La señalización de CXCR3 favorece el reclutamiento de células T Delta One y la eficacia antitumoral en el cáncer colorrectal.

La aparición de enfoques inmunoterapéuticos basados en los linfocitos T γδ ha posicionado a este inusual subconjunto de linfocitos como un candidato prometedor para terapias celulares “listas para usar”. Los linfocitos T γδ combinan diversos mecanismos de reconocimiento tumoral, potente actividad antitumoral, propiedades naturales de homing tisular y ausencia de restricción por el complejo mayor de histocompatibilidad, características que permiten una amplia focalización tumoral con idoneidad alogénica y un riesgo reducido de enfermedad de injerto contra huésped.^[1]

El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de mortalidad por cáncer en todo el mundo. Aunque las inmunoterapias han transformado los resultados en otros tipos de cáncer, su impacto en el CCR ha sido limitado. La eficacia de los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICPI) se restringe principalmente al 5–15% de los casos de CCR, específicamente aquellos que presentan deficiencia en la reparación de desajustes del ADN (MMR-d). Estos tumores acumulan un gran número de mutaciones, generando muchos neoantígenos que provocan una abundante infiltración y activación de los linfocitos T αβ. Sin embargo, la mayoría de los casos de CCR tienen una reparación de desajustes del ADN funcional (MMR-p), lo que implica una cantidad insuficiente de neoantígenos y muestran una infiltración mínima de linfocitos T αβ, lo que resulta en resistencia a los ICPI.^[2] Como ocurre en otros cánceres sólidos, las terapias celulares adoptivas, incluidos los linfocitos T que expresan receptores quiméricos de antígenos (CAR), también enfrentan importantes obstáculos en el CCR, incluida una infiltración limitada en el núcleo tumoral y la exposición a un microambiente tumoral inmunosupresor (MIT).

Los linfocitos T γδ, y en particular su subconjunto que expresa el receptor de células T (TCR) Vδ1, están enriquecidos en los tejidos epiteliales, donde contribuyen a la vigilancia tisular, la integridad de la barrera y la defensa inmunitaria. En el contexto del CCR, los linfocitos T Vδ1 se encuentran con frecuencia dentro de las lesiones tumorales, donde constituyen el principal subconjunto de linfocitos T γδ, y se ha demostrado que ejercen actividad citotóxica contra las células epiteliales malignas con un grado limitado de agotamiento.^[3] Además, su infiltración se correlaciona con resultados clínicos favorables, lo que subraya su relevancia como efectores antitumorales naturales en el intestino.^[4] Aprovechando estas propiedades, nuestro grupo desarrolló las células Delta One T (DOT), un producto de linfocitos T γδ con predominio de Vδ1 de grado clínico generado mediante la expansión de células sanguíneas periféricas de donantes sanos.^[5] Además de controlar las neoplasias hematológicas, las células DOT han demostrado la capacidad de infiltrarse y controlar los tumores de CCR injertados en modelos preclínicos.^[6] Estos hallazgos sugieren que los productos celulares enriquecidos con Vδ1 podrían superar las limitaciones que enfrentan las terapias celulares adoptivas convencionales en el CCR. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las células DOT derivadas de la sangre se reclutan en el CCR u otros sitios tumorales siguen siendo poco conocidos.

De hecho, la infiltración de células inmunitarias es un determinante crítico del control tumoral y el resultado del paciente en todos los tumores sólidos, incluido el CCR. Los gradientes de quimiocinas dentro del MIT promueven el reclutamiento de efectores inmunitarios, incluidos los asesinos naturales (NK), los linfocitos T αβ y los linfocitos T γδ. Entre los ejes de quimiocinas implicados en la inmunidad tumoral, la vía CXCR3-CXCL9/10/11 ha demostrado ser consistentemente importante para dirigir el tráfico de las células efectoras y se ha asociado con un mejor pronóstico en varios cánceres.^[7] CXCR3 es un receptor acoplado a proteína G que se une a tres ligandos inducidos por el interferón (IFN): CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) y CXCL11 (I-TAC). Sin embargo, la participación del eje de ligando CXCR3-CXCR3 en la mediación del tráfico de las células Vδ1/DOT hacia los tumores sigue siendo desconocida.

Aquí, investigamos el perfil del receptor de quimiocinas de las células DOT y su función en la infiltración del CCR. Identificamos CXCR3 como un mediador clave de la migración de las células DOT hacia los tumores de CCR y demostramos que el aumento de la interacción con los ligandos CXCL9-11 en el MIT mejora la infiltración y la actividad antitumoral de las células DOT. Nuestros hallazgos resaltan el eje CXCR3 como un objetivo prometedor para potenciar la eficacia terapéutica de los productos de linfocitos T γδ enriquecidos con Vδ1 en el CCR.

Materiales y métodos

Expansión de células DOT

Las células DOT se expandieron según lo descrito previamente^[5] con ligeras modificaciones. Se obtuvieron buffy coats de donantes sanos anónimos del Instituto Português do Sangue e da Transplantação y se utilizaron para generar células DOT después de la aprobación institucional. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante centrifugación de gradiente de Ficoll-Hypaque y posteriormente se eliminaron los linfocitos T αβ mediante incubación con anticuerpo monoclonal anti-TCR αβ-Biotina (Miltenyi Biotec) seguido de microesferas anti-Biotina (Miltenyi Biotec). Después de la separación magnética utilizando columnas LS (Miltenyi Biotec), las PBMC empobrecidas en αβ se resuspendieron en medio OpTmizer-CTS (Gibco) suplementado con un 2,5% de plasma humano inactivado por calor Octaplas (Octapharma), 2 mmol/L de L-glutamina (Thermo Fisher Scientific), 50 U/mL y 50 µg/mL de penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher Scientific) y un 0,1% de heparina (Braun), a partir de ahora denominado Complete-Optimizer. Luego, las células se cultivaron durante 14 días en plataformas G-REX (Wilson Wolf Manufacturing) a 37 °C y 5% de CO2. El día 0, se añadieron al medio el anti-CD3 (clon OKT-3, 140 ηg/mL; BioLegend) y las citocinas humanas recombinantes, incluido el IL-4 (100 ηg/mL), el IFNγ (70 ηg/mL), el IL-21 (7 ηg/mL) y el IL-1β (15 ηg/mL; todos de PeproTech). El día 7, se suplementaron los cultivos con anti-CD3 (clon OKT-3, 1 µg/mL), rIL-21 (13 ηg/mL) y rIL-15 (70 ηg/mL). El día 11, las células recibieron medio fresco que contenía anti-CD3 (1 µg/mL) y rIL-15 (100 ηg/mL). El día 14, se cosecharon las células DOT, se fenotiparon y se crioconservaron en CryoStor CS10 (Merck) y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso. Solo se utilizaron para los experimentos expansiones de células DOT que alcanzaron ≥65% de linfocitos T Vδ1+.

Para evaluar la expresión de CXCR3 en los diferentes subconjuntos de diferenciación de Vδ1+, las células empobrecidas en αβ se clasificaron en poblaciones CXCR3− Vδ1+, CXCR3+ Vδ1+ y Vδ1−. Para la expansión de células DOT, se cultivaron 10³ células CXCR3− Vδ1+ o CXCR3+ Vδ1+ en placas de 96 pocillos en presencia de 49×10³ células alimentadoras autólogas Vδ1− (5×10⁴ células/pocillo en total). Después de la clasificación, las células Vδ1+ se expandieron utilizando una versión adaptada del protocolo DOT-cell descrito previamente. Las células se cultivaron en Complete-Optimizer suplementado con anti-CD3 (1 µg/mL) y las citocinas humanas recombinantes IL-4 (100 ηg/mL), IFNγ (70 ηg/mL), IL-21 (7 ηg/mL) y IL-1β (15 ηg/mL). El día 7, se añadió medio fresco que contenía anti-CD3 (2 µg/mL), rIL-21 (13 ηg/mL) y rIL-15 (70 ηg/mL) a los pocillos. El día 11, las células de cada pocillo se resuspendieron y se distribuyeron en seis pocillos de réplica. Luego, se añadió medio fresco suplementado con anti-CD3 (2 µg/mL) y rIL-15 (100 ηg/mL) a todos los pocillos. Las células DOT se cosecharon y se fenotiparon el día 14.

Líneas celulares de cáncer

Las líneas celulares de cáncer de colon humano HCT-116 y SW620 se compraron a la American Type Culture Collection (ATCC, referencias #CCL-247 y #CCL-227, respectivamente). Las células SW620 Luc+/+ GFPhigh se generaron mediante la transducción de células SW620 con el lentivirus CMV-Luciferase (luciéraga)-2A-GFP (#LVP020, Amsbio). Ambas líneas celulares se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB, Gibco), un 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) y un 0,2% de MycoZap (Lonza). Las células se cultivaron en matraces T75 (75 cm2; Nunc EasYFlask; Thermo Scientific) con 15 mL de medio y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Los ensayos se realizaron con células que alcanzaron una confluencia óptica del 60–80%. En este punto, se retiró el medio y las células se lavaron con 8 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La separación de las células se logró incubándolas con 2 mL de TrypLe-Express (1X, rojo fenol, Gibco) durante 5 minutos a 37 °C.

Modelo de xenoinjerto ortotópico de CCR

Se compraron ratones hembra hIL15-NOG (NOD.Cg-Prkdcscid
Il2rgtm1Sug Tg(CMV-IL-2/IL-15)1-1Jic/JicTac) de Taconic Biosciences. Se utilizaron animales de 7 a 20 semanas de edad para los experimentos y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos en la Plataforma de Roedores GIMM. El modelo de xenoinjerto ortotópico de CCR se generó según lo descrito previamente.^[6] En resumen, se anestesiaron los ratones con un 3% de isoflurano en oxígeno administrado a través de una cánula nasal y se inocularon cuidadosamente 105 células SW620 Luc+/+ GFPhigh, suspendidas en 20 µL de PBS, en el seroso cecal expuesto, entre las capas epiteliales de la pared cecal. Después de reposicionar el ciego, se suturó el peritoneo y los ratones recibieron una administración subcutánea de 100 µL de buprenorfina (0,3 mg/mL) para la analgesia.

Se evaluó el crecimiento tumoral en todos los animales utilizando el sistema de imagen de bioluminiscencia y fluorescencia IVIS Lumina (Caliper, LifeSciences). Se anestesiaron los ratones mediante inyección intraperitoneal de 200 µL de solución anestésica (7,5 mg/mL de ketamina y 0,1 mg/mL de medetomidina en agua), seguida de una inyección intraperitoneal de 200 µL de 15 mg/mL de sustrato bioluminiscente XenoLight D-Luciferin—K+ Salt (Revvity). Después de 7 minutos, se midió la luminiscencia con 30 y 60 segundos de exposición, y se consideró el valor más alto para el análisis. Finalmente, se administró intraperitonealmente 200 µL de 0,1 mg/mL de Antisedan (Esteve) para la recuperación. La luminiscencia se analizó mediante el software Living Image V.3.0 y se evaluó el tamaño del tumor como fotones liberados por segundo. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal de GIMM y la autoridad competente nacional (DGAV) con el número de licencia 0421/000/000/2023.

Tratamientos in vivo

Se asignaron aleatoriamente los ratones a los diferentes grupos experimentales y todos los protocolos de tratamiento se iniciaron después de la confirmación del tumor mediante los ensayos de luminiscencia. Para evaluar la infiltración de células DOT en los tumores de CCR, los ratones recibieron una inyección intravenosa semanal de 107 células DOT, suspendidas en 100 µL de Optimizer (Gibco), durante 3 semanas.

Para los ensayos de pérdida de función de CXCR3, los ratones recibieron tratamiento con el antagonista de CXCR3 AMG487 3 semanas después de la implantación del tumor, siguiendo una estrategia sistémica o dirigida. En el enfoque sistémico, los ratones recibieron una única inyección intravenosa de células DOT seguida de una administración intraperitoneal diaria del antagonista de CXCR3 AMG487 (5 mg/kg; MedChem) durante 1 semana. El antagonista se preparó en 100 µL de vehículo que consistía en un 10% de dimetilsulfóxido y un 90% de aceite de maíz (MedChem). En el enfoque dirigido, las células DOT se pretrataron in vitro con AMG487 (1 µM; MedChem Express) y citocinas humanas recombinantes IL-15 (100 ηg/mL) durante 1 día antes de la infusión. Luego, se inyectaron por vía intravenosa 107 células DOT en ratones con tumores. Los ratones se sacrificaron 1 semana después de la inyección para evaluar la infiltración de células DOT en los tumores.

Para el tratamiento in vivo con AC484, el fármaco se formuló en etanol, PEG400 y Phosal-50PG en una proporción de 10:30:60 (vehículo). Los ratones recibieron AC484 (20 mg/kg) ^[8] o el vehículo por sonda oral diaria durante los primeros 3 días de tratamiento, comenzando el día 6 después de la inoculación del tumor y luego cada dos días durante 18 días. En paralelo, se inyectaron por vía intravenosa 107 células DOT los días 7, 14 y 21.

Muestras de tumores primarios de pacientes con CCR

Se recolectaron muestras de tumores colorrectales de pacientes no tratados mediante colonoscopia entre enero de 2023 y noviembre de 2025 en el Hospital Santa Maria (Lisboa, Portugal). Tras la resección quirúrgica, las muestras de tumor se mantuvieron en DMEM (Gibco) suplementado con 5% de penicilina/estreptomicina (Gibco), 5% de fungizona/anfotericina B (Gibco), 0,2% de gentamicina (Gibco) y 0,1% de metronidazol (Duchefa Biochemie). Dentro de las primeras 3 horas después de la recolección, las muestras de tumor se cortaron en fragmentos de 1-2 mm³ y se crioconservaron en un medio de crioconservación celular CryoStor CS10 (Merck) en nitrógeno líquido hasta su uso. Para los ensayos experimentales, las biopsias se procesaron siguiendo el protocolo publicado.^[9] Las muestras de tumor crioconservadas se descongelaron antes del procesamiento, mientras que las muestras frescas se procesaron directamente. Tanto para las muestras frescas como para las crioconservadas descongeladas, se retiró el medio y los fragmentos se transfirieron a un tubo de Falcon con 1 ml de DMEM suplementado con 0,1 mg/ml de DNasa I (Roche) y 0,25 U/ml de Liberase (Roche). Las muestras de tumor se picaron mecánicamente en fragmentos más pequeños para facilitar la acción enzimática y se incubaron con 4 ml adicionales de medio de digestión durante 20 minutos a 37 °C con agitación a 100 rpm. Tras la digestión enzimática, las suspensiones celulares se pasaron a través de un filtro de 100 µm, luego se lavaron y se resuspendieron para su uso posterior en RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% de FBS (Gibco), 1% de CTS Glutamax (Gibco), 1% de solución de aminoácidos no esenciales MEM (Gibco) y 0,2% de Mycozap (Lonza), a partir de ahora denominado RPMI completo.

Ensayos de quimiotaxis in vitro

La migración de las células DOT se evaluó utilizando placas Transwell de 96 pocillos (tamaño de poro de 5 µm, Corning). Las células DOT se descongelaron y se dejaron reposar durante la noche con rIL-15 (100 ηg/ml; PeproTech) antes del ensayo. El día del experimento, se resuspendieron 2 × 10⁵ células DOT en 100 µl de RPMI completo y se cargaron cuidadosamente en los insertos de Transwell.

Para evaluar la capacidad de respuesta de las células DOT a las señales quimiotácticas, se añadieron quimiocinas recombinantes (CCL2, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL12 y CXCL16, todas de PreproTech) a los pocillos inferiores en RPMI completo, a concentraciones de 1, 10 y 100 ηg/ml, inmediatamente antes del ensayo.

Además, se sembraron células SW620 y HCT-116 marcadas con CTV, y suspensiones de células simples de muestras de CRC derivadas de pacientes crioconservadas, a densidades crecientes en las cámaras inferiores en RPMI completo y se incubaron durante la noche a 37 °C.

Para los ensayos de pérdida de función de CXCR3, las células DOT se trataron con el antagonista de CXCR3 AMG487 (1 µM, MedChem Express) durante la incubación nocturna o se preincubaron con un anticuerpo monoclonal anti-CXCR3 humano (20 µg/ml, clon 49801, R&D Systems) durante 15 minutos a 4 °C, inmediatamente antes del ensayo de migración. Para establecer un gradiente quimiotáctico, se sembraron 8 × 10⁵ células tumorales en las cámaras inferiores y se incubaron durante la noche para permitir la secreción de ligandos. Se utilizó CXCL10 humano recombinante (10 ηg/ml; BioLegend) como control positivo. Como enfoque complementario, se estimularon las células SW620 con rIFNγ (10 ηg/ml) y se cultivaron durante 3 días a 37 °C y 5% de CO2 para generar sobrenadantes enriquecidos en quimiocinas. Estos sobrenadantes se colocaron luego en las cámaras inferiores de las placas Transwell, solos o en combinación con anticuerpos neutralizantes contra CXCL9 humano (20 µg/ml, clon 49106, R&D Systems), CXCL10 (20 µg/ml, clon 33036, R&D Systems) o CXCL11 (20 µg/ml, clon 87328, R&D Systems) durante 1 hora a 37 °C antes de iniciar el ensayo de migración. Para los experimentos de ganancia de función, se suplementaron las células tumorales cultivadas en los pocillos inferiores con ABBV-CLS-484 (AC484; 10 µM; MedChemExpress) junto con rIFNγ y se incubaron durante la noche a 37 °C.

Se utilizaron suspensiones de células simples de muestras de CRC derivadas de pacientes frescas como quimioatrayentes. Después del procesamiento, se aislaron las células CD45− de la muestra inicial mediante separación MACS (Miltenyi Biotec) y se sembraron en las cámaras inferiores en RPMI completo. Las células se cultivaron en presencia o ausencia de AC484 (10 µM; MedChemExpress) y IFNγ (100 ηg/ml), y se incubaron durante la noche a 37 °C.

En todos los experimentos, las células DOT cargadas en las cámaras superiores de la Transwell se incubaron durante 6 horas a 37 °C. Luego, se recolectaron las células DOT migradas de las cámaras inferiores, se cuantificaron y se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos contra marcadores de superficie. El índice de quimiotaxis se calculó como la relación entre el número de células DOT que migraron en cada condición y el número que migró en los pocillos de control sin células tumorales.

Análisis multiplex de quimiocinas

Las células SW620 y HCT-116 (4 × 10⁶ células/ml) se cultivaron durante 3 días en presencia o ausencia de rIFNγ (10 ηg/ml). Se recolectaron los sobrenadantes del cultivo, se congelaron rápidamente para su conservación y se analizaron los niveles de quimiocinas utilizando el ensayo de descubrimiento de 96 plex de citoquinas/quimiocinas humanas (HD96, Eve Technologies Corporation). Este análisis se realizó utilizando la tecnología Luminex xMAP, una plataforma multiplexada basada en cuentas que emplea cuentas codificadas por colores internamente conjugadas con anticuerpos de captura específicos. Este sistema permite la detección y cuantificación simultánea de noventa y seis citoquinas, quimiocinas y factores de crecimiento humanos.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se extrajo el ARN total con el kit de aislamiento de ARN High Pure (Roche) y se transcribió a ADNc (Promega). Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) en un sistema ViiA 7 Real-Time PCR (Applied Biosystems) utilizando reactivos SYBR Green (Thermo Fisher Scientific). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla suplementaria en línea 1. Los niveles de ARN mensajero (ARNm) se determinaron utilizando el método 2−ΔΔCT y se normalizaron a la expresión del gen de referencia β-actina.

ELISA

Se recolectaron y almacenaron a -80 °C hasta su uso los sobrenadantes de las células SW620 y HCT-116 cultivadas durante 3 días a 37 °C, con o sin rIFNγ (100 ηg/ml). En paralelo, también se recolectaron y almacenaron en las mismas condiciones los sobrenadantes de los ensayos de migración realizados con células CD45− aisladas de muestras de CRC frescas. Los niveles de CXCL10 se cuantificaron utilizando el kit de desarrollo ELISA estándar de CXCL10 humano (PeproTech), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Procesamiento de órganos para los análisis in vivo de las células DOT

Los animales se sacrificaron mediante narcosis con CO2 4 semanas después de la inoculación del tumor, y se recolectaron tumores, sangre y bazo. Los tumores se cortaron en trozos pequeños y se procesaron en 1 ml de IMDM (Gibco) suplementado con 20% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de anfotericina B (Gibco) y 0,1% de 50 mg/ml de gentamicina (Gibco), a partir de ahora denominado IMDM completo. Para garantizar la digestión enzimática, se añadieron 0,05 mg/ml de colagenasa IV (Roche) y 1 mg/ml de DNasa I (Roche) a los tubos de Eppendorf con células tumorales. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 37 °C con agitación a 900 rpm. Las suspensiones celulares resultantes se filtraron a través de un filtro de células de 70 µm utilizando un émbolo de jeringa, luego se lavaron y se resuspendieron en IMDM completo para su posterior análisis por citometría de flujo. Simultáneamente, se machacó el bazo y se filtró a través de un filtro de células de 70 µm. Las suspensiones de células simples de sangre y bazo se trataron con tampón de lisis de glóbulos rojos (BioLegend), se lavaron y se resuspendieron en PBS para el posterior tinción por citometría de flujo.

Citometría de flujo

Las suspensiones de células simples se incubaron en PBS con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos contra marcadores de superficie y colorantes de viabilidad durante 20 minutos a 4 °C en la oscuridad. Para evitar la unión inespecífica, se incluyeron anticuerpos anti-CD16/CD32 (Invitrogen, 14-0161-86) y/o anti-receptor Fc humano (Invitrogen, 14-9161-73) durante la tinción de superficie. Después de la incubación, se lavaron las muestras y se resuspendieron en PBS.

Para la evaluación de marcadores intracelulares, las células se preestimularon con 0,5% de Brefeldin A (Merck) y 0,1% de Monensin (Invitrogen) durante 3 horas a 37 °C para inhibir la secreción de citoquinas. Luego, se realizó la tinción de superficie como se describió anteriormente, seguida de la fijación y permeabilización utilizando el kit de tinción de Foxp3 (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se fijaron durante 30 minutos a 4 °C, se lavaron con tampón de permeabilización y luego se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos dirigidos a moléculas intracelulares durante 1 hora a 4 °C. Finalmente, se lavaron las células y se resuspendieron en PBS para la adquisición por citometría de flujo.

La adquisición por citometría de flujo se realizó en BD FACSymphony A5 SE (BD Biosciences) o Cytek Aurora (Cytek Biosciences). Los datos se analizaron con el software FlowJo (Tree Star).

Todos los anticuerpos y colorantes utilizados para la citometría de flujo se enumeran en la tabla suplementaria en línea 2.

Expresión génica de TCGA

Se recuperaron datos de expresión génica del Cancer Genome Atlas (TCGA) para las cohortes de adenocarcinoma de colon y adenocarcinoma de recto. Los valores de expresión se normalizaron como fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas (FPKM) para permitir la comparación entre conjuntos de datos.

Análisis estadístico

La normalidad de los datos se evaluó utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. Para los datos distribuidos normalmente, las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando una prueba t de Student no pareada o una prueba t pareada para muestras emparejadas. Las comparaciones que involucran más de dos grupos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de un factor seguido de una prueba de comparación múltiple de Dunnett o Tukey. La prueba de Dunnett se utilizó cuando se comparaban varios grupos con un solo control, mientras que la prueba de Tukey se aplicó para las comparaciones entre todos los grupos. Para los datos que no se distribuyen normalmente, se utilizó la prueba de Mann-Whitney U para las comparaciones entre dos grupos, y la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunn se utilizó para las comparaciones entre varios grupos. Cuando se analizaron dos variables independientes, se aplicó un ANOVA de dos vías seguido de una prueba post hoc de comparación múltiple de Šidák. El coeficiente de correlación de rango de Spearman se utilizó para evaluar las asociaciones entre variables continuas. Todos los análisis de datos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism V.8 y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas para valores de p