Las células madre cancerosas (CSCs) favorecen la progresión del cáncer colorrectal y la resistencia a la terapia, pero los reguladores del equilibrio redox que mantienen la identidad de las CSC no están completamente definidos. Investigamos el papel de la peroxiredoxina 5 (PRX5) en la formación de CSC y la tumorigénesis utilizando modelos de cáncer colorrectal HCT116. Las CSC se enriquecieron mediante cultivo de esferoides en medio libre de suero y se caracterizaron mediante qPCR y western blot para evaluar la pluripotencia y los marcadores de superficie. La expresión de PRX5 se reguló mediante la interrupción génica con siRNA o shRNA y la sobreexpresión.
El ROS intracelular se midió con tinción de DCF-DA. La activación de STAT3 se analizó mediante inmunoblot de p-STAT3. Los ensayos funcionales incluyeron la formación de esferoides, el análisis de dilución límite extrema (ELDA), la formación de colonias y la tumorigénesis in vivo en xenoinjertos en ratones BALB/c-nu. La inducción de esferoides aumentó selectivamente la expresión de PRX5 entre los isoformas de PRX.
Una reducción eficiente de PRX5 (>95%) redujo la expresión de OCT4, SOX2, NANOG y CD133, aumentó el ROS intracelular, disminuyó los niveles de p-STAT3 y redujo la frecuencia de formación de esferoides. Por el contrario, la sobreexpresión de PRX5 mejoró la expresión de los marcadores de pluripotencia y la proliferación. In vivo, los xenoinjertos con sobreexpresión de PRX5 crecieron más rápido, alcanzando un volumen tumoral 2,5 veces mayor al día 19 y un peso tumoral medio 1,82 veces mayor en comparación con los controles. Los tejidos tumorales mostraron niveles elevados de OCT4, SOX2, NANOG, CD133 y EPCAM.
PRX5 contribuye a mantener un entorno redox asociado con la activación de STAT3 y los programas centrales de pluripotencia en el CRC, promoviendo los fenotipos de CSC y la tumorigénesis. El tratamiento dirigido a la señalización redox mediada por PRX5 puede ser objeto de una mayor investigación como un posible enfoque para interrumpir el mantenimiento de las CSC y superar la quimiorresistencia.
El cáncer colorrectal (CCR) es un desafío de salud mundial y una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer [[1]]. Si bien los avances en la detección temprana y las terapias multimodales (que incluyen la resección quirúrgica, la quimioterapia y los agentes dirigidos) han mejorado la respuesta inicial del paciente, las altas tasas de recurrencia tumoral, metástasis a distancia y resistencia terapéutica intrínseca a menudo conducen al fracaso del tratamiento [[2],[3]]. Este preocupante resultado clínico se atribuye a la persistencia de una pequeña subpoblación de células madre cancerosas (CMCs) altamente agresivas [[4]]. La notable capacidad de estas últimas para la autorrenovación, la diferenciación en la masa tumoral heterogénea y el extraordinario potencial de iniciación tumoral les permite impulsar la progresión tumoral y la evasión terapéutica [[4],[5]]. La línea celular de CCR humano HCT116 es un modelo in vitro bien establecido para estudiar los intrincados mecanismos moleculares que subyacen a la generación y proliferación de este crucial fenotipo de CMC [[6],[7]].
La identidad central de las CMCs se mantiene transcripcionalmente mediante una red altamente regulada de factores de pluripotencia, OCT4, SOX2, NANOG y c-MYC [[8],[9]]. La expresión sinérgica y amplificada de estos factores de transcripción hace que las células colorrectales degeneren en un estado troncal primitivo, indiferenciado y agresivo, lo que confiere las características biológicas clave de la troncalidad del cáncer. Además, el fenotipo funcional de la CMC se puede identificar mediante la expresión de marcadores específicos de la superficie celular, como EPCAM, CD24, CD44 y CD133, que se pueden utilizar para lograr el aislamiento físico y la explotación pronóstica de estas células [[10–12]]. La coexpresión y la regulación dinámica de estos factores de transcripción y marcadores de superficie de la troncalidad del cáncer indican la inducción del estado de CMC, un proceso que es necesario para navegar y sobrevivir en microambientes desafiantes.
Las CMCs deben mantener la viabilidad y la funcionalidad durante la actividad metabólica aumentada y el estrés oxidativo resultante que se encuentra en el microambiente tumoral [[13]]. Las células de CMC pueden aumentar la expresión de robustos sistemas de defensa antioxidantes para reducir el efecto del estrés oxidativo y preservar el delicado equilibrio necesario para la autorrenovación [[14],[15]]. Un estudio reciente ha destacado aún más que las CMCs dependen de programas antioxidantes coordinados y redes de señalización sensibles al redox para mantener la autorrenovación, la plasticidad fenotípica, la resistencia terapéutica y el potencial de iniciación tumoral bajo estrés oxidativo [[16]]. Central para esta defensa está la familia de peroxiredoxinas (PRX) de enzimas, un grupo de peroxidasa tiol-específicas altamente conservadas que comprende seis isoformas distintas (PRX1-6) [[14],[17]]. Estas enzimas funcionan en varios compartimentos celulares para regular la homeostasis redox celular mediante la eliminación y reducción efectivas de los peróxidos. En particular, las CMCs requieren un nivel específico bajo a moderado de especies reactivas de oxígeno (ROS) para una autorrenovación y proliferación óptimas, ya que los niveles excesivos de ROS pueden desencadenar la diferenciación o la apoptosis [[18–20]]. Por lo tanto, la regulación de este equilibrio fino de ROS es primordial para la supervivencia de las CMCs, siendo la PRX5 (localizada principalmente en las mitocondrias y los peroxisomas) particularmente importante [[21–24]]. Dada su función crucial en la regulación de los ROS dentro de los orgánulos clave involucrados en la reprogramación metabólica, hipotetizamos que la PRX5 podría proporcionar un papel específico y no redundante para facilitar la supervivencia y el mantenimiento del estado troncal maligno.
A pesar del papel conocido de los sistemas antioxidantes en la progresión del cáncer, la función reguladora específica de las isoformas individuales de PRX, en particular la PRX5, en el contexto de la troncalidad del CCR y la tumorigenicidad sigue siendo en gran medida desconocida. Por lo tanto, este estudio fue diseñado para determinar los roles funcionales y mecánicos de la PRX5 en la regulación del fenotipo de CMC en las células HCT116. Primero, empleamos un método de cultivo de esferoides bien validado para inducir y enriquecer con éxito una población de células de CMC y validamos el modelo mediante la regulación al alza transcripcional y proteómica de los factores y marcadores de troncalidad centrales. A continuación, mediante un análisis comparativo de la expresión de los miembros de la familia PRX, identificamos la PRX5 como la isoforma predominantemente regulada al alza durante la inducción de CMC. En particular, utilizamos tanto el silenciamiento mediado por ARN de horquilla corta (shRNA) como la sobreexpresión estable de PRX5 para descubrir la relación causal entre la PRX5 y el fenotipo maligno de CMC y evaluar su impacto en la expresión de los marcadores de troncalidad centrales y la capacidad proliferativa. Finalmente, proporcionamos una validación traslacional mediante el uso de un modelo de xenoinjerto murino in vivo para evaluar directamente el efecto de la sobreexpresión de PRX5 en el crecimiento tumoral, estableciendo así la PRX5 como un impulsor crítico de la progresión del CCR. En conjunto, este trabajo proporciona evidencia de los cambios morfológicos, la expresión genética y proteica, y la funcionalidad in vivo de la PRX5 para descubrir su papel como un componente regulador que sustenta el programa transcripcional que subyace a la identidad de la CMC y promueve la tumorigenicidad en el CCR.
Métodos
Reactivos
El factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF) y el factor de crecimiento básico de fibroblastos humano recombinante (bFGF) se obtuvieron de PeproTech (Cranbury, NJ, EE. UU.). El suplemento B-27 se compró a Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). La insulina, la N-acetil-L-cisteína (NAC) y el inhibidor de STAT3 III, WP1066, se compraron a Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Se proporciona información detallada sobre los reactivos utilizados en este estudio, incluidos los nombres de los proveedores y los números de catálogo, en la Tabla S2.
Cultivo celular y formación de esferoides
Las células de cáncer de colon humano HCT116 se compraron a la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.). Las células se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado (DMEM) (Welgene, Daegu, Corea) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB; Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (Welgene) a 37 °C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO2. Para la formación de esferoides, las células HCT116 se desprendieron con 1 x Trypsin-EDTA (Welgene) para preparar una suspensión de células individuales, que se sembró en placas de 96 pocillos de ultra baja adherencia a una densidad de 1 × 103 células/pocillo. Los esferoides se mantuvieron hasta 12 días en medio DMEM/F-12 suplementado con 20 ng/mL de EGF, 10 ng/mL de bFGF, 5 μg/mL de insulina y 1x de suplemento B-27 (Thermo Fisher Scientific). El medio de cultivo se reemplazó cuidadosamente cada 3 días para minimizar las alteraciones en la integridad de los esferoides. Para los experimentos de modulación funcional, las células se trataron con NAC (1 mM) o WP1066 (10 μM). Los tratamientos se iniciaron en el momento de la siembra y se reaplicaron en cada cambio de medio. La formación de esferoides se monitoreó utilizando un lector de imágenes multimodo Cytation 5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.).
Construcción de plásmidos y generación de lentivirus
El gen PRX5 se amplificó mediante PCR utilizando la ADN polimerasa PrimeSTAR® GXL (Takara Bio Inc., Shiga, Japón). Los fragmentos de PRX5 amplificados se insertaron en pLenti6.3/V5-DEST utilizando los sitios de restricción EcoRV y un kit de clonación In-Fusion® Snap Assembly (Takara Bio Inc.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para generar un constructo con una etiqueta V5 en el extremo C-terminal (pLenti6.3-PRX5). Las células HEK293FT se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 70-80% y se transfectaron con pLenti6.3-PRX5, el vector de empaquetamiento psPAX2 y el vector de envoltura pMD.2G utilizando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen, Hilden, Alemania). Después de 12 horas, el medio se reemplazó con medio completo fresco. Los sobrenadantes que contienen lentivirus se recolectaron 24-48 horas después y se filtraron a través de un filtro de jeringa Minisart de 0,45 μm (Sartorius, Gottingen, Alemania). Para lograr un alto título viral, el medio que contiene lentivirus se concentró y purificó utilizando una unidad de filtración centrífuga Amicon® Ultra-15 (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.).
Líneas celulares estables
Para generar líneas celulares HCT116 que expresan PRX5 (línea celular HCT116-PRX5) y líneas celulares HCT116 con PRX5 silenciado (HCT116-PRX5 shRNA), el lentivirus construido respectivo se utilizó para infectar las células HCT116 en presencia de 8 μg/mL de polibreno. Después de 48 horas de incubación, las células HCT116-PRX5 se seleccionaron utilizando 8 μg/mL de blasticidina (Sigma–Aldrich) durante 1 semana, mientras que las células HCT116-PRX5 shRNA se seleccionaron utilizando 1 μg/mL de puromicina (Sigma–Aldrich) durante 1 semana.
Interferencia de ARN
El silenciamiento mediado por siRNA se realizó utilizando un siRNA AccuTarget™ prediseñado (Bioneer, Daejeon, Corea) específico para PRX5. Para ello, las células HCT116 se transfectaron con siPRX5 o un siRNA de control negativo (siCtrl) utilizando Lipofectamine™ RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuencia objetivo para el siRNA de PRX5 fue 5'-CAUCUUUGGGAAUCGACGU-3'.
Análisis de Western blot
Se extrajeron proteínas totales de lisados de células y tejidos utilizando la solución de extracción de proteínas PRO-PREP (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Corea). Para las muestras de tejido tumoral, los lisados se complementaron aún más con 1× cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas Halt (Thermo Fisher Scientific). Los lisados de proteínas se aclararon mediante centrifugación a 16.000 × g y se cuantificaron utilizando el ensayo de Bradford (Bio-Rad, CA, EE. UU.) con un lector de placas Synergy H1 (Agilent Technologies). Se separaron muestras que contenían cantidades iguales de proteína (10-30 μg) mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en geles de SDS del 8-15% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Pall Corporation, Pensacola, FL, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% (BD Biosciences, CA, EE. UU.) y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: GAPDH (Santa Cruz Biotech., 1:20.000), OCT4 (Cell Signaling Technology; CST, 1:1.000), NANOG (CST, 1:1.000), SOX2 (CST, 1:1.000), EPCAM (CST, 1:1.000), CD133 (CST, 1:1.000), PRX1 (AbFrontier, 1:1.000), PRX2 (ProteinTech, 1:1.000), PRX3 (AbFrontier, 1:1.000), PRX4 (AbFrontier, 1:1.000), PRX5 (AbFrontier, 1:1.000), PRX6 (AbFrontier, 1:1.000) y etiqueta V-5 (Enogene, 1:1.000). Las membranas se lavaron cinco veces con 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) que contiene 150 mM de NaCl y 0,1% de Tween-20 (TBST) y luego se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) de cabra anti-conejo y anti-ratón (Thermo Fisher Scientific). Posteriormente, las membranas se lavaron seis veces con TBST para eliminar los anticuerpos secundarios que se unieron de forma no específica. Las bandas inmunorreactivas se detectaron utilizando NICSRO-WEST ECL PICO (BIONICS, Seúl, Corea) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y las intensidades de las bandas se analizaron utilizando el sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Las especificaciones de todos los anticuerpos, como sus proveedores y números de catálogo, se resumen en la Tabla S2.
PCR cuantitativa (qPCR)
Se extrajo el ARN total de los tejidos tumorales y las células utilizando un kit Ribospin™ II (GeneAll, Seúl, Corea). El ARN se convirtió en ADNc utilizando la transcriptasa inversa Rocketscript™ (Bioneer). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en una placa de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific) utilizando la mezcla maestra TB green (Takara Bio Inc.). La lista de cebadores utilizados se proporciona en la Tabla S1.
Ensayo de formación de colonias
Para los ensayos de formación de colonias, las células HCT116 y HCT116-PRX5 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10² células por pocillo en DMEM suplementado con 10% de SFB. Después de una incubación de 12 días, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se fijaron y se tiñeron simultáneamente con una solución mixta que contiene 6% de glutaraldehído y 0,5% de cristal violeta (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos. Se adquirieron imágenes y se analizaron utilizando un lector de imágenes multimodo Cytation 5 (Agilent Technologies) equipado con el software Gen5, que cuantificó automáticamente las colonias de más de 300 μm de diámetro.
Cuidado de animales y xenoinjerto
SPANISH TRANSLATION:
Adquirimos y utilizamos ratones nudosos (BALB/c-nu) machos de 5 semanas de edad (JA Bio, Suwon, Corea). Los ratones se alojaron a 23 °C en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas nacionales, tras la aprobación del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional de Kyungpook. Se estableció un modelo de xenoinjerto bilateral en la región lateral después de que los ratones alcanzaran las 6 semanas de edad. Para ello, las células HCT116 y HCT116-PRX5 (5 × 10⁶ células en 100 μL) se resuspendieron en Matrigel (354248, Corning, EE. UU.) diluido 1:2 en solución salina tamponada con fosfato fría y se inyectaron subcutáneamente en los flancos izquierdo y derecho, respectivamente, utilizando una jeringa de calibre 31 (n = 5). La preparación celular y la inyección se llevaron a cabo de forma aleatorizada por diferentes investigadores. No se aplicó aleatorización a nivel de los animales, ya que cada ratón sirvió como su propio control en un diseño emparejado de flanco izquierdo-derecho. En el día 4, los experimentos continuaron solo en los ratones en los que los tumores en ambos lados se habían establecido con éxito (n = 4). El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron cada 3 días, y el volumen tumoral se calculó utilizando la siguiente fórmula:
De acuerdo con el protocolo animal aprobado, la carga tumoral no superó el 5% del peso corporal del animal huésped, y el experimento se finalizó en el día 19. Después de la finalización, los ratones fueron sacrificados por un investigador capacitado mediante dislocación cervical bajo 2,2,2-tribromoetanol (Avertin; Sigma-Aldrich), y luego se recolectaron y analizaron las masas tumorales.
Inmunohistoquímica
Los tejidos tumorales recolectados de cada grupo de animales se fijaron en un 4% de paraformaldehído, se incluyeron utilizando un compuesto Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek, Torrance, CA, EE. UU.), se cortaron en secciones de 12 μm de espesor y se sometieron a inmunohistoquímica. Brevemente, las secciones de tejido se incubaron primero con una solución de bloqueo (suero de cabra normal (10%); Thermo Fisher Scientific) seguida de la incubación con los anticuerpos anti-CD133 y anti-PRX5 a 4 °C. Posteriormente, las secciones de tejido se marcaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, OR, EE. UU.) durante 1 hora y se observaron bajo un microscopio confocal LSM-800 (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
Ensayo de dilución límite extrema (ELDA)
El ensayo de dilución límite extrema (ELDA) se realizó basándose en una publicación previa [[25]]. Las células HCT116 se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en U de ultra baja adherencia a diferentes dosis (1000, 100, 10 y 1), y se midió la formación de esferoides bajo un microscopio. Los resultados de la formación de esferoides se calcularon utilizando el software de análisis de dilución límite extrema [[26]].
Imagen de esferoides, medición de ROS y análisis morfométrico
Los esferoides se mantuvieron en placas de 96 pocillos con fondo en U de ultra baja adherencia durante 12 días (n = 10). Para la medición de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares y el análisis morfométrico, los esferoides se incubaron con 5 μM de CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific) y 1 μg/ml de Hoechst 33242 (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos a 37 °C, seguido de tres lavados con PBS. Los esferoides teñidos se visualizaron mediante adquisición de imágenes en z-stack utilizando un sistema de imagen de alto contenido Operetta CLS (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.), que incluye imágenes de campo claro. Las imágenes en z-stack adquiridas se procesaron y se fusionaron en una sola imagen de proyección utilizando el software Harmony (PerkinElmer), y se cuantificó la intensidad media de fluorescencia para el análisis. Además, la circularidad de los esferoides se analizó utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.), y la circularidad se calculó utilizando la fórmula Circularidad = 4π × (Área/Perímetro²).
Análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM) de tres o más experimentos independientes. Las diferencias estadísticamente significativas se determinaron utilizando pruebas t de Student de dos colas no emparejadas, análisis de varianza (ANOVA) de una vía o ANOVA de dos vías utilizando el software GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Después de ANOVA de una o dos vías, se realizaron pruebas post hoc de Tukey para las comparaciones intergrupales. Los resultados con p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los asteriscos indican los valores de p calculados de la siguiente manera: *: p < 0,05; : p < 0,01; *: p < 0,001.
Reactivos
El factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF) y el factor de crecimiento básico de fibroblastos humano recombinante (bFGF) se obtuvieron de PeproTech (Cranbury, NJ, EE. UU.). El suplemento B-27 se compró a Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). La insulina, la N-acetil-L-cisteína (NAC) y el inhibidor de STAT3 III, WP1066, se compraron a Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Se proporciona información detallada sobre los reactivos utilizados en este estudio, incluidos los nombres de los proveedores y los números de catálogo, en la Tabla S2.
Cultivo celular y formación de esferoides
Las células de cáncer de colon humano HCT116 se compraron a la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.). Las células se mantuvieron en medio Dulbecco modificado Eagle (DMEM) (Welgene, Daegu, Corea) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS; Thermo Fisher Scientific), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (Welgene) a 37 °C en una incubadora humidificada que contiene un 5% de CO2. Para la formación de esferoides, las células HCT116 se desprendieron con 1 x Trypsin-EDTA (Welgene) para preparar una suspensión de células individuales, que se sembró en placas de 96 pocillos con fondo en U de ultra baja adherencia a una densidad de 1 × 10³ células/pocillo. Los esferoides se mantuvieron hasta 12 días en medio DMEM/F-12 suplementado con 20 ng/mL de EGF, 10 ng/mL de bFGF, 5 μg/mL de insulina y 1x de suplemento B-27 (Thermo Fisher Scientific). El medio de cultivo se reemplazó cuidadosamente cada 3 días para minimizar las alteraciones en la integridad de los esferoides. Para los experimentos de modulación funcional, las células se trataron con NAC (1 mM) o WP1066 (10 μM). Los tratamientos se iniciaron en el momento de la siembra y se reaplicaron en cada cambio de medio. La formación de esferoides se controló utilizando un lector de imágenes de múltiples modos Cytation 5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.).
Construcción de plásmidos y generación de lentivirus
El gen PRX5 se amplificó mediante PCR utilizando la ADN polimerasa PrimeSTAR® GXL (Takara Bio Inc., Shiga, Japón). Los fragmentos de PRX5 amplificados se insertaron en pLenti6.3/V5-DEST utilizando los sitios de restricción EcoRV y un kit de clonación In-Fusion® Snap Assembly (Takara Bio Inc.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para generar un constructo con una etiqueta V5 en el extremo C-terminal (pLenti6.3-PRX5). Las células HEK293FT se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 70-80% y se transfectaron con pLenti6.3-PRX5, el vector de empaquetamiento psPAX2 y el vector de envoltura pMD.2G utilizando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen, Hilden, Alemania). Después de 12 horas, el medio se reemplazó con medio completo fresco. Los sobrenadantes que contenían lentivirus se recolectaron 24-48 horas después y se filtraron a través de un filtro de jeringa Minisart de 0,45 μm (Sartorius, Gottingen, Alemania). Para lograr un alto título viral, el medio que contenía lentivirus se concentró y purificó utilizando una unidad de filtración centrífuga Amicon® Ultra-15 (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.).
Líneas celulares estables
Para generar líneas celulares HCT116 que expresan PRX5 de forma estable (HCT116-PRX5) y líneas celulares HCT116 con PRX5 silenciado (HCT116-PRX5 shRNA), el lentivirus construido respectivo se utilizó para infectar las células HCT116 en presencia de 8 μg/mL de polibreno. Después de 48 horas de incubación, las células HCT116-PRX5 se seleccionaron utilizando 8 μg/mL de blasticidina (Sigma–Aldrich) durante 1 semana, mientras que las células HCT116-PRX5 shRNA se seleccionaron utilizando 1 μg/mL de puromicina (Sigma–Aldrich) durante 1 semana.
Interferencia de ARN
La inhibición mediada por siRNA se realizó utilizando un siRNA AccuTarget™ prediseñado (Bioneer, Daejeon, Corea) específico para PRX5. Para ello, las células HCT116 se transfectaron con siPRX5 o un siRNA de control negativo (siCtrl) utilizando Lipofectamine™ RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuencia objetivo para el siRNA de PRX5 fue 5'-CAUCUUUGGGAAUCGACGU-3'.
Análisis de Western blot
Se extrajo proteína total de lisados de células y tejidos tumorales utilizando la solución de extracción de proteínas PRO-PREP (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Corea). Para las muestras de tejido tumoral, los lisados se complementaron con 1× cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas Halt (Thermo Fisher Scientific). Los lisados de proteínas se aclararon mediante centrifugación a 16.000 × g y se cuantificaron utilizando el ensayo de Bradford (Bio-Rad, CA, EE. UU.) con un lector de placas Synergy H1 (Agilent Technologies). Se separaron muestras que contenían cantidades iguales de proteína (10-30 μg) mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en geles de SDS del 8-15% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Pall Corporation, Pensacola, FL, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada (BD Biosciences, CA, EE. UU.) y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: GAPDH (Santa Cruz Biotech., 1:20.000), OCT4 (Cell Signaling Technology; CST, 1:1.000), NANOG (CST, 1:1.000), SOX2 (CST, 1:1.000), EPCAM (CST, 1:1.000), CD133 (CST, 1:1.000), PRX1 (AbFrontier, 1:1.000), PRX2 (ProteinTech, 1:1.1000), PRX3 (AbFrontier, 1:1.000), PRX4 (AbFrontier, 1:1.000), PRX5 (AbFrontier, 1:1.000), PRX6 (AbFrontier, 1:1.000) y etiqueta V-5 (Enogene, 1:1.000). Las membranas se lavaron cinco veces con 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) que contiene 150 mM de NaCl y 0,1% de Tween-20 (TBST) y luego se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) de cabra anti-conejo y anti-ratón (Thermo Fisher Scientific). Posteriormente, las membranas se lavaron seis veces con TBST para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos de forma específica. Las bandas inmunorreactivas se detectaron utilizando NICSRO-WEST ECL PICO (BIONICS, Seúl, Corea) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se analizaron las intensidades de las bandas utilizando el sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Las especificaciones de todos los anticuerpos, como sus proveedores y números de catálogo, se resumen en la Tabla S2.
PCR cuantitativa (qPCR)
Se extrajo el ARN total de los tejidos tumorales y las células utilizando un kit Ribospin™ II (GeneAll, Seúl, Corea). El ARN se convirtió en ADNc utilizando la transcriptasa inversa Rocketscript™ (Bioneer). Las reacciones de PCR se realizaron en una placa de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific) utilizando la mezcla maestra TB green (Takara Bio Inc.). La lista de los cebadores utilizados se proporciona en la Tabla S1.
Ensayo de formación de colonias
Para los ensayos de formación de colonias, las células HCT116 y HCT116-PRX5 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10² células por pocillo en DMEM suplementado con un 10% de FBS. Después de una incubación de 12 días, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se fijaron y se tiñeron simultáneamente con una solución mixta que contiene un 6% de glutaraldehído y un 0,5% de cristal violeta (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos. Se adquirieron imágenes y se analizaron utilizando un lector de imágenes de múltiples modos Cytation 5 (Agilent Technologies) equipado con el software Gen5, que cuantificó automáticamente las colonias de más de 300 μm de diámetro.
Cuidado de los animales y xenoinjerto
Adquirimos y utilizamos ratones nudosos (BALB/c-nu) de 5 semanas de edad (JA Bio, Suwon, Corea). Los ratones se alojaron a 23 °C en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas nacionales, tras la aprobación del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional de Kyungpook. Se estableció un modelo de xenoinjerto bilateral en la región lateral después de que los ratones alcanzaran las 6 semanas de edad. Para ello, las células HCT116 y HCT116-PRX5 (5 × 10⁶ células en 100 μL) se resuspendieron en Matrigel (354248, Corning, EE. UU.) diluido 1:2 en solución salina tamponada con fosfato fría y se inyectaron subcutáneamente en los flancos izquierdo y derecho, respectivamente, utilizando una jeringa de calibre 31 (n = 5). La preparación celular y la inyección se llevaron a cabo de forma aleatorizada por diferentes investigadores. No se aplicó aleatorización a nivel de los animales, ya que cada ratón sirvió como su propio control en un diseño emparejado de flanco izquierdo y derecho. En el día 4, los experimentos continuaron solo en los ratones en los que los tumores en ambos lados se habían establecido con éxito (n = 4). El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron cada 3 días, y el volumen tumoral se calculó utilizando la siguiente fórmula:
De acuerdo con el protocolo animal aprobado, la carga tumoral no superó el 5% del peso corporal del animal huésped, y el experimento se finalizó en el día 19. Después de la finalización, los ratones fueron sacrificados por un investigador capacitado mediante dislocación cervical bajo 2,2,2-tribromoetanol (Avertin; Sigma-Aldrich), y luego se recolectaron y analizaron las masas tumorales.
Inmunohistoquímica
Los tejidos tumorales recolectados de cada grupo de animales se fijaron en un 4% de paraformaldehído, se incluyeron utilizando un compuesto Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek, Torrance, CA, EE. UU.), se cortaron en secciones de 12 μm de espesor y se sometieron a inmunohistoquímica. Brevemente, las secciones de tejido se incubaron primero con una solución de bloqueo (suero de cabra normal (10%); Thermo Fisher Scientific) seguida de la incubación con anticuerpos anti-CD133 y anti-PRX5 a 4 °C. Posteriormente, las secciones de tejido se marcaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, OR, EE. UU.) durante 1 hora y se observaron bajo un microscopio confocal LSM-800 (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
Ensayo de dilución límite extrema (ELDA)
El ensayo de dilución límite extrema (ELDA) se realizó basándose en una publicación previa [[25]]. Las células HCT116 se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en U de ultra baja adherencia a diferentes dosis (1000, 100, 10 y 1), y se midió la formación de esferoides bajo un microscopio. Los resultados de la formación de esferoides se calcularon utilizando el software de análisis de dilución límite extrema [[26]].
Imagen de esferoides, medición de ROS y análisis morfométrico
Los esferoides se mantuvieron en placas de 96 pocillos con fondo en U de ultra baja adherencia durante 12 días (n = 10). Para la medición de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares y el análisis morfométrico, los esferoides se incubaron con 5 μM de CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific) y 1 μg/ml de Hoechst 33242 (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos a 37 °C, seguido de tres lavados con PBS. Los esferoides teñidos se visualizaron mediante adquisición de imágenes en z-stack utilizando un sistema de imagen de alto contenido Operetta CLS (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.), incluido el análisis de imagen de campo claro. Las imágenes en z-stack adquiridas se procesaron y se fusionaron en una sola imagen de proyección utilizando el software Harmony (PerkinElmer), y se cuantificó la intensidad media de fluorescencia para el análisis. Además, la circularidad de los esferoides se analizó utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD, EE. UU.), y la circularidad se calculó utilizando la fórmula Circularidad = 4π × (Área/Perímetro²).
Análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM) de tres o más experimentos independientes. Las diferencias estadísticamente significativas se determinaron utilizando pruebas t de Student de dos colas no emparejadas, análisis de varianza (ANOVA) de una vía o ANOVA de dos vías utilizando el software GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Después de ANOVA de una o dos vías, se realizaron pruebas post hoc de Tukey para las comparaciones intergrupales. Los resultados con p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los asteriscos indican los valores de p calculados de la siguiente manera: *: p < 0,05; : p < 0,01; *: p < 0,001.
Resultados
Inducción y caracterización de una subpoblación de CSC de células HCT116
Para investigar la adquisición de propiedades similares a las de las CSC en las células HCT116 de CRC, empleamos un método de cultivo basado en esferoides bien establecido. Este enfoque enriquece selectivamente las células con características similares a las de las células madre explotando su capacidad para sobrevivir y proliferar en condiciones de sustrato independiente y libres de suero. Como se ilustra en el esquema experimental de la Figura 1A, las células HCT116 parentales se cultivaron en un medio especializado libre de suero suplementado con EGF y bFGF, que son críticos para el mantenimiento y la proliferación de las CSC. Al emplear las condiciones de cultivo especializadas, observamos la formación de agregados de CSC tridimensionales no adherentes (denominados esferoides) dentro de la población de células HCT116 (Figura S1). Este enriquecimiento selectivo resultó en una subpoblación distinta capaz de una proliferación sostenida sin adherencia al sustrato, una característica morfológica distinta del crecimiento adherente típico de las células HCT116.
Para validar la similitud con las células madre de las células formadoras de esferoides enriquecidas, primero realizamos qPCR para medir la expresión de ARNm de los factores de transcripción de pluripotencia centrales OCT4, SOX2, NANOG y C-MYC. Estos genes son reguladores maestros de la pluripotencia que se sabe que están regulados al alza en las CSC, manteniendo así su capacidad de autorrenovación. Los niveles de expresión de los cuatro genes se regularon significativamente al alza en los cultivos de esferoides de 12 días en comparación con las células parentales adheridas (día 0), más de 5 veces para OCT4, 4,1 veces para SOX2, 1,7 veces para NANOG y 3,1 veces para C-MYC (Figura 1B). Este aumento significativo proporciona evidencia molecular de que se indujo una reprogramación transcripcional profunda hacia un estado indiferenciado primitivo en el cultivo de esferoides.
Se realizó una validación adicional de la población de CSC enriquecida cuantificando la expresión de ARNm de cuatro marcadores de superficie de CSC bien conocidos que se utilizan comúnmente para identificar y aislar las CSC en varios tipos de cáncer: EPCAM, CD24, CD44 y CD133. Después de 12 días de cultivo de los esferoides, estos marcadores se regularon significativamente al alza, con sus niveles de ARNm aumentando en 1,8 veces para EPCAM, 2,3 veces para CD24, 1,4 veces para CD44 y 1,4 veces para CD133 (Figura 1C). Tenga en cuenta que los aumentos en la expresión de estos marcadores de superficie son más modestos que los de los factores de transcripción centrales (Figura 1C). Esta diferencia se debe probablemente a los distintos papeles de estos conjuntos de genes: si bien OCT4, SOX2, NANOG y C-MYC orquestan el programa de similitud con las células madre a nivel genético, la expresión de los marcadores de superficie es una consecuencia posterior de esta reprogramación y refleja cambios en las interacciones célula a célula y las propiedades funcionales que pueden retrasar la manifestación.
No obstante, la regulación al alza de los marcadores CD24, CD44 y CD133 asociados con la tumorigenicidad y la resistencia a la terapia proporciona evidencia importante de que se enriqueció con éxito una subpoblación de CSC significativa. Además, confirmamos que las características de similitud con las células madre observadas a nivel de ARNm eran consistentes a nivel de proteínas. Los niveles de expresión de proteínas de OCT4, SOX2, NANOG y EPCAM fueron notablemente más altos en las células HCT116 después de 6 y 12 días de inducción de CSC en comparación con el día 0 (Figura 1D y E). La correlación entre la regulación al alza de los niveles de expresión de ARNm y proteínas valida que los cambios a nivel de transcripción se tradujeron con éxito en proteínas funcionales, apoyando así nuestros hallazgos. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de que nuestro método de cultivo de esferoides indujo eficazmente una subpoblación de CSC de células HCT116, lo que se validó mediante el análisis de los factores de similitud con las células madre centrales y la expresión de los marcadores de superficie de las CSC.
PRX5 es un antioxidante clave regulado al alza en las CSC de HCT116
Para determinar los mecanismos moleculares que subyacen a la adquisición de propiedades similares a las de las CSC, nos centramos en la expresión de la familia de proteínas antioxidantes PRX, que se sabe que son críticas para mantener la homeostasis redox celular. Comenzamos examinando el nivel de expresión de ARNm de PRX5 en las células HCT116 durante su diferenciación en el estado similar a las CSC, que se reguló al alza en aproximadamente 1,7 veces durante el período de inducción de 12 días en comparación con el día 0 (Figura 2A). Este hallazgo sugiere un posible vínculo entre PRX5 y el fenotipo de las CSC.
A continuación, ampliamos nuestra investigación a los niveles de expresión de proteínas de toda la familia PRX. Si bien los niveles de expresión de PRX1-6 mostraron ligeros aumentos durante el proceso de diferenciación de las CSC, la regulación al alza de PRX5 fue notablemente más pronunciada (Figura 2B). Este patrón de expresión diferencial destaca una regulación al alza preferencial de PRX5, lo que sugiere un posible papel en las CSC de HCT116 (Figura 2B y C). A diferencia de otros miembros de la familia PRX que se expresan más ampliamente en varios compartimentos celulares, PRX5 mostró la inducción más prominente durante la formación de esferoides, lo que sugiere una posible asociación con la regulación redox en el fenotipo similar a las CSC de las células HCT116.
La inhibición de PRX5 suprime los marcadores de similitud con las células madre y el fenotipo de las CSC en las células HCT116
Primero establecimos las CSC de HCT116 mediante un protocolo de inducción de diferenciación de 12 días, lo que se confirmó mediante la regulación al alza exitosa de los factores de pluripotencia centrales OCT4, SOX2, NANOG y c-MYC (Figura 1B). El análisis cuantitativo posterior de los miembros de la familia PRX en las CSC inducidas reveló un aumento significativamente mayor en la expresión de PRX5 en comparación con los otros isoformas de PRX (Figura 2C), lo que sugiere un papel específico de PRX5 en el mantenimiento del estado de las CSC. Para caracterizar este papel, utilizamos un siRNA dirigido a PRX5 (siPRX5) para lograr un silenciamiento eficiente con más del 97% de supresión de la expresión de ARNm de PRX5 (Figura 3A). El silenciamiento de PRX5 resultó en una alteración del fenotipo de similitud con las células madre, como lo demuestra la regulación a la baja general de los factores de transcripción centrales de similitud con las células madre OCT4, SOX2, NANOG y c-MYC (Figura 3A). Es importante destacar que los niveles de expresión de OCT4, SOX2 y c-MYC se redujeron significativamente, lo que demuestra que PRX5 es esencial para mantener la red de transcripción que respalda la similitud con las células madre. Además, este vínculo funcional se corroboró mediante el análisis del marcador de superficie de las CSC CD133, cuya expresión se inhibió en más del 23% mediante siPRX5 (Figura 3A). Por lo tanto, la supresión sincrónica de OCT4, SOX2 y CD133 tras el agotamiento de PRX5 sugiere que PRX5 puede funcionar como un componente regulador de las propiedades agresivas similares a las de las células madre de las CSC de HCT116.
El análisis mediante Western blot confirmó una eficiencia en la reducción de la expresión de siPRX (96 %) en las células HCT116 (Figura 3B). En los resultados de qPCR, el silenciamiento de PRX5 atenuó significativamente los niveles de proteína de OCT4, SOX2 y NANOG, así como del marcador de células madre cancerosas (CSC) CD133 (Figura 3C). Para examinar cómo la depleción de PRX5 afecta a las vías de señalización relacionadas con la pluripotencia, cuantificamos la expresión de genes diana representativos mediante qPCR (Figura 3D). La reducción de la expresión de PRX5 condujo a una disminución en la expresión de SOCS3, lo que indica una disminución de la actividad de STAT3. LGR5 y ASCL2, que están asociados con la señalización de Wnt/β-catenina, también mostraron una tendencia a la baja. En contraste, los marcadores de la vía de Notch, HES1 y HEY1, no se indujeron y no se correlacionaron con la depleción de PRX5, mientras que la expresión de GLI1 permaneció en gran medida sin cambios. Estas observaciones indican que los efectos de la pérdida de PRX5 están asociados principalmente con la atenuación de la señalización de STAT3 y, en menor medida, con los programas de transcripción relacionados con Wnt. En conjunto, estos resultados indican que PRX5 es necesario para mantener el fenotipo de CSC y sus redes de señalización y transcripción asociadas en las células HCT116.
La sobreexpresión de PRX5 potencia las características de pluripotencia y la capacidad proliferativa en las células HCT116.
Para investigar el papel de PRX5 en la tumorigenicidad y la formación de esferoides, generamos una línea celular HCT116 que expresa de forma estable PRX5 marcada con V5 (HCT116-PRX5). Se confirmó la sobreexpresión exitosa de PRX5 48 horas después de la transfección (Figura S1). Hipotetizamos que PRX5 impulsa el fenotipo de CSC. Durante un período de inducción de 12 días, el análisis de qPCR reveló un aumento dependiente del tiempo en los factores de pluripotencia principales: OCT4 (1,60 veces), NANOG (1,67 veces), SOX2 (1,25 veces) y KLF4 (1,96 veces) (Figura 4A). En consonancia con estos hallazgos, EPCAM, CD24 y CD133 también se regularon al alza de forma significativa, 1,61, 1,97 y 1,57 veces, respectivamente (Figura 4A). Este cambio transcripcional subraya que PRX5 promueve un estado más agresivo y similar a una célula madre en las células HCT116.
El análisis mediante Western blot confirmó que la sobreexpresión de PRX5 aumentó significativamente los niveles de proteína de OCT4 (1,23 veces) y SOX2 (1,43 veces) después de 12 días, lo que refleja los datos transcripcionales (Figura 4B y C). Si bien los niveles de NANOG y EPCAM permanecieron estables en estas condiciones, la regulación al alza paralela del ARNm y la proteína de OCT4 y SOX2 sugiere su regulación directa por PRX5. Los ensayos funcionales mostraron que la sobreexpresión de PRX5 mejoró la viabilidad celular. Específicamente, las células HCT116-PRX5 exhibieron un aumento de 1,26 veces en la proliferación, según lo medido por la formación de focos después de 48 horas (Figura S2A y S2B). La regulación al alza constante de los marcadores de pluripotencia, junto con una mayor proliferación, proporciona evidencia consistente con un papel de PRX5 en la inducción de CSC. Estos datos sugieren que PRX5 puede contribuir al programa de autorrenovación y al crecimiento tumoral agresivo al estabilizar la señalización y las redes de transcripción de las células madre.
Para definir aún más el contexto de señalización asociado con la sobreexpresión de PRX5, analizamos los principales genes diana de las principales vías de señalización relacionadas con la pluripotencia mediante qPCR (Figura 4D). Los niveles elevados de PRX5 se acompañaron de un aumento en la expresión de SOCS3, lo que fue consistente con una mayor activación de STAT3. En paralelo, los genes asociados con Wnt/β-catenina, LGR5 y ASCL2, se regularon al alza, lo que apoya su participación en los programas de pluripotencia impulsados por PRX5. En contraste, los marcadores de las vías de Notch y Hedgehog no mostraron una asociación consistente con la sobreexpresión de PRX5. En conjunto, estos resultados sugieren que la pluripotencia impulsada por PRX5 se apoya preferentemente mediante la señalización de STAT3, con una contribución parcial de la actividad de transcripción relacionada con Wnt/β-catenina. En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que PRX5 mejora los fenotipos asociados con CSC a través de la regulación coordinada de las redes de señalización y transcripción.
PRX5 regula la pluripotencia y la señalización de STAT3 dependiente del redox.
Para comprender el papel funcional de PRX5, establecimos una línea celular HCT116 estable con shPRX5. shPRX5 redujo significativamente la formación de esferoides tumorales y disminuyó la frecuencia de células madre cancerosas, según lo determinado por el análisis de dilución limitante (Figura S3). De manera consistente, el análisis mediante Western blot mostró que la supresión de PRX5 redujo la expresión de los marcadores asociados con la pluripotencia, incluidos CD133, OCT4, SOX2, NANOG y EPCAM (Figura 5A y B). En paralelo, la depleción de PRX5 disminuyó significativamente los niveles de STAT3 fosforilada (p-STAT3), lo que apoya una asociación entre la expresión de PRX5 y la activación de STAT3.
Para determinar si este efecto regulador se conservaba en las líneas celulares de cáncer colorrectal, se moduló la expresión de PRX5 en las células HT29 y SW480. shPRX5 suprimió la expresión de CD133, OCT4, NANOG y EPCAM en ambas líneas celulares, y las células SW480 mostraron una reducción particularmente marcada en los niveles de CD133 y EPCAM (Figura S4A y S4B). Por el contrario, la sobreexpresión de PRX5 aumentó la expresión de CD133, OCT4 y NANOG en las células HT29, y de OCT4 y NANOG en las células SW480 (Figuras S4A y S4B). También examinamos la expresión de E-caderina como un marcador exploratorio con respecto a la señalización de STAT3 dependiente de PRX5. La supresión de PRX5 resultó en una disminución de la expresión de E-caderina en las células HT29 y SW480, acompañada de una reducción de los niveles de p-STAT3 (Figura S5A y S5B), lo que sugiere una posible asociación entre la actividad de STAT3 mediada por PRX5 y la expresión de marcadores epiteliales.
Para evaluar aún más el papel de PRX5 en la homeostasis del redox y la integridad de los esferoides, se analizaron los niveles intracelulares de ROS y la morfología de los esferoides en los esferoides derivados de las células HCT116 WT, con sobreexpresión de PRX5 y con shPRX5 después de 12 días de cultivo. La tinción con CM-H2DCFDA reveló que la reducción de la expresión de PRX5 aumentó significativamente los niveles de ROS en comparación con los esferoides WT y con sobreexpresión de PRX5, mientras que la sobreexpresión de PRX5 no alteró significativamente los niveles de ROS en relación con los controles WT (Figura 5C). En consonancia con este hallazgo, el análisis cuantitativo de la intensidad de la fluorescencia de CM-H2DCFDA mostró una elevación significativa en los esferoides shPRX5, lo que indica que la depleción de PRX5 interrumpió el equilibrio redox intracelular dentro de los esferoides. A continuación, evaluamos la morfología de los esferoides midiendo la circularidad. Los esferoides shPRX5 mostraron una circularidad más baja que los esferoides WT y con sobreexpresión de PRX5, lo que indica una estructura de esferoides más irregular y desorganizada (Figura 5D). En contraste, los esferoides con sobreexpresión de PRX5 mantuvieron una morfología compacta y redondeada comparable a la de los controles WT.
Para evaluar aún más si los cambios dependientes del redox influyen en la activación de STAT3 y los fenotipos asociados con la pluripotencia, realizamos experimentos adicionales utilizando un eliminador de ROS y un inhibidor de STAT3. El tratamiento con el eliminador de ROS N-acetilcisteína (NAC) aumentó significativamente los niveles de p-STAT3 y reguló al alza significativamente la expresión de los factores de transcripción de pluripotencia principales OCT4, SOX2 y NANOG en las células HCT116 y HCT116 shPRX5 (Figura 6A y B). La expresión de EPCAM aumentó significativamente en las células HCT116 después del tratamiento con NAC, mientras que solo se observaron cambios modestos en las células con reducción de la expresión de PRX5. Por el contrario, la inhibición farmacológica de STAT3 utilizando WP1066 redujo significativamente los niveles de p-STAT3 y condujo a una disminución de la expresión de OCT4, SOX2 y NANOG en las células HCT116 y con sobreexpresión de PRX5 (Figura 6C y D). En contraste, la expresión de EPCAM mostró cambios mínimos o ligeramente aumentados. En conjunto, estos resultados sugieren que PRX5 contribuye al mantenimiento de la homeostasis del redox y la integridad estructural de los esferoides, particularmente a través de la regulación del redox de la señalización de STAT3 que sustenta las propiedades asociadas con la pluripotencia en las células de cáncer colorrectal.
La sobreexpresión de PRX5 impulsa la pluripotencia del cáncer y una mayor tumorigenicidad mediante la regulación al alza de los factores de pluripotencia en el CRC.
Utilizamos un modelo de xenoinjerto murino para investigar el papel de PRX5 en la proliferación de CSC y la progresión tumoral in vivo. Establecimos una línea celular HCT116 estable con PRX5 y monitoreamos el crecimiento de los tumores durante 3 semanas después de inyectar por vía subcutánea células HCT116 WT y HCT116-PRX5 en los flancos de ratones desnudos (Figura 7A y B). Sorprendentemente, los tumores formados por HCT116-PRX5 crecieron más rápido que los tumores HCT116 WT, y la diferencia se volvió estadísticamente significativa a partir del día 13 después de la implantación. La diferencia en el volumen tumoral fue 1,92 veces mayor en el día 16 y aumentó aún más a 2,5 veces en el día 19 (Figura 7C). Durante el período de observación de tres semanas, todos los ratones implantados con células HCT116 mantuvieron un peso corporal estable, lo que indica que el procedimiento de trasplante y el crecimiento tumoral no indujeron un estrés sistémico significativo ni efectos adversos (Figura 7D). Después del período de observación de 3 semanas, se extirparon los tumores y se pesaron. El peso promedio de los tumores HCT116-PRX5 (0,53 g) fue aproximadamente 1,82 veces mayor que el de los tumores HCT116 WT (0,29 g), lo que confirmó que la mayor tumorigenicidad mediada por la sobreexpresión de PRX5 in vivo (Figura 7E). Luego, investigamos si los efectos pro-pluripotencia observados en los ensayos basados en células podrían replicarse in vivo. Con este fin, se analizaron los niveles de expresión de ARNm y proteína en los tejidos tumorales cosechados 3 semanas después de la implantación. En consonancia con nuestros datos in vitro, los niveles de expresión de ARNm de OCT4, SOX2, NANOG y c-MYC fueron 1,5 veces mayores en los tumores HCT116-PRX5 en comparación con el grupo WT (Figura 7F). Además, la sobreexpresión de PRX5 en el tejido del ratón condujo a un aumento correspondiente de 1,25 a 2,2 veces en los niveles de proteína de OCT4, SOX2, NANOG y CD133 y EPCAM en comparación con los del grupo HCT116 WT (Figura 7G y H).
En conjunto, los resultados in vivo sugieren que PRX5 puede funcionar como un factor contribuyente en la promoción de las propiedades de CSC de las células HCT116 al regular la expresión de los genes asociados con la pluripotencia en el microambiente tumoral, lo que conduce a la autorrenovación dependiente de PRX5 de CSC y a una mayor tumorigenicidad.
Inducción y caracterización de una subpoblación de CSC de las células HCT116.
Para investigar la adquisición de propiedades similares a las de las CSC en las células HCT116 de cáncer colorrectal, empleamos un método de cultivo basado en esferoides bien establecido. Este enfoque enriquece selectivamente las células con características similares a las de las células madre explotando su capacidad para sobrevivir y proliferar en condiciones de sustrato independiente y libres de suero. Como se ilustra en el esquema experimental de la Figura 1A, las células HCT116 parentales se cultivaron en un medio especializado libre de suero suplementado con EGF y bFGF, que son críticos para el mantenimiento y la proliferación de las CSC. Al emplear las condiciones de cultivo especializadas, observamos la formación de agregados de CSC tridimensionales no adherentes (denominados esferoides) dentro de la población de células HCT116 (Figura S1). Este enriquecimiento selectivo resultó en una subpoblación distinta capaz de una proliferación sostenida sin unión al sustrato, una característica morfológica distinta del crecimiento adherente típico de las células HCT116.
Para validar la pluripotencia de las células enriquecidas con formación de esferoides, primero realizamos qPCR para medir la expresión de ARNm de los factores de transcripción de pluripotencia principales OCT4, SOX2, NANOG y C-MYC. Estos genes son reguladores maestros de la pluripotencia que se sabe que se regulan al alza en las CSC, manteniendo así su capacidad de autorrenovación. Los niveles de expresión de los cuatro genes se regularon al alza significativamente en los cultivos de esferoides de 12 días en comparación con las células parentales adheridas (día 0), más de 5 veces para OCT4, 4,1 veces para SOX2, 1,7 veces para NANOG y 3,1 veces para C-MYC (Figura 1B). Este aumento significativo proporciona evidencia molecular de que se indujo una reprogramación transcripcional profunda hacia un estado primitivo y no diferenciado en el cultivo de esferoides.
Se realizó una validación adicional de la población enriquecida de CSC mediante la cuantificación de la expresión de ARNm de cuatro marcadores de superficie de CSC bien conocidos, que se utilizan habitualmente para identificar y aislar CSC en diversos tipos de cáncer: EPCAM, CD24, CD44 y CD133. Después de 12 días de cultivo de los esferoides, estos marcadores se expresaron significativamente más, y sus niveles de ARNm aumentaron 1,8 veces para EPCAM, 2,3 veces para CD24, 1,4 veces para CD44 y 1,4 veces para CD133 (Figura 1C). Cabe señalar que los aumentos en la expresión de estos marcadores de superficie son más modestos que los de los factores de transcripción principales (Figura 1C). Esta diferencia probablemente se deba a los distintos papeles de estos conjuntos de genes: mientras que OCT4, SOX2, NANOG y C-MYC orquestan el programa principal de "stemness" a nivel genético, la expresión de los marcadores de superficie es una consecuencia posterior de esta reprogramación y refleja cambios en las interacciones célula-célula y las propiedades funcionales que pueden retrasar la manifestación.
No obstante, la sobreexpresión de los marcadores CD24, CD44 y CD133, asociados con la tumorigenicidad y la resistencia a la terapia, proporciona evidencia importante de que se enriqueció con éxito una subpoblación significativa de CSC. Además, confirmamos que las características de "stemness" observadas a nivel de ARNm eran consistentes a nivel de proteína. Los niveles de expresión de las proteínas OCT4, SOX2, NANOG y EPCAM fueron notablemente más altos en las células HCT116 después de 6 y 12 días de inducción de CSC en comparación con el día 0 (Figura 1D y E). La correlación entre la sobreexpresión de los niveles de ARNm y proteína valida que los cambios a nivel de transcripción se tradujeron con éxito en proteínas funcionales, lo que respalda nuestros hallazgos. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de que nuestro método de cultivo de esferoides indujo eficazmente una subpoblación de CSC de células HCT116, lo que se validó mediante el análisis de los factores principales de "stemness" y la expresión de los marcadores de superficie de CSC.
PRX5 es un antioxidante clave cuya expresión se incrementa en las CSC de HCT116
Para determinar los mecanismos moleculares subyacentes a la adquisición de propiedades similares a las de las CSC, nos centramos en la expresión de la familia de proteínas antioxidantes PRX, que se sabe que son fundamentales para mantener la homeostasis redox celular. Comenzamos examinando el nivel de expresión de ARNm de PRX5 en las células HCT116 durante su diferenciación hacia el estado similar a las CSC, que se incrementó aproximadamente 1,7 veces durante el período de inducción de 12 días en comparación con el día 0 (Figura 2A). Este hallazgo sugiere una posible relación entre PRX5 y el fenotipo de CSC.
A continuación, ampliamos nuestra investigación a los niveles de expresión de proteínas de toda la familia PRX. Si bien los niveles de expresión de PRX1-6 mostraron ligeros aumentos durante el proceso de diferenciación de CSC, la sobreexpresión de PRX5 fue notablemente más pronunciada (Figura 2B). Este patrón de expresión diferencial destaca una sobreexpresión preferencial de PRX5, lo que sugiere un posible papel en las CSC de HCT116 (Figura 2B y C). A diferencia de otros miembros de la familia PRX que se expresan de forma más amplia en varios compartimentos celulares, PRX5 mostró la inducción más prominente durante la formación de esferoides, lo que sugiere una posible asociación con la regulación redox en el fenotipo similar a las CSC de las células HCT116.
La inhibición de PRX5 suprime los marcadores de "stemness" y el fenotipo de CSC en las células HCT116
Primero, establecimos las CSC de HCT116 mediante un protocolo de inducción de diferenciación de 12 días, lo que se confirmó mediante la sobreexpresión exitosa de los factores de pluripotencia principales OCT4, SOX2, NANOG y c-MYC (Figura 1B). El análisis cuantitativo posterior de los miembros de la familia PRX en las CSC inducidas reveló un aumento significativamente mayor en la expresión de PRX5 en comparación con el de los otros isoformas de PRX (Figura 2C), lo que sugiere un papel específico de PRX5 en el mantenimiento del estado de CSC. Para caracterizar este papel, utilizamos un siRNA dirigido a PRX5 (siPRX5) para lograr un silenciamiento eficiente con más del 97% de supresión de la expresión de ARNm de PRX5 (Figura 3A). El silenciamiento de PRX5 resultó en una alteración del fenotipo de "stemness", como lo demuestra la regulación a la baja general de los factores de transcripción principales de "stemness" OCT4, SOX2, NANOG y c-MYC (Figura 3A). Es importante destacar que los niveles de expresión de OCT4, SOX2 y c-MYC se redujeron significativamente, lo que demuestra que PRX5 es esencial para mantener la red de transcripción que respalda la "stemness" del cáncer. Además, esta relación funcional se corroboró mediante el análisis del marcador de superficie de CSC CD133, cuya expresión se inhibió en más del 23% mediante siPRX5 (Figura 3A). Por lo tanto, la supresión sincrónica de OCT4, SOX2 y CD133 tras la depleción de PRX5 sugiere que PRX5 puede funcionar como un componente regulador de las propiedades agresivas similares a las de las células madre de las CSC de HCT116.
El análisis de Western blot confirmó una eficiencia de silenciamiento de siPRX (96%) en las células HCT116 (Figura 3B). En los resultados de qPCR, el silenciamiento de PRX5 atenuó significativamente los niveles de proteína de OCT4, SOX2 y NANOG, así como el marcador de CSC CD133 (Figura 3C). Para examinar cómo la depleción de PRX5 afecta a las vías de señalización relacionadas con la "stemness", cuantificamos la expresión de genes diana posteriores representativos mediante qPCR (Figura 3D). El silenciamiento de PRX5 condujo a una reducción en la expresión de SOCS3, lo que indica una disminución de la actividad de STAT3. LGR5 y ASCL2, que están asociados con la señalización de Wnt/β-catenina, también mostraron una tendencia a la baja. En contraste, los marcadores de la vía de Notch HES1 y HEY1 no se indujeron y no se correlacionaron con la depleción de PRX5, mientras que la expresión de GLI1 permaneció en gran medida sin cambios. Estas observaciones indican que los efectos de la pérdida de PRX5 están asociados principalmente con la atenuación de la señalización de STAT3 y, en menor medida, con los programas de transcripción relacionados con Wnt. En conjunto, estos resultados indican que PRX5 es necesario para mantener el fenotipo de CSC y sus redes de transcripción y señalización asociadas en las células HCT116.
La sobreexpresión de PRX5 potencia las características de "stemness" y la capacidad proliferativa en las células HCT116
Para investigar el papel de PRX5 en la tumorigenicidad y la formación de esferoides, generamos una línea celular HCT116 que expresa de forma estable PRX5 con una etiqueta V5 (HCT116-PRX5). Se confirmó la sobreexpresión exitosa de PRX5 48 horas después de la transfección (Figura S1). Hipotetizamos que PRX5 impulsa el fenotipo de CSC. Durante un período de inducción de 12 días, el análisis de qPCR reveló un aumento dependiente del tiempo en los factores de pluripotencia principales: OCT4 (1,60 veces), NANOG (1,67 veces), SOX2 (1,25 veces) y KLF4 (1,96 veces) (Figura 4A). Coherente con estos hallazgos, EPCAM, CD24 y CD133 también se expresaron significativamente más, 1,61, 1,97 y 1,57 veces, respectivamente (Figura 4A). Este cambio transcripcional subraya que PRX5 promueve un estado más agresivo y similar a las células madre en las células HCT116.
El análisis de Western blot confirmó que la sobreexpresión de PRX5 aumentó significativamente los niveles de proteína de OCT4 (1,23 veces) y SOX2 (1,43 veces) después de 12 días, lo que reflejó los datos de transcripción (Figura 4B y C). Si bien los niveles de NANOG y EPCAM permanecieron estables en estas condiciones, la regulación ascendente paralela de ARNm y proteína para OCT4 y SOX2 sugiere su regulación directa por PRX5. Los ensayos funcionales mostraron que la sobreexpresión de PRX5 mejoró la viabilidad celular. Específicamente, las células HCT116-PRX5 exhibieron un aumento de 1,26 veces en la proliferación, según lo medido por la formación de focos después de 48 horas (Figura S2A y S2B). La regulación ascendente constante de los marcadores de "stemness" combinada con una mayor proliferación proporciona evidencia consistente con un papel de PRX5 en la inducción de CSC. Estos datos sugieren que PRX5 puede contribuir al programa de autorrenovación y al crecimiento tumoral agresivo al estabilizar la señalización transcripcional de las células madre.
Para definir aún más el contexto de señalización asociado con la sobreexpresión de PRX5, analizamos los genes diana posteriores clave de las principales vías relacionadas con la "stemness" mediante qPCR (Figura 4D). Los niveles elevados de PRX5 se acompañaron de un aumento en la expresión de SOCS3, lo que fue consistente con una mayor activación de STAT3. En paralelo, los genes asociados con Wnt/β-catenina LGR5 y ASCL2 también se regularon al alza, lo que respalda su participación en los programas de "stemness" impulsados por PRX5. En contraste, los marcadores de las vías de Notch y Hedgehog no mostraron una asociación consistente con la sobreexpresión de PRX5. En conjunto, estos resultados sugieren que la "stemness" impulsada por PRX5 se apoya preferentemente mediante la señalización de STAT3, con una contribución parcial de la actividad de transcripción relacionada con Wnt/β-catenina. En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que PRX5 mejora los fenotipos asociados con CSC mediante la regulación coordinada de las redes de transcripción y señalización.
PRX5 regula la "stemness" y la señalización de STAT3 dependiente del redox
Para comprender el papel funcional de PRX5, establecimos una línea celular HCT116 estable con shPRX5. shPRX5 redujo significativamente la formación de esferoides tumorales y disminuyó la frecuencia de células madre cancerosas, según lo determinado por el análisis de dilución limitante (Figura S3). De manera consistente, el análisis de Western blot mostró que la supresión de PRX5 redujo la expresión de los marcadores asociados con la "stemness", incluidos CD133, OCT4, SOX2, NANOG y EPCAM (Figura 5A y B). En paralelo, la depleción de PRX5 disminuyó significativamente los niveles de STAT3 fosforilada (p-STAT3), lo que respalda una asociación entre la expresión de PRX5 y la activación de STAT3.
Para determinar si este efecto regulador se conservaba en las líneas celulares de cáncer colorrectal, se moduló la expresión de PRX5 en las células HT29 y SW480. shPRX5 suprimió la expresión de CD133, OCT4, NANOG y EPCAM en ambas líneas celulares, y las células SW480 mostraron una reducción particularmente marcada en los niveles de CD133 y EPCAM (Figura S4A y S4B). Por el contrario, la sobreexpresión de PRX5 aumentó la expresión de CD133, OCT4 y NANOG en las células HT29, y OCT4 y NANOG en las células SW480 (Figuras S4A y S4B). También examinamos la expresión de E-caderina como un marcador exploratorio con respecto a la señalización de STAT3 dependiente de PRX5. La supresión de PRX5 resultó en una disminución de la expresión de E-caderina en las células HT29 y SW480, acompañada de una reducción de los niveles de p-STAT3 (Figura S5A y S5B), lo que sugiere una posible asociación entre la actividad de STAT3 mediada por PRX5 y la expresión de marcadores epiteliales.
Para evaluar aún más el papel de PRX5 en la homeostasis redox y la integridad de los esferoides, se analizaron los niveles intracelulares de ROS y la morfología de los esferoides en los esferoides derivados de las células HCT116 WT, con sobreexpresión de PRX5 y con shPRX5 después de 12 días de cultivo. La tinción con CM-H2DCFDA reveló que el silenciamiento de PRX5 aumentó notablemente los niveles de ROS en comparación con los esferoides WT y con sobreexpresión de PRX5, mientras que la sobreexpresión de PRX5 no alteró significativamente los niveles de ROS en relación con los controles WT (Figura 5C). Coherente con este hallazgo, el análisis cuantitativo de la intensidad de la fluorescencia de CM-H2DCFDA mostró una elevación significativa en los esferoides shPRX5, lo que indica que la depleción de PRX5 alteró el equilibrio redox intracelular dentro de los esferoides. A continuación, evaluamos la morfología de los esferoides midiendo la circularidad. Los esferoides shPRX5 mostraron una circularidad más baja que los esferoides WT y con sobreexpresión de PRX5, lo que indica una estructura de esferoides más irregular y desorganizada (Figura 5D). En contraste, los esferoides con sobreexpresión de PRX5 mantuvieron una morfología compacta y redondeada comparable a la de los controles WT.
Para evaluar más a fondo si los cambios dependientes del redox influyen en la activación de STAT3 y en los fenotipos asociados a la capacidad de formar células madre, realizamos experimentos adicionales utilizando un eliminador de ROS y un inhibidor de STAT3. El tratamiento con el eliminador de ROS, la N-acetilcisteína (NAC), aumentó notablemente los niveles de p-STAT3 y aumentó significativamente la expresión de los factores de transcripción centrales de la capacidad de formar células madre, OCT4, SOX2 y NANOG, tanto en las células HCT116 como en las células HCT116 shPRX5 (Figura 6A y B). La expresión de EPCAM aumentó significativamente en las células HCT116 después del tratamiento con NAC, mientras que solo se observaron cambios modestos en las células con la expresión de PRX5 reducida. Por el contrario, la inhibición farmacológica de STAT3 utilizando WP1066 redujo significativamente los niveles de p-STAT3 y provocó una disminución de la expresión de OCT4, SOX2 y NANOG tanto en las células HCT116 como en las células con sobreexpresión de PRX5 (Figura 6C y D). En cambio, la expresión de EPCAM mostró cambios mínimos o ligeramente aumentados. En conjunto, estos resultados sugieren que PRX5 contribuye al mantenimiento de la homeostasis redox y la integridad estructural de los esferoides, particularmente a través de la regulación dependiente del redox de la señalización de STAT3, lo que sustenta las propiedades asociadas a la capacidad de formar células madre en las células de cáncer colorrectal.
La sobreexpresión de PRX5 impulsa la capacidad de formar células madre y una mayor tumorigenicidad mediante la regulación al alza de los factores de pluripotencia en el CRC
Utilizamos un modelo de xenoinjerto murino para investigar el papel de PRX5 en la proliferación de las CSC y la progresión tumoral in vivo. Establecimos una línea celular estable HCT116-PRX5 y monitoreamos el crecimiento de los tumores durante 3 semanas después de inyectar por vía subcutánea células HCT116 WT y HCT116-PRX5 en los flancos de ratones desnudos (Figura 7A y B). Notablemente, los tumores formados por HCT116-PRX5 crecieron más rápido que los tumores HCT116 WT, y la diferencia se volvió estadísticamente significativa a partir del día 13 después de la implantación. La diferencia en el volumen tumoral fue 1,92 veces mayor el día 16 y aumentó aún más a 2,5 veces el día 19 (Figura 7C). Durante el período de observación de tres semanas, todos los ratones implantados con células HCT116 mantuvieron un peso corporal estable, lo que indica que el procedimiento de trasplante y el crecimiento tumoral no indujeron estrés sistémico significativo ni efectos secundarios adversos (Figura 7D). Después del período de observación de 3 semanas, se extirparon y pesaron los tumores. El peso promedio de los tumores HCT116-PRX5 (0,53 g) fue aproximadamente 1,82 veces mayor que el de los tumores HCT116 WT (0,29 g), lo que confirmó que la mayor tumorigenicidad mediada por la sobreexpresión de PRX5 in vivo (Figura 7E). Luego, investigamos si los efectos pro-células madre observados en los ensayos basados en células podrían replicarse in vivo. Con este fin, se analizaron los niveles de expresión de ARNm y proteínas en los tejidos tumorales recolectados 3 semanas después de la implantación. Coherente con nuestros datos in vitro, los niveles de expresión de ARNm de OCT4, SOX2, NANOG y c-MYC fueron 1,5 veces mayores en los tumores HCT116-PRX5 en comparación con el grupo WT (Figura 7F). Además, la sobreexpresión de PRX5 en el tejido del ratón condujo a un aumento correspondiente de 1,25 a 2,2 veces en los niveles de proteína de OCT4, SOX2, NANOG y CD133 y EPCAM en comparación con el grupo HCT116 WT (Figura 7G y H).
En conjunto, los resultados in vivo sugieren que PRX5 puede funcionar como un factor contribuyente en la promoción de las propiedades de las CSC de las células HCT116 al regular al alza la expresión de los genes centrales asociados a la capacidad de formar células madre dentro del microambiente tumoral, lo que conduce al auto-renovamiento dependiente de PRX5 de las CSC y a una mayor tumorigenicidad.
Discusión
El estudio actual sugiere que PRX5 es un regulador positivo contribuyente de las propiedades de las CSC y la tumorigenicidad en las células HCT116 CRC, como lo indican los cambios morfológicos, los niveles elevados de transcripción y proteínas, y la evidencia funcional in vivo [[27–29]]. El modelo de cultivo de esferoides indujo con éxito una subpoblación de CSC caracterizada por la inducción de los factores de pluripotencia centrales OCT4, SOX2, NANOG y c-MYC y los marcadores funcionales de CSC en la superficie celular CD24, CD44, CD133 y EPCAM, validando así el modelo celular para el análisis mecanístico posterior [[30–32]]. Luego, encontramos que, entre la familia PRX, PRX5 se reguló al alza significativamente durante la inducción de las CSC, lo que sugiere una función específica para esta isoforma en la capacidad de formar células madre de HCT116. Los estudios funcionales a través del silenciamiento de PRX5 mediado por siRNA y shRNA y la sobreexpresión estable de PRX5 condujeron a cambios consistentes tanto en la expresión de los marcadores de CSC como en la capacidad proliferativa, respectivamente, estableciendo así una asociación consistente entre la expresión de PRX5 y el fenotipo maligno de las CSC. Lo más importante es que los experimentos de xenoinjerto in vivo proporcionaron una validación traslacional, donde la sobreexpresión de PRX5 condujo a una aceleración significativa del crecimiento tumoral (un aumento del 2,5 veces en el volumen) y el peso (un aumento del 1,82 veces), acompañado de una marcada regulación al alza de OCT4, SOX2, NANOG, c-MYC, CD133 y EPCAM en el tejido tumoral, lo que sugiere colectivamente que PRX5 regula la progresión del CRC.
Si bien nuestro estudio sugiere que PRX5 contribuye a mantener la expresión de los marcadores centrales de la capacidad de formar células madre y el fenotipo de las CSC en las células HCT116, las vías reguladoras moleculares precisas, específicamente los mediadores intermedios y las diversas cascadas de señalización del crecimiento celular asociadas con PRX5, siguen sin estar claras. Sin embargo, es probable que PRX5 contribuya al mantenimiento del fenotipo de las CSC al modular los factores de señalización clave. Primero, mantener un bajo nivel de ROS es esencial para el auto-renovamiento de las CSC. Wei et al. informaron que PRX5 elimina los ROS dentro de las mitocondrias y los peroxisomas, lo que ha demostrado que promueve la fosforilación de STAT3 [[33]]. Una vez activado por PRX5, STAT3 puede translocarse al núcleo para regular al alza OCT4 y NANOG. En segundo lugar, Lu y sus colegas demostraron que PRX5 desempeña un papel fundamental en la homeostasis redox intracelular [[34]]. Estos hallazgos sugieren que PRX5 puede estabilizar la beta-catenina o promover la entrada en el núcleo, lo que induce la expresión de los marcadores de las CSC, como CD44 y CD133. Finalmente, dado que PRX5 se localiza en las mitocondrias, se ha informado que reprograma el metabolismo en las células cancerosas para mantener un estado similar al de las células madre a través de la regulación de los ROS mitocondriales [[24]]. Esta reprogramación metabólica puede respaldar las características de la capacidad de formar células madre a través de mecanismos que aún deben identificarse. Además, otras vías moleculares pueden respaldar la regulación de la capacidad de formar células madre mediada por PRX5. Dada la homología funcional entre los miembros de la familia PRX, PRX5 podría participar en la señalización de Hedgehog. En las células de cáncer de colon, PRX2 impulsa un fenotipo similar al de las células madre a través de GLI1 con la regulación al alza de OCT4 y NANOG [[35]]. Es posible que PRX5 también pueda regular de manera similar los factores de transcripción GLI para mejorar la expresión de los genes de pluripotencia. Si bien se ha informado que la sobreexpresión de PRX5 aumenta el factor EMT Snail en el cáncer gástrico [[36]], la relevancia directa de este hallazgo para la capacidad de formar células madre en el CRC requiere una mayor investigación con paneles integrales de marcadores EMT. Dado que se sabe que Snail y Slug activan los programas de capacidad de formar células madre en los carcinomas, Snail inducido por PRX5 podría elevar indirectamente los marcadores de las CSC, como OCT4 y NANOG. En la señalización antioxidante, PRX5 se une y estabiliza NRF2 en las células de cáncer de pulmón, y las defensas antioxidantes impulsadas por NRF2 son esenciales para el auto-renovamiento de las células madre cancerosas [[37],[38]]. Por lo tanto, PRX5 puede mejorar los rasgos de las CSC al mejorar la expresión de los genes dependientes de NRF2.
Para caracterizar los roles específicos de PRX5, primero investigamos la capacidad de formación de esferoides y la frecuencia de las CSC en un sistema de silenciamiento estable de PRX5 mediado por shRNA. En particular, el agotamiento de PRX5 redujo significativamente la frecuencia de las CSC, lo que indica que PRX5 no es simplemente un subproducto incidental que se regula al alza durante la inducción de las CSC, sino más bien un regulador funcional esencial para mantener el potencial de auto-renovamiento [[39],[40]]. Además, la modulación de la expresión de PRX5 alteró los niveles de los marcadores de CSC canónicos, incluidos OCT4, NANOG, EPCAM y CD133, no solo en las células HCT116, sino también en las células HT29 y SW480. Este patrón consistente en múltiples líneas celulares de CRC sugiere que la regulación dependiente de PRX5 de la capacidad de formar células madre es un mecanismo conservado en lugar de un fenómeno específico de la línea celular. La marcada reducción de CD133 y EPCAM en SW480 indica aún más que PRX5 puede actuar como un regulador dependiente del contexto gobernado por el contexto celular.
Nuestros datos identifican a PRX5 como un regulador que vincula el equilibrio redox celular a la señalización de STAT3 en las células de cáncer colorrectal HCT116. PRX5 aumentó los niveles de ROS intracelulares y se acompañó de una reducción en la fosforilación de STAT3, mientras que la sobreexpresión de PRX5 redujo los ROS y preservó la activación de STAT3. Estas observaciones respaldan un modelo en el que PRX5 mantiene un entorno redox óptimo que permite la transcripción dependiente de STAT3 de los reguladores clave de la capacidad de formar células madre, como OCT4 y NANOG, definiendo así una señalización PRX5-ROS-STAT3 dependiente del redox.
STAT3 es un regulador de la transcripción bien establecido en la biología de las células madre y las CSC. Puede regular directamente la expresión de los genes relacionados con la pluripotencia, incluidos OCT4 y NANOG, y también promueve los programas de transcripción necesarios para el mantenimiento de la capacidad de formar células madre [[41]]. La fosforilación de STAT3 en Tyr705 es esencial para su translocación nuclear y la actividad de la transcripción, y la activación persistente de STAT3 (pY705) se ha relacionado con fenotipos de CSC mejorados y resistencia terapéutica en múltiples tipos de tumores [[42]]. Nuestros resultados sugieren que los niveles reducidos de p-STAT3 después del silenciamiento de PRX5 regulan la disminución de los niveles de OCT4, SOX2 y NANOG, lo que indica un vínculo funcional entre PRX5 y los factores de transcripción de la capacidad de formar células madre. PRX5 se localiza en múltiples compartimentos subcelulares y funciona como una enzima antioxidante que reduce el peróxido de hidrógeno y otros peróxidos. Además de la eliminación de ROS, PRX5 y otras peroxiredoxinas se han reconocido cada vez más como moduladores de las vías de señalización sensibles al redox. La actividad de STAT3 es sensible al estado redox intracelular. Los ROS moderados pueden promover la fosforilación de STAT3, mientras que el estrés oxidativo excesivo puede inhibir la señalización JAK/STAT. Por lo tanto, la pérdida de PRX5 puede alterar la homeostasis redox, lo que lleva a una reducción de la fosforilación de STAT3 y la supresión posterior de los programas de transcripción asociados a la capacidad de formar células madre [[43]]. En particular, nuestros resultados sugieren que el papel de PRX5 va más allá de la protección antioxidante general para la regulación de las redes de señalización que controlan las propiedades de las CSC. Esto apoya la hipótesis de que, a pesar de cierta redundancia funcional entre los miembros de la familia PRX, PRX5 puede desempeñar un papel en el nicho de las CSC. La regulación al alza de la expresión de la isoforma PRX5 en condiciones de inducción de las CSC en nuestros experimentos apoya aún más este hallazgo.
Si bien los datos actuales demuestran cambios coordinados en los niveles de ROS, p-STAT3 y la expresión de marcadores de células madre tras la modulación de PRX5, la relación entre estos componentes aún no se ha establecido formalmente mediante experimentos de rescate. No obstante, múltiples líneas de evidencia independientes convergen para respaldar el eje regulador propuesto PRX5-ROS-STAT3-células madre. La reducción estable de PRX5 mediada por shRNA elevó los niveles de ROS intracelular, redujo p-STAT3 y suprimió la expresión de OCT4, SOX2, NANOG y CD133, mientras que la sobreexpresión de PRX5 produjo efectos recíprocos en estos mismos parámetros, un patrón más consistente con una vía reguladora lineal que con efectos independientes. Estos hallazgos se reprodujeron en las células HT29 y SW480, lo que indica que la relación reguladora se conserva en los modelos de CRC. El modelo propuesto está aún más respaldado por principios bioquímicos establecidos. La actividad de STAT3 es muy sensible al entorno redox intracelular, con niveles moderados de ROS que promueven la fosforilación de STAT3 a través de la activación de la quinasa JAK y niveles excesivos de ROS que inhiben la señalización a través de la oxidación de residuos de cisteína críticos en JAK2 y STAT3 [[43],[44]]. Entre los miembros de la familia de peroxiredoxinas, se ha demostrado que PRX2 forma una transferencia redox directa con STAT3 al controlar los niveles locales de H₂O₂ [[44]], y dado que PRX5 tiene una especificidad de sustrato más amplia y una localización multicompartimental [[27]], una regulación análoga es concebible desde el punto de vista mecanicista. A continuación, STAT3 regula directamente la transcripción de OCT4 y NANOG al unirse a sus regiones promotoras proximales, como se demostró mediante el análisis ChIP [[41],[45]], lo que proporciona un mecanismo transcripcional definido que vincula la activación de STAT3 con los marcadores de células madre examinados en este estudio. Sin embargo, este modelo aún debe confirmarse definitivamente mediante experimentos de rescate formales. Con este fin, se están llevando a cabo experimentos de rescate utilizando STAT3 constitutivamente activo (STAT3-C), el eliminador de ROS N-acetilcisteína y los inhibidores específicos de STAT3, y se incluirán en el manuscrito revisado. Además, se requerirán estudios de interacción bioquímica para determinar si PRX5 regula la fosforilación de STAT3 a través de interacciones proteína-proteína directas o indirectamente a través de la modulación de la concentración local de H₂O₂ que afecta a la actividad de la quinasa JAK.
Cabe señalar que los cambios observados en los marcadores individuales de células madre tras la modulación de PRX5 (1,2–2,0 veces) son modestos en su magnitud. Sin embargo, con respecto a la señalización redox, las respuestas biológicas están gobernadas por umbrales dependientes de la concentración en lugar de por relaciones dosis-respuesta proporcionales; desviaciones tan pequeñas como 2 veces en los niveles de H₂O₂ pueden cambiar los programas celulares entre proliferación, diferenciación y apoptosis [[46],[47]]. La red central de factores de transcripción de pluripotencia opera dentro de una ventana de expresión particularmente estrecha. Niwa y sus colegas demostraron que cambios inferiores a 2 veces en la expresión de OCT4 son suficientes para redirigir las decisiones del destino de las células madre embrionarias, lo que establece que pequeños cambios cuantitativos producen cambios fenotípicos cualitativos [[48]]. La producción transcripcional de STAT3 también es sensible a los cambios en los niveles de fosforilación debido a la dinámica de unión al ADN cooperativa en los promotores diana [[49]]. Los estudios publicados sobre los reguladores de las CSC en el CRC, incluido PRX2, han informado de efectos biológicamente significativos dentro de un rango comparable de 1,3 a 1,8 veces que se correlacionan con resultados funcionales significativos [[34],[35]]. En esencia, los cambios observados en nuestro estudio se reproducen de forma consistente en múltiples niveles moleculares, múltiples marcadores independientes (OCT4, SOX2, NANOG, CD133, EPCAM), estrategias de perturbación bidireccionales, múltiples parámetros funcionales y las células HCT116, HT29 y SW480. Es importante destacar que los cambios moleculares in vitro se amplificaron a un aumento de 2,5 veces en el volumen tumoral y un aumento de 1,82 veces en el peso tumoral en los xenoinjertos con sobreexpresión de PRX5 (Figura 7), lo que es una característica de los nodos reguladores que funcionan en puntos de control críticos de la vía. Estas consideraciones respaldan la conclusión de que PRX5 funciona como un regulador biológicamente significativo, aunque no único, del fenotipo de las CSC en el CRC. Además del eje de señalización STAT3 dependiente del redox descrito aquí, la evidencia emergente sugiere que PRX5 puede participar en las vías asociadas a la ferroptosis, un proceso estrechamente relacionado con la peroxidación de lípidos dependiente de los ROS [[50],[51]]. En consonancia con esto, también se ha propuesto que PRX5 es un posible objetivo terapéutico en múltiples contextos de cáncer, incluidos los cánceres colorrectales y los cánceres de próstata resistentes a la castración [[52]].
Observamos que los niveles de ARNm y proteína no se correlacionaron de manera uniforme para todos los marcadores examinados, una discrepancia que refleja mecanismos biológicos en lugar de problemas experimentales. En particular, NANOG mostró una importante sobreexpresión de ARNm que no se reflejó de manera consistente a nivel de proteína, probablemente debido a su extensa regulación postranscripcional a través de la desestabilización del ARNm mediada por elementos ricos en AU, la degradación proteasómica dependiente de la ubiquitina a través de las E3 ligasas como FBXW8 y la estabilidad de las proteínas sensible al redox [[53],[54]]. Dado que la modulación de PRX5 altera los niveles de ROS intracelular, es plausible que los cambios dependientes del redox en la estabilidad de la proteína NANOG antagonicen parcialmente la sobreexpresión transcripcional, creando un mecanismo compensatorio. De manera similar, los niveles de proteína EPCAM se vieron más afectados in vivo que in vitro, lo que es consistente con la regulación conocida de la expresión de EPCAM en la superficie por la proteólisis intramembrana regulada a través de TACE/ADAM17 y γ-secretasa, la glicosilación postraduccional y las señales microambientales que están más completamente representadas en el modelo de xenoinjerto [[55],[56]]. Una brecha entre el ARNm y la proteína es un fenómeno conocido a nivel del genoma, con correlaciones de solo r = 0,4–0,6 entre la abundancia de transcritos y proteínas [[57]]. Es importante destacar que, para aquellos marcadores en los que se observó correlación entre el ARNm y la proteína (OCT4, SOX2), los cambios consistentes en ambos niveles moleculares promueven la validez de los efectos regulatorios identificados.
Aunque la expresión de E-caderina se redujo tras la reducción de PRX5 en las células HT29 y SW480 (Figura S5A y S5B), esta observación de un solo marcador es insuficiente para concluir que PRX5 regula directamente la transición epitelio-mesenquimal. Una evaluación exhaustiva requeriría el análisis de un panel completo de marcadores epiteliales y mesenquimales, junto con ensayos funcionales de migración e invasión. La reducción de E-caderina tras la depleción de PRX5 puede reflejar una interrupción de la integridad epitelial o cambios en la transcripción de E-caderina dependiente de STAT3 en lugar de la activación del programa EMT. Cabe destacar que se ha informado que STAT3 regula la expresión de E-caderina en entornos celulares, lo que sugiere que la reducción observada de E-caderina puede ser una consecuencia secundaria de la disminución de los niveles de p-STAT3 en lugar de un evento EMT independiente. Estudios recientes han demostrado que las CSC residen con frecuencia en estados híbridos epiteliales/mesenquimales (E/M) que no se ajustan al marco binario canónico de EMT [[58],[59]]. La relación entre PRX5, la homeostasis del redox y la flexibilidad epitelial requiere una investigación dedicada en estudios futuros que empleen marcadores y ensayos funcionales exhaustivos.
Una limitación del presente estudio es que no establece definitivamente una relación entre la pérdida de PRX5, la reducción de p-STAT3 y la disminución de la expresión de los marcadores de células madre. Los estudios futuros deben incluir experimentos de rescate funcionales que utilicen STAT3 constitutivamente activo para determinar si la restauración de la actividad de STAT3 puede recuperar la expresión de OCT4/NANOG y los fenotipos de las CSC en las células deficientes en PRX5. Para fortalecer aún más nuestras conclusiones, se necesitan más estudios. Estos incluyen la modulación farmacológica de la vía JAK/STAT y los ensayos ChIP para confirmar la unión de p-STAT3 en los promotores de OCT4 y NANOG. Además, los experimentos de seguimiento del tiempo ayudarían a aclarar la secuencia temporal de los cambios en los niveles de ROS, la activación de p-STAT3 y la expresión de los marcadores de células madre [[23],[41]].
Otra limitación es que la frecuencia de las células iniciadoras de tumores in vivo no se cuantificó directamente mediante la limitación de la dilución del trasplante (LDT). Aunque ELDA in vitro demostró que la depleción de PRX5 redujo significativamente la frecuencia de las CSC, y los experimentos de xenoinjerto de dosis única mostraron un crecimiento tumoral mejorado (2,5 veces mayor volumen, 1,82 veces mayor peso) y una mayor expresión de los marcadores de células madre en los tumores con sobreexpresión de PRX5, los ensayos de dilución limitante in vivo formales representan el estándar de oro para cuantificar la frecuencia de las células iniciadoras de tumores. Al inyectar células tanto en el lado izquierdo como en el derecho de cada ratón, comparamos los grupos dentro del mismo animal. Este enfoque garantiza que las diferencias observadas en el crecimiento no se deban a variaciones individuales entre los ratones. No obstante, los estudios futuros deben incorporar LDT in vivo con pasajes en serie para establecer definitivamente que PRX5 modula la frecuencia de las células iniciadoras de tumores y que el enriquecimiento de las CSC dependiente de PRX5 se mantiene en los trasplantes en serie, lo que representa el estándar de oro para demostrar la capacidad de autorrenovación [[60],[61]]. Estos experimentos permitirían una cuantificación precisa del número mínimo de células necesarias para la iniciación del tumor y la evaluación de si la sobreexpresión de PRX5 reduce este umbral, proporcionando así evidencia definitiva de una mayor capacidad de iniciación del tumor en lugar de una mayor capacidad proliferativa.
En resumen, nuestros hallazgos proponen un modelo en el que PRX5 mantiene un entorno redox permisivo que permite la activación de STAT3 y el mantenimiento transcripcional de los programas asociados a las CSC en las células cancerosas de colon. Estos resultados sugieren que PRX5 es un posible objetivo molecular para estrategias destinadas a interrumpir el mantenimiento de las CSC a través de enfoques basados en el redox. Se requerirá una validación mecánica y in vivo adicional para determinar la posibilidad terapéutica de dirigir la señalización PRX5-ROS-STAT3.
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