La deficiencia de PLSCR3 desencadena la activación del cGAS-STING impulsada por el ADN mitocondrial para potenciar la inmunidad antitumoral en el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad por cáncer a nivel mundial, lo que plantea importantes desafíos clínicos a pesar de los avances en cirugía, quimioterapia y terapias dirigidas [^[1], ^[2]]. En los últimos años, la inmunoterapia, en particular el bloqueo de puntos de control inmunitarios (BCPI) dirigido a la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), ha surgido como una modalidad transformadora en el CCR [^[3]]. Sin embargo, solo un subconjunto de pacientes, principalmente aquellos con tumores con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H), presenta respuestas duraderas a la inmunoterapia, lo que destaca la urgente necesidad de dilucidar nuevos mecanismos reguladores de la inmunidad tumoral e identificar nuevos objetivos terapéuticos [^[4], ^[5]].

Las mitocondrias son fundamentales no solo para el metabolismo energético celular, sino también para la regulación inmunitaria y la biología tumoral [^[6]–^[8]]. La disfunción mitocondrial y la permeabilización de la membrana provocan la liberación de ADN mitocondrial (ADNmt) —un potente patrón molecular asociado al daño (DAMP)— hacia el citosol [^[9]–^[11]]. El ADNmt citosólico es detectado por la sintasa cíclica de GMP-AMP (cGAS), que cataliza la producción de tipo I de interferón (IFN-I) dependiente del estimulador de genes de interferón (STING) [^[12]]. Se ha demostrado que la activación de la vía cGAS-STING en las células tumorales y el microambiente tumoral (MET) mejora la inmunidad antitumoral y mejora las respuestas al BCPI [^[13]–^[15]].

La fosfolipasa scramblasa 3 (PLSCR3), una proteína transportadora de lípidos residente en la membrana interna mitocondrial (MIM), mantiene la asimetría y la función de la membrana mitocondrial [^[16], ^[17]]. Aunque los estudios en contextos no cancerosos implican a la PLSCR3 en el control de calidad mitocondrial y la mitofagia [^[18], ^[19]], su participación en la biología tumoral y la regulación inmunitaria no se ha investigado a fondo. En esencia, si bien los reguladores de la membrana externa mitocondrial (MEM) (por ejemplo, PINK1/Parkin) modulan el control de calidad mitocondrial [^[20]], aún no se ha resuelto si los guardianes de la MIM, como la PLSCR3, restringen las respuestas inmunitarias antitumorales.

En este estudio, primero realizamos análisis bioinformáticos integrados utilizando los conjuntos de datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) para identificar genes relacionados con las mitocondrias que se expresan de manera diferente en el CCR y que están asociados con el pronóstico del paciente. Entre los genes candidatos, la PLSCR3 surgió como un candidato principal, mostrando una alta expresión tumoral correlacionada con una mala supervivencia. Mecanísticamente, la deficiencia de PLSCR3 desencadena la disfunción mitocondrial, lo que provoca la acumulación de ADNmt en el citosol y la activación de la vía cGAS-STING. Los estudios funcionales demuestran que la pérdida de PLSCR3 mejora notablemente las respuestas de IFN-I y la secreción de quimiocinas que potencian la inmunidad antitumoral mediada por células asesinas naturales (NK) y células T citotóxicas. Es importante destacar que la deficiencia de PLSCR3 sensibiliza los tumores a la inmunoterapia anti-PD-1 in vivo. En particular, la deficiencia de PLSCR3 supera la resistencia al bloqueo de PD-1 en el CCR MSS in vivo.

En este estudio, realizamos un análisis integrativo de los conjuntos de datos transcriptómicos del CCR para identificar genes asociados a las mitocondrias vinculados a la expresión diferencial y la supervivencia. Se priorizó la PLSCR3 porque se sobreexpresó en el CCR, se asoció con una peor supervivencia en el análisis univariado y se localizó en las mitocondrias. Mecanísticamente, demostramos que la deficiencia de PLSCR3 perjudica la homeostasis mitocondrial, promueve la liberación de ADNmt en el citosol y activa la señalización cGAS-STING. Funcionalmente, la pérdida de PLSCR3 mejora la muerte tumoral mediada por células inmunitarias y mejora la respuesta a la terapia anti-PD-1 en un modelo sinérgico CT26. Estos hallazgos respaldan la PLSCR3 como un posible regulador que conecta la homeostasis mitocondrial con la señalización inmunitaria innata intrínseca del tumor en el CCR.

2. Método

2.1. Adquisición y procesamiento de datos

Los datos transcriptómicos y la información clínica para COAD-READ se obtuvieron de TCGA. Los datos brutos se descargaron y se procesaron/filtraron utilizando el software R (versión 4.0.5). El conjunto de genes relacionados con las mitocondrias se seleccionó de la base de datos MitoCarta 3.0 (https://www.broadinstitute.org/mitocarta/mitocarta30-inventory-mammalian-mitochondrial-proteins-and-pathways) y GSEA/MSigDB (http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp); la estrategia analítica fue coherente con estudios previos de genes mitocondriales en el CCR [^[21]]. Las imágenes de inmunohistoquímica (IHC) del CCR, los datos de localización subcelular y los transcriptomas de las líneas celulares del CCR se obtuvieron de la base de datos Human Protein Atlas (HPA) (https://www.proteinatlas.org/). Los datos de tejidos humanos sanos se obtuvieron del proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx) (https://gtexportal.org/). El análisis pronóstico se realizó utilizando la plataforma en línea KM Plotter (https://kmplot.com/analysis/).

2.2. Análisis funcional

Tras la adquisición de los datos transcriptómicos del CCR, se identificaron los genes expresados de forma diferencial (DEG) utilizando el paquete limma en R (p ajustada por FDR < 0,05, |log₂FC| > 0,585). Posteriormente, se realizó una anotación funcional de los DEG mediante el enriquecimiento de GO (ontología génica) y los análisis de vías KEGG (enciclopedia de genes y genomas de Kioto) a través del paquete R clusterProfiler.

2.3. Análisis pronóstico

El conjunto de genes relacionados con las mitocondrias (obtenido como se indicó anteriormente) se intersectó con los DEG del CCR utilizando el análisis basado en R. Los genes que se superponían entre estos dos conjuntos se sometieron a una regresión de Cox univariada utilizando el paquete de supervivencia R. Se calcularon las razones de riesgo (HR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) para evaluar las asociaciones con la supervivencia general (OS) en las cohortes de CCR.

2.4. Transfección y construcción de líneas celulares estables

Se utilizó Lipofectamine 3000 para la transfección transitoria de plásmidos o dúplex de siRNA según las instrucciones del fabricante. Para la interferencia de ARN, la transfección se repitió dos veces con un intervalo de 24 horas para lograr la máxima eficacia del ARN de interferencia. El siRNA específico para PLSCR3 (5'‐AUGGAAGUACAGGCUCCACC‐3') se obtuvo de GentleGen. Las líneas celulares estables se generaron mediante la transfección transitoria del plásmido específico y la selección con G418 o puromicina. La inhibición de PLSCR3 en las células HT29 y DLD1 se logró utilizando siRNA.

2.5. Eliminación génica mediada por lentivirus en las células CT26.WT

La eliminación de PLSCR3 mediada por CRISPR/Cas9 se realizó en las células CT26. Brevemente, un vector lentiviral que expresa gRNA se transfectó con vectores de empaquetamiento en células HEK293T de empaquetamiento. Los sobrenadantes virales se recogieron y se filtraron con un filtro de 0,22 mm a las 48 y 72 horas después de la transfección. Las células diana se infectaron dos veces y se clasificaron mediante la clasificación celular mediada por citometría de flujo. Para algunos experimentos, se sembró una sola célula en una placa de 96 pocillos mediante citometría de flujo para el aislamiento de un solo clon. Se verificaron los clones únicos aislados mediante Western blot.

2.6. Líneas celulares

La línea celular de carcinoma de colon humano HT29 (núm. de catálogo ATCC-HTB-38) y la línea celular de carcinoma de colon de ratón CT26.WT (núm. de catálogo CRL-2638, ATCC, Virginia, Estados Unidos) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (núm. de catálogo BC-M-017, Bio-Channel, Jiangsu, China) suplementado con un 10% de suero fetal bovino. Las líneas celulares se cultivaron en una atmósfera húmeda con un 5% de CO2 a 37 °C. El tampón fosfato salino (PBS) utilizado en el cultivo celular se compró a Bio-Channel (núm. de catálogo BC-BPBS-01, Bio-Channel, Jiangsu, China).

2.7. Anticuerpos y reactivos

Anti-PLSCR3 (ratón/IgG, núm. de catálogo sc-100808) se compró a Santa Cruz Biotechnology (Texas, Estados Unidos). Anti-STING (conejo/IgG, núm. de catálogo 19851-1-AP), anti-ISG60 (conejo/IgG, núm. de catálogo 15201-1-AP), anti-GAPDH (conejo/IgG, núm. de catálogo 10494-1-AP) y anti-IFIH1 (conejo/IgG, núm. de catálogo 21775-1-AP) se compraron a Proteintech (Illinois, Estados Unidos). Los anticuerpos anti-Phospho-STING (conejo/IgG, núm. de catálogo 50907s) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Massachusetts, Estados Unidos). El agonista STING (núm. de catálogo HY-103665, núm. CAS: 2138299-29-1) y el DDC (núm. de catálogo HY-17392, núm. CAS: 7481-89-2) se compraron a MedChemExpress (Shanghái, China).

2.8. Análisis de Western blot

Las proteínas se extrajeron utilizando un tampón de lisis RIPA, se cuantificaron mediante un ensayo de BCA y se desnaturalizaron en un tampón de Laemmli a 95 °C durante 5 minutos. Las muestras (30 μg/carril) se separaron mediante SDS-PAGE (geles al 12%) a 120 V y luego se transfirieron a membranas de PVDF mediante transferencia en húmedo (100 mA, 2 h). Las membranas se bloquearon en un 5% de leche descremada/TBST durante 1 h a temperatura ambiente, se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios, se lavaron tres veces con TBST y se sondearon con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:5000, 1 h a temperatura ambiente). Después de los lavados finales, las señales se detectaron utilizando un sustrato quimioluminiscente (ECL) y se visualizaron mediante sistemas digitales (Azure), con GAPDH como controles de carga.

2.9. Ensayo de potencial de membrana mitocondrial JC-1

Las células se incubaron con el colorante JC-1 (MedChemExpress, núm. de catálogo HY-K0601) a 37 °C en la oscuridad, lo que permitió la acumulación en las mitocondrias; el alto potencial de membrana promovió la formación de agregados J (fluorescencia roja), mientras que las mitocondrias despolarizadas retuvieron los monómeros de JC-1 (fluorescencia verde). Después de la tinción, las células se lavaron y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia, y la relación de fluorescencia roja/verde se cuantificó para evaluar los cambios en el potencial de membrana mitocondrial.

2.10. Cuantificación de la fluorescencia JC-1

El potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se evaluó mediante la tinción con JC-1, y las imágenes de fluorescencia se cuantificaron utilizando el software ImageJ (NIH). Las imágenes RGB se dividieron en canales rojo y verde para separar los agregados de JC-1 (fluorescencia roja, que indica un ΔΨm alto) de los monómeros de JC-1 (fluorescencia verde, que indica un ΔΨm bajo). La fluorescencia de fondo se restó utilizando un radio de bola rodante de 50 píxeles. Se definieron regiones de interés (ROI) que correspondían a las áreas celulares mediante el umbral automático, y la intensidad media de fluorescencia (MFI) de los canales rojo y verde se midió dentro de las mismas ROI. El potencial de membrana mitocondrial se expresó como la relación de intensidad de fluorescencia rojo a verde. Todos los parámetros de imagen, incluidos la intensidad del láser, el tiempo de exposición, la ganancia y la configuración del objetivo, se mantuvieron constantes entre los grupos para garantizar la comparabilidad.

2.11. Detección de la tasa de consumo de oxígeno (OCR)

Las células se sembraron a 2 × 104 células por pocillo en placas de microcultivo XF de Seahorse y se dejaron adherir durante la noche. La OCR se midió utilizando un analizador de flujo extracelular XFe96 de Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, California, Estados Unidos). Antes del ensayo, las células se equilibraron en un medio de ensayo XF de Seahorse sin CO2 y luego se trataron secuencialmente con moduladores mitocondriales: primero se añadió oligomicina (1-2 μM) para inhibir la ATP sintasa, seguida de una medición de 10-15 minutos de la respiración dependiente de ATP; a continuación, se inyectó FCCP (0,5 μM) para desacoplar las mitocondrias, y se registró la respiración máxima después de un equilibrio de 2-3 minutos; por último, se administraron conjuntamente rotenona (0,5 μM) y antimicina A (0,5 μM) para bloquear el complejo I/III, lo que permitió medir el consumo de oxígeno no mitocondrial. Los niveles de oxígeno se rastrearon en tiempo real mediante sensores ópticos, y los valores de OCR se derivaron de las tasas de agotamiento y se normalizaron al recuento de células o al contenido de proteínas para el análisis funcional.

2.12. Extracción mitocondrial y medición de la relación D-loop de ADNmt

Las células se recogieron mediante centrifugación a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C. Los sedimentos celulares resultantes se lavaron una vez con PBS frío y, a continuación, se resuspendieron en un tampón hipotónico frío suplementado con inhibidores de proteasas (tabletas de cóctel completo de inhibidores de proteasas, Roche). Posteriormente, las células se sometieron a lisis utilizando un homogeneizador Dounce. Los lisados se centrifugaron a 500 × g durante 10 minutos a 4 °C para sedimentar los núcleos (que se descartaron), y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Estos sobrenadantes se centrifugaron a 5000 × g durante 10 minutos a 4 °C, obteniendo dos fracciones: la fracción mitocondrial (P5K) y la fracción citosólica no mitocondrial (S5K). El ADNmt se purificó a partir de estas distintas fracciones utilizando un kit de extracción de ADN (n.º de catálogo D3396-01; OMEGA, Norcross, Georgia). Tras la purificación, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando cebadores específicos para la región del bucle D para analizar los niveles de ADNmt. La relación entre los niveles de ADNmt en la fracción S5K y los de la fracción P5K se utilizó para representar la liberación relativa de ADNmt de las mitocondrias al citosol. (D-loop-MT325F: 5′-CACAGCACTTAAACACATCTCTGC-3′; D-loop-MT474R: 5′-AGTATGGGAGTGRGAGGGRAAAA-3′). Dado que la fracción citosólica se definió operativamente mediante centrifugación diferencial, no se puede excluir por completo la posible contaminación mitocondrial residual y debe tenerse en cuenta al interpretar estos datos.

2.13. Cuantificación de 2′3′-cGAMP (ciclo-guanosina monofosfato-adenosina monofosfato)

Para determinar el nivel intracelular de 2′3′-cGAMP en células HT29 con reducción de PLSCR3 (KDPLSCR3) y células de control normales (NC), se realizó un ELISA competitivo utilizando el kit de ELISA competitivo 2′3′-cíclico GAMP (n.º de catálogo 501700, Cayman Chemical). Brevemente, las células se recogieron, se lavaron dos veces con PBS preenfriado y se lisaron en tampón de lisis M-PER (n.º de catálogo 78501, Thermo Fisher Scientific) sobre hielo durante 15 minutos (con mezcla en vórtice tres veces); el lisado se centrifugó a 12 000 × g durante 15 minutos a 4 °C para recoger el sobrenadante, y la concentración de proteína se normalizó utilizando el ensayo BCA. Para el ELISA, se añadieron 100 μL de estándares de cGAMP diluidos en serie (0-1600 pg/mL) o muestras (por triplicado) a placas de 96 pocillos pretratadas con anticuerpos, seguidas de 100 μL de trazador cGAMP-HRP; la placa se selló e incubó a temperatura ambiente con agitación (500 rpm) durante 1 hora. Después de cinco lavados con tampón de lavado 1×, se añadieron 100 μL de sustrato TMB durante 15-20 minutos de incubación protegida de la luz, y la reacción se detuvo con 50 μL de H2SO4 2 N. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas, y la concentración de cGAMP se calculó mediante regresión logística de cuatro parámetros de la curva estándar (requiriendo R_
2 > 0,99). Se aseguró el control de calidad manteniendo un coeficiente de variación (CV) < 10 % para los estándares y < 15 % para los triplicados de las muestras, y todas las operaciones se realizaron sobre hielo o a 4 °C para minimizar la degradación del cGAMP.

2.14. ELISA

Las células HT29 (1 × 106) con o sin reducción de PLSCR3 se sembraron en placas de seis pocillos en un medio de crecimiento completo. Las quimiocinas secretadas se midieron mediante el kit de ELISA de IFNβ humano (PI572, Beyotime, China) y el kit de ELISA de CXCL10 humano (PC208, Beyotime, China), según los protocolos del fabricante. Los tumores aislados del injerto se prepararon y se picaron con cuchillas, y luego los tejidos tumorales se cultivaron en PBS durante 4 horas a 37 °C. La cantidad secretada de Granzima B en el cultivo se midió mediante el kit de ELISA de Granzima B de ratón (BMS6029), según los protocolos del fabricante.

2.15. RT-qPCR

Se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol, se cuantificó mediante espectrofotometría (relación A260/A280 ≥ 1,8) y se transcribió a ADNc utilizando una transcriptasa inversa con cebadores de oligo(dT) o hexámeros aleatorios. Las reacciones de qPCR se prepararon con SYBR Green Pro Tag HS Premix (AG11701, Accurate Biology, China), cebadores específicos del gen (100 nM) y plantilla de ADNc (50 ng) y luego se amplificaron en un sistema de PCR en tiempo real en condiciones de ciclaje estandarizadas (95 °C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 1 minuto). El análisis de la curva de fusión confirmó la especificidad del cebador, y la expresión génica relativa se cuantificó mediante el método Δ
ΔCt, normalizado a controles endógenos (GAPDH), con controles sin plantilla y sin RT incluidos para excluir la contaminación.

2.16. Microscopía Confocal

Las células HT29 transfectadas se subcultivaron y se cultivaron en portaobjetos. Para detectar el estado y la ubicación celular de STING, las células se fijaron con un 4 % de paraformaldehído, se permeabilizaron con Triton-X100 y se incubaron en un 5 % de FBS y anti-STING, seguido de la incubación con IgG antirrabbit conjugado con FITC (H + L) a temperatura ambiente. Las imágenes de las células se capturaron con un microscopio confocal de escaneo láser ZEISS (Zeiss LSM 900, Oberkochen, Alemania). El software ZEISS ZEN Microscope se utilizó para la operación y la adquisición. Los porcentajes de células con formación de focos se analizaron estadísticamente.

Para la cuantificación de la activación de STING, las células que mostraban focos puntados de STING se contaron manualmente en al menos cinco campos seleccionados aleatoriamente por muestra en condiciones de imagen idénticas. El porcentaje de células STING-positivas se calculó como el número de células con focos de STING dividido por el número total de células por campo. Se analizaron al menos 100 células por condición en cada experimento. La cuantificación se realizó en tres réplicas biológicas independientes.

2.17. Citotoxicidad de células NK ex vivo

Las células NK se aislaron de sangre del cordón umbilical (proporcionada por el Banco de Células Hematopoyéticas del Cordón Umbilical de la Provincia de Zhejiang). En primer lugar, la sangre del cordón umbilical se diluyó y se sometió a una centrifugación de gradiente de densidad sobre una capa de Ficoll para aislar las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC). Posteriormente, se empleó la clasificación celular activada magnéticamente (MACS) utilizando un kit de aislamiento de células NK específico (Miltenyi, n.º de catálogo 130-092-657) para enriquecer selectivamente las células NK en función de la expresión de CD56. La población de células NK enriquecida se purificó aún más mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) con anticuerpos dirigidos. Por último, se validó la pureza y la funcionalidad de las células NK aisladas mediante citometría de flujo y ensayos funcionales para garantizar su integridad y relevancia biológica.

Para los ensayos de citotoxicidad, las células de CRC (HT29 o DLD1) se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 104 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Se añadieron células NK purificadas a una relación efector:objetivo (E:T) de 5:1, a menos que se indique lo contrario. La cocultivo se realizó durante 24 horas a 37 °C. Después del cocultivo, la viabilidad de las células tumorales se evaluó mediante microscopía de contraste de fases y se cuantificó contando el número de células tumorales adheridas restantes en campos seleccionados aleatoriamente (n = 5 campos por pocillo). En paralelo, la viabilidad celular se confirmó aún más mediante el ensayo de exclusión de azul de tripan. Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes.

2.18. Preparación de células T infiltrantes tumorales

Los tumores se picaron con tijeras y luego se digirieron con el tampón de digestión (medio RPMI 1640, 5 % de FBS, 1 % de penicilina-estreptomicina, 25 mM de HEPES y 300 U de colagenasa, Sigma C0130) en un agitador a 37 °C durante 2 horas. Se prepararon células individuales mediante un tamiz celular de 70 μm. Los eritrocitos se eliminaron mediante la incubación en un tampón de lisis de glóbulos rojos (R7757, Sigma) a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las células se prepararon en PBS (con una concentración de ~2 × 107) para los estudios.

2.19. Citometría de flujo

La suspensión de células individuales se fijó con una solución de paraformaldehído al 4 % (E672002, Sangon Biotech, China). Las células T CD45+ se seleccionaron a partir de una suspensión de células individuales (aproximadamente 2 × 107 células digeridas a partir del tejido tumoral) mediante citometría de flujo con los siguientes anticuerpos (anti-ratón CD45; BD Pharmingen, 561875). Y luego las células se tiñeron con anti-ratón CD3e PE (145-2C11, BD Pharmingen, 553063), anti-ratón CD4 FITC (RM4-5, BD Pharmingen, 553046), anti-ratón CD4 PE/Cy7 (GK1.5, BioLegend, 100421), anti-ratón CD8 FITC (53-6.7, BD Pharmingen, 553031) y anti-ratón CD8a APC/Cy7 (53-6.7, BioLegend, 100713).

El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando una estrategia de selección estándar. Brevemente, primero se identificaron las células individuales en función de los perfiles de dispersión directa y lateral (FSC-A frente a FSC-H) para excluir los dobletes. Las células muertas se excluyeron en función de la tinción del tinte de viabilidad, cuando corresponda. A continuación, se seleccionaron las células leucocíticas CD45+, seguidas de la selección de los subconjuntos de células T CD3+. Dentro de la población de células T CD3+, se identificaron aún más los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo.

2.20. Modelo de injerto de carcinoma colorrectal sinérgico

Las células CT26.WT con reducción de PLSCR3 o con control aleatorio (1,5 × 105) se mezclaron con BD Matrigel (matriz con factor de crecimiento reducido) (BD, 354230) en 100 μL de PBS y luego se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones BALB/c de 8 a 10 semanas de edad (del Jackson Laboratory, 000664). El crecimiento tumoral se midió con un calibrador, y el tamaño se expresó en centímetros cúbicos cada 3 días. Para el tratamiento con anticuerpos, se inyectó IgG de control (10 mg/kg) o anti-PD-1 (RMP1-14, BioXCell, 10 mg/kg) por vía intraperitoneal (i.p.) en los días 6, 9, 12, 15 y 18 después de la inoculación de las células tumorales. Para la curva de crecimiento tumoral, los injertos se midieron con un calibrador y se establecieron (0,5 × longitud × ancho2) cada 5 días. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, y el protocolo fue revisado y aprobado por el Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang.

2.21. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 11. Los datos se presentan como media ± DE, a menos que se indique lo contrario. Las comparaciones entre dos grupos independientes se realizaron utilizando una prueba t de Student de dos colas no pareada. Para las comparaciones que involucran a más de dos grupos, se utilizó ANOVA de una vía seguida de la prueba post hoc de comparación múltiple de Tukey, a menos que se indique lo contrario. Las curvas de crecimiento tumoral se analizaron utilizando ANOVA de medidas repetidas de dos vías con las pruebas post hoc de comparación múltiple apropiadas. Se consideraron estadísticamente significativas las diferencias con p < 0,05 y altamente significativas con p < 0,01, p < 0,001 y p < 0,0001.

2.1. Adquisición y procesamiento de datos

Los datos transcriptómicos y la información clínica del COAD-READ se obtuvieron de TCGA. Los datos brutos se descargaron y se procesaron/filtraron utilizando el software R (versión 4.0.5). El conjunto de genes relacionados con las mitocondrias se seleccionó a partir de la base de datos MitoCarta 3.0 (https://www.broadinstitute.org/mitocarta/mitocarta30-inventory-mammalian-mitochondrial-proteins-and-pathways) y GSEA/MSigDB (http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp); la estrategia analítica fue coherente con estudios previos de genes mitocondriales en el CRC [^[21]]. Las imágenes de inmunohistoquímica (IHC) del CRC, los datos de localización subcelular y los transcriptomas de las líneas celulares del CRC se obtuvieron de la base de datos del Human Protein Atlas (HPA) (https://www.proteinatlas.org/). Los datos de tejidos humanos sanos se obtuvieron del proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx) (https://gtexportal.org/). El análisis pronóstico se realizó utilizando la plataforma en línea KM Plotter (https://kmplot.com/analysis/).

2.2. Análisis funcional

Tras la adquisición de los datos transcriptómicos del CRC, se identificaron los genes expresados diferencialmente (DEG) utilizando el paquete limma en R (FDR ajustado p < 0,05, |log2FC| > 0,585). Posteriormente, se realizó una anotación funcional de los DEG mediante el enriquecimiento GO (ontología génica) y los análisis de vías KEGG (enciclopedia de genes y genomas de Kioto) a través del paquete R clusterProfiler.

2.3. Análisis pronóstico

El conjunto de genes relacionados con las mitocondrias (seleccionado como se indicó anteriormente) se intersectó con los DEG del CRC utilizando el análisis basado en R. Los genes que se superponían entre estos dos conjuntos se sometieron a una regresión de riesgos proporcional univariada utilizando el paquete de supervivencia R. Se calcularon las razones de riesgo (HR) y los intervalos de confianza del 95 % (IC) para evaluar las asociaciones con la supervivencia general (OS) en las cohortes de CRC.

2.4. Transfección y Construcción de Líneas Celulares Estables

Se utilizó Lipofectamine 3000 para la transfección transitoria de plásmidos o dúplexes de siRNA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la interferencia de ARN, la transfección se repitió dos veces con un intervalo de 24 horas para lograr la máxima eficacia de la interferencia de ARN. El siRNA específico para PLSCR3 (5′‐AUGGAAGUACAGGCUCCACC‐3′) se obtuvo de GentleGen. Las líneas celulares estables se generaron mediante la transfección transitoria del plásmido específico y la selección con G418 o puromicina. La reducción de la expresión de PLSCR3 en las células HT29 y DLD1 se logró utilizando siRNA.

2.5. Eliminación Génica Mediada por Lentivirus en Células CT26.WT

La eliminación de PLSCR3 mediada por CRISPR/Cas9 se realizó en células CT26. Brevemente, un vector lentiviral que expresa gRNA se transfectó con vectores de empaquetamiento en células de empaquetamiento HEK293T. Los sobrenadantes virales se recolectaron y se filtraron con un filtro de 0,22 mm a las 48 y 72 horas después de la transfección. Las células diana se infectaron dos veces y se clasificaron mediante clasificación celular mediada por citometría de flujo. Para algunos experimentos, se sembró una sola célula en una placa de 96 pocillos mediante citometría de flujo para el aislamiento de un solo clon. Se verificaron los clones únicos aislados mediante Western blot.

2.6. Líneas Celulares

La línea celular de carcinoma de colon humano HT29 (N.º de catálogo ATCC‐HTB‐38) y la línea celular de carcinoma de colon de ratón CT26.WT (N.º de catálogo CRL‐2638, ATCC, Virginia, Estados Unidos) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (N.º de catálogo BC‐M‐017, Bio‐Channel, Jiangsu, China) suplementado con un 10% de suero fetal bovino. Las líneas celulares se cultivaron en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2 a 37°C. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizada en el cultivo celular se adquirió de Bio‐Channel (N.º de catálogo BC‐BPBS‐01, Bio‐Channel, Jiangsu, China).

2.7. Anticuerpos y Reactivos

Anti‐PLSCR3 (ratón/IgG, N.º de catálogo sc‐100808) se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Texas, Estados Unidos). Anti‐STING (conejo/IgG, N.º de catálogo 19851‐1‐AP), anti‐ISG60 (conejo/IgG, N.º de catálogo 15201‐1‐AP), anti‐GAPDH (conejo/IgG, N.º de catálogo 10494‐1‐AP) y anti‐IFIH1 (conejo/IgG, N.º de catálogo 21775‐1‐AP) se adquirieron de Proteintech (Illinois, Estados Unidos). Los anticuerpos anti‐Phospho‐STING (conejo/IgG, N.º de catálogo 50907s) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Massachusetts, Estados Unidos). El agonista de STING (N.º de catálogo HY‐103665, N.º CAS: 2138299‐29‐1) y DDC (N.º de catálogo HY‐17392, N.º CAS: 7481‐89‐2) se adquirieron de MedChemExpress (Shanghái, China).

2.8. Análisis de Inmunoblot

Las proteínas se extrajeron utilizando un tampón de lisis RIPA, se cuantificaron mediante un ensayo de BCA y se desnaturalizaron en un tampón de Laemmli a 95°C durante 5 minutos. Las muestras (30 μg/carril) se separaron mediante SDS‐PAGE (geles al 12%) a 120 V y luego se transfirieron a membranas de PVDF mediante transferencia en húmedo (100 mA, 2 h). Las membranas se bloquearon en un 5% de leche descremada/TBST durante 1 h a temperatura ambiente, se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios, se lavaron tres veces con TBST y se sondearon con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:5000, 1 h a temperatura ambiente). Después de los lavados finales, las señales se detectaron utilizando un sustrato quimioluminiscente (ECL) y se visualizaron mediante sistemas digitales (Azure), con GAPDH como controles de carga.

2.9. Ensayo de Potencial de Membrana Mitocondrial JC‐1

Las células se incubaron con el colorante JC‐1 (MedChemExpress, N.º de catálogo HY‐K0601) a 37°C en la oscuridad, lo que permitió su acumulación en las mitocondrias; un alto potencial de membrana promovió la formación del agregado J (fluorescencia roja), mientras que las mitocondrias despolarizadas retuvieron los monómeros de JC‐1 (fluorescencia verde). Después de la tinción, las células se lavaron y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia, y la relación de fluorescencia roja/verde se cuantificó para evaluar los cambios en el potencial de membrana mitocondrial.

2.10. Cuantificación de la Fluorescencia de JC‐1

El potencial de membrana mitocondrial (Δ
Ψ
m) se evaluó mediante la tinción con JC‐1, y las imágenes de fluorescencia se cuantificaron utilizando el software ImageJ (NIH). Las imágenes RGB se dividieron en canales rojo y verde para separar los agregados de JC‐1 (fluorescencia roja, que indica un alto Δ
Ψ
m) de los monómeros de JC‐1 (fluorescencia verde, que indica un bajo Δ
Ψ
m). La fluorescencia de fondo se restó utilizando un radio de bola rodante de 50 píxeles. Se definieron regiones de interés (ROI) que correspondían a las áreas celulares mediante umbralización automática, y se midió la intensidad media de fluorescencia (MFI) de los canales rojo y verde dentro de las mismas ROI. El potencial de membrana mitocondrial se expresó como la relación de intensidad de fluorescencia rojo a verde. Todos los parámetros de imagen, incluidos la intensidad del láser, el tiempo de exposición, la ganancia y la configuración del objetivo, se mantuvieron constantes en todos los grupos para garantizar la comparabilidad.

2.11. Detección de la Tasa de Consumo de Oxígeno (OCR)

Las células se sembraron a 2 × 104 células por pocillo en placas de microcultivo celular Seahorse XF y se dejaron adherir durante la noche. La OCR se midió utilizando un analizador de flujo extracelular Seahorse XFe96 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, Estados Unidos). Antes del ensayo, las células se equilibraron en un medio de ensayo Seahorse XF sin CO2 y se trataron secuencialmente con moduladores mitocondriales: primero se añadió oligomicina (1–2 μM) para inhibir la ATP sintasa, seguida de una medición de 10–15 minutos de la respiración dependiente de ATP; luego se inyectó FCCP (0,5 μM) para desacoplar las mitocondrias, y la respiración máxima se registró después de 2–3 minutos de equilibrio; finalmente, se coadministraron rotenona (0,5 μM) y antimicina A (0,5 μM) para bloquear el complejo I/III, lo que permitió medir el consumo de oxígeno no mitocondrial. Los niveles de oxígeno se rastrearon en tiempo real mediante sensores ópticos, y los valores de OCR se derivaron de las tasas de agotamiento y se normalizaron al recuento de células o al contenido de proteínas para el análisis funcional.

2.12. Extracción Mitocondrial y Medición de la Relación D‐Loop mtDNA

Las células se recolectaron mediante centrifugación a 500 × g durante 5 minutos a 4°C. Los pellets celulares resultantes se lavaron una vez con PBS frío y luego se resuspendieron en un tampón hipotónico frío suplementado con inhibidores de proteasas (tabletas de cóctel de inhibidores de proteasas completo, Roche). Posteriormente, las células se sometieron a lisis utilizando un homogeneizador Dounce. Los lisados se centrifugaron a 500 × g durante 10 minutos a 4°C para eliminar los núcleos (que se descartaron), y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Estos sobrenadantes se centrifugaron luego a 5000 × g durante 10 minutos a 4°C, lo que produjo dos fracciones: la fracción mitocondrial (P5K) y la fracción citosólica no mitocondrial (S5K). El ADN mitocondrial se purificó a partir de estas distintas fracciones utilizando un kit de extracción de ADN (N.º de catálogo D3396‐01; OMEGA, Norcross, Georgia). Después de la purificación, se realizó una reacción de PCR en tiempo real cuantitativa (RT‐qPCR) utilizando cebadores específicos para la región D‐loop para analizar los niveles de ADN mitocondrial. La relación de los niveles de ADN mitocondrial en la fracción S5K con los de la fracción P5K se utilizó para representar la liberación relativa de ADN mitocondrial de las mitocondrias al citosol. (D‐loop‐MT325F: 5′‐CACAGCACTTAAACACATCTCTGC‐3′; D‐loop‐MT474R: 5′‐AGTATGGGAGTGRGAGGGRAAAA‐3′). Dado que la fracción citosólica se definió operativamente mediante centrifugación diferencial, no se puede excluir por completo la contaminación mitocondrial residual y se debe tener en cuenta al interpretar estos datos.

2.13. Cuantificación de 2′3′‐cGAMP (Ciclo de Guanosina Monofosfato–Adenosina Monofosfato)

Para determinar el nivel intracelular de 2′3′‐cGAMP en las células PLSCR3 con reducción de la expresión (KDPLSCR3) y las células de control normal (NC) HT29, se realizó un ELISA competitivo utilizando el kit de ELISA competitivo 2′3′‐cíclico GAMP (N.º de catálogo 501700, Cayman Chemical). Brevemente, las células se recolectaron, se lavaron dos veces con PBS preenfriado y se lisaron en un tampón de lisis M‐PER (N.º de catálogo 78501, Thermo Fisher Scientific) sobre hielo durante 15 minutos (con vórtice tres veces); luego, el lisado se centrifugó a 12 000 × g durante 15 minutos a 4°C para recolectar el sobrenadante, y la concentración de proteínas se normalizó utilizando el ensayo de BCA. Para el ELISA, se añadieron 100 μL de estándares de cGAMP diluidos en serie (0–1600 pg/mL) o muestras (en triplicado) a placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpos, seguidas de 100 μL de trazador de cGAMP‐HRP; la placa se selló y se incubó a temperatura ambiente con agitación (500 rpm) durante 1 h. Después de cinco lavados con tampón de lavado 1×, se añadieron 100 μL de sustrato TMB durante 15–20 minutos de incubación protegida de la luz, y la reacción se detuvo con 50 μL de H2SO4 2 N. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas, y la concentración de cGAMP se calculó mediante regresión logística de cuatro parámetros de la curva estándar (que requiere R_
2 > 0,99). Se aseguró el control de calidad manteniendo un coeficiente de variación (CV) < 10% para los estándares y < 15% para los triplicados de las muestras, y todas las operaciones se realizaron sobre hielo o a 4°C para minimizar la degradación de cGAMP.

2.14. ELISA

Las células HT29 (1 × 106) con o sin reducción de la expresión de PLSCR3 se sembraron en placas de seis pocillos en un medio de crecimiento completo. Las quimiocinas secretadas se midieron mediante el kit de ELISA de IFNβ humano (PI572, Beyotime, China) y el kit de ELISA de CXCL10 humano (PC208, Beyotime, China), según los protocolos del fabricante. Los tumores injertados aislados se prepararon y se picaron con cuchillas, y luego, los tejidos tumorales se cultivaron en PBS durante 4 h a 37°C. La cantidad secretada de granzima B en el cultivo se midió mediante el kit de ELISA de granzima B de ratón (BMS6029), según los protocolos del fabricante.

2.15. RT‐qPCR

Se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol, se cuantificó mediante espectrofotometría (relación A260/A280 ≥ 1,8) y se transcribió a ADNc utilizando una transcriptasa inversa con cebadores de oligo(dT) o hexámeros aleatorios. Las reacciones de qPCR se prepararon con SYBR Green Pro Tag HS Premix (AG11701, Accurate Biology, China), cebadores específicos para el gen (100 nM) y plantilla de ADNc (50 ng) y luego se amplificaron en un sistema de PCR en tiempo real en condiciones de ciclado estandarizadas (95°C durante 10 minutos, seguidas de 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto). El análisis de la curva de fusión confirmó la especificidad del cebador, y la expresión génica relativa se cuantificó mediante el método Δ
ΔCt, normalizado a controles endógenos (GAPDH), con controles sin plantilla y sin RT incluidos para excluir la contaminación.

2.16. Microscopía Confocal

Las células HT29 transfectadas se subcultivaron y se cultivaron en portaobjetos. Para detectar el estado y la ubicación celular de STING, las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído, se permeabilizaron con Triton‐X100 y se incubaron en un 5% de FBS y anti‐STING, seguido de la incubación con IgG antirratón FITC conjugado (H+L) a temperatura ambiente. Las imágenes celulares se capturaron con un microscopio confocal láser ZEISS (Zeiss LSM 900, Oberkochen, Alemania). El software ZEISS ZEN Microscope se utilizó para la operación y la adquisición. Los porcentajes de células con formación de focos se analizaron estadísticamente.

Para la cuantificación de la activación de STING, se contaron manualmente las células que presentaban focos puntados de STING en al menos cinco campos seleccionados aleatoriamente por muestra en condiciones de imagen idénticas. El porcentaje de células STING positivas se calculó como el número de células con focos de STING dividido por el número total de células por campo. Se analizaron al menos 100 células por condición en cada experimento. La cuantificación se realizó en tres réplicas biológicas independientes.

2.17. Citotoxicidad de Células NK Ex Vivo

Las células NK se aislaron de sangre del cordón umbilical (proporcionada por el Banco de Células Hematopoyéticas del Cordón Umbilical de la Provincia de Zhejiang). En primer lugar, la sangre del cordón umbilical se diluyó y se sometió a una centrifugación de gradiente de densidad sobre una capa de Ficoll para aislar las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC). Posteriormente, se empleó la clasificación celular activada magnéticamente (MACS) utilizando un kit de aislamiento de células NK específico (Miltenyi, N.º de catálogo 130‐092‐657) para enriquecer selectivamente las células NK en función de la expresión de CD56. La población de células NK enriquecida se purificó aún más mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) con anticuerpos dirigidos. Finalmente, se validó la pureza y la funcionalidad de las células NK aisladas mediante citometría de flujo y ensayos funcionales para garantizar su integridad y relevancia biológica.

Para los ensayos de citotoxicidad, se sembraron células de CRC (HT29 o DLD1) en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 104 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Se añadieron células NK purificadas a una relación efector:diablo (E:T) de 5:1, a menos que se indicara lo contrario. La cocultivación se realizó durante 24 horas a 37 °C. Después de la cocultivación, se evaluó la viabilidad de las células tumorales mediante microscopía de contraste de fases y se cuantificó contando el número de células tumorales adheridas restantes en campos seleccionados al azar (n = 5 campos por pocillo). En paralelo, se confirmó además la viabilidad celular mediante el ensayo de exclusión de azul de trypan. Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes.

2.18. Preparación de células T infiltrantes tumorales

Los tumores se picaron con tijeras y luego se digirieron con el tampón de digestión (medio RPMI 1640, 5 % de FBS, 1 % de penicilina-estreptomicina, 25 mM de HEPES y 300 U de colagenasa, Sigma C0130) en un agitador a 37 °C durante 2 horas. Se prepararon células individuales mediante un tamiz celular de 70 μm. Se eliminaron los eritrocitos mediante incubación en un tampón de lisis de glóbulos rojos (R7757, Sigma) a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las células se prepararon en PBS (con una concentración de ~2 × 107) para los estudios.

2.19. Citometría de flujo

La suspensión de células individuales se fijó con una solución de paraformaldehído al 4 % (E672002, Sangon Biotech, China). Las células T CD45+ se seleccionaron a partir de una suspensión de células individuales (aproximadamente 2 × 107 células obtenidas de tejido tumoral) mediante citometría de flujo con los siguientes anticuerpos (anticuerpo antimouse CD45; BD Pharmingen, 561875). A continuación, las células se tiñeron con anticuerpo antimouse CD3e PE (145-2C11, BD Pharmingen, 553063), anticuerpo antimouse CD4 FITC (RM4-5, BD Pharmingen, 553046), anticuerpo antimouse CD4 PE/Cy7 (GK1.5, BioLegend, 100421), anticuerpo antimouse CD8 FITC (53-6.7, BD Pharmingen, 553031) y anticuerpo antimouse CD8a APC/Cy7 (53-6.7, BioLegend, 100713).

El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando una estrategia de separación estándar. Brevemente, primero se identificaron las células individuales basándose en los perfiles de dispersión directa y lateral (FSC-A vs. FSC-H) para excluir los dobletes. Se excluyeron las células muertas basándose en la tinción con un colorante de viabilidad, cuando fue aplicable. A continuación, se separaron los leucocitos CD45+ y, a continuación, se seleccionaron las células T CD3+. Dentro de la población CD3+, se identificaron además los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo.

2.20. Modelo de injerto de carcinoma colorrectal sinérgico

Las células PLSCR3 con knockdown o las células CT26.WT con control (Scramble) (1,5 × 105) se mezclaron con BD Matrigel (Matrix Growth Factor Reduced) (BD, 354230) en 100 μL de PBS y luego se inyectaron por vía subcutánea en los flancos derechos de ratones BALB/c de 8 a 10 semanas de edad (del Jackson Laboratory, 000664). El crecimiento tumoral se midió con un calibrador y el tamaño se expresó en centímetros cúbicos cada 3 días. Para el tratamiento con anticuerpos, se inyectó IgG de control (10 mg/kg) o anti-PD-1 (RMP1-14, BioXCell, 10 mg/kg) por vía intraperitoneal (i.p.) en los días 6, 9, 12, 15 y 18 después de la inoculación de células tumorales. Para la curva de crecimiento tumoral, los injertos se midieron con un calibrador y se establecieron (0,5 × longitud × ancho2) cada 5 días. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, y el protocolo fue revisado y aprobado por el Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang.

2.21. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 11. Los datos se presentan como media ± DE, a menos que se indique lo contrario. Las comparaciones entre dos grupos independientes se realizaron utilizando una prueba t de Student de dos colas no pareada. Para las comparaciones que involucran a más de dos grupos, se utilizó una ANOVA de una vía seguida de la prueba post hoc de comparación múltiple de Tukey, a menos que se indique lo contrario. Las curvas de crecimiento tumoral se analizaron utilizando una ANOVA de medidas repetidas de dos vías con las pruebas post hoc de comparación múltiple apropiadas. Se consideraron estadísticamente significativas las diferencias con ∗
p < 0,05 y altamente significativas con ∗∗
p < 0,01, ∗∗∗
p < 0,001 y ∗∗∗∗
p < 0,0001.

3. Resultados

3.1. Identificación y análisis del gen pronóstico relacionado con las mitocondrias PLSCR3 en CRC

El análisis transcriptómico del grupo TCGA CRC identificó 10 224 DEG (log₂FC > 0,585, adj. p < 0,05; Figura 1A). Para visualizar los principales factores, los 50 genes más significativamente alterados se mostraron en un mapa de calor agrupado (Figura 1B). El enriquecimiento funcional (GO/KEGG) reveló que la patogénesis del CRC estaba significativamente asociada con las vías metabólicas (Figura 1C, módulo resaltado en amarillo). Para investigar la participación mitocondrial, los DEG (conjunto azul, n = 9862) se cruzaron con el conjunto de genes mitocondriales MitoCarta 3.0 (conjunto púrpura, n = 1469), lo que dio como resultado 363 DEG relacionados con las mitocondrias (Figura 1D). El análisis de Cox univariado identificó 89 genes que se correlacionaron significativamente con el pronóstico del CRC. Se priorizó PLSCR3 como un gen candidato clave asociado al pronóstico debido a su alto HR (HR = 2,18, p < 0,001; Figura 1E). La validación confirmó una expresión significativamente elevada de PLSCR3 en los tumores de CRC en comparación con los tejidos normales (Figura 1F). Una alta expresión de PLSCR3 predijo una reducción de la supervivencia libre de recurrencia (RFS) en un grupo independiente de adenocarcinoma de colon (KM plotter: HR = 2,16, p = 6,7e − 10; Figura 1G).

El análisis de la base de datos GTEx demostró una expresión ubicua de PLSCR3 en múltiples órganos humanos sanos (Figura S1A). El perfilado pancanceroso reveló además que PLSCR3 estaba significativamente sobreexpresado en >85 % de los tipos de tumores (Figura S1B). Tanto los datos de secuenciación de ARN (nTPM) como los datos de detección de proteínas confirmaron una expresión consistentemente alta de PLSCR3 en 63 líneas celulares de CRC (Figura S1C). La expresión de PLSCR3 estaba marcadamente elevada en los tumores de CRC en comparación con los tejidos normales (Figura S1D). En esencia, los ensayos de localización subcelular posicionaron inequívocamente a PLSCR3 dentro de las mitocondrias (Figura S1E), lo que sugiere su posible papel en la regulación de las funciones mitocondriales.

Se seleccionó PLSCR3 para un estudio más profundo porque cumplía tres criterios simultáneamente: expresión diferencial en CRC, asociación significativa con la supervivencia en el análisis univariado y localización mitocondrial establecida.

Para caracterizar aún más el contexto genómico de PLSCR3 en CRC, realizamos un análisis exploratorio de los datos de genómica del cáncer de dominio público. Las alteraciones genómicas de PLSCR3 fueron relativamente poco frecuentes y consistieron principalmente en mutaciones con cambio de sentido y deleciones profundas, lo que indica que la interrupción genómica directa de PLSCR3 no es un evento común en CRC (Figura S2). Los análisis de supervivencia basados en el estado de la alteración sugirieron una posible asociación con el resultado clínico, aunque la baja frecuencia de casos alterados limitó la potencia estadística. Estos hallazgos sugieren que la expresión elevada y los efectos funcionales de PLSCR3 observados en este estudio probablemente no se expliquen principalmente por la alteración genómica recurrente y pueden estar más estrechamente relacionados con el nivel de expresión y la función mitocondrial.

3.2. La deficiencia de PLSCR3 altera la homeostasis mitocondrial en las células de CRC

En este estudio, "integridad mitocondrial" se refiere a la preservación del potencial de membrana mitocondrial, la función respiratoria y la retención compartimentalizada del ADNmt, según se evalúa mediante la tinción con JC-1, la medición de la OCR y la cuantificación del ADNmt citosólico, respectivamente. Los resultados anteriores indican que la expresión de PLSCR3 está sobreexpresada en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales. Por lo tanto, a continuación, buscamos investigar el papel funcional de PLSCR3 acumulado de forma aberrante en CRC. Para investigar la función de PLSCR3 en las mitocondrias de las células tumorales, desactivamos la expresión de PLSCR3 en las células y detectamos el estado de las mitocondrias. El knockdown de PLSCR3 en las células HT29 y DLD1 comprometió significativamente la función mitocondrial, como se evidencia por múltiples enfoques experimentales (Figura 2 y Figura S3). El Western blot cuantitativo y el RT-PCR verificaron una reducción de más del 80 % en los niveles de ARN de PLSCR3 en comparación con el control negativo (NC) (p < 0,001, n = 3) (Figura 2A, B y Figura S3A). La microscopía de fluorescencia mostró un aumento en la fluorescencia del monómero verde JC-1 y una reducción en la fluorescencia del agregado rojo en las células con knockdown de PLSCR3 en comparación con las células de control (Figura 2C y Figura S3B). El análisis cuantitativo de la relación de intensidad de fluorescencia rojo/verde confirmó además una reducción significativa en el potencial de membrana mitocondrial después del knockdown de PLSCR3 (Figura 2D y Figura S3C). El análisis de la respiración mitocondrial demostró una capacidad respiratoria deteriorada bajo el desafío de FCCP (p < 0,001) (Figura 2E). Al mismo tiempo, las células con knockdown de PLSCR3 exhibieron una acumulación de ADN mitocondrial de doble cadena (dsDNA) en comparación con NC (p < 0,001) (Figura 2F y Figura S3D). En conjunto, estos hallazgos indican que la deficiencia de PLSCR3 altera la homeostasis mitocondrial y promueve la liberación de ADNmt en las células de CRC.

3.3. La deficiencia de PLSCR3 activa la señalización cGAS-STING asociada al ADNmt

Aunque algunas evidencias sugieren que la vía cGAS-STING es difícil de activar debido a la inhibición de la expresión mediada por la metilación génica en algunas células de CRC [^[22]], otras evidencias indican que en las células de CRC con expresión positiva de cGAS-STING, STING puede activarse y ejercer funciones en la activación de la inmunidad antitumoral [^[23]]. Estudios recientes han demostrado que la fuga de ADNmt en el citoplasma puede activar el cGAS endógeno en las células. El cGAS activado produce 2′3′-cGAMP, que se une a STING para activar la respuesta IFN-I descendente. Los resultados experimentales anteriores indican que el knockdown de PLSCR3 altera la integridad mitocondrial e induce la fuga de ADNmt en las células de CRC. Por lo tanto, la siguiente pregunta que abordamos fue si la deficiencia de PLSCR3 activa la vía inmune innata cGAS-STING endógena en las células de CRC a través de la liberación de ADNmt.

Como se muestra en la Figura 3, el tratamiento con control (scramble) indujo un aumento en los niveles de 2′3′-cGAMP en las células con knockdown de PLSCR3 en comparación con los controles negativos (NC) (p < 0,0001; n = 3 réplicas biológicas), mientras que el tratamiento con dideoxicitidina (DDC), que causó una depleción sustancial de ADNmt, abolió este aumento, sin mostrar una diferencia significativa con NC (ns; p > 0,05) (Figura 3A). Esto sugiere que la deficiencia de PLSCR3 activa la detección de ADN o la síntesis de dinucleótidos cíclicos de forma dependiente del ADNmt. En condiciones competentes para STING, las células KDPLSCR3 exhibieron una elevación de 28 veces en la producción de IFNβ (142,5 ± 11,3 frente a 5,1 ± 0,9 pg/mL; p < 0,0001) y un aumento de 15 veces en la secreción de CXCL10 (302,4 ± 18,6 frente a 20,1 ± 2,3 pg/mL; p < 0,0001) en comparación con NC (Figura 3B, C) en las células HT29. Al mismo tiempo, el knockdown de PLSCR3 también activó la secreción de IFNβ_ y CXCL10 en las células DLD1 (Figura S4). El knockout de STING mediado por CRISPR (sgRNA STING) abolió por completo estos efectos, con los niveles de citocinas que volvieron a la línea de base (Figura 3B, C). El análisis de Western blot confirmó la regulación al alza de los efectores inmunes innatos en las células con knockdown de PLSCR3 competentes para STING, mostrando un aumento en los niveles de proteína IFIH1, ISG60, STING fosforilada (Ser366) e ISG15 en relación con los controles de carga de GAPDH (Figura 3D). El perfilado del transcriptoma demostró además una inducción significativa de los genes estimulados por el interferón (ISG) en estas células, incluidos ISG15, ISG56 e ISG54 (Figura 3E). Estos datos indican que la liberación de ADNmt inducida por la deficiencia de PLSCR3 activa la respuesta IFN-I en las células de CRC de forma dependiente de cGAS-STING.

3.4. La deficiencia de PLSCR3 mejora la sensibilidad a la citotoxicidad mediada por células inmunitarias en CRC

Múltiples estudios han demostrado que la activación de la vía cGAS-STING endógena en las células tumorales desencadena respuestas inmunitarias locales y sistémicas, promoviendo la infiltración de varios subconjuntos de células inmunitarias en el microambiente tumoral (TME) y mejorando la función citotóxica de las células NK [^[24], ^[25]]. Para investigar aún más si la focalización de PLSCR3 puede provocar una activación eficaz de la inmunidad antitumoral a través de la vía cGAS-STING, primero examinamos el impacto de PLSCR3 en la citotoxicidad de las células NK. Las células HT29 deficientes en PLSCR3 o las células de control se cocultivaron con células NK derivadas de sangre de cordón umbilical humana (Figura 4A).

El análisis morfológico mostró un número reducido de células PLSCR3 con expresión reducida (PLSCR3-knockdown) que sobrevivieron bajo estas condiciones de cocultivo (Figura 4B, C). Estos datos indican que la reducción de la expresión de PLSCR3 aumentó la susceptibilidad de las células HT29 a la citotoxicidad mediada por las células NK bajo las condiciones E:T probadas.

Para identificar si la depleción de PLSCR3 inducía una respuesta inmune en las células de adenocarcinoma de colon CT26, se trató un carcinoma de injerto murino con células CT26 con expresión reducida de PLSCR3 utilizando anticuerpos anti-PD-1 (10 mg/kg) en los días 6, 9, 12, 15 y 18 después de la inoculación de células tumorales en ratones BALB/c inmunocompetentes. Coherente con el informe previo [^[26]], los ratones inyectados con células CT26 de control no respondieron al tratamiento anti-PD-1. Sin embargo, el silenciamiento de PLSCR3 combinado con el tratamiento anti-PD-1 confirió una inhibición sustancial del crecimiento tumoral en las células de adenocarcinoma de colon CT26 (Figura 4D, E).

El análisis del microambiente tumoral del injerto (TME) mediante citometría de flujo mostró un aumento de la infiltración de células T CD8+ y CD4+ detectada en el injerto tumoral CT26 después de la depleción de PLSCR3, lo que se vio fuertemente aumentado por el tratamiento anti-PD-1 (Figura 4F-H). Además, se detectó un aumento leve a moderado en la expresión de GZMB y una mayor regulación de la activación de CD69, IFNγ, CD25 y CD107 en las células T CD8+ infiltrantes tumorales del injerto tumoral CT26 después del silenciamiento de PLSCR3, lo que se vio fuertemente aumentado por el tratamiento anti-PD-1 (Figura S5).

En conjunto, estos datos respaldan que la depleción de PLSCR3 puede aumentar la susceptibilidad de las células tumorales a la citotoxicidad mediada por las células NK en las células HT29 y promover un microambiente inmunitario tumoral más favorable durante el tratamiento anti-PD-1 en el modelo CT26 subcutáneo.

En conjunto, nuestros datos indican que PLSCR3 mantiene la homeostasis mitocondrial para suprimir la señalización cGAS-STING. Como se esquematiza en la Figura 5, la ablación de PLSCR3 desencadena una conversión inmunogénica impulsada por el ADNmt, proporcionando una base mecanicista para la mayor eficacia anti-PD-1 observada en los modelos de CRC MSS.

3.1. Identificación y análisis del gen pronóstico relacionado con las mitocondrias PLSCR3 en el CRC

El análisis transcriptómico del grupo de CRC de TCGA identificó 10.224 DEG (log₂FC > 0,585, adj. p < 0,05; Figura 1A). Para visualizar los principales factores, los 50 genes más significativamente alterados se mostraron en un mapa de calor agrupado (Figura 1B). El enriquecimiento funcional (GO/KEGG) reveló que la patogénesis del CRC estaba significativamente asociada con las vías metabólicas (Figura 1C, módulo resaltado en amarillo). Para investigar la participación mitocondrial, los DEG (conjunto azul, n = 9862) se cruzaron con el conjunto de genes mitocondriales MitoCarta 3.0 (conjunto púrpura, n = 1469), lo que dio como resultado 363 DEG relacionados con las mitocondrias (Figura 1D). El análisis univariado de Cox identificó 89 genes que se correlacionaron significativamente con el pronóstico del CRC. PLSCR3 se priorizó como un gen candidato clave asociado al pronóstico debido a su alto HR (HR = 2,18, p < 0,001; Figura 1E). La validación confirmó una expresión significativamente elevada de PLSCR3 en los tumores de CRC en comparación con los tejidos normales (Figura 1F). Una alta expresión de PLSCR3 predijo una reducción de la supervivencia libre de recurrencia (RFS) en un grupo independiente de adenocarcinoma de colon (KM plotter: HR = 2,16, p = 6,7e-10; Figura 1G).

El análisis de la base de datos GTEx demostró una expresión ubicua de PLSCR3 en múltiples órganos humanos sanos (Figura S1A). El perfilado pan-cáncer reveló además que PLSCR3 se sobreexpresaba significativamente en >85% de los tipos de tumores (Figura S1B). Tanto los datos de secuenciación de ARN (nTPM) como los datos de detección de proteínas confirmaron una expresión consistentemente alta de PLSCR3 en 63 líneas celulares de CRC (Figura S1C). La expresión de PLSCR3 se elevó notablemente en los tumores de CRC en comparación con los tejidos normales (Figura S1D). Lo más importante es que los ensayos de localización subcelular posicionaron inequívocamente a PLSCR3 dentro de las mitocondrias (Figura S1E), lo que sugiere su posible papel en la regulación de las funciones mitocondriales.

Se seleccionó PLSCR3 para un estudio más profundo porque cumplía tres criterios simultáneamente: expresión diferencial en el CRC, asociación significativa con la supervivencia en el análisis univariado y localización mitocondrial establecida.

Para caracterizar aún más el contexto genómico de PLSCR3 en el CRC, realizamos un análisis exploratorio de datos genómicos públicos del cáncer. Las alteraciones genómicas de PLSCR3 fueron relativamente poco frecuentes y consistieron principalmente en mutaciones con cambio de sentido y deleciones profundas, lo que indica que la interrupción genómica directa de PLSCR3 no es un evento común en el CRC (Figura S2). Los análisis de supervivencia basados en el estado de la alteración sugirieron una posible asociación con el resultado clínico, aunque la baja frecuencia de casos alterados limitó la potencia estadística. Estos hallazgos sugieren que la elevada expresión y los efectos funcionales de PLSCR3 observados en este estudio probablemente no se expliquen principalmente por una alteración genómica recurrente y pueden estar más estrechamente relacionados con el nivel de expresión y la función mitocondrial.

3.2. La deficiencia de PLSCR3 altera la homeostasis mitocondrial en las células de CRC

En este estudio, la "integridad mitocondrial" se refiere a la preservación del potencial de membrana mitocondrial, la función respiratoria y la retención compartimentada del ADNmt, según lo evaluado mediante la tinción con JC-1, la medición de la OCR y la cuantificación del ADNmt citosólico, respectivamente. Los resultados mencionados anteriormente indican que la expresión de PLSCR3 se sobreexpresa en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales. Por lo tanto, a continuación, buscamos investigar el papel funcional de PLSCR3 acumulado de forma aberrante en el CRC. Para investigar la función de PLSCR3 en las mitocondrias de las células tumorales, redujimos la expresión de PLSCR3 en las células y detectamos el estado de las mitocondrias. La reducción de la expresión de PLSCR3 en las células HT29 y DLD1 comprometió significativamente la función mitocondrial, como lo demuestran múltiples enfoques experimentales (Figura 2 y Figura S3). El Western blot cuantitativo y el análisis de RT-PCR verificaron una reducción de más del 80% en los niveles de ARN de PLSCR3 en comparación con el control negativo (NC) (p < 0,001, n = 3) (Figura 2A, B y Figura S3A). La microscopía de fluorescencia mostró un aumento en la fluorescencia del monómero verde JC-1 y una reducción en la fluorescencia del agregado rojo en las células con expresión reducida de PLSCR3 en comparación con las células de control (Figura 2C y Figura S3B). El análisis cuantitativo de la relación de intensidad de fluorescencia rojo/verde confirmó además una reducción significativa en el potencial de membrana mitocondrial después de la reducción de la expresión de PLSCR3 (Figura 2D y Figura S3C). El análisis de la respiración mitocondrial demostró una capacidad respiratoria alterada bajo el desafío de FCCP (p < 0,001) (Figura 2E). Concurrentemente, las células con expresión reducida de PLSCR3 exhibieron una acumulación de ADN mitocondrial de doble cadena (dsDNA) en comparación con NC (p < 0,001) (Figura 2F y Figura S3D). En conjunto, estos hallazgos indican que la deficiencia de PLSCR3 altera la homeostasis mitocondrial y promueve la liberación de ADNmt en las células de CRC.

3.3. La deficiencia de PLSCR3 activa la señalización cGAS-STING asociada al ADNmt

Aunque algunas evidencias sugieren que la vía cGAS-STING es difícil de activar debido a la inhibición de la expresión mediada por la metilación génica en algunas células de CRC [^[22]], otras evidencias indican que en las células de CRC con expresión positiva de cGAS-STING, STING puede activarse y ejercer funciones en la activación de la inmunidad antitumoral [^[23]]. Estudios recientes han demostrado que la fuga de ADNmt en el citoplasma puede activar el cGAS endógeno en las células. El cGAS activado produce 2′3′-cGAMP, que se une a STING para activar la respuesta IFN-I descendente. Los resultados experimentales mencionados anteriormente indican que la reducción de la expresión de PLSCR3 altera la integridad mitocondrial e induce la fuga de ADNmt en las células de CRC. Por lo tanto, la pregunta posterior que abordamos fue si la deficiencia de PLSCR3 activa la vía inmunitaria cGAS-STING endógena en las células de CRC a través de la liberación de ADNmt.

Como se muestra en la Figura 3, el tratamiento con un vector de control (scramble) indujo un aumento en los niveles de 2′3′-cGAMP en las células con expresión reducida de PLSCR3 en comparación con los controles negativos (NC) (p < 0,0001; n = 3 réplicas biológicas), mientras que el tratamiento con dideoxicitidina (DDC), que causó una depleción sustancial de ADNmt, abolió este aumento, sin mostrar una diferencia significativa con NC (ns; p > 0,05) (Figura 3A). Esto sugiere que la deficiencia de PLSCR3 activa la detección de ADN o la síntesis de dinucleótidos cíclicos de una manera dependiente del ADNmt. En condiciones competentes para STING, las células KDPLSCR3 exhibieron una elevación de 28 veces en la producción de IFNβ (142,5 ± 11,3 frente a 5,1 ± 0,9 pg/mL; p < 0,0001) y un aumento de 15 veces en la secreción de CXCL10 (302,4 ± 18,6 frente a 20,1 ± 2,3 pg/mL; p < 0,0001) en comparación con NC (Figura 3B, C) en las células HT29. Mientras tanto, la reducción de la expresión de PLSCR3 también activó la secreción de IFNβ_ y CXCL10 en las células DLD1 (Figura S4). La eliminación mediada por CRISPR de STING (STING sgRNA) abolió por completo estos efectos, con los niveles de citocinas que volvieron a la línea de base (Figura 3B, C). El análisis de Western blot confirmó la regulación al alza de los efectores inmunitarios innatos en las células con expresión reducida de PLSCR3 competentes para STING, mostrando un aumento en los niveles de proteína IFIH1, ISG60, STING fosforilada (Ser366) e ISG15 en relación con los controles de carga de GAPDH (Figura 3D). El perfilado del transcriptoma demostró además una inducción significativa de los genes estimulados por el interferón (ISG) en estas células, incluidos ISG15, ISG56 e ISG54 (Figura 3E). Estos datos indican que la liberación de ADNmt inducida por la deficiencia de PLSCR3 activa la respuesta IFN-I en las células de CRC de una manera dependiente de cGAS-STING.

3.4. La deficiencia de PLSCR3 mejora la sensibilidad a la citotoxicidad mediada por las células inmunitarias en el CRC

Múltiples estudios han demostrado que la activación de la vía cGAS-STING endógena en las células tumorales desencadena respuestas inmunitarias locales y sistémicas, promoviendo la infiltración de varios subconjuntos de células inmunitarias en el microambiente tumoral (TME) y mejorando la función citotóxica de las células NK [^[24], ^[25]]. Para investigar más a fondo si la focalización de PLSCR3 puede provocar una activación inmunitaria antitumoral eficaz a través de la vía cGAS-STING, primero examinamos el impacto de PLSCR3 en la citotoxicidad de las células NK. Las células CT26 con expresión reducida de PLSCR3 o las células de control se cocultivaron con células NK derivadas de sangre de cordón umbilical (Figura 4A).

El análisis morfológico mostró un número reducido de células PLSCR3 con expresión reducida que sobrevivieron bajo estas condiciones de cocultivo (Figura 4B, C). Estos datos indican que la reducción de la expresión de PLSCR3 aumentó la susceptibilidad de las células HT29 a la citotoxicidad mediada por las células NK bajo las condiciones E:T probadas.

Para identificar si la depleción de PLSCR3 inducía una respuesta inmune en las células de adenocarcinoma de colon CT26, se trató un carcinoma de injerto murino con células CT26 con expresión reducida de PLSCR3 utilizando anticuerpos anti-PD-1 (10 mg/kg) en los días 6, 9, 12, 15 y 18 después de la inoculación de células tumorales en ratones BALB/c inmunocompetentes. Coherente con el informe previo [^[26]], los ratones inyectados con células CT26 de control no respondieron al tratamiento anti-PD-1. Sin embargo, el silenciamiento de PLSCR3 combinado con el tratamiento anti-PD-1 confirió una inhibición sustancial del crecimiento tumoral en las células de adenocarcinoma de colon CT26 (Figura 4D, E).

El análisis del microambiente tumoral del injerto (TME) mediante citometría de flujo mostró un aumento de la infiltración de células T CD8+ y CD4+ detectada en el injerto tumoral CT26 después de la depleción de PLSCR3, lo que se vio fuertemente aumentado por el tratamiento anti-PD-1 (Figura 4F-H). Además, se detectó un aumento leve a moderado en la expresión de GZMB y una mayor regulación de la activación de CD69, IFNγ, CD25 y CD107 en las células T CD8+ infiltrantes tumorales del injerto tumoral CT26 después del silenciamiento de PLSCR3, lo que se vio fuertemente aumentado por el tratamiento anti-PD-1 (Figura S5).

En conjunto, estos datos respaldan que la depleción de PLSCR3 puede aumentar la susceptibilidad de las células tumorales a la citotoxicidad mediada por las células NK en las células HT29 y promover un microambiente inmunitario tumoral más favorable durante el tratamiento anti-PD-1 en el modelo CT26 subcutáneo.

En conjunto, nuestros datos indican que PLSCR3 mantiene la homeostasis mitocondrial para suprimir la señalización cGAS-STING. Como se esquematiza en la Figura 5, la ablación de PLSCR3 desencadena una conversión inmunogénica impulsada por el ADNmt, proporcionando una base mecanicista para la mayor eficacia anti-PD-1 observada en los modelos de CRC MSS.

4. Discusión

Nuestros datos respaldan el papel de PLSCR3 como un regulador negativo de la señalización inmune innata asociada al ADN mitocondrial (mtADN) en el CCRC. La deficiencia de PLSCR3 se acompañó de despolarización mitocondrial, alteración de la función respiratoria, aumento del mtADN citosólico y activación de la vía cGAS-STING. Funcionalmente, estos cambios se asociaron con un aumento de la muerte tumoral mediada por células inmunitarias y una mejora de la respuesta a la terapia anti-PD-1 en el modelo CT26. Estos hallazgos conectan la homeostasis mitocondrial con la inmunogenicidad tumoral en el CCRC.

Los agentes farmacológicos inducen con frecuencia la disfunción mitocondrial para desencadenar la liberación de mtADN y la activación de cGAS-STING. La lovastatina promueve la apoptosis de las células de CCRC a través de la despolarización de la membrana inducida por estrés oxidativo mitocondrial y la liberación de mtADN [^[27]]. El oxaliplatino genera especies reactivas de oxígeno (ROS), abriendo los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) para activar la señalización cGAS-STING/TBK1/IRF5 y la muerte celular inmunogénica [^[28]]. En el cáncer de mama, el paclitaxel induce la formación de micronúcleos y la fuga de mtADN, activando cGAS-STING para impulsar la secreción de IFN y TNFα, lo que promueve la apoptosis [^[29]]. En cuanto a los reguladores endógenos, la proteína de la membrana externa mitocondrial (OMM) VDAC2 mantiene la integridad de la membrana durante el ataque de las células T CD8+ a través de IFNγ. VDAC2 inhibe la activación de BAK, previniendo el colapso de la membrana mitocondrial, mientras que la deficiencia de VDAC2 causa una activación excesiva de BAK y la fuga de mtADN [^[30]].

PLSCR3 opera a través de un mecanismo distinto. Como una scramblasa de fosfolípidos de la membrana interna mitocondrial (IMM), mantiene la integridad de la membrana independientemente de las señales externas. La deficiencia de PLSCR3 desencadena de forma autónoma la fuga de mtADN, revelando un proceso fundamental de regulación de la inmunidad innata en el CCRC. A diferencia de la deleción de VDAC2, que induce la apoptosis dependiente de la caspasa, la deficiencia de PLSCR3 activa principalmente la señalización inmunogénica innata con una citotoxicidad directa mínima (Figura 4). Esto establece una inmunidad compartimentada a través de las membranas mitocondriales: las proteínas de la OMM como VDAC2 regulan la inmunidad impulsada por la apoptosis, mientras que las proteínas de la IMM como PLSCR3 controlan las respuestas inmunitarias innatas a través de la estabilización de la membrana.

La fuga de mtADN tras la deficiencia de PLSCR3 puede contribuir a una mayor sensibilidad a la terapia anti-PD-1 en el modelo de CCRC MSS subcutáneo CT26. La activación sostenida de bajo grado de STING (Figura 3A, D) puede eludir el silenciamiento epigenético y la degradación de STING que normalmente hacen que algunos tumores MSS sean refractarios a los estímulos inmunitarios exógenos [^[31]]. Esta reprogramación inmunogénica intrínseca transforma los entornos inmunológicamente "fríos" de CCRC MSS en microambientes inflamados, evidenciado por la expansión de las células NK Granzyme B+ y una mayor infiltración de células T CD8+ (Figura 4F-J).

Estudios recientes han destacado la liberación de mtADN como un desencadenante crítico de la activación de cGAS-STING en el cáncer. Los agentes farmacológicos, como el oxaliplatino y los compuestos que inducen ROS, pueden promover la fuga de mtADN y mejorar la inmunidad antitumoral. En contraste con estos inductores exógenos, nuestros hallazgos sugieren que los reguladores mitocondriales intrínsecos también desempeñan un papel clave en el control de la liberación de mtADN. Si bien se ha implicado a las proteínas de la OMM, como VDAC2, en la liberación de mtADN asociada a la apoptosis, nuestros datos indican que los componentes de la IMM, como PLSCR3, pueden regular la retención de mtADN en condiciones basales. Esto posiciona a PLSCR3 como un posible vínculo entre la homeostasis mitocondrial y la señalización inmunitaria innata tumoral intrínseca.

PLSCR3 exhibe una funcionalidad dependiente del contexto. Aunque se reconoce como un amplificador de la piroptosis en las células inmunitarias al facilitar la exposición de la cardiolipina y el direccionamiento del terminal N de GSDMD a la mitocondria [^[32]], nuestros datos revelan un papel opuesto en las células de CCRC. La sobreexpresión de PLSCR3 se correlaciona con un mal pronóstico, mientras que su ablación induce disfunción mitocondrial, fuga de mtADN e inmunidad antitumoral mediada por cGAS-STING. Esta dicotomía proviene de funciones específicas de la línea celular: los macrófagos requieren PLSCR3 para la permeabilización aguda de la mitocondria durante la piroptosis inmunostimuladora, mientras que las células tumorales explotan PLSCR3 para mantener la homeostasis mitocondrial y evadir el estrés inmunogénico crónico. Mecánicamente, la deficiencia de PLSCR3 en el CCRC cambia el destino celular de la lisis rápida mediada por GSDMD hacia la activación inmunitaria acumulativa impulsada por el mtADN, donde la señalización persistente de cGAS-STING supera las respuestas pirotóticas atenuadas. Por lo tanto, PLSCR3 funciona como un regulador pleiotrópico en la interfaz mitocondria-inmunidad, con efectos netos sobre la progresión tumoral determinados por el contexto celular y la cinética del daño mitocondrial.

La traslación clínica exige estrategias terapéuticas precisas. Aunque la inhibición genética de PLSCR3 sugiere un potencial terapéutico en el modelo de CCRC MSS CT26 (Figura 4D, E), la posible toxicidad "on-target" en los tejidos no malignos requiere enfoques de administración selectiva del tumor (por ejemplo, siRNA de PLSCR3 conjugado con anticuerpos). Las combinaciones de radioterapia o quimioterapia a baja dosis podrían interrumpir localmente las membranas mitocondriales para sinergizar con la terapia anti-PD-1 y minimizar la toxicidad sistémica. Las preguntas clave sin resolver incluyen (1) los mecanismos moleculares subyacentes a la estabilización del mtADN mediada por PLSCR3 en el CCRC, (2) la modulación de la actividad de PLSCR3 por las mutaciones comunes del CCRC, como KRASG12D, y (3) si la inhibición farmacológica de PLSCR3 recapitula la eficacia de la ablación genética en modelos adicionales de CCRC, incluidos los modelos ortotópicos y los modelos de xenoinjerto derivados de pacientes/xenoinjerto de organoides derivados de PDX. Abordar estas preguntas acelerará el desarrollo de la inmunoterapia mitocondrial.

En los análisis genómicos exploratorios, las alteraciones de PLSCR3 parecían ser infrecuentes, lo que sugiere que su contribución al CCRC puede estar más estrechamente relacionada con el nivel de expresión y la función mitocondrial que con las alteraciones codificantes recurrentes. Sin embargo, la relación entre la regulación mitocondrial dependiente de PLSCR3 y las mutaciones o estados de número de copias del CCRC canónico aún no está clara y justifica una mayor investigación.

Este estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, la priorización inicial de candidatos y los análisis de supervivencia se basaron en los conjuntos de datos públicos de TCGA y KM plotter y no se validaron en una cohorte GEO independiente o en una cohorte clínica institucional; por lo tanto, los hallazgos de supervivencia respaldan la asociación en lugar del valor pronóstico independiente. En segundo lugar, la validación in vivo utilizó una única línea celular de CCRC MSS, CT26, en un modelo de injerto sinérgico subcutáneo. Se requerirán modelos ortotópicos más clínicamente relevantes, modelos de xenoinjerto derivados de pacientes/organoides y modelos adicionales de CCRC MSS para determinar la generalizabilidad de los hallazgos. En tercer lugar, el ensayo de muerte celular mediada por células NK se realizó a una única relación E:T (5:1) en células de CCRC humanas y no incluyó una curva de respuesta a la dosis o una validación de CT26; se necesitan más estudios en múltiples relaciones E:T y líneas celulares para establecer la amplitud de los efectos inmunorreguladores. En cuarto lugar, aunque el mtADN citosólico se cuantificó mediante la fraccionamiento diferencial, una evaluación dedicada basada en marcadores de la pureza de la fracción fortalecería aún más la interpretación. Finalmente, la relación entre la regulación mitocondrial asociada a PLSCR3 y las alteraciones comunes del CCRC, como las mutaciones de APC, TP53, KRAS o SMAD4, aún no se ha definido.

En resumen, PLSCR3 funciona como un punto de control de calidad mitocondrial que suprime la activación de cGAS-STING impulsada por el mtADN y la inmunogenicidad tumoral en el CCRC. Al conectar la homeostasis mitocondrial con la inmunidad antitumoral y la respuesta al tratamiento, este trabajo identifica un nuevo eje objetivo con un potencial terapéutico significativo. El desarrollo de inhibidores o moduladores de PLSCR3 podría generar estrategias de combinación eficaces para mejorar la ICB para los pacientes con CCRC resistentes a la inmunoterapia.

Contribuciones de los autores

Limian Ling y Jingyu Wu contribuyeron por igual a este trabajo y comparten la autoría principal.

Financiación

Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, 10.13039/501100001809, 81701988, y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Zhejiang, 10.13039/100022963, 2025C02065.

Declaración ética

El diseño del estudio fue aprobado por el Segundo Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (número de aprobación: IRB-2021-562).

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.