La inhibición de la metilación de la proteína de unión y motilidad celular 1 reduce la infiltración de macrófagos M2 y potencia la eficacia del anti-PD-1 en el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común a nivel mundial, con más de 1,8 millones de nuevos casos notificados a nivel mundial y aproximadamente 560.000 nuevos casos anuales en China [^[1]]. Los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICIs) han demostrado tener efectos beneficiosos en pacientes con inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H) [^[2], ^[3]]. No obstante, más de la mitad de los pacientes con CCR MSI-H presentan resistencia primaria o secundaria a los ICIs, y algunos desarrollan progresión tumoral durante el curso de la enfermedad [[4–6]]. Las razones detrás de esta falta de respuesta en algunos pacientes aún no están claras.

El microambiente tumoral contiene varias células inmunitarias, que interactúan de formas complejas y que pueden promover u obstaculizar el crecimiento tumoral [^[7]]. Los macrófagos asociados al tumor (TAM), especialmente el subtipo M2, son componentes importantes del microambiente tumoral, que pueden liberar una variedad de citocinas y quimiocinas antiinflamatorias, como la ligando de quimiocina C-C 18 (CCL18), para promover el crecimiento tumoral, la angiogénesis, la metástasis y la evasión inmune tumoral [^[8]]. Los TAM similares a M2 pueden expresar ligandos de los puntos de control inmunitario de las células T (como la ligando de muerte programada 1 [PD-L1] y la ligando de muerte programada 2 [PD-L2]), secretar citocinas inhibidoras (como la interleucina [IL]-10 y el factor de crecimiento transformante-β [TGF-β]) y reclutar células inmunosupresoras (como las células T reguladoras [Treg]) para suprimir la respuesta inmune antitumoral [[9–11]]. La evidencia acumulada ha demostrado que la evasión inmune del CCR está modulada predominantemente por la composición y la distribución de las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral, así como por los factores moleculares reguladores en las células tumorales [^[12]]. Por lo tanto, es crucial identificar las moléculas clave que median la interacción entre las células tumorales y las células inmunitarias.

Se ha informado que la proteína de engullimiento y motilidad celular 1 (ELMO1) desempeña un papel fundamental en los procesos patológicos asociados a los macrófagos, incluidos las infecciones bacterianas, los trastornos inflamatorios y la progresión tumoral [[13–16]]. Al interactuar con las proteínas de la familia dedicator of cytokinesis (DOCK), ELMO1 modula la migración y la invasión celular para mejorar la progresión tumoral [^[17]]. En los tumores del tracto gastrointestinal superior y en ciertas enfermedades benignas, ELMO1 actúa como un mediador clave que regula la interacción entre las células tumorales y las células inmunitarias [[18–22]]. Sin embargo, la correlación entre ELMO1 y la progresión del CCR, así como el mecanismo regulador relevante, aún no está clara.

En este estudio, descubrimos una nueva asociación entre ELMO1 y la remodelación del microambiente tumoral MSI-H. Encontramos que una alta expresión de ELMO1 se asoció con un peor pronóstico en el grupo de CCR MSI-H. El silenciamiento de ELMO1 suprimió el crecimiento celular en las células cancerosas MSI-H. La liberación de ELMO1 de las células tumorales indujo la acumulación de macrófagos M2 y facilitó la polarización de M0 a M2 mediante la activación de la señalización del transductor y activador de la señal 6 (STAT6). Además, la CCL18 secretada por los macrófagos M2 mejoró la interacción entre la metiltransferasa de arginina de proteínas 5 (PRMT5) y ELMO1. La inhibición farmacológica de PRMT5 redujo la metilación de ELMO1 y suprimió el crecimiento de las células tumorales. Además, la combinación de un inhibidor de PRMT5 y un anticuerpo anti-PD1 mejoró el efecto antitumoral sobre los tumores con alta expresión de ELMO1, lo que aclaró la interacción entre el CCR y los TAM. En conjunto, nuestros resultados proporcionan un prometedor objetivo terapéutico para el tratamiento del CCR MSI-H con sobreexpresión de ELMO1.

Materiales y métodos

Muestras clínicas

Los pacientes con CCR que se sometieron a una resección radical entre 2014 y 2019 en el Sexto Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen (Guangdong, China), fueron incluidos en este estudio. El diagnóstico patológico y la estadificación del CCR se realizaron mediante la Clasificación de Tumores del Sistema Digestivo, 4ª edición, de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Sistema de Estadificación del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC). Se recolectaron un total de 80 muestras de tejido fresco de CCR y se sometieron a una detección de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para el análisis de la expresión génica (resumido en la Tabla S1 suplementaria). Se incluyó otra cohorte independiente de 72 tejidos de CCR incluidos en parafina para la tinción inmunohistoquímica y el posterior análisis de correlación clínica, con características clínicas detalladas que se enumeran en la Tabla 1 y la Tabla S2 suplementaria. Las muestras utilizadas en este estudio fueron aprobadas por los Comités de Revisión Ética de la Investigación que involucra a seres humanos en el Sexto Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen (No. 2022ZSLYEC-172 y No. 2023ZSLYEC-135).

Se evaluaron cinco marcadores (BAT-26, BAT-25, D5S346, D2S123 y D17S250) que son recomendados por el Instituto Nacional del Cáncer para el análisis uniforme de MSI-H en el CCR mediante qRT-PCR del ADN genómico aislado de los pacientes.

Cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer colorrectal HCT116 (CCL-247), DLD-1 (CCL-221), SW480 (CCL-228), HT-29 (HTB-38), Caco2 (HTB-37), RKO (CRL-2577), LoVo (CCL-229) y las líneas celulares epiteliales colónicas normales HIEC6 (CRL-3266) se adquirieron del Banco de Cultivos de Células Americano (ATCC; Rockefeller, MD, EE. UU.). Las células se mantuvieron en DMEM-glucosa alta (C11995500BT; Gibco; Waltham, MA, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS; FSP500; ExCell Bio; Suzhou, Jiangsu, China) y un 1% de penicilina-estreptomicina (15140–122; Gibco) en una atmósfera humidificada del 5% de CO2 a 37°C. Las células THP-1 se obtuvieron del Centro Chino de Colección de Cultivos Celulares y se cultivaron en RPMI1640 (12633020; Gibco) con un 10% de FBS inactivado por calor, un 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM de β-mercaptoetanol (60-24-2; TCI; Shanghái, China).

Polarización de macrófagos

Las células THP-1 se diferenciaron en una etapa M0 con el estímulo de 1 µg/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; 524400; Merck Sigma; MA, EE. UU.). Luego, los macrófagos M0 se polarizaron en macrófagos M2 mediante la estimulación con IL-4 (20 ng/mL; 200-04-20ug; Thermo Fisher; Waltham, MA, EE. UU.) e IL-13 (20 ng/mL; 200-13-10ug; Thermo Fisher).

Ensayo de migración de macrófagos

Después de la polarización in vitro de las células THP-1, se realizó el ensayo de migración utilizando placas de 24 pocillos con insertos de poro de 5,0 µm. Las células tumorales indicadas se colocaron en el fondo de la cámara inferior como un atrayente quimiotáctico y se agregaron macrófagos M0 o M2 a los insertos de transwell superior (14331; Labselect; Pekín, China) y se incubaron durante 48 h a 37°C y 5% de CO2. Para inhibir la secreción de proteínas, las células tumorales se incubaron con 10 µM de monensina durante 48 h antes del ensayo de migración. Para el ensayo de migración de macrófagos M2 inducido con ELMO1 recombinante (P05836; Solarbio; Pekín, China), se colocaron macrófagos M2 en los insertos superiores y se agregó ELMO1 recombinante a los pocillos inferiores. Después de 48 h, se retiraron los insertos de transwell de la placa y se lavaron tres veces con PBS. Luego, las células migradas adheridas a la superficie inferior de la membrana se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% (P0099; Beyotime Biotechnology; Shanghái, China), se tiñeron con cristal violeta al 0,1% (C0121; Beyotime Biotechnology) y luego se cuantificaron contando el número de células en diez campos aleatorios bajo un microscopio.

Ensayo de cocultivo de transwell de macrófagos M0 y células tumorales

Se realizó un ensayo de cocultivo indirecto utilizando insertos de cultivo celular de 3,0 µm (14122; Labselect). Las células THP-1 polarizadas M0 se sembraron en el inserto superior y las células tumorales indicadas se sembraron en los pocillos inferiores en presencia de PMA. Luego, se recolectaron los macrófagos y se analizaron los marcadores de macrófagos M2 (CD68 [333806; BioLegend; San Diego, CA, EE. UU.] y CD163 [326511; BioLegend]) mediante citometría de flujo y qPCR.

Co-inmunoprecipitación

Se realizó un ensayo de co-inmunoprecipitación (Co-IP) para detectar la interacción proteica entre PRMT5 y ELMO1. Brevemente, las células que expresan Flag-ELMO1 se lisaron en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS y una mezcla de inhibidores de proteasas Roche (Roche, Reino Unido) y se incubaron con los anticuerpos indicados (anti-Flag; TT0003; Abmart; Shanghái, China) a 4°C durante 1 h y luego se incubaron con cuentas magnéticas de proteína A/G. Después de lavados exhaustivos, las proteínas unidas se eluyeron y se analizaron mediante Western blot. Las muestras de entrada se cargaron simultáneamente como controles internos para la detección mediante inmunoblot.

Modelos animales

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité para el Uso de Animales Vivos en la Enseñanza y la Investigación de la Universidad Sun Yat-sen. Para el ensayo de tumorigénesis in vivo, se injertaron células de CCR de 4 semanas de edad en la parte posterior del miembro posterior derecho de ratones desnudos mediante la inyección subcutánea de diferentes números de células (HCT116: 5 × 105; DLD-1: 2 × 106) en una suspensión de 100 µL. Después de 2 semanas, se inyectaron 20 µL de medio acondicionado M2 (CM) y medio libre de suero (grupo de control) en la masa tumoral de forma subcutánea cada 3 días. El volumen tumoral se midió cada 3 días durante un período de 4 semanas. El volumen tumoral se midió semanalmente y se calculó utilizando la fórmula V = 0,5 × W2 × L (V, volumen; L, longitud; W, ancho). Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos de animales aprobados por el Comité de Cuidado y Ética de los Animales de la Universidad Sun Yat-sen y se siguieron las Directrices Nacionales de Salud sobre el Cuidado y el Uso de Animales (IACUC-2020070602, IACUC-2022031401, IACUC-2022031402).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis transcriptómico para la selección exploratoria de candidatos y se validaron aún más los genes clave mediante experimentos funcionales independientes para excluir los falsos positivos. Para los datos clínicos, las características demográficas se mostraron utilizando estadísticas descriptivas. La correlación entre la expresión de ELMO1 y las características clínico-patológicas se evaluó utilizando la prueba de chi-cuadrado de Pearson. Las curvas de supervivencia se derivaron utilizando el método de Kaplan-Meier y se evaluaron de forma univariada utilizando la prueba de rango logarítmico, con un nivel de significación establecido en 0,05 de dos colas. Los pasos anteriores se realizaron utilizando el software estadístico SPSS versión 20.0. El análisis de la infiltración de 22 tipos de células inmunitarias se realizó utilizando el algoritmo CIBERSORT [^[23]]. Los datos de proliferación celular, formación de colonias, Western blot y ensayos de qPCR se analizaron utilizando la prueba t de Student y el análisis de varianza (ANOVA) de una vía. La prueba t de Student se utilizó para las comparaciones de dos grupos, mientras que el ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey se aplicó para las comparaciones de múltiples grupos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS y GraphPad Prism. Se consideró que un valor de P < 0,05 es estadísticamente significativo.

Muestras clínicas

Los pacientes con CCR que se sometieron a una resección radical entre 2014 y 2019 en el Sexto Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen (Guangdong, China), fueron incluidos en este estudio. El diagnóstico patológico y la estadificación del CCR se realizaron mediante la Clasificación de Tumores del Sistema Digestivo, 4ª edición, de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Sistema de Estadificación del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC). Se recolectaron un total de 80 muestras de tejido fresco de CCR y se sometieron a una detección de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para el análisis de la expresión génica (resumido en la Tabla S1 suplementaria). Se incluyó otra cohorte independiente de 72 tejidos de CCR incluidos en parafina para la tinción inmunohistoquímica y el posterior análisis de correlación clínica, con características clínicas detalladas que se enumeran en la Tabla 1 y la Tabla S2 suplementaria. Las muestras utilizadas en este estudio fueron aprobadas por los Comités de Revisión Ética de la Investigación que involucra a seres humanos en el Sexto Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen (No. 2022ZSLYEC-172 y No. 2023ZSLYEC-135).

Se evaluaron cinco marcadores (BAT-26, BAT-25, D5S346, D2S123 y D17S250) que son recomendados por el Instituto Nacional del Cáncer para el análisis uniforme de MSI-H en el CCR mediante qRT-PCR del ADN genómico aislado de los pacientes.

Cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer colorrectal HCT116 (CCL-247), DLD-1 (CCL-221), SW480 (CCL-228), HT-29 (HTB-38), Caco2 (HTB-37), RKO (CRL-2577), LoVo (CCL-229) y las líneas celulares epiteliales colónicas normales HIEC6 (CRL-3266) se adquirieron de la Colección de Cultivos Celulares Estadounidense (ATCC; Rockefeller, MD, EE. UU.). Las células se mantuvieron en DMEM con alta concentración de glucosa (C11995500BT; Gibco; Waltham, MA, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB; FSP500; ExCell Bio; Suzhou, Jiangsu, China) y un 1% de penicilina-estreptomicina (15140-122; Gibco) en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2 a 37 °C. Las células THP-1 se obtuvieron del Centro Chino de Colección de Cultivos Celulares y se cultivaron en RPMI1640 (12633020; Gibco) con un 10% de SFB inactivado por calor, un 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM de β-mercaptoetanol (60-24-2; TCI; Shanghái, China).

Polarización de macrófagos

Las células THP-1 se diferenciaron en una etapa M0 con el estímulo de 1 µg/mL de 12-O-tetradecanilforbol-13-acetato (PMA; 524400; Merck Sigma; MA, EE. UU.). A continuación, los macrófagos M0 se polarizaron en macrófagos M2 mediante la estimulación con IL-4 (20 ng/mL; 200-04-20ug; Thermo Fisher; Waltham, MA, EE. UU.) e IL-13 (20 ng/mL; 200-13-10ug; Thermo Fisher).

Ensayo de migración de macrófagos

Después de la polarización in vitro de las células THP-1, se realizó el ensayo de migración utilizando placas de 24 pocillos con insertos de poro de 5,0 µm. Las células tumorales indicadas se colocaron en el fondo de la cámara inferior como un agente quimioatractivo, y se añadieron macrófagos M0 o M2 a los insertos de transwell superiores (14331; Labselect; Pekín, China) y se incubaron durante 48 h a 37 °C y 5% de CO2. Para inhibir la secreción de proteínas, las células tumorales se incubaron con 10 µM de monensina durante 48 h antes del ensayo de migración. Para el ensayo de migración de macrófagos M2 inducido con ELMO1 recombinante (P05836; Solarbio; Pekín, China), los macrófagos M2 se colocaron en los insertos superiores y se añadió ELMO1 recombinante a los pocillos inferiores. Después de 48 h, se retiraron los insertos de transwell de la placa y se lavaron tres veces con PBS. A continuación, las células migradas adheridas a la superficie inferior de la membrana se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% (P0099; Beyotime Biotechnology; Shanghái, China), se tiñeron con cristal violeta al 0,1% (C0121; Beyotime Biotechnology) y luego se cuantificaron contando el número de células en diez campos aleatorios bajo un microscopio.

Ensayo de cocultivo en transwell de macrófagos M0 y células tumorales

Se realizó un ensayo de cocultivo indirecto utilizando insertos de cultivo celular de 3,0 µm (14122; Labselect). Las células THP-1 polarizadas en M0 se sembraron en el inserto superior, y las células tumorales indicadas se sembraron en los pocillos inferiores en presencia de PMA. A continuación, se recogieron los macrófagos y se analizaron los marcadores de macrófagos M2 (CD68 [333806; BioLegend; San Diego, CA, EE. UU.] y CD163 [326511; BioLegend]) mediante citometría de flujo y qPCR.

Co-inmunoprecipitación

Se realizó un ensayo de co-inmunoprecipitación (Co-IP) para detectar la interacción proteica entre PRMT5 y ELMO1. Brevemente, las células que expresaban Flag-ELMO1 se lisaron en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS y la mezcla de inhibidores de proteasas Roche (Roche, Reino Unido) y se incubaron con los anticuerpos indicados (anti-Flag; TT0003; Abmart; Shanghái, China) a 4 °C durante 1 h, y luego se incubaron con cuentas magnéticas de proteína A/G. Después de un lavado exhaustivo, las proteínas unidas se eluyeron y se analizaron mediante Western blot. Las muestras de entrada se cargaron simultáneamente como controles internos para la detección mediante inmunoblot.

Modelos animales

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité para el Uso de Animales en la Enseñanza y la Investigación de la Universidad Sun Yat-sen. Para el ensayo in vivo de tumorigénesis, se injertaron células de CRC en la parte posterior de la extremidad posterior derecha de ratones nudosos de 4 semanas mediante la inyección subcutánea de diferentes números de células (HCT116: 5 × 105; DLD-1: 2 × 106) en una suspensión de 100 µL. Después de 2 semanas, se inyectaron 20 µL de medio acondicionado M2 concentrado (CM) y medio libre de suero (grupo de control) en la masa tumoral de forma subcutánea cada 3 días. El volumen tumoral se midió cada 3 días durante un período de 4 semanas. El volumen tumoral se midió semanalmente y se calculó utilizando la fórmula V = 0,5 × W2 × L (V, volumen; L, longitud; W, anchura). Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos de animales aprobados por el Comité de Cuidado y Ética de los Animales de la Universidad Sun Yat-sen y se siguieron las Directrices Nacionales de Salud sobre el Cuidado y Uso de Animales (IACUC-2020070602, IACUC-2022031401, IACUC-2022031402).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis transcriptómico para la selección exploratoria de candidatos, y los genes clave se validaron posteriormente mediante experimentos funcionales independientes para excluir falsos positivos. Para los datos clínicos, las características demográficas se mostraron utilizando estadísticas descriptivas. La correlación entre la expresión de ELMO1 y las características clínico-patológicas se evaluó utilizando la prueba de chi-cuadrado de Pearson. Las curvas de supervivencia se obtuvieron utilizando el método de Kaplan-Meier y se evaluaron de forma univariada utilizando la prueba de rango logarítmico, con un nivel de significación establecido en 0,05 de dos colas. Los pasos anteriores se realizaron utilizando el software estadístico SPSS versión 20.0. El análisis de la infiltración de 22 tipos de células inmunitarias se realizó utilizando el algoritmo CIBERSORT [^[23]]. Los datos de proliferación celular, formación de colonias, Western blot y ensayos de qPCR se analizaron utilizando la prueba t de Student y el análisis de varianza (ANOVA) de una vía. La prueba t de Student se utilizó para comparaciones de dos grupos, mientras que el ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey se aplicó para comparaciones de múltiples grupos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS y GraphPad Prism. Se consideró que un valor de P < 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados

ELMO1 está sobreexpresado en el CRC MSI-H y se asocia con un mal pronóstico

Se realizó un perfilado transcriptómico en tejidos tumorales y muestras de sangre periférica de tres pacientes con CRC MSI-H, tres pacientes con CRC MSS y tejidos colónicos normales de individuos sanos para identificar firmas moleculares específicas del tumor. Se incluyeron tres conjuntos de datos GEO (GSE13067, GSE13294 y GSE13911) para un análisis bioinformático integrativo, que comprendía un total de 89 muestras de CRC MSI-H y 140 muestras de CRC MSS. Los resultados bioinformáticos revelaron que ELMO1 estaba significativamente sobreexpresado en el CRC MSI-H en comparación con el CRC MSS, lo que indica una estrecha asociación entre la expresión de ELMO1 y el estado MSI (Fig. S1 suplementaria). Para validar estos hallazgos, incluimos 80 tejidos tumorales frescos (incluidos 21 tumores MSI-H y 59 tumores MSS) para el análisis transcripcional y una cohorte separada de 72 casos (incluidos 35 tumores MSI-H y 37 tumores MSS) para la expresión de proteínas (Tablas S1 y S2 suplementarias). De manera consistente, la expresión de ELMO1 aumentó significativamente en los tejidos tumorales MSI-H en relación con los tejidos tumorales MSS y los tejidos no tumorales (P < 0,05, Fig. 1A y B). A continuación, se analizaron las correlaciones entre la expresión de ELMO1 y las características clínico-patológicas (Tabla 1). La alta expresión de ELMO1 se correlacionó significativamente con el estado MSI-H (P = 0,017), la metástasis linfática (P = 0,031) y las etapas tardías de TNM (P = 0,025). A continuación, exploramos más a fondo las relaciones entre la sobreexpresión de ELMO1 y las características clínico-patológicas por separado en las cohortes MSI-H y MSS. El análisis clínico-patológico indicó que la metástasis a distancia también se asoció con la expresión de ELMO1 en los pacientes con CRC MSI-H (P = 0,003, Tabla 2). El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con ELMO1 positivo tenían peores resultados clínicos que los pacientes con ELMO1 negativo o la cohorte general de 72 pacientes con CRC (P = 0,032, Fig. 1C). La regresión de Cox multivariante mostró que la regulación al alza de ELMO1 fue un factor pronóstico independiente en 72 pacientes con CRC (Tabla 3). El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que los pacientes con CRC MSI-H con baja expresión de ELMO1 tenían una supervivencia general y una supervivencia específica del cáncer significativamente más largas que aquellos con alta expresión de ELMO1 (P = 0,029 y P = 0,018; Fig. 1D y E). Cabe destacar que no se detectó una correlación significativa en el subgrupo MSS. La regresión de Cox multivariante indicó que la metástasis orgánica, la etapa de TNM y la regulación al alza de ELMO1 fueron factores pronósticos independientes en 35 pacientes con CRC MSI-H (Tabla 4). En conjunto, estos resultados destacan que ELMO1 actúa como un regulador clave en el CRC MSI-H.

Para explorar el papel funcional de ELMO1 en el CRC MSI-H, determinamos sus niveles de proteína en siete líneas celulares de CRC y una línea celular epitelial colónica normal mediante Western blot (Fig. S2A y B suplementaria). Se utilizaron dos ARNs de interferencia (ARNi) para silenciar ELMO1 en HCT116, DLD-1, SW480 y HT-29 (Fig. S2C y D suplementaria). Los ensayos in vitro e in vivo revelaron que el silenciamiento de ELMO1 suprimió significativamente el crecimiento celular en las líneas celulares de CRC MSI-H, HCT116 y DLD-1 (Fig. S3A-C suplementaria). Sin embargo, la reducción de la expresión de ELMO1 no tuvo un impacto aparente en la proliferación celular y la formación de colonias en las líneas celulares de CRC MSS, SW480 y HT-29 (Fig. S4 suplementaria). En conjunto, estos hallazgos indican que la expresión elevada de ELMO1 se correlaciona estrechamente con un pronóstico desfavorable específicamente en pacientes con CRC MSI-H y facilita la proliferación maligna de las células de CRC MSI-H, lo que destaca la necesidad de explorar más a fondo el papel mecanicista de ELMO1 en la promoción de la progresión del CRC MSI-H.

ELMO1 recluta la infiltración de macrófagos M2

Para explorar si ELMO1 desempeña un papel en la interacción entre las células tumorales y las células inmunitarias en el microambiente tumoral del CRC, cuantificamos la infiltración de 22 subconjuntos de células inmunitarias a partir de dos conjuntos de datos GEO utilizando el algoritmo CIBERSORT (Fig. 1E). Los resultados mostraron que los marcadores de macrófagos M2 CD206 y CD163, junto con el marcador de macrófagos pan, CD68, estaban significativamente elevados en el grupo con sobreexpresión de ELMO1 (P < 0,05; Fig. 1G y H). Para investigar la relación entre ELMO1 derivado del tumor y la infiltración de macrófagos M2 in vivo, generamos ratones deficientes en Elmo1 (Elmo1−/−) y establecimos un modelo de ratón de cáncer colorrectal asociado a la colitis inducido por AOM/DSS. En comparación con los ratones de tipo salvaje, los ratones Elmo1−/− desarrollaron significativamente menos lesiones polipoides y más pequeñas, con una reducción de aproximadamente dos veces en el tamaño del tumor (Fig. 2A y B). El inmunohistoquímico, la inmunofluorescencia y los análisis de qRT-PCR confirmaron además que los niveles de expresión de los marcadores de macrófagos M2, incluidos CD68, CD206 y CD163, disminuyeron significativamente en los tejidos de CAC de los ratones Elmo1−/−_ en relación con los controles de tipo salvaje (Fig. 2C-E). En conjunto, estos resultados demuestran que ELMO1 derivado del tumor facilita el reclutamiento de macrófagos M2 a los sitios tumorales.

ELMO1 extracelular facilita el reclutamiento de macrófagos M2

A continuación, exploramos más a fondo cómo ELMO1 media la interacción cruzada entre las células tumorales y los macrófagos M2 in vitro. Las células THP-1 se polarizaron en macrófagos M0 y M2, y posteriormente se realizó un ensayo de migración. Después de 48 horas de incubación, el número de macrófagos M2 migrados se redujo significativamente tras la inducción con células tumorales silenciadas para ELMO1 (Fig. 3A). Además, se estableció un sistema de cocultivo que consistía en macrófagos M0 y células tumorales silenciadas para ELMO1 o con un control de silenciamiento. Los resultados de la citometría de flujo y la qRT-PCR mostraron que la proporción de macrófagos M2 CD206+/CD68+ disminuyó notablemente cuando los macrófagos M0 se cocultivaron con células tumorales con expresión reducida de ELMO1 (Fig. 3B y C; Fig. S5A en el suplemento). La monensina, que se aplicó para modular la liberación de carga extracelular relacionada con los exosomas a una alta concentración [^[24]], abolió la infiltración y polarización de macrófagos M2 desencadenadas por ELMO1 secretado (Fig. 3D-F y Fig. S5B en el suplemento). Los ensayos de inmunoensayo de enlace enzimático (ELISA) mostraron que la expresión de ELMO1 disminuyó notablemente bajo el tratamiento con monensina en las células cancerosas MSI-H (Fig. 3G). Para dilucidar el papel modulador de ELMO1 en los macrófagos M2, se aplicó proteína ELMO1 recombinante, lo que condujo a un aumento notable en la migración de macrófagos M2 (Fig. 3H e I; Fig. S5C en el suplemento). Además, el Western blot reveló que ELMO1 secretado facilitó la polarización de macrófagos M2 específicamente mediante la activación de STAT6 (Fig. 3K).

A continuación, exploramos más a fondo el efecto de los macrófagos M2 en las células CRC MSI-H. Se construyeron líneas celulares ELMO1-positivas (ELMO1(+)) mediante la transfección de cDNA ELMO1 en células CRC MSI-H silenciadas para ELMO1 para experimentos posteriores. Los ensayos in vitro mostraron que las células ELMO1(+) presentaban una proliferación mejorada cuando se incubaron con CM de macrófagos M2 (Fig. 4A-C). Los resultados de xenoinjertos subcutáneos in vivo revelaron que los tumores en el grupo ELMO1(+) crecieron notablemente más después del tratamiento con CM de macrófagos M2 en relación con el grupo M0 (Fig. 4D). Estudios previos han informado que los macrófagos M2 impulsan la iniciación y progresión del tumor mediante la secreción de mediadores pro-tumorales como CCL18 y TGF-β [^[25-28]]. Los ensayos de ELISA y XTT verificaron que los macrófagos M2 secretaron niveles más altos de CCL18, lo que promovió prominentemente la proliferación de células CRC MSI-H ELMO1(+) (Fig. 4E y F). En resumen, los exosomas derivados de las células tumorales ELMO1 indujeron la polarización de macrófagos M2 y la acumulación peritumoral; los macrófagos M2 reclutados secretan posteriormente CCL18, lo que mejora el crecimiento de las células tumorales con sobreexpresión de ELMO1.### ELMO1 facilita el crecimiento tumoral y la acumulación de M2 a través de la metilación dependiente de CCL18/PRMT5

Con base en los hallazgos anteriores, exploramos más a fondo el mecanismo molecular subyacente a la interacción cruzada entre las células tumorales con sobreexpresión de ELMO1 y los macrófagos M2. Se realizó un co-IP combinado con secuenciación de ARN para identificar las principales firmas moleculares correlacionadas con la expresión elevada de ELMO1 (Fig. 5A y B). Observamos que el tratamiento con CCL18 aumentó notablemente la expresión de PRMT5, ARF6 y SRC fosforilada en las células HCT116 y DLD-1 ELMO1(+) (Fig. 5C). Posteriormente, se aplicaron inhibidores farmacológicos específicos dirigidos a ARF6 (NAV-2729), SRC (Dasatinib) y PRMT5 (GSK591) para verificar los cambios en la expresión de estas proteínas. Tras la intervención con el inhibidor, la activación de PRMT5, ARF6 y SRC fosforilada se atenuó obviamente en las células CRC MSI-H ELMO1(+), mientras que la expresión total de SRC permaneció inalterada (Fig. 5D). Notablemente, los resultados de ELISA mostraron que GSK591 redujo significativamente la secreción extracelular de ELMO1 en comparación con los otros dos inhibidores, lo que indica que PRMT5 funciona como un regulador ascendente específico de ELMO1 (Fig. 5E). El ensayo de co-IP confirmó una interacción directa entre PRMT5 y ELMO1 (Fig. 5F). En las células CRC MSI-H tratadas con GSK591, los niveles endógenos de metilación de ELMO1 disminuyeron notablemente (Fig. 5G). En conjunto, estos resultados indicaron que CCL18 secretado de los macrófagos M2 desencadenó que PRMT5 interactuara directamente con ELMO1 y modulara la modificación de metilación de ELMO1.

A continuación, investigamos si el bloqueo farmacológico de PRMT5 afecta la progresión maligna de las células tumorales ELMO1(+) MSI-H. Los ensayos de XTT y formación de colonias revelaron que la inhibición de PRMT5 suprimió notablemente la proliferación de las células CRC MSI-H positivas para ELMO1 (Fig. 6A y B). Además, el efecto antitumoral de GSK591 se validó aún más in vivo utilizando modelos de xenoinjerto tumoral. El tratamiento con GSK591 redujo significativamente el crecimiento y el volumen del tumor del xenoinjerto (Fig. 6C). Se recolectaron tejidos tumorales para la validación mecanicista posterior del inhibidor de PRMT5 in vivo. Los resultados de qRT-PCR mostraron que los marcadores de macrófagos M2 CD206 se redujeron significativamente en el grupo ELMO1-positivo después del tratamiento con GSK591 en relación con el grupo de control con PBS (Fig. 6D). Estos hallazgos sugieren que la focalización de PRMT5 puede servir como una prometedora estrategia terapéutica para el tratamiento de CRC MSI-H positivo para ELMO1.### La metilación de la proteína ELMO1 es un posible objetivo terapéutico para la inmunoterapia del CRC

Para explorar si ELMO1 participa en la regulación de la inmunidad antitumoral, detectamos la expresión de ELMO1, PRMT5 y CD206 en especímenes archivados pre-inmunoterapia de 35 pacientes con CRC MSI-H que recibieron tratamiento posterior con anti-PD-1/PD-L1 (nivolumab, pembrolizumab o atezolizumab), y analizamos además la correlación entre la expresión de los marcadores y los resultados terapéuticos clínicos (Tabla S2 en el suplemento). En los casos resistentes a anti-PD-1 (ejemplificados por el paciente A), los tres marcadores se expresaron en alto grado. Por el contrario, ninguno de los tres proteínas mostró tinción inmunohistoquímica positiva en los casos sensibles a anti-PD-1 (ejemplificados por el paciente D) (Fig. 7A). En los especímenes con expresión indetectable o marginal de PRMT5 (ejemplificados por el paciente B y el paciente C), solo se observó una escasa infiltración del marcador de macrófagos M2 CD206. La prominente correlación positiva de la tinción de CD206 con ELMO1 y PRMT5 indicó que la alta expresión tumoral de ELMO1 y PRMT5 está estrechamente asociada con la resistencia a la terapia anti-PD-1.

Dado que se ha informado que la reducción de la infiltración de TAM similares a M2 se correlaciona con una mejor eficacia inmunoterapéutica en múltiples neoplasias [^[29]], exploramos más a fondo si el bloqueo de PRMT5 podría potenciar la inmunoterapia anti-PD-1 en CRC con sobreexpresión de ELMO1. Como se esperaba, la inhibición farmacológica de PRMT5 mejoró notablemente la eficacia terapéutica del tratamiento anti-PD-1 y suprimió el crecimiento tumoral en modelos de tumor sinérgico MC38 (MSI-H) (Fig. 7B-E). La tinción de inmunohistoquímica confirmó además que el tratamiento combinado con el inhibidor de PRMT5 y el anticuerpo anti-PD-1 redujo notablemente la acumulación de macrófagos M2 dentro de los tejidos tumorales (Fig. 7F).

Estos resultados indicaron que el bloqueo del eje PRMT5/ELMO1 es una prometedora estrategia terapéutica factible para los pacientes con CRC MSI-H con alta expresión de ELMO1.

ELMO1 se sobreexpresa en CRC MSI-H y se asocia con un mal pronóstico

Se realizó un perfilado transcriptómico en tejidos tumorales y muestras de sangre periférica de tres pacientes con CRC MSI-H, tres pacientes con CRC MSS y tejidos cólicos normales de individuos sanos para identificar firmas moleculares específicas del tumor. Se incluyeron además tres conjuntos de datos GEO (GSE13067, GSE13294 y GSE13911) para un análisis bioinformático integrativo, que comprendieron un total de 89 especímenes de CRC MSI-H y 140 especímenes de CRC MSS. Los resultados bioinformáticos revelaron que ELMO1 se reguló al alza significativamente en CRC MSI-H en comparación con CRC MSS, lo que indica una estrecha asociación entre la expresión de ELMO1 y el estado MSI (Fig. S1 en el suplemento). Para validar estos hallazgos, inscribimos 80 tejidos tumorales frescos (incluidos 21 MSI-H y 59 tumores MSS) para el análisis transcripcional y una cohorte separada de 72 casos (incluidos 35 tumores MSI-H y 37 tumores MSS) para la expresión de proteínas (Tablas S1 y S2 en el suplemento). De manera consistente, la expresión de ELMO1 aumentó notablemente en los tejidos tumorales MSI-H en relación con los tejidos tumorales MSS y los tejidos no tumorales (_P