La terapia celular adoptiva (ACT) que utiliza células T con receptores de células T modificados (TCR-T) es una estrategia prometedora para el tratamiento de tumores sólidos. Un factor que influye en la eficacia de la ACT es el tipo de células T utilizadas, siendo las células T que presentan fenotipos más jóvenes, menos diferenciados o residentes en los tejidos, las que se asocian con una mayor actividad antitumoral. Nuestro objetivo fue desarrollar un protocolo rápido a escala clínica para generar células TCR-T más jóvenes y potentes para la terapia. Las células PBMC derivadas del paciente se estimularon, se enriquecieron con CD8+ y se transfectaron retroviralmente para expresar TCR dirigidos a KRAS G12D, y se expandieron durante 10 días en presencia de una nueva combinación de citocinas (CKT) que contenía IL-2, IL-7, IL-15 y TGF-β.
Se evaluó el impacto de la CKT en el fenotipo, la función efectora y la actividad antitumoral in vitro, y se comparó con las células TCR-T fabricadas con IL-2. Este proceso se adaptó posteriormente para la fabricación a escala clínica. Las células TCR-T generadas con CKT mostraron una mayor frecuencia de células T de memoria temprana (Tn/scm) y células T similares a las residentes en los tejidos (Trm), con una expresión reducida de KLRG1 en comparación con las células TCR-T fabricadas con IL-2. Las células TCR-T fabricadas con CKT demostraron una mayor regulación de 4-1BB, producción de IFN-γ, TNF y granzima B (GZMB), y una mayor capacidad de eliminación de líneas celulares de cáncer de páncreas y cáncer colorrectal en cocultivos de tumores en 2D y 3D.
Las ejecuciones de ingeniería a escala clínica produjeron 3,30 y 6,15 x 109 células en total, que mostraron atributos fenotípicos y funcionales similares a los observados en los estudios a pequeña escala. Nuestro nuevo protocolo de fabricación de células TCR-T de 10 días que utiliza IL-2, IL-7, IL-15 y TGF-β genera células TCR-T caracterizadas por marcadores distintos de memoria y residencia tisular, como CCR7, CD103 y CD49a, y funciones efectoras potentes con el potencial de mejorar la eficacia de la terapia celular adoptiva.
La terapia con células T modificadas con receptores de células T (TCR-T) es un tipo de terapia celular adoptiva en la que las células T periféricas autólogas de un paciente se modifican genéticamente para expresar un TCR que se dirige a un antígeno expresado por el tumor del paciente. Se ha observado una prometedora actividad clínica en tumores sólidos con la terapia TCR-T dirigida a antígenos tumorales como NY-ESO-1 ([1]–[7]), MAGE-A3 ([8], [9]), MAGE-A4 ([10], [11]), PRAME ([12]), HPV16-E6 ([13]) y E7 ([14]), TP53 R175H ([15]), KRAS G12D ([16]), así como mutaciones personalizadas ([17]). Aproximadamente el 40% de los pacientes con sarcoma sinovial experimentaron una respuesta clínica después de la terapia TCR-T dirigida a MAGE-A4 ([10]), lo que llevó a la aprobación por parte de la FDA de la primera terapia TCR-T (afamitresgene autoleucel) en 2024 para esta indicación. Sin embargo, a pesar de la prometedora actividad clínica, actualmente no existen informes publicados sobre respuestas completas duraderas mediadas por la terapia TCR-T en pacientes con cánceres sólidos metastásicos fuera del melanoma. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de mejorar la eficacia de la terapia TCR-T para los cánceres epiteliales metastásicos.
Diferentes subconjuntos de células T tienen diferentes capacidades para eliminar tumores. Una gran cantidad de datos en modelos de tumores de ratón han demostrado que la transferencia adoptiva de células T CD8+ menos diferenciadas, como las células T de memoria de células madre (Tscm) y las células T de memoria central (Tcm), es más eficaz para mediar la regresión tumoral que las células T efectoras (Teff) y las células T efectoras terminalmente diferenciadas (Tte) (revisado en ([18])). Los datos correlativos en la terapia con linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) adoptivos en humanos ([19]) y la terapia con células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) ([20]–[24]) también han implicado un papel de las células T menos diferenciadas en la mediación de las respuestas antitumorales. Además de las Tscm y las Tcm, otros subconjuntos de células T pueden ser deseables para su uso en la terapia celular adoptiva (ACT). Por ejemplo, las células T de memoria residentes tisulares (Trm) se asocian con resultados favorables y respuestas clínicas a la inmunoterapia en una variedad de cánceres humanos (revisado en ([25]) y ([26])). Si bien existen estudios limitados sobre el uso de Trm para ACT, la transferencia de células CAR-T similares a Trm fue superior a las células CAR-T convencionales en modelos de xenoinjerto de tumores sólidos y líquidos ([27]), y la transferencia de células T que se asemejan a Trm a través de la deleción de Vhl o la sobreexpresión del factor de transcripción Runx3 condujo a un mejor control de los tumores de ratón sinérgicos ([28], [29]). Clínicamente, previamente informamos sobre un paciente con adenocarcinoma ductal pancreático metastásico (PDAC) que logró una respuesta clínica después de la infusión de células TCR-T dirigidas a KRAS G12D; estas células se inclinaron hacia un fenotipo similar a Trm mediante la fabricación en presencia de TGF-β ([16]).
Una característica única de la ACT es la capacidad de manipular las condiciones de cultivo celular para generar células T con fenotipos y atributos funcionales deseados. De hecho, las citocinas como IL-7, IL-15 y IL-21 pueden promover la generación de células T humanas Tscm y/o Tcm ([30]–[34]), mientras que TGF-β se ha utilizado para generar células T humanas similares a Trm ([16], [27]). Aquí, desarrollamos un protocolo de fabricación de células TCR-T de 10 días que utiliza la novedosa combinación de citocinas IL-2, IL-7, IL-15 y TGF-β y biorreactores G-Rex. Descubrimos que los productos TCR-T fabricados con este cóctel de citocinas (CKT) estaban enriquecidos en células Tscm, Tcm y similares a Trm en comparación con las células fabricadas con IL-2 solo. Además, las células TCR-T fabricadas con CKT exhibieron una capacidad citotóxica superior y una producción de citocinas efectoras contra líneas celulares tumorales en comparación con las cultivadas con IL-2 solo. Las ejecuciones de ingeniería en nuestras instalaciones de sala limpia utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes produjeron de 3,3 a 6,1 × 109 células CD8 enriquecidas con una eficiencia de transducción de TCR promedio del 85%. Por lo tanto, este nuevo proceso de fabricación puede generar números clínicamente relevantes de células TCR-T con atributos deseables para ACT.
Materiales y métodos
Muestras de pacientes
Los productos de leucaféresis se obtuvieron de pacientes a través de un protocolo de adquisición de tejidos aprobado por un IRB (número de IRB 2018000418). Las PBMC se aislaron de los productos de leucaféresis utilizando métodos estándar de gradiente de densidad de Ficoll-Paque y las PBMC se crioconservaron en CryoStor10 (BioLife Solutions). Las PBMC utilizadas en este estudio se derivaron de dos pacientes con cáncer colorrectal (CRC), CRI-5268 y CRI-5126 (ambos con genotipo HLA-C*08:02), y dos pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), CRI-5178 y CRI-2890 (genotipo HLA-A*11:01 y HLA-C*08:02, respectivamente).
Líneas celulares
Las líneas celulares endógenas KRAS G12D positivas, incluidas las líneas celulares de adenocarcinoma pancreático HPAC y HPAFII, así como las líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal LS513 y LS180, se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Estas líneas celulares se transducieron retroviralmente para expresar de forma estable HLA-C*08:02 y proteína verde fluorescente (GFP), o HLA-A*11:01 y GFP, con los genes HLA y GFP separados por una secuencia peptídica de auto-escisión 2A. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio de Dulbecco modificado Eagle (DMEM, Gibco) suplementado con alta glucosa, GlutaMax, 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco) y 1% de penicilina/estreptomicina.
TCR y vectores retrovirales
Los tres TCR reactivos a KRAS G12D utilizados en este estudio se han caracterizado previamente ([16], [35], [36]). Se utilizaron dos TCR restringidos a HLA-C*08:02: el TCR C08-9mer que reconoce el péptido de 9 aminoácidos GADGVGKSA, y el TCR C08-10mer que reconoce el péptido de 10 aminoácidos GADGVGKSAL. El tercer TCR, A11-10mer TCR, está restringido a HLA-A*11:01 y reconoce el péptido de 10 aminoácidos VVVGADGVGK. Cada TCR contiene las regiones constantes de TCRα y TCRβ del ratón, lo que promueve el emparejamiento del TCR introducido y permite la identificación de las células T transducidas con TCR mediante un anticuerpo contra la región constante de TCRβ del ratón. El vector gammaretroviral para cada TCR se produjo bajo GMP por la Unidad de Producción de Vectores en el Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. Los vectores retrovirales (RV) pasaron las pruebas de seguridad, incluidos los ensayos basados en células para virus adventicios y retrovirus competentes para la replicación, así como pruebas de micoplasma, esterilidad y endotoxinas. Las pruebas de virus adventicios y retrovirus competentes para la replicación en el RV se realizaron en el National Gene Vector Biorepository de la Universidad de Indiana, que cuenta con financiación del contrato 75N92019D00018 del National Heart Lung and Blood Institute.
Transducción y expansión de células TCR-T, a pequeña escala
Las PBMC se descongelaron y 48 × 106 células se estimularon con 50 ng/mL de anti-CD3 (clon OKT3, Miltenyi Biotec) en medio TCR-CKT2–5 completo, que comprendía medio AIM-V CTS (Gibco), 5% de suero humano AB (GeminiBio) con las citocinas apropiadas, 300 UI/mL de IL-2 (R&D Systems, grado GMP), 30 ng/mL de IL-7 (R&D Systems, grado GMP), 20 ng/mL de IL-15 (R&D Systems, grado GMP) y 5 ng/mL de TGF-β (Biolegend, grado GMP). Las PBMC se sembraron en un matraz T-75 (48 mL/matraz, 1 × 106/mL) y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante dos días. Una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos no tratada se recubrió con 10 µg/mL de RetroNectin (2 mL/pocillo, Takara Bio) un día antes de la transducción y se almacenó durante la noche a 4 °C. Después de dos días, las células estimuladas se cosecharon y las células T CD8+ se enriquecieron mediante el agotamiento de CD4+ utilizando MicroBeads CliniMACS CD4 a tres veces la cantidad de cuentas recomendada y columnas LS (Miltenyi Biotec). Las placas de RetroNectin se cargaron con 4 mL de vector retroviral (dilución optimizada para lograr
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