Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga mitigan in vitro el desgaste del músculo esquelético inducido por células de carcinoma colorrectal a través de una vía dependiente de la 15-LOX.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más diagnosticado y el segundo cáncer más mortal en todo el mundo (^[1]). Hasta el 50% de los pacientes con cáncer colorrectal corren el riesgo de desarrollar caquexia cancerosa, un síndrome complejo y multifactorial que se caracteriza por un deterioro funcional progresivo resultante de la pérdida de masa y fuerza muscular esquelética (^[2], ^[3]). La pérdida de masa muscular esquelética afecta negativamente la calidad de vida, la tasa de supervivencia y la tolerancia a los tratamientos contra el cáncer en pacientes con CCR (^[4]–^[6]). A pesar de la investigación activa sobre estrategias anticacécticas, los tratamientos terapéuticos para prevenir y tratar la caquexia del CCR son actualmente limitados (^[4]). En consecuencia, existe una necesidad urgente de desarrollar terapias contra el cáncer que inhiban el crecimiento tumoral y, al mismo tiempo, preserven la masa muscular para mejorar los resultados clínicos en los supervivientes de cáncer.

El desgaste muscular inducido por el CCR podría estar impulsado por múltiples mecanismos, como la inflamación elevada, un desequilibrio entre la señalización catabólica y anabólica y la disfunción mitocondrial (^[7]). Entre estos, la elevación crónica de las citocinas proinflamatorias circulantes, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) y la interleucina-6 (IL-6), es una de las características clínicas más observadas de la caquexia cancerosa (^[8]). Los tratamientos antiinflamatorios, como los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y los antagonistas de citocinas seleccionados, se han propuesto desde hace tiempo como posibles terapias para la caquexia cancerosa (^[9], ^[10]). Sin embargo, los fármacos antiinflamatorios, como los corticosteroides, son catabólicos e inmunosupresores y, por lo tanto, pueden ejercer potencialmente efectos negativos sobre los músculos esqueléticos a largo plazo (^[11]). Además, la compleja interacción entre las células tumorales, los músculos esqueléticos y el sistema inmunitario del huésped en el síndrome de caquexia podría limitar la eficacia de una única terapia antiinflamatoria (^[12]).

Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga omega-3 (n-3) (LC-PUFA) son lípidos dietéticos naturales con propiedades antiinflamatorias bien conocidas (^[13]). Investigaciones previas han demostrado que la pérdida de masa muscular esquelética inducida por el cáncer se asoció con un nivel circulante más bajo de PUFA n-3 (^[14], ^[15]). Además, la suplementación dietética con aceites de pescado ricos en PUFA n-3 puede reducir los marcadores inflamatorios circulantes, como la IL-6, en pacientes con cáncer (^[16], ^[17]). Los estudios preclínicos también han demostrado que la suplementación con aceite de pescado puede proteger contra el desgaste muscular relacionado con el cáncer en modelos de roedores con tumores (^[18]). De manera similar, los ensayos humanos aleatorizados, doble ciego y controlados con placebo en pacientes con cáncer han informado de efectos prometedores de la suplementación dietética con aceite de pescado en el mantenimiento del peso corporal (^[19]–^[21]). Sin embargo, otros ensayos clínicos sugirieron que la suplementación con aceite de pescado puede no ser capaz de limitar el desgaste muscular inducido por el cáncer (^[22]–^[24]). En particular, la evidencia específica de la caquexia relacionada con el CCR ha sido limitada.

La mayoría de los estudios previos sobre la caquexia cancerosa han evaluado suplementos de aceite de pescado que contienen una mezcla compleja de PUFA n-3, incluidos el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-3) y el ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3), entre muchos otros, con una variabilidad considerable en la dosis y la pureza de los PUFA (^[19], ^[23]). Las diferencias en la composición lipídica, la estructura molecular de los PUFA y la dosis podrían contribuir potencialmente a los resultados inconsistentes observados en los diferentes estudios. Varios estudios han informado de que la administración de EPA puro exhibe efectos anticacécticos en ratones con tumores al inhibir la lipólisis, estimular la síntesis de proteínas y reprimir la degradación de proteínas (^[25]–^[27]). Si bien algunos estudios anteriores informaron que no hay beneficios de la suplementación con DHA o ácido alfa linolénico (ALA, 18:2n-3) en la atenuación de la caquexia cancerosa (^[28]–^[30]), se ha informado más recientemente que el DHA puro protege contra la pérdida de peso corporal inducida por la quimioterapia en ratas con tumores (^[31]). Otros lípidos bioactivos, como el PUFA n-3 intermedio ácido docosapentaenoico (DPA, 22:5n-3) y el principal PUFA n-6 ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6), también han demostrado que pueden beneficiar la salud muscular en un entorno no canceroso. Por ejemplo, previamente demostramos que la suplementación de células musculares cultivadas con varios PUFA LC individuales, incluidos ARA, EPA, DPA y DHA, puede promover individualmente la hipertrofia de las células musculares C2C12 (^[32]). Además, los metabolitos derivados del ARA, incluido el prostaglandina F2α (PGF2α), pueden estimular la síntesis de proteínas y promover la hipertrofia muscular (^[33]). De manera consistente, muchos estudios han demostrado que el bloqueo de la biosíntesis de prostaglandinas mediante la inhibición farmacológica de la vía de la ciclooxigenasa (COX) puede perjudicar la miogénesis (^[34]). Sin embargo, hasta la fecha, no se han realizado estudios que hayan comparado los posibles efectos de varios PUFA n-3 y n-6 individuales sobre la caquexia del CCR.

Un posible mecanismo que puede explicar los efectos anticacécticos de los PUFA LC es la producción posterior de mediadores lipídicos proresolutivos especializados (SPM). Los SPM son mediadores lipídicos bioactivos que pueden derivarse tanto de los PUFA n-3 como de los n-6 a través de la acción de tres enzimas biosintéticas principales, que incluyen la ciclooxigenasa (COX), la lipoxigenasa (LOX) y la epoxigenasa (CYP) (^[35]). Recientemente se ha demostrado que los SPM suprimen la inflamación inducida por el cáncer y promueven la inmunidad antitumoral a través de diversos mecanismos (^[36]). Por ejemplo, la resolvina D1 (RvD1) y la resolvina D2 (RvD2), que se derivan del DHA n-3 a través de la vía 15-LOX/5-LOX, pueden suprimir la secreción de citocinas proinflamatorias inducidas por el tumor y estimular la fagocitosis de macrófagos (^[37]). La resolvina E1 (RvE1), derivada del EPA n-3 a través de la acción coordinada de la vía CYP/5-LOX, puede reducir los neutrófilos y macrófagos asociados al tumor (^[38]). En particular, la lipoxina A4 (LXA4), derivada del ARA n-6 por la vía 15-LOX/5-LOX y/o la vía 5-LOX/12-LOX, puede promover la inmunidad antitumoral al inhibir las células B reguladoras en modelos animales de cáncer colorrectal (^[39]). Además, el tratamiento con LXA4 en una etapa posterior del cáncer puede aumentar los neutrófilos periféricos al tiempo que suprime los linfocitos (^[40]). La evidencia emergente indica que los SPM modulan la inflamación y la regeneración del músculo esquelético después de una lesión aguda (^[41]). Además, la creciente evidencia sugiere que los SPM, incluidos LXA4, RvD1, RvD2, PD1 y RvE1, pueden suprimir la inflamación muscular y aliviar el desgaste muscular en afecciones como la distrofia muscular de Duchenne (^[42]–^[45]). Sin embargo, el posible papel de los SPM en el desgaste muscular asociado al CCR aún está por determinar.

En el estudio actual, examinamos los posibles efectos de la suplementación con varios PUFA n-3 y n-6 LC individuales sobre el desgaste muscular inducido por el CCR. Además, buscamos determinar el papel de las diferentes vías biosintéticas de mediadores lipídicos en la mediación de los efectos de los PUFA LC sobre la caquexia del CCR. Utilizando modelos in vitro, examinamos la influencia directa de los PUFA n-3 y n-6 sobre el desgaste de los miotubos C2C12 inducido por factores secretados por el tumor. De manera interesante, demostramos que los PUFA LC individuales, incluidos ARA, EPA, DPA y DHA, atenuaron la atrofia de los miotubos C2C12 inducida por el CCR. Además, los beneficios de cada uno de estos PUFA LC dependen completamente de la actividad de la 15-LOX, una enzima fundamental que cataliza la biosíntesis de SPM. Para caracterizar la posible capacidad de la comunicación entre las células tumorales y musculares para producir SPM, se analizaron muestras de medios acondicionados derivadas de cocultivos de cáncer y músculo que recibieron suplementación con PUFA LC mediante el perfilado metabololipidómico basado en LC-MS/MS. Los cocultivos de células tumorales y musculares caquécticos que recibieron suplementación con PUFA LC producen muchos metabolitos lipídicos, incluidos los SPM bioactivos. Además, la administración directa de SPM maduros producidos por ARA, EPA, DPA y DHA ejerce efectos protectores diferenciales sobre el desgaste muscular inducido por el CCR. En resumen, nuestros resultados podrían contribuir a una mejor comprensión de cómo los diferentes tipos de PUFA LC dietéticos pueden influir en la caquexia cancerosa, así como en sus posibles mecanismos. En última instancia, esto podría guiar las pautas de suplementación dietética y nutricional personalizadas en los supervivientes de cáncer.

MÉTODOS

Cultivo celular:

La línea celular de músculo esquelético murino C2C12 (ATCC, CRL-1772) y la línea celular de carcinoma colorrectal CT26 (ATCC, CRL-2638) se cultivaron por separado en medios de crecimiento (GM) que consisten en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco, 11995–065) que contiene un 10% de suero fetal bovino (SFB, Corning, 35–010-CV) y antibióticos (penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 μg/mL, Gibco, 15140–122) a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Para inducir la formación de miotubos, los mioblastos C2C12 se cultivaron en medios de diferenciación (DM) que consisten en DMEM que contiene un 2% de suero de caballo (SH, Gibco 26050088) y antibióticos durante 72 horas antes de los tratamientos experimentales.

Tratamiento con PUFA LC y SPM:

Los PUFA LC individuales, incluidos ARA (20:4n-6) (Cayman Chemical, 90010), EPA (20:5n-3) (Cayman Chemical, 90110), DPA (22:5n-3) (Cayman Chemical, 90165) y DHA (22:6n-3) (Cayman Chemical, 90310), se dividieron en alícuotas y se almacenaron a −80 °C bajo gas nitrógeno hasta su uso. Los viales de un solo uso de PUFA LC se descongelaron sobre hielo y se prepararon en medios de diferenciación C2C12. En todos los experimentos que involucran tratamientos con PUFA, la concentración final de ARA, EPA, DPA o DHA fue de 25 μM, y el 0,05% de etanol en medios de diferenciación se utilizó como el control del vehículo correspondiente. Los SPM maduros individuales, incluidos LXA4 (Cayman Chemical, 90410), RvE1 (Cayman Chemical, 10007848), RvD1 (Cayman Chemical, 10012554), RvD5 (Cayman Chemical, 10007280), protectina D1 (PD1) (Cayman Chemical, 10010390), maresina 1 (MaR1) (Cayman Chemical, 10878) y resolvina D2 n-3 derivada de DPA (RvD2n-3 DPA) (Cayman Chemical, 34482), se almacenaron a −80 °C bajo gas nitrógeno hasta su uso. Los SPM se prepararon en medios de diferenciación C2C12 y se administraron a una dosis de 100 nM, con un 0,28% de etanol en medios de diferenciación utilizado como el control del vehículo apropiado.

Desgaste muscular inducido por TNFα:

Las células C2C12 subconfluentes se sembraron en una placa de 12 pocillos en GM a una densidad celular de 2,5 × 104/cm2 y se les permitió proliferar y crecer en medios de crecimiento durante 3 días. Luego, el GM se reemplazó por DM para inducir la diferenciación de C2C12 durante 72 horas. Para imitar la influencia de las citocinas proinflamatorias derivadas del cáncer, el TNFα recombinante de ratón (Cayman Chemical, 32069) se agregó a los miotubos C2C12 maduros en el día 3 posterior a la diferenciación a una dosis de 100 ng/mL. Después del cambio de medios, los PUFA o SPM individuales se añadieron a los pocillos según lo descrito anteriormente durante otras 72 horas antes de la fijación y la inmunocitoquímica.

Medios acondicionados de CT26:

Para obtener medios acondicionados de células de carcinoma colorrectal (CM), las células CT26 se sembraron a 2,67 × 104/cm2 en un matraz de T75 en DMEM sin suero que contiene antibióticos. Después de 48 horas, los medios de cultivo de las células CT26 se recogieron y se centrifugaron a 500 × g para eliminar los restos celulares, y el sobrenadante se almacenó a −20 °C hasta su uso. El día del tratamiento, los medios de CT26 se descongelaron una vez y se mezclaron con DMEM que contiene un 4% de SH a una dilución de 1:1 para alcanzar un 50% final de medios de CT26 con un 2% de SH (CM de CT26). Para inducir el desgaste muscular, los mioblastos C2C12 se diferenciaron en DM durante 72 horas según lo descrito anteriormente, y los miotubos C2C12 maduros recibieron medios frescos de CT26. Luego, los PUFA o SPM individuales se añadieron a los miotubos C2C12 según lo descrito anteriormente durante otras 72 horas antes de la fijación y la inmunocitoquímica.

Cocultivo de músculo y cáncer:

Se sembraron mioblastos C2C12 en una placa base de cocultivo de 24 pocillos (Corning, 353504) en medio de crecimiento a una densidad celular de 2,5 × 104/cm2 y se les permitió proliferar y alcanzar la confluencia durante 72 horas. Luego, el medio de crecimiento se reemplazó por DM para inducir la diferenciación miogénica. El mismo día, las células CT26 se sembraron en los compartimentos superiores de los insertos de placas de cocultivo (Corning, 353095) a una densidad celular de 1,67 × 105/cm2. En paralelo, se sembraron 1,67 × 105/cm2 de células C2C12 en los insertos como control de células no cancerosas para el experimento de cocultivo. 72 horas después de que comenzara la diferenciación de C2C12, los insertos de cocultivo superiores se trasladaron a los compartimentos inferiores de las placas base. Se añadió DM fresco para reemplazar el medio de cultivo tanto en las placas base como en los insertos de cocultivo después de que los compartimentos se juntaran. Los LC-PUFAs individuales, incluidos ARA, EPA, DPA y DHA, se añadieron tanto a los compartimentos inferiores como a los insertos a una concentración de 25 μM, como se describe anteriormente. Después de 72 horas, se recogieron muestras de medio de cultivo acondicionado de los compartimentos inferiores para el análisis LC-MS/MS y los miotubos C2C12 se fijaron y se tiñeron para su visualización, como se describe a continuación.

Inhibidores de LOX:

Para examinar el papel de los metabolitos derivados de LOX en la mediación de los efectos de los LC-PUFAs sobre la atrofia muscular inducida por CT26, se preparó el inhibidor pan-LOX de venta comercial, el ácido nordihidroguaiaretico (NDGA) (Cayman Chemicals, 70300) o el inhibidor específico de 15-LOX, BLX3887 (Cayman Chemicals, 27391), en CM de CT26 para alcanzar una concentración final de 50 μM y 10 μM, respectivamente. Los mioblastos C2C12, que alcanzaron la confluencia, se diferenciaron durante 72 horas, después de lo cual el medio de diferenciación se reemplazó por CM de CT26 con o sin NDGA o BLX-2887. Luego, los PUFAs individuales, incluidos ARA, EPA, DHA y DPA, se añadieron a los pocillos para alcanzar una concentración final de 25 μM. Después de 72 horas de incubación en presencia de los tratamientos experimentales, los miotubos C2C12 se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA) en preparación para el análisis de inmunocitoquímica.

Inmunocitoquímica y análisis de imágenes:

Para visualizar la morfología celular después de la exposición a factores cancerosos, los miotubos C2C12 se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA, Electron Microscopy Sciences, 15710) durante 30 minutos a 4 °C y luego se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células C2C12 se bloquearon en 1% de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma-Aldrich A3294–50G) durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios contra la miosina sarcomérica (MF20c, DSHB, 1:100) y la miogenina (F5Dc, DSHB, 1:100) preparados en el tampón de bloqueo a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, las células C2C12 se lavaron en PBS y luego se incubaron con anticuerpos secundarios, incluidos el Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 (Invitrogen A-21124, Thermo Fisher Scientific, 1:500) y el Goat Anti-Mouse IgG2b Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A-21242, 1:500). Se utilizó DAPI (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific D21490, 2 μg/mL) para la contratinción de los núcleos celulares. Luego, los miotubos C2C12 se visualizaron con el microscopio fluorescente (Echo Revolution) que funciona en configuración invertida. Nueve imágenes se capturaron automáticamente utilizando un objetivo Plan Fluorite de 10× desde las mismas posiciones predeterminadas en cada pocillo de cultivo para evitar el sesgo del investigador. Para evaluar los diámetros de los miotubos, se eligieron las diez células positivas para la miosina más grandes de cada imagen y se midió la distancia de su punto uniforme más ancho perpendicular a la longitud de la célula utilizando la herramienta de selección de línea recta en Image J/FIJI. Cada rama de los miotubos ramificados se midió como un miotubo individual, y la región donde las ramas convergen se excluyó del análisis.

Extracción de ARN y RT-qPCR:

Para los experimentos con CM de CT26, se indujo la diferenciación de los mioblastos C2C12, que alcanzaron la confluencia, durante 48 h, y las células C2C12 se pretrataron con una dosis de 25 μM de PUFAs individuales, incluidos ARA, EPA, DPA y DHA, durante otras 24 horas. Luego, el DM se reemplazó por CM de CT26, y se añadió una dosis de 25 μM de PUFAs individuales, incluidos ARA, EPA, DPA y DHA, al CM durante 3 horas. Para los experimentos con SPM, se indujo la diferenciación de los mioblastos C2C12, que alcanzaron la confluencia, durante 72 h, y luego los miotubos recibieron DM fresco que contenía 100 ng/mL de TNFα. 30 minutos después, los miotubos C2C12 se trataron con 100 nM de SPM individuales, incluidos RvD1, RvD5, RvE1, RvD2n-3 DPA, LXA4, MaR1 y PD1, durante 3 horas. El ARN se extrajo utilizando el reactivo TRIzol y el aislamiento con cloroformo/isopropanol. El rendimiento de ARN se determinó utilizando un espectrofotómetro UV/Vis NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies, E112352). Se eliminó cualquier ADN genómico contaminante mediante Ambion™ DNase I (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, AM2222). Se realizó la transcripción inversa de ARN (2 μg) a ADNc utilizando el kit High-Capacity RNA-to-cDNA (Thermo Fisher Scientific 4387406). Se realizó RT-qPCR en reacciones de 10 μL de PowerUp SYBR™ Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, A25742) con 1 μM de cebador directo y 1 μM de cebador inverso (Tabla 1) en un instrumento de PCR en tiempo real QuantStudio™ 5 de 384 pocillos (Thermo Fisher Scientific, A28135) con muestras cargadas en duplicado. Se calculó el cambio de expresión relativa de ARNm utilizando el método 2−ΔΔCT, con la beta-2-microglobulina (B2m) utilizada como control endógeno.

Perfilado metabololipidómico basado en LC-MS/MS de medios de cultivo acondicionado:

Se recogieron muestras de medios de cultivo celular acondicionado (500 μL) de los compartimentos inferiores del modelo de cocultivo músculo-cáncer, como se describe anteriormente, y se centrifugaron a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Luego, se recogieron los sobrenadantes del medio y se almacenaron a −80 °C hasta el análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Antes de la extracción en fase sólida (SPE), se añadieron 1 ng de cada uno de 15(S)-HETE-d8, 14(15)-EpETrE-d11, Resolvina D2-d5, Leucotrieno B4-d4 y Prostaglandina E1-d4 como estándares internos (en 150 μL de metanol) para la recuperación y la cuantificación, y se mezclaron a fondo. Luego, las muestras se extrajeron para los metabolitos de ácidos grasos poliinsaturados utilizando columnas de extracción C18, como se describió anteriormente (^[46]). Brevemente, las muestras con estándares internos añadidos se aplicaron a cartuchos C18 acondicionados, se lavaron con 15% de metanol en agua seguido de hexano y luego se secaron al vacío. Los cartuchos se eluyeron con 2 volúmenes de 0,5 mL de metanol con 0,1% de ácido fórmico. El eluido se secó bajo una suave corriente de nitrógeno. El residuo se redisolvió en 50 μL de metanol-acetato de amonio acuoso 25 mM (1:1) y se sometió a análisis de LC-MS/MS.

Se realizó HPLC utilizando un sistema UPHLC ExionLC-40 (Sciex) con una columna Luna C18 (3 μm, 2,1 × 150 mm). La fase móvil consistió en un gradiente entre A: metanol-agua-acetonitrilo (10:85:5 v/v) y B: metanol-agua-acetonitrilo (90:5:5 v/v), ambos que contienen 0,1% de acetato de amonio. El programa de gradiente con respecto a la composición de B fue el siguiente: 0-1 min, 50%; 1-8 min, 50%-80%; 8-15 min, 80%-95%; y 15-17 min, 95%. La velocidad de flujo fue de 0,2 mL/min. El eluido de HPLC se introdujo directamente en la fuente ESI del analizador de masas QTRAP7500 (SCIEX) en el modo de iones negativos con las siguientes condiciones: gas de cortina y GS1: 40 psi, y GS2: 70 psi, Temperatura: 500 °C, Voltaje de pulverización de iones: -2500 V, Gas de colisión: l2 psi, Potencial de desclúster: -60 V y Potencial de entrada: -7 V. El eluido se monitorizó mediante el método de monitorización de reacciones múltiples (MRM) para detectar combinaciones únicas de iones moleculares-iones hija para cada uno de los 125 transiciones (para monitorizar un total de 156 mediadores lipídicos). El MRM se programó para monitorizar cada transición durante 120 s alrededor del tiempo de retención establecido para cada mediador lipídico. Se utilizaron energías de colisión optimizadas (18-35 eV) y potenciales de salida de la celda de colisión (7-10 V) para cada transición MRM. Se registraron los espectros de masas para cada mediador lipídico detectado utilizando la función de ion producto mejorado (EPI) para verificar la identidad del pico detectado además de la coincidencia de la transición MRM y el tiempo de retención con el estándar. Los datos se recopilaron y los cromatogramas de transición MRM se cuantificaron utilizando el software Sciex OS 3.4. Se utilizaron picos integrados con una relación señal/ruido >3 para la cuantificación. Las señales del estándar interno en cada cromatograma se utilizaron para la normalización para la recuperación, así como para la cuantificación relativa de cada analito. Todos los mediadores lipídicos cuantificados se identificaron positivamente comparando los tiempos de retención de HPLC con estándares auténticos y combinaciones específicas de iones padre-hija, así como los espectros de masas obtenidos del método de adquisición dependiente de la información (IDA). Se muestra en la Tabla S1A una lista completa de los analitos con los tiempos de retención esperados, las transiciones MRM y el mapeo MRM-estándar interno utilizado para la cuantificación.

Análisis para lipidómica:

Los analitos se clasificaron como No Detectados (ND) en cada grupo experimental si sus relaciones señal/ruido (S/N) de pico eran 3 para la cuantificación. Las señales del estándar interno en cada cromatograma se utilizaron para la normalización de la recuperación y la cuantificación relativa de cada analito. Todos los mediadores lipídicos cuantificados se identificaron positivamente comparando los tiempos de retención de HPLC con los estándares auténticos y las combinaciones específicas de iones padre-hija, así como los espectros de masas obtenidos mediante el método de adquisición de información dependiente (IDA). Se muestra una lista completa de los analitos con los tiempos de retención esperados, las transiciones MRM y el mapeo MRM-estándar interno utilizado para la cuantificación en la Tabla S1A.

Análisis para la lipidómica:

Se clasificaron los analitos como No Detectados (ND) en cada grupo experimental si sus relaciones señal/ruido de los picos eran 50%) (Figura 3A y B). La suplementación con varios tratamientos de LC-PUFA individuales, incluidos ARA, EPA, DPA y DHA, aumentó significativamente el diámetro de los miotubos caquecticos, aunque claramente no a un nivel similar al observado en los miotubos sanos (Figura 3A y B).

Para comprender mejor los posibles mecanismos subyacentes responsables de los efectos protectores de los LC-PUFA en la caquexia del cáncer, utilizamos LC-MS/MS para analizar el perfil metabololipidómico de las muestras de medio de cultivo condicionado obtenidas de los cocultivos C2C12-CT26. Se muestra una lista completa de los analitos monitoreados, aquellos que se detectaron frente a los que estaban por debajo de los límites de detección del ensayo, y su concentración promedio en los diferentes grupos experimentales en la Tabla S1A. Las relaciones señal-ruido (S/N) correspondientes para cada analito detectado se muestran en la Tabla S1B. Se muestra una lista completa de las comparaciones por pares entre los grupos experimentales, incluido el cambio de pliegue, los valores p brutos y los valores p corregidos de Benjamini-Hochberg FDR en la Tabla S2. En ausencia de la suplementación con LC-PUFA, la producción de 21 mediadores lipídicos fue diferente (p bruta