Sistema de administración oral nano-vacunal mucoadhesivo con capacidad inmunomoduladora para una terapia sinérgica contra el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más prevalentes en todo el mundo, ocupando el tercer lugar en incidencia y el segundo en mortalidad relacionada con el cáncer [^[1]]. En China, su incidencia ha aumentado hasta el segundo lugar, con una tendencia ascendente persistente y un alarmante incremento entre las poblaciones más jóvenes [^[2]]. Las modalidades de tratamiento actuales para el CCR incluyen principalmente la intervención quirúrgica, la quimioterapia y la radioterapia [^[3],^[4]]. Entre estas, la quimioterapia (ejemplificada por el 5-fluorouracilo, 5-FU) sigue siendo un pilar fundamental tanto en los entornos adyuvantes como neoadyuvantes [^[5],^[6]]. Sin embargo, su eficacia clínica está severamente limitada por desafíos significativos, incluida la aparición de resistencia a los fármacos, la baja biodisponibilidad y la pronunciada toxicidad sistémica, lo que subraya la urgente necesidad de nuevas estrategias terapéuticas con una mayor especificidad y seguridad [^[7]].

En los últimos años, la inmunoterapia contra el cáncer ha surgido como un enfoque transformador, que se clasifica ampliamente en bloqueo de puntos de control inmunitario, transferencia de células adoptivas, vacunas contra el cáncer, etc. [[^[8]], [^[9]], [^[10]], [^[11]], [^[12]]]. Entre estas, las vacunas contra el cáncer ofrecen ventajas distintas al entrenar al sistema inmunitario del huésped con antígenos específicos del tumor para reconocer y eliminar con precisión las células malignas [^[13],^[14]]. Las vacunas contra el cáncer se clasifican ampliamente en vacunas profilácticas, que están bien establecidas para prevenir los cánceres asociados a virus, y vacunas terapéuticas, la mayoría de las cuales aún se encuentran en investigación clínica [[^[15]], [^[16]], [^[17]], [^[18]]]. Las vacunas terapéuticas proporcionan una alta especificidad, una memoria inmunitaria duradera y un perfil de seguridad favorable, lo que representa una estrategia prometedora para establecer una inmunidad antitumoral a largo plazo [[^[19]], [^[20]], [^[21]]]. En particular, las vacunas basadas en lisados de células tumorales completas (LCT) han ganado una atención considerable debido a su capacidad para presentar un amplio espectro de antígenos asociados al tumor, evitando así la necesidad de identificar antígenos y reduciendo el riesgo de evasión inmunitaria [^[22],^[23]]. A pesar de estas ventajas, las vacunas contra el cáncer actuales enfrentan obstáculos críticos para lograr una focalización eficiente del tumor colorrectal y provocar una activación inmunitaria potente y específica [[^[24]], [^[25]], [^[26]]], lo que destaca la urgente necesidad de estrategias de administración avanzadas y adyuvantes inmunológicos eficaces.

Dado que el CCR se origina en la porción terminal del tracto digestivo, la administración oral representa una de las vías más directas y eficaces para la administración de fármacos [^[27]]. La liberación localizada de fármacos en el colon y el recto permite una focalización precisa del tumor y puede provocar respuestas inmunitarias robustas dentro de la región colorrectal, controlando así el crecimiento tumoral y mejorando los resultados terapéuticos [[^[28]], [^[29]], [^[30]], [^[31]]]. Además, dado que el fármaco actúa principalmente a nivel local, la administración oral minimiza la exposición sistémica al fármaco, reduciendo la toxicidad fuera del objetivo [^[32]]. Además, en comparación con la terapia intravenosa, los regímenes orales ofrecen una mejor adherencia del paciente, lo que facilita un tratamiento sostenido y constante [^[33],^[34]].

Más allá de la vía de administración, el diseño del vehículo de administración es igualmente crítico. Un vehículo ideal debe cumplir dos funciones clave: en primer lugar, debe proteger la carga útil de la degradación en el duro entorno gastrointestinal y permitir la acumulación dirigida en los tumores colorrectales. Por ejemplo, ciertos sistemas de administración pueden resistir la acidez gástrica y la digestión enzimática, llegando intactos al tracto intestinal, y pueden diseñarse con propiedades superficiales (por ejemplo, carga positiva) para mejorar la retención y el enriquecimiento en los sitios tumorales [^[35],^[36]]. En segundo lugar, más allá de actuar como un vehículo pasivo, el vehículo debe funcionar como un adyuvante inmunológico, involucrando activamente las vías inmunitarias innatas para amplificar la inmunidad antitumoral [^[37],^[38]]. En este sentido, los materiales a base de manganeso han atraído un interés considerable, ya que pueden liberar iones de Mn2+ que promueven la maduración de las células dendríticas (CD) y mejoran la presentación de antígenos, al tiempo que administran antígenos tumorales [^[39],^[40]].

Teniendo esto en cuenta, desarrollamos una nanovacuna oral (HML@HN) basada en dióxido de manganeso hueco (HM) cargado con LCT y recubierto secuencialmente con norepinefrina (NE) y ácido hialurónico (AH) para lograr una focalización colorrectal eficiente y una inmunoterapia robusta, como se ilustra en el Esquema 1. Tras la administración oral, la nanovacuna se adhiere eficazmente a la mucosa del colon, facilitada por los grupos catecol mucoadhesivos de la NE y las propiedades de focalización tumoral del AH, lo que permite una retención localizada y sostenida. Tras la internalización por las células tumorales, la estructura hueca de MnO2 responde a la alta concentración de glutatión (GSH) en el citoplasma, liberando iones de Mn2+ y catalizando la conversión de H2O2 endógeno en radicales ·OH citotóxicos. Al mismo tiempo, el LCT cargado, que contiene 5-FU derivado del lisado, ejerce efectos quimioterapéuticos adicionales, lo que en conjunto induce una robusta apoptosis de las células tumorales. Los restos tumorales resultantes son capturados por las CD en el sistema inmunitario intestinal, mientras que el Mn2+ liberado promueve la activación de las CD, superando la tolerancia inmunitaria local, promoviendo la maduración de las CD y, en última instancia, impulsando una potente respuesta inmunitaria antitumoral específica contra el cáncer colorrectal.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de HML@HN

Inicialmente, se sintetizaron nanopartículas de HM con un diámetro de aproximadamente 70 nm siguiendo un método descrito previamente (Fig. 1a). Después de cargar con LCT, la molécula adhesiva NE y la molécula de focalización tumoral AH se modificaron en la superficie mediante sonicación, formando HML@HN. Para confirmar la construcción exitosa, las nanopartículas se caracterizaron desde múltiples perspectivas. En primer lugar, caracterizamos las propiedades de la superficie, que incluyen principalmente la morfología de la superficie y el potencial eléctrico. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (MET) revelaron que las nanopartículas de HML@HN preparadas exhibieron una distribución uniforme del tamaño con un diámetro promedio de alrededor de 75 nm (Fig. 1b y c). Además, el análisis del potencial zeta demostró que HML@HN presentaba una carga superficial negativa de −22,05 mV (Fig. 1d). En segundo lugar, investigamos la composición elemental y el estado de valencia de los elementos principales en HML@HN. Los resultados de la espectroscopía de dispersión de rayos X de energía (EDS) mostraron la presencia de elementos del HM (manganeso y oxígeno), LCT (carbono, oxígeno, nitrógeno, fósforo y flúor), NE y AH (carbono, oxígeno y nitrógeno), lo que confirmó la construcción exitosa de HML@HN. Esto también fue evidente a partir del análisis del espectro, que consistentemente exhibió los elementos de carbono, manganeso, nitrógeno, oxígeno, flúor y fósforo (Fig. 1e, f y Tabla S1). Posteriormente, realizamos un análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) para evaluar el estado de valencia del manganeso. Los resultados en la Fig. 1g y h mostraron que el elemento manganeso estaba presente en el estado tetravalente, lo que destaca el potencial de generar especies reactivas de oxígeno (ERO) con H2O2 después de ser reducido por el GSH reductor en las células tumorales. Para explorar esta propiedad, detectamos la capacidad de producción de ·OH en diferentes condiciones utilizando azul de metileno (MB) como sonda para eliminar ·OH. Como podemos ver en la Fig. 1i, los grupos de MB, MB + H2O2 + HM y MB + GSH + HM compartieron picos y absorbancia característicos similares, lo que indica la capacidad insignificante de generación de ·OH. En particular, cuando GSH y H2O2 estaban presentes simultáneamente, la absorbancia UV-vis de MB disminuyó notablemente y el color se atenuó (Fig. S1), lo que sugiere la capacidad eficiente de producción de ·OH.

El objetivo principal en el diseño de HML@HN fue establecer un depósito de vacuna eficaz dentro de la región colorrectal, siendo el principal desafío mantener su estabilidad a lo largo del tracto gastrointestinal, particularmente en las condiciones altamente ácidas del estómago, que es un obstáculo importante para la mayoría de los fármacos administrados por vía oral. Con este fin, la estabilidad de HML@HN en el entorno digestivo se evaluó incubando las formulaciones en fluido gástrico simulado (FGS) y fluido intestinal simulado (FIS). Como se muestra en la Fig. 1j y k, HML@HN retuvo su integridad estructural incluso después de 2 horas de exposición tanto al FGS como al FIS, lo que confirmó su robustez en condiciones gástricas e intestinales. Para una estimulación inmunitaria eficaz, los iones de Mn de la vacuna mucosa deben liberarse de forma sostenida dentro del intestino, al tiempo que se minimiza la liberación prematura en el estómago. En consecuencia, se investigó el perfil de liberación de HML@HN en FGS y FIS. Dado que el tiempo máximo de tránsito gástrico en humanos es de aproximadamente 2 horas, solo se liberó alrededor del 18% de los iones de Mn después de 2 horas en FGS (Fig. 1l), lo que indica la ausencia de una liberación rápida en el estómago. En contraste, una vez que HML@HN llegó al entorno intestinal, los iones de Mn restantes se liberaron gradualmente, con más del 80% liberado en 48 horas (Fig. 1m). En conjunto, este perfil de liberación garantiza la eficacia inmunostimulante sostenida de la vacuna.

Análisis in vitro de endocitosis, citotoxicidad y activación inmunitaria

Tras la construcción exitosa de la nanovacuna HML@HN, evaluamos sistemáticamente su modo de acción y eficacia terapéutica a nivel celular. Para lograr un enriquecimiento eficaz tanto en los tejidos intestinales como en los tumorales, la superficie de las nanopartículas se funcionalizó con NE y AH, que se diseñaron para mejorar la focalización tanto a nivel tisular como celular. En concreto, se sabe que los receptores CD44 se expresan en gran medida en la superficie de las células de cáncer colorrectal, y el AH puede unirse específicamente a CD44 [^[41]], lo que facilita la captación celular activa y permite la administración dirigida. Con este fin, primero evaluamos la eficiencia de endocitosis de las nanopartículas en las células CT26 utilizando microscopía confocal y citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 2a-c, se observaron aumentos dependientes del tiempo en la captación intracelular en los grupos de tratamiento con HML@NE y HML@HN. En particular, el grupo HML@HN exhibió una internalización significativamente mayor en comparación con el grupo HML@NE, lo que confirmó el papel fundamental de la modificación con AH para mejorar la capacidad de focalización hacia las células de cáncer colorrectal. Para dilucidar el mecanismo de endocitosis subyacente, HML@HN se co-incubó con células CT26 en presencia de varios inhibidores de la endocitosis, incluidos la clorpromazina, la citocalasina D, la nistatina y la genisteína. Los resultados demostraron que la eficiencia de la internalización se redujo notablemente tras el tratamiento con clorpromazina y a 4 °C, lo que indica que la vía de endocitosis de HML@HN es principalmente a través de la endocitosis mediada por clatrina (Fig. 2d).

Tras la internalización, la capacidad de HML@HN para generar ERO es un determinante crítico de su actividad citotóxica. Sin embargo, las altas concentraciones intracelulares de GSH pueden reducir la citotoxicidad al eliminar las ERO. Para investigar el efecto de HML@HN sobre el GSH, el resultado de la citometría de flujo demostró que HML@HN podría consumir eficazmente el GSH después de tratar las células CT26 con diferentes concentraciones de HML@HN (Fig. S2). Además, se evaluó la producción de ERO utilizando una sonda fluorescente tras la incubación de diferentes formulaciones con células CT26. La imagen de fluorescencia reveló señales de ERO detectables en los grupos HM, HML, HML@NE y HML@HN, lo que confirmó la generación eficiente de ERO mediada por HM. Entre estos, el grupo HML@HN exhibió la producción de ERO más pronunciada, lo que subraya su eficacia superior en la terapia quimiodinámica (TQD) (Fig. 2e). Habiendo confirmado la captación celular eficiente y la generación de ERO, evaluamos a continuación la citotoxicidad in vitro de HM, HML, HML@NE y HML@HN contra las células CT26 utilizando el ensayo CCK-8. Como se ilustra en la Fig. 2f, la viabilidad celular disminuyó de forma dependiente de la concentración en todos los grupos de tratamiento, siendo HML@HN el que demostró el efecto citotóxico más potente. Este hallazgo fue corroborado aún más por el análisis citométrico de flujo de la apoptosis utilizando la tinción con Annexin V-FITC/PI, que confirmó de forma consistente que HML@HN indujo la tasa más alta de apoptosis de las células tumorales (Fig. 2g y Fig. S3).

Tras establecer la potente citotoxicidad de HML@HN contra las células CT26, investigamos a continuación su capacidad para iniciar la inmunidad antitumoral a nivel inferior. De acuerdo con nuestro diseño inicial, la acción concertada del CDT mediado por Mn2+ y el agente quimioterapéutico 5-FU, derivado del TCL cargado, mata eficazmente las células tumorales, lo que conduce a la liberación de patrones moleculares asociados al daño (DAMP). Por ejemplo, la calreticulina (CRT) es un miembro importante de los DAMP, que se expone en la superficie de la membrana celular durante la muerte celular inmunogénica, enviando una señal de "cómemelo" que promueve la maduración de las células dendríticas (DCs). Como se muestra en la Fig. S4, las células CT26 tratadas con HML@HN exhibieron la intensidad de fluorescencia de CRT más alta, lo que indica que el grupo HML@HN fue capaz de inducir eficazmente los DAMP. Concurrentemente, el Mn2+ liberado del HM fue capaz de activar la vía de señalización cGAS-STING en las DCs (Fig. S5), orquestando así una potente respuesta inmune. Además, tras la salida del endosoma, el TCL puede liberarse extracelularmente, contribuyendo aún más a la activación de las DCs. Basándonos en esta premisa, evaluamos la capacidad de HML@HN para activar las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDCs) utilizando un sistema de cocultivo Transwell. Como se muestra en la Fig. 2h e i y en la Fig. S6, después de 24 horas de cocultivo con células CT26 pretratadas con varias formulaciones, la maduración de las DCs se mejoró progresivamente en el orden de control, HM, HML, HML@NE y grupos HML@HN. Estos resultados demuestran colectivamente que HML@HN exhibe una capacidad superior para activar las DCs, lo que subraya su potencial como una nanovacuna oral multifuncional capaz de matar directamente las células tumorales y activar una respuesta inmune robusta.

Biosseguridad y biodistribución in vivo de HML@HN

Tras evaluar sistemáticamente el modo de acción, la citotoxicidad y la activación inmune de HML@HN a nivel celular, realizamos a continuación una serie de investigaciones in vivo. Primero, evaluamos el perfil de biosseguridad de la nanovacuna tras la administración oral. Específicamente, se recogieron muestras de sangre para realizar análisis hematológicos y bioquímicos del suero de rutina. Como se muestra en la Fig. 3a, no se observaron cambios significativos en los niveles de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC), hemoglobina (HGB) o plaquetas (PLT), lo que indica una favorable compatibilidad hematológica. Además, los marcadores que reflejan la función hepática y renal, incluido el aspartato aminotransferasa (ALT), la fosfatasa alcalina (ALP), la urea nitrogenada en sangre (BUN) y la creatinina (CR), se mantuvieron dentro de los rangos normales (Fig. 3b). Además de la seguridad hematológica, el análisis histopatológico mediante tinción con H&E no reveló daños evidentes en los principales órganos de los ratones tratados (Fig. 3c), lo que confirmó colectivamente el favorable perfil de biosseguridad de HML@HN.

Tras establecer su biocompatibilidad, evaluamos a continuación la biodistribución in vivo de HML@HN en un modelo murino de cáncer colorrectal utilizando un sistema de imagenología in vivo de animales pequeños. Para mejorar la retención intestinal, la superficie de las nanopartículas se funcionalizó con NE, que se somete a autooxidación para formar una película protectora de poli-NE que protege el nanocargador de los ataques ambientales externos. Además, los grupos catecolamina de NE, conocidos por sus fuertes propiedades adhesivas en las proteínas del pie de mejillón, dotan al nanocargador de una robusta adhesión a la mucosa [^[42],^[43]], prolongando así la retención intestinal sin comprometer su integridad funcional. En comparación con los ratones tratados con tinte DiR libre, el grupo HML@NE exhibió una retención intestinal significativamente mayor y más sostenida. Notablemente, el grupo HML@HN, que incorporó la modificación con HA, demostró una retención aún mayor, con señales de fluorescencia detectables hasta 24 horas después de la administración, lo que subraya el papel fundamental de HA en la mejora del direccionamiento al tumor colorrectal. En concordancia con estos hallazgos, la imagenología ex vivo de los tejidos recogidos confirmó que HML@HN logró la mayor acumulación de fluorescencia en los tejidos tumorales intestinales a las 24 horas después de la administración oral, lo que validó aún más su capacidad de direccionamiento superior (Fig. 3d-f). En conjunto, estos resultados demuestran que HML@HN exhibe una biosseguridad favorable y logra una retención intestinal sostenida con una mayor acumulación específica del tumor a través de los efectos sinérgicos de la mucoadhesión mediada por NE y el direccionamiento activo mediado por HA.

Eficacia antitumoral in vivo de HML@HN en un modelo ortotópico de cáncer colorrectal

Tras establecer el perfil de biosseguridad favorable y la capacidad de direccionamiento tumoral de HML@HN, evaluamos sistemáticamente su potencial terapéutico como una vacuna contra el cáncer oral en un modelo de ratón de cáncer colorrectal ortotópico. Con este fin, se estableció un modelo de cáncer colorrectal ortotópico CT26-luc, y los ratones recibieron por vía oral PBS, HM, HML, HML@NE o HML@HN de acuerdo con el programa de tratamiento que se muestra en la Fig. 4a. La progresión tumoral se monitorizó dinámicamente mediante imagenología de bioluminiscencia en los puntos de tiempo indicados (Fig. 4b). El grupo de control exhibió un rápido crecimiento tumoral, como lo demuestra el aumento progresivo de las señales de bioluminiscencia, lo que confirmó el establecimiento exitoso del modelo ortotópico. El grupo HM mostró solo una actividad antitumoral marginal, lo que refleja la eficacia limitada del portador de dióxido de manganeso solo. En contraste, el grupo HML@NE demostró resultados terapéuticos significativamente mejorados, con una supresión sustancial de la intensidad de la bioluminiscencia en el día 12, un efecto atribuido principalmente a la prolongada retención intestinal conferida por la modificación con NE. Notablemente, el grupo HML@HN logró la inhibición tumoral más pronunciada entre todos los grupos de tratamiento, lo que subraya el papel fundamental de HA en la facilitación del direccionamiento específico del tumor (Fig. 4c). Durante todo el período de tratamiento, el peso corporal se mantuvo estable en todos los grupos, lo que proporciona una sólida evidencia del favorable perfil de biosseguridad in vivo de HML@HN (Fig. 4d). El día 15, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos tumorales para la evaluación directa de la eficacia antitumoral. La carga tumoral siguió un orden descendente en los grupos de tratamiento, con el grupo PBS que exhibió el mayor tamaño tumoral, seguido secuencialmente por los grupos HM, HML, HML@NE y HML@HN (Fig. 4e). Estos resultados corroboran aún más el rendimiento antitumoral superior de HML@HN. Para obtener una comprensión más profunda del mecanismo subyacente, las secciones tumorales de cada grupo se sometieron a tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y a un ensayo de tinción con desoxinucleotidil transferasa dUTP (TUNEL). Como se muestra en la Fig. 4f y g, el grupo HML@HN exhibió la tasa más alta de apoptosis de las células tumorales, lo que confirmó su excepcional eficacia antitumoral. En conjunto, estos resultados demuestran que HML@HN logra una potente actividad antitumoral en un modelo de cáncer colorrectal ortotópico a través de los efectos sinérgicos, lo que lo posiciona como una prometedora vacuna nanotecnológica oral para la inmunoterapia del cáncer colorrectal.

Efectos de la activación inmune de HML@HN in vivo

Basándonos en la excepcional eficacia antitumoral de HML@HN demostrada in vivo, buscamos a continuación dilucidar sus mecanismos de activación inmune subyacentes. El efecto terapéutico de HML@HN se atribuye a una combinación sinérgica de tres factores contribuyentes: el CDT mediado por Mn2+, la acción quimioterapéutica del 5-FU derivado del TCL cargado y, lo que es importante, la inducción de una robusta respuesta inmune antitumoral. Para investigar los mecanismos inmunes, se estableció un modelo de cáncer colorrectal ortotópico en ratones, y los ratones se sometieron a varios tratamientos, incluidos PBS, HM, HML, HML@NE y HML@HN, seguidos de análisis de citometría de flujo y tinción de inmunofluorescencia.

Primero, examinamos el estado de activación de las células presentadoras de antígenos, incluidas las DCs y los macrófagos. Coherente con los resultados de la activación de DCs in vitro, el tratamiento con HML@HN indujo la proporción más alta de DCs maduras, alcanzando el 48,4%, lo que demuestra su potente capacidad para estimular la presentación de antígenos (Fig. 5a). Con respecto a la polarización de los macrófagos, el tratamiento con HML@HN resultó en un aumento marcado de la proporción de macrófagos de tipo M1 (F4/80+CD86+) hasta el 49,1%, aproximadamente tres veces más que el observado en el grupo de control (Fig. 5b). En consecuencia, la proporción de macrófagos de tipo M2 (F4/80+CD206+) disminuyó a 19,9%, lo que representa una reducción de 2,5 veces en comparación con el grupo de control (Fig. 5c). Tras establecer la activación eficaz de las células presentadoras de antígenos, analizamos a continuación el impacto en las poblaciones de linfocitos T. El análisis de citometría de flujo reveló que el grupo tratado con HML@HN exhibió proporciones significativamente mayores de células T CD8+ (CD8+CD3+) y células T CD4+ (CD4+CD3+) en comparación con los otros grupos de tratamiento (Fig. 5d y e), mientras que mostró proporciones más bajas de células T reguladoras (FOXP3+CD25+CD45+CD4+CD3+), lo que refleja una robusta activación de las respuestas inmunes adaptativas (Fig. 5f). Estos hallazgos fueron corroborados aún más por la tinción de inmunofluorescencia, que confirmó un aumento sustancial de la infiltración de células T CD4+ y CD8+ en el grupo HML@HN (Fig. 5g). Además, la variación de las células T CD8+ y las células T CD4+ en el bazo después del tratamiento con HML@HN demostró aún más la mejora del sistema inmune adaptativo (Fig. S7). En conjunto, estos resultados demuestran que HML@HN orquesta eficazmente una respuesta inmune antitumoral multifacética al promover la maduración de las DCs, reprogramar los macrófagos hacia el fenotipo M1 proinflamatorio y mejorar la infiltración de las células T efectoras en el microambiente tumoral.

Preparación y caracterización de HML@HN

Inicialmente, se sintetizaron nanopartículas de HM con un diámetro de aproximadamente 70 nm siguiendo un método previamente publicado (Fig. 1a). Después de cargar con TCL, la molécula adhesiva NE y la molécula de direccionamiento tumoral HA se modificaron en la superficie mediante sonicación y se formó HML@HN. Para confirmar el éxito de la construcción, las nanopartículas se caracterizaron desde múltiples perspectivas. En primer lugar, caracterizamos las propiedades de la superficie, que incluyen principalmente la morfología de la superficie y el potencial eléctrico. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) revelaron que las nanopartículas de HML@HN preparadas exhibieron una distribución uniforme del tamaño con un diámetro promedio de alrededor de 75 nm (Fig. 1b y c). Además, el análisis del potencial zeta demostró que HML@HN presentaba una carga superficial negativa de -22,05 mV (Fig. 1d). En segundo lugar, investigamos la composición elemental y el estado de valencia de los elementos principales en HML@HN. Los resultados de la espectroscopía de dispersión de rayos X de energía (EDS) mostraron la presencia de elementos del HM (manganeso y oxígeno), TCL (carbono, oxígeno, nitrógeno, fósforo y flúor), NE y HA (carbono, oxígeno y nitrógeno), lo que confirmó el éxito de la construcción de HML@HN. Esto también fue evidente a partir del análisis del espectro, que mostró consistentemente los elementos de carbono, manganeso, nitrógeno, oxígeno, flúor y fósforo (Fig. 1e, f y Tabla S1). Posteriormente, realizamos un análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) para evaluar el estado de valencia del manganeso. Los resultados en la Fig. 1g y h mostraron que el elemento manganeso estaba presente en el estado tetravalente, lo que destaca el potencial de generar especies reactivas de oxígeno (ROS) con H2O2 después de ser reducido por el GSH reductor en las células tumorales. Para explorar esta propiedad, detectamos la capacidad de producción de ·OH en diferentes condiciones utilizando azul de metileno (MB) como sonda para eliminar ·OH. Como podemos ver en la Fig. 1i, los grupos de MB, MB + H2O2 + HM y MB + GSH + HM compartieron picos y absorbancia similares, lo que indica una capacidad insignificante de generación de ·OH. Notablemente, cuando GSH y H2O2 estaban presentes simultáneamente, la absorbancia UV-vis de MB disminuyó aparentemente y el color se desvaneció (Fig. S1), lo que sugiere la eficiente capacidad de producción de ·OH.

El objetivo principal en el diseño de HML@HN fue establecer un depósito de vacuna eficaz dentro de la región del cáncer colorrectal, siendo el principal desafío mantener su estabilidad a lo largo del tracto gastrointestinal, especialmente en las condiciones altamente ácidas del estómago, lo cual representa un obstáculo importante para la mayoría de los fármacos administrados por vía oral. Para este fin, se evaluó la estabilidad de HML@HN en el entorno digestivo incubando las formulaciones en fluido gástrico simulado (FGS) y fluido intestinal simulado (FIS). Como se muestra en las Figuras 1j y 1k, HML@HN conservó su integridad estructural incluso después de 2 horas de exposición tanto al FGS como al FIS, lo que confirma su robustez en condiciones gástricas e intestinales. Para una inmunostimulación eficaz, los iones de Mn de la vacuna mucosa deben liberarse de forma sostenida en el intestino, minimizando al mismo tiempo la liberación prematura en el estómago. En consecuencia, se investigó el perfil de liberación de HML@HN en FGS y FIS. Dado que el tiempo máximo de tránsito gástrico en humanos es de aproximadamente 2 horas, solo se liberó alrededor del 18% de los iones de Mn después de 2 horas en FGS (Figura 1l), lo que indica la ausencia de una liberación rápida en el estómago. En cambio, una vez que HML@HN llegó al entorno intestinal, los iones de Mn restantes se liberaron gradualmente, con más del 80% liberado en 48 horas (Figura 1m). En conjunto, este perfil de liberación garantiza la eficacia inmunostimulante sostenida de la vacuna.

Análisis in vitro de endocitosis, citotoxicidad y activación inmune

Tras la construcción exitosa de la nanovacuna HML@HN, evaluamos sistemáticamente su modo de acción y eficacia terapéutica a nivel celular. Para lograr un enriquecimiento eficiente tanto en los tejidos intestinales como en los tumorales, la superficie de las nanopartículas se funcionalizó con NE y HA, diseñadas para mejorar la focalización a nivel tisular y celular. Específicamente, se sabe que los receptores CD44 se expresan en gran medida en la superficie de las células del cáncer colorrectal, y la HA puede unirse específicamente a CD44 [^[41]], facilitando así la captación celular activa y permitiendo la administración dirigida. Con este fin, primero evaluamos la eficiencia de endocitosis de las nanopartículas en las células CT26 utilizando microscopía confocal y citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 2a-c, se observaron aumentos dependientes del tiempo en la captación intracelular tanto en los grupos de tratamiento con HML@NE como con HML@HN. En particular, el grupo HML@HN exhibió una internalización significativamente mayor en comparación con el grupo HML@NE, lo que confirma el papel fundamental de la modificación con HA en la mejora de la capacidad de focalización hacia las células del cáncer colorrectal. Para dilucidar el mecanismo de endocitosis subyacente, HML@HN se co-incubó con células CT26 en presencia de varios inhibidores de la endocitosis, incluidos la clorpromazina, la citocalasina D, la nistatina y la genisteína. Los resultados demostraron que la eficiencia de la internalización se redujo notablemente tras el tratamiento con clorpromazina y a 4 °C, lo que indica que la vía de endocitosis de HML@HN se produce principalmente mediante endocitosis mediada por clatrina (Figura 2d).

Tras la internalización, la capacidad de HML@HN para generar ROS es un determinante crítico de su actividad citotóxica. Sin embargo, las altas concentraciones intracelulares de GSH pueden reducir la citotoxicidad al eliminar los ROS. Para investigar el efecto de HML@HN sobre el GSH, el resultado de la citometría de flujo demostró que HML@HN podía consumir eficazmente el GSH después de tratar las células CT26 con diferentes concentraciones de HML@HN (Figura S2). Además, se evaluó la producción de ROS utilizando una sonda fluorescente tras la incubación de diferentes formulaciones con células CT26. La imagen de fluorescencia reveló señales de ROS detectables en los grupos HM, HML, HML@NE y HML@HN, lo que confirmó la generación eficiente de ROS mediada por HM. Entre estos, el grupo HML@HN exhibió la producción de ROS más pronunciada, lo que subraya su eficacia superior en la terapia quimiodinámica (CDT) (Figura 2e). Tras confirmar la captación celular eficiente y la generación de ROS, evaluamos a continuación la citotoxicidad in vitro de HM, HML, HML@NE y HML@HN contra las células CT26 utilizando el ensayo CCK-8. Como se ilustra en la Figura 2f, la viabilidad celular disminuyó de forma dependiente de la concentración en todos los grupos de tratamiento, siendo HML@HN el que demostró el efecto citotóxico más potente. Este hallazgo fue corroborado aún más por el análisis citométrico de flujo de la apoptosis utilizando la tinción con Annexin V-FITC/PI, que confirmó de forma consistente que HML@HN indujo la tasa más alta de apoptosis de las células tumorales (Figura 2g y Figura S3).

Tras establecer la potente citotoxicidad de HML@HN contra las células CT26, investigamos a continuación su capacidad para iniciar la inmunidad antitumoral descendente. De acuerdo con nuestro diseño inicial, la acción concertada de la CDT mediada por Mn2+ y el agente quimioterapéutico 5-FU, derivado del TCL cargado, mata eficazmente las células tumorales, lo que conduce a la liberación de patrones moleculares asociados al daño (DAMP). Por ejemplo, la calreticulina (CRT) es un miembro importante de los DAMP, que se expone en la superficie de la membrana celular durante la muerte celular inmunogénica, enviando una señal de "cómeme" que promueve la maduración de las células dendríticas (DC). Como se muestra en la Figura S4, las células CT26 tratadas con HML@HN exhibieron la intensidad de fluorescencia de CRT más fuerte, lo que indica que el grupo HML@HN fue capaz de inducir eficazmente los DAMP. Concurrentemente, el Mn2+ liberado del HM fue capaz de activar la vía de señalización cGAS-STING en las DC (Figura S5), orquestando así una potente respuesta inmune. Además, tras la salida del endosoma, el TCL puede liberarse extracelularmente, lo que contribuye aún más a la activación de las DC. Basándonos en esta premisa, evaluamos la capacidad de HML@HN para activar las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) utilizando un sistema de cocultivo Transwell. Como se muestra en las Figuras 2h e i y en la Figura S6, después de 24 horas de cocultivo con células CT26 pretratadas con varias formulaciones, la maduración de las DC se mejoró progresivamente en el orden de control, HM, HML, HML@NE y grupos HML@HN. Estos resultados demuestran en conjunto que HML@HN exhibe una capacidad superior para activar las DC, lo que subraya su potencial como una nanovacuna oral multifuncional capaz de matar directamente el tumor y activar una respuesta inmune robusta.

Biosseguridad y biodistribución in vivo de HML@HN

Tras evaluar sistemáticamente el modo de acción, la citotoxicidad y la activación inmune de HML@HN a nivel celular, realizamos a continuación una serie de investigaciones in vivo. Primero, evaluamos el perfil de biosseguridad de la nanovacuna tras la administración oral. Específicamente, se recogieron muestras de sangre para realizar análisis hematológicos y bioquímicos séricos de rutina. Como se muestra en la Figura 3a, no se observaron cambios significativos en los niveles de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC), hemoglobina (HGB) o plaquetas (PLT), lo que indica una compatibilidad hematológica favorable. Además, los marcadores que reflejan la función hepática y renal, incluido el aspartato aminotransferasa (ALT), la fosfatasa alcalina (ALP), la urea en sangre (BUN) y la creatinina (CR), se mantuvieron dentro de los rangos normales (Figura 3b). Además de la seguridad hematológica, el análisis histopatológico mediante tinción con H&E no reveló daños evidentes en los órganos principales de los ratones tratados (Figura 3c), lo que confirmó en conjunto el perfil de biosseguridad favorable de HML@HN.

Tras establecer su biocompatibilidad, evaluamos a continuación la biodistribución in vivo de HML@HN en un modelo murino de cáncer colorrectal utilizando un sistema de imagen in vivo de animales pequeños. Para mejorar la retención intestinal, la superficie de las nanopartículas se funcionalizó con NE, que se somete a autooxidación para formar una película protectora de poli-NE que protege el nanocargador de los ataques del entorno externo. Además, los grupos catecolamina de NE, conocidos por sus fuertes propiedades adhesivas en las proteínas del pie de mejillón, dotan al nanocargador de una robusta adhesión a la mucosa [^[42],^[43]], prolongando así la retención intestinal sin comprometer su integridad funcional. En comparación con los ratones tratados con tinte DiR libre, el grupo HML@NE exhibió una retención intestinal significativamente mayor y más sostenida. En particular, el grupo HML@HN, que incorporó la modificación con HA, demostró una retención aún mayor, con señales de fluorescencia detectables hasta 24 horas después de la administración, lo que subraya el papel fundamental de HA en la mejora de la focalización del tumor colorrectal. De acuerdo con estos hallazgos, la imagen ex vivo de los tejidos cosechados confirmó que HML@HN logró la mayor acumulación de fluorescencia en los tejidos tumorales intestinales a las 24 horas después de la administración oral, lo que validó aún más su capacidad de focalización superior (Figuras 3d-f). En conjunto, estos resultados demuestran que HML@HN exhibe una biosseguridad favorable y logra una retención intestinal sostenida con una mayor acumulación tumoral específica a través de los efectos sinérgicos de la mucoadhesión mediada por NE y la focalización activa mediada por HA.

Eficacia antitumoral in vivo de HML@HN en un modelo ortotópico de cáncer colorrectal

Tras establecer el perfil de biosseguridad favorable y la capacidad de focalización tumoral de HML@HN, evaluamos sistemáticamente su potencial terapéutico como una vacuna contra el cáncer oral en un modelo de cáncer colorrectal ortotópico en ratones. Con este fin, se estableció un modelo de cáncer colorrectal ortotópico CT26-luc, y los ratones recibieron por vía oral PBS, HM, HML, HML@NE o HML@HN de acuerdo con el programa de tratamiento que se muestra en la Figura 4a. La progresión tumoral se monitorizó dinámicamente mediante imagen de bioluminiscencia en los puntos de tiempo indicados (Figura 4b). El grupo de control exhibió un rápido crecimiento tumoral, como lo evidenciaron las señales de bioluminiscencia progresivamente crecientes, lo que confirmó el establecimiento exitoso del modelo ortotópico. El grupo HM mostró solo una actividad antitumoral marginal, lo que refleja la eficacia limitada del portador de dióxido de manganeso solo. En cambio, el grupo HML@NE demostró resultados terapéuticos significativamente mejorados, con la intensidad de la bioluminiscencia suprimida sustancialmente en el día 12, un efecto atribuido principalmente a la prolongada retención intestinal conferida por la modificación con NE. En particular, el grupo HML@HN logró la inhibición tumoral más pronunciada entre todos los grupos de tratamiento, lo que subraya el papel fundamental de HA en la facilitación de la focalización tumoral específica (Figura 4c). Durante todo el período de tratamiento, el peso corporal se mantuvo estable en todos los grupos, lo que proporciona una sólida evidencia del perfil de biosseguridad in vivo favorable de HML@HN (Figura 4d). El día 15, se sacrificaron los ratones y se cosecharon los tejidos tumorales para una evaluación directa de la eficacia antitumoral. La carga tumoral siguió un orden descendente en los grupos de tratamiento, siendo el grupo PBS el que exhibió el mayor tamaño tumoral, seguido secuencialmente por los grupos HM, HML, HML@NE y HML@HN (Figura 4e). Estos resultados corroboran aún más el rendimiento antitumoral superior de HML@HN. Para obtener una comprensión más profunda del mecanismo subyacente, las secciones tumorales de cada grupo se sometieron a tinción con hematoxilina-eosina (H&E) y ensayo de tinción con desoxinucleotidil transferasa dUTP (TUNEL). Como se muestra en las Figuras 4f y 4g, el grupo HML@HN exhibió la tasa más alta de apoptosis de las células tumorales, lo que confirmó su excelente eficacia antitumoral. En conjunto, estos resultados demuestran que HML@HN logra una potente actividad antitumoral en un modelo de cáncer colorrectal ortotópico a través de los efectos sinérgicos, lo que lo posiciona como una prometedora vacuna nanoral contra el cáncer colorrectal.

Efectos de la activación inmune de HML@HN in vivo

Basándonos en la excelente eficacia antitumoral de HML@HN demostrada in vivo, buscamos a continuación dilucidar sus mecanismos de activación inmune subyacentes. El efecto terapéutico de HML@HN se atribuye a una combinación sinérgica de tres factores contribuyentes: la CDT mediada por Mn2+, la acción quimioterapéutica del 5-FU derivado del TCL cargado y, lo que es importante, la inducción de una robusta respuesta inmune antitumoral. Para investigar los mecanismos inmunes, se estableció un modelo de cáncer colorrectal ortotópico en ratones, y los ratones se sometieron a varios tratamientos, incluidos PBS, HM, HML, HML@NE y HML@HN, seguidos de análisis de citometría de flujo y tinción de inmunofluorescencia.

Inicialmente, examinamos el estado de activación de las células presentadoras de antígenos, incluidos las células dendríticas (DCs) y los macrófagos. En consonancia con los resultados de la activación de DCs in vitro, el tratamiento con HML@HN indujo la mayor proporción de DCs maduras, alcanzando el 48,4%, lo que demuestra su potente capacidad para estimular la presentación de antígenos (Fig. 5a). En relación con la polarización de los macrófagos, el tratamiento con HML@HN resultó en un aumento marcado en la proporción de macrófagos de tipo M1 (F4/80+CD86+) hasta el 49,1%, aproximadamente tres veces más que lo observado en el grupo de control (Fig. 5b). En consecuencia, la proporción de macrófagos de tipo M2 (F4/80+CD206+) disminuyó a 19,9%, lo que representa una reducción de 2,5 veces en comparación con el grupo de control (Fig. 5c). Una vez que se estableció la activación efectiva de las células presentadoras de antígenos, analizamos a continuación el impacto sobre las poblaciones de linfocitos T. El análisis citométrico de flujo reveló que el grupo tratado con HML@HN exhibió proporciones significativamente mayores de células T CD8+ (CD8+CD3+) y células T CD4+ (CD4+CD3+) en comparación con los otros grupos de tratamiento (Fig. 5d y e), mientras que mostró proporciones más bajas de células Treg (FOXP3+CD25+CD45+CD4+CD3+), lo que refleja una activación robusta de las respuestas inmunitarias adaptativas (Fig. 5f). Estos hallazgos fueron corroborados aún más por la tinción de inmunofluorescencia, que confirmó un aumento sustancial en la infiltración de células T CD4+ y CD8+ en el grupo HML@HN (Fig. 5g). Además, la variación de las células T CD8+ y las células T CD4+ en el bazo después del tratamiento con HML@HN demostró aún más la mejora del sistema inmunitario adaptativo (Fig. S7). En conjunto, estos resultados demuestran que HML@HN orquesta eficazmente una respuesta inmunitaria antitumoral multifacética al promover la maduración de las DCs, reprogramar los macrófagos hacia el fenotipo M1 proinflamatorio y mejorar la infiltración de células T efectoras en el microambiente tumoral.

Conclusiones

En resumen, hemos desarrollado un sistema de administración oral de nanovacunas (HML@HN) que integra protección gástrica, adhesión intestinal, administración tumoral específica y una robusta activación inmunitaria para la inmunoterapia del cáncer colorrectal. El sistema se construyó cargando TCL que contiene 5-FU en HM y recubriéndolo conjuntamente con NE y HA. Este diseño racional aborda los principales desafíos en el desarrollo de vacunas orales, ya que el recubrimiento de NE proporciona una doble funcionalidad al proteger la nanovacuna de la degradación gástrica y, al mismo tiempo, confiere fuertes propiedades mucoadhesivas para una retención intestinal prolongada, la modificación de HA permite la focalización tumoral activa a través de la endocitosis mediada por CD44 y la TCL sirve como fuente de antígenos tumorales de células completas para provocar una potente inmunidad antitumoral. Tras la internalización por las células tumorales, el núcleo de HM responde a la alta concentración de glutatión en el microambiente tumoral, lo que desencadena la liberación sostenida de Mn2+ y la generación de ROS para la CDT. Este proceso, en combinación con el efecto quimioterapéutico del 5-FU derivado de la TCL cargada, induce DAMPs y mejora la inmunogenicidad tumoral. Concurrentemente, el Mn2+ liberado promueve la maduración de las DCs, estableciendo un puente entre las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. En un modelo de ratón con CRC ortotópico, la administración oral de HML@HN suprimió significativamente el crecimiento tumoral, remodeló el microambiente tumoral inmunosupresor y provocó una robusta inmunidad antitumoral con una excelente bioseguridad.

Las nanovacunas tumorales representan una prometedora tecnología de vanguardia en el campo de la inmunoterapia, que ofrece estrategias innovadoras para superar los desafíos tradicionales en el tratamiento del cáncer. En comparación con las estrategias de tratamiento clínico existentes, las nanovacunas tumorales pueden inducir respuestas inmunitarias específicas contra los antígenos tumorales y exhibir una eficacia potencial en la mejora de la capacidad antitumoral del sistema inmunitario. Para la aplicación clínica de la nanovacuna HML@HN desarrollada en este estudio, los siguientes aspectos merecen una mayor investigación. En primer lugar, el mecanismo molecular por el cual el Mn2+ media la activación de las DCs en el microambiente intestinal requiere una exploración más profunda, en particular su interacción con otras vías inmunitarias innatas. En segundo lugar, la combinación de HML@HN con inhibidores de puntos de control inmunitario representa una estrategia prometedora para mejorar aún más la eficacia terapéutica. A continuación, desde una perspectiva de la medicina traslacional, los problemas como la producción a gran escala, la estabilidad del almacenamiento a largo plazo y la consistencia entre lotes deben evaluarse sistemáticamente. Además, considerando la vía de administración oral, la interacción entre la nanovacuna y la microbiota intestinal es una dirección de investigación intrigante que puede revelar nuevos mecanismos subyacentes a sus efectos antitumorales. Con los continuos avances en inmunología y ciencia de los materiales, así como con una colaboración más profunda entre estas dos disciplinas, se espera que el desarrollo de nanovacunas contra el cáncer de próxima generación se acelere significativamente.

Materiales y métodos

Reactivo

Hexanol, ciclohexano, solución de amoníaco, tetraetilsilicato (TEOS), permanganato de potasio (KMnO4), carbonato de sodio (Na2CO3) y etanol se compraron a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (Shanghái, China). El 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) se compró a Sigma Aldrich (EE. UU.). El ácido hialurónico (HA) se compró a Macklin Biochemical Co., Ltd (Shanghái, China). La norepinefrina (NE) se obtuvo de MedChemExpress LLC (EE. UU.). El 5-fluorouracilo (5-FU) se compró a Selleck Chemicals LLC (EE. UU.). El suero fetal bovino (FBS) se compró a PAN-Biotech GmbH (Alemania). El medio RPMI 1640 se compró a Gibco Life Sciences (EE. UU.). La penicilina-estreptomicina-anfotericina B se compró a M&C Gene Technology Ltd (Pekín, China). El kit de apoptosis Annexin V-FITC/PI y la 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se compraron a Keygen Biotech Co., Ltd (Nanjing, China). El kit de recuento de células CCK-8 y la sal de D-luciferina de potasio se compraron a TargetMol Chemicals Inc (EE. UU.). La solución de Triton X-100 (10%, estéril), el rastreador de actina verde, el kit de ensayo de ROS y la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de 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la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de la matriz de membrana de

La captación celular de HML@HN por la línea celular de cáncer de colon de ratón (CT26) se observó mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM) y se analizó cuantitativamente mediante citometría de flujo. Primero, las células se sembraron en cada pocillo de placas de 12 pocillos a una densidad de 8 × 104 células por pocillo y se incubaron durante la noche sobre portaobjetos circulares de vidrio estéril para permitir la adhesión. Luego, se añadió HML@NE y HML@HN marcados con Cy3 a cada pocillo, respectivamente, y se incubaron durante 6 h. Posteriormente, el citoesqueleto y los núcleos se tiñeron con Actin-Tracker Green-488 y DAPI para su visualización. Para el análisis cuantitativo mediante citometría de flujo, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células por pocillo y se incubaron durante la noche. Se añadió HML@NE y HML@HN marcados con Cy3 a cada pocillo, respectivamente, y se incubaron durante 1, 3 y 6 h. Las células sin ningún tratamiento se utilizaron como control negativo. Luego, se recogieron las células de cada grupo de tratamiento y se cuantificaron mediante análisis de citometría de flujo.

Detección de ROS intracelulares

Las células CT26 se sembraron en placas de microscopía confocal (1 × 105 células por placa) durante 24 h de incubación. Las células se trataron con diferentes grupos durante 6 h: PBS (control), HM, HML, HML@NE y HML@HN (50 μg/mL). Después de desechar la solución de tratamiento, las células se incubaron con DCFH-DA durante 20 min a 37 °C. Luego, las células tratadas se lavaron suavemente con PBS tres veces. Finalmente, se registró la fluorescencia de ROS mediante un microscopio de fluorescencia.

Ensayo de viabilidad celular

Las células CT26 se sembraron en una placa de 96 pocillos (5 × 103 células por pocillo) y se incubaron durante 12 h para permitir la adhesión celular. Luego, se desechó el sobrenadante y se añadió medio de cultivo fresco que contenía diferentes concentraciones de diversas nanomedicinas (HM, HML, HML@NE y HML@HN). El tratamiento con PBS sirvió como grupo de control. Después de 24 h de incubación, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron con tampón PBS. Posteriormente, se añadió la solución de CCK-8 diluida y se mezcló a fondo, seguida de la incubación en un incubador a 37 °C durante 2 h. Finalmente, se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas para calcular la viabilidad celular.

Detección de CRT

Las células CT26 se sembraron en placas de microscopía confocal (1 × 105 células por placa) y se incubaron durante 12 h. En primer lugar, las células se trataron con PBS (control), HM, HML, HML@NE y HML@HN durante 12 h, respectivamente. Posteriormente, las células CT26 se fijaron con paraformaldehído durante 30 min, se permeabilizaron con 0,5% de Triton X-100 durante 10 min y, a continuación, se bloquearon con 5% de BSA (preparado en 0,5% de Triton X-100) para la dilución del anticuerpo primario (anti-CRT), seguida de la incubación a 4 °C durante la noche. Luego, las células CT26 se incubaron con el anticuerpo secundario diluido a 37 °C durante 1 h. Los núcleos se tiñeron con DAPI a temperatura ambiente durante 30 min. Después de cada paso, las células se lavaron dos veces con PBS. Finalmente, se capturó la fluorescencia de CRT utilizando un sistema de imagen confocal.

Análisis de apoptosis celular

Las células CT26 se sembraron en una placa de 6 pocillos (1 × 105 células por pocillo) durante 24 h de incubación. Luego, las células se trataron durante 12 h de la siguiente manera: PBS (control), HM, HML, HML@NE y HML@HN (50 μg/mL). Posteriormente, las células se recogieron y se tiñeron con una mezcla de PI y Annexin V-FITC durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, las células se analizaron mediante citometría de flujo.

Maduración y activación de células dendríticas (DCs)

En primer lugar, los fémures y las tibias se aislaron asépticamente del ratón y, a continuación, se lavó la cavidad del hueso para obtener células de la cavidad del hueso. En segundo lugar, las células de la cavidad del hueso se sometieron a lisis de glóbulos rojos y se preparó una suspensión de células individuales. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía 10% de FBS y se suplementaron con 20 ng/mL de GM-CSF y 10 ng/mL de IL-4 para la inducción. El medio de cultivo se cambió a la mitad y se reponieron los citocinas en los días 3 y 5-6 del cultivo. Posteriormente, las DCs inmaduras se recogieron entre los días 6 y 7 para construir un modelo Transwell con células CT26. Las células CT26 en las cámaras superiores se trataron con diferentes grupos: PBS (control), HM, HML, HML@NE y HML@HN (50 μg/mL). Después de 12 h, las DCs en la cámara inferior se recogieron y se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia contra CD11c (APC), CD80 (FITC) y CD86 (PE). Finalmente, se analizaron la maduración y la activación de las DCs mediante citometría de flujo.

Estudio de seguridad in vivo

La seguridad in vivo de HML@HN se evaluó en ratones sanos (n = 3). La formulación se administró por vía oral cada dos días (5 mg/kg), lo que era consistente con las dosis en el análisis de eficacia antitumoral. Después de la administración final, se recogió sangre total para el análisis hematológico y se recogieron muestras de suero para evaluar la función hepática (alanina aminotransferasa (ALT) y fosfatasa alcalina (ALP)) y la función renal (nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina (CR)). Además, se recogieron los principales órganos, incluido el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones, el estómago, el intestino delgado y el ciego, para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) con el fin de evaluar posibles daños tisulares. Los ratones sanos sirvieron como grupo de control.

Biodistribución in vivo de HML@HN

Se estableció un modelo de tumor de colon ortotópico CT26-luc en ratones para evaluar la progresión del tumor utilizando un sistema de imagen tridimensional in vivo de animales pequeños IVIS Spectrum CT. En resumen, se anestesiaron ratones hembra BALB/c (5 semanas de edad) con isoflurano y se colocaron en un entorno estéril. Se realizó una pequeña incisión en el abdomen para exponer el ciego, y se inyectó una suspensión de células CT26-luc mezcladas con Matrigel en una proporción de 1:1 (1 × 106 células por ratón) en la pared del ciego utilizando una microseringa de 31G. Los ratones se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano durante todo el procedimiento. Cinco días después de la inoculación de células CT26-luc, se administró D-Luciferina potásica por vía intraperitoneal y se evaluó el crecimiento del tumor colorrectal utilizando el sistema de imagen IVIS.

La capacidad de acumulación intestinal de DiR, HML@NE y HML@HN se observó utilizando el sistema de imagen IVIS. Después de confirmar el establecimiento exitoso del tumor mediante imagen in vivo, se administró por vía oral DiR libre, HML@NE marcado con DiR y HML@HN marcado con DiR a ratones con tumor de colon a una dosis de DiR (0,5 mg/kg). En varios puntos temporales, se anestesiaron los ratones con isoflurano y se registró la señal fluorescente roja en cada grupo utilizando el sistema de imagen IVIS. 24 h después de la administración oral, se disecaron los ratones y se recogieron los principales órganos, incluido el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y el tumor, para su imagen.

Análisis de eficacia antitumoral in vivo

Los ratones con tumores de colon ortotópicos CT26-luc se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (n = 6 por grupo). Los grupos 1 a 5 recibieron por vía oral PBS, HM, HML, HML@NE o HML@HN (5 mg/kg), respectivamente, en los días 1, 3, 5, 7 y 9, con un período de tratamiento total de 15 días. Se registró el peso corporal cada tres días y se evaluó el crecimiento del tumor cada seis días utilizando un sistema de imagen in vivo. Se inyectó D-Luciferina potásica (150 mg/kg) por vía intraperitoneal en los ratones y se realizó una imagen de bioluminiscencia utilizando el sistema de imagen in vivo 10 min después de la inyección para evaluar la progresión del tumor. El día 15, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tumores y se almacenaron rápidamente en una solución de paraformaldehído al 4% para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y los ensayos de marcaje de extremos de rotura de ADN mediados por terminal desoxinucleotidiltransferasa (TUNEL).

Evaluación de la respuesta inmune in vivo

En primer lugar, se recogieron los tejidos tumorales y se procesaron mediante molienda, filtración, lisis de glóbulos rojos y tamizado para obtener una suspensión de células individuales.

Para detectar las DCs maduras, la suspensión de células individuales se incubó con APC anti-ratón CD11c, PE anti-ratón CD86 y FITC anti-ratón CD80 para la tinción y, a continuación, se analizaron cuantitativamente mediante citometría de flujo. Posteriormente, para el análisis fenotípico de los macrófagos, la suspensión de células individuales se tiñó con APC anti-ratón F4/80, PE anti-ratón CD86 y FITC anti-ratón CD206. Los macrófagos M1 y M2 se analizaron mediante citometría de flujo. Las células T se tiñeron con FITC anti-ratón CD45, Brilliant Violet 510™ anti-ratón CD3, Brilliant Violet 421™ anti-ratón CD4 y PE/cianina 7 anti-ratón CD8a durante 30 min y se analizaron mediante citometría de flujo. De manera similar, se realizó el mismo procedimiento en el bazo para CD4 y CD8. Además, para el análisis de las células Treg, la suspensión de células individuales se fijó y se permeabilizó, seguida de la tinción con FITC anti-ratón CD45, Brilliant Violet 510™ anti-ratón CD3, Brilliant Violet 421™ anti-ratón CD4, PE anti-ratón CD25 y APC FOXP3, y se analizaron mediante citometría de flujo. Toda la tinción fluorescente se llevó a cabo en condiciones de oscuridad.

Además, se sacrificaron otros ratones después de los diferentes tratamientos. Se recogieron los tumores para la tinción inmunohistoquímica de CD4 y CD8.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos y las representaciones gráficas se llevaron a cabo principalmente utilizando GraphPad Prism 8 (GraphPad, MA, EE. UU.). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando una ANOVA de una vía para la comparación de múltiples grupos. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Se consideró que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo. La significación estadística se denota como *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001 y ****p < 0,0001.

Reactivos

Hexanol, ciclohexano, solución de amoníaco, tetraetilsilicato (TEOS), permanganato de potasio (KMnO4), carbonato de sodio (Na2CO3) y etanol se compraron a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (Shanghái, China). 3-Aminopropiltrietoxisilano (APTES) se compró a Sigma Aldrich (EE. UU.). El ácido hialurónico (HA) se compró a Macklin Biochemical Co., Ltd (Shanghái, China). La norepinefrina (NE) se obtuvo de MedChemExpress LLC (EE. UU.). 5-Fluorouracilo (5-FU) se compró a Selleck Chemicals LLC (EE. UU.). Suero fetal bovino (FBS) se compró a PAN-Biotech GmbH (Alemania). El medio RPMI 1640 se compró a Gibco Life Sciences (EE. UU.). Penicilina-estreptomicina-anfotericina B se compró a M&C Gene Technology Ltd (Pekín, China). El kit de apoptosis Annexin V-FITC/PI y la 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se compraron a Keygen Biotech Co., Ltd (Nankín, China). El kit de conteo de células CCK-8 y la sal de D-Luciferina potásica se compraron a TargetMol Chemicals Inc (EE. UU.). La solución de Triton X-100 (10%, estéril), Actin-Tracker Green, el kit de ensayo de ROS y la matriz de membrana del basamento Matrix-Gel™ se compraron a Beyotime Biotechnology Co., Ltd (Shanghái, China). Los anticuerpos de citometría de flujo se compraron a BIOLEGEND Biotechnology Co., Ltd (EE. UU.). Todos los reactivos eran de pureza analítica sin modificaciones adicionales.

Línea celular y animales

Las células CT26 se obtuvieron del Banco de Cultivos de Células Americano y se cultivaron en RPMI 1640 con 10% de FBS. La morfología de las células se observó periódicamente durante el cultivo a 37 °C con 5% de CO2.

Los ratones BALB/c se compraron a Vital River Laboratories (Pekín, China). El análisis in vivo se realizó de acuerdo con las directrices pertinentes y fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencias Médicas de Shandong y la Academia de Ciencias Médicas de Shandong (W202512290941).

Preparación de HML@HN

Síntesis de nanopartículas de dióxido de manganeso hueco (HM): Se prepararon nanopartículas de sílice funcionalizadas con amino (ASiO2 NPs) según un método descrito previamente [^[44]]. Brevemente, se añadieron n-hexanol (5,4 mL), ciclohexano (22,5 mL) y Triton X-100 (5,3 mL) a un vaso de precipitados de 100 mL y se agitó durante 5 min. Posteriormente, se introdujo agua desionizada (1 mL) en la solución mezclada. Después de la reacción durante 30 min, se añadió gota a gota solución de amoníaco (0,75 mL) y se permitió que la reacción continuara durante otros 30 min. A continuación, se añadió gota a gota una mezcla de APTES (100 μL) y TEOS (500 μL) y se continuó agitando durante 24 h. Las ASiO2 NPs se recogieron por centrifugación y se lavaron con etanol y agua varias veces. Finalmente, las ASiO2 NPs obtenidas se dispersaron en agua desionizada (5 mL) y se determinó la concentración para su uso posterior.

Posteriormente, se pesaron 50 mg de ASiO2 NPs y se redispersaron en agua desionizada (50 mL) que contenía permanganato de potasio (350 mg), seguido de agitación durante 12 h para permitir que se produjera la reacción. Las ASiO2 NPs recubiertas con dióxido de manganeso (MnO2) (ASiO2@MnO2) se recogieron por centrifugación y se lavaron tres veces con agua desionizada. Posteriormente, las ASiO2@MnO2 NPs obtenidas se dispersaron en solución de carbonato de sodio (50 mL, 2 M) bajo agitación continua a 60 °C. Después de agitar durante 12 h, el MnO2 hueco (HM) se recogió por centrifugación a 6000 rpm durante 10 min y se lavó tres veces con agua desionizada. Finalmente, el HM se dispersó en agua desionizada y se determinó la concentración para su uso posterior.

Síntesis de HML: Para preparar el lisado de células tumorales (TCL), las células CT26 se pretrataron con 5-FU. Después de inducir la muerte celular durante 24 h, se recogió el sobrenadante que contenía citocinas y restos de células tumorales, y las células tumorales se rompieron aún más utilizando un homogeneizador ultrasónico para obtener TCL que contenía 5-FU. El HM se mezcló con TCL, y la carga de citocinas y fragmentos de membrana celular en el HM se logró mediante sonicación. A continuación, se recogió el HML por centrifugación.

Síntesis de HML@HN: Se disolvieron NE (1 mg) y HA (1 mg) en agua (1 mL), y la solución resultante se añadió gota a gota a la nanosuspensión de HML (4 mL, 3 mg de HM) bajo agitación. Después de agitar durante 6 h, se recogió el HML@HN por centrifugación a 6000 rpm durante 10 min y se lavó dos veces con PBS.

Caracterización

La morfología y el tamaño de las nanopartículas se determinaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) con un voltaje de aceleración de 120 kV (HITACHI, Japón). El mapeo elemental de las nanopartículas se obtuvo utilizando un TEM de alta resolución con un instrumento de voltaje de aceleración de 200 kV (Thermo Scientific, EE. UU.). El potencial superficial de las nanopartículas se midió utilizando un analizador de tamaño de partículas y potencial zeta de Zetasizer Pro (Malvern Panalytical, Reino Unido). El análisis cuantitativo de la liberación de manganeso de las nanopartículas se caracterizó mediante un instrumento de cromatografía iónica-espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) (Thermo Fisher, EE. UU.). El estado de valencia atómica y la información elemental se midieron mediante un instrumento de espectrómetro de fotoelectrones de rayos X (XPS) (Shimadzu, Japón). La viabilidad celular se midió mediante un lector de microplacas (Thermo Fisher, EE. UU.). La imagen de fluorescencia de las células se realizó mediante un microscopio confocal láser (Olympus, Japón). El análisis de las células inmunitarias y la apoptosis se evaluó utilizando un análisis citométrico de flujo (Challenbio, China). La imagen del ratón se obtuvo utilizando un sistema de imagen tridimensional en vivo para animales pequeños (PerkinElmer, EE. UU.).

Estabilidad y liberación de HML@HN en el tracto gastrointestinal simulado

Para evaluar la estabilidad, el HML@HN se dispersó en fluido gástrico simulado o fluido intestinal simulado, y la morfología de los nanomateriales se observó mediante TEM en el día 7. Brevemente, el HML@HN (1 mL, 1 mg/mL) se colocó en una bolsa de diálisis (punto de corte de peso molecular de 3 kDa), que luego se sumergió en fluido gástrico simulado (50 mL) o fluido intestinal simulado (50 mL) y se colocó en un agitador (37 °C, 100 rpm) con una agitación suave. A los 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 y 72 h, se extrajo 1 mL de solución y se rellenó con 1 mL de fluido gástrico o intestinal simulado fresco para mantener un volumen constante del medio de disolución. Las muestras obtenidas se nitrificaron con ácido nítrico y se determinó la concentración de iones Mn utilizando un instrumento ICP-MS, lo que permitió calcular la liberación de iones Mn.

Análisis de la captación celular

La captación celular de HML@HN por la línea celular de cáncer de colon de ratón (CT26) se observó utilizando microscopía confocal láser (CLSM) y se analizó cuantitativamente mediante citometría de flujo. Primero, las células se sembraron en cada pocillo de placas de 12 pocillos a una densidad de 8 × 104 células por pocillo y se incubaron durante la noche sobre cubiertas de vidrio redondas estériles para permitir la adhesión. A continuación, se añadieron HML@NE y HML@HN marcados con Cy3 a cada pocillo, respectivamente, y se incubaron durante 6 h. Posteriormente, el citoesqueleto y los núcleos se tiñeron con Actin-Tracker Green-488 y DAPI para su visualización. Para el análisis cuantitativo mediante citometría de flujo, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células por pocillo y se incubaron durante la noche. Se añadieron HML@NE y HML@HN marcados con Cy3 a cada pocillo, respectivamente, y se incubaron durante 1, 3 y 6 h. Las células sin ningún tratamiento se utilizaron como control negativo. A continuación, se recogieron las células de cada grupo de tratamiento y se cuantificaron mediante análisis de citometría de flujo.

Detección de ROS intracelular

Las células CT26 se sembraron en platos de microscopía confocal (1 × 105 células por plato) durante 24 h de incubación. Las células se trataron con diferentes grupos durante 6 h: PBS (control), HM, HML, HML@NE y HML@HN (50 μg/mL). Después de desechar la solución de tratamiento, las células se incubaron con DCFH-DA durante 20 min a 37 °C. A continuación, las células tratadas se lavaron suavemente con PBS tres veces. Finalmente, se registró la fluorescencia de ROS mediante un microscopio de fluorescencia.

Ensayo de viabilidad celular

Las células CT26 se sembraron en una placa de 96 pocillos (5 × 103 células por pocillo) y se incubaron durante 12 h para permitir la adhesión celular. A continuación, se desechó el sobrenadante y se añadió un medio de cultivo fresco que contenía diferentes concentraciones de diversas nanomoléculas (HM, HML, HML@NE y HML@HN). El tratamiento con PBS sirvió como grupo de control. Después de 24 h de incubación, se desechó el sobrenadante y las células se lavaron con tampón PBS. A continuación, se añadió la solución CCK-8 diluida y se mezcló a fondo, seguida de incubación en un incubador a 37 °C durante 2 h. Finalmente, se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas para calcular la viabilidad celular.

Detección de CRT

Las células CT26 se sembraron en platos de microscopía confocal (1 × 105 células por plato) y se incubaron durante 12 h. En primer lugar, las células se trataron con PBS (control), HM, HML, HML@NE y HML@HN durante 12 h, respectivamente. A continuación, las células CT26 se fijaron con paraformaldehído durante 30 min, se permeabilizaron con 0,5% de Triton X-100 durante 10 min y, a continuación, se bloquearon con 5% de BSA (preparado en 0,5% de Triton X-100) para la dilución del anticuerpo primario (anti-CRT), seguida de incubación a 4 °C durante la noche. A continuación, las células CT26 se incubaron con el anticuerpo secundario diluido a 37 °C durante 1 h. Los núcleos se tiñeron con DAPI a temperatura ambiente durante 30 min. Después de cada paso, las células se lavaron dos veces con PBS. Finalmente, se capturó la fluorescencia de CRT utilizando un sistema de imagen confocal.

Análisis de la apoptosis celular

Las células CT26 se sembraron en una placa de 6 pocillos (1 × 105 células por pocillo) durante 24 h de incubación. A continuación, las células se trataron durante 12 h de la siguiente manera: PBS (control), HM, HML, HML@NE y HML@HN (50 μg/mL). A continuación, se recogieron las células y se tiñeron con una mezcla de PI y Annexin V-FITC durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, se analizaron las células mediante citometría de flujo.

Maduración y activación de las células dendríticas (DCs)

En primer lugar, se aislaron asépticamente los fémures y las tibias del ratón y, a continuación, se lavó la cavidad del hueso para obtener células de la cavidad del hueso. En segundo lugar, las células de la cavidad del hueso se sometieron a lisis de los glóbulos rojos y se preparó una suspensión de células individuales. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía 10% de FBS y se suplementó con 20 ng/mL de GM-CSF y 10 ng/mL de IL-4 para la inducción. El medio de cultivo se cambió a la mitad y se rellenó con citocinas en los días 3 y 5-6 de la cultura. A continuación, se recogieron las DCs inmaduras en los días 6-7 para construir un modelo Transwell con células CT26. Las células CT26 en las cámaras superiores se trataron con diferentes grupos: PBS (control), HM, HML, HML@NE y HML@HN (50 μg/mL). Después de 12 h, se recogieron las DCs en la cámara inferior y se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia contra CD11c (APC), CD80 (FITC) y CD86 (PE). Finalmente, se analizaron la maduración y la activación de las DCs mediante citometría de flujo.

Estudio de seguridad in vivo

La seguridad in vivo de HML@HN se evaluó en ratones sanos (n = 3). La formulación se administró por vía oral cada dos días (5 mg/kg), lo que era consistente con las dosis en el análisis de eficacia antitumoral. Después de la administración final, se recogió sangre total para el análisis hematológico y se recogieron muestras de suero para evaluar la función hepática (alanina aminotransferasa (ALT) y fosfatasa alcalina (ALP)) y la función renal (nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina (CR)). Además, se recogieron los principales órganos, incluido el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones, el estómago, el intestino delgado y el ciego, para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) con el fin de evaluar posibles daños tisulares. Los ratones sanos sirvieron como grupo de control.

Biodistribución in vivo de HML@HN

Se estableció un modelo de tumor de colon ortotópico CT26-luc en ratones para evaluar la progresión del tumor utilizando un sistema de imagen tridimensional in vivo de animales pequeños IVIS Spectrum CT. Brevemente, se anestesiaron ratones hembra BALB/c (5 semanas de edad) con isoflurano y se colocaron en un entorno estéril. Se realizó una pequeña incisión en el abdomen para exponer el ciego, y se inyectó en la pared del ciego una suspensión de células CT26-luc mezclada con Matrigel en una proporción de 1:1 (1 × 106 células por ratón) utilizando una jeringa de 31 G. Los ratones se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano durante todo el procedimiento. Cinco días después de la inoculación de las células CT26-luc, se administró D-Luciferina potásica por vía intraperitoneal y se evaluó el crecimiento del tumor de colon utilizando el sistema de imagen IVIS.

La capacidad de acumulación intestinal de DiR, HML@NE y HML@HN se observó utilizando el sistema de imagen IVIS. Después de confirmar el establecimiento exitoso del tumor mediante la imagen in vivo, se administró por vía oral DiR libre, DiR-HML@NE y DiR-HML@HN a ratones con tumor de colon a una dosis de DiR (0,5 mg/kg). En varios puntos temporales, se anestesiaron los ratones con isoflurano y se registró la señal fluorescente roja en cada grupo utilizando el sistema de imagen IVIS. 24 h después de la administración oral, se disecaron los ratones y se recogieron los principales órganos, incluido el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y el tumor, para su imagen.

Análisis de la eficacia antitumoral in vivo

Los ratones con tumores de colon ortotópicos CT26-luc se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (n = 6 por grupo). Los grupos 1 a 5 recibieron por vía oral PBS, HM, HML, HML@NE o HML@HN (5 mg/kg), respectivamente, en los días 1, 3, 5, 7 y 9, con un período de tratamiento total de 15 días. Se registró el peso corporal cada tres días y se evaluó el crecimiento del tumor cada seis días utilizando un sistema de imagen in vivo. Se inyectó D-Luciferina potásica (150 mg/kg) por vía intraperitoneal en los ratones y se realizó una imagen de bioluminiscencia utilizando el sistema de imagen in vivo 10 min después de la inyección para evaluar la progresión del tumor. El día 15, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tumores y se almacenaron rápidamente en una solución de paraformaldehído al 4% para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y los ensayos de tinción terminal de transferencia de desoxinucleótidos mediada por dUTP (TUNEL).

Evaluación de la respuesta inmunitaria in vivo

En primer lugar, se recogieron y procesaron los tejidos tumorales mediante trituración, filtración, lisis de glóbulos rojos y tamizado para obtener una suspensión de células individuales.

Para detectar las células dendríticas maduras (DCs), la suspensión de células individuales se incubó con APC anti-ratón CD11c, PE anti-ratón CD86 y FITC anti-ratón CD80 para la tinción y, a continuación, se analizó cuantitativamente mediante citometría de flujo. Posteriormente, para el análisis fenotípico de los macrófagos, la suspensión de células individuales se tiñó con APC anti-ratón F4/80, PE anti-ratón CD86 y FITC anti-ratón CD206. Los macrófagos M1 y M2 se analizaron mediante citometría de flujo. Las células T se tiñeron con FITC anti-ratón CD45, Brilliant Violet 510™ anti-ratón CD3, Brilliant Violet 421™ anti-ratón CD4 y PE/Cyanina7 anti-ratón CD8a durante 30 minutos y se analizaron mediante citometría de flujo. De manera similar, los CD4 y CD8 en el bazo se analizaron de la misma manera que en los tumores. Además, para el análisis de las células Treg, la suspensión de células individuales se fijó y permeabilizó, seguida de la tinción con FITC anti-ratón CD45, Brilliant Violet 510™ anti-ratón CD3, Brilliant Violet 421™ anti-ratón CD4, PE anti-ratón CD25 y APC FOXP3, y se analizaron mediante citometría de flujo. Todas las tinciones de fluorescencia se llevaron a cabo en condiciones de oscuridad.

Además, se sacrificaron otros ratones después de los diferentes tratamientos. Se recogieron los tumores para la tinción inmunohistoquímica de CD4 y CD8.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos y las representaciones gráficas se realizaron principalmente utilizando GraphPad Prism 8 (GraphPad, MA, EE. UU.). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando una ANOVA de una vía para la comparación de múltiples grupos. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Se consideró que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo. La significación estadística se denota como ∗p