Envejecimiento inflamatorio del estroma en la colitis ulcerosa y el cáncer asociado a la colitis.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que incluye la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), se caracteriza por una inflamación crónica y recurrente del tracto gastrointestinal, que resulta de una respuesta inmune anormal. Esta desregulación conduce a ciclos de remisión y recurrencia que pueden durar décadas y afectar a individuos de todas las edades [^[1]–^[4]]. En pacientes con CU de larga duración, la inflamación crónica no resuelta aumenta el riesgo de desarrollo de cáncer asociado a la colitis (CAC) [^[5]–^[7]]. El desarrollo de displasia en la CU y la progresión de la enfermedad a cáncer se han relacionado con el reclutamiento de células inmunitarias y las interacciones posteriores mediadas por quimiocinas y citocinas con las células epiteliales y del estroma [^[8]–^[10]]. Estos cambios pueden conducir a alteraciones moleculares y pueden desencadenar mutaciones genéticas que impulsan la progresión de la CU hacia el CAC.

En el tejido displásico, se ha implicado a los fibroblastos asociados a la colitis ulcerosa (FACU) y a los fibroblastos asociados al cáncer (FAC) en la iniciación y progresión del tumor [^[1], ^[11]]. Los fibroblastos en el microambiente colónico pueden responder a las señales de las células epiteliales y a los estímulos inflamatorios, adoptando un estado activado asociado con funciones proinflamatorias y promotoras del tumor [^[12]]. Los FACU y los FAC influyen en el panorama inmunitario en el colon mediante la secreción de factores de crecimiento, citocinas y componentes de la matriz extracelular que pueden suprimir la inmunidad antitumoral, promoviendo así la iniciación y progresión del tumor a través de la proliferación, invasión y metástasis de las células cancerosas [^[13]–^[15]]. Además, los FACU y los FAC modulan el sistema inmunitario dentro del colon al suprimir el microambiente inmunitario [^[16], ^[17]], promoviendo en última instancia la iniciación, el crecimiento y la supervivencia del tumor. El reconocimiento de los FACU y los FAC como contribuyentes activos a la tumorigénesis ha estimulado el interés en las estrategias terapéuticas dirigidas al microambiente tumoral, incluido el señalamiento mediado por fibroblastos y la remodelación del estroma [^[18], ^[19]].

La inflamación crónica puede promover un fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) en los FACU y los FAC, lo que resulta en la secreción de mediadores proinflamatorios y protumorogénicos [^[20], ^[21]]. Los factores SASP incluyen citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y proteasas que alteran la homeostasis tisular e influyen en la función, diferenciación y proliferación celular, proporcionando en última instancia un microambiente de apoyo para el crecimiento tumoral [^[21]]. Entre los numerosos moduladores secretados proinflamatorios dentro del SASP, la quimiocina CXCL8 desempeña un papel crucial en las respuestas inflamatorias asociadas con la CU [^[22]–^[24]]. Se han encontrado niveles elevados de CXCL8 en las biopsias de colon de pacientes con CU y cáncer de colon, lo que indica una posible relación entre CXCL8 y el desarrollo del CAC [^[23], ^[25]]. Si bien CXCL8 es secretada por células epiteliales, inmunitarias y endoteliales [^[26]–^[29]], los datos recientes destacan una contribución significativa de los fibroblastos [^[23]]. Por lo tanto, CXCL8 derivada de los fibroblastos puede desempeñar un papel importante en la mediación del cruce tumoral-estromal en el CAC [^[30]].

El presente estudio se centra en la regulación de la secreción de CXCL8 en los fibroblastos primarios del colon humano como un paradigma para el cruce fibroblasto-epitelial y estroma-microbiano en el colon inflamado y neoplásico. Mostramos que los fibroblastos de pacientes con colitis humana exhiben un fenotipo inflamatorio aumentado en comparación con sus contrapartes normales del colon sano. La firma inflamatoria se agrava aún más durante la transición al CAC. Demostramos que la expresión de CXCL8 está regulada por TNFα, IL-1β y LPS a través de la señalización de NF-κB. Además, la infección por micoplasma como estímulo microbiano es capaz de desencadenar respuestas similares, lo que ejemplifica el impacto del microbioma en la inflamación del estroma. Esta interacción es relevante para la enfermedad in vivo, ya que los FACU aumentan la formación de tumores en ratones, lo que se ve aún más aumentado por el TNFα. Finalmente, mostramos que la respuesta mejorada de CXCL8 de los FACU en comparación con los fibroblastos normales del colon se mantiene mediante la reprogramación en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y la diferenciación en fibroblastos derivados del mesénquima, lo que sugiere un fenotipo proinflamatorio codificado epigenéticamente. En conjunto, nuestros hallazgos posicionan a CXCL8 derivada de los fibroblastos como un marcador robusto y un posible objetivo en la tumorigénesis del colon impulsada por la inflamación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material de pacientes humanos

Se obtuvo el consentimiento de los pacientes con colitis ulcerosa o cáncer asociado a la colitis según el IRB 13-1159 (Cleveland Clinic) o el IRB 2021-0161 (Universidad de Texas, Southwestern) para la recuperación de muestras de tejido quirúrgicamente resecado. Los datos demográficos se presentan en la Tabla Suplementaria S1. Los tejidos humanos se recolectaron bajo observación patológica, y los tejidos normales del colon se obtuvieron de ubicaciones al menos 10 cm alejadas de los tumores evidentes. La revisión patológica fue realizada por el Dr. Michael Cruise (Cleveland Clinic) y el Dr. Zhikai Chi (Universidad de Texas, Southwestern) (Tabla Suplementaria S1).

Aislamiento de fibroblastos humanos primarios

Las muestras de tejido quirúrgicamente resecado se esterilizaron sumergiéndolas en lejía diluida durante 30 segundos, seguido de tratamiento con antifúngicos y antimicrobianos (#15240-062, Gibco) 3 veces durante 15 minutos cada vez. Los tejidos se picaron en 500-1000 μl de DMEM que contiene 1 mg/ml de colagenasa tipo 1A (#C9891, Sigma) en un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2 ml hasta que el homogeneizado pueda pasar a través de una punta de pipeta de 1000 μl. El tejido picado se transfirió a un tubo cónico de 50 ml con la adición de 9 ml de medio que contiene colagenasa, y luego se colocó en un baño de agua agitado a 37 °C durante 30 minutos. La actividad de la colagenasa se detuvo agregando medio DMEM que contiene suero y filtrando a través de un filtro de 40 μm. El filtrado se cultivó en placas de cultivo de tejidos en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de Pen/Strep.

Se realizaron análisis de repetición de tándem corto (STR) para confirmar la identidad de los aislados primarios de fibroblastos/organoides mediante la extracción de ADN genómico (DNEasy Blood and Tissue Kit, #69506, Qiagen) utilizando Duke University (10 marcadores), Genetica (16 marcadores) o el núcleo de genómica McDermott en la Universidad de Texas Southwestern (24 marcadores) (Tabla Suplementaria S2). Se definió como validación de la identidad una concordancia de >90% de los marcadores. Para los aislados primarios, los derivados celulares se compararon con el ADN genómico aislado de las secciones de formalina fijada e incrustada en parafina (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, #56404, Qiagen).

La generación de la línea de fibroblastos asociados a la colitis ulcerosa CT5-SV40-largeT-TERT se describió previamente [^[30]]. Este aislado se estableció a partir de un paciente con colitis aguda en la Universidad de Florida, y luego se inmortalizó con el antígeno SV40-Large T en un constructo viral (regalo de Rosa Hwang, MD Anderson). La línea celular de fibroblastos del colon humano (CRL1541) y la línea celular epitelial del cáncer de colon (HCT 116) se obtuvieron de ATCC, se validaron mediante análisis de STR y se probaron para detectar contaminación por micoplasma antes de su uso.

Animales vertebrados

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas institucionales y las pautas ARRIVE para el cuidado y uso de animales de laboratorio (protocolo IACUC #103065). Se estableció una colonia de cría de ratones inmunodeficientes NOD-SCID IL2 gamma-receptor nulo (aquí denominados NSG) por el Simmons Comprehensive Cancer Center en la Universidad de Texas Southwestern. Los grupos experimentales consistieron en al menos 5 ratones de entre 7 y 9 semanas de edad con una proporción de 1,3:1 F:M. Los ratones se controlaron cada 2-3 días y se determinó el volumen tumoral utilizando calibradores digitales. Los animales fueron sacrificados antes de que los tumores alcanzaran un diámetro de 2 cm, según lo requerido por la política del IACUC. El sacrificio se realizó utilizando una dosis letal de ketamina-xilazina seguida de dislocación cervical. Ningún animal superó los puntos finales humanitarios descritos en el protocolo.

Estadísticas

Todos los análisis estadísticos para los estudios in vitro se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 10). La significación estadística se definió como P < 0,05. En todos los casos, se utilizaron un mínimo de 3 réplicas biológicas y técnicas.

Todos los análisis estadísticos para los estudios in vitro se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 10). La significación estadística se definió como P < 0,05. En todos los casos, se utilizó un mínimo de 3 réplicas biológicas y técnicas.

RESULTADOS

Expresión de CXCL8 en fibroblastos primarios humanos asociados a la colitis.

Para investigar los cambios en la expresión de CXCL8 en los fibroblastos del colon humano durante la progresión hacia el cáncer asociado a la colitis, establecimos cultivos primarios de fibroblastos libres de micoplasma a partir de tejido normal del colon, colitis ulcerosa y cáncer de colon (incluyendo tanto el cáncer asociado a la colitis como el cáncer de colon esporádico). En concordancia con nuestros informes anteriores,[^[30], ^[31]] tanto los análisis ELISA como qRT-PCR demostraron niveles elevados de CXCL8 mRNA y proteína en los UCAFs en comparación con los fibroblastos normales (Figura 1A, B). Dado que CXCL8 forma parte del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP)[^[32]], evaluamos a continuación la expresión de los marcadores canónicos de la senescencia, incluyendo los niveles de mRNA de CDKN2A/p16, TP53 y CDKN1A/p21 (Figura 1C-E). TP53 se sobreexpresó significativamente, con una tendencia hacia un aumento en la expresión de CDKN1A en los UCAFs, mientras que los niveles de CDKN2A permanecieron sin cambios. Este patrón sugiere que los UCAFs exhiben senescencia inducida por lesiones/estrés en comparación con los fibroblastos normales del colon, en lugar de senescencia replicativa. Cabe destacar que los fibroblastos asociados al cáncer (CAFs) mostraron una tendencia en la misma dirección, pero con una respuesta menos pronunciada que los UCAFs.

Para obtener más información, reanalizamos los datos de transcriptómica de mRNA de fibroblastos normales del colon, UCAFs y CAFs que habíamos informado previamente.[^[30]] El análisis de componentes principales (PCA) separó los UCAFs y los CAFs en comparación con los fibroblastos normales del colon, con una varianza del 33% explicada por PC1 y una varianza del 17,19% por PC2 (Figura 1F). El diagrama de dispersión que compara los fibroblastos normales del colon y los UCAFs (con un umbral de cambio de 2,5 veces y un valor de P ajustado de 0,05) identificó 2 genes sobreexpresados en los fibroblastos normales del colon y 26 en los UCAFs (Figura 1G). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando conjuntos de genes Hallmark reveló una sobreexpresión significativa de las vías de señalización inflamatorias en los UCAFs, como INFLAMMATORYRESPONSE, INTERFERONALPHARESPONSE, WNTBETACATENINSIGNALING, INTERFERONGAMMARESPONSE, TNFASIGNALINGVIANFKB, IL6JAKSTAT3SIGNALING (Figura 1H-L y Figura S1I, J suplementaria). Además, observamos un enriquecimiento en los conjuntos de genes de senescencia y SASP (Figura S2A, B suplementaria). Se obtuvieron resultados similares al comparar los CAFs con los fibroblastos normales del colon (Figura S1A-H suplementaria, Figura S2C, D suplementaria). Los análisis de mapas de calor de los genes individuales más expresados diferencialmente dentro de estas vías para los tres grupos de fibroblastos demostraron una baja expresión en los fibroblastos normales, niveles intermedios en los UCAFs y un mayor aumento en los CAFs (Figura 1M-R). En conjunto, estos datos indican que los UCAFs exhiben firmas transcripcionales de inflamación y senescencia, que se amplifican aún más en los CAFs.

La expresión de CXCL8 está regulada por varios mediadores inflamatorios.

Para determinar si la expresión de CXCL8 está regulada por las vías de señalización inflamatorias, probamos las citocinas (TNFα, IL-1β e IFNγ) así como los estímulos bacterianos, el lipopolisacárido (LPS) y la proteína flagelar Flagelina (FliC) solos o en combinación, utilizando la línea celular UCAF CT5-S/T y la línea celular de fibroblastos normales del colon CRL1541-S/T. En nuestro análisis, incluimos la línea celular epitelial de cáncer de colon HCT116, así como las células HEK293T como un tipo de célula de control no intestinal. El mRNA de CXCL8 y la proteína CXCL8 secretada se evaluaron mediante qRT-PCR y ELISA, respectivamente. TNFα indujo CXCL8 en los tres tipos de células del colon, pero no en las células HEK293T (Figura 2A-F y Figura S3A suplementaria). En contraste, IL-1β desencadenó una fuerte respuesta en CT5-S/T y las células epiteliales HCT116, pero no en los fibroblastos normales del colon CRL1541-S/T (Figura 2A-F y Figura S3B suplementaria). Ambas líneas celulares de fibroblastos mostraron una respuesta modesta al tratamiento con LPS solo, mientras que las células HCT116 no respondieron (Figura 2A-F y Figura S3C, H suplementaria). Por el contrario, FliC provocó una respuesta solo en las células HCT116, pero no en las dos líneas celulares de fibroblastos (Figura 2A-F y Figura S3D, G suplementaria). La combinación de estos tratamientos (por ejemplo, TNFα e IL-1β) produjo efectos aditivos y ligeramente sinérgicos. Finalmente, IFNγ solo no indujo CXCL8 en ninguno de los tipos de células, y el cotratamiento con IFNγ redujo el CXCL8 inducido por TNFα. Este efecto no se debió a una falta de expresión de los respectivos receptores de señalización (Figura S3F suplementaria). En cambio, es consistente con el hecho de que IFNγ señala a través de la vía JAK/STAT y no de NFκB como los otros estímulos probados [^[33], ^[34]].

Los ensayos de respuesta a la dosis confirmaron que la expresión de CXCL8 inducida por citocinas era saturable. TNFα exhibió una CE50 de 3,63 ng/ml para CT5-S/T y 2,92 ng/ml para CRL1541-S/T (Figura 2G, H). Esta respuesta se alineó con los datos de secuenciación de mRNA de los receptores de TNFα (TNFRSF1A y TNFRSF1B), donde TNFRSF1A se expresó en los tres tipos de células (CT5-S/T, CRL154-S/T y HCT116), mientras que TNFRSF1B se expresó predominantemente en CRL1541-S/T, pero a niveles mucho más bajos en CT5-S/T y HCT116 (Figura 2I). Los valores de CE50 de IL-1β difirieron entre las líneas celulares de fibroblastos, con mayor sensibilidad en el representante de UCAF, CT5-S/T (314 pg/ml) que en el fibroblasto normal del colon CRL1541-S/T (79 pg/ml) (Figura 2J, K). Coherente con este hallazgo, los datos de secuenciación de mRNA que muestran la expresión diferencial de los receptores de IL-1β, IL1R1, IL1R2 y IL1RN (Figura 2L). Si bien IL1R1 y IL1R2 se expresaron en ambas líneas celulares de fibroblastos (es decir, CT5-S/T y CRL1541-S/T), estos receptores estuvieron presentes a niveles más bajos en las células epiteliales del colon HCT116. Sin embargo, el antagonista del receptor de IL-1β, IL1RN, se expresó principalmente en CRL1541-S/T, el fibroblasto normal del colon, lo que podría explicar la disminución de la respuesta a IL-1β a pesar de una mayor expresión del receptor. En conjunto, estos datos demuestran que CXCL8 está fuertemente regulado por estímulos inflamatorios de una manera dependiente del tipo de célula y del receptor.

TNFα acelera las interacciones tumor-estromales y el crecimiento tumoral in vivo.

Para abordar la relevancia in vivo de la modulación inflamatoria mediada por TNFα, evaluamos el efecto sobre la tumorigénesis en un modelo de coinoculación (Figura 3A). Se implantaron en ratones inmunocomprometidos NSG, por vía subcutánea, un pellet de liberación sostenida de TNFα o un pellet de placebo, seguido de la inoculación de organoides tumorales epiteliales CAC227 solos o en combinación con la línea celular primaria UCAF originalmente aislada de un colon con colitis (CT461-Dist). Se monitoreó el crecimiento tumoral mediante mediciones seriadas con calibrador.

Primero, evaluamos si los UCAFs aumentan la tumorigénesis de las células de cáncer de colon en ausencia de TNFα exógeno. Para este fin, analizamos los tumores que consistían en CAC227 solo o en combinación con los UCAFs CT461-Dist en presencia del pellet de placebo. Las mediciones del volumen tumoral revelaron un cambio significativo en la pendiente (P = 0,0319, Figura S4A suplementaria) y la latencia tumoral mostró una tendencia no significativa a la reducción de 21 a 14 días (P = 0,1701, Figura S4B suplementaria).

A continuación, evaluamos el impacto de TNFα en la iniciación y la progresión del tumor. En los ratones coinoculados con tumores derivados de CAC227/CT461-Dist, la adición de un pellet de liberación sostenida que contenía TNFα redujo la latencia tumoral de 6 días a 4 días en comparación con los ratones con el pellet de placebo (P = 0,0282, Figura 3B). Las trayectorias de crecimiento tumoral fueron consistentes con esta reducción en la latencia. No hubo diferencia en la pendiente (P = 0,10480) pero hubo una diferencia altamente significativa en la intersección (P < 0,0001, Figura 3C). El volumen tumoral aumentó en 1,61 mm3/día en los ratones tratados con placebo versus 2,01 mm3/día en los ratones tratados con TNFα. Estos hallazgos se validaron en un segundo experimento independiente (Figura S4C suplementaria). Finalmente, al final del estudio, se evaluó la proliferación mediante inmunotinción con KI67 o PCNA, pero no se detectaron diferencias (Figura S4D, E suplementaria), lo que apoya aún más que TNFα afecta la latencia tumoral, en lugar del volumen tumoral (al menos al final del estudio).

En conjunto, estos resultados muestran que los UCAFs mejoran la iniciación del tumor, y que TNFα acelera aún más este proceso cuando están presentes los UCAFs. Destacan un papel crítico de la señalización inflamatoria en la configuración de las interacciones tumor-estromales in vivo.

Las infecciones por micoplasma imitan el impacto de los reguladores inflamatorios en CXCL8.

La microbiota del colon juega un papel crítico en la patogénesis de la colitis y la progresión hacia el cáncer asociado a la colitis [^[35]–^[38]]. Dadas las dificultades técnicas para cocultivar bacterias y fibroblastos ex vivo, utilizamos la presencia de pequeñas bacterias intracelulares, es decir, micoplasma, como un sustituto del intercambio microbiano dentro de la capa intersticial del colon. Como se informó previamente [^[39]], los análisis de inmunofluorescencia y RNAscope® confirmaron la presencia de micoplasma en los fibroblastos humanos del colon (Figura 4A y datos no mostrados).

Durante el establecimiento de las líneas celulares primarias de fibroblastos a partir del tejido del colon resecado, generamos rutinariamente cultivos libres de micoplasma. Como parte del proceso, los aislados de pasaje temprano se conservan criogénicamente antes de la descontaminación, lo que nos permite examinar pares de células positivas y negativas para micoplasma de la misma línea. Utilizando este recurso, comparamos la expresión de CXCL8 utilizando una línea celular de fibroblastos normales del colon (CT303-Prox) y dos líneas celulares de UCAF (CT306-Dist y CT307-Dist) con y sin micoplasma (Figura 4B). Las tres líneas celulares exhibieron niveles significativamente más altos de proteína CXCL8 y mRNA en presencia de micoplasma (Figura 4C, D). Como se muestra en la Figura 1A, B, los niveles basales de CXCL8 son elevados en los UCAFs libres de micoplasma en comparación con los fibroblastos normales del colon. Esta diferencia se amplificó aún más en presencia de micoplasma (compare CT303-Prox con CT306-Dist y CT307-Dist en la Figura 4C, D), lo que sugiere una relación sinérgica. En nuestro estudio anterior [^[30]], descubrimos que miR-20a, un miRNA de la familia miR-17, es un fuerte regulador de la expresión de CXCL8. Cuando examinamos la expresión del miembro de la familia miR-17, los niveles de miR-20a y miR-20b no cambiaron al comparar los fibroblastos normales libres de micoplasma con los UCAFs y los CAFs, mientras que miR-93 se sobreexpresó ligeramente (Figura S5 suplementaria). En contraste, los tres miRNAs se redujeron en presencia de micoplasma (Figura 4E-G), lo que es consistente con su función conocida en la restricción de los transcritos inflamatorios.

Para determinar si el micoplasma aumenta la expresión de CXCL8 a través de TNFα o Il-1β, evaluamos el papel de la señalización de NFκB, que es su principal mediador de señalización aguas abajo [^[40]]. De hecho, IKK-16, un inhibidor selectivo de la quinasa IκB, bloqueó la inducción de CXCL8 mRNA por TNFα en las células CT5-S/T y CRL1541-S/T (Figura S6A suplementaria). El tratamiento de CT303-Prox, CT306-Dist y CT307-Dist que contenían micoplasma con IKK-16 suprimió significativamente CXCL8 mRNA, lo que indica una convergencia en la señalización de NF-κB (Figura 5A-C). Además, realizamos experimentos complementarios para abordar si los niveles máximos de CXCL8 se alteraron tras la infección por micoplasma. Sin embargo, la adición de TNFα o LPS a los fibroblastos del colon tanto libres de micoplasma como positivos para micoplasma alcanzó niveles comparables máximos de expresión de CXCL8 mRNA independientemente de los niveles de micoplasma (Figura 5D-F). En conjunto, estos experimentos respaldan que el micoplasma es un regulador in vivo de CXCL8 que prepara a los fibroblastos a través de la señalización de NF-κB, pero no altera la capacidad general de señalización.

Los análisis del transcriptoma corroboraron aún más estos resultados. Como se esperaba, la infección por micoplasma fue el principal componente que separó los datos (PC1=82.66%, Figura S6C en el material suplementario). De hecho, la mayoría de los cambios transcripcionales observados fueron la disminución de la expresión génica en los fibroblastos positivos para micoplasma (Figura 5G), con solo un pequeño subconjunto de genes con expresión aumentada, incluidos los quimiocinas CXCL3 y CXCL8. GSEA confirmó la amplia disminución de los conjuntos de genes Hallmark y Reactome (Figura 5H y Figura S6D en el material suplementario). Entre las pocas vías con expresión aumentada se encontraban TNFRECEPTORSUPERFAMILY(TNFSF)MEMBERSMEDIATINGNON-CANONICALNF-KBPATHWAY, CHEMOKINERECEPTORSBINDCHEMOKINES y HALLMARKIL6JAKSTAT3_SIGNALING (Figura 5I-L y Figura S6E,F en el material suplementario), lo que apoya aún más que las respuestas inflamatorias son una consecuencia importante de la infección por micoplasma.

En conjunto, estos datos demuestran que la infección por micoplasma puede servir como un paradigma para las interacciones microbianas-fibroblásticas en el colon inflamado. El efecto sobre la regulación de CXCL8 está mediado por vías dependientes de NF-κB compartidas, lo que destaca un mecanismo microbiano para amplificar la señalización inflamatoria del estroma relevante para la colitis.### Los fibroblastos asociados a la colitis conservan su respuesta a CXCL8 durante la reprogramación de células madre.

A continuación, buscamos explorar por qué los fibroblastos normales del colon y los UCAF responden de manera diferente a los estímulos inflamatorios. Previamente informamos que las diferencias entre los fibroblastos normales, los UCAF y los CAF con respecto a la secreción de CXCL8 están mediadas, en parte, por los microARN de la familia miR-17 [^[30]]. Esta observación se corroboró en nuestro estudio actual. Aunque el micoplasma aumentó la expresión de CXCL8 en los fibroblastos normales del colon y los UCAF, los miembros de la familia miR-17 se regularon a la baja de manera consistente (Figura 4E-G). Curiosamente, esto parece ser independiente del principal factor de transcripción que regula la expresión de la familia miR-17, MYC.[^[41], ^[42]] El análisis de qRT-PCR para MYC no mostró una regulación a la baja como resultado de la presencia de micoplasma (Figura S6B en el material suplementario).

También evaluamos si los citocinas inflamatorias y los estímulos bacterianos podían influir en la expresión de los microARN de la familia miR-17. Curiosamente, la expresión de miR-20a y miR-93 solo cambió en los UCAF CT5-S/T, pero no en los fibroblastos normales CRL1541-S/T (Figura S3I-N en el material suplementario). Estos hallazgos sugirieron una diferencia intrínseca entre los fibroblastos normales del colon y los UCAF en la regulación de la expresión de CXCL8.

Con base en estos resultados, nos preguntamos si esto se debía a una "memoria inflamatoria", como se describió previamente en los fibroblastos de la piel.[^[43]] Para probar esta hipótesis, utilizamos los fibroblastos derivados del mesénquima (MDF) que informamos recientemente [^[31]]. Estos MDF se aíslan de organoides, que se generaron utilizando células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de fibroblastos normales del colon o UCAF (Figura 6A). Estos MDF conservan el genotipo de los fibroblastos originales, pero se restablecen a un estado más homogéneo y menos diferenciado y carecen de cualquier exposición al microambiente tumoral.

Cuando se compararon los CT5-MDF con su contraparte inmortalizada, CT5-S/T (Figura 6B), la inducción de CXCL8 por TNFα se redujo moderadamente, con un valor Emax más bajo (706 vs. 1183) y un EC50 ligeramente más alto (4,34 vs. 3,39 ng/ml). En contraste, los CRL1541-MDF mostraron una respuesta marcadamente atenuada en comparación con los fibroblastos CRL1541-S/T (Emax de 263 vs. 1264, EC50 de 1,11 vs. 4,92 ng/ml) (Figura 6C). MDF adicionales, uno de una línea de fibroblastos normales del colon (DPNL-MDF) y uno de una línea de UCAF (KHCT-MDF), corroboraron los resultados (Figura 6D): los MDF de los fibroblastos normales exhibieron una inducción de CXCL8 atenuada (Emax de 35,67 y 68,07), mientras que los MDF de los UCAF conservaron una mayor capacidad de respuesta (Emax de 712,1 y 327,3), respectivamente. En conjunto, estos hallazgos demuestran que, al menos en nuestro número limitado de muestras, la reprogramación de iPSC de los UCAF conservó la capacidad de respuesta a TNFα similar a los UCAF inmortalizados, mientras que la reprogramación de iPSC de los fibroblastos normales del colon resultó en una respuesta más atenuada. Esto indica que la memoria epigenética o la programación transcripcional estable pueden subyacer al fenotipo inflamatorio persistente observado en los CAF.

Expresión de CXCL8 en los fibroblastos asociados a la colitis humana primarios.

Para investigar los cambios en la expresión de CXCL8 en los fibroblastos del colon humano durante la progresión hacia el cáncer asociado a la colitis, establecimos cultivos de fibroblastos primarios libres de micoplasma a partir de tejido normal del colon, colitis ulcerosa y cáncer de colon (incluidos tanto el cáncer asociado a la colitis como el cáncer de colon esporádico). En concordancia con nuestros informes anteriores,[^[30], ^[31]] tanto los análisis de ELISA como de qRT-PCR demostraron niveles elevados de CXCL8 mRNA y proteína en los UCAF en comparación con los fibroblastos normales (Figura 1A,B). Dado que CXCL8 es parte del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP)[^[32]], a continuación, evaluamos la expresión de los marcadores canónicos de la senescencia, incluidos los niveles de mRNA de CDKN2A/p16, TP53 y CDKN1A/p21 (Figura 1C-E). TP53 se reguló significativamente a la alza, con una tendencia hacia una mayor expresión de CDKN1A en los UCAF, mientras que los niveles de CDKN2A permanecieron sin cambios. Este patrón sugiere que los UCAF exhiben senescencia inducida por lesiones/estrés en comparación con los fibroblastos normales del colon, en lugar de senescencia replicativa. Cabe destacar que los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) mostraron una tendencia en la misma dirección, pero con una respuesta menos pronunciada que los UCAF.

Para obtener más información, reanalizamos los datos del transcriptoma de mRNA de los fibroblastos normales del colon, los UCAF y los CAF que informamos previamente.[^[30]] El análisis de componentes principales (PCA) separó los UCAF y los CAF en comparación con los fibroblastos normales del colon, con un 33% de la varianza explicada por PC1 y un 17,19% de la varianza por PC2 (Figura 1F). El diagrama de dispersión que compara los fibroblastos normales del colon y los UCAF (con un umbral de cambio de 2,5 veces y un valor de P ajustado de 0,05) identificó 2 genes con expresión aumentada en los fibroblastos normales del colon y 26 en los UCAF (Figura 1G). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando conjuntos de genes Hallmark reveló una regulación al alza significativa de las vías de señalización inflamatoria en los UCAF, como INFLAMMATORYRESPONSE, INTERFERONALPHARESPONSE, WNTBETACATENINSIGNALING, INTERFERONGAMMARESPONSE, TNFASIGNALINGVIANFKB, IL6JAKSTAT3SIGNALING (Figura 1H-L y Figura S1I,J en el material suplementario). Además, observamos un enriquecimiento en los conjuntos de genes de senescencia y SASP (Figura S2A,B en el material suplementario). Los análisis de mapas de calor de los genes individuales más expresados diferencialmente dentro de estas vías para los tres grupos de fibroblastos demostraron una baja expresión en los fibroblastos normales, niveles intermedios en los UCAF y un mayor aumento en los CAF (Figura 1M-R). En conjunto, estos datos indican que los UCAF exhiben firmas transcripcionales de inflamación y senescencia, que se amplifican aún más en los CAF.

La expresión de CXCL8 está regulada por varios mediadores inflamatorios

Para determinar si la expresión de CXCL8 está regulada aguas abajo de las vías de señalización inflamatoria, probamos las citocinas (TNFα, IL-1β e IFNγ) así como los estímulos bacterianos, el lipopolisacárido (LPS) y la proteína flagelar Flagelina (FliC) solos o en combinación, utilizando la línea celular UCAF CT5-S/T y la línea celular de fibroblastos normales del colon CRL1541-S/T. En nuestro análisis, incluimos la línea celular de cáncer de colon epitelial HCT116, así como las células HEK293T como un tipo de célula de control no intestinal. Se evaluaron el mRNA de CXCL8 y la proteína CXCL8 secretada mediante qRT-PCR y ELISA, respectivamente. TNFα indujo CXCL8 en los tres tipos de células del colon, pero no en las células HEK293T (Figura 2A-F y Figura S3A en el material suplementario). En contraste, IL-1β desencadenó una fuerte respuesta en CT5-S/T y las células epiteliales HCT116, pero no en los fibroblastos normales del colon CRL1541-S/T (Figura 2A-F y Figura S3B en el material suplementario). Ambas líneas de fibroblastos mostraron una respuesta modesta al tratamiento con LPS solo, mientras que las células HCT116 no respondieron (Figura 2A-F y Figura S3C,H en el material suplementario). Por el contrario, FliC provocó una respuesta solo en las células HCT116, pero no en las dos líneas de fibroblastos (Figura 2A-F y Figura S3D,G en el material suplementario). La combinación de estos tratamientos (por ejemplo, TNFα e IL-1β) produjo efectos aditivos y ligeramente sinérgicos. Finalmente, IFNγ solo no indujo CXCL8 en ninguno de los tipos de células, y el cotratamiento con IFNγ redujo CXCL8 inducido por TNFα. Este efecto no se debió a una falta de expresión de los respectivos receptores de señalización (Figura S3F en el material suplementario). En cambio, es consistente con el hecho de que IFNγ señala a través de la vía JAK/STAT y no de NFκB como los otros estímulos probados [^[33], ^[34]].

Los ensayos de respuesta a la dosis confirmaron que la expresión de CXCL8 inducida por citocinas era saturable. TNFα exhibió un CE50 de 3,63 ng/ml para CT5-S/T y 2,92 ng/ml para CRL1541-S/T (Figura 2G,H). Esta respuesta se alineó con los datos de mRNA-seq de los receptores de TNFα (TNFRSF1A y TNFRSF1B), donde TNFRSF1A se expresó en los tres tipos de células (CT5-S/T, CRL154-S/T y HCT116), mientras que TNFRSF1B se expresó predominantemente en CRL1541-S/T, pero a niveles mucho más bajos en CT5-S/T y HCT116 (Figura 2I). Los valores de CE50 de IL-1β difirieron entre las líneas de fibroblastos, con mayor sensibilidad en el representante de UCAF, CT5-S/T (314 pg/ml) que en los fibroblastos normales del colon CRL1541-S/T (79 pg/ml) (Figura 2J,K). Coherente con este hallazgo, los datos de mRNA-seq que muestran la expresión diferencial de los receptores de IL-1β, IL1R1, IL1R2 e IL1RN (Figura 2L). Si bien IL1R1 e IL1R2 se expresaron en ambas líneas de fibroblastos (es decir, CT5-S/T y CRL1541-S/T), estos receptores estuvieron presentes a niveles más bajos en las células epiteliales del colon HCT116. Sin embargo, el antagonista del receptor de IL-1β, IL1RN, se expresó principalmente en CRL1541-S/T, el fibroblasto normal del colon, lo que podría explicar la disminución de la capacidad de respuesta a IL-1β a pesar de una mayor expresión del receptor. En conjunto, estos datos demuestran que CXCL8 está fuertemente regulado por estímulos inflamatorios de una manera dependiente del tipo de célula y del receptor.

TNFα acelera las interacciones tumor-estromales y el crecimiento tumoral in vivo

Para abordar la relevancia in vivo de la modulación inflamatoria mediada por TNFα, evaluamos el efecto sobre la tumorigénesis en un modelo de coinoculación (Figura 3A). Se implantaron ratones inmunocomprometidos NSG por vía subcutánea con una pastilla de liberación sostenida de TNFα o una pastilla de placebo, seguida de la inoculación de organoides tumorales epiteliales CAC227 solos o en combinación con la línea de UCAF primaria aislada originalmente de un colon con colitis (CT461-Dist). Se monitoreó el crecimiento tumoral mediante mediciones seriadas con calibrador.

Primero, evaluamos si los UCAF aumentan la tumorigénesis de las células de cáncer de colon en ausencia de TNFα exógeno. Con este fin, analizamos los tumores que consistían en CAC227 solo o en combinación con los UCAF CT461-Dist en presencia de la pastilla de placebo. Las mediciones del volumen tumoral revelaron un cambio significativo en la pendiente (P = 0,0319, Figura S4A en el material suplementario) y la latencia tumoral mostró una tendencia no significativa a la reducción de 21 a 14 días (P = 0,1701, Figura S4B en el material suplementario).

A continuación, evaluamos el impacto del TNFα en la iniciación y progresión del tumor. En ratones coinoculados con tumores derivados de CAC227/CT461-Dist, la adición de un implante de liberación sostenida que contenía TNFα redujo la latencia tumoral de 6 días a 4 días en comparación con los ratones con el implante de placebo (P = 0,0282, Figura 3B). Las trayectorias de crecimiento tumoral fueron consistentes con esta reducción en la latencia. No hubo diferencia en la pendiente (P = 0,10480) pero sí una diferencia altamente significativa en la intersección (P < 0,0001, Figura 3C). El volumen tumoral aumentó en 1,61 mm3/día en los ratones tratados con placebo, frente a 2,01 mm3/día en los ratones tratados con TNFα. Estos hallazgos se validaron en un segundo experimento independiente (Figura S4C suplementaria). Finalmente, al final del estudio, la proliferación se evaluó mediante inmunotinción con KI67 o PCNA, pero no se detectaron diferencias (Figura S4D, E suplementaria), lo que apoya aún más que el TNFα afecta la latencia tumoral, en lugar del volumen tumoral (al menos al final del estudio).

En conjunto, estos resultados muestran que los UCAF mejoran la iniciación del tumor y que el TNFα acelera aún más este proceso cuando los UCAF están presentes. Destacan un papel fundamental de la señalización inflamatoria en la configuración de las interacciones tumor-estroma in vivo.

Las infecciones por Micoplasma imitan el impacto de los reguladores inflamatorios en CXCL8

La microbiota colónica desempeña un papel fundamental en la patogénesis de la colitis y en la progresión hacia el CAC [^[35]–^[38]]. Dada las dificultades técnicas en el cocultivo de bacterias y fibroblastos ex vivo, utilizamos la presencia de pequeñas bacterias intracelulares, es decir, micoplasma, como un sustituto del intercambio microbiano dentro de la capa intersticial del colon. Como se informó previamente [^[39]], los análisis de inmunofluorescencia y RNAscope® confirmaron la presencia de micoplasma en los fibroblastos colónicos humanos (Figura 4A y datos no mostrados).

Durante el establecimiento de las líneas de fibroblastos primarias a partir del tejido colónico resecado, generamos rutinariamente cultivos libres de micoplasma. Como parte del proceso, los aislados de pasajes tempranos se conservan criogénicamente antes de la descontaminación, lo que nos permite examinar pares de células positivas y negativas para micoplasma de las mismas líneas. Utilizando este recurso, comparamos la expresión de CXCL8 utilizando una línea de fibroblastos colónicos normales (CT303-Prox) y dos líneas de UCAF (CT306-Dist y CT307-Dist) con y sin micoplasma (Figura 4B). Las tres líneas celulares exhibieron niveles significativamente más altos de proteína CXCL8 y niveles de ARNm en presencia de micoplasma (Figura 4C, D). Como ya se muestra en la Figura 1A, B, los niveles basales de CXCL8 están elevados en los UCAF libres de micoplasma en comparación con los fibroblastos colónicos normales. Esta diferencia se amplificó aún más en presencia de micoplasma (compare CT303-Prox con CT306-Dist y CT307-Dist en la Figura 4C, D), lo que sugiere una relación sinérgica. En nuestro estudio anterior [^[30]], descubrimos que miR-20a, un microARN de la familia miR-17, es un potente regulador de la expresión de CXCL8. Cuando examinamos la expresión del miembro de la familia miR-17, los niveles de miR-20a y miR-20b no cambiaron al comparar los fibroblastos normales libres de micoplasma con los UCAF y los CAF, mientras que miR-93 se reguló ligeramente al alza (Figura S5 suplementaria). En contraste, los tres microARN se regularon a la baja en presencia de micoplasma (Figura 4E-G), lo que es consistente con su función conocida en la restricción de los transcritos inflamatorios.

Para determinar si el micoplasma regula al alza la expresión de CXCL8 a través de TNFα o Il-1β, evaluamos el papel de la señalización de NFκB, que es su principal mediador de señalización aguas abajo [^[40]]. De hecho, IKK-16, un inhibidor selectivo de la quinasa IκB, bloqueó la inducción del ARNm de CXCL8 por TNFα en las células CT5-S/T y CRL1541-S/T (Figura S6A suplementaria). El tratamiento de CT303-Prox, CT306-Dist y CT307-Dist que contenían micoplasma con IKK-16, suprimió significativamente el ARNm de CXCL8, lo que indica una convergencia en la señalización de NF-κB (Figura 5A-C). Además, realizamos experimentos complementarios para determinar si los niveles máximos de CXCL8 se alteraron tras la infección por micoplasma. Sin embargo, la adición de TNFα o LPS tanto a los fibroblastos colónicos libres de micoplasma como a los positivos para micoplasma alcanzó niveles comparables máximos de expresión de ARNm de CXCL8, independientemente de los niveles de micoplasma (Figura 5D-F). En conjunto, estos experimentos respaldan que el micoplasma es un regulador in vivo de CXCL8 que prepara a los fibroblastos a través de la señalización de NF-κB, pero no altera la capacidad general de señalización.

Los análisis del transcriptoma corroboraron aún más estos resultados. Como se esperaba, la infección por micoplasma fue el principal componente que separó los datos (PC1 = 82,66%, Figura S6C suplementaria). De hecho, la mayoría de los cambios transcripcionales observados fue la regulación a la baja de la expresión génica en los fibroblastos positivos para micoplasma (Figura 5G), con solo un pequeño subconjunto regulado al alza, incluidos los quimiocinas CXCL3 y CXCL8. GSEA confirmó la amplia regulación a la baja de los conjuntos de genes Hallmark y Reactome (Figura 5H y Figura S6D suplementaria). Entre las pocas vías reguladas al alza se encuentran TNFRECEPTORSUPERFAMILY(TNFSF)MEMBERS MEDIATINGNON-CANONICALNF-KB PATHWAY, CHEMOKINERECEPTORSBINDCHEMOKINES y HALLMARKIL6JAKSTAT3SIGNALING (Figura 5I-L y Figura S6E, F suplementaria), lo que apoya aún más que las respuestas inflamatorias son una consecuencia importante de la infección por micoplasma.

En conjunto, estos datos demuestran que la infección por micoplasma puede servir como un paradigma para las interacciones microbianas-fibroblásticas en el colon inflamado. El efecto sobre la regulación de CXCL8 se media a través de vías dependientes de NF-κB compartidas, lo que destaca un mecanismo microbiano para amplificar la señalización inflamatoria del estroma relevante para la colitis.

Los fibroblastos asociados a la colitis conservan su respuesta a CXCL8 durante la reprogramación de células madre.

A continuación, buscamos explorar por qué los fibroblastos colónicos normales y los UCAF responden de manera diferente a los estímulos inflamatorios. Informamos previamente que las diferencias entre los fibroblastos normales, los UCAF y los CAF con respecto a la secreción de CXCL8 están mediadas en parte por los microARN de la familia miR-17 [^[30]]. Esta observación se corroboró en nuestro estudio actual. Aunque el micoplasma aumentó la expresión de CXCL8 en los fibroblastos colónicos normales y los UCAF, los miembros de la familia miR-17 se regularon constantemente a la baja (Figura 4E-G). Curiosamente, esto parece ser independiente del principal factor de transcripción que regula la expresión de la familia miR-17, MYC. [^[41], ^[42]] El análisis de qRT-PCR para MYC no mostró una regulación a la baja como resultado de la presencia de micoplasma (Figura S6B suplementaria).

También evaluamos si los citocinas inflamatorias y los estímulos bacterianos podrían influir en la expresión de los microARN de la familia miR-17. Curiosamente, la expresión de miR-20a y miR-93 solo cambió en los UCAF CT5-S/T, pero no en los fibroblastos normales CRL1541-S/T (Figura S3I-N suplementaria). Estos hallazgos sugieren una diferencia intrínseca entre los fibroblastos colónicos normales y los UCAF en la regulación de la expresión de CXCL8.

Con base en estos resultados, nos preguntamos si esto se debía a la "memoria asociada a la senescencia", como se describió previamente en los fibroblastos de la piel. [^[43]] Para probar esta hipótesis, utilizamos los fibroblastos derivados del mesénquima (MDF) que informamos recientemente [^[31]]. Estos MDF se aíslan de organoides, que se generan utilizando células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de fibroblastos colónicos normales o UCAF (Figura 6A). Estos MDF conservan el genotipo de los fibroblastos originales, pero se restablecen a un estado más homogéneo y menos diferenciado y carecen de cualquier exposición al microambiente tumoral.

Cuando se compararon los CT5-MDF con su contraparte inmortalizada, CT5-S/T (Figura 6B), la inducción de CXCL8 por TNFα se redujo moderadamente, con un valor Emax más bajo (706 vs. 1183) y un EC50 ligeramente más alto (4,34 vs. 3,39 ng/ml). En contraste, los CRL1541-MDF mostraron una respuesta marcadamente atenuada en comparación con los fibroblastos CRL1541-S/T (Emax de 263 vs. 1264, EC50 de 1,11 vs. 4,92 ng/ml) (Figura 6C). MDF adicionales, uno de una línea de fibroblastos colónicos normales (DPNL-MDF) y uno de una línea de UCAF (KHCT-MDF), corroboraron los resultados (Figura 6D): los MDF de los fibroblastos normales exhibieron una inducción atenuada de CXCL8 (Emax de 35,67 y 68,07), mientras que los MDF de los UCAF conservaron una mayor capacidad de respuesta (Emax de 712,1 y 327,3), respectivamente. En conjunto, estos hallazgos demuestran que, al menos en nuestro número limitado de muestras, la reprogramación de iPSC de los UCAF conservó la capacidad de respuesta a TNFα similar a los UCAF inmortalizados, mientras que la reprogramación de iPSC de los fibroblastos colónicos normales resultó en una respuesta más atenuada. Esto indica que la memoria epigenética o la programación transcripcional estable pueden subyacer al fenotipo inflamatorio persistente observado en los CAF.

DISCUSIÓN

El fenotipo secretor asociado a la senescencia de los fibroblastos colónicos

El objetivo de este estudio fue dilucidar los mecanismos responsables de la elevada secreción de CXCL8 de los fibroblastos intersticiales que contribuyen a la progresión de la colitis ulcerosa a CAC, lo que informamos previamente. [^[23], ^[30]] Utilizando cultivos primarios de fibroblastos colónicos aislados de pacientes sometidos a resección de colon y sus derivados inmortalizados, realizamos un análisis exhaustivo en una gran cohorte para tener en cuenta la heterogeneidad biológica debida a factores genéticos o ambientales. La observación principal fue que el perfil de expresión de los UCAF refleja un estado inflamatorio intrínseco, basado en la regulación al alza del ARNm y la proteína CXCL8, y el enriquecimiento de múltiples firmas inflamatorias, que incluyen HALLMARKINFLAMATORYRESPONSES, HALLMARKINTERFERONALPHARESPONSES y HALLMARKINTERFERONGAMMARESPONSES.

Este estado proinflamatorio es probablemente desencadenado por la senescencia inducida por el estrés, ya que dos de los principales activadores transcripcionales en este proceso, TP53 y CDKN1A, se regulan al alza en los fibroblastos humanos primarios de UCAF en comparación con los fibroblastos colónicos normales, lo que es consistente con las descripciones previas del SASP. [^[14]] En particular, este fenotipo senescente estaba presente en los fibroblastos aislados ex vivo, lo que sugiere que la senescencia y la inflamación son propiedades celulares estables e intrínsecas de los UCAF. Sin embargo, este estado "basal" puede amplificarse aún más por las citocinas inflamatorias (por ejemplo, TNFα o IL-1β) o los estímulos microbianos (por ejemplo, LPS o micoplasma). Por el contrario, puede reducirse mediante la inhibición de la señalización de NFκB, lo que sugiere in vivo, la implantación de un implante de liberación sostenida de TNFα aceleró la aparición y el crecimiento del tumor en presencia de UCAF, lo que confirma la relevancia fisiopatológica de este eje (Figura 3). Si bien no hemos abordado la fuente precisa de estos ligandos inflamatorios in vivo, estos probablemente provienen de interacciones epiteliales, estromales, inmunitarias y microbianas dentro del microambiente del colon inflamado. Las respuestas específicas del tipo celular observadas en nuestro estudio probablemente se deban a los niveles de expresión de los diferentes receptores. Si bien los receptores de TNFα e IL-1β están presentes en todos los tipos de células estudiados, el receptor de LPS TLR4 solo está presente en los fibroblastos colónicos utilizados en este estudio, pero no en la línea celular epitelial de cáncer de colon. Como tal, su expresión se correlaciona con la respuesta de estas células al LPS (Figura 2I, L y Figura S3H suplementaria).

Otra observación interesante del estudio de los fibroblastos del colon primarios es que la progresión de un colon normal a la colitis y, finalmente, al Cáncer de Colon Asociado a Colitis (CAC) no es lineal. Los fibroblastos asociados al cáncer (CAFs) no simplemente "aumentan" el fenotipo inflamatorio observado en los fibroblastos asociados a la colitis ulcerosa (UCAFs). Si bien la mayoría de las firmas génicas características en los CAFs están aún más reguladas al alza en comparación con los UCAFs (Figura 1M-R), los genes individuales de estos conjuntos de genes no siguen todos esta tendencia. Por ejemplo, en HALLMARKRESPUESTASINFLAMATORIAS (Figura 1M), múltiples genes (CCF5, CXCL6, PDPN, TLR3 y TNFSF10) tienen una alta expresión en los UCAFs, pero se reducen en los CAFs, lo que sugiere que los CAFs pueden experimentar una remodelación pro-tumorogénica. De manera similar, los niveles de CXCL8 se reducen en los CAFs (Figura 1A, B). Esta respuesta más matizada podría atribuirse a un cambio en el microambiente, donde las células inmunitarias asumen parte de la señalización inflamatoria que originalmente proporcionaban los fibroblastos. Además, las células cancerosas del colon liberan factores antiinflamatorios para remodelar el tejido circundante, apoyar el crecimiento tumoral y evadir la detección inmune. Como resultado, los CAFs deben adaptarse al microambiente tumoral cambiado. De hecho, se ha demostrado que los CAFs tienden a cambiar su función para apoyar la progresión tumoral y la remodelación de la matriz extracelular durante la progresión de la enfermedad [^[44]].

Diferencias entre los fibroblastos normales del colon y los UCAFs.

Una de las diferencias más llamativas entre los fibroblastos normales del colon y los UCAFs es la magnitud de la inducción de CXCL8, tanto en condiciones basales como tras la estimulación. Esto se observó en la colección de fibroblastos primarios del colon (Figura 1A, B) y tras la estimulación con cantidades crecientes de, por ejemplo, IL-1β (Figura 2J, K) o por la presencia de micoplasma (Figura 4C, D). Para comprender la diferencia entre los fibroblastos normales del colon y los UCAFs, primero nos centramos en los microARN (miARN). Publicamos previamente que los miARN de la familia miR-17 regulan la expresión de CXCL8 y están regulados a la baja en los UCAFs y los CAFs en comparación con los fibroblastos normales del colon, lo que establece una relación inversa [^[30]]. Aquí, ahora mostramos que los miARN de la familia miR-17 también se modifican por las señales inflamatorias o la infección por micoplasma. Sin embargo, esto parece estar restringido a los UCAFs y no se observó en los fibroblastos normales del colon. Además, la magnitud de los cambios en los niveles de expresión de los miARN de la familia miR-17 no parece ser suficiente para explicar el grado de cambio en la expresión de CXCL8. La modulación directa de los niveles de expresión de la familia de miARN miR-17 es formalmente necesaria para descartar este posible mecanismo.

Se obtuvo una conclusión similar para la vía de señalización NFκB, que es uno de los principales mediadores del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) en muchos tipos de células [^[32], ^[45]–^[47]]. Si bien el inhibidor de NFκB, IKK-16, redujo la expresión de CXCL8, no fue suficiente para disminuir por completo toda la expresión (Figura 5A-C).

Nuestros datos sugieren que otras vías están involucradas en la regulación de la expresión de CXCL8. Con este fin, consideramos la memoria inflamatoria, similar a los estudios realizados en otros tejidos, como la piel [^[43]]. Informamos previamente que los organoides derivados de iPSC de origen humano de la colitis ulcerosa (UC) derivados de UCAFs conservaron sus características funcionales en comparación con un modelo de organoides normal derivado de iPSC de fibroblastos normales del colon [^[31]]. Aquí, mostramos que los fibroblastos mesenquimales derivados de iPSC de estos organoides derivados de UCAFs mostraron una respuesta robusta de CXCL8 a TNFα, mientras que los fibroblastos del colon derivados de iPSC de fibroblastos normales del colon mostraron una respuesta muy limitada. Estos hallazgos sugieren que los fibroblastos del colon pueden conservar las características fenotípicas de los fibroblastos originales y exhibir una memoria de la enfermedad en la forma en que responden a los estímulos inflamatorios. Si bien estos datos son muy interesantes, se necesitarán experimentos adicionales para identificar el mecanismo subyacente a esta memoria. Basado en el estudio original en la piel [^[43]], esto probablemente involucrará cambios epigenéticos que no se borran durante el establecimiento de las células iPSC.

¿Inflamación como estado basal para los fibroblastos del colon?

Además de comprender estos cambios en los fibroblastos durante la colitis y su contribución a la progresión tumoral, el estudio también destaca un desafío técnico. El estado inflamatorio del entorno real del colon en el cuerpo humano es claramente muy diferente de cómo se mantienen las células en el cultivo celular. In vivo, las células epiteliales, los fibroblastos, las células inmunitarias, la microbiota, así como los componentes de las heces, forman un microambiente activo. Sin embargo, los protocolos estándar de cultivo celular en laboratorio se basan en un entorno "limpio", donde los fibroblastos carecen de signos de contaminación (por ejemplo, micoplasma) o la presencia de bacterias. Nuestros datos ahora sugieren que un UCAF "limpio" carece de muchas de las características de los UCAFs presentes in vivo y, por lo tanto, es menos representativo de un entorno real del colon. Por lo tanto, los estudios futuros de los UCAFs se beneficiarán de sistemas experimentales que repliquen mejor el microambiente colónico nativo presente en el colon humano.

El fenotipo secretor asociado a la senescencia de los fibroblastos del colon

El objetivo de este estudio fue dilucidar los mecanismos responsables de la elevada secreción de CXCL8 de los fibroblastos intersticiales que contribuyen a la progresión de la colitis ulcerosa a CAC, lo que informamos previamente [^[23], ^[30]]. Utilizando cultivos primarios de fibroblastos del colon aislados de pacientes sometidos a resección de colon y sus derivados inmortalizados, realizamos análisis exhaustivos en una gran cohorte para tener en cuenta la heterogeneidad biológica debida a factores genéticos o ambientales. La observación principal fue que el perfil de expresión de los UCAFs refleja un estado inflamatorio intrínseco, basado en la regulación al alza del ARNm y la proteína de CXCL8, y el enriquecimiento de múltiples firmas inflamatorias, incluyendo HALLMARKRESPUESTASINFLAMATORIAS, HALLMARKRESPUESTAINTERFERONALFA y HALLMARKRESPUESTAINTERFERONGAMMA.

Este estado proinflamatorio probablemente es desencadenado por la senescencia inducida por el estrés, ya que dos de los principales activadores transcripcionales en este proceso, TP53 y CDKN1A, están regulados al alza en los UCAFs humanos primarios en comparación con los fibroblastos normales del colon, lo que es consistente con las descripciones previas del SASP [^[14]]. Cabe destacar que este fenotipo senescente estaba presente en los fibroblastos aislados ex vivo, lo que sugiere que la senescencia y la inflamación son propiedades estables e intrínsecas de los UCAFs. Sin embargo, este estado "basal" puede amplificarse aún más por las citocinas inflamatorias (por ejemplo, TNFα o IL-1β) o los estímulos microbianos (por ejemplo, LPS o micoplasma). Por el contrario, puede reducirse mediante la inhibición de la señalización de NFκB, la señalización in vivo, la implantación de una pastilla de liberación sostenida de TNFα aceleró la aparición y el crecimiento del tumor en presencia de UCAFs, lo que confirma la relevancia fisiopatológica de este eje (Figura 3). Si bien no hemos abordado la fuente precisa de estos ligandos inflamatorios in vivo, estos probablemente provienen de interacciones epiteliales, estromales, inmunitarias y microbianas dentro del microambiente inflamado del colon. Las respuestas específicas del tipo de célula observadas en nuestro estudio probablemente se deban a los niveles de expresión de los diferentes receptores. Si bien los receptores de TNFα e IL-1β se expresan en todos los tipos de células estudiados, el receptor de LPS, TLR4, solo está presente en los fibroblastos del colon utilizados en este estudio, pero no en la línea celular epitelial del cáncer de colon. Como tal, su expresión se correlaciona con la respuesta de estas células a LPS (Figura 2I, L y Figura S3 suplementaria).

Otra observación interesante del estudio de los fibroblastos primarios del colon es que la progresión de un colon normal a la colitis y, finalmente, al Cáncer de Colon Asociado a Colitis (CAC) no es lineal. Los fibroblastos asociados al cáncer (CAFs) no simplemente "aumentan" el fenotipo inflamatorio observado en los fibroblastos asociados a la colitis ulcerosa (UCAFs). Si bien la mayoría de las firmas génicas características en los CAFs están aún más reguladas al alza en comparación con los UCAFs (Figura 1M-R), los genes individuales de estos conjuntos de genes no siguen todos esta tendencia. Por ejemplo, en HALLMARKRESPUESTASINFLAMATORIAS (Figura 1M), múltiples genes (CCF5, CXCL6, PDPN, TLR3 y TNFSF10) tienen una alta expresión en los UCAFs, pero se reducen en los CAFs, lo que sugiere que los CAFs pueden experimentar una remodelación pro-tumorogénica. De manera similar, los niveles de CXCL8 se reducen en los CAFs (Figura 1A, B). Esta respuesta más matizada podría atribuirse a un cambio en el microambiente, donde las células inmunitarias asumen parte de la señalización inflamatoria que originalmente proporcionaban los fibroblastos. Además, las células cancerosas del colon liberan factores antiinflamatorios para remodelar el tejido circundante, apoyar el crecimiento tumoral y evadir la detección inmune. Como resultado, los CAFs deben adaptarse al microambiente tumoral cambiado. De hecho, se ha demostrado que los CAFs tienden a cambiar su función para apoyar la progresión tumoral y la remodelación de la matriz extracelular durante la progresión de la enfermedad [^[44]].

Diferencias entre los fibroblastos normales del colon y los UCAFs.

Una de las diferencias más llamativas entre los fibroblastos normales del colon y los UCAFs es la magnitud de la inducción de CXCL8, tanto en condiciones basales como tras la estimulación. Esto se observó en la colección de fibroblastos primarios del colon (Figura 1A, B) y tras la estimulación con cantidades crecientes de, por ejemplo, IL-1β (Figura 2J, K) o por la presencia de micoplasma (Figura 4C, D). Para comprender la diferencia entre los fibroblastos normales del colon y los UCAFs, primero nos centramos en los microARN (miARN). Publicamos previamente que los miARN de la familia miR-17 regulan la expresión de CXCL8 y están regulados a la baja en los UCAFs y los CAFs en comparación con los fibroblastos normales del colon, lo que establece una relación inversa [^[30]]. Aquí, ahora mostramos que los miARN de la familia miR-17 también se modifican por las señales inflamatorias o la infección por micoplasma. Sin embargo, esto parece estar restringido a los UCAFs y no se observó en los fibroblastos normales del colon. Además, la magnitud de los cambios en los niveles de expresión de los miARN de la familia miR-17 no parece ser suficiente para explicar el grado de cambio en la expresión de CXCL8. La modulación directa de los niveles de expresión de la familia de miARN miR-17 es formalmente necesaria para descartar este posible mecanismo.

Se obtuvo una conclusión similar para la vía de señalización NFκB, que es uno de los principales mediadores del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) en muchos tipos de células [^[32], ^[45]–^[47]]. Si bien el inhibidor de NFκB, IKK-16, redujo la expresión de CXCL8, no fue suficiente para disminuir por completo toda la expresión (Figura 5A-C).

Nuestros datos sugieren que otras vías están involucradas en la regulación de la expresión de CXCL8. Con este fin, consideramos la memoria inflamatoria, similar a los estudios realizados en otros tejidos, como la piel [^[43]]. Informamos previamente que los organoides derivados de iPSC de origen humano de la colitis ulcerosa (UC) derivados de UCAFs conservaron sus características funcionales en comparación con un modelo de organoides normal derivado de iPSC de fibroblastos normales del colon [^[31]]. Aquí, mostramos que los fibroblastos mesenquimales derivados de iPSC de estos organoides derivados de UCAFs mostraron una respuesta robusta de CXCL8 a TNFα, mientras que los fibroblastos del colon derivados de iPSC de fibroblastos normales del colon mostraron una respuesta muy limitada. Estos hallazgos sugieren que los fibroblastos del colon pueden conservar las características fenotípicas de los fibroblastos originales y exhibir una memoria de la enfermedad en la forma en que responden a los estímulos inflamatorios. Si bien estos datos son muy interesantes, se necesitarán experimentos adicionales para identificar el mecanismo subyacente a esta memoria. Basado en el estudio original en la piel [^[43]], esto probablemente involucrará cambios epigenéticos que no se borran durante el establecimiento de las células iPSC.

¿Inflamación como estado basal para los fibroblastos del colon?

Además de comprender estos cambios en los fibroblastos tras la colitis y su contribución a la progresión tumoral, el estudio también destaca un desafío técnico. El estado inflamatorio del entorno real del colon en el cuerpo humano es claramente muy diferente de cómo se mantienen las células en cultivo tisular. In vivo, las células epiteliales, los fibroblastos, las células inmunitarias, la microbiota, así como los componentes de las heces, forman un microentorno activo. Sin embargo, los protocolos estándar de cultivo celular en el laboratorio se basan en un entorno "limpio", donde los fibroblastos carecen de cualquier signo de contaminación (por ejemplo, micoplasma) o de la presencia de bacterias. Nuestros datos sugieren ahora que un UCAF "limpio" carece de muchas de las características de los UCAF presentes in vivo y, por lo tanto, es menos representativo de un entorno real del colon. Por lo tanto, los futuros estudios de los UCAF se beneficiarán de sistemas experimentales que repliquen mejor el microentorno colónico nativo presente en el colon humano.

CONCLUSIONES

En resumen, nuestro estudio identificó los UCAF y los CAF como mediadores estromales clave de la inflamación en la CU y el CAC, que se caracterizan por una senescencia estable e intrínseca a las células y una expresión persistente de CXCL8. Demostramos que la expresión de CXCL8 derivada de los fibroblastos se amplifica mediante citocinas y señales microbianas a través de las vías de NFκB, y que esta mayor capacidad de respuesta se mantiene incluso después de la reprogramación de las iPSC, lo que sugiere una memoria epigenética. Estos hallazgos destacan a los fibroblastos no solo como contribuyentes al cruce de señales entre el tumor y el estroma, sino también como posibles biomarcadores de la progresión de la enfermedad y objetivos terapéuticos para interceptar la oncogénesis del colon impulsada por la inflamación.