Ensayo de ADN tumoral circulante libre de tejido y resultados en pacientes en un ensayo de fase III de quimioterapia adyuvante basada en FOLFOX (Alliance N0147).

El tratamiento estándar para pacientes con cáncer de colon en estadio III es la resección quirúrgica seguida de quimioterapia adyuvante, generalmente con CAPOX o FOLFOX durante tres o seis meses.^[1] En la actualidad, solo se utilizan los datos de la estadificación TNM para tomar decisiones sobre el tratamiento adyuvante, basándose en la categorización de los tumores como de bajo (T1-3N1) o alto riesgo (T4 y/o N2) de recurrencia.^[1],^[2] La quimioterapia adyuvante se administra para reducir el riesgo de recurrencia, presumiblemente eliminando eficazmente la enfermedad residual micrometastásica después de la cirugía.^[3],^[4] Entre los pacientes en estadio III, existe una variabilidad considerable en los resultados, como se muestra en la colaboración International Duration Evaluation of Adjuvant chemotherapy (IDEA), donde la supervivencia libre de enfermedad (DFS) a los 5 años varió del 89% para los tumores T1N1a resecados al 31% para los tumores T4N2b.^[5] Estos datos de supervivencia indican que algunos pacientes tienen enfermedad residual mínima postquirúrgica (MRD), definida como ADN tumoral circulatorio detectable (ctDNA), que se ha asociado fuertemente con un mal pronóstico en el cáncer colorrectal (CRC).^[6]-^[9] La quimioterapia adyuvante reduce la tasa absoluta de recurrencia en solo un 10-15%, a pesar de su uso rutinario en los cánceres de estadio III, donde se asocia con efectos secundarios relacionados con el tratamiento significativos.^[10],^[11]

Un ensayo de MRD sin necesidad de tejido puede ofrecer una ventaja logística al evitar la carga de la obtención de tejido y acortar el tiempo de respuesta para el resultado inicial en comparación con un ensayo basado en tejido informado por el tumor.^[13],^[14] Los ensayos sin necesidad de tejido también pueden ser la única opción para los pacientes con un número limitado de muestras de tumor. Dado que faltan estudios amplios que evalúen los ensayos de ctDNA sin necesidad de tejido con un seguimiento prolongado, evaluamos el plasma postquirúrgico de un ensayo adyuvante de fase 3 en pacientes con cáncer de colon en estadio III (NCCTG N0147) utilizando dos ensayos de ctDNA sin necesidad de tejido (Guardant Reveal y Guardant 360) para determinar la importancia pronóstica de la detección de ctDNA, la fracción tumoral (TF) y las alteraciones genómicas en relación con las características clinicopatológicas y los resultados a largo plazo de los pacientes. La cuantificación de la TF del ctDNA puede servir como una medida aproximada de la carga tumoral^[12] que, junto con el MRD, puede refinar aún más la estimación del riesgo de recurrencia.

MÉTODOS

Diseño del estudio y participantes

NCCTG N0147 (Alliance) es un ensayo de fase 3 que incluyó a 3084 pacientes con cáncer de colon en estadio III, aleatorizados (1:1) para recibir FOLFOX (n=1402) solo o combinado con cetuximab (n=1350) durante 12 ciclos (6 meses).^[3] Los pacientes elegibles tenían 18 años o más, presentaban adenocarcinoma confirmado histológicamente y comenzaron la quimioterapia adyuvante dentro de las 10 semanas posteriores a la cirugía con intención curativa. Inicialmente, los pacientes se incluyeron independientemente del estado de mutación de KRAS, pero los criterios de inclusión se modificaron posteriormente cuando se informó que solo los tumores de KRAS de tipo salvaje responden al cetuximab.^[16],^[17]. Por lo tanto, hubo un tercer brazo no aleatorizado para los pacientes con tumores de KRAS mutado (n=332) que fueron tratados con FOLFOX (12 ciclos) como tratamiento estándar. El ensayo no mostró ningún beneficio para su punto final primario de DFS con la adición de cetuximab a FOLFOX.^[3] Los datos de recurrencia, el sitio de la primera recurrencia y los datos de supervivencia se recopilaron y registraron en los centros de estudio según lo exigido por el protocolo del estudio.

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. El protocolo clínico fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Mayo Clinic. El estudio (NCT00079274) se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Población del estudio para el análisis de ctDNA

El protocolo incluyó la recolección de sangre postquirúrgica para estudios correlativos, obtenida dentro de las 10 semanas posteriores a la cirugía y antes de la quimioterapia adyuvante.^[3] El plasma se aisló de la sangre y se almacenó a −80 °C en el Biobanco de Mayo. De los 3084 participantes en el ensayo N0147, 824 fueron excluidos del análisis de ctDNA postquirúrgico según los siguientes factores: no se recolectó sangre o fecha de recolección desconocida (n=726), se recolectó sangre pero se retiró antes del tratamiento del protocolo (n = 44); se obtuvo sangre después de comenzar el tratamiento (n = 15); y falla técnica del ensayo de ctDNA (n = 39). Un total de 2260 pacientes estuvieron disponibles para el análisis de ctDNA. El estado del ctDNA por brazo de estudio se muestra en la Figura 1 del Apéndice. Para el análisis de ctDNA, los datos de los brazos de estudio se combinaron ya que el punto final primario de DFS para N0147 no difería significativamente entre los brazos.

Análisis de ctDNA sin necesidad de tejido en plasma

En el ADN libre de células extraído del plasma, se realizó un ensayo epigenómico sin necesidad de tejido (Guardant Reveal™) que ha demostrado una alta sensibilidad clínica y analítica y >98% de especificidad para la predicción de recurrencia.^[18] Este ensayo no utiliza datos genómicos para la detección de ctDNA. Entre las más de 20 000 regiones metiladas diferencialmente (DMR) evaluadas, un modelo bioinformático se centra en aproximadamente 2000 DMR que están más fuertemente asociadas con el CRC. Los valores superiores a un umbral predefinido se consideran ctDNA positivo y se informan junto con una TF estimada, determinada como la relación de moléculas metiladas en las DMR en comparación con las moléculas metiladas totales en las regiones de control.

Perfil genómico de los pacientes con ctDNA positivo

Todos los casos de ctDNA positivo se evaluaron con el ensayo Guardant360 que analiza 739 genes relacionados con el cáncer, incluidos los cambios en el número de copias (CNV), las fusiones de genes, la carga de mutación tumoral (TMB) y el estado de inestabilidad de microsatélites (MSI). El ensayo detecta >95% de los variantes de un solo nucleótido (SNV) que se encuentran en muestras con ≥0,20% de TF con una especificidad de >99,99%. Para evaluar si las mutaciones somáticas estaban significativamente enriquecidas en los pacientes con recurrencia frente a los pacientes sin recurrencia, se comparó la proporción de pacientes con alteraciones no sinónimas (después de excluir las mutaciones canónicas asociadas con la hematopoyesis clonal) para cada gen en función del estado de DFS a los 3 años utilizando la prueba exacta de Fisher de dos colas, y se calculó la razón de probabilidades correspondiente. Los pacientes con < 3 años de seguimiento (n=27) fueron excluidos de la genotipificación.

Datos de biomarcadores tisulares del ensayo N0147

El estado de mutación de KRAS y BRAFV600E del tejido tumoral se analizó de forma centralizada durante el ensayo N0147 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que analizó siete mutaciones de KRAS en los codones 12 y 13, y evaluó la mutación puntual BRAFV600E.^[3],^[19] Tras la finalización del ensayo, la expresión de la proteína de reparación de errores de emparejamiento (MMR) se evaluó mediante inmunohistoquímica en todos los participantes en los que se dispuso de tejido.^[20]

Análisis estadístico

Las asociaciones entre el estado del ctDNA y las características demográficas de los pacientes, las variables clinicopatológicas y los biomarcadores se determinaron utilizando la prueba de chi-cuadrado o la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon para las variables categóricas y continuas, respectivamente. Los puntos finales del estudio se midieron desde la fecha de aleatorización hasta la primera recurrencia documentada (tiempo hasta la recurrencia, TTR), la primera recurrencia documentada o la muerte por cualquier causa (supervivencia libre de enfermedad, DFS) o hasta la fecha de muerte por cualquier causa (supervivencia global, OS). Los pacientes sin un evento se censuraron en la última visita de seguimiento. Los puntos finales de tiempo hasta el evento se estimaron mediante el método de Kaplan-Meier y se compararon utilizando la prueba de rango logarítmico. Los modelos de riesgos proporcionales de Cox se ajustaron para la edad, el sexo, el ECOG PS, el grado, el número de ganglios positivos, el estadio T, la ubicación del tumor primario, el tipo de cirugía (abierta/laparoscópica/conversión), la obstrucción o perforación intestinal, la adherencia tumoral y los biomarcadores tisulares (KRAS, BRAFV600E y MMR). Se realizaron análisis de subgrupos si el valor p de la interacción fue < 0,05. Los resultados de supervivencia según el estado del ctDNA se examinaron por brazo de tratamiento. Todos los análisis se realizaron utilizando el software SAS versión 9.4; se consideraron estadísticamente significativos los valores p de dos colas < 0,05.

Se determinaron las asociaciones entre el estado del ctDNA y las características demográficas de los pacientes, las variables clinicopatológicas y los biomarcadores mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para las variables categóricas y continuas, respectivamente. Los criterios de valoración del estudio se midieron desde la fecha de aleatorización hasta la primera recurrencia documentada (tiempo hasta la recurrencia, TTR), la primera recurrencia documentada o la muerte por cualquier causa (supervivencia libre de enfermedad, DFS) o hasta la fecha de muerte por cualquier causa (supervivencia global, OS). Los pacientes sin un evento se censuraron en la última visita de seguimiento. Los criterios de valoración del tiempo hasta el evento se estimaron mediante el método de Kaplan-Meier y se compararon utilizando la prueba de rango logarítmico. Los modelos de riesgos proporcionales de Cox se ajustaron para la edad, el sexo, el ECOG PS, el grado, el número de ganglios positivos, el estadio T, la ubicación del tumor primario, el tipo de cirugía (abierta/laparoscópica/de conversión), la obstrucción o perforación intestinal, la adherencia tumoral y los biomarcadores tisulares (KRAS, BRAFV600E y MMR). Se realizaron análisis de subgrupos si el valor p de la interacción fue < 0,05. Se examinaron los resultados de supervivencia según el estado del ctDNA por grupo de tratamiento. Todos los análisis se realizaron utilizando el software SAS v9.4; se consideraron estadísticamente significativos los valores de P bilaterales < 0,05.

RESULTADOS

Características de los pacientes y detección de ctDNA

Los 2260 pacientes con resultados de ctDNA postquirúrgicos fueron similares a la cohorte general N0147.^[3] Las muestras de plasma se recogieron a una mediana de 42 días (± 7 días) después de la cirugía y antes de la quimioterapia adyuvante [Figura 1 del Apéndice]. Se detectó ctDNA, es decir, fue positivo, en 461 (20,4%) pacientes, de los cuales 397 (89,0%) eran pMMR y 49 (11,0%) eran dMMR. La tasa de positividad del ctDNA más alta se observó en pacientes con perforación intestinal (36,8%); la más baja fue en pacientes con tumores T1-2 (9,1%) [Tabla 1, Figura 2 del Apéndice]. Las tasas de positividad del ctDNA fueron del 31,0% para los tumores T4, del 31,6% para N2, del 24,4% para el grado alto y del 25,7% para aquellos con BRAFV600E [Tabla 1]. Se observó un número medio mayor de ganglios afectados en los pacientes con ctDNA positivo en comparación con los negativos [mediana de 5,0 (1,0, 31,0) frente a 2,0 (0,0, 32,0); p < 0,0001].

La detección de ctDNA postoperatorio se asocia con peores resultados en los pacientes

En un seguimiento medio de los pacientes de 6,1 años (IC del 95%, 6,0 a 6,2 años), la positividad del ctDNA se asoció significativamente con un peor DFS a los 5 años [razón de riesgos (HR) 5,03, intervalo de confianza (IC) del 95%, 4,36-5,81, P < 0,0001], un TTR más corto (HR 5,96, IC del 95%, 5,11-6,96, P < 0,0001) y una OS (HR 4,45, IC 3,76-5,27, P < 0,0001) [Figura 1A-C]. Entre los pacientes con ctDNA positivo y negativo, las tasas de DFS a los 5 años fueron del 27,7% (IC del 95%, 23,8-32,2%) frente al 77,1% (IC del 95%, 75,1-79,1%), respectivamente; y para la OS fueron del 50,4% (IC del 95%, 45,9-55,3%) frente al 86,8% (IC del 95%, 85,2-88,4%), respectivamente. Por el análisis multivariable, la positividad del ctDNA siguió estando significativamente asociada con resultados adversos (DFS: HR ajustada 3,74, IC del 95%, 3,18-4,39, P < 0,0001), (TTR: HR ajustada 4,33, IC del 95%, 3,65-5,13, P < 0,0001), (OS: HR ajustada 3,17, IC del 95%, 2,63-3,83, P < 0,0001) [Tabla 2].

Se observó un mayor efecto perjudicial sobre el DFS entre los pacientes con ctDNA positivo y negativo para los tumores T1/2 frente a T3 frente a T4 [Figura 2A], N1 frente a N2 [Figura 2B], grupos de riesgo clínico bajos frente a altos [Figura 2C] y tumores dMMR frente a pMMR [Figura 2D]. Entre los pacientes con ctDNA positivo, aquellos con tumores dMMR frente a pMMR presentaban una OS a los 5 años marcadamente peor, del 34,6% frente al 52,6%, respectivamente (P = 0,022) [Figura 2E]. Las mujeres con tumores con ctDNA positivo presentaban un peor DFS en comparación con los hombres (P de interacción ajustada = 0,039) [Figura 3, Tabla 1 del Apéndice]. Estos hallazgos entre los subgrupos siguieron siendo estadísticamente significativos después del ajuste por múltiples covariables. Se observaron efectos de interacción significativos entre la detección de ctDNA y el estadio T, el estadio N, el grupo de riesgo clínico y el estado de MMR para el DFS, el TTR y la OS; para el estado de MMR: valores de P de interacción: 0,024, 0,002 y 0,022, respectivamente [Tabla 1 del Apéndice]. Estos efectos de interacción estadísticamente significativos (valores p: 0,0007 a 0,0236) a un nivel de significación nominal (es decir, 0,05) fueron suficientes para dirigir análisis de subgrupos adicionales. La asociación de la positividad del ctDNA con un peor DFS fue estadísticamente significativa en todos los subgrupos (todos los P < 0,0001) [Figura 3]. Con un ajuste de Bonferroni para controlar las comparaciones múltiples, todos los análisis de subgrupos siguieron siendo significativos (valores p < 0,0015).

Fracción tumoral epigenética (TF) mejora la predicción por ctDNA

Determinamos la TF epigenética como una medida cuantitativa de la enfermedad residual mínima (ERM) y su distribución en los 461 casos con ctDNA positivo, donde la TF mediana fue de 0,0011 (RIC, 0,0004, 0,0049). La TF bruta mediana fue mayor en los pacientes con dMMR frente a pMMR (0,0024 frente a 0,0010, p = 0,0085) [Figura 3 del Apéndice]. Encontramos una TF mediana casi dos veces mayor en los pacientes que presentaron recurrencia o fallecieron en comparación con aquellos que permanecieron libres de recurrencia (mediana ≈ 0,0016 frente a 0,0008; ~2 veces mayor; P = 0,0002) [Figura 4 del Apéndice]. Univariablemente, se demostró que la TF dicotomizada estratificaba significativamente a los pacientes por DFS, TTR y OS (todos los P < 0,0002) [Figura 4A-C]. Entre los pacientes con ctDNA positivo, aquellos con una TF por encima o por debajo de la mediana presentaban un TTR significativamente más corto [Figura 4C] y un peor DFS a los 5 años del 22,1% frente al 33,4% (HR 1,56, IC 1,26-1,93, p < 0,0001) [Figura 4A]. Después del ajuste por covariables, incluido el estado de MMR, KRAS y BRAFV600E, los pacientes con una TF de ctDNA por encima o por debajo de la mediana presentaban un TTR, DFS y OS significativamente peores (todos los valores p < 0,002) [Tabla 2].

Estado del ctDNA y sitio anatómico de la recurrencia tumoral

Entre los pacientes que eran ctDNA-positivos, la recurrencia se produjo con mayor frecuencia en el hígado en comparación con los pacientes ctDNA-negativos (31,9% frente a 12,9%) y fue menos frecuente en el pulmón o en los sitios locorregionales (Figura 5 del Apéndice). En contraste, los pacientes ctDNA-negativos frente a positivos que experimentaron recurrencia tenían más probabilidades de tener recurrencia locorregional, incluida la afectación peritoneal (34,6% frente a 20,3%) (Figura 5 del Apéndice). El análisis de la TF del ctDNA por sitio de recurrencia tumoral reveló que los pacientes con una TF alta tenían una mayor proporción de recurrencias en el hígado, pero menos recurrencias en el pulmón, en comparación con los pacientes con una TF baja (Figura 6 del Apéndice).

Análisis predictivo

Evaluamos el estado del ctDNA por grupo de tratamiento (FOLFOX ± cetuximab) y los resultados entre los tumores KRAS de tipo salvaje. Entre los pacientes ctDNA-negativos, el TTR, el DFS y la OS fueron similares entre los grupos [Figura 7A-C del Apéndice]. En los pacientes ctDNA-positivos, el DFS y el TTR no difirieron por grupo, pero la OS fue significativamente peor con FOLFOX + cetuximab en comparación con FOLFOX solo [Figura 7C del Apéndice]. Se observaron resultados similares cuando se limitó a los pacientes ctDNA-positivos con KRAS/BRAF de tipo salvaje, pMMR y primarios izquierdos (n = 131) [Figura 7D del Apéndice]. No se dispuso de datos de tratamiento postrecurrencia.

Impacto del genotipo plasmático en los resultados de los pacientes

Entre los pacientes ctDNA-positivos, se realizó la genotipificación utilizando el ensayo Guardant360 (739 genes) para identificar posibles factores de recurrencia o resistencia al tratamiento. De los 434 pacientes con datos completos de recurrencia a los 3 años (276 con recurrencia, 158 sin recurrencia), los genes más frecuentemente mutados, que se producen a tasas similares en ambos grupos, incluyeron TP53 (52,1%), ATM (11,8%), NF1 (10,8%), PIK3CA (9,0%) y CHEK2 (8,5%) [Tablas 2 y 3 del Apéndice]. Un oncoprint de las alteraciones del ctDNA detectadas por Guardant360 reveló una mayor prevalencia de mutaciones de BRAF y genes de respuesta al daño del ADN (ATM, CHEK2) en los casos de recurrencia, mientras que las alteraciones de TP53 y APC eran comunes en ambos grupos [Figura 8 del Apéndice]. Se identificaron mutaciones de BRAF en el 10,8% de los pacientes (7,8% BRAFV600E), y fueron más frecuentes en aquellos con recurrencia (13% frente a 7%; BRAFV600E 7,8% frente a 5,1%). Diez genes tenían más probabilidades de estar mutados en los casos de recurrencia (OR 1,6-11,3, p = 0,008-0,049) [Figura 9 del Apéndice]. Las mutaciones en los genes FLT1 (VEGFR1) y PREX2 fueron las que mejor discriminaron a los pacientes por recurrencia. FLT1 es una RTK implicada en la angiogénesis, y PREX2 está implicada en la vía Rac1/PI3K. ^[22], ^[23] Otros genes mutados que estaban significativamente enriquecidos en los pacientes con recurrencia incluyen KRAS, BARD1, CDKN2A, APC, PTPRT, KDM6A, KMT2B y BRCA2 [Figura 9 del Apéndice]. Dos genes, SRSF2 y NCR1, fueron más frecuentes en los pacientes que no presentaron recurrencia (p = 0,048).

Entre los 420 pacientes con estado de MMR tisular, las mutaciones que estaban enriquecidas en dMMR (n = 45) frente a tumores pMMR incluyeron BRAFV600E, POLE, POLD1, MLH1, MSH2 y MSH6 (p < 0,01). Las mutaciones de PALB2 fueron más frecuentes en los pacientes dMMR sin recurrencia frente a los que sí la presentaron [30,8% (4/13) frente a 3,1% (1/32); OR = 0,07, p = 0,019]. También se asociaron otros genes con el estado dMMR, aunque esto puede reflejar la mayor carga mutacional y de fondo en estos tumores.

Determinamos el TF epigenético como una medida cuantitativa de la EMR y su distribución en los 461 casos positivos de ctDNA, donde la mediana de TF fue de 0,0011 (ICR, 0,0004, 0,0049). La mediana del TF bruto fue mayor en pacientes dMMR en comparación con pacientes pMMR (0,0024 vs. 0,0010, p= 0,0085) [Figura 3 del Apéndice]. Encontramos que la mediana de TF fue casi el doble de alta en pacientes que presentaron recurrencia o fallecieron en comparación con aquellos que permanecieron libres de recurrencia (mediana ≈ 0,0016 vs. 0,0008; ~2 veces mayor; P = 0,0002) [Figura 4 del Apéndice]. Univariadamente, se demostró que el TF dicotómico estratificó significativamente a los pacientes por DFS, TTR y OS (todos P