FKBP9 aumenta la proliferación de las células de cáncer de colon al inhibir la ferroptosis mediada por GPX4.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad relacionadas con el cáncer en todo el mundo [^[1], ^[2]], lo que pone de manifiesto la urgente necesidad de una mejor comprensión de sus mecanismos subyacentes para mejorar las estrategias terapéuticas. Investigaciones previas sobre las vías moleculares que regulan el CCR han dilucidado varios aspectos de la biología del cáncer, en particular el papel de las vías de muerte celular regulada, como la apoptosis [^[3]] y, más recientemente, la ferroptosis [^[4], ^[5]]. La ferroptosis, caracterizada por la peroxidación lipídica dependiente del hierro [^[6]], es un mecanismo fundamental de supresión tumoral; sin embargo, su papel en el CCR aún no se comprende adecuadamente, lo que la convierte en un área crítica para una mayor exploración.

Aunque la ferroptosis es un objetivo valioso en la terapia contra el cáncer, los reguladores moleculares específicos implicados aún no se han caracterizado por completo, especialmente en el contexto del CCR. Estudios previos han demostrado la importancia de la glutatión peroxidasa 4 (GPX4) en la protección contra la muerte celular por ferroptosis [^[7]], mejorando así la supervivencia celular en condiciones de estrés oxidativo [^[8]]. Sin embargo, no se ha realizado ninguna investigación exhaustiva sobre cómo otras proteínas podrían influir en la actividad de GPX4 y en la resistencia a la ferroptosis. En particular, FKBP9, una inmunofilina implicada en el plegamiento de proteínas y en las respuestas al estrés celular [^[9], ^[10]], se sobreexpresa en varios cánceres que no son CCR [^[10], ^[11]]; sin embargo, hasta la fecha, su papel en la regulación de la ferroptosis y su impacto en la proliferación de las células cancerosas no se han investigado de forma sistemática.

Este estudio se llevó a cabo para abordar estas lagunas, con la hipótesis de que FKBP9 mejora la proliferación de las células CCR al inhibir la ferroptosis, principalmente mediante la estabilización de GPX4. Comprender el mecanismo funcional de FKBP9 podría dilucidar su papel en la regulación de la ferroptosis y contribuir significativamente al desarrollo de estrategias terapéuticas que manipulen las vías de la ferroptosis, mejorando así el tratamiento del cáncer.

Aquí, empleamos una combinación de técnicas de biología molecular, que incluyen la PCR cuantitativa de transcripción inversa y el Western blotting, junto con ensayos de proliferación celular, para investigar los efectos de FKBP9 en las líneas celulares de cáncer de colon (HCT116 y SW480) bajo estímulos de ferroptosis. El objetivo principal fue dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales FKBP9 aumenta la expresión de GPX4 y, en última instancia, mejora la proliferación celular, obteniendo así información sobre posibles objetivos terapéuticos para la aplicación clínica en el tratamiento del CCR.

Materiales y Métodos

Líneas celulares y cultivo

Las líneas celulares de CCR humano HCT116 y SW480 se obtuvieron de ATCC (EE. UU.) y se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se utilizaron para todos los experimentos [^[12]]. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas (STR) en GENEWIZ Inc. y se confirmaron rutinariamente como libres de micoplasma mediante un kit de detección basado en PCR (Beyotime, C0301S).

Construcción de plásmidos y transfección celular

El plásmido de sobreexpresión de FKBP9 (pcDNA3.1-FKBP9) y el vector vacío de control (pcDNA3.1) se sintetizaron en Miaoling Company. Las células HCT116 y SW480 se transfectaron con 1 μg de plásmido por pocillo de una placa de 6 pocillos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el medio se reemplazó con medio fresco que contenía 2 μg/mL de puromicina (Sangon) para la selección de clones estables durante 7 días.

Tratamiento con fármacos y reactivos

El inductor de ferroptosis Erastin (MCE), el inhibidor de la ferroptosis Ferrostatin-1 (Fer-1, MCE), el inhibidor de lisosomas Cloroquina (CQ, HY-17589A) y el inhibidor de proteasomas MG132 (HY-13259) se obtuvieron de MCE. Todos los compuestos se disolvieron en DMSO (Sigma) y se almacenaron según lo recomendado por los fabricantes. La cicloheximida (CHX, C7698) se obtuvo de Sigma. También se utilizaron una sonda de fluorescencia DCFH-DA (Biyuntian), un kit de detección de EdU (Sangon) y un kit de detección de GSH (Sangon) en este estudio.

Western blotting

Las células se lavaron con PBS helado y se lisaron sobre hielo durante 30 minutos en tampón de lisis RIPA que contenía un 1% de inhibidor de proteasas (Beyotime). El lisado se centrifugó a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C y se recogió el sobrenadante. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante un ensayo de BCA (Beyotime). Se separaron concentraciones iguales de proteína (30 μg por carril) utilizando SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada durante 1 hora y se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: FKBP9 (Proteintech, 1:1000), GPX4 (Abcam, 1:2000), LC3B (Cell Signaling Technology, 1:1000), ATG5 (CST, 1:1000), ATG7 (CST, 1:1000) y β-actina (Sigma, 1:5000). Después del lavado con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:5000, CST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el reactivo de quimioluminiscencia ECL (Biosharp) y las densidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

El ARN total se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.) y la transcripción inversa se realizó utilizando el kit de reactivo de transcripción inversa PrimeScript (TAKARA, Japón). La qRT-PCR se realizó utilizando TB Green Premix Ex Taq II (TAKARA, Japón). Se diseñaron y sintetizaron cebadores específicos para el gen diana (FKBP9) y los genes de referencia (β-actina/GAPDH) por Sangon Biotech (Shanghái) Co. Ltd. Las secuencias de los cebadores se verificaron utilizando NCBI BLAST. Las secuencias de los cebadores para FKBP9 son las siguientes: sentido 5'-GGAGAGGAAGGAAGAGGGAATA-3', reverso 5'-GGTTTGTAGTGGGAGGTGATG-3'. La expresión génica relativa se cuantificó utilizando el método 2−ΔΔCt y los datos se presentan como la media ± desviación estándar. La significación se determinó utilizando GraphPad Prism 8.0 (*p < 0,05).

Tinción inmunohistoquímica (IHC)

La IHC se realizó en tejidos de colon normales y de CCR, según los protocolos establecidos. Los tejidos se desparafinaron utilizando una serie de etanol graduado, seguida de un paso de bloqueo de 30 minutos con un 5% de suero a temperatura ambiente. Posteriormente, los tejidos se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo primario contra FKBP9 (dilución 1:100, Wuhan SanYing). A continuación, se aplicó un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:100; Sangon) durante 60 minutos a temperatura ambiente. El sustrato DAB (Sangon Biotech) se utilizó para la visualización, seguido de la contratinción con hematoxilina, la diferenciación en ácido clorhídrico al 1% en etanol, el reavivado con amoníaco y la deshidratación a través de una serie de etanol graduado. Se colocaron cubreobjetos con resina neutra y se capturaron imágenes utilizando un microscopio invertido con un aumento de 20×.

Evaluación de la estabilidad de GPX4

Las células de cáncer de colon HCT116 se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron transitoriamente con 1 μg del plásmido vacío pcDNA3.0 o del plásmido pcDNA3.0-FKBP9, siguiendo el protocolo de Lipofectamine 2000. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se trataron con 15 μg/mL de CHX durante 0, 2, 4 y 6 horas. Los niveles de proteína GPX4 se evaluaron mediante Western blotting y se cuantificaron utilizando ImageJ.

Ensayo de proliferación celular (MTT)

Las células se sembraron a una densidad de 3 × 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Posteriormente, se añadieron 10 μL de solución de MTT (5 mg/mL, Sigma) a cada pocillo a 0, 24, 48 y 72 horas, y la placa se incubó durante 4 horas a 37 °C. A continuación, se eliminó el sobrenadante y se añadió 150 μL de DMSO (Sigma) para disolver los cristales de formazán resultantes. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de ELISA.

Detección de EdU

Las células (5 × 104 por pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos e incubaron con 10 μM de EdU durante 2 horas. Después de la fijación, las células se tiñeron según las instrucciones del fabricante (Sangon, n.º E607204). A continuación, se cuantificó la proporción de células EdU positivas utilizando microscopía de fluorescencia.

Ensayo de formación de colonias

Las células (500 por pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 10-14 días. Posteriormente, las colonias se fijaron y se tiñeron con cristal violeta; se contaron las que contenían más de 50 células.

Detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) y glutatión (GSH)

Para la detección de ROS, las células se incubaron con 10 μM de DCFH-DA en la oscuridad durante 30 minutos y luego se lavaron con PBS. La intensidad de la fluorescencia se cuantificó utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia (Ex/Em = 488/525 nm; PerkinElmer). Para la detección de GSH, las células se lisaron y se hicieron reaccionar con DTNB, y la absorbancia se midió a 412 nm utilizando un lector de ELISA. A continuación, se calculó la concentración de GSH utilizando una curva estándar.

Co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Las células HCT116 y 116-FKBP9 se recogieron y se lisaron utilizando un tampón de lisis de inmunoprecipitación (Sangon Biotech). El lisado se incubó durante la noche a 4 °C con 2 μg de anticuerpo GPX4 (Abcam), seguido de una incubación de 4 horas con cuentas magnéticas de proteína A/G (Thermo Fisher). Las cuentas magnéticas se lavaron con PBS y las proteínas unidas se eluyeron por ebullición. Se realizó Western blotting para detectar LC3B en el eluido. Después de tres lavados, las muestras inmunoprecipitadas se sometieron a SDS-PAGE y se analizaron mediante Western blotting, como se describió anteriormente [^[13]].

Experimento de formación de tumores

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el comité de ética institucional. Las células se suspendieron a una concentración de 4 × 106 células/100 μL. Los ratones se inocularon con células tumorales y se observaron hasta que aparecieron nódulos del tamaño de una semilla de soja (7 días). Posteriormente, se midió el volumen del tumor. Después de 21 días, se sacrificaron los ratones y se extirparon los tumores, se pesaron y se marcaron para su posterior análisis.

Observación mediante microscopía electrónica de transmisión (MET)

Las células se fijaron en un 2,5% de glutaraldehído, se lavaron con tampón durante 20 minutos, se deshidrataron y se incluyeron en resina. Se prepararon secciones ultrafinas por Zhenjiang Zhuanbo Testing Technology Co. Ltd. A continuación, se observaron las estructuras de los autofagosomas mediante MET.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como la media ± DE. La significación se determinó utilizando pruebas t o ANOVA de una vía en GraphPad Prism 8.0 (*p < 0,05). Todos los experimentos se repitieron de forma independiente tres veces.

Líneas celulares y cultivo

Las líneas celulares de CCR humano HCT116 y SW480 se obtuvieron de ATCC (EE. UU.) y se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se utilizaron para todos los experimentos [^[12]]. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas (STR) en GENEWIZ Inc. y se confirmaron rutinariamente como libres de micoplasma mediante un kit de detección basado en PCR (Beyotime, C0301S).

Construcción de plásmidos y transfección celular

El plásmido de sobreexpresión de FKBP9 (pcDNA3.1-FKBP9) y el vector vacío de control (pcDNA3.1) se sintetizaron en Miaoling Company. Las células HCT116 y SW480 se transfectaron con 1 μg de plásmido por pocillo de una placa de 6 pocillos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el medio se reemplazó con medio fresco que contenía 2 μg/mL de puromicina (Sangon) para la selección de clones estables durante 7 días.

Tratamiento con fármacos y reactivos

El inductor de ferroptosis Erastin (MCE), el inhibidor de la ferroptosis Ferrostatin-1 (Fer-1, MCE), el inhibidor de lisosomas Cloroquina (CQ, HY-17589A) y el inhibidor de proteasomas MG132 (HY-13259) se obtuvieron de MCE. Todos los compuestos se disolvieron en DMSO (Sigma) y se almacenaron según lo recomendado por los fabricantes. La cicloheximida (CHX, C7698) se obtuvo de Sigma. También se utilizaron una sonda de fluorescencia DCFH-DA (Biyuntian), un kit de detección de EdU (Sangon) y un kit de detección de GSH (Sangon) en este estudio.

Las células se lavaron con PBS frío y se lisaron sobre hielo durante 30 minutos en tampón de lisis RIPA que contenía un 1% de inhibidor de proteasas (Beyotime). A continuación, el lisado se centrifugó a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, y se recogió el sobrenadante. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante un ensayo BCA (Beyotime). Se separaron concentraciones iguales de proteína (30 μg por carril) utilizando SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore). A continuación, las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada durante 1 hora y se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: FKBP9 (Proteintech, 1:1000), GPX4 (Abcam, 1:2000), LC3B (Cell Signaling Technology, 1:1000), ATG5 (CST, 1:1000), ATG7 (CST, 1:1000) y β-actina (Sigma, 1:5000). Después de lavar con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:5000, CST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el reactivo de quimioluminiscencia ECL (Biosharp) y las densidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.) y se realizó la transcripción inversa utilizando el kit de reactivo PrimeScript RT (TAKARA, Japón). La qRT-PCR se realizó utilizando TB Green Premix Ex Taq II (TAKARA, Japón). Se diseñaron y sintetizaron cebadores específicos para el gen diana (FKBP9) y los genes de referencia (β-actina/GAPDH) por Sangon Biotech (Shanghai) Co. Ltd. Las secuencias de los cebadores se verificaron utilizando NCBI BLAST. Las secuencias de los cebadores para FKBP9 son las siguientes: sentido 5'-GGAGAGGAAGGAAGAGGGAATA-3', reverso 5'-GGTTTGTAGTGGGAGGTGATG-3'. La expresión génica relativa se cuantificó utilizando el método 2−ΔΔCt, y los datos se presentan como la media ± desviación estándar. La significación se determinó utilizando GraphPad Prism 8.0 (*p < 0.05).

Tinción inmunohistoquímica (IHC)

La IHC se realizó en tejidos de colon normales y de CRC, según los protocolos establecidos. Los tejidos se desparafinaron utilizando una serie de etanol graduado, seguido de un paso de bloqueo de 30 minutos con un 5% de suero a temperatura ambiente. Posteriormente, los tejidos se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo primario FKBP9 (dilución 1:100, Wuhan SanYing). A continuación, se aplicó un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:100; Sangon) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se utilizó el sustrato DAB (Sangon Biotech) para la visualización, seguido de una contratinción con hematoxilina, diferenciación en ácido clorhídrico al 1% en etanol, re-coloración con amoníaco y deshidratación a través de una serie de etanol graduado. Se colocaron cubreobjetos con resina neutra y se capturaron imágenes utilizando un microscopio invertido con un aumento de 20×.

Evaluación de la estabilidad de GPX4

Las células de cáncer de colon HCT116 se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron transitoriamente con 1 μg del plásmido vacío pcDNA3.0 o del plásmido pcDNA3.0-FKBP9, siguiendo el protocolo de Lipofectamine 2000. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se trataron con 15 μg/mL de CHX durante 0, 2, 4 y 6 horas. A continuación, se evaluaron los niveles de proteína GPX4 mediante Western blot y se cuantificaron utilizando ImageJ.

Ensayo de proliferación celular (MTT)

Las células se sembraron a una densidad de 3 × 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Posteriormente, se añadieron 10 μL de solución de MTT (5 mg/mL, Sigma) a cada pocillo a los tiempos 0, 24, 48 y 72 horas, y la placa se incubó durante 4 horas a 37 °C. A continuación, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 150 μL de DMSO (Sigma) para disolver los cristales de formazán resultantes. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector ELISA.

Detección de EdU

Las células (5 × 104 por pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos y se incubaron con 10 μM de EdU durante 2 horas. Después de la fijación, las células se tiñeron según las instrucciones del fabricante (Sangon, n.º E607204). A continuación, se cuantificó la proporción de células EdU-positivas utilizando microscopía de fluorescencia.

Ensayo de formación de colonias

Las células (500 por pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 10-14 días. Posteriormente, las colonias se fijaron y se tiñeron con cristal violeta; se contaron las que contenían más de 50 células.

Detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) y glutatión (GSH)

Para la detección de ROS, las células se incubaron con 10 μM de DCFH-DA en la oscuridad durante 30 minutos y luego se lavaron con PBS. La intensidad de la fluorescencia se cuantificó utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia (Ex/Em = 488/525 nm; PerkinElmer). Para la detección de GSH, las células se lisaron y se hicieron reaccionar con DTNB, y la absorbancia se midió a 412 nm utilizando un lector ELISA. A continuación, se calculó la concentración de GSH utilizando una curva estándar.

Co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Las células HCT116 y 116-FKBP9 se recogieron y se lisaron utilizando un tampón de lisis para inmunoprecipitación (Sangon Biotech). El lisado se incubó durante la noche a 4 °C con 2 μg de anticuerpo GPX4 (Abcam), seguido de una incubación de 4 horas con cuentas magnéticas de proteína A/G (Thermo Fisher). Las cuentas magnéticas se lavaron con PBS y las proteínas unidas se eluyeron por ebullición. Se realizó Western blot para detectar LC3B en el eluido. Después de tres lavados, las muestras inmunoprecipitadas se sometieron a SDS-PAGE y se analizaron mediante Western blot, como se describió anteriormente [^[13]].

Experimento de formación de tumores

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el comité de ética institucional. Las células se suspendieron a una concentración de 4 × 106 células/100 μL. Se inocularon ratones con células tumorales y se observaron hasta que aparecieron nódulos del tamaño de una semilla de soja (7 días). Posteriormente, se midió el volumen del tumor. Después de 21 días, se sacrificaron los ratones y se extirparon los tumores, se pesaron y se marcaron para su posterior análisis.

Observación mediante microscopía electrónica de transmisión (MET)

Las células se fijaron en glutaraldehído al 2,5%, se lavaron con tampón durante 20 minutos, se deshidrataron y se incluyeron en resina. Se prepararon secciones ultrafinas por Zhenjiang Zhuanbo Testing Technology Co. Ltd. A continuación, se observaron las estructuras de los autofagosomas mediante MET.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como la media ± DE. La significación se determinó utilizando pruebas t o ANOVA de una vía en GraphPad Prism 8.0 (*p < 0.05). Todos los experimentos se repitieron de forma independiente tres veces.

Resultados

Cribado e identificación de genes asociados positivamente con NKD1 en CRC

Anteriormente demostramos que NKD1 promueve la proliferación y la migración de las células de CRC [^[12], ^[13], ^[14]], lo que indica su potencial como biomarcador de CRC. Para identificar los genes que están significativamente correlacionados con la expresión de NKD1 en CRC, analizamos la expresión diferencial de genes en CRC y en los tejidos normales correspondientes de la base de datos TCGA, utilizando los criterios |log2FC| > 0,7 y FDR < 0,05 para la selección de genes diferenciales. El análisis reveló 4172 genes sobreexpresados (en rojo) y 1559 genes subexpresados (en azul) en los tejidos cancerosos (Figura 1A y Tabla ST1). Posteriormente, el secuenciamiento del transcriptoma de las células SW620 y las células SW620-nkd1−/− con knockout de NKD1 identificó los genes expresados de forma diferencial, como se muestra en los gráficos de dispersión. El knockout de NKD1 aumentó significativamente la expresión de 47 genes y disminuyó notablemente la de 99 genes en las células SW620 (p < 0,05) (Figura 1B y Tabla ST2). Para centrarnos en los genes que se expresan en gran medida en los tejidos de CRC pero que se reducen en las células con knockout de NKD1, seleccionamos los 1800 genes más expresados en los tejidos de CRC y los 10 genes más reducidos en las células con knockout de NKD1, y realizamos un análisis de Venn de estos dos conjuntos de genes. Los resultados identificaron dos genes compartidos: ECT2 y FKBP9 (Figura 1C). A continuación, evaluamos la correlación entre la expresión de estos genes y la supervivencia general de los pacientes, clasificando a los pacientes de TCGA-COAD según los valores medianos de expresión de FKBP9 y ECT2. Las curvas de supervivencia mostraron resultados significativamente peores en los pacientes con alta expresión de FKBP9 que en los que tenían baja expresión de FKBP9 (Figura 1D), lo que indica que los altos niveles de FKBP9 se correlacionan con un mal pronóstico.

En nuestra búsqueda bibliográfica, no encontramos informes previos sobre la función de FKBP9 en CRC, lo que nos llevó a investigar su función biológica y los mecanismos moleculares subyacentes. El análisis de la base de datos TIMER2.0 reveló una alta expresión de FKBP9 en varios tipos de cáncer, incluidos CHOL, COAD, GBM y otros; en cambio, mostró una menor expresión en BRCA, KICH y PRAD (Figura 1E y Tabla ST3). Un análisis de la expresión de FKBP9 en CRC frente a los tejidos normales confirmó estos hallazgos, y se observaron niveles significativamente más altos de FKBP9 en los tejidos cancerosos (Figura 1F). La IHC y el Western blot corroboraron el aumento de la expresión de FKBP9 en los tejidos de CRC (Figura 1G, H). Para explorar la función biológica de FKBP9, realizamos Western blot para evaluar los niveles de FKBP9 en varias líneas celulares de CRC, lo que confirmó que estas células expresan FKBP9 a niveles significativamente más altos que las células NCM460, siendo su expresión la más alta en las células SW620, seguida de la de las células HCT116 y SW480 (Figura 1I). Estos resultados confirman que la expresión de FKBP9 está regulada al alza en los tejidos y las líneas celulares de CRC; sin embargo, su función en CRC no se ha examinado en la literatura existente.

FKBP9 mejora la proliferación de las células de CRC

Para dilucidar la función biológica de FKBP9 en la proliferación de CRC, transfectamos las células HCT116 y SW480 con un lentivirus que expresa FKBP9, generando líneas celulares de cáncer de colon estables con sobreexpresión de FKBP9 (HCT116-FKBP9 y SW480-FKBP9). Verificamos la sobreexpresión de FKBP9 mediante qRT-PCR y Western blot, lo que confirmó una regulación al alza significativa en las células HCT116-FKBP9 y SW480-FKBP9 (Figura 2A-C), lo que validó la creación exitosa de líneas celulares de cáncer de colon con sobreexpresión de FKBP9. A continuación, evaluamos la capacidad proliferativa de las células HCT116 y HCT116-FKBP9 utilizando los ensayos MTT y EdU, lo que reveló una proliferación significativamente mayor en las células HCT116-FKBP9 que en las células HCT116 (Figura 2D, E). La comparación de las células SW480 y SW480-FKBP9 destacó aún más el papel de FKBP9 en la promoción de la proliferación de las células de cáncer de colon (Figura 2F, G). Además, los ensayos de formación de colonias mostraron que la proliferación de las células SW480-FKBP9 era sustancialmente mayor que la de las células SW480 (Figura 2H). Para complementar estos resultados in vitro, realizamos experimentos in vivo de formación de tumores implantando células HCT116 y HCT116-FKBP9 en ratones desnudos. Las células HCT116-FKBP9 dieron lugar a tumores más grandes, con un tamaño, volumen y peso aumentados en comparación con los tumores formados por las células HCT116 (Figura 2I-K). En conjunto, estos hallazgos indican que FKBP9 es un regulador positivo de la proliferación de las células de CRC.

FKBP9 promueve la proliferación de CRC al inhibir la ferroptosis

En nuestros estudios anteriores, demostramos que NKD1 desempeña un papel importante en la progresión de CRC al modular la vía de señalización de Wnt y que está estrechamente relacionado con la muerte celular programada [^[15]]. Dados estos hallazgos y la identificación de FKBP9 como un gen que se correlaciona positivamente con la expresión de NKD1, hipotetizamos que FKBP9 puede ejercer sus efectos oncogénicos en CRC al regular una vía específica de muerte celular programada. Para probar esta hipótesis e identificar qué vía se ve afectada por FKBP9, establecimos líneas celulares de CRC con sobreexpresión de FKBP9 y examinamos la expresión de las proteínas marcadoras clave asociadas con varias vías de muerte celular programada bien caracterizadas mediante Western blot. Observamos niveles significativamente más altos de proteína GPX4 en las células HCT116-FKBP9 que en las células HCT116. Aunque se observaron alteraciones en las proteínas relacionadas con la apoptosis (BAX y BCL2) y los marcadores del ciclo celular (ciclinas), GPX4 mostró la regulación al alza más pronunciada (Figura 3A), lo que indica que FKBP9 mejora la expresión de GPX4 y promueve la vía de señalización de la ferroptosis.

A continuación, medimos los niveles de ROS y GSH en las células HCT116 y HCT116-FKBP9 para validar el papel de FKBP9 en la regulación de la vía de la ferroptosis, revelando una reducción significativa de los niveles de ROS en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116 (Figura 3B). Este hallazgo indica que FKBP9 inhibe la producción de ROS en las células tumorales. Además, los niveles de GSH fueron significativamente más altos en las células HCT116-FKBP9 que en las células HCT116 (Figura 3C). A continuación, tratamos las células HCT116 y HCT116-FKBP9 con el inductor de ferroptosis Erastin (10 μM) durante 24 horas y monitoreamos la expresión de FKBP9 mediante Western blot. La sobreexpresión de FKBP9 persistió en las células tratadas con DMSO o Erastin (Figura 3D), lo que indica que la expresión de FKBP9 no se ve afectada por la inducción de la ferroptosis. En conjunto, evaluamos los niveles de GSH y ROS en las células HCT116 y HCT116-FKBP9 después del tratamiento. Los resultados demostraron que, en ambos tratamientos, las células HCT116-FKBP9 exhibieron niveles significativamente más altos de GSH y niveles más bajos de ROS que las células HCT116. Además, los niveles de GSH se redujeron en las células tratadas con Erastin en comparación con las células tratadas con DMSO (Figura 3E). Por el contrario, los niveles de ROS aumentaron en ambos tratamientos (Figura 3F). Los ensayos MTT de las células tratadas con Erastin mostraron una ventaja significativa en la proliferación de las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116, lo que subraya el papel de FKBP9 en la promoción de la proliferación de las células de CRC.

FKBP9 Promueve la Proliferación de CRC a través de la Regulación al Alza de GPX4

Para investigar cómo FKBP9 regula la ferroptosis, examinamos la expresión de tres reguladores clave de la ferroptosis: SLC7A11, NOX1 y GPX4. Se observaron niveles significativamente elevados de GPX4 en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116 (Figura 4A), lo que confirma el papel de FKBP9 en el aumento de la expresión de GPX4. Luego, inhibimos la expresión de GPX4 en las células HCT116-FKBP9, lo que condujo a un aumento de los niveles de expresión de FKBP9 y GPX4 en relación con los de las células HCT116. En particular, la expresión de GPX4 se redujo notablemente en las células HCT116-FKBP9-shGPX4 en comparación con las células HCT116-FKBP9 (Figura 4B), lo que indica una inhibición exitosa de GPX4. Para demostrar aún más la influencia de FKBP9 en la ferroptosis, evaluamos los niveles de GSH y ROS en las células HCT116, HCT116-FKBP9 y HCT116-FKBP9-shGPX4. La expresión de GSH fue significativamente más alta en las células HCT116-FKBP9, mientras que los niveles de ROS se redujeron significativamente. Por el contrario, la expresión de GSH disminuyó notablemente en las células HCT116-FKBP9-shGPX4 en comparación con las células HCT116-FKBP9 (Figura 4C), lo que condujo a un aumento pronunciado de los niveles de ROS en las células HCT116-FKBP9-shGPX4 en comparación con los controles (Figura 4D).

A continuación, realizamos ensayos MTT, EdU y de formación de colonias en las células HCT116, HCT116-FKBP9 y HCT116-FKBP9-shGPX4. Se observaron aumentos sustanciales en la proliferación en las células HCT116-FKBP9 en comparación con sus contrapartes HCT116, mientras que las células HCT116-FKBP9-shGPX4 exhibieron una capacidad de proliferación significativamente comprometida en comparación con las células HCT116-FKBP9 (Figura 4E-G). En conjunto, estos hallazgos sugieren que FKBP9 mejora la proliferación de las células de CRC al aumentar la expresión de GPX4.

FKBP9 Inhibe la Degradación Autofágica de GPX4

Para dilucidar el mecanismo por el cual FKBP9 regula al alza la expresión de la proteína GPX4, primero evaluamos la vida media de GPX4 en las células HCT116 y HCT116-FKBP9. Expusimos las células a CHX (100 μg/mL) durante intervalos variables (2, 4 o 6 horas) y realizamos Western blot. La vida media de GPX4 fue notablemente más larga en las células HCT116-FKBP9 que en las células HCT116 (Figura 5A), lo que indica que la sobreexpresión de FKBP9 inhibe la degradación de GPX4. Para identificar la vía involucrada en la degradación de GPX4, tratamos las células HCT116 con DMSO (control), CQ (un inhibidor de la autofagia) o MG132 (un inhibidor del proteasoma) y medimos la expresión de GPX4 mediante Western blot. El tratamiento con CQ elevó significativamente los niveles de GPX4 en comparación con los controles de DMSO (Figura 5B), lo que sugiere que GPX4 se degrada predominantemente a través de las vías autofágicas-lisosomales en las células de CRC.

Se realizaron ensayos de inmunoprecipitación para analizar la unión de LC3B a GPX4, lo que reveló que los niveles de LC3B unidos a GPX4 se redujeron marcadamente en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116 (Figura 5C), lo que sugiere que FKBP9 desempeña un papel en la inhibición de la interacción GPX4-LC3B. Un análisis adicional de los datos de entrada reveló una mayor expresión de LC3B en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116 (Figura 5C), lo que indica que FKBP9 mejora la expresión de los marcadores de autofagia. Examinamos otros marcadores de autofagia en las células HCT116 y HCT116-FKBP9 mediante Western blot, lo que reveló niveles significativamente más altos de las proteínas marcadoras de autofagia ATG7, ATG5 y LC3B en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116, lo que indica que FKBP9 activa la vía de señalización autofágica lisosomal. Finalmente, confirmamos que FKBP9 activa la vía autofagolisosomal mediante TEM, como lo demuestra un número significativamente mayor de vesículas autofágicas en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116. En conjunto, estos resultados sugieren que FKBP9 inhibe la degradación autofágica de GPX4 al prevenir la unión de LC3B-GPX4 al tiempo que activa simultáneamente la vía autofagolisosomal en las células de CRC (Figura 6).

Cribado e Identificación de Genes Positivamente Asociados con NKD1 en CRC

Previamente demostramos que NKD1 promueve la proliferación y la migración de las células de CRC [^[12], ^[13], ^[14]], lo que indica su potencial como biomarcador de CRC. Para identificar los genes que están significativamente correlacionados con la expresión de NKD1 en CRC, analizamos la expresión diferencial de genes en los tejidos de CRC y los tejidos normales correspondientes de la base de datos TCGA, utilizando los criterios de |log2FC|> 0,7 y FDR < 0,05 para la selección de genes diferenciales. El análisis reveló 4172 genes regulados al alza (en rojo) y 1559 genes regulados a la baja (en azul) en los tejidos cancerosos (Figura 1A y Tabla ST1). Posteriormente, el secuenciamiento del transcriptoma de las células SW620 y las células SW620-nkd1-/- con knockout de NKD1 identificó los genes expresados de manera diferencial, como se muestra en los gráficos de dispersión. El knockout de NKD1 aumentó significativamente la expresión de 47 genes y redujo marcadamente la de 99 genes en las células SW620 (p < 0,05) (Figura 1B y Tabla ST2). Para centrarnos en los genes que se expresan en gran medida en los tejidos de CRC pero que se reducen en las células con knockout de NKD1, examinamos los 1800 genes más expresados en los tejidos de CRC y los 10 genes más reducidos en las células con knockout de NKD1, y realizamos un análisis de Venn de estos dos conjuntos de genes. Los resultados identificaron dos genes compartidos: ECT2 y FKBP9 (Figura 1C). Luego, evaluamos la correlación entre la expresión de estos genes y la supervivencia general del paciente, clasificando a los pacientes de TCGA-COAD según los valores medianos de la expresión de FKBP9 y ECT2. Las curvas de supervivencia mostraron resultados significativamente peores en los pacientes con alta expresión de FKBP9 que en aquellos con baja expresión de FKBP9 (Figura 1D), lo que indica que los niveles altos de FKBP9 se correlacionan con un mal pronóstico.

En nuestra búsqueda bibliográfica, no encontramos informes previos sobre la función de FKBP9 en CRC, lo que nos llevó a investigar su papel biológico y los mecanismos moleculares subyacentes. El análisis de la base de datos TIMER2.0 reveló una alta expresión de FKBP9 en varios tipos de cáncer, incluidos CHOL, COAD, GBM y otros; en contraste, mostró una menor expresión en BRCA, KICH y PRAD (Figura 1E y Tabla ST3). Un análisis de la expresión de FKBP9 en los tejidos de CRC frente a los tejidos normales confirmó estos hallazgos, y se observaron niveles significativamente más altos de FKBP9 en los tejidos cancerosos (Figura 1F). La inmunohistoquímica y el Western blot corroboraron el aumento de la expresión de FKBP9 en los tejidos de CRC (Figura 1G, H). Para explorar la función biológica de FKBP9, realizamos Western blot para evaluar los niveles de FKBP9 en varias líneas celulares de CRC, lo que confirmó que estas células expresan FKBP9 a niveles significativamente más altos que las células NCM460, siendo su expresión la más alta en las células SW620, seguida de las células HCT116 y SW480 (Figura 1I). Estos resultados confirman que la expresión de FKBP9 está regulada al alza en los tejidos y las líneas celulares de CRC; sin embargo, su función en CRC no se ha examinado en la literatura existente.

FKBP9 Mejora la Proliferación de las Células de CRC

Para dilucidar el papel biológico de FKBP9 en la proliferación de CRC, transfectamos las células HCT116 y SW480 con un lentivirus que expresa FKBP9, generando líneas celulares de cáncer de colon estables con sobreexpresión de FKBP9 (HCT116-FKBP9 y SW480-FKBP9). Verificamos la sobreexpresión de FKBP9 mediante qRT-PCR y Western blot, lo que confirmó una regulación al alza significativa en las células HCT116-FKBP9 y SW480-FKBP9 (Figura 2A-C), lo que validó la creación exitosa de líneas celulares de cáncer de colon con sobreexpresión de FKBP9. A continuación, evaluamos la capacidad proliferativa de las células HCT116 y HCT116-FKBP9 utilizando los ensayos MTT y EdU, lo que reveló una proliferación significativamente mayor en las células HCT116-FKBP9 que en las células HCT116 (Figura 2D, E). La comparación de las células SW480 y SW480-FKBP9 destacó aún más el papel de FKBP9 en la promoción de la proliferación de las células de cáncer de colon (Figura 2F, G). Además, los ensayos de formación de colonias mostraron que la proliferación de las células SW480-FKBP9 fue sustancialmente mayor que la de las células SW480 (Figura 2H). Para complementar estos resultados in vitro, realizamos ensayos de formación de tumores in vivo implantando células HCT116 y HCT116-FKBP9 en ratones desnudos. Las células HCT116-FKBP9 dieron como resultado tumores más grandes, con un tamaño, volumen y peso aumentados en comparación con los tumores formados por las células HCT116 (Figura 2I-K). En conjunto, estos hallazgos indican que FKBP9 es un regulador positivo de la proliferación de las células de CRC.

FKBP9 Promueve la Proliferación de CRC al Inhibir la Ferroptosis

En nuestros estudios anteriores, demostramos que NKD1 desempeña un papel importante en la progresión de CRC al modular la vía de señalización de Wnt y que está estrechamente relacionado con la muerte celular programada [^[15]]. Dados estos hallazgos y la identificación de FKBP9 como un gen que se correlaciona positivamente con la expresión de NKD1, hipotetizamos que FKBP9 puede ejercer sus efectos oncogénicos en CRC al regular una vía específica de muerte celular programada. Para probar esta hipótesis e identificar qué vía se ve afectada por FKBP9, establecimos líneas celulares de CRC con sobreexpresión de FKBP9 y examinamos la expresión de las proteínas marcadoras clave asociadas con varias vías de muerte celular programada bien caracterizadas mediante Western blot. Observamos niveles significativamente más altos de la proteína GPX4 en las células HCT116-FKBP9 que en las células HCT116. Aunque se observaron alteraciones en las proteínas relacionadas con la apoptosis (BAX y BCL2) y los marcadores del ciclo celular (ciclinas), GPX4 mostró la regulación al alza más pronunciada (Figura 3A), lo que indica que FKBP9 mejora la expresión de GPX4 y promueve la vía de señalización de la ferroptosis.

A continuación, medimos los niveles de ROS y GSH en las células HCT116 y HCT116-FKBP9 para validar el papel de FKBP9 en la regulación de la vía de la ferroptosis, lo que reveló una reducción significativa de los niveles de ROS en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116 (Figura 3B). Este hallazgo indica que FKBP9 inhibe la producción de ROS en las células tumorales. Además, los niveles de GSH fueron significativamente más altos en las células HCT116-FKBP9 que en las células HCT116 (Figura 3C). A continuación, tratamos las células HCT116 y HCT116-FKBP9 con el inductor de ferroptosis Erastin (10 μM) durante 24 horas y monitoreamos la expresión de FKBP9 mediante Western blot. La sobreexpresión de FKBP9 persistió en las células tratadas con DMSO o Erastin (Figura 3D), lo que indica que la expresión de FKBP9 no se ve afectada por la inducción de la ferroptosis. En conjunto, evaluamos los niveles de GSH y ROS en las células HCT116 y HCT116-FKBP9 después del tratamiento. Los resultados demostraron que, en ambos tratamientos, las células HCT116-FKBP9 exhibieron niveles significativamente más altos de GSH y niveles más bajos de ROS que las células HCT116. Además, los niveles de GSH se redujeron en las células tratadas con Erastin en comparación con las células tratadas con DMSO (Figura 3E). Por el contrario, los niveles de ROS aumentaron en ambos tratamientos (Figura 3F). Los ensayos MTT de las células tratadas con Erastin mostraron una ventaja significativa en la proliferación de las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116, lo que subraya el papel de FKBP9 en la promoción de la proliferación de las células de CRC.

Para investigar cómo FKBP9 regula la ferroptosis, examinamos la expresión de tres reguladores clave de la ferroptosis: SLC7A11, NOX1 y GPX4. Se observaron niveles significativamente elevados de GPX4 en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116 (Figura 4A), lo que confirma el papel de FKBP9 en el aumento de la expresión de GPX4. A continuación, inhibimos la expresión de GPX4 en las células HCT116-FKBP9, lo que provocó un aumento de los niveles de expresión de FKBP9 y GPX4 en relación con los de las células HCT116. Cabe destacar que la expresión de GPX4 se redujo notablemente en las células HCT116-FKBP9-shGPX4 en comparación con las células HCT116-FKBP9 (Figura 4B), lo que indica una inhibición exitosa de GPX4. Para demostrar aún más la influencia de FKBP9 en la ferroptosis, evaluamos los niveles de GSH y ROS en las células HCT116, HCT116-FKBP9 y HCT116-FKBP9-shGPX4. La expresión de GSH fue significativamente mayor en las células HCT116-FKBP9, mientras que los niveles de ROS se redujeron significativamente. Por el contrario, la expresión de GSH disminuyó notablemente en las células HCT116-FKBP9-shGPX4 en comparación con las células HCT116-FKBP9 (Figura 4C), lo que provocó un aumento pronunciado de los niveles de ROS en las células HCT116-FKBP9-shGPX4 en comparación con los controles (Figura 4D).

A continuación, realizamos ensayos de MTT, EdU y formación de colonias en las células HCT116, HCT116-FKBP9 y HCT116-FKBP9-shGPX4. Se observó un aumento sustancial de la proliferación en las células HCT116-FKBP9 en comparación con sus homólogas HCT116, mientras que las células HCT116-FKBP9-shGPX4 mostraron una capacidad de proliferación significativamente comprometida en comparación con las células HCT116-FKBP9 (Figura 4E-G). En conjunto, estos hallazgos sugieren que FKBP9 mejora la proliferación de las células de CRC al aumentar la expresión de GPX4.

FKBP9 inhibe la degradación autofágica de GPX4

Para dilucidar el mecanismo por el cual FKBP9 aumenta la expresión de la proteína GPX4, primero evaluamos la vida media de GPX4 en las células HCT116 y HCT116-FKBP9. Expusimos las células a CHX (100 μg/mL) durante intervalos variables (2, 4 o 6 horas) y realizamos inmunotransferencia (Western blotting). La vida media de GPX4 fue notablemente más larga en las células HCT116-FKBP9 que en las células HCT116 (Figura 5A), lo que indica que la sobreexpresión de FKBP9 inhibe la degradación de GPX4. Para identificar la vía implicada en la degradación de GPX4, tratamos las células HCT116 con DMSO (control), CQ (un inhibidor de la autofagia) o MG132 (un inhibidor del proteasoma) y medimos la expresión de GPX4 mediante inmunotransferencia. El tratamiento con CQ elevó significativamente los niveles de GPX4 en comparación con los controles de DMSO (Figura 5B), lo que sugiere que GPX4 se degrada predominantemente a través de las vías autofágicas-lisosomales en las células de CRC.

Se realizaron ensayos de inmunoprecipitación para analizar la unión de LC3B a GPX4, lo que reveló que los niveles de LC3B unidos a GPX4 se redujeron notablemente en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116 (Figura 5C), lo que sugiere que FKBP9 desempeña un papel en la inhibición de la interacción GPX4-LC3B. Un análisis adicional de los datos de entrada reveló una mayor expresión de LC3B en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116 (Figura 5C), lo que indica que FKBP9 mejora la expresión de marcadores de autofagia. Examinamos otros marcadores de autofagia en las células HCT116 y HCT116-FKBP9 mediante inmunotransferencia, lo que reveló niveles significativamente más altos de proteínas de los marcadores de autofagia ATG7, ATG5 y LC3B en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116, lo que indica que FKBP9 activa la vía de señalización autofágica-lisosomal. Finalmente, confirmamos que FKBP9 activa la vía autofagolisosomal mediante TEM, como lo demuestra un número significativamente mayor de vesículas autofágicas en las células HCT116-FKBP9 en comparación con las células HCT116. En conjunto, estos resultados sugieren que FKBP9 inhibe la degradación autofágica de GPX4 al prevenir la unión de LC3B a GPX4, al tiempo que activa simultáneamente la vía autofagolisosomal en las células de CRC (Figura 6).

Discusión

Los hallazgos de este estudio arrojan luz sobre la compleja interacción entre FKBP9, GPX4 y el mecanismo de ferroptosis en el CRC, proporcionando información crucial para el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a estas vías. El CRC es un problema de salud mundial importante, y comprender los mecanismos moleculares que impulsan su progresión es fundamental para formular planes de tratamiento eficaces [^[16], ^[17]]. Este estudio exploró cómo FKBP9 promueve la proliferación de las células de CRC al inhibir la ferroptosis a través de la estabilización de GPX4. Descubrimos que FKBP9 se sobreexpresa en las células de CRC (HCT116, SW480) y que aumenta los niveles de GPX4, reduciendo los niveles de ROS y protegiendo contra la ferroptosis, lo que a su vez mejora la proliferación.

Este estudio contribuye al creciente cuerpo de literatura sobre las vías moleculares que subyacen a la progresión del CRC. Las investigaciones previas han identificado varios factores que influyen en la ferroptosis [^[18], ^[19], ^[20]]; sin embargo, persiste una importante laguna en relación con los reguladores moleculares que modulan la actividad de GPX4, en particular en el contexto del CRC. Esta doble contribución (confirmación de la sobreexpresión de FKBP9 y sus efectos directos sobre GPX4) destaca la compleja interacción entre las vías de degradación autofágica y las respuestas celulares al estrés oxidativo. Al situar nuestros hallazgos junto con la literatura existente, demostramos que el papel de FKBP9 se extiende más allá de la mera sobreexpresión; participa activamente en un circuito de retroalimentación que mejora la expresión de GPX4 al tiempo que inhibe su degradación autofágica. Esto posiciona a FKBP9 como un actor clave que puede ayudar a combatir la resistencia terapéutica que se observa comúnmente en los pacientes con CRC, especialmente cuando se trata con agentes que promueven la ferroptosis.

A pesar de los prometedores resultados, se deben considerar varias limitaciones al interpretar los resultados de este estudio. En primer lugar, el enfoque en solo dos líneas celulares de CRC limita la generalizabilidad de nuestros hallazgos. Aunque HCT116 y SW480 proporcionan información útil, se deben explorar otros modelos de CRC para confirmar la universalidad de FKBP9 en diferentes antecedentes genéticos. Además, nuestra investigación sobre las vías de degradación autofágica implica factores significativos, pero quizás subestimados. Por ejemplo, observamos que la expresión de GPX4 se reguló al alza en las células tratadas con el inhibidor del proteasoma MG132, lo que sugiere la participación de la vía ubiquitina-proteasoma junto con la vía autofágica en la regulación de los niveles de GPX4 en el cáncer de colon [^[21]]. Este aspecto no se explora adecuadamente en el estudio actual, lo que deja espacio para futuras investigaciones para dilucidar las intrincadas interacciones moleculares que median la degradación de GPX4. Además, los detalles de cómo FKBP9 interactúa con estas vías siguen sin estar claros, lo que requiere una investigación más exhaustiva de los mecanismos moleculares que subyacen a estas interacciones. Además, la aplicabilidad de estos hallazgos in vivo aún está por establecerse. Aunque nuestros resultados indican que FKBP9 promueve la proliferación de las células de CRC en condiciones controladas, es necesario explorar cómo se traducen estas dinámicas en sistemas biológicos más complejos. Los modelos animales son esenciales para determinar si FKBP9 es un objetivo terapéutico viable y para examinar sus posibles interacciones con otras vías celulares implicadas en la proliferación y progresión del tumor.

Dadas las limitaciones identificadas, surgen varias recomendaciones para futuras direcciones de investigación. En primer lugar, ampliar el alcance de la investigación para incluir líneas celulares de CRC adicionales y explorar muestras de tumores primarios podría ayudar a validar el papel de FKBP9 en diferentes variantes de CRC. Este enfoque también puede facilitar la identificación de biomarcadores predictivos que podrían guiar el desarrollo de planes de tratamiento individualizados según los niveles de expresión de FKBP9 y GPX4. Además, analizar la relación entre FKBP9 y la vía de degradación ubiquitina-proteasoma proporcionaría información completa sobre los mecanismos multifacéticos que regulan GPX4 en el cáncer de colon. Investigar otras proteínas que puedan regular la actividad o la estabilidad de FKBP9 podría arrojar más luz sobre la red reguladora que modula la ferroptosis en las células cancerosas. Finalmente, dilucidar el potencial de dirigir FKBP9 en contextos terapéuticos podría producir resultados prometedores. El desarrollo de inhibidores de FKBP9 o pequeñas moléculas que puedan interrumpir eficazmente su interacción con GPX4 o sus vías reguladoras podría potenciar nuevas estrategias de tratamiento. Estas estrategias podrían mejorar la sensibilidad de las células de CRC a la ferroptosis y, en última instancia, mejorar los resultados de supervivencia de los pacientes.

En conclusión, este estudio subraya el papel significativo de FKBP9 en la regulación de la ferroptosis mediada por GPX4 y en la promoción de la proliferación de las células de CRC. Al abordar las lagunas de conocimiento existentes y destacar las implicaciones clínicas de nuestros hallazgos, sentamos las bases para futuras investigaciones destinadas a adaptar los enfoques de tratamiento dirigidos a estas vías moleculares críticas.

Contribuciones de los autores

Jianzhong Deng: metodología (principal), redacción del borrador original (principal), revisión y edición (principal). Anqi Jiang: curación de datos (principal), metodología (de apoyo). Xizheng Zhang: investigación (de apoyo), visualización (principal). Jiayu Wei: software (principal), validación (de apoyo). Qian Liu: conceptualización (de apoyo), adquisición de financiación (principal). Ying Shen: redacción del borrador original (igual), revisión y edición (igual). Dong Hua: conceptualización (igual), administración del proyecto (principal), recursos (principal).

Financiación

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Abierto del Laboratorio Clave de la Universidad Médica de Xuzhou en la Provincia de Jiangsu, XZSYSKF2023034, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, 81872275, el Proyecto de Formación de Talentos Médicos de Alto Nivel de Changzhou, 2022CZBJ110.

Declaración

Estudios en animales: Sí.

Declaración ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Wujin afiliado a la Universidad de Jiangsu. Se notificó a todos los participantes y proporcionaron su consentimiento antes del inicio de la investigación. Aprobación del protocolo de investigación por un Comité de Revisión Institucional: Sí (2024-SR-129).

Consentimiento

Los autores no declaran nada.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.