Evaluación de la mesotelina como un blanco inmunoterapéutico para las células T endógenas.

La mesotelina (MSLN) es una glicoproteína de superficie celular expresada por las células mesoteliales que recubren la pleura, el peritoneo y el pericardio. Inicialmente sintetizada como una proteína precursora de 69 kDa, la MSLN se escinde postraduccionalmente, lo que da como resultado un fragmento C-terminal unido a la membrana de 40 kDa y un fragmento N-terminal secretado de 31 kDa [también conocido como el factor potenciador de megacariocitos (hMPF)] (^[1]–^[5]). En los humanos, el papel fisiológico de la MSLN aún no está claro, pero los ratones con mutaciones nulas homocigóticas no presentan defectos anatómicos, de desarrollo o reproductivos detectables (^[6]). Sin embargo, la MSLN está sobreexpresada en muchos tumores, incluidos el mesotelioma, el cáncer de páncreas, el cáncer de ovario, el cáncer de colon, el cáncer de útero, el cáncer de cuello uterino y el cáncer de mama triple negativo (TNBC) (^[7]–^[13]), y en el entorno maligno se han publicado informes que destacan un posible papel en la adhesión, la supervivencia, la proliferación, la progresión tumoral y la resistencia a la quimioterapia de las células cancerosas (^[8], ^[9], ^[14]–^[21]).

Dado que la MSLN está sobreexpresada en la superficie de muchos tumores y tiene una expresión mínima en los tejidos normales, se ha investigado ampliamente como un objetivo para terapias basadas en anticuerpos, incluidos los inmunotoxinas recombinantes y los anticuerpos monoclonales (^[5], ^[22]–^[25]), así como las células T con receptores quiméricos de antígenos (CAR) (^[26]–^[32]). En el presente estudio, sin embargo, buscamos explorar la MSLN como un objetivo para las células T a través del receptor de células T nativo, que reconoce el antígeno que se procesa y se presenta mediante las moléculas del antígeno leucocitario humano (HLA). Consideramos que este enfoque produciría un beneficio terapéutico potente y duradero y sería inmune al impacto del escisión del antígeno de la superficie de las células tumorales.

Ahora examinamos la inmunogenicidad de la MSLN en las células T endógenas aisladas de individuos con diversos antecedentes de HLA e investigamos el perfil efector y el potencial inmunoterapéutico de las células CD8+ y CD4+ específicas del antígeno. Aquí presentamos los resultados sobre la inmunodominancia, las características fenotípicas y la actividad funcional de las células reactivas, y mapeamos los nuevos péptidos epítopos de células T CD4+ y CD8+ inmunogénicos, un subconjunto de los cuales también están restringidos por HLA. También confirmamos que estas células pueden expandirse a partir de la sangre periférica de los pacientes. Finalmente, investigamos la capacidad de las células reactivas para mediar efectos antitumorales potentes en modelos 2D y 3D de cánceres que expresan MSLN.

Materiales y métodos

Donantes y líneas celulares

Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) [obtenidas de voluntarios adultos sanos y pacientes con consentimiento informado utilizando protocolos aprobados por la junta de revisión institucional del Baylor College of Medicine (H-45017, H-47389 y H-40378)] para generar células dendríticas (DC), células T específicas de MSLN (MSLN-ST) y blastos de fitohemaglutinina (PHA). Los donantes se seleccionaron en función de (i) la tipificación de HLA y (ii) la disponibilidad para la extracción de sangre. No se tuvieron en cuenta consideraciones de sexo/género para la selección de donantes. Los blastos de PHA se generaron a partir de PBMC (0,5 × 106/ml) utilizando 5 µg/ml de PHA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se cultivaron en medio para células T [45% de medio RPMI 1640 (HyClone Laboratories, Logan, Utah), 45% de medio Click’s (Irvine Scientific, Santa Ana, California), 2 mM de GlutaMAX TM-I (Life Technologies, Grand Island, New York) y 10% de suero humano AB (Valley Biomedical, Winchester, Virginia)] suplementado con 100 U/ml de interleucina 2 [IL2; Proleukin® (aldesleucina), Yardley, PA], que se reponía cada 2 días. Se adquirió un panel de líneas celulares cancerosas humanas, que incluía cáncer de páncreas (CFPAC-1, CAPAN-1), carcinoma de cuello uterino (MS751), adenocarcinoma de colon (SK-CO-1), cáncer de mama (Hs578T, HCC1806), adenocarcinoma uterino (KLE), cáncer de ovario (OVCAR3), cáncer de próstata (LNCaP) y mesotelioma (NCI-H2052, NCI-H2452, NCI-H28) de la Colección de Cultivos Celulares Americanos (ATCC, Manassas, VA). Las células CFPAC-1 y CAPAN-1 se cultivaron en IMDM (Gibco, Waltham, MA); MS751 y SK-CO-1 en EMEM (ATCC); Hs578T y KLE en DMEM (HyClone Laboratories), con KLE suplementado adicionalmente con Ham’s F-12 (Gibco); y OVCAR3, HCC1806, LNCaP, NCI-H2052, NCI-H2452 y NCI-H28 en RPMI-1640. Todos los medios se suplementaron con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2.

Péptidos/mezclas de péptidos de MSLN

Para la estimulación específica del antígeno, utilizamos mezclas de péptidos (mezclas de péptidos) (péptidos de 15 aminoácidos que se superponen en 11 aminoácidos) que abarcan la MSLN, que se adquirieron de Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX) y LifeTein, LLC (Somerset, NJ). Para el mapeo de epítopos, los péptidos se agruparon en 25 minipools, cada uno de los cuales contenía de 12 a 13 péptidos de 15 aminoácidos, organizados de tal manera que cada péptido estuviera presente de forma única en dos minipools. Para identificar los epítopos mínimos, generamos una serie de péptidos más cortos que van desde 14 hasta 9 aminoácidos de longitud, que abarcan las secuencias inmunogénicas de la MSLN y cubren todos los posibles epítopos peptídicos. Los péptidos liofilizados se reconstituieron a 10 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich).

Generación de MSLN-ST

Generación de DC

Se utilizaron DC autólogas como células presentadoras de antígeno (APC) y se generaron aislando monocitos de las PBMC mediante la selección de CD14 utilizando cuentas MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, GmbH). Posteriormente, las células se cultivaron en medio para DC (CellGenix, Friburgo, GmbH) con 800 U/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Sargramostim Leukine; Immunex, Seattle, WA) y 400 U/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante 5 días. La IL-4 y el GM-CSF se reponían en el día 3 y, en el día 5, las DC se maduraban en medio para DC suplementado con 10 ng/ml de IL-1β (R&D Systems), 10 ng/ml de factor de necrosis tumoral (TNF)-α (R&D Systems), 1 µg/ml de prostaglandina E2 (Sigma-Aldrich), 10 ng/ml de IL6 (R&D Systems), 800 U/ml de GM-CSF y 400 U/ml de IL-4.

Generación de células T MSLN

En el día 6 o 7 del cultivo, las DC maduras se incubaron durante 30 a 45 minutos a 37 °C con 200 ng de la mezcla de péptidos de MSLN. Las PBMC CD14 negativas se utilizaron como células respondedoras y se estimularon con DC pulsadas con la mezcla de péptidos de MSLN a una relación estimulador:respondedor (S:R) de 1:10. Las células se cultivaron a 1 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 (10 ng/ml), IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (5 ng/ml) y IL-6 (10 ng/ml) (R&D Systems). En el día 9 o 10, las MSLN-ST se cosecharon, se contaron utilizando la exclusión de azul de tripan para distinguir las células vivas y muertas, se resuspendieron a 0,5 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 e IL-15 y, a continuación, se reestimularon con DC pulsadas con la mezcla de péptidos de MSLN a una relación S:R de 1:10. Entre 3 y 4 días después de la reestimulación, los cultivos se alimentaron con medio fresco para células T suplementado con IL-15. A partir de entonces, los cultivos se estimularon semanalmente con DC pulsadas con la mezcla de péptidos a una relación S:R de 1:10 y se alimentaron con medio fresco para células T suplementado con IL-15.

Para la expansión de células T específicas de MSLN a partir de pacientes, las PBMC se expusieron directamente a 200 ng de la mezcla de péptidos de MSLN y se cultivaron durante 7 a 10 días a 1 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (5 ng/ml).

Inmunofenotipado

Las MSLN-ST se tiñeron en superficie con anticuerpos monoclonales contra CD25 (RRID: AB400334), CD28 (RRID: AB400368), CD69 (RRID: AB400054), CD45RO (RRID: AB400511), CD279 (PD-1) (RRID: AB2159176), CCR7 (CD197) (RRID: AB10561679) [Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ], CD3 (RRID: AB2876783), CD4 (cat# A96417), CD8 (cat# A82791), CD16 (cat# IM1238U), CD56 (RRID: AB131195), CD62L (cat# IM2713U) (Beckman Coulter, Brea, CA), CD366 (TIM-3) (RRID: AB2561717) y CD223 (LAG3) (RRID: AB2629755) (BioLegend, San Diego, CA). Se añadieron un total de 2 × 105 células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich), seguido de la adición de anticuerpos en cantidades saturantes (5 µl) e incubación durante 15 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron, se resuspendieron en 300 µl de PBS y se adquirieron al menos 30 000 células vivas en un citómetro de flujo Gallios™ (Beckman Coulter). Para detectar la expresión de MSLN en las líneas celulares cancerosas, se lavaron dos veces 2 × 105 células y se tiñeron con 2 µl de un anticuerpo monoclonal, anti-humano, recombinante MSLN (RRID: AB_2733680) (Miltenyi Biotec), diluido 1:50 en PBS que contenía 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich). Después de 10 minutos de incubación a 4 °C en la oscuridad, las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en 200 µl de PBS que contenía 0,5% de BSA y se adquirieron aproximadamente 30 000 células vivas utilizando un citómetro de flujo CytoFLEX (Beckman Coulter). Los datos de la citometría de flujo se analizaron utilizando el software Kaluza® versión 2.1 (Beckman Coulter).

Estudios funcionales

Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISpot)

El análisis ELISpot se utilizó para cuantificar la frecuencia de células secretoras de IFNγ o granzima B (GrB). Brevemente, las MSLN-ST se resuspendieron a 1-2 × 106 células/ml en medio para células T y se añadieron 100 µl de células a cada pocillo ELISpot. La actividad específica del antígeno se midió después de la estimulación directa con los péptidos estimulantes. Después de 16 a 18 horas de incubación, las placas se desarrollaron según las instrucciones del fabricante (Mabtech, Inc., Cincinnati, OH), se secaron durante la noche a temperatura ambiente y, a continuación, se cuantificaron utilizando el lector IRIS ELISpot/FluoroSpot (Mabtech, Inc.). La amplitud de la actividad de las MSLN-ST se evaluó mediante ELISpot de IFNγ utilizando los 25 minipools, cada uno de los cuales contenía de 12 a 13 péptidos, que representaban toda la secuencia de MSLN. Las MSLN-ST se estimularon con cada uno de los minipools para identificar los péptidos de 15 aminoácidos que contenían epítopos peptídicos inmunogénicos. A continuación, se realizaron estudios de mapeo fino utilizando un panel de péptidos más cortos que van desde 14 hasta 9 aminoácidos de longitud, que abarcan la secuencia de los péptidos estimulantes de 15 aminoácidos. Para los estudios de bloqueo de HLA, las MSLN-ST se preincubaron con 10 µl del anticuerpo de clase I del MHC (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) o 10 µl de anticuerpos DR, DQ, DP (Biolegend) durante 30 minutos a 37 °C, antes de añadirse a la placa ELISpot.

FluoroSpot

Para la cuantificación de células polifuncionales que secretan simultáneamente IFNγ, GrB y/o TNFα, se utilizó un ensayo FluoroSpot comercial (Human IFNγ/Granzyme B/TNFα FluoroSpot Plus, Mabtech, Inc.). Brevemente, las MSLN-ST se resuspendieron a 0,5 a 2 × 106 células/ml en medio para células T y se añadieron 100 µl de células a cada pocillo FluoroSpot. La actividad específica del antígeno se midió después de la estimulación directa con los péptidos estimulantes. Después de un mínimo de 18 horas de incubación, las placas se desarrollaron según las instrucciones del fabricante y, a continuación, se visualizaron y cuantificaron utilizando el lector IRIS ELISpot/FluoroSpot.

Tinción intracelular de citocinas

Las MSLN-ST se cosecharon, se resuspendieron en medio para células T (2 × 106/ml) y se añadieron 200 µl por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano. Las células se incubaron durante la noche con 200 ng de péptidos de prueba o de control junto con brefeldina A (1 µg/ml), monensina (1 µg/ml), CD28 y CD49d (1 µg/ml) (BD). A continuación, las MSLN-ST se lavaron con PBS, se centrifugaron, se tiñeron en superficie con CD8 (cat# IM2469U; Beckman Coulter) y CD3 (RRID: AB400286) (BD) (5 µl/anticuerpo/tubo) durante 15 minutos a 4 °C, se lavaron, se centrifugaron, se fijaron y se permeabilizaron con solución Cytofix/Cytoperm (BD) durante 20 minutos a 4 °C en la oscuridad. Después de lavar con tampón Perm/Wash (BD), las células se incubaron con 10 µl de anticuerpos IFNγ (RRID: AB400425) y TNFα (RRID: AB_400435) (BD) durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. A continuación, las células se lavaron dos veces con tampón Perm/Wash y se adquirieron al menos 50 000 células vivas en un citómetro de flujo Gallios™ y se analizaron con el software de análisis de flujo Kaluza®.

Ensayo de liberación de cromo

SPANISH TRANSLATION:

Medimos la actividad citotóxica en ensayos de liberación de 51Cr de 5 a 8 horas, utilizando relaciones E:T de 40:1, 20:1, 10:1 y 5:1. Se utilizaron células T específicas para MSLN como efectoras y los objetivos fueron células PHA solas, células PHA estimuladas con pepmix de MSLN o líneas celulares cancerosas que expresaban MSLN de forma endógena (CFPAC-1, Capan-1, MS751, SK-CO-1, NCI-H2452). Para identificar la restricción del HLA, utilizamos células PHA estimuladas con péptidos autólogas y parcialmente compatibles con el HLA como objetivos. El porcentaje de lisis específica se calculó de la siguiente manera: [(liberación experimental – liberación espontánea)/(liberación máxima – liberación espontánea)] x 100. Para los estudios de bloqueo del HLA, los objetivos marcados con 51Cr se pre-incubaron con 10 µl de los anticuerpos de clase I o clase II del MHC durante 30 minutos a 37 °C, antes de añadir las células T efectoras.

Ensayo de citotoxicidad basado en la fluorescencia utilizando esferoides 3D

Los esferoides se generaron sembrando 2000 células MS751 o CFPAC-1 GFP/FFluc+/pozo en placas de fondo plano de 96 pocillos (Corning, NY) que se pre-recubrieron con 45 µL de 1% (p/v) de agarosa/pozo (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Tras la formación de los esferoides (24 horas), se añadieron células MSLN-ST o células T de control [(células T específicas para el virus sincitial respiratorio (RSV-ST)] a las células tumorales a las relaciones E:T indicadas. Se monitorizó la intensidad integrada total de objetos verdes (expresada como GCU × µm²/imagen) utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte S3 (Sartorius, Gottingen, GmbH) durante un período de co-cultivo de 24 horas. La cuantificación se realizó tras el análisis de sustracción de fondo Top-Hat.

Inmunohistoquímica

Para evaluar el perfil de expresión de MSLN en las muestras de tumores pancreáticos primarios, se colocó una matriz de tejidos (IMGENEX Corporation, San Diego, CA) en un horno a 60 °C durante 60 minutos, se desparafinizó con tres cambios de xileno durante 5 minutos cada uno y, a continuación, se rehidrató mediante una serie de alcoholes graduados con un enjuague final en agua destilada. Los peróxidos endógenos se eliminaron sumergiendo las secciones en 3% de peróxido de hidrógeno en metanol durante 10 minutos. Tras el lavado con agua destilada, las láminas se colocaron en una vaporizadora durante 20 minutos (alta presión) en solución de recuperación de antígenos (Dako Corporation, Carpinteria, CA). A continuación, se dejaron enfriar las láminas durante 20 minutos en la misma solución, se enjuagaron con tres cambios de agua destilada y se colocaron en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 pH 7,4 (ScyTek Laboratories, Inc., West Logan, UT) durante 5 minutos. Se utilizó el sistema de detección de polímeros no biotinados PolyVue HRP/DAB (Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA) en los protocolos de inmunotinción. Las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se especifique lo contrario, y en cada paso las secciones se recubrieron con 2 o 3 gotas de reactivo. Se utilizó solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (pH 7,4) para enjuagar las secciones entre cada paso. Se utilizó la solución Background Sniper (Biocare Medical, Concord, CA) para bloquear la tinción inespecífica durante 20 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo monoclonal anti-MSLN de ratón (Rockland Immunochemicals, Inc. Antibodies & Assays, Gilbertsville, PA) se diluyó (1:200) utilizando la solución Renaissance Background Reducing Diluent (Biocare Medical). Las láminas se incubaron con 100 µl de la solución de anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las láminas se incubaron en el anticuerpo secundario universal proporcionado con el kit. Posteriormente, se aplicó DAB Plus estable durante 1-2 minutos como cromógeno y las láminas se enjuagaron en agua destilada, se contrateñieron manualmente con hematoxilina (Biocare Medical) durante 10 segundos y, a continuación, se enjuagaron en agua destilada. A continuación, se aplicaron cubiertas a cada lámina, utilizando vidrio sintético y medio de montaje Permount. Se incluyeron controles negativos y positivos (negativo; LNCaP, positivo; OVCAR-3) en cada procedimiento de inmunotinción.

Análisis estadístico

Los datos de citotoxicidad pareados se analizaron utilizando la prueba de rango de Wilcoxon con signo para tener en cuenta la no normalidad, la distribución sesgada de los datos y la variabilidad del donante. Se consideró que un valor de P < 0,05 era estadísticamente significativo y el análisis se realizó utilizando la versión 9.4 de SAS. Todos los demás análisis estadísticos se realizaron utilizando Microsoft Excel versión 16 (Microsoft, Redmond, WA). Se calcularon estadísticas descriptivas para analizar las características de las células MSLN-ST y se resumieron los datos utilizando la media, la desviación estándar o el error estándar de la media (para describir el promedio y la dispersión de conjuntos de datos pequeños con una distribución de datos simétrica, por ejemplo, réplicas técnicas) o las medianas y el rango intercuartílico (RIC) (para resumir conjuntos de datos que consisten en datos sesgados o inusualmente distribuidos con valores atípicos). No se realizaron ajustes para la normalidad.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos generados durante el estudio se mantienen en formato electrónico en una base de datos alojada por el Centro de Terapia Celular y Genética del Baylor College of Medicine. Todos los datos utilizados en el análisis de los resultados del presente estudio se incluyen en el artículo y en la información complementaria. Todos los demás datos (brutos o analizados) están disponibles a petición razonable del autor correspondiente (A.M.L.).

Donantes y líneas celulares

Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) [obtenidas de voluntarios adultos sanos y de pacientes con consentimiento informado utilizando protocolos aprobados por la junta de revisión institucional del Baylor College of Medicine (H-45017, H-47389 y H-40378)] para generar células dendríticas (DC), células T específicas para MSLN (MSLN-ST) y células PHA. Los donantes se seleccionaron en función de (i) la tipificación del HLA y (ii) la disponibilidad para la extracción de sangre. No se tuvieron en cuenta consideraciones sobre el sexo/género para la selección de donantes. Las células PHA se generaron a partir de PBMC (0,5 × 106/ml) utilizando 5 µg/ml de PHA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se cultivaron en medio para células T [45% de RPMI 1640 (HyClone Laboratories, Logan, Utah), 45% de medio Click (Irvine Scientific, Santa Ana, California), 2 mM de GlutaMAX TM-I (Life Technologies, Grand Island, New York) y 10% de suero humano AB (Valley Biomedical, Winchester, Virginia)] suplementado con 100 U/ml de interleucina 2 [IL2; Proleukin® (aldesleucina), Yardley, PA], que se reponía cada 2 días. Se utilizó un panel de líneas celulares cancerosas humanas, que incluía cáncer de páncreas (CFPAC-1, CAPAN-1), carcinoma cervical (MS751), adenocarcinoma de colon (SK-CO-1), cáncer de mama (Hs578T, HCC1806), adenocarcinoma uterino (KLE), cáncer de ovario (OVCAR3), cáncer de próstata (LNCaP) y mesotelioma (NCI-H2052, NCI-H2452, NCI-H28), que se adquirieron en el American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células CFPAC-1 y CAPAN-1 se cultivaron en IMDM (Gibco, Waltham, MA); MS751 y SK-CO-1 en EMEM (ATCC); Hs578T y KLE en DMEM (HyClone Laboratories), con KLE además suplementado con Ham’s F-12 (Gibco); y OVCAR3, HCC1806, LNCaP, NCI-H2052, NCI-H2452 y NCI-H28 en RPMI-1640. Todos los medios se suplementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2.

Péptidos/pepmixes de MSLN

Para la estimulación específica de antígenos, utilizamos mezclas de péptidos (pepmixes) (péptidos de 15 aminoácidos que se superponen en 11 aminoácidos) que abarcan MSLN, que se adquirieron en Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX) y LifeTein, LLC (Somerset, NJ). Para el mapeo de epítopos, los péptidos se agruparon en 25 mini-grupos, cada uno de los cuales contenía 12 o 13 péptidos de 15 aminoácidos, organizados de tal manera que cada péptido estuviera presente de forma única en dos mini-grupos. Para identificar los epítopos mínimos, generamos una serie de péptidos más cortos que abarcan de 14 a 9 aminoácidos de longitud, que abarcan las secuencias inmunogénicas de MSLN y cubren todos los posibles epítopos peptídicos. Los péptidos liofilizados se reconstituyeron a 10 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO (Sigma-Aldrich).

Generación de MSLN-ST

Generación de DC

Se utilizaron DC autólogas como células presentadoras de antígenos (APC) y se generaron aislando monocitos de PBMC mediante la selección de CD14 utilizando cuentas MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, GmbH). Posteriormente, las células se cultivaron en medio para DC (CellGenix, Freiburg, GmbH) con 800 U/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Sargramostim Leukine; Immunex, Seattle, WA) y 400 U/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante 5 días. La IL-4 y el GM-CSF se reponían en el día 3 y, en el día 5, las DC se maduraron en medio para DC suplementado con 10 ng/ml de IL-1β (R&D Systems), 10 ng/ml de factor de necrosis tumoral (TNF)-α (R&D Systems), 1 µg/ml de prostaglandina E2 (Sigma-Aldrich), 10 ng/ml de IL6 (R&D Systems), 800 U/ml de GM-CSF y 400 U/ml de IL-4.

Generación de células T MSLN

En el día 6 o 7 del cultivo, las DC maduras se estimularon durante 30-45 minutos a 37 °C con 200 ng de pepmix de MSLN. Las PBMC CD14-negativas se utilizaron como células respondedoras y se estimularon con DC estimuladas con pepmix de MSLN en una relación estimulador:respondedor (S:R) de 1:10. Las células se cultivaron a 1 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 (10 ng/ml), IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (5 ng/ml) e IL-6 (10 ng/ml) (R&D Systems). En el día 9 o 10, las MSLN-ST se cosecharon, se contaron utilizando la exclusión de azul de tripan para distinguir las células vivas y muertas, se resuspendieron a 0,5 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 e IL-15 y, a continuación, se reestimularon con DC estimuladas con pepmix de MSLN en una relación S:R de 1:10. Entre 3 y 4 días después de la reestimulación, los cultivos se alimentaron con medio fresco para células T suplementado con IL-15. A partir de entonces, los cultivos se estimularon semanalmente con DC estimuladas con pepmix en una relación S:R de 1:10 y se alimentaron con medio fresco para células T suplementado con IL-15.

Para la expansión de células T específicas para MSLN de pacientes, las PBMC se expusieron directamente a 200 ng de pepmix de MSLN y se cultivaron durante 7-10 días a 1 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (5 ng/ml).

Generación de DC

Se utilizaron DC autólogas como células presentadoras de antígenos (APC) y se generaron aislando monocitos de PBMC mediante la selección de CD14 utilizando cuentas MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, GmbH). Posteriormente, las células se cultivaron en medio para DC (CellGenix, Freiburg, GmbH) con 800 U/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Sargramostim Leukine; Immunex, Seattle, WA) y 400 U/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante 5 días. La IL-4 y el GM-CSF se reponían en el día 3 y, en el día 5, las DC se maduraron en medio para DC suplementado con 10 ng/ml de IL-1β (R&D Systems), 10 ng/ml de factor de necrosis tumoral (TNF)-α (R&D Systems), 1 µg/ml de prostaglandina E2 (Sigma-Aldrich), 10 ng/ml de IL6 (R&D Systems), 800 U/ml de GM-CSF y 400 U/ml de IL-4.

Generación de células T MSLN

En el día 6 o 7 del cultivo, las DC maduras se estimularon durante 30-45 minutos a 37 °C con 200 ng de pepmix de MSLN. Las PBMC CD14-negativas se utilizaron como células respondedoras y se estimularon con DC estimuladas con pepmix de MSLN en una relación estimulador:respondedor (S:R) de 1:10. Las células se cultivaron a 1 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 (10 ng/ml), IL-12 (10 ng/ml), IL-15 (5 ng/ml) e IL-6 (10 ng/ml) (R&D Systems). En el día 9 o 10, las MSLN-ST se cosecharon, se contaron utilizando la exclusión de azul de tripan para distinguir las células vivas y muertas, se resuspendieron a 0,5 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 e IL-15 y, a continuación, se reestimularon con DC estimuladas con pepmix de MSLN en una relación S:R de 1:10. Entre 3 y 4 días después de la reestimulación, los cultivos se alimentaron con medio fresco para células T suplementado con IL-15. A partir de entonces, los cultivos se estimularon semanalmente con DC estimuladas con pepmix en una relación S:R de 1:10 y se alimentaron con medio fresco para células T suplementado con IL-15.

Para la expansión de células T específicas para MSLN de pacientes, las PBMC se expusieron directamente a 200 ng de pepmix de MSLN y se cultivaron durante 7-10 días a 1 × 106/ml en medio para células T suplementado con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (5 ng/ml).

Inmunofenotipado

Las células MSLN-ST se tiñeron en superficie con anticuerpos monoclonales contra CD25 (RRID: AB400334), CD28 (RRID: AB400368), CD69 (RRID: AB400054), CD45RO (RRID: AB400511), CD279 (PD-1) (RRID: AB2159176), CCR7 (CD197) (RRID: AB10561679) [Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ], CD3 (RRID: AB2876783), CD4 (núm. de catálogo A96417), CD8 (núm. de catálogo A82791), CD16 (núm. de catálogo IM1238U), CD56 (RRID: AB131195), CD62L (núm. de catálogo IM2713U) (Beckman Coulter, Brea, CA), CD366 (TIM-3) (RRID: AB2561717) y CD223 (LAG3) (RRID: AB2629755) (BioLegend, San Diego, CA). Se recogieron un total de 2 × 105 células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich), y a continuación se añadieron los anticuerpos en cantidades saturantes (5 µl) y se incubó durante 15 minutos a 4 °C. A continuación, se lavaron las células, se resuspenden en 300 µl de PBS y se adquirieron al menos 30 000 células viables en un citómetro de flujo Gallios™ (Beckman Coulter). Para detectar la expresión de MSLN en líneas celulares cancerosas, se lavaron dos veces 2 × 105 células y se tiñeron con 2 µl de un anticuerpo monoclonal, anti-humano, recombinante contra MSLN (RRID: AB_2733680) (Miltenyi Biotec), diluido 1:50 en PBS que contiene 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich). Después de 10 minutos de incubación a 4 °C en la oscuridad, se lavaron las células dos veces, se resuspendieron en 200 µl de PBS que contiene 0,5% de BSA y se adquirieron aproximadamente 30 000 células viables utilizando un citómetro de flujo CytoFLEX (Beckman Coulter). Los datos de la citometría de flujo se analizaron utilizando el software Kaluza® versión 2.1 (Beckman Coulter).

Estudios funcionales

Ensayo de inmunoensayo con enlace a enzimas

El análisis ELISpot se utilizó para cuantificar la frecuencia de células secretoras de IFNγ o Granzima B (GrB). Brevemente, las células MSLN-ST se resuspendieron a una concentración de 1–2 × 106 células/ml en medio para células T, y se añadieron 100 µl de células a cada pocillo ELISpot. La actividad específica del antígeno se midió después de la estimulación directa con los péptidos estimulantes. Después de 16–18 horas de incubación, las placas se procesaron según las instrucciones del fabricante (Mabtech, Inc., Cincinnati, OH), se secaron durante la noche a temperatura ambiente y, a continuación, se cuantificaron utilizando el lector IRIS ELISpot/FluoroSpot (Mabtech, Inc.). La amplitud de la actividad de las células MSLN-ST se evaluó mediante ELISpot de IFNγ utilizando los 25 grupos de minipéptidos, cada uno de los cuales contiene 12 o 13 péptidos, que representan toda la secuencia de MSLN. Las células MSLN-ST se estimularon con cada uno de los grupos de minipéptidos para identificar péptidos de 15 aminoácidos que contienen epítopos peptídicos inmunogénicos. Posteriormente, se realizaron estudios de mapeo fino utilizando un panel de 14–9 péptidos que abarcan la secuencia de los péptidos estimulantes de 15 aminoácidos. Para los estudios de bloqueo de HLA, las células MSLN-ST se preincubaron con 10 µl del anticuerpo de la clase I del MHC (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) o 10 µl de anticuerpos DR (Leinco Technologies, Fenton, MO), DQ, DP (Biolegend) durante 30 minutos a 37 °C, antes de añadirlas a la placa ELISpot.

FluoroSpot

Para la cuantificación de células polifuncionales que secretan simultáneamente IFNγ, GrB y/o TNFα, se utilizó un ensayo comercial FluoroSpot (Human IFNγ/Granzyme B/TNFα FluoroSpot Plus, Mabtech, Inc.). Brevemente, las células MSLN-ST se resuspendieron a una concentración de 0,5 a 2 × 106 células/ml en medio para células T y se añadieron 100 µl de células a cada pocillo FluoroSpot. La actividad específica del antígeno se midió después de la estimulación directa con los péptidos estimulantes. Después de un mínimo de 18 horas de incubación, las placas se procesaron según las instrucciones del fabricante y, a continuación, se visualizaron y cuantificaron utilizando el lector IRIS ELISpot/FluoroSpot.

Tinción intracelular de citocinas

Las células MSLN-ST se recogieron, se resuspendieron en medio para células T (2 × 106/ml) y se añadieron 200 µl por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U. Las células se incubaron durante la noche con 200 ng de péptidos de prueba o de control junto con Brefeldin A (1 µg/ml), monensina (1 µg/ml), CD28 y CD49d (1 µg/ml) (BD). A continuación, las células MSLN-ST se lavaron con PBS, se recogieron, se tiñeron en superficie con CD8 (núm. de catálogo IM2469U; Beckman Coulter) y CD3 (RRID: AB400286) (BD) (5 µl/anticuerpo/tubo) durante 15 minutos a 4 °C, y luego se lavaron, se recogieron, se fijaron y se permeabilizaron con la solución Cytofix/Cytoperm (BD) durante 20 minutos a 4 °C en la oscuridad. Después de lavar con el tampón Perm/Wash (BD), las células se incubaron con 10 µl de anticuerpos contra IFNγ (RRID: AB400425) y TNFα (RRID: AB_400435) (BD) durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. A continuación, se lavaron las células dos veces con el tampón Perm/Wash y se adquirieron al menos 50 000 células viables en un citómetro de flujo Gallios™ y se analizaron con el software de análisis de flujo Kaluza®.

Ensayo de liberación de cromo

Medimos la actividad citotóxica en ensayos de liberación de 51Cr de 5 a 8 horas, utilizando relaciones efector:objetivo (E:O) de 40:1, 20:1, 10:1 y 5:1. Las células T específicas de MSLN se utilizaron como efectoras y los objetivos fueron linfoblastos PHA solos, linfoblastos PHA pulsados con pepmix de MSLN o líneas celulares cancerosas que expresan MSLN de forma endógena (CFPAC-1, Capan-1, MS751, SK-CO-1, NCI-H2452). Para identificar la restricción de HLA, utilizamos linfoblastos PHA pulsados con péptidos autólogos y parcialmente compatibles con HLA como objetivos. El porcentaje de lisis específica se calculó de la siguiente manera: [(liberación experimental – liberación espontánea)/(liberación máxima – liberación espontánea)] × 100. Para los estudios de bloqueo de HLA, los objetivos marcados con 51Cr se preincubaron con 10 µl de los anticuerpos de la clase I o de la clase II del MHC durante 30 minutos a 37 °C, antes de añadir las células T efectoras.

Ensayo de citotoxicidad basado en la fluorescencia utilizando esferoides 3D

Los esferoides se generaron sembrando 2000 células MS751 o CFPAC-1 GFP/FFluc+ por pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos (Corning, NY) que se pre-recubrieron con 45 µl de 1% (p/v) de agarosa por pocillo (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Tras la formación de los esferoides (24 horas), se añadieron células MSLN-ST parcialmente compatibles con HLA o células T de control [(células T específicas del virus respiratorio sincitial (RSV-ST)] a las células tumorales a las relaciones E:O indicadas. La intensidad total integrada del objeto verde (expresada como GCU × µm²/imagen) se monitorizó utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte S3 (Sartorius, Gottingen, GmbH) durante un período de co-cultivo de 24 horas. La cuantificación se realizó tras el análisis de sustracción de fondo Top-Hat.

Inmunohistoquímica

Para evaluar el perfil de expresión de MSLN en muestras primarias de tumores pancreáticos, se colocó un microarreglo de tejidos (IMGENEX Corporation, San Diego, CA) en un horno a 60 °C durante 60 minutos, se desparafinizó con tres cambios de xileno durante 5 minutos cada uno y luego se rehidrató a través de una serie de alcoholes graduados, con un enjuague final en agua destilada. Los peróxidos endógenos se inactivaron sumergiendo las secciones en un 3% de peróxido de hidrógeno metílico durante 10 minutos. Después de lavar con agua destilada, las láminas se colocaron en una vaporera durante 20 minutos (alta presión) en solución de recuperación de antígenos (Dako Corporation, Carpinteria, CA). Luego, se dejó que las láminas se enfriaran durante 20 minutos en la misma solución, se enjuagaron en tres cambios de agua destilada y se colocaron en solución salina tamponada con Tris y Tween 20 a pH 7,4 (ScyTek Laboratories, Inc., West Logan, UT) durante 5 minutos. Se utilizó el sistema de detección de polímeros no biotinilados PolyVue HRP/DAB (Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA) en los protocolos de inmunotinción. Las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se especifique lo contrario, y en cada paso las secciones se cubrieron con 2 o 3 gotas de reactivo. Se utilizó solución salina tamponada con Tris y Tween 20 (pH 7,4) para enjuagar las secciones entre cada paso. Se utilizó la solución Background Sniper (Biocare Medical, Concord, CA) para bloquear la tinción no específica durante 20 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo monoclonal anti-MSLN de ratón (Rockland Immunochemicals, Inc. Antibodies & Assays, Gilbertsville, PA) se diluyó (1:200) utilizando la solución Renaissance Background Reducing Diluent (Biocare Medical). Las láminas se incubaron con 100 µl de la solución de anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, las láminas se incubaron en el anticuerpo secundario universal proporcionado con el kit. Posteriormente, se aplicó DAB Plus estable durante 1 o 2 minutos como cromógeno y las láminas se enjuagaron en agua destilada, se contrateñieron manualmente con hematoxilina (Biocare Medical) durante 10 segundos y luego se enjuagaron en agua destilada. Luego, se aplicaron cubiertas a cada lámina, utilizando vidrio sintético y medio de montaje permount. Se incluyeron controles negativos y positivos (negativo: LNCaP, positivo: OVCAR-3) en cada procedimiento de inmunotinción.

Análisis estadístico

Los datos de citotoxicidad pareados se analizaron utilizando la prueba de rangos con signo de Wilcoxon para tener en cuenta la falta de normalidad, la distribución sesgada de los datos y la variabilidad del donante. Se consideró que un valor de P < 0,05 era estadísticamente significativo y el análisis se realizó utilizando la versión 9.4 de SAS. Todos los demás análisis estadísticos se realizaron utilizando Microsoft Excel versión 16 (Microsoft, Redmond, WA). Se calcularon estadísticas descriptivas para analizar las características de MSLN-ST y los datos se resumieron utilizando la media, la desviación estándar o el error estándar de la media (para describir el promedio y la dispersión de conjuntos de datos pequeños con una distribución de datos simétrica, por ejemplo, réplicas técnicas) o las medianas y el rango intercuartílico (RIC) (para resumir conjuntos de datos que consisten en datos sesgados o inusualmente distribuidos con valores atípicos). Las comparaciones no se ajustaron para la normalidad.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos generados durante el estudio se mantienen en formato electrónico en una base de datos alojada por el Centro de Terapia Celular y Genética, Baylor College of Medicine. Todos los datos utilizados en el análisis de los resultados del presente estudio se incluyen en el artículo y en la información complementaria. Todos los demás datos (crudos o analizados) están disponibles a solicitud razonable del autor correspondiente (A.M.L.).

Resultados

Expresión de MSLN en líneas celulares y tumores primarios

Evaluamos la expresión de MSLN en varios tipos de cáncer, tanto mediante citometría de flujo como mediante inmunohistoquímica. Como se muestra en la Figura Suplementaria 1A, MSLN se expresa a niveles elevados en varias líneas celulares cancerosas [mesotelioma (NCI-H2052 - 64%, NCI-H2452 - 94%), TNBC (HCC1806 - 87%), uterino (KLE - 95%), cervical (MS751 - 85%), colon (SK-CO-1 - 87%), ovario (OVCAR3 - 76%) y líneas celulares de cáncer de páncreas (CAPAN-1 - 35% y CFPAC-1 - 31%)] y en muestras de tumores pancreáticos primarios analizadas por inmunohistoquímica (IHC), de las cuales 7 de 9 fueron MSLN+ (Figura Suplementaria 1B). Los controles negativos incluyen las líneas celulares HS578T, LNCaP y NCI-H28, que representan TNBC, cáncer de próstata y mesotelioma, respectivamente (Figura Suplementaria 1A, panel derecho).

Expansión, inmunofenotipo y especificidad de los linfocitos T específicos de MSLN

Para investigar a continuación la inmunogenicidad de MSLN en los linfocitos T nativos, expusimos las células PBMC de donantes sanos (n = 29) con diversos tipos de HLA (Tabla 1) a péptidos cargados en células dendríticas (DC), seguido de la expansión en un medio de linfocitos T suplementado con citocinas polarizantes Th1, proliferativas y pro-supervivencia. Después de 23 ± 2 días y 3 rondas de estimulación, 21 de las 29 líneas exhibieron actividad anti-MSLN [definida como la detección de >50 células formadoras de puntos de IFNγ (SFC)/2x105 células de entrada], con una frecuencia media de 1528 ± 504 SFC/2x105 células de entrada (mediana, 736; rango 114 – 10089 SFC en los respondedores) con una actividad no específica insignificante (control: media 18 ± 2 SFC/2x105 células de entrada) (Figura 1A). En los respondedores a MSLN, se logró una expansión media de 32,3 ± 5,2 veces en el número de células (Figura 1B), lo que resultó en 276 ± 54x106 células totales (Figura Suplementaria 2A; Tabla Suplementaria 1). Las imágenes ELIspot representativas se muestran en la Figura Suplementaria 2B. Las células expandidas estaban compuestas predominantemente por células CD3+ (97,6 ± 1%) que representaban subconjuntos CD4+ (40,5 ± 4,9%) y CD8+ (60,0 ± 4,6%) que expresaban tanto marcadores de memoria central [CD45RO+/CD62L+ (57,1 ± 4,3%)] como de memoria efectora [CD45RO+/CD62L− (40,7 ± 4,5%)], una composición preparada para una función efectora inmediata y una persistencia in vivo a largo plazo. Además, estas células se activaron en función de la regulación al alza de CD25, CD28 y CD69 (64,7 ± 2,3%, 46,7 ± 4,4% y 40,5 ± 2,3%, respectivamente), con una coexpresión mínima de marcadores de agotamiento (CD3+/PD1+/TIM3+/LAG3+: 1,8 ± 0,3%, Figura 1C). También confirmamos la presencia de linfocitos T específicos de MSLN en la sangre periférica de pacientes con tumores MSLN+ (Figura Suplementaria 3).

Los linfocitos T específicos de MSLN generados con péptidos expandidos ex vivo son polifuncionales

A continuación, examinamos si tanto los linfocitos T CD4+ como los CD8+ contenían células reactivas a MSLN mediante la realización de ICS para IFNγ y TNFα. La actividad dirigida a MSLN se detectó predominantemente en el compartimento CD8+ con una reactividad CD4+ más débil (Figura 2A, panel izquierdo: resultados representativos de 2 donantes; Figura 2A, panel derecho: datos resumidos, 17 ± 4,1% de células CD8+/productoras de IFNγ; 3,5 ± 2% de células CD4+/productoras de IFNγ, n = 21). Se ha demostrado que la eficacia in vivo de los linfocitos T infundidos está estrechamente relacionada con su capacidad para producir múltiples moléculas efectoras (es decir, polifuncionalidad), y nos animó descubrir que la mayoría de las células reactivas producían tanto IFNγ como TNFα, según lo evaluado por ICS (Figura 2B, panel izquierdo: resultados representativos de 2 donantes; Figura 2B, panel derecho: datos resumidos, 14,8 ± 3,7% de células CD8+/productoras de IFNγ/TNFα; 1,8 ± 1,2% de células CD4+/productoras de IFNγ/TNFα, n = 21). Cuando exploramos más a fondo la polifuncionalidad utilizando el ensayo FluoroSpot, descubrimos que, tras la exposición a MSLN, las células reactivas secretaban no solo IFNγ (810 ± 261 SFC/2x105 células) y TNFα (780 ± 354 SFC/2x105 células), sino también granzima B (GrB; 444 ± 158 SFC/2x105 células) (Figura 2C, superior). Además, de todas las células productoras de IFNγ, el 52% eran polifuncionales, produciendo además GrB (8%), TNFα (36%) o ambos, GrB y TNFα (8%) (n = 6). Estos resultados se corroboraron cuando nos centramos en TNFα o GrB (61% y 57% polifuncionales, respectivamente; Figura 2C, inferior).

Aunque los resultados de FluoroSpot (Figura 2C) y ELISpot (Figura Suplementaria 4) de GrB indicaron un potencial citolítico, examinamos formalmente la actividad litica incubando linfocitos T reactivos a MSLN con péptidos cargados en células autólogas (blastos de PHA) o con células de control que no expresaban el antígeno. Los linfocitos T pudieron lisar específicamente los objetivos autólogos cargados con péptidos de MSLN (Figura 3A: resultados representativos de 2 donantes; Figura 3B: datos resumidos, mediana, 55% de lisis específica; rango 26-90%, 40:1 E:T, n = 18, P < 0,0001, prueba de rangos con signo de Wilcoxon), y la destrucción disminuyó en presencia de anticuerpos bloqueantes de la clase I del MHC, pero no de la clase II del MHC. Además, las células reactivas también pudieron reconocer y destruir líneas celulares parcialmente compatibles con el HLA que expresaban MSLN de forma endógena, como se muestra en la Figura 3C.

Los sistemas de cultivo 3D replican más estrechamente las características in vivo, y los esferoides tumorales proporcionan un modelo que imita mejor la arquitectura y la fisiología del tumor sólido. Por lo tanto, exploramos a continuación los beneficios de nuestra estrategia con esferoides tumorales derivados de cáncer de páncreas y cáncer de cuello uterino MSLN+. Primero, establecimos esferoides utilizando células tumorales etiquetadas con GFP/FFLuc (Figura 4A). Para evaluar la actividad antitumoral, co-cultivamos esferoides tumorales solos (Tumor) o con linfocitos T específicos de MSLN o de control parcialmente compatibles con el HLA a la relación E:T indicada (basada en el número inicial de células tumorales utilizadas para generar los esferoides). La imagen de fluorescencia de los esferoides demostró una disminución de la carga tumoral en ambas condiciones tratadas con linfocitos T de MSLN (Figuras 4B, C). En conjunto, estos resultados demuestran que los linfocitos T específicos de MSLN, generados utilizando un péptido, pueden reconocer y destruir objetivos tumorales que expresan MSLN de forma endógena en sistemas de cultivo 2D y 3D.

Magnitud y especificidad de la reactividad de MSLN dentro de las líneas de linfocitos T expandidas ex vivo

Para comprender mejor la amplitud de la reactividad de los epítopos de los linfocitos T dentro de nuestras líneas de linfocitos T policlonales, utilizamos la biblioteca de péptidos superpuestos de MSLN que comprende 153 péptidos de 15 aminoácidos (Tabla Suplementaria 2) que abarcan toda la secuencia del antígeno. Estos péptidos se dividieron en 25 minipools, cada uno de los cuales contenía 12 o 13 péptidos y se organizó de tal manera que cada péptido individual estuviera presente en 2 minipools. Luego, las líneas de linfocitos T reactivas se volvieron a examinar utilizando estos minipools. Un ejemplo del proceso de selección se muestra en la Figura 5A, en la que una línea de linfocitos T generada a partir del donante 15 reaccionó contra los minipools de péptidos 1, 6, 15 y 25, lo que reveló 4 péptidos estimulantes potenciales: #25, #30, #145 y #150 (Figura 5B). El examen posterior con cada uno de estos péptidos individuales mediante ICS para IFNγ reveló que los dos péptidos que contenían epítopos eran #30 y #145 (Figura 5C). Las Figuras Suplementarias 5A-C muestran datos similares para el donante 11, cuya reactividad de minipool se asignó a los pools 6, 8, 9, 15 y 23, lo que reveló respuestas específicas de epítopos en los péptidos #30, #128 y #129.

La Figura 5D resume los resultados de la selección de péptidos de minipool para todos los 21 donantes respondedores. En general, 44 de los 153 péptidos (29%) provocaron una respuesta en al menos 1 donante y 11 péptidos fueron reconocidos por ≥ 3 individuos (Figura 5E). De estos, el péptido #30 fue el más inmunogénico, con reactividad identificada en 12 individuos, seguido en orden descendente por #145 (n = 8), #91 y #128/129 (n = 6), #72 y 151 (n = 4) y #s 15, 16, 109, 118 y 133 reconocidos por n = 3. De los péptidos más reconocidos, la reactividad fue principalmente mediada por CD8, con la excepción del péptido 72, contra el cual se detectaron respuestas tanto en el compartimento de linfocitos T CD4+ como en el de CD8+ (Figuras Suplementarias 6A-D). Cabe destacar que la reactividad contra los péptidos #109 y 133 reflejó la reactividad hacia los epítopos A24 restringidos FYPGYLCSL (^[33], ^[34]) y A2 restringidos VLPLTVAEV (^[34]) previamente descritos, respectivamente.

Identificación de los alelos de restricción del HLA que presentan nuevos epítopos de linfocitos T

A continuación, buscamos identificar los alelos HLA que restringen los nuevos péptidos inmunogénicos revelados por nuestros estudios de cribado, con un enfoque específico en aquellos que eran inmunodominantes. Las figuras 6A y 6B, paneles izquierdos, muestran un ejemplo de los estudios de mapeo realizados en la línea del donante 15 (HLA-A: 24, 26; HLA-B: 35, 40), cuya respuesta a los péptidos #30 y #145 fue mediada por CD8+, según lo revelado por ICS. Para identificar a continuación el alelo HLA que restringe el péptido, se utilizaron células PHA autólogas y parcialmente compatibles en HLA, cargadas con péptidos, como objetivos en un ensayo de citotoxicidad, y solo los objetivos cargados con péptidos compatibles con B35 fueron destruidos en cada caso [Figuras 6A y 6B, paneles derechos]. De manera similar, se descubrió que los péptidos #91 y #128/129 se presentaban a través de HLA-B35 (Figuras 6C y 6D), mientras que los péptidos #132, #151, #34 y #118 se mapearon a HLA-A11, HLA-A2, HLA-A24 y HLA-A24, respectivamente (Figuras suplementarias 7A-D). Finalmente, para identificar los epítopos mínimos reconocidos por los péptidos #30, 145, 91 y 128/129, utilizamos un panel de 9-14 mer, que reveló los epítopos mínimos como 9 mer - LPLDLLLFL (Figura suplementaria 8A), 9 mer – IPNGYLVLD (Figura suplementaria 8B), 12 mer – YPESVIQHLGYL (Figura suplementaria 8C) y 9 mer – NVSMDLATF (Figura suplementaria 8D), respectivamente. La Tabla 2 enumera los péptidos estimulantes para los cuales se identificaron restricciones HLA en este estudio, así como en otros (^[33], ^[34]), mientras que los 44 péptidos que se encontraron inmunogénicos se resaltan en la Tabla suplementaria 2.

Expresión de MSLN en líneas celulares y tumores primarios

Evaluamos la expresión de MSLN en varios tipos de cáncer, tanto mediante citometría de flujo como mediante inmunohistoquímica. Como se muestra en la Figura suplementaria 1A, MSLN se expresa en niveles elevados en varias líneas celulares cancerosas [mesotelioma (NCI-H2052 - 64%, NCI-H2452 - 94%), TNBC (HCC1806 - 87%), uterino (KLE - 95%), cervical (MS751 - 85%), colon (SK-CO-1 - 87%), ovario (OVCAR3 - 76%) y líneas celulares de cáncer de páncreas (CAPAN-1 - 35% y CFPAC-1 - 31%)] y en muestras de tumores primarios de páncreas analizadas por inmunohistoquímica (IHC), de las cuales 7 de 9 fueron MSLN+ (Figura suplementaria 1B). Los controles negativos incluyen las líneas celulares HS578T, LNCaP y NCI-H28, que representan TNBC, cáncer de próstata y mesotelioma, respectivamente (Figura suplementaria 1A, panel derecho).

Expansión, inmunofenotipo y especificidad de las células T específicas de MSLN

Para investigar a continuación la inmunogenicidad de MSLN en las células T nativas, expusimos las PBMCs de donantes sanos (n = 29) con diversos tipos de HLA (Tabla 1) a DCs cargadas con pepmix, seguido de la expansión en un medio de células T suplementado con citoquinas polarizantes Th1, proliferativas y pro-supervivencia. Después de 23 ± 2 días y 3 rondas de estimulación, 21 de las 29 líneas exhibieron actividad anti-MSLN [definida como la detección de >50 células formadoras de puntos de IFNγ (SFC)/2x105 células de entrada], con una frecuencia media de 1528 ± 504 SFC/2x105 células de entrada (mediana, 736; rango 114 – 10 089 SFC en los respondedores) con una actividad no específica insignificante (control: media 18 ± 2 SFC/2x105 células de entrada) (Figura 1A). En los respondedores a MSLN, se logró una expansión media de 32,3 ± 5,2 veces en el número de células (Figura 1B), lo que produjo 276 ± 54 x 106 células totales (Figura suplementaria 2A; Tabla suplementaria 1). Las imágenes ELIspot representativas se muestran en la Figura suplementaria 2B. Las células expandidas se componían predominantemente de células CD3+ (97,6 ± 1%), que representaban los subconjuntos CD4+ (40,5 ± 4,9%) y CD8+ (60,0 ± 4,6%), que expresaban tanto marcadores de memoria central [CD45RO+/CD62L+ (57,1 ± 4,3%)] como de memoria efectora [CD45RO+/CD62L− (40,7 ± 4,5%)], una composición preparada para una función efectora inmediata y una persistencia in vivo a largo plazo. Además, estas células se activaron en base a la regulación al alza de CD25, CD28 y CD69 (64,7 ± 2,3%, 46,7 ± 4,4% y 40,5 ± 2,3%, respectivamente), con una coexpresión mínima de marcadores de agotamiento (CD3+/PD1+/TIM3+/LAG3+: 1,8 ± 0,3%, Figura 1C). También confirmamos la presencia de células T específicas de MSLN en la sangre periférica de pacientes con tumores MSLN+ (Figura suplementaria 3).

Las células T específicas de MSLN generadas con pepmix expandidas ex vivo son polifuncionales

A continuación, examinamos si tanto las células T CD4+ como las CD8+ contenían células reactivas a MSLN mediante la realización de ICS para IFNγ y TNFα. La actividad dirigida a MSLN se detectó predominantemente en el compartimento CD8+, con una reactividad CD4+ más débil (Figura 2A, panel izquierdo: resultados representativos de 2 donantes; Figura 2A, panel derecho: datos resumidos, 17 ± 4,1% de células CD8+/productoras de IFNγ; 3,5 ± 2% de células CD4+/productoras de IFNγ, n = 21). La eficacia in vivo de las células T infundidas está estrechamente relacionada con su capacidad para producir múltiples moléculas efectoras (es decir, polifuncionalidad), y nos alentó descubrir que la mayoría de las células reactivas producían tanto IFNγ como TNFα, según lo evaluado por ICS (Figura 2B, panel izquierdo: resultados representativos de 2 donantes; Figura 2B, panel derecho: datos resumidos, 14,8 ± 3,7% de células CD8+/productoras de IFNγ/TNFα; 1,8 ± 1,2% de células CD4+/productoras de IFNγ/TNFα, n = 21). Cuando exploramos más a fondo la polifuncionalidad utilizando el ensayo FluoroSpot, descubrimos que, tras la exposición a MSLN, las células T reactivas secretaban no solo IFNγ (810 ± 261 SFC/2x105 células) y TNFα (780 ± 354 SFC/2x105 células), sino también granzima B (GrB; 444 ± 158 SFC/2x105 células) (Figura 2C, superior). Además, de todas las células productoras de IFNγ, el 52% eran polifuncionales, produciendo además GrB (8%), TNFα (36%) o ambos, GrB y TNFα (8%) (n = 6). Estos resultados se corroboraron cuando nos centramos en TNFα o GrB (61% y 57% polifuncionales, respectivamente; Figura 2C, inferior).

Aunque los resultados de FluoroSpot (Figura 2C) y ELISpot (Figura suplementaria 4) de GrB indicaron un potencial citolítico, examinamos formalmente la actividad litica incubando las células T reactivas a MSLN con pepmix cargado con células autólogas (células PHA) o con objetivos de control que no expresaban el antígeno. Las células T pudieron lisar específicamente los objetivos autólogos cargados con pepmix de MSLN (Figura 3A: resultados representativos de 2 donantes; Figura 3B: datos resumidos, mediana, 55% de lisis específica; rango 26-90%, 40:1 E:T, n = 18, P < 0,0001, prueba de rango firmado de Wilcoxon), y la destrucción disminuyó en presencia de anticuerpos bloqueantes de la clase I del MHC, pero no de la clase II del MHC. Además, las células reactivas también pudieron reconocer y destruir líneas celulares parcialmente compatibles en HLA que expresaban endógenamente MSLN, como se muestra en la Figura 3C.

Los sistemas de cultivo 3D replican más estrechamente las características in vivo, y los esferoides tumorales proporcionan un modelo que imita mejor la arquitectura y la fisiología del tumor sólido. Por lo tanto, a continuación, exploramos los beneficios de nuestra estrategia con esferoides tumorales derivados de cáncer de páncreas y cáncer de cuello uterino MSLN+. Primero, establecimos esferoides utilizando células tumorales etiquetadas con GFP/FFLuc (Figura 4A). Para evaluar la actividad antitumoral, co-cultivamos esferoides tumorales solos (Tumor) o con células T específicas de MSLN o de control parcialmente compatibles en HLA a la proporción E:T indicada (basada en el número inicial de células tumorales utilizadas para generar los esferoides). La imagen de fluorescencia de los esferoides demostró una disminución de la carga tumoral en ambas condiciones tratadas con células T de MSLN (Figuras 4B y 4C). En conjunto, estos resultados demuestran que las células T específicas de MSLN, generadas utilizando un pepmix, pueden reconocer y destruir los objetivos tumorales que expresan endógenamente MSLN en sistemas de cultivo 2D y 3D in vitro.

Magnitud y especificidad de la reactividad de MSLN dentro de las líneas de células T expandidas ex vivo

Para comprender mejor la amplitud de la reactividad de los epítopos de las células T dentro de nuestras líneas de células T policlonales, utilizamos la biblioteca de péptidos superpuestos de MSLN que comprende 153 péptidos de 15 mer (Tabla suplementaria 2) que abarcan toda la secuencia del antígeno. Estos péptidos se dividieron en 25 minipools, cada uno de los cuales contenía 12 o 13 péptidos y se organizó de tal manera que cada péptido individual estuviera presente en 2 minipools. A continuación, se volvieron a examinar las líneas de células T reactivas utilizando estos minipools. Un ejemplo del proceso de cribado se muestra en la Figura 5A, en la que una línea de células T generada a partir del donante 15 reaccionó contra los minipools de péptidos 1, 6, 15 y 25, lo que reveló 4 péptidos estimulantes potenciales: #25, #30, #145 y #150 (Figura 5B). El cribado posterior con cada uno de estos péptidos individuales mediante ICS para IFNγ reveló los dos péptidos que contenían epítopos como #30 y #145 (Figura 5C). Las Figuras suplementarias 5A-C muestran datos similares para el donante 11, cuya reactividad de minipool se mapeó a los pools 6, 8, 9, 15 y 23, lo que reveló respuestas específicas de epítopos en los péptidos #30, #128 y #129.

La Figura 5D resume los resultados del cribado de péptidos de minipool para los 21 donantes respondedores. En general, 44 de los 153 péptidos (29%) provocaron una respuesta en al menos 1 donante y 11 péptidos fueron reconocidos por ≥ 3 individuos (Figura 5E). De estos, el péptido #30 fue el más inmunogénico, con reactividad identificada en 12 individuos, seguido en orden descendente por #145 (n = 8), #91 y #128/129 (n = 6), #72 y 151 (n = 4) y #s 15, 16, 109, 118 y 133 reconocidos por n = 3. De los péptidos más reconocidos, la reactividad fue principalmente mediada por CD8+, con la excepción del péptido 72, contra el cual se detectaron respuestas tanto en el compartimento de células T CD4+ como en el de CD8+ (Figuras suplementarias 6A-D). Cabe destacar que la reactividad contra los péptidos #109 y #133 reflejó la reactividad hacia los epítopos A24 restringidos FYPGYLCSL (^[33], ^[34]) y A2 restringidos VLPLTVAEV (^[34]) previamente descritos, respectivamente.

Identificación de los alelos HLA que restringen los nuevos epítopos de células T

A continuación, buscamos identificar los alelos HLA que restringen los nuevos péptidos inmunogénicos revelados por nuestros estudios de cribado, con un enfoque específico en aquellos que eran inmunodominantes. Las figuras 6A y 6B, paneles izquierdos, muestran un ejemplo de los estudios de mapeo realizados en la línea del donante 15 (HLA-A: 24, 26; HLA-B: 35, 40), cuya respuesta a los péptidos #30 y #145 fue mediada por CD8+, según lo revelado por ICS. Para identificar a continuación el alelo HLA que restringe el péptido, se utilizaron células PHA autólogas y parcialmente compatibles en HLA, cargadas con péptidos, como objetivos en un ensayo de citotoxicidad, y solo los objetivos cargados con péptidos compatibles con B35 fueron destruidos en cada caso [Figuras 6A y 6B, paneles derechos]. De manera similar, se descubrió que los péptidos #91 y #128/129 se presentaban a través de HLA-B35 (Figuras 6C y 6D), mientras que los péptidos #132, #151, #34 y #118 se mapearon a HLA-A11, HLA-A2, HLA-A24 y HLA-A24, respectivamente (Figuras suplementarias 7A-D). Finalmente, para identificar los epítopos mínimos reconocidos por los péptidos #30, 145, 91 y 128/129, utilizamos un panel de 9-14 mer, que reveló los epítopos mínimos como 9 mer - LPLDLLLFL (Figura suplementaria 8A), 9 mer – IPNGYLVLD (Figura suplementaria 8B), 12 mer – YPESVIQHLGYL (Figura suplementaria 8C) y 9 mer – NVSMDLATF (Figura suplementaria 8D), respectivamente. La Tabla 2 enumera los péptidos estimulantes para los cuales se identificaron restricciones HLA en este estudio, así como en otros (^[33], ^[34]), mientras que los 44 péptidos que se encontraron inmunogénicos se resaltan en la Tabla suplementaria 2.

Discusión

Orientar tumores sólidos sigue siendo un obstáculo para las aplicaciones inmunoterapéuticas debido a una serie de problemas, uno de los cuales es la escasez de antígenos diana adecuados que se expresen o sobreexpresen exclusivamente en las células tumorales. En el presente estudio, exploramos el potencial inmunoterapéutico de MSLN, un antígeno que se expresa de forma diferencial en varios tipos de cáncer, muchos de los cuales tienen un mal pronóstico. Tanto su sobreexpresión como su contribución al mantenimiento del fenotipo maligno lo convierten en un objetivo atractivo, y aquí evaluamos el potencial de orientar las células tumorales que expresan MSLN utilizando células T con una especificidad de TCR nativa. Demostramos que las células T específicas de MSLN se pueden expandir fácilmente a partir de donantes sanos con diversos antecedentes de HLA, y la actividad dominante se detectó en el subconjunto de células T CD8+. Las células reactivas están polarizadas hacia Th1, son polifuncionales y son capaces de mediar efectos citotóxicos potentes, lo que da como resultado efectos antitumorales pronunciados contra el mesotelioma, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de colon y las células de cáncer de páncreas que expresan endógenamente MSLN en modelos tumorales in vitro 2D y 3D. En conjunto, estos datos respaldan la exploración adicional de esta modalidad como un posible agente inmunoterapéutico.

MSLN es una proteína de superficie celular anclada a GPI que se sobreexpresa en muchos tipos diferentes de tumores sólidos, incluidos el mesotelioma, el cáncer de ovario y el cáncer de páncreas, el adenocarcinoma gástrico y el cáncer de mama triple negativo (^[7], ^[10]–^[13], ^[21], ^[35]). En general, las proteínas unidas a GPI desempeñan un papel en la señalización y la adhesión celular, y aunque la función fisiológica de MSLN no está clara, en el contexto maligno existen pruebas de que desempeña un papel en la promoción de la proliferación y la diseminación de las células tumorales (^[9], ^[14], ^[16], ^[18]–^[20]). En un esfuerzo por explotar terapéuticamente MSLN, se han desarrollado varias modalidades dirigidas, incluidas vacunas (^[36]), así como agentes dirigidos a MSLN expresado en la superficie, como anticuerpos monoclonales, inmunotoxinas, conjugados anticuerpo-fármaco (^[5], ^[22]–^[25]) y células CAR T (^[26], ^[27], ^[29]–^[32]), que generalmente se han tolerado bien. Las excepciones incluyen LMB-100, una inmunotoxina recombinante que consiste en un Fab que se une a MSLN y una carga de toxina A de Pseudomonas modificada (iTox), que se administró con nab-paclitaxel a pacientes con cáncer de páncreas en un ensayo de fase I/II. Se informaron toxicidades limitantes de la dosis debido al síndrome de fuga capilar (CLS) en 2 de 5 pacientes tratados a 100 μg/kg, y los investigadores postularon que esto se debió a la captación inespecífica de iTox por las células endoteliales, lo que provocó su daño directo en lugar de una especificidad para el direccionamiento a MSLN (^[37]). De manera similar, se han notificado algunas toxicidades en pacientes tratados con células CAR T. Beatty y sus colegas fueron los primeros en avanzar a la clínica utilizando células T que se transfectaron de forma transitoria (ARNm) con un CAR murino (^[28]). Las células T se administraron (1-3x108/m2, 3 veces por semana durante 3 semanas) a 6 pacientes con cáncer de páncreas metastásico resistente a la quimioterapia, pero el impacto clínico fue mínimo (estabilización transitoria de la enfermedad, n=2), aunque las infusiones se toleraron bien (sin DLT, sin pleuritis, pericarditis o peritonitis y sin CRS/neurotoxicidad). Sin embargo, un paciente posterior tuvo una reacción anafiláctica y sufrió un paro cardíaco después de recibir 3 infusiones de células en 49 días. Tras una investigación exhaustiva, el equipo concluyó que esto probablemente se debió al desarrollo de anticuerpos IgE dirigidos por el CAR murino, formados como resultado de dosis repetidas de células durante un período de dosificación prolongado (^[38]). Para abordar este problema, este equipo cambió de una plataforma de transfección transitoria (ARNm) a una plataforma estable (lentivirus) y de un CAR murino a un CAR de segunda generación totalmente humano (41BB), que incluía un scFV que se eligió en función de su capacidad para detectar incluso niveles muy bajos de MSLN. Desafortunadamente, cuando se administró a 2 pacientes a una dosis de 1x108/m2 (sin linfodepleción), ambos desarrollaron una toxicidad pulmonar grave (^[39]), lo que provocó la muerte de uno, como consecuencia del reconocimiento de niveles bajos de MSLN que se habían aumentado en las células epiteliales pulmonares normales en el contexto de una lesión pulmonar. Morgan y sus colegas informaron efectos similares de "objetivo correcto, tumor incorrecto" al dirigir el antígeno tumoral sobreexpresado ERBB2 en un paciente con cáncer de colon que había hecho metástasis en los pulmones y el hígado (^[40]). A los 15 minutos de administrar 1010 células CAR T (que contienen los endodominios CD28, 4-1BB y CD3z), el paciente experimentó dificultad respiratoria, y el examen histológico posterior de los tejidos de la autopsia reveló bajos niveles de ERBB2 en el parénquima pulmonar normal, lo que sugiere el reconocimiento de los niveles fisiológicos de ERBB2 por las células CAR T altamente activas. Los autores señalan que esta toxicidad nunca se había observado previamente en miles de pacientes tratados con trastuzumab (anticuerpo monoclonal ERBB2), inmunizados con epítopos de ERBB2 o a los que se les infundieron clones de células T autólogas específicas de ERBB2. De manera similar, en pacientes a los que se les administraron anticuerpos monoclonales dirigidos a MSLN, conjugados anticuerpo-fármaco, vacunas o células CAR T modificadas con un scFV reactivo contra los niveles sobreexpresados de MSLN, no se documentaron toxicidades graves (^[5], ^[22]–^[27], ^[29], ^[30]).

Una de las complejidades de dirigir MSLN es la posibilidad de que se desprenda de la superficie celular y que el MSLN soluble (presente en niveles elevados en el suero de pacientes con tumores sólidos) pueda interferir con el reconocimiento (^[41]). En contraste, las células T transferidas de forma adoptiva con especificidad nativa del TCR reconocen el antígeno diana que ha sido procesado y presentado en la superficie celular en el contexto de las moléculas de HLA y, por lo tanto, son inmunes tanto a la presencia de antígeno soluble como a los eventos de escisión. Jaffee y sus colegas (^[42]) fueron los primeros en identificar que MSLN era inmunogénico para las células T endógenas en estudios correlativos realizados en pacientes que recibieron líneas celulares de cáncer de páncreas que secretan GM-CSF. De hecho, en los pacientes que desarrollaron respuestas de hipersensibilidad retardada (DTH) después de la vacunación, descubrieron niveles amplificados de células T dirigidas a epítopos presentados en el contexto de HLA-A2, A3 y A24 (^[34]). Además, en estudios de fase I y II posteriores en pacientes con cáncer de páncreas, se demostró que la supervivencia libre de enfermedad prolongada se correlacionaba con la inducción y el mantenimiento de niveles elevados de células T dirigidas a MSLN en pacientes positivos para HLA-A1, HLA-A2 y HLA-A3 (^[43]–^[46]). En el presente estudio, buscamos ampliar la biblioteca de epítopos dirigidos a MSLN utilizando un enfoque imparcial en el que utilizamos péptidos superpuestos (153 péptidos de 15 aminoácidos cada uno, con una superposición de 11 aminoácidos) para interrogar los epítopos de las células T CD4+ y CD8+ en individuos con diversos antecedentes de HLA. En general, encontramos respuestas inmunitarias que se asignan a casi un tercio del antígeno (44/153 péptidos provocaron una respuesta en al menos 1 donante) y, además de detectar varias respuestas CD8 documentadas previamente (^[33], ^[34]), mapeamos numerosas respuestas nuevas de células T CD8+ restringidas a péptidos presentados en el contexto de HLA-B35, A2, A11 y A24. Aunque las respuestas CD4+ se detectaron con menos frecuencia, pudimos identificar la presencia de epítopos de células T CD4+ y CD8+ superpuestos dentro del péptido n.º 72 (aa ERTILRPRFRREVEK), que fue reconocido por 4 de nuestros donantes analizados.

Este estudio tiene limitaciones, incluida la de que los estudios de expansión ex vivo y la caracterización fenotípica y funcional se realizaron principalmente utilizando células generadas a partir de individuos sanos y no de pacientes con tumores que expresan MSLN. Dado que el microambiente de los tumores sólidos puede ser inmunosupresor, no se puede inferir que sea factible expandir estas células a partir de pacientes o, de hecho, que estas células (si se generan) sean igualmente potentes/polifuncionales, etc. En segundo lugar, aunque evaluamos la seguridad de las células T reactivas a MSLN in vitro utilizando células normales, incluidas las células T, así como fibroblastos de la piel y los pulmones como dianas (datos no mostrados), se sabe que MSLN se expresa en la pleura, el peritoneo y el pericardio. Sin embargo, dado que (a) las células T específicas de MSLN circulan de forma natural en la periferia de los pacientes con tumores MSLN+ (^[33], ^[34], ^[42]) y (b) la detección se ha asociado con mejores resultados en ausencia de efectos secundarios (^[43]–^[46]), es probable que el reconocimiento de las células T del TCR se centre preferentemente en los tejidos sobreexpresados. Sin embargo, la exploración clínica inicial debe basarse en la precaución, con la administración planificada de dosis bajas de células (^[47]) sin linfodepleción y con la posible incorporación de nuestro gen de suicidio clínicamente validado (^[48]–^[51]).

Nuestro grupo ha dirigido clínicamente una variedad de antígenos de cáncer de testículo/compartidos/de diferenciación, incluidos PRAME, SSX2, MAGEA4, SURVIVIN, NY-ESO-1 y WT-1 en enfermedades que incluyen la leucemia (^[52], ^[53]), el linfoma (^[54]), el mieloma múltiple (^[55]), el cáncer de mama (^[56]) y el cáncer de páncreas (^[57]) utilizando células T autólogas o alogénicas expandidas ex vivo sin toxicidades graves relacionadas con la infusión y con efectos clínicos a largo plazo documentados. El trabajo actual apoya la investigación adicional de MSLN como un antígeno potencial para agregar a nuestro repertorio de dianas. MSLN es inmunogénico, y es factible generar células T reactivas que reconozcan las células diana cargadas con antígeno y que expresen el antígeno de forma endógena. Esto, además de los informes previos que documentan una asociación entre las células T endógenas específicas de MSLN en los receptores de vacunas y el beneficio clínico prolongado, apoya una mayor exploración de este antígeno como una diana inmunoterapéutica.