Establecimiento de una radioinmunodiagnosis predirigida basada en (68)Ga-DOTA.

La radioinmunodiagnóstica y la radioinmunoterapia predirigidas son campos de investigación activos en el desarrollo de nuevas radiofármacos para el tratamiento del cáncer. A diferencia de los enfoques convencionales que se basan en la administración directa de radioinmunoconjugados (“un solo paso”), las estrategias de predirigido (“dirigido en múltiples pasos”) implican la administración secuencial de un anticuerpo dirigido al tumor, seguido de una pequeña molécula radiomarcada (radiohapteno o radioligando complementario), lo que permite un dirigido tumoral altamente específico al tiempo que se minimiza la captación fuera del objetivo. Recientemente, desarrollamos un enfoque de anticuerpo bispecífico (BsAb) para la radioinmunoterapia predirigida (PRIT), empleando un fragmento de cadena variable de un solo dominio con afinidad ultra alta para DOTA, conocido como “C825”, para administrar selectivamente radioisótopos emisores alfa y beta a una variedad de tumores sólidos humanos; este método se conoce como DOTA-PRIT.

Los pequeños haptenos DOTA establecidos, utilizados en DOTA-PRIT, incluyen el ácido S-2-(4-aminobencil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano tetraacético (p-NH2-Bn-DOTA), que es adecuado para el marcado con 177Lu y 86Y, y una molécula especializada llamada “Proteus” (Pr), diseñada para su uso con 111In y 225Ac para la PRIT alfa guiada por imagen. El hapteno Pr comprende un complejo 175Lu-bencil-DOTA no radioactivo, reconocido por el anticuerpo C825, un enlazador de tetraetilenglicol (PEG4) y un ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (DO3A) vacío para la quelación de radiometales terapéuticos o diagnósticos. Estos radiohaptenos exhiben propiedades farmacocinéticas y de biodistribución muy favorables para aplicaciones de predirigido, caracterizadas por una estabilidad in vivo favorable, una rápida eliminación renal, una mínima participación hepatobiliar y una retención en todo el cuerpo excepcionalmente baja.

A medida que continuamos optimizando y ampliando la versatilidad de DOTA-PRIT, nuestro objetivo es aprovechar las ventajas únicas de los radiofármacos teranósticos, en particular su tremendo valor para comprender el comportamiento de los fármacos y cuantificar la exposición de los órganos normales y los tumores mediante imágenes no invasivas. Esta capacidad permite la selección de pacientes, la planificación del tratamiento personalizado y la dosimetría. En este estudio, ampliamos nuestro conjunto de herramientas de PET diagnóstica más allá de los radiohaptenos 86Y poco comunes.

Clínicamente, las sondas de PET basadas en 68Ga (vida media = 1,1 h) se utilizan ampliamente para el diagnóstico, la estadificación y el seguimiento de la respuesta al tratamiento. La popularidad del 68Ga se debe a su disponibilidad a partir de la síntesis con un generador y a su química de coordinación como radiometal trivalente, lo que permite una complejación fácil, eficiente y estable con una amplia gama de quelantes bien caracterizados, como DOTA y 1,4,7-triazaciclononano, ácido 1-glutarico-4,7-acético (NODAGA). Las sondas aprobadas por la FDA incluyen [68Ga]­Ga-PSMA-11 (dirigido al antígeno de membrana específico de la próstata en el cáncer de próstata) y [68Ga]­Ga-DOTATATE (dirigido a los receptores de somatostatina en los tumores neuroendocrinos).

Si bien los isótopos diagnósticos de vida corta, como el 68Ga, se utilizan típicamente con péptidos, debido a que su farmacocinética se alinea con la corta vida media física del 68Ga, DOTA-PRIT aprovecha una cinética similar de las pequeñas moléculas, lo que da como resultado un dirigido tumoral excepcionalmente rápido, lo que hace factible el uso de 68Ga en la inmunoPET predirigida. En este enfoque, los BsAb localizados en el tumor capturan el radiohapteno dentro de 1 hora después de la inyección, lo que se corresponde bien con la desintegración física del 68Ga. Esto convierte al 68Ga en un isótopo ideal para la imagen PET predirigida.

Para explorar el potencial de extender la plataforma DOTA-PRIT a la PET diagnóstica basada en 68Ga, investigamos el uso de haptenos DOTA marcados con 68Ga (radiohaptenos 68Ga) como posibles agentes de imagen complementarios. Específicamente, evaluamos el rendimiento in vivo de DOTA-PRIT de Pr3 marcado con 68Ga ([68Ga]­Ga-Pr) y NODAGA-Pr marcado con 68Ga ([68Ga]­Ga-NODAGA-Pr) utilizando un régimen DOTA-PRIT de 3 pasos establecido contra el antígeno tumoral glicoproteína A33 (GPA33). GPA33 se expresa en más del 95% de los cánceres colorrectales humanos primarios y metastásicos y es un objetivo bien validado tanto para la radioinmunodiagnóstica como para la radioinmunoterapia utilizando formas radiomarcadas del anticuerpo monoclonal anti-GPA33 huA33.

Para caracterizar aún más las propiedades in vivo de nuestros nuevos radiohaptenos 68Ga, los probamos en un sistema de prueba basado en células diseñadas previamente para radiohaptenos en aplicaciones de imagen y radioinmunoterapia predirigidas: células embrionarias humanas 293T que expresan el anticuerpo humanizado C825 anclado a la membrana (293T-huC825).

Basándonos en el éxito de [111In]­In-Pr y [225Ac]­Ac-Pr, hipotetizamos que [68Ga]­Ga-Pr y [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr servirían como radiohaptenos 68Ga ideales para una radioinmunodiagnóstica predirigida de alto contraste, debido a sus favorables características fisicoquímicas, en particular su pequeño tamaño y baja lipofilicidad. Estos estudios tienen como objetivo establecer un nuevo radiohapteno 68Ga para la radioinmunodiagnóstica predirigida basada en 68Ga-DOTA del cáncer colorrectal humano (CRC) que expresa GPA33 y proporcionar un compañero diagnóstico adecuado para futuras aplicaciones teranósticas que involucren la captura de radiohaptenos.

Materiales y Métodos

Síntesis del precursor de radiohapteno NODAGA-Pr

Los productos químicos eran de grado reactivo y se utilizaron tal cual, sin purificación adicional. Los quelantes bifuncionales (S)-p-SCN-Bn-DOTA y NH2-PEG4-NODAGA se compraron a Macrocyclics y CheMatech, respectivamente. Para la síntesis del nuevo NODAGA-Pr, el complejo de isómero principal p-SCN-Bn-DOTA·Lu3+ (20 mg, 27,6 μmol) y NH2-PEG4-NODAGA (17 mg, 28,6 μmol) se disolvieron en dimetilformamida anhidra (DMF) (0,8 mL) antes de ser tratados con trietilamina (Et3N) (20 μL). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego, los disolventes se eliminaron por evaporación al vacío y el residuo incoloro se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase inversa (RP) C-18, utilizando el gradiente 5-40% de acetonitrilo en agua (ambos contenían 0,05% v/v de ácido trifluoroacético).

Consideraciones generales de radiquímica

La radiquímica se realizó en campanas de extracción química debidamente blindadas, equipadas con monitoreo electrónico del flujo y ventanas de vidrio con plomo deslizantes. Se utilizó un calibrador de dosis CRC-55tR para medir la radiactividad utilizando la configuración de calibración recomendada por el fabricante (Capintec Inc., Florham Park, NJ). Los tampones y el agua utilizados para la síntesis radiquímica se trataron con resina de intercambio iónico Chelex al 5% p/v (resina BT Chelex 100, Bio-Rad Inc., Hercules, CA) para eliminar los metales pesados adventicios. El material de plástico (puntas de pipeta y tubos de microcentrífuga) era de grado de metales traza/grado de ARN.

La identidad y la pureza radiroquímica (PRQ) de los productos marcados se determinaron mediante radioHPLC y/o cromatografía en capa fina radioactiva (radioTLC). La radioHPLC se realizó en un sistema HPLC Shimadzu Prominence que consta de un módulo de bomba dual LC-20AB, un desgasificador DGU-20A3R, un autosamplificador SIL-20ACHT, un detector UV-vis SPD-20A y un detector de radiactividad Bioscan Flow-Count B-FC-1000 con PMT/NaI en línea. Las separaciones se realizaron en una columna HPLC analítica de 4,6 × 250 mm Gemini-NX C18 o Fusion RP C18 (Phenomenex, Inc., Torrance, CA). A menos que se especifique lo contrario, las condiciones de HPLC fueron las siguientes: disolvente A: 10 mM NH4OAc (pH 5,0); disolvente B: CH3CN; caudal: 1,0 mL/min; λ = 254 nm; volumen de inyección: 10-50 μL; gradiente: 0% B a 40% B en 10 min. Se diluyeron alícuotas de metales radiactivos libres, mezclas de reacción y productos purificados 1:5 en 5 mM de trietilenetetramina pentaacético (DTPA) antes del análisis.

Para la radioTLC, se colocaron alícuotas (1 μL) de las mezclas de reacción crudas en papel de cromatografía de microfibra de vidrio impregnado con gel de sílice (iTLC-SG, Agilent Technologies), se desarrollaron en un tampón de citrato de sodio 0,1 M (pH 5,0) y se escanearon utilizando un escáner Eckert & Ziegler iTLC (AR-2000). En estas condiciones, [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr permanece en la línea de base, mientras que [68Ga]­Ga-DTPA migra a un R
f de 1,0. Se realizó una radioTLC adicional utilizando una fase móvil de tampón de acetato de amonio 1,25 M (pH 5,5): DMF (1:1) como fase móvil para evaluar la presencia de [68Ga]­Ga-coloide. En este sistema, [68Ga]­Ga-coloide permanece en la línea de base, mientras que [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr o [68Ga]­Ga-Pr migran a un R
f de 1,0.

Procedimiento de radiomarcado para estudios en animales

Se realizó un procedimiento de radiomarcado típico de la siguiente manera: NODAGA-Pr (2 nmol en 20 μL de agua) se añadió a [68Ga]­GaCl3 neutralizado (175 MBq/4,7 mCi) y se mezcló suavemente (concentración final de NODAGA-Pr de aproximadamente 2 μM). El tubo se colocó en un bloque de calentamiento a 95 °C durante 15 min. Después de enfriar durante 5 min, todo el contenido se cargó por gravedad en una cartucha SPE Strata-X de 30 mg (Phenomenex, Torrance CA), que se había equilibrado con 1 mL de etanol y 1 mL de agua. Se utilizó agua (100 μL) para enjuagar el tubo de reacción y se pasó a través de la cartucha. La columna se lavó con 200 μL de agua, se secó con un chorro de gas nitrógeno y, a continuación, el producto se eluyó lentamente por goteo con 200 μL de etanol en un tubo de microcentrífuga limpio. El volumen del eluyente se redujo bajo un flujo de gas nitrógeno a aproximadamente 50 μL, se diluyó en 2 mL de solución salina normal (Hospira, Lake Forest, IL) y se filtró estérilmente. Se confirmó que este procedimiento de purificación eliminaba eficazmente el [68Ga]­Ga-coloide (ver Figura S1).

Ensayo de lipofilicidad del coeficiente de distribución (Log D)

[68 Ga]­Ga-NODAGA-Pr (962 kBq/26 μCi) o [68Ga]­Ga-Pr (740 kBq/20 μCi) en 30 μL de tampón de acetato de sodio 1 M (pH 5,0) se añadieron a un tubo de Eppendorf que contenía tampón fosfato salino (PBS) saturado (200 μL) y 1-octanol saturado (200 μL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 min en un termomixer Eppendorf a 900 rpm y, a continuación, se centrifugó durante 5 min a 1000 rcf. Se recogió una alícuota de 50 μL de la fase de 1-octanol (capa superior). La radiactividad de la muestra de 50 μL de octanol se midió utilizando un contador gamma, y se escaló al volumen total de la fase de octanol (×4). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. El Log D se calculó utilizando la ecuación:

[68Ga]-Ga-Pr (629 kBq/17
μCi) o [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr (888 kBq/24 μCi)
en 50 μL de tampón de acetato de sodio 1 M (pH 5.0) se añadió a 100
μL de suero de ratón en un tubo de Eppendorf. La mezcla se incubó
a 37 °C (600 rpm, Eppendorf ThermoMixer). Se tomaron alícuotas (1.5 μL)
a los 15, 30, 60, 120 y 360 min para el análisis por radio-TLC
(desarrollado con tampón de citrato de sodio 0.1 M, pH 5.0). Todos los experimentos
se realizaron por triplicado.

Se realizaron ensayos de estabilidad adicionales
solo con [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr. Aproximadamente 5
MBq (135 μCi) de [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr se incubaron
en 0.25 mL de suero de ratón a 37 °C durante 15, 30 y 60 min. En
cada punto temporal, las proteínas del suero se eliminaron por precipitación
(750 μL de CH3CN:CH3OH 3:1), y el sobrenadante
se clarificó aún más mediante ultrafiltración a través de un filtro de membrana de nylon Spin-X de 0.22 μm (5 min a 15,000 × g). La radiactividad
en el filtrado se examinó utilizando radio-HPLC (25–50 μL
volumen de inyección; columna C-18 de 4.6 × 250 mm; gradiente de 0–40% (A:
10 mM NH4OAc (pH 5.0), B: CH3CN)). Todos los experimentos
se realizaron por triplicado.

Cultivo Celular, Modelos Animales y Régimen de DOTA-PRIT

La línea celular humana de CRC que expresa GPA33, SW1222, se obtuvo del
Instituto Ludwig para la Inmunoterapia del Cáncer (Nueva York, NY). Las células SW1222 se mantuvieron en medio IMDM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina y 100 unidades/mL de estreptomicina. Las células 293T-C825 modificadas genéticamente[] y las células HEK 293T parentales se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Media Core del Memorial Sloan Kettering Cancer Center [MSKCC], Nueva York, NY), con la
misma suplementación.

Se obtuvieron ratones nude atímicos hembra (de 6 a 8
semanas de edad) de Envigo (West Lafayette, Indiana, EE. UU.). Los estudios in vivo se realizaron en el Weill Cornell Medical College (WCM)
bajo los números de garantía del bienestar animal A3290-01 (WCM) o A3311-01
(MSKCC). Los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el IACUC (Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales) (laboratorio Cheal: WCM
#2022-0010; Laboratorio Veach: MSK #00-03-053) en las instalaciones/vivarios de contención
bajo la estricta supervisión del Centro de Recursos de Investigación Animal (RARC) de WCM/MSKCC. Para el modelo de tumor subcutáneo SW1222, aproximadamente 5
× 106 células SW1222 suspendidas en 50% de Matrigel (Corning)
se inyectaron subcutáneamente en los hombros de los ratones. Para el
modelo de tumor subcutáneo 293T-huC825, los ratones se implantaron bilateralmente con 3 × 106 células 293T-huC825 (hombro derecho) y
3 × 106 células de control 293T parentales (hombro izquierdo),
ambas suspendidas en 50% de Matrigel. La imagen in vivo y
los estudios de biodistribución se iniciaron cuando el volumen del tumor alcanzó
100–300 mm3, normalmente entre 7 y 11 días después de la inoculación.

El sistema DOTA-PRIT consta de tres reactivos: un anticuerpo bispecífico anti-GPA33/anti-DOTA (anti-huA33-C825 BsAb, 210 kDa), el agente de eliminación de dendrón-DOTA, CCA α-16-DOTA-Y3+ (PM: 9059 Da) y un radiohapteno de 68Ga. Todos los reactivos se prepararon según se describió anteriormente.[],[],[] Se muestra un diagrama
del protocolo experimental en la Figura.

Los ratones con tumores SW1222 recibieron 0.25 mg (1.19
nmol) de huA33-C825
en t = −28 h, seguido de 25 μg (2.76
nmol) del agente de eliminación en t = −4 h, y
finalmente, [68Ga]-Ga-Pr o [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr
en t = 0 h. Los ratones con xenoinjertos bilaterales de 293T-huC825
y tumores 293T recibieron solo el radiohapteno de 68Ga. Todos
los reactivos se administraron por vía intravenosa a través de la vena de la cola.

Imagen MicroPET/CT

La imagen PET/CT se realizó utilizando
el escáner microPET/CT Inveon (Siemens). A los ratones con xenoinjertos subcutáneos de SW1222 se les inyectó por vía intravenosa 6.0 MBq (130 pmol)
de [68Ga]-Ga-Pr o [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr predirigidos a GPA33. A los ratones con xenoinjertos bilaterales de 293T-huC825 + 293T se les administró solo [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr. Inmediatamente antes de
el escaneo, los animales se anestesiaron con 2% de isoflurano y se colocaron en posición prona. Se adquirieron imágenes estáticas de 1 a 2 h después de la inyección (p.i.)
utilizando un escaneo de 15 min. Para evaluar aún más la distribución del radiohapteno de 68Ga, se realizó un estudio de biodistribución de órganos ex vivo
inmediatamente después de la imagen.

Estudio de Biodistribución

Para caracterizar de forma más exhaustiva
el comportamiento in vivo de DOTA-PRIT con [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr, realizamos estudios de biodistribución seriados de [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr predirigido a GPA33 a los 5, 15, 30 y 60 min p.i. en
grupos de ratones con tumores SW1222. Se sacrificaron cohortes de animales (n = 4–5) en cada punto temporal, y se recolectaron los órganos de
interés, se secaron con una gasa y se pesaron en tubos. La radiactividad
en cada tejido se midió con un contador gamma (PerkinElmer 1480
Wizard 3), se corrigió por la desintegración isotópica y se calculó como porcentaje
de la actividad inyectada por gramo (%IA/g).

Análisis Estadístico

Todos los datos experimentales se presentan
como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos y el ajuste de curvas no lineales se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión
10.1.2. Las diferencias en la captación de tejido entre los grupos se evaluaron
utilizando múltiples pruebas t no pareadas, con un valor de P < 0.05 considerado estadísticamente significativo.

Síntesis del Precursor del Radiohapteno NODAGA-Pr

Los
productos químicos eran de grado reactivo y se utilizaron tal cual, sin purificación adicional.
Los quelantes bifuncionales (S)-p-SCN-Bn-DOTA y NH2-PEG4-NODAGA se compraron
a Macrocyclics y CheMatech, respectivamente. Para la síntesis del
nuevo NODAGA-Pr, el complejo de isómero principal de p-SCN-Bn-DOTA·Lu3+ (20 mg, 27.6 μmol) y NH2-PEG4-NODAGA (17 mg, 28.6 μmol) se disolvieron en
dimetilformamida (DMF) anhidra (0.8 mL) antes del tratamiento con trietilamina
(Et3N) (20 μL). La mezcla resultante se agitó
a temperatura ambiente durante la noche. Los disolventes se eliminaron por evaporación al vacío, y el residuo incoloro se purificó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa
(RP), utilizando el
gradiente de 5–40% de acetonitrilo en agua (ambos contienen 0.05%
v/v de ácido trifluoroacético).

Consideraciones Generales de Radiquímica

La radiquímica
se realizó en campanas de extracción química apropiadamente protegidas, equipadas
con monitoreo electrónico del flujo y ventanas de vidrio con plomo deslizantes.
Se utilizó un calibrador de dosis CRC-55tR para medir la radiactividad utilizando
la configuración de calibración recomendada por el fabricante (Capintec Inc., Florham
Park, NJ). Los tampones y el agua utilizados para la síntesis radiquímica se trataron con resina de intercambio iónico Chelex al 5% p/v (resina BT Chelex 100, Bio-Rad Inc., Hercules, CA) para eliminar los metales pesados adventicios. El material de plástico (puntas de pipeta y tubos de microcentrífuga) era de grado de metales traza/grado de ARN.

La identidad y la pureza radiroquímica (PRQ) de los productos etiquetados se determinaron con radio-HPLC y/o radio-cromatografía en capa fina (radio-TLC). La radio-HPLC se realizó en un sistema HPLC Shimadzu Prominence que consta de un módulo de bomba dual LC-20AB, un desgasificador DGU-20A3R, un muestreador automático SIL-20ACHT, un detector UV-vis SPD-20A y un detector de radiactividad Bioscan
Flow-Count B-FC-1000 con PMT/NaI en línea.
Las separaciones se realizaron en una columna analítica de C18 Gemini-NX de 4.6 × 250 mm o en una columna de HPLC de fase inversa Fusion RP (Phenomenex, Inc., Torrance, CA). A menos que se especifique lo contrario, las condiciones de HPLC fueron las siguientes: disolvente
A: 10 mM NH4OAc (pH 5.0); disolvente B: CH3CN;
tasa de flujo: 1.0 mL/min; λ = 254 nm; volumen de inyección: 10–50
μL; gradiente: 0% B a 40% B durante 10 min. Las muestras de radiometales libres, las mezclas de reacción y los productos purificados se diluyeron 1:5 en 5 mM
de trietilenetetramina pentaacético (DTPA) antes del análisis.

Para
la radio-TLC, se colocaron alícuotas (1 μL) de las mezclas de reacción crudas
en papel de microfibra de cromatografía impregnado
con gel de sílice (iTLC-SG, Agilent Technologies), se desarrolló en tampón de citrato de sodio 0.1 M (pH 5.0) y se escaneó utilizando un escáner Eckert &
Ziegler iTLC (AR-2000). En estas condiciones, [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr permanece en la línea de base, mientras que [68Ga]-Ga-DTPA
migra a un R
f de
1.0. Se realizó una radio-TLC adicional utilizando una fase móvil de tampón de acetato de amonio 1.25 M (pH 5.5): DMF (1:1) como fase móvil
para evaluar la presencia de [68Ga]-Ga-coloide. En este sistema,
[68Ga]-Ga-coloide permanece en la línea de base, mientras que [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr o [68Ga]-Ga-Pr migran a un R
f de 1.0.

Etiquetado con 68Galio de NODAGA-Pr y Pr

[68Ga]GaCl3 (185 MBq/5.0 mCi) en 0.5–1 mL
de HCl 0.1 M se eluyó de un generador GalliaPharm 68Ge/68Ga (Eckert & Ziegler Radiopharma GmbH, Berlín, Alemania)
y se transfirió a un tubo de microcentrífuga de metal libre de 2 mL. Un procedimiento de radiosíntesis típico de [68Ga]-Ga-Pr es el siguiente (nota: se utiliza un procedimiento idéntico para [68Ga]-Ga-NODAGA-Pr). A 700 μL
de tampón de acetato de sodio 1 M (pH 5.0) en un tubo de Eppendorf Safe-Lock de 1.5 mL (grado Biopur), se añadió [68Ga]-GaCl3 (159 MBq/4.3
mCi en 500 μL de HCl 0.1 M), seguido de 4.3 μL
de solución de Pr (4.3 nmol en agua). La mezcla se agitó suavemente y se calentó a 95 °C durante 15 min en un termomixer de Eppendorf. La reacción se apagó con 4.3 μL de 10 mM de DTPA y se analizó por radio-TLC.

Inicialmente, se realizó un estudio de titulación de masa para determinar
la actividad molar máxima que se puede alcanzar manteniendo una alta PRQ y un alto rendimiento radiroquímico (es decir, ambos >90%). Se utilizó una solución de NODAGA-Pr de 0.1 nmol/μL. Se colocaron volúmenes correspondientes a 10, 5, 2, 1 y 0.2 nmol
de NODAGA-Pr en cinco tubos de microcentrífuga de polipropileno de grado PCR. Se añadió tampón de Chelex 0.5 M NaOAc pH 5.3 para llevar el volumen total a 200 μL. A esto se añadió 200 μL de
[68Ga]-GaCl3 en HCl 0.1 M (37 MBq/1.0 mCi) como
eluido del generador; por lo tanto, las concentraciones finales de
NODAGA-Pr fueron de 25, 12.5, 5, 2.5 y 0.5 μM en un volumen de 400
μL. Los tubos se mezclaron y se colocaron en un bloque de calentamiento de 80 °C
durante 10 min, se enfriaron durante 2 min y luego se apagaron con la adición de
10 μL de 50 mM de EDTA acuoso. Se transfirieron alícuotas de las reacciones de etiquetado crudas (200 μL) en viales de autosampler de HPLC y se analizaron
por radio-HPLC.

Procedimiento de Etiquetado Radiológico para Estudios en Animales

Se realizó un procedimiento de etiquetado radiológico típico de la siguiente manera: NODAGA-Pr (2 nmol
en 20 μL de agua) se añadió a [68Ga]-GaCl3 neutralizado (175 MBq/4.7 mCi) y se mezcló suavemente (concentración final de NODAGA-Pr de aproximadamente 2 μM). El tubo se colocó en un bloque de calentamiento a 95 °C
durante 15 min. Después de enfriar durante 5 min, todo se cargó por gravedad
en una cartucha SPE Strata-X de 30 mg (Phenomenex, Torrance CA), que se había equilibrado con 1 mL de etanol y 1 mL de agua. Se utilizó agua (100 μL) para enjuagar el tubo de reacción y se pasó a través de
la cartucha. La columna se lavó con 200 μL de agua, se secó con nitrógeno y, a continuación, el producto se eluyó lentamente por goteo con 200 μL de etanol en un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 mL. El
volumen del eluyente se redujo bajo un flujo de nitrógeno seco a aproximadamente
50 μL, se diluyó en 2 mL de solución salina normal (Hospira, Lake Forest,
IL) y se filtró estérilmente. Se confirmó que este procedimiento eliminaba eficazmente cualquier galio no unido.

SPANISH TRANSLATION:

Se realizaron ensayos de estabilidad adicionales únicamente con [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr. Aproximadamente 5 MBq (135 μCi) de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr se incubaron en 0,25 mL de suero de ratón a 37 °C durante 15, 30 y 60 minutos. En cada punto temporal, las proteínas del suero se eliminaron por precipitación (750 μL de CH3CN:CH3OH 3:1), y el sobrenadante se clarificó aún más mediante ultrafiltración a través de un filtro de membrana de nylon Spin-X de 0,22 μm (5 min a 15 000 × g). La radiactividad en el filtrado se examinó mediante radioHPLC (25–50 μL de volumen de inyección; columna C-18 de 4,6 × 250 mm; gradiente de 0–40% (A: 10 mM de NH4OAc (pH 5,0), B: CH3CN)).

Cultivo celular, modelos animales y régimen de DOTA-PRIT

La línea celular humana de CRC SW1222 que expresa GPA33 se obtuvo del Ludwig Institute for Cancer Immunotherapy (Nueva York, NY). Las células SW1222 se mantuvieron en medio IMDM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina y 100 unidades/mL de estreptomicina. Las células 293T-C825 modificadas genéticamente[] y las células HEK 293T parentales se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Media Core del Memorial Sloan Kettering Cancer Center [MSKCC], Nueva York, NY), con la misma suplementación.

Se obtuvieron ratones nudosos atímicos hembra (de 6 a 8 semanas de edad) de Envigo (West Lafayette, Indiana, EE. UU.). Los estudios in vivo se realizaron en el Weill Cornell Medical College (WCM) bajo los números de garantía de bienestar animal A3290-01 (WCM) o A3311-01 (MSKCC). Los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el IACUC (Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales) (laboratorio Cheal: WCM #2022-0010; laboratorio Veach: MSK #00-03-053) en las instalaciones/vivarios de contención bajo la estricta supervisión del RARC (Centro de Recursos de Investigación Animal) de WCM/MSKCC. Para el modelo de tumor subcutáneo SW1222, se inyectaron aproximadamente 5 × 106 células SW1222 suspendidas en 50% de Matrigel (Corning) por vía subcutánea en los hombros de los ratones. Para el modelo de tumor subcutáneo 293T-huC825, se implantaron bilateralmente en los ratones 3 × 106 células 293T-huC825 (hombro derecho) y 3 × 106 células de control 293T parentales (hombro izquierdo), ambas suspendidas en 50% de Matrigel. Los estudios de imagen in vivo y biodistribución se iniciaron cuando el volumen del tumor alcanzó los 100–300 mm3, normalmente entre 7 y 11 días después de la inoculación.

El sistema DOTA-PRIT consta de tres reactivos: un anticuerpo bispecífico anti-GPA33/anti-DOTA (anti-huA33-C825 BsAb, 210 kDa), el agente de eliminación de dendrón-DOTA CCA α-16-DOTA-Y3+ (PM: 9059 Da) y un radiohapteno de 68Ga. Todos los reactivos se prepararon según lo descrito anteriormente.[],[],[] Se muestra un diagrama del protocolo experimental en la figura.

Los ratones con tumores SW1222 recibieron 0,25 mg (1,19 nmol) de huA33-C825 en t = −28 h, seguido de 25 μg (2,76 nmol) del agente de eliminación en t = −4 h, y finalmente, [68Ga]­Ga-Pr o [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr en t = 0 h. Los ratones con xenoinjertos bilaterales de 293T-huC825 y 293T recibieron solo el radiohapteno de 68Ga. Todos los reactivos se administraron por vía intravenosa a través de la vena de la cola.

Imagen MicroPET/CT

La imagen PET/CT se realizó utilizando el escáner microPET/CT Inveon (Siemens). Se inyectaron por vía intravenosa a los ratones con xenoinjertos subcutáneos de SW1222 6,0 MBq (130 pmol) de [68Ga]­Ga-Pr o [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr predirigidos a GPA33. Los ratones con xenoinjertos bilaterales de 293T-huC825 + 293T recibieron solo [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr. Inmediatamente antes del escaneo, los animales se anestesiaron con 2% de isoflurano y se colocaron en posición prona. Se adquirieron imágenes estáticas de 1 a 2 horas después de la inyección (p.i.) utilizando un escaneo de 15 minutos. Para evaluar aún más la distribución del radiohapteno de 68Ga, se realizó un estudio de biodistribución de órganos ex vivo inmediatamente después de la imagen.

Estudio de biodistribución

Para caracterizar de forma más exhaustiva el comportamiento in vivo de DOTA-PRIT con [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr, realizamos estudios de biodistribución seriados de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr predirigido a GPA33 a los 5, 15, 30 y 60 minutos p.i. en grupos de ratones con tumores SW1222. Se sacrificaron cohortes de animales (n = 4–5) en cada punto temporal, y se recolectaron los órganos de interés, se secaron con papel absorbente y se pesaron en tubos. La radiactividad en cada tejido se midió con un contador gamma (PerkinElmer 1480 Wizard 3), se corrigió por la desintegración del isótopo y se calculó como porcentaje de la actividad inyectada por gramo (%IA/g).

Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se presentan como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos y el ajuste de curvas no lineales se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 10.1.2. Las diferencias en la captación de tejido entre los grupos se evaluaron utilizando múltiples pruebas t no pareadas, con un valor de P < 0,05 considerado estadísticamente significativo.

Resultados

Síntesis de NODAGA-Pr

La vía de síntesis de NODAGA-Pr se muestra en la figura A. Se obtuvo NODAGA-Pr (15,1 mg, 41%) como una espuma blanca después de la liofilización de las fracciones apropiadas. 1H NMR (600 MHz, D2O) δ 7,15–7,25 (m, 4 H), 3,94–3,91 (m, 1 H), 3,89–3,51 (m, 26 H), 3,45–2,81 (m, 24 H), 2,5–2,35 (m, 12 H), 2,20–2,18 (m, 1 H), 2,07–2,03 (m, 1 H), 1,97–1,94 (m, 1 H). Observamos dos isómeros en la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) con las siguientes proporciones: 18% y 82%. El isómero menor eluye a los 3,02 min, y el isómero mayor a los 3,08 min (tiempo total de ejecución del método: 8 min). MS (ESI+) m/z calculado para C49H77LuN10O19S [M + H]+ 1317,45, [M + 2H]2+ 659,23, encontrado 659,35.

Radiosíntesis y caracterización in vitro de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr y [68Ga]­Ga-Pr

El esquema de radiosíntesis para los radiohaptenos de 68Ga se ilustra en la figura B. El marcado radiactivo de NODAGA-Pr o Pr con 68Ga eluido del generador GalliaPharm fue muy eficiente (actividad molar (A M) al final de la síntesis: 70 MBq/nmol (no corregido por la desintegración); RCY: >98%; RCP: 98%). La radioHPLC y/o la radioTLC de las preparaciones crudas y purificadas confirmaron el marcado radiactivo completo sin detectar 68Ga libre (radioHPLC: isómero principal R f = 8,1 min, >99% de conversión). Se muestra un ejemplo de radioTLC de la reacción de radiosíntesis cruda de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr en la figura A, B. La actividad molar máxima observada fue de 140 MBq/nmol (RCY: >98%; RCP: 98%, concentración final de NODAGA-Pr ≥2,5 μM) en los estudios de titulación de masa de ligando, y se observó una baja conversión con 0,2 nmol de precursor (concentración final de NODAGA-Pr ∼0,5 μM) (figura S2A). Los coeficientes de partición octanol-agua (pH 7,4, tampón PBS) (log D o/w) se midieron utilizando un ensayo de lipofilicidad. Los radiohaptenos de 68Ga fueron muy hidrofílicos, como se resume en la tabla. Los valores de Log P o/w predichos (MLOGP y SILICOS-IT), derivados utilizando la herramienta in silico en línea SwissADME[], se alinean estrechamente con los valores experimentales obtenidos empíricamente del ensayo de lipofilicidad.

Los estudios de estabilidad in vitro en suero de ratón demostraron que tanto [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr como [68Ga]­Ga-Pr permanecieron intactos durante 6 horas de incubación a 37 °C, sin degradación en ningún momento (figura C, D). Estudios adicionales de estabilidad del suero de ratón de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr, evaluados mediante radioHPLC, no revelaron cambios detectables en los radiogramas y una transferencia insignificante a las proteínas del suero. Estos hallazgos sugieren que no se produce una desmetalación significativa en 1 hora y una unión mínima de radiactividad a las proteínas del suero (figura S2B).

Farmacocinética y biodistribución de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr y [68Ga]­Ga-Pr

Los radiohaptenos de 68Ga purificados se administraron a ratones sanos para evaluar su farmacocinética sanguínea y biodistribución tisular a 1 hora p.i. (figuras y S2). Tanto [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr como [68Ga]­Ga-Pr mostraron una rápida eliminación de la sangre, con semividas que oscilaron entre 7,8 y 9,2 minutos (tabla y figura S3). No se observaron diferencias significativas en la captación tisular entre los dos radiotrazadores, excepto en el hígado, donde [68Ga]­Ga-Pr mostró aproximadamente 4 veces más captación en comparación con [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr (0,87 ± 0,49%IA/g frente a 0,23 ± 0,03%IA/g; P < 0,05). En general, estos hallazgos indican que ambos radiohaptenos de 68Ga poseen una rápida eliminación sistémica y una baja captación no específica en los tejidos sanos, características favorables para las aplicaciones de imagen in vivo.

Imagen MicroPET/CT de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr predirigido a GPA33

Se realizó una imagen MicroPET/CT para evaluar la eficiencia de orientación tumoral in vivo de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr predirigido a GPA33 y [68Ga]­Ga-Pr en ratones con xenoinjertos de SW1222 (n = 3/grupo). Las imágenes representativas de microPET adquiridas a las 2 horas p.i. se muestran en la figura A–D. Estas imágenes demostraron claramente la acumulación focal de los radiohaptenos de 68Ga predirigidos a GPA33 en este modelo de CRC, con una clara delimitación del tumor coregistrada anatómicamente con la TC (figura A, C). En contraste, los controles no predirigidos (n = 1) mostraron una captación tumoral insignificante, lo que destaca la especificidad de la estrategia DOTA-PRIT (figura B, D).

Estos hallazgos de imagen se corroboraron con estudios de biodistribución ex vivo realizados inmediatamente después de la imagen (figura E). [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr predirigido a GPA33 mostró una robusta captación tumoral (9,80 ± 1,07%IA/g) y una baja actividad de fondo en los tejidos normales. La mayor captación en los tejidos normales se observó en el hígado (0,72 ± 0,90%IA/g), con una acumulación notablemente baja en los riñones (0,37 ± 0,06%IA/g). En contraste, el predirigimiento con [68Ga]­Ga-Pr resultó en una captación tumoral mínima (98%; RCP: 98%). La radioHPLC y/o la radioTLC de las preparaciones crudas y purificadas confirmaron una radiomarcación completa sin detectar 68Ga libre (radioHPLC: isómero principal R f = 8,1 min, >99% de conversión). Se muestra un radioTLC representativo de la reacción de radiosíntesis cruda de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr en la Figura A y B. La actividad molar máxima observada fue de 140 MBq/nmol (RCY: >98%; RCP: 98%, concentración final de NODAGA-Pr ≥2,5 μM) en estudios de titulación de masa de ligando, y se observó una baja conversión con 0,2 nmol de precursor (concentración final de NODAGA-Pr ∼0,5 μM) (Figura S2A). Los coeficientes de distribución octanol-agua (pH 7,4, tampón PBS) (log D o/w) se midieron utilizando un ensayo de lipofilicidad. Los radiohaptenos de 68Ga fueron altamente hidrofílicos, como se resume en la Tabla. Los valores predichos de Log P o/w (MLOGP y SILICOS-IT), derivados utilizando la herramienta in silico en línea SwissADME[], se alinean estrechamente con los valores experimentales obtenidos empíricamente del ensayo de lipofilicidad.

Los estudios de estabilidad in vitro en suero de ratón demostraron que tanto [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr como [68Ga]­Ga-Pr permanecieron intactos durante 6 h de incubación a 37 °C, sin degradación en ningún momento (Figura C y D). Estudios adicionales de estabilidad en suero de ratón de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr, evaluados por radioHPLC, no revelaron cambios detectables en los radiogramas y una transferencia insignificante a las proteínas del suero. Estos hallazgos sugieren que no hay una desmetalación significativa en 1 h y una unión mínima de la radiactividad a las proteínas del suero (Figura S2B).

Farmacocinética y biodistribución de [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr y [68Ga]­Ga-Pr

Se administraron radiohaptenos de 68Ga purificados a ratones sanos para evaluar su farmacocinética sanguínea y biodistribución tisular a 1 h p.i. (Figuras y S2). Tanto [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr como [68Ga]­Ga-Pr exhibieron una rápida eliminación de la sangre, con semividas que oscilaron entre 7,8 y 9,2 min (Tabla y Figura S3). No se observaron diferencias significativas en la captación tisular entre los dos radiotrazadores, excepto en el hígado, donde [68Ga]­Ga-Pr mostró una captación aproximadamente 4 veces mayor en comparación con [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr (0,87 ± 0,49%IA/g frente a 0,23 ± 0,03%IA/g; P < 0,05). En general, estos hallazgos indican que ambos radiohaptenos de 68Ga poseen una rápida eliminación sistémica y una baja captación inespecífica en los tejidos sanos, características favorables para las aplicaciones de imagen in vivo.

Imagen MicroPET/CT de GPA33-pretratado con radiohaptenos de 68Ga

Se realizó una imagen MicroPET/CT para evaluar la eficiencia de la captación tumoral in vivo del GPA33-pretratado con [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr y [68Ga]­Ga-Pr en ratones portadores de xenoinjertos SW1222 (n = 3/grupo). Las imágenes MicroPET representativas adquiridas a las 2 h p.i. se muestran en la Figura A-D. Estas imágenes demostraron claramente una acumulación focal de los radiohaptenos de 68Ga pretratados con GPA33 en este modelo de CRC, con una delimitación tumoral distinta corregida anatómicamente con TC (Figura A y C). En contraste, los controles no pretratados (n = 1) exhibieron una captación tumoral insignificante, lo que destaca la especificidad de la estrategia DOTA-PRIT (Figura B y D).

Estos hallazgos de imagen se corroboraron con estudios de biodistribución ex vivo realizados inmediatamente después de la imagen (Figura E). El GPA33-pretratado con [68Ga]­Ga-NODAGA-Pr mostró una robusta captación tumoral (9,80 ± 1,07%IA/g) y una baja actividad de fondo en los tejidos normales. La mayor captación en los tejidos normales se observó en el hígado (0,72 ± 0,90%IA/g), con una acumulación notablemente baja en los riñones (0,37 ± 0,06%IA/g). En contraste, el pretratamiento con [68Ga]­Ga-Pr resultó en una captación tumoral mínima (