección bacteriana.^[24]

A continuación, observamos que los neutrófilos CD15+ ya están presentes en el sitio de la barrera intestinal adyacente al CRC, un tipo de célula que no se encuentra de forma predominante en el tejido del colon en condiciones homeostáticas.^[34] De hecho, se ha descubierto que la interacción con la microbiota intestinal comensal suprime el reclutamiento de neutrófilos durante la salud intestinal.^[35] La presencia de neutrófilos en el tejido intestinal adyacente al CRC podría reflejar una integridad alterada de la barrera intestinal.^[36] Una barrera intestinal debilitada podría permitir posteriormente la translocación bacteriana a las capas subyacentes, como lo respaldan nuestros datos de histología tridimensional del tejido intestinal adyacente al CRC. En línea con esto, la proteína PVALP visualizada en nuestro conjunto de datos de imagen tridimensional también es un marcador de una barrera vascular intestinal alterada y se informó previamente que se encuentra cada vez más en el CRC y el tejido intestinal adyacente al CRC, y no se detecta en el colon sano.^[12] Además, como se observa en nuestro estudio y lo respaldan los hallazgos de la literatura, se han encontrado cada vez más neutrófilos dentro del tejido del CRC.^[32] Curiosamente, la población de neutrófilos identificada en nuestro conjunto de datos de IMC coexpresa granzima B, lo que es consistente con un estudio previo en el que se detectó este tipo de células en tumores de colon humanos y modelos de roedores.^[37] El análogo del ácido lipídico, la parte lipídica del LPS, indujo la liberación de granzima B por estos neutrófilos, lo que provocó la apoptosis de las células tumorales.^[37] Por lo tanto, la población de subtipos de células CD15+ que expresan granzima B podría representar una población de neutrófilos con actividad antitumoral, lo que sugiere un tipo N1 proinflamatorio.^[37] Si bien no medimos la actividad antitumoral funcional de los neutrófilos en este estudio, nuestros datos de transcriptómica espacial también revelaron que los genes proinflamatorios y activados asociados con los neutrófilos se regularon al alza específicamente en el tejido del CRC, lo que apoya aún más una polarización tipo N1 de los neutrófilos detectados en el microambiente del CRC.

En contraste, los neutrófilos asociados al tumor también podrían inducir el blindaje de las células inmunitarias citotóxicas de los tumores debido a su formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET).^[20],^[38] En un estudio reciente, se encontraron células CD66b+ inmaduras, que también se utilizan como marcador de neutrófilos, en regiones inmunosupresoras del CRC.^[15] Aquí, vemos una mayor asociación de los neutrófilos CD15+ con las células T CD4+ y las células T CD8+ en el tejido tumoral en comparación con el colon adyacente. Las interacciones de los neutrófilos con las células T pueden conducir tanto a la supresión y la apoptosis como a la activación.^[21],^[39-42]

Curiosamente, el agotamiento de las células dendríticas CD11c+ y los macrófagos CD163+ en el tejido del CRC, junto con una mayor presencia de neutrófilos, sugiere un cambio hacia un mecanismo alternativo de presentación de antígenos a las células T. Se ha demostrado que los neutrófilos activan las células T de memoria específicas del antígeno in vitro. Además, se ha demostrado que estos subtipos de neutrófilos inducen una potente inmunidad antitumoral en modelos murinos.^[43] Por lo tanto, además de la proximidad espacial, un análisis más detallado de los marcadores de neutrófilos y células T podría proporcionar información sobre su función y si se producen efectos inmunosupresores o proinflamatorios después de las interacciones de los neutrófilos activados y las células T en el CRC.

Coherente con nuestros hallazgos, una mayor infiltración de neutrófilos y células T CD4+ en el tejido del CRC en comparación con la mucosa sana se asoció moderadamente con la presencia de cepas bacterianas específicas, como Bacteroides fragilis y Fusobacterium nucleatum, y se relacionó más fuertemente con un aumento general de la actividad bacteriana más allá de estos patógenos principales.^[27] El análisis metagenómico de los tejidos del CRC y el colon adyacente emparejados del mismo paciente reveló que solo una especie bacteriana grampositiva era diferencialmente abundante. Por lo tanto, en lugar de que las especies bacterianas individuales impulsen el reclutamiento de células inmunitarias, la presencia general de bacterias translocadas, LPS de origen bacteriano u otros productos bacterianos puede dar forma al panorama inmunitario dentro del tejido del CRC.

En general, nuestros hallazgos contribuyen a la comprensión del microambiente tumoral (TME) heterogéneo y de las bacterias como un componente del mismo. Observamos un fenotipo inflamatorio del tejido del CRC, acompañado de una abundancia bacteriana heterogénea e interacciones de células inmunitarias en el tejido del CRC en comparación con el tejido adyacente no tumoral emparejado. Además, se identificaron cambios distintos en las poblaciones de células inmunitarias específicas y sus asociaciones con el LPS bacteriano en los tumores de CRC. Una comprensión más profunda de estas interacciones entre bacterias y células inmunitarias será esencial para comprender la patogénesis del CRC y, en última instancia, para avanzar en las estrategias terapéuticas basadas en bacterias en el CRC.