El eje ADAR1-circRAB5A-BIP regula la resistencia a la radioterapia en el cáncer colorrectal mediante la coordinación de la autofagia protectora y la apoptosis.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más común a nivel mundial, con más de 1,5 millones de nuevos casos anualmente.^[1] Desempeña un papel crucial en el manejo de la enfermedad locorregional y ha atraído una atención significativa en los últimos años.^[2], ^[3] A pesar de los avances tecnológicos, la radioresistencia intrínseca o adquirida afecta al 30-40% de los pacientes,^[4], lo que provoca recurrencia y un mal pronóstico. Si bien se ha implicado la desregulación de las vías de reparación del ADN y la señalización oncogénica, la evidencia emergente destaca los ARN no codificantes,^[5], ^[6], en particular los ARN circulares (circARN), como moduladores clave, aunque poco explorados, de las respuestas a la radiación.^[7] Los circARN, formados por el retro-splicing del pre-ARNm, exhiben una expresión específica de tejido y regulan la progresión del cáncer al actuar como "esponjas" de los microARN (miARN), interactuar con proteínas de unión al ARN o incluso codificar péptidos.^[8], ^[9] La desregulación de ciertos circARN siempre modula las vías de señalización al afectar la función de su miARN o proteínas objetivo, exhibiendo así la función de los ARN reguladores.^[10] La evidencia acumulada ha revelado su papel en la quimiorresistencia y la evasión inmune,^[11], pero su participación en la radioresistencia aún no se ha caracterizado en gran medida.

La adaptación al estrés del retículo endoplásmico (RE) ha surgido como un mecanismo de supervivencia en los tumores radioresistentes.^[12] La chaperona BIP, un regulador maestro de la respuesta al estrés del RE (UPR), estabiliza la proteostasis, lo que modula tanto la autofagia pro-supervivencia como la apoptosis en condiciones de estrés extracelular.^[13] El papel de BIP en el equilibrio entre la autofagia y la apoptosis es un arma de doble filo,^[14], en la que, en algunas situaciones, BIP mejora la autofagia y el reciclaje de la UPR para mantener la supervivencia celular e inhibir la apoptosis, lo que contribuye a la radioresistencia.^[15] Sin embargo, la autofagia sobreactivada también conduce a una apoptosis incontrolada. Por lo tanto, revelar el papel de la autofagia en la radioresistencia es clave para descubrir los mecanismos del equilibrio BIP-mediado entre la autofagia y la apoptosis. Específicamente, en el CCR, la función de BIP, su relación con la autofagia y la participación de los circARN reguladores en la radioresistencia merecen una mayor exploración.

La adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN 1 (ADAR1) es una enzima de edición de ARN que cataliza las conversiones de adenosina a inosina (A a I).^[16] Como se ha informado, la sobreexpresión de ADAR1 en los tumores promueve la metástasis y la resistencia a la terapia al alterar el splicing del ARNm o la orientación de los microARN (miARN).^[17] En particular, los elementos Alu, que son secuencias repetitivas específicas de primates que facilitan la biogénesis de los circARN, son puntos críticos para la edición de ADAR1. ADAR1 puede regular la biogénesis de los circARN al modular las secuencias Alu, promoviendo así una expresión diferencial.^[18] Un estudio de Tian et al. también destacó que ADAR1 se sobreexpresaba durante la radioresistencia^[19]; sin embargo, su mecanismo molecular subyacente y su regulación de los circARN aún no están claros.

En el presente estudio, abordamos estas lagunas investigando el papel de un nuevo circARN, circRAB5A, y su red reguladora que involucra a ADAR1 y BIP en la radioresistencia del CCR. Utilizando el conjunto de datos del Gene Expression Omnibus (GEO) y el análisis bioinformático, hipotetizamos que ADAR1 suprime la biogénesis de circRAB5A al unirse a los elementos Alu Jo/Jr en las células de CCR radioresistentes. La deficiencia de circRAB5A modula la estabilidad de BIP a través de la ubiquitinación mediada por TRIM21, coordinando así el equilibrio entre la autofagia y la apoptosis para impulsar la radioresistencia. Nuestros hallazgos proporcionan nuevas perspectivas sobre la base molecular del eje ADAR1/circRAB5A/BIP en la radioresistencia del CCR y destacan posibles objetivos terapéuticos para mejorar la eficacia de la radioterapia.

Materiales y métodos

Muestras de pacientes

Se recolectaron cuarenta pares de tejidos tumorales de CCR y tejidos mucosos colónicos normales adyacentes de pacientes que se sometieron a una resección radical en el Departamento de Cirugía Gastrointestinal del Southwest Medical University (Luzhou, Sichuan, China) entre septiembre de 2022 y septiembre de 2023. Todos los pacientes recibieron radioterapia preoperatoria (45-50 Gy en 25-28 fracciones) como parte de su régimen de tratamiento, y ninguno de ellos había recibido quimioterapia neoadyuvante u otras terapias contra el cáncer antes de la cirugía. Los grupos radiosensibles y radioresistentes se clasificaron de la siguiente manera. Los pacientes se estratificaron en grupos radiosensibles (n= 20) y radioresistentes (n= 20) en función de los resultados clínicos. La radioresistencia se definió como recurrencia tumoral local dentro de los seis meses posteriores a la radioterapia, confirmada por evidencia endoscópica o de imagen (TC o RM). Los pacientes radiosensibles no mostraron recurrencia y lograron una respuesta completa o parcial, según lo evaluado por los criterios RECIST 1.1^[20] dentro de los 12 meses posteriores a la radioterapia. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Southwest Medical University (Número de aprobación: KY2022025) y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

Cultivo celular y reactivos

Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), HCT8 (ATCC CCL-244), HCT116 (ATCC CCL-247) y Caco-2 (ATCC HTB-37), y la línea celular de epitelio colónico humano normal NCM460 (CELLCOOK, CCC-223) se adquirieron de Guangzhou CELLCOOK Biotech Co. (Guangzhou, China). Las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas (Genetic Testing Biotechnology Co., Guangzhou, China). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, EE. UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB, Gibco), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (Gibco) a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Todas las células resultaron negativas para la contaminación por micoplasma antes de la recolección.

Para el análisis de la autofagia celular, el inhibidor de la autofagia, cloroquina (CQ) (Número CAS: 54-05-7), se adquirió de Selleck (EE. UU.) y se utilizó a una concentración de trabajo de 10 μM. El inductor de la autofagia, rapamicina (Rapa) (Número CAS: 53123-88-9), se adquirió de Selleck y se utilizó a una concentración de trabajo de 25 nM. MG132 (Sigma-Aldrich) se utilizó como inhibidor del proteasoma a una concentración de 10 μM. Las células cultivadas se trataron durante 6 horas para bloquear la degradación proteasómica.

Construcción de células radioresistentes

Se establecieron células SW480 radioresistentes (SW480-IR) utilizando un protocolo de irradiación fraccionada para imitar los regímenes de radioterapia clínica. Las células SW480 parentales se cultivaron hasta una confluencia del 60% en placas de 10 cm (Corning, EE. UU.) y se expusieron a 2 Gy por fracción a una dosis de 0,75 Gy/min. Después de cada irradiación, las células se devolvieron a la incubadora (37 °C, 5% CO₂) y se les permitió recuperarse hasta una confluencia del 80% antes de la siguiente fracción. Este proceso se repitió durante 10 fracciones, administrando una dosis acumulada total de 20 Gy durante cinco semanas (dos fracciones por semana). Después de la irradiación final, las células se cultivaron durante 3 semanas adicionales para estabilizar el fenotipo radioresistente.

Ensayo de supervivencia clonogénica

La radiosensibilidad se evaluó utilizando un ensayo de supervivencia clonogénica. Brevemente, las células SW480 y SW480-IR se sembraron a baja densidad de 1000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se expusieron a 0, 2, 4, 6 u 8 Gy de radiación. Después de 14 días, las colonias (>50 células) se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA), se tiñeron con 0,5% de cristal violeta y se contaron utilizando el software ImageJ. Se generaron curvas de respuesta a la dosis utilizando el modelo de un solo objetivo múltiple (y = (1 - e^(-D/D0))^n) en GraphPad Prism 9.0, donde D representa la dosis de radiación (Gy), D0 representa la dosis letal media (Gy) y n representa el número de extrapolación. Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes.

Construcción de plásmidos y transfección celular

La secuencia lineal completa de circRAB5A se amplificó por PCR a partir del ADNc de SW480. El amplicon, complementado con secuencias circulares, se clonó en los sitios EcoRI/BamHI del vector pLCDH-mir (GeneChem, Shanghái, China) utilizando la ligasa de ADN T4 (NEB). El plásmido recombinante (pLCDH-circRAB5A) se verificó mediante secuenciación de Sanger (Tsingke Biotechnology Co., Beijing, China). La construcción de los vectores de expresión de ADAR1, BIP y TRIM21, así como los vectores de expresión recombinantes de BIP de tipo salvaje o truncado, se llevó a cabo por Tsingke Biotechnology Co. mediante la clonación de la secuencia completa o truncada en el vector pcDNA3.1 (Addgene). El vector simulado sirvió como control negativo (NC).

Para la inhibición, se diseñaron y sintetizaron ARN de interferencia pequeños (siARN) dirigidos a circRAB5A (sicircRAB5A), ADAR1 (siADAR1), BIP (siBIP) y TRIM21 por GeneChem. Los efectos fuera del objetivo se minimizaron seleccionando secuencias con menos de dos desajustes con otros transcritos humanos. Las secuencias de siARN se proporcionan en la Tabla S1 complementaria.

Para la transfección con plásmidos, las células SW480 y SW620 se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning) a una densidad de 3 × 10⁵ células/pocillo y se cultivaron hasta una confluencia del 60-70%. La transfección se realizó utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Para la transfección con siARN, las células se sembraron a 2 × 10⁵ células/pocillo en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 50 nM de siARN utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las células se cosecharon 48 horas después de la transfección para los ensayos posteriores.

Identificación de circARN

Para caracterizar la estructura circular de circRAB5A, se llevaron a cabo múltiples ensayos, que incluyeron la PCR divergente/convergente, la digestión con RNasa R, el ensayo de transcripción inversa con oligo (dT) y el ensayo con actinomicina D (ACT-D), según la literatura publicada por Zhou et al.^[21]

Fraccionamiento subcelular

Las fracciones citoplasmáticas y nucleares se aislaron utilizando los reactivos de extracción nuclear y citoplasmática NE-PER (Thermo Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Se realizó una qRT-PCR para detectar la expresión de circRAB5A, utilizando marcadores citoplasmáticos (GAPDH) y nucleares (U6) como controles.

Ensayo de apoptosis celular

La apoptosis se evaluó utilizando un kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC/PI (Solarbio, Beijing, China). Las células (3 × 10⁵/pocillo en placas de 6 pocillos) se irradiaron y se cosecharon 24 horas después. Las células se recolectaron, lavaron y se resuspendieron en tampón de unión. Después de ser teñidas con 2,5 μL de Annexin V-FITC y 2,5 μL de PI, las células apoptóticas se analizaron mediante citometría de flujo (NovoCyte, Agilent, EE. UU.).

Western blot (WB)

Se extrajo la proteína total de las células SW480 y SW620 utilizando el tampón de lisis RIPA (Beyotime, Jiangsu, China) complementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Beyotime) y un cóctel de inhibidores de fosfatasas (Beyotime). La concentración de proteína se cuantificó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime). Se cargaron cantidades iguales de proteínas y se separaron mediante un gel SDS-PAGE del 7,5% al 15% y luego se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% o FBS al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C: anti-BIP (Proteintech, 1:1000), anti-LC3B (CST, 1:2000), anti-p62 (CST, 1:2000), anti-p-Akt (CST, 1:1000), anti-Beclin1 (CST, 1:1000), anti-Flag (Sigma-Aldrich, 1:5000) y anti-GAPDH (Abclonal, 1:5000). Después de eso, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Abclonal, 1:5000) durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, las bandas de proteína se visualizaron utilizando el reactivo ECL Plus (Bio-Rad, EE. UU.) y se obtuvieron imágenes utilizando un sistema de imágenes ChemiDoc (Bio-Rad). La cuantificación se realizó utilizando el software ImageJ, con los niveles de proteína objetivo normalizados a los de GAPDH.

Ensayo de qRT-PCR

Se extrajo ARN total de las células SW480 y SW620 utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se lisaron 1 × 10⁶ células en 1 mL de TRIzol, se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y se mezcló con 200 μL de cloroformo. Después de la centrifugación (12.000 × g durante 15 minutos), se recogió la fase acuosa y el ARN se precipitó con isopropanol, se lavó con etanol al 75% y se resuspendió en agua libre de RNasas. Se midió la pureza (A260/A280 ≥ 1,8) y la concentración del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). A continuación, se realizó la transcripción inversa de 1 μg de ARN a cDNA utilizando el kit de reactivo PrimeScript RT con eliminador de ADN genómico (gADN) (Takara). La mezcla de reacción incluyó 2 μL de tampón 5× gADN Eraser, 1 μL de gADN Eraser y la plantilla de ARN, y se incubó a 42 °C durante 2 minutos para eliminar el ADN genómico. La transcripción inversa se realizó con 1 μL de la mezcla de enzimas PrimeScript RT, 1 μL de la mezcla de cebadores RT y 4 μL de tampón 5× RT, y se incubó a 37 °C durante 15 minutos y a 85 °C durante 5 segundos. Se realizó qPCR utilizando TB Green Premix Ex Taq II (Takara) en un sistema Bio-Rad CFX96 Real-Time. Cada reacción contenía 10 μL de TB Green Mix, 0,8 μL de cebadores directos/reversos de 10 μM, 2 μL de cDNA y 7,2 μL de agua libre de RNasas. Las condiciones del ciclo se establecieron de la siguiente manera: 95 °C durante 30 segundos, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 5 segundos y 60 °C durante 30 segundos. La expresión relativa se calculó utilizando el método 2⁻ΔΔCt y se normalizó con respecto a GAPDH. Las secuencias de los cebadores para genes específicos y controles internos se enumeran en la Tabla S2 del material suplementario.

Imagen de fluorescencia para la detección de la autofagia

La formación de autofagosomas se visualizó utilizando un reportero de doble fluorescencia mCherry-GFP-LC3 (Beyotime). Las células SW480 se transfectaron con el plásmido pCMV-mCherry-GFP-LC3 utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) 24 horas antes del tratamiento con radiación (4 Gy). Las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído 24 horas después de la irradiación y se observaron mediante un microscopio de fluorescencia Zeiss (Leica Microsystems) con un objetivo de inmersión en aceite de 63×. Los autolisosomas (puntos rojos, mCherry+GFP−) y los autofagosomas por célula (puntos amarillos, mCherry+GFP+) se contaron manualmente a partir de tres campos aleatorios utilizando el software ImageJ.

Imagen de fluorescencia e hibridación in situ con fluorescencia (FISH) de circRAB5A

La localización subcelular de circRAB5A se detectó utilizando un kit FISH (Riobio, Guangzhou, China) ^[22] con una sonda de ADN marcada con Cy5 dirigida a la unión de retro-empalme de circRAB5A. Las células se sembraron en portaobjetos, se fijaron con un 4% de PFA, se permeabilizaron con un 0,5% de Triton X-100 (Beyotime) y se hibridaron con una sonda de 50 nM en tampón de hibridación a 37 °C durante la noche. Después del lavado con 2× SSC, los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia (Zeiss).

Análisis bioinformático

La predicción de proteínas de unión al ARN con secuencias Alu Jo/Jr se realizó utilizando el software bioinformático en línea catRAPID ^[23] según las instrucciones del fabricante. Los resultados de la predicción se proporcionan en las tablas S3 y S4 del material suplementario.

Extracción de ARN

Las interacciones ARN-proteína se detectaron utilizando el kit Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down (Thermo Scientific) con sondas biotiniladas dirigidas a circRAB5A (GenePharma, Guangzhou, China). En resumen, se lisaron 1 × 10⁷ células SW480 o SW620 en 1 mL de tampón de lisis de ARN con cóctel de inhibidores de proteasas y 100 U/mL de inhibidor de RNasas (Takara) durante 15 minutos sobre hielo. A continuación, las sondas biotiniladas se mezclaron con 500 μL del lisado celular y se incubaron a 37 °C durante 1 hora para permitir la unión ARN-proteína. A continuación, se añadieron cuentas magnéticas de estreptavidina a la mezcla de sonda-lisado. Las muestras se rotaron a 4 °C durante 2 horas para capturar los complejos biotinilados. A continuación, las cuentas se lavaron con tampón de lavado para eliminar la unión inespecífica. Las proteínas unidas se eluyeron con 50 μL de tampón de elución a 95 °C durante 5 minutos y se analizaron mediante WB. La extracción con sonda NC sirvió como control negativo.

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP)

Las interacciones ARN-proteína se validaron utilizando el kit Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoprecipitation (Millipore) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se lisaron 1 × 10⁷ células SW480 o SW620 en 1 mL de tampón de lisis RIP que contenía cóctel de inhibidores de proteasas y 100 U/mL de inhibidor de RNasas durante 30 minutos sobre hielo. A continuación, las cuentas magnéticas se lavaron con tampón de lavado RIP y se incubaron con 5 μg de anticuerpo anti-BIP (CST) o IgG normal (Millipore, control negativo) a 4 °C durante 2 horas. A continuación, se añadieron los lisados (500 μL) a las cuentas unidas al anticuerpo y se rotaron a 4 °C durante la noche para co-inmunoprecipitar los complejos ARN-proteína. Al día siguiente, las cuentas se lavaron con tampón de lavado RIP y el ARN unido se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se analizó mediante qRT-PCR.

Ensayo de ubiquitinación

La ubiquitinación de BIP se evaluó utilizando la co-inmunoprecipitación (co-IP) para detectar la conjugación de ubiquitina. Brevemente, las células SW480 se transfectaron con un plásmido de sobreexpresión de circRAB5A, sicircRAB5A o controles respectivos durante 48 horas. Para bloquear la degradación proteasómica, las células se trataron con 10 μM de MG132 (Sigma-Aldrich) durante 6 horas antes de la lisis. A continuación, las células se lisaron en 500 μL de tampón de lisis IP (Beyotime) suplementado con cóctel de inhibidores de proteasas, cóctel de inhibidores de fosfatasas y 10 mM de N-etilmaleimida (Sigma-Aldrich). Los lisados se incubaron sobre hielo durante 30 minutos y, a continuación, se centrifugaron a 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, tras lo cual se recogieron los sobrenadantes. A continuación, se pre-limpiaron 500 μg de proteína total con 20 μL de cuentas de agarosa proteína A/G (Invitrogen) durante 1 hora a 4 °C. Los sobrenadantes se incubaron con 2 μg de anticuerpo anti-BIP (CST) o IgG normal (Millipore, control negativo) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 20 μL de cuentas de agarosa proteína A/G y se rotaron durante 2 horas a 4 °C para capturar los complejos anticuerpo-proteína. Las cuentas se lavaron con tampón de lisis IP y las proteínas unidas se eluyeron y se analizaron mediante WB.

Estudio con animales

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica del Suroeste (Número de aprobación: swmu20230056) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE ^[24]. Se compraron un total de 30 ratones BALB/c hembra de cuatro semanas de edad (grado SPF) a Hunan SJA Laboratory Animal Co. (Hunan, China). Los ratones se alojaron en condiciones controladas (22 °C ± 2 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 horas) con acceso libre a alimentos y agua. El silenciamiento estable de circRAB5A y BIP se logró mediante lentivirus que expresaba shRNA dirigido a circRAB5A (sh-circRAB5A) y BIP (sh-BIP) y se verificó mediante qRT-PCR. Se establecieron xenoinjertos de CRC mediante la inyección subcutánea de 5 × 10⁶ células SW480 en la fosa axilar derecha de los ratones. Cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 75-100 mm³ (7 días después de la inyección), los ratones se asignaron aleatoriamente a cinco grupos (n = 6 por grupo) utilizando un método de números aleatorios. Antes de la irradiación tumoral, se anestesiaron todos los ratones utilizando una mezcla de isoflurano al 5% y oxígeno para una inducción rápida de la anestesia y se mantuvo una concentración de isoflurano del 1,5-2% durante el procedimiento de irradiación para inducir un plano de anestesia estable, minimizando al mismo tiempo el estrés respiratorio y cardiovascular. A continuación, los ratones recibieron irradiación tumoral local utilizando un irradiador biológico X-RAD 320 (Precision X-ray, EE. UU.) a una dosis de 0,5 Gy/min. Los ratones del grupo sh-NC + radiación recibieron 3 Gy en 2 fracciones (días consecutivos), y los del grupo sh-BIP recibieron una dosis única de 2 Gy. El crecimiento tumoral se controló dos veces por semana utilizando un calibrador. El volumen tumoral se calculó utilizando la siguiente fórmula: volumen (mm³) = 0,5 × ancho² × longitud. Cuatro semanas después de la implantación tumoral, se sacrificaron los ratones mediante una inyección intraperitoneal de tribromoetanol (20 μL/g, AbMole, EE. UU.) seguida del método de dislocación cervical. Por último, se recogieron los tumores, se pesaron y se procesaron para su posterior análisis.

Inmunohistoquímica y tinción TUNEL

Los tejidos tumorales de los xenoinjertos se fijaron en un 4% de PFA, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm de grosor. A continuación, las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se lavaron con PBS. Después de la incubación con un 3% de H₂O₂ para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, las secciones se trataron con una solución de BSA al 5% (Beyotime) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario, conejo anti-Ki67 (Abclonal), se diluyó 1:200 con PBS y las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, el anticuerpo secundario, HRP de cabra anti-conejo (Abclonal), se diluyó 1:400 con PBS y se incubó con las secciones durante 2 horas a temperatura ambiente. Se utilizó un kit de tinción DAB (Abcam, EE. UU.) para desarrollar un color marrón. La tinción TUNEL se realizó según el protocolo del fabricante utilizando un kit de tinción TUNEL (Beyotime Biotechnology). Por último, los núcleos se tiñeron con hematoxilina y se adquirieron imágenes utilizando un microscopio Olympus (Japón).

Análisis GEO

Se identificaron los circRNAs diferencialmente expresados en el CRC resistente a la radiación utilizando datos transcriptómicos disponibles públicamente de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Se descargaron, preprocesaron y visualizaron los datos brutos del conjunto de datos GSE186940 de Shao. Y. et al. ^[25] utilizando R 4.3.1. Los umbrales de los circRNAs diferencialmente expresados se establecieron en: |log₂(cambio de pliegue)| > 1, FDR < 0,05. Se excluyeron aquellos con un recuento de expresión cero en el grupo radiosensible o resistente a la radiación.

Análisis estadísticos

Todos los datos experimentales se obtuvieron de al menos tres réplicas independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) y R versión 4.3.1. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Para las comparaciones entre dos grupos, se aplicó la prueba t de Student a los datos distribuidos normalmente con varianzas homogéneas, mientras que se utilizó la prueba de Mann-Whitney U para los datos no distribuidos normalmente o con heteroscedasticidad. Para las comparaciones entre tres o más grupos, se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. El análisis de correlación se realizó con GraphPad utilizando un modelo de regresión lineal simple. La supervivencia general se estimó utilizando el método de Kaplan-Meier y se comparó entre los grupos utilizando la prueba de rango logarítmico. La significación estadística se definió como p < 0,05, siendo p < 0,01 y p < 0,001 indicativos de una alta significación.

Muestras de pacientes

Se recogieron cuarenta pares de tejidos tumorales de CRC y tejidos mucosos colónicos normales adyacentes de pacientes que se sometieron a una resección radical en el Departamento de Cirugía Gastrointestinal del Southwest Medical University (Luzhou, Sichuan, China) entre septiembre de 2022 y septiembre de 2023. Todos los pacientes recibieron radioterapia preoperatoria (45-50 Gy en 25-28 fracciones) como parte de su régimen de tratamiento, y ninguno de ellos había recibido quimioterapia neoadyuvante u otras terapias contra el cáncer antes de la cirugía. Los grupos radiosensible y resistente a la radiación se clasificaron de la siguiente manera. Los pacientes se estratificaron en grupos radiosensibles (n = 20) y resistentes a la radiación (n = 20) en función de los resultados clínicos. La resistencia a la radiación se definió como la recurrencia tumoral local dentro de los seis meses posteriores a la radioterapia, confirmada por pruebas endoscópicas o de imagen (TC o RM). Los pacientes radiosensibles no mostraron recurrencia y lograron una respuesta completa o parcial, según lo evaluado por los criterios RECIST 1.1 ^[20] dentro de los 12 meses posteriores a la radioterapia. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica del Suroeste (Número de aprobación: KY2022025) y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

Cultivo celular y reactivos

Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), HCT8 (ATCC CCL-244), HCT116 (ATCC CCL-247) y Caco-2 (ATCC HTB-37), y la línea celular normal de epitelio de colon humano NCM460 (CELLCOOK, CCC-223) se adquirieron de Guangzhou CELLCOOK Biotech Co. (Guangzhou, China). La autenticación de las líneas celulares se realizó mediante el análisis de repeticiones tándem cortas (Genetic Testing Biotechnology Co., Guangzhou, China). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (Gibco) a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Todas las células resultaron negativas para la contaminación por micoplasma antes de su recolección.

Para el análisis de la autofagia celular, el inhibidor de la autofagia, cloroquina (CQ) (CAS No. 54-05-7), se adquirió de Selleck (EE. UU.) y se utilizó a una concentración de trabajo de 10 μM. El inductor de la autofagia, rapamicina (Rapa) (CAS No. 53123-88-9), se adquirió de Selleck y se utilizó a una concentración de trabajo de 25 nM. MG132 (Sigma-Aldrich) se utilizó como inhibidor del proteasoma a una concentración de 10 μM. Las células cultivadas se trataron durante 6 h para bloquear la degradación proteasómica.

Construcción de células resistentes a la radiación

Se establecieron células SW480 resistentes a la irradiación (SW480-IR) utilizando un protocolo de irradiación fraccionada para simular los regímenes de radioterapia clínica. Las células SW480 parentales se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 60% en placas de 10 cm (Corning, EE. UU.) y se expusieron a 2 Gy por fracción a una dosis de 0,75 Gy/min. Después de cada irradiación, las células se devolvieron a la incubadora (37 °C, 5% de CO₂) y se les permitió recuperarse hasta alcanzar una confluencia del 80% antes de la siguiente fracción. Este proceso se repitió durante 10 fracciones, administrando una dosis acumulada total de 20 Gy durante cinco semanas (dos fracciones por semana). Después de la irradiación final, las células se cultivaron durante 3 semanas adicionales para estabilizar el fenotipo radioresistente.

Ensayo de supervivencia clonogénica

La radiosensibilidad se evaluó utilizando un ensayo de supervivencia clonogénica. Brevemente, las células SW480 y SW480-IR se sembraron a una baja densidad de 1000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se expusieron a 0, 2, 4, 6 u 8 Gy de radiación. Después de 14 días, las colonias (>50 células) se fijaron con un 4% de paraformaldehído (PFA), se tiñeron con un 0,5% de cristal violeta y se contaron utilizando el software ImageJ. Se generaron curvas de respuesta a la dosis utilizando el modelo de un solo golpe con múltiples objetivos (y = (1 − e−D/D0)n) en GraphPad Prism 9.0, donde D representa la dosis de radiación (Gy), D0 representa la dosis letal media (Gy) y n representa el número de extrapolación. Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes.

Construcción de plásmidos y transfección celular

La secuencia lineal completa de circRAB5A se amplificó por PCR a partir del ADNc de SW480. El amplicón, suplementado con secuencias circulares, se clonó en los sitios EcoRI/BamHI del vector pLCDH-mir (GeneChem, Shanghái, China) utilizando la ligasa de ADN T4 (NEB). El plásmido recombinante (pLCDH-circRAB5A) se verificó mediante secuenciación de Sanger (Tsingke Biotechnology Co., Pekín, China). La construcción de los vectores de expresión de ADAR1, BIP y TRIM21, así como los vectores de expresión recombinantes truncados o de tipo salvaje de BIP, se llevó a cabo por Tsingke Biotechnology Co. mediante la clonación de la secuencia completa o truncada en el vector pcDNA3.1 (Addgene). El vector simulado sirvió como control negativo (NC).

Para la inhibición génica, se diseñaron y sintetizaron ARN de interferencia pequeños (siARN) dirigidos a circRAB5A (sicircRAB5A), ADAR1 (siADAR1), BIP (siBIP) y TRIM21 (siTRIM21) por GeneChem. Se minimizó los efectos fuera del objetivo seleccionando secuencias con menos de dos desajustes con otros transcritos humanos. Las secuencias de siARN se proporcionan en la Tabla S1 del material suplementario.

Para la transfección con plásmidos, las células SW480 y SW620 se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning) a una densidad de 3 × 10⁵ células/pocillo y se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 60-70%. La transfección se realizó utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Para la transfección con siARN, las células se sembraron a 2 × 10⁵ células/pocillo en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 50 nM de siARN utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las células se recolectaron 48 h después de la transfección para los ensayos posteriores.

Identificación de circARN

Para caracterizar la estructura circular de circRAB5A, se realizaron varios ensayos, que incluyeron PCR divergente/convergente, digestión con RNasa R, ensayo de transcripción inversa con oligo (dT) y ensayo con actinomicina D (ACT-D), según la literatura publicada por Zhou et al.^[21].

Fraccionamiento subcelular

Las fracciones citoplasmáticas y nucleares se aislaron utilizando los reactivos de extracción nuclear y citoplasmática NE-PER (Thermo Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Se realizó una qRT-PCR para detectar la expresión de circRAB5A, utilizando marcadores citoplasmáticos (GAPDH) y nucleares (U6) como controles.

Ensayo de apoptosis celular

La apoptosis se evaluó utilizando un kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC/PI (Solarbio, Pekín, China). Las células (3 × 10⁵/pocillo en placas de 6 pocillos) se irradiaron y se recolectaron 24 h después. Las células se recolectaron, se lavaron y se resuspendieron en tampón de unión. Después de la tinción con 2,5 μL de Annexin V-FITC y 2,5 μL de PI, las células apoptóticas se analizaron mediante citometría de flujo (NovoCyte, Agilent, EE. UU.).

Western blot (WB)

Se extrajo la proteína total de las células SW480 y SW620 utilizando el tampón de lisis RIPA (Beyotime, Jiangsu, China) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Beyotime) y un cóctel de inhibidores de fosfatasas (Beyotime). La concentración de proteína se cuantificó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime). Se cargaron cantidades iguales de proteínas y se separaron mediante un gel SDS-PAGE del 7,5% al 15% y luego se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada o un 3% de FBS durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C: anti-BIP (Proteintech, 1:1000), anti-LC3B (CST, 1:2000), anti-p62 (CST, 1:2000), anti-p-Akt (CST, 1:1000), anti-Beclin1 (CST, 1:1000), anti-Flag (Sigma-Aldrich, 1:5000) y anti-GAPDH (Abclonal, 1:5000). Después de eso, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Abclonal, 1:5000) durante 2 h a temperatura ambiente. Finalmente, las bandas de proteína se visualizaron utilizando el reactivo ECL Plus (Bio-Rad, EE. UU.) y se obtuvieron imágenes utilizando un sistema de imagen ChemiDoc (Bio-Rad). La cuantificación se realizó utilizando el software ImageJ, con los niveles de proteína diana normalizados con respecto a los de GAPDH.

Ensayo de qRT-PCR

Se extrajo el ARN total de las células SW480 y SW620 utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se lisaron 1 × 10⁶ células en 1 mL de TRIzol, se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente y se mezclaron con 200 μL de cloroformo. Después de la centrifugación (12 000 × g durante 15 min), se recolectó la fase acuosa y el ARN se precipitó con isopropanol, se lavó con etanol al 75% y se resuspendió en agua libre de RNasas. Se midió la pureza (A260/A280 ≥ 1,8) y la concentración del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). A continuación, se transcribió 1 μg de ARN a ADNc utilizando el kit de reactivo RT PrimeScript con ADN genómico (gADN) Eraser (Takara). La mezcla de reacción incluyó 2 μL de tampón 5× gADN Eraser, 1 μL de gADN Eraser y la plantilla de ARN, y se incubó a 42 °C durante 2 min para eliminar el ADN genómico. La transcripción inversa se realizó con 1 μL de la mezcla de enzimas RT PrimeScript, 1 μL de la mezcla de cebadores RT y 4 μL de tampón 5× RT, y se incubó a 37 °C durante 15 min y a 85 °C durante 5 s. La qPCR se realizó utilizando TB Green Premix Ex Taq II (Takara) en un sistema de tiempo real Bio-Rad CFX96. Cada reacción contenía 10 μL de TB Green Mix, 0,8 μL de 10 μM de cebadores directo/inverso, 2 μL de ADNc y 7,2 μL de agua libre de RNasas. Las condiciones del ciclo se establecieron de la siguiente manera: 95 °C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s. La expresión relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt y se normalizó con respecto a GAPDH. Las secuencias de los cebadores para los genes específicos y los controles internos se enumeran en la Tabla S2 del material suplementario.

Imagen de fluorescencia para la detección de la autofagia

La formación de autofagosomas se visualizó utilizando el reportero de doble fluorescencia mCherry-GFP-LC3 (Beyotime). Las células SW480 se transfectaron con el plásmido pCMV-mCherry-GFP-LC3 utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) 24 h antes del tratamiento con radiación (4 Gy). Las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído 24 h después de la irradiación y se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss (Leica Microsystems) con un objetivo de inmersión en aceite de 63×. Los autolisosomas (puntos rojos, mCherry+GFP−) y los autofagosomas por célula (puntos amarillos, mCherry+GFP+) se contaron manualmente a partir de tres campos aleatorios utilizando el software ImageJ.

Imagen de fluorescencia e hibridación in situ fluorescente (FISH) de circRAB5A

La localización subcelular de circRAB5A se detectó utilizando un kit FISH (Riobio, Guangzhou, China)^[22] con una sonda de ADN marcada con Cy5 dirigida a la unión de empalme posterior de circRAB5A. Las células se sembraron en portaobjetos, se fijaron con un 4% de PFA, se permeabilizaron con un 0,5% de Triton X-100 (Beyotime) y se hibridaron con una sonda de 50 nM en tampón de hibridación a 37 °C durante la noche. Después del lavado con 2× SSC, los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia (Zeiss).

Análisis bioinformático

La predicción de las proteínas de unión al ARN con secuencias Alu Jo/Jr se realizó utilizando el software bioinformático en línea catRAPID^[23] según las instrucciones del fabricante. Los resultados de la predicción se proporcionan en las Tablas S3 y S4 del material suplementario.

Extracción de ARN-proteínas

Las interacciones ARN-proteínas se detectaron utilizando el kit de extracción de proteínas magnéticas Pierce RNA-Protein Pull-Down (Thermo Scientific) con sondas biotiniladas dirigidas a circRAB5A (GenePharma, Guangzhou, China). En resumen, se lisaron 1 × 10⁷ células SW480 o SW620 en 1 mL de tampón de lisis de ARN con un cóctel de inhibidores de proteasas y 100 U/mL de inhibidor de RNasas (Takara) durante 15 min sobre hielo. A continuación, se mezclaron las sondas biotiniladas con 500 μL del lisado celular y se incubaron a 37 °C durante 1 h para permitir la unión ARN-proteínas. A continuación, se añadieron las cuentas magnéticas de estreptavidina a la mezcla de sonda-lisado. Las muestras se rotaron a 4 °C durante 2 h para capturar los complejos biotinilados. A continuación, las cuentas se lavaron con tampón de lavado para eliminar la unión inespecífica. Las proteínas unidas se eluyeron con 50 μL de tampón de elución a 95 °C durante 5 min y se analizaron mediante WB. La extracción con sonda NC sirvió como control negativo.

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP)

Las interacciones ARN-proteínas se validaron utilizando el kit de inmunoprecipitación de proteínas de unión a ARN Magna RIP (Millipore) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se lisaron 1 × 10⁷ células SW480 o SW620 en 1 mL de tampón de lisis RIP que contenía un cóctel de inhibidores de proteasas y 100 U/mL de inhibidor de RNasas durante 30 min sobre hielo. A continuación, las cuentas magnéticas se lavaron con tampón de lavado RIP y se incubaron con 5 μg de anticuerpo anti-BIP (CST) o IgG normal (Millipore, control negativo) a 4 °C durante 2 h. A continuación, se añadieron los lisados (500 μL) a las cuentas unidas al anticuerpo y se rotaron a 4 °C durante la noche para co-inmunoprecipitar los complejos ARN-proteínas. Al día siguiente, las cuentas se lavaron con tampón de lavado RIP y el ARN unido se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se analizó mediante qRT-PCR.

Ensayo de ubiquitinación

La ubiquitinación de BIP se evaluó mediante co-inmunoprecipitación (co-IP) para detectar la conjugación de ubiquitina. Brevemente, las células SW480 se transfectaron con un plásmido de sobreexpresión de circRAB5A, sicircRAB5A o los respectivos controles durante 48 horas. Para bloquear la degradación proteasómica, las células se trataron con 10 μM de MG132 (Sigma-Aldrich) durante 6 horas antes de la lisis. A continuación, las células se lisaron en 500 μL de tampón de lisis IP (Beyotime) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas, un cóctel de inhibidores de fosfatasas y 10 mM de N-etilmaleimida (Sigma‒Aldrich). Los lisados se incubaron sobre hielo durante 30 minutos y luego se centrifugaron a 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, tras lo cual se recogieron los sobrenadantes. A continuación, se pre-clarificaron 500 μg de proteína total con 20 μL de cuentas de proteína A/G (Invitrogen) durante 1 hora a 4 °C. Los sobrenadantes se incubaron con 2 μg de anticuerpo anti-BIP (CST) o IgG normal (Millipore, control negativo) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 20 μL de cuentas de proteína A/G y se agitaron durante 2 horas a 4 °C para capturar los complejos anticuerpo-proteína. Las cuentas se lavaron con tampón de lisis IP y las proteínas unidas se eluyeron y se analizaron mediante WB.

Estudio en animales

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica del Suroeste (Número de aprobación: swmu20230056) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE.^[24] Se adquirieron un total de 30 ratones BALB/c nude hembra de cuatro semanas de edad (grado SPF) de Hunan SJA Laboratory Animal Co. (Hunan, China). Los ratones se alojaron en condiciones controladas (22 °C ± 2 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 horas) con acceso libre a alimentos y agua. El silenciamiento estable de circRAB5A y BIP se logró mediante lentivirus que expresaba shRNA dirigido a circRAB5A (sh-circRAB5A) y BIP (sh-BIP), y se verificó mediante qRT-PCR. Se establecieron xenoinjertos de CRC mediante inyección subcutánea de 5 × 10⁶ células SW480 en la fosa axilar derecha de los ratones. Cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 75-100 mm³ (7 días después de la inyección), los ratones se asignaron aleatoriamente a cinco grupos (n = 6 por grupo) utilizando un método de tabla de números aleatorios. Antes de la irradiación tumoral, todos los ratones fueron anestesiados con una mezcla de 5% de isoflurano y oxígeno para una inducción rápida de la anestesia y se mantuvo una concentración de isoflurano del 1,5-2% durante el procedimiento de irradiación para inducir un plano de anestesia estable, minimizando al mismo tiempo el estrés respiratorio y cardiovascular. A continuación, los ratones recibieron irradiación tumoral local utilizando un Irradiador Biológico X-RAD 320 (Precision X-ray, EE. UU.) a una dosis de 0,5 Gy/min. Los ratones del grupo sh-NC + radiación recibieron 3 Gy en 2 fracciones (días consecutivos), y los del grupo sh-BIP recibieron una dosis única de 2 Gy. El crecimiento tumoral se controló dos veces por semana utilizando calibradores. El volumen tumoral se calculó utilizando la siguiente fórmula: volumen (mm³) = 0,5 × ancho² × longitud. Cuatro semanas después de la implantación del tumor, los ratones fueron sacrificados mediante una inyección intraperitoneal de tribromoetanol (20 μL/g, AbMole, EE. UU.) siguiendo el método de dislocación cervical. Por último, se recolectaron los tumores, se pesaron y se procesaron para su posterior análisis.

Inmunohistoquímica y tinción TUNEL

Los tejidos tumorales de xenoinjertos se fijaron en PFA al 4%, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm. Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se lavaron con PBS. Después de la incubación con 3% de H₂O₂ para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, las secciones se trataron con una solución de BSA al 5% (Beyotime) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario, conejo anti-Ki67 (Abclonal), se diluyó 1:200 con PBS y las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, el anticuerpo secundario, cabra anti-conejo HRP (Abclonal), se diluyó 1:400 con PBS y se incubó con las secciones durante 2 horas a temperatura ambiente. Se utilizó un kit de tinción DAB (Abcam, EE. UU.) para desarrollar un color marrón. La tinción TUNEL se realizó según el protocolo del fabricante utilizando un kit de tinción TUNEL (Beyotime Biotechnology). Finalmente, los núcleos se tiñeron con hematoxilina y se adquirieron imágenes utilizando un microscopio Olympus (Japón).

Análisis GEO

Se identificaron los circRNAs expresados diferencialmente en CRC radioresistente utilizando datos transcriptómicos disponibles públicamente de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Se descargaron, preprocesaron y visualizaron los datos brutos del conjunto de datos GSE186940 de Shao. Y. et al.^[25] utilizando R 4.3.1. Los umbrales de los circRNAs expresados diferencialmente se establecieron como: |log₂(cambio de expresión)| > 1, FDR < 0,05. Se excluyeron aquellos con un recuento de expresión cero en el grupo radiosensible o radioresistente.

Análisis estadísticos

Todos los datos experimentales se obtuvieron de al menos tres réplicas individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) y R versión 4.3.1. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Para las comparaciones entre dos grupos, se aplicó la prueba t de Student a los datos distribuidos normalmente con varianzas homogéneas, mientras que se utilizó la prueba de Mann-Whitney U para los datos no distribuidos normalmente o heterocedásticos. Para las comparaciones entre tres o más grupos, se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey para la diferencia significativa honesta (HSD). El análisis de correlación se realizó con GraphPad utilizando un modelo de regresión lineal simple. La supervivencia general se estimó utilizando el método de Kaplan-Meier y se comparó entre los grupos utilizando la prueba de rango logarítmico. La significación estadística se definió como p < 0,05, con p < 0,01 y p < 0,001 que indican una alta significación.

Resultados

CircRAB5A está significativamente reducido en los tejidos y líneas celulares de cáncer colorrectal radioresistente

Para identificar los circRNAs asociados con la radioresistencia, analizamos el conjunto de datos GEO GSE186940, que incluye los perfiles transcriptómicos de ocho tejidos de pacientes con CRC radiosensibles y ocho tejidos radioresistentes. Los criterios de selección se establecieron de la siguiente manera: (1) umbral de expresión diferencial (|log₂(cambio de expresión)| > 1, FDR < 0,05). (2) El recuento de expresión original no era cero. (3) poseer características típicas de circRNA: secuencias disponibles en circBase y longitudes adecuadas (200-500 nt), y formadas por el retro-splicing de exones. (4) No reportado. Con base en esto, se centró en hsa-circ-0123297 (designado circRAB5A), que fue el circRNA más significativamente reducido en las muestras radioresistentes (Figura 1A). Para validar este hallazgo, examinamos la expresión de circRAB5A en 40 pares de muestras de tejido de CRC clínico (20 radiosensibles, 20 radioresistentes y tejidos mucosos normales adyacentes). La qRT-PCR confirmó que los niveles de circRAB5A se redujeron significativamente en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos mucosos normales adyacentes y disminuyeron aún más en las muestras radioresistentes en comparación con las muestras de CRC radiosensibles (Figura 1B). Estos resultados fueron consistentes con el conjunto de datos GEO que mostraba que circRAB5A estaba reducido en los tejidos de CRC radioresistentes.

A continuación, evaluamos la expresión de circRAB5A en las líneas celulares de CRC. La qRT-PCR mostró que circRAB5A estaba reducido en las líneas celulares de CRC (SW480, SW620, HCT116 y Caco-2) en comparación con la línea celular de epitelio de colon normal NCM460 (Figura 1C). Para confirmar su naturaleza circular, realizamos una PCR con cebadores divergentes, en la que los cebadores divergentes amplificaron la unión de retro-splicing en el ADNc pero no en el ADN genómico (ADNg), y el secuenciamiento de Sanger verificó la secuencia de retro-splicing (Figura 1D y E). La fraccionamiento subcelular y los ensayos FISH demostraron que circRAB5A se localizaba predominantemente en el citoplasma (Figura 1F y G). El tratamiento con ACT-D reveló que circRAB5A tenía una vida media más larga que el RAB5A lineal (Figura S1A suplementaria), lo que confirmó su estabilidad. Los ensayos de digestión con RNase R mostraron que circRAB5A era resistente a la degradación por exonucleasa, a diferencia del ARNm lineal de RAB5A (Figura S1B suplementaria). Además, circRAB5A no se transcribió inversamente mediante cebadores de oligo (dT), lo que indica una estructura no poliadenilada (Figura S1C suplementaria). En conjunto, estos datos confirman que circRAB5A es un ARN circular estable, enriquecido en el citoplasma, que se identificó por primera vez como reducido en el CRC radioresistente.

ADAR1 suprime la biogénesis de circRAB5A mediante la unión a los elementos Alu Jo/Jr

Para investigar el mecanismo subyacente a la reducción de circRAB5A en la radioresistencia, establecimos células SW480 radioresistentes (SW480-IR) mediante 10 fracciones de 2 Gy de irradiación (total 20 Gy durante 5 semanas), lo que se validó mediante un ensayo de supervivencia clonogénica (Figura 2A y Figura S1D suplementaria). La qRT-PCR confirmó que los niveles de circRAB5A eran notablemente más bajos en las células SW480-IR que en las células SW480 parentales, mientras que la expresión del ARNm lineal de RAB5A permaneció sin cambios (Figura 2B), lo que indica una eficiencia de retro-splicing reducida en lugar de una disminución de la transcripción del gen huésped.

A continuación, para dilucidar el mecanismo molecular subyacente a la reducción de circRAB5A, realizamos un ensayo mecanístico. Dado que las secuencias conservadas de Alu en los intrones flanqueantes eran responsables de la formación de circRNA, exploramos los elementos Alu Jo y Alu Jr alrededor de la secuencia lineal de circRAB5A y si participan en la biogénesis de circRAB5A. Construimos vectores de expresión que contenían el ARNm pre-RAB5A de longitud completa o variantes truncadas de Alu Jo/Jr (Figura 2C). La qRT-PCR reveló que solo el vector de longitud completa (que contenía tanto Jo como Jr) aumentó significativamente la biogénesis de circRAB5A (Figura 2D). A continuación, mediante el software en línea catRAPID, los resultados predijeron que las proteínas de unión al ARN (RBPs) ADAR1 y DHX9 podrían interactuar con las secuencias Alu Jo y Jr (Tablas S3 y S4 suplementarias). Primero, realizamos una qRT-PCR para explorar si las expresiones de estas RBPs se alteraron durante la irradiación, incluyendo ADAR1, DHX9 y QKI (control negativo). Los resultados mostraron que solo la expresión de ADAR1 se incrementó significativamente en las células SW480-IR, mientras que los niveles de DHX9 y QKI no cambiaron (Figura 2E). En segundo lugar, para probar si ADAR1 modula circRAB5A a través de Alu Jo/Jr, realizamos una inmunoprecipitación de ARN (RIP) y encontramos que los anticuerpos anti-ADAR1 enriquecieron significativamente las secuencias Alu Jo/Jr en comparación con el control IgG (Figura 2F), lo que confirmó la unión directa. La sobreexpresión de ADAR1 en las células SW480 parentales redujo los niveles de circRAB5A (Figura 2G), mientras que el silenciamiento de ADAR1 en las células SW480-IR restauró la expresión de circRAB5A (Figura 2H). Por último, para dilucidar la relación entre ADAR1 y circRAB5A en los tejidos de CRC, también validamos la expresión de ADAR1 en 20 muestras de CRC radiosensibles y 20 radioresistentes. El resultado de la PCR mostró que, si bien ADAR1 se sobreexpresó en el grupo radioresistente (Figura S1E suplementaria), el análisis de correlación no mostró una relación significativa entre ADAR1 y circRAB5A en las muestras de CRC (Figura S1F suplementaria; R = -0,173, p = 0,283). Esto indica que ADAR1 probablemente no es la única RBP que regula la biogénesis de circRAB5A. En conjunto, estos datos demuestran que la sobreexpresión de ADAR1 en el CRC radioresistente suprime la biogénesis de circRAB5A al unirse a los elementos Alu Jo/Jr, reduciendo así la eficiencia del retro-splicing.

El agotamiento de circRAB5A confiere radioresistencia al promover la autofagia protectora e inhibir la apoptosis

Para determinar el papel funcional de circRAB5A en la radioresistencia, realizamos ensayos de supervivencia clonogénica utilizando células de CRC con expresión alterada de circRAB5A. En las células SW620, la transfección con sicircRAB5A (eficiencia de silenciamiento > 50%, Figura S2A complementaria) aumentó significativamente la supervivencia de las colonias de 0 a 8 Gy y elevó la viabilidad celular a 4 Gy (Figura 3A y Figura S2C complementaria). Por el contrario, la expresión forzada de circRAB5A en las células SW480 redujo la supervivencia de las colonias, disminuyó la viabilidad celular a 4 Gy y sensibilizó las células a la radiación (Figura 3B y Figura S2B y D complementarias). Estos resultados confirmaron que circRAB5A regula negativamente la radioresistencia en las células de CRC. A continuación, evaluamos la apoptosis mediante tinción con Annexin V/PI. Después de 4 Gy de radiación, las células SW620 transfectadas con sicircRAB5A mostraron una reducción significativa en las células apoptóticas, mientras que las células SW480 con sobreexpresión de circRAB5A exhibieron un aumento en la apoptosis (Figura 3D y E).

Dado el papel de la autofagia en el mantenimiento de la homeostasis intracelular en respuesta a diversos estímulos, evaluamos el papel protector de la autofagia en la radioresistencia de las células de CRC y el mecanismo subyacente de circRAB5A. Tratamos las células SW480 con el inhibidor de la autofagia cloroquina (CQ, 10 μM) y se analizaron las alteraciones en las proteínas LC3-II y p62 mediante Western blot (Figura S3D complementaria). Además, los resultados mostraron que CQ disminuyó notablemente la viabilidad celular y aumentó las células apoptóticas después del tratamiento con radiación en comparación con el grupo control (DMSO) (Figura S3A–C complementaria), lo que confirmó el papel protector de la autofagia contra la radiación en las células de CRC. A continuación, evaluamos el flujo autofágico utilizando Western blot y reporteros de doble fluorescencia mCherry-GFP-LC3. En las células SW620, sicircRAB5A disminuyó p62 y aumentó LC3-II (Figura 3C). Por el contrario, en las células SW480, la sobreexpresión de circRAB5A redujo la expresión de LC3-II, lo que indica una inhibición de la autofagia, lo que se confirmó aún más mediante la reducción de la formación de autolisosomas (puntos mCherry+GFP−) (Figura 3F y G). Para revelar aún más el papel de circRAB5A en la regulación de la autofagia y su relación mecanicista con la radioresistencia, realizamos un ensayo funcional utilizando CQ o rapamicina (Rapa, un inductor de la autofagia, 25 nM) tras la sobreexpresión o el silenciamiento de circRAB5A. El ensayo CCK8 y el ensayo de apoptosis demostraron que CQ abolió la radioresistencia inducida por sicircRAB5A, mientras que Rapa contrarrestó la disminución de la radioresistencia inducida por la expresión forzada de circRAB5A (Figura S4 complementaria). En conjunto, estos datos indican que el agotamiento de circRAB5A mejora la radioresistencia al promover la autofagia protectora y suprimir la apoptosis.

CircRAB5A regula la estabilidad de la proteína BIP a través de la ubiquitinación mediada por TRIM21

Para investigar el mecanismo molecular de circRAB5A, realizamos ensayos de "pull-down" de ARN utilizando sondas de circRAB5A biotiniladas. La tinción con plata de las proteínas eluidas reveló una banda prominente de aproximadamente 70 kDa en el grupo circRAB5A (Figura 4A), que se identificó como BIP (GRP78) mediante espectrometría de masas (10 péptidos únicos, cobertura de secuencia del 22%). El Western blot confirmó que BIP se enriqueció específicamente en los "pull-downs" de circRAB5A (Figura 4B). La inmunoprecipitación recíproca de ARN (RIP) con anticuerpos anti-BIP mostró que circRAB5A se enriqueció significativamente en las fracciones unidas a BIP en comparación con el control de IgG (Figura 4C), lo que confirmó la interacción directa. Para aclarar la base molecular de la interacción circRAB5A-BIP, se realizó un experimento de truncamiento. Como se muestra en la Figura 4D, dividimos la proteína BIP en cuatro dominios principales y construimos proteínas de tipo salvaje (de longitud completa) y proteínas truncadas individualmente en vectores de expresión. El resultado mostró que la sonda circRAB5A no pudo realizar el "pull-down" de la proteína truncada Del3 (que carece de un enlazador interno y del dominio SBD, posición: 409–500) (Figura 4E). Además, la RIP con un anticuerpo anti-Flag no pudo precipitar circRAB5A en el grupo Del3 (Figura 4F). Esto indica que circRAB5A interactúa con el enlazador interno y el dominio SBD de la proteína BIP.

A continuación, examinamos los efectos de circRAB5A sobre la expresión de BIP. El Western blot mostró que la sobreexpresión de circRAB5A redujo los niveles de proteína BIP, mientras que sicircRAB5A aumentó BIP (Figura 5A y B). Para probar si esta regulación se produce a nivel postraduccional, realizamos ensayos de persecución con cicloheximida (CHX), y los resultados mostraron que la vida media de BIP se prolongó en las células sicircRAB5A y se acortó en las células con sobreexpresión de circRAB5A (Figura 5C y D), lo que indica que circRAB5A desestabiliza BIP. Para determinar si la vía ubiquitina-proteasoma media la degradación de BIP, tratamos las células con el inhibidor del proteasoma MG132 (10 μM, 6 h). MG132 rescató la disminución de BIP en las células con sobreexpresión de circRAB5A (Figura 5E), lo que confirmó la degradación por proteasomas. Los ensayos de ubiquitinación mostraron que la sobreexpresión de circRAB5A aumentó la ubiquitinación de BIP, mientras que sicircRAB5A la redujo (Figura 5F). Dado que TRIM21 es una E3 ubiquitina ligasa de BIP,^[26] probamos su papel. La expresión forzada de TRIM21 en las células SW480 mejoró la ubiquitinación de BIP (Figura S5B complementaria), lo que se incrementó aún más mediante la co-sobreexpresión de circRAB5A (Figura 5G). Por el contrario, el silenciamiento de TRIM21 (siTRIM21, eficiencia > 75%, Figura S5A complementaria) abolió la ubiquitinación de BIP inducida por circRAB5A (Figura 5H). Estos datos confirmaron que circRAB5A promueve la ubiquitinación de BIP mediada por TRIM21, lo que reduce la estabilidad de BIP.

El eje circRAB5A/BIP modula el equilibrio de la autofagia-apoptosis inducida por la radiación a través de la vía p-Akt/Beclin1

Para validar la relación funcional entre circRAB5A y BIP en la radioresistencia, realizamos experimentos de rescate al cotransfectar las células SW620 con sicircRAB5A y siBIP (eficiencia de silenciamiento de BIP > 65%, Figura S5C complementaria). Los ensayos de supervivencia clonogénica mostraron que el silenciamiento combinado de BIP abolió la radioresistencia inducida por sicircRAB5A y disminuyó la viabilidad celular a 4 Gy (Figura 6A y Figura S6A complementaria). Por el contrario, la sobreexpresión de BIP en las células SW480 con sobreexpresión de circRAB5A restauró la radioresistencia y la viabilidad celular a 4 Gy (Figura 6B y Figuras S5D y S6B complementarias). Estos resultados confirmaron que BIP es un efector aguas abajo crítico de circRAB5A en la regulación de la radioresistencia.

A continuación, evaluamos el efecto del eje circRAB5A/BIP sobre la apoptosis y la autofagia. La tinción con Annexin V/PI reveló que la reducción de la apoptosis inducida por sicircRAB5A se revirtió con siBIP, mientras que la sobreexpresión de BIP atenuó el aumento de la apoptosis causado por la sobreexpresión de circRAB5A (Figura 6C y D). El Western blot mostró que sicircRAB5A aumentó la expresión de LC3-II y disminuyó los niveles de p62, lo que se abolió con siBIP (Figura 6E). Por el contrario, la sobreexpresión de BIP restauró el flujo autofágico en las células con sobreexpresión de circRAB5A (Figura S6C y D complementaria). La imagen de mCherry-GFP-LC3 confirmó estos hallazgos. El porcentaje de autolisosomas se redujo con la sobreexpresión de circRAB5A, pero se restauró con la co-sobreexpresión de BIP (Figura 6F).

Para identificar la vía de señalización que media esta interacción cruzada, examinamos el eje p-Akt/Beclin1, un regulador clave del equilibrio de la autofagia-apoptosis. El Western blot mostró que la sobreexpresión de circRAB5A disminuyó los niveles de p-Akt y Beclin1, mientras que sicircRAB5A aumentó p-Akt y Beclin1 (Figura 6G). La sobreexpresión de BIP rescató los niveles de p-Akt y Beclin1 en las células con sobreexpresión de circRAB5A, y el silenciamiento de BIP revirtió el aumento de p-Akt/Beclin1 inducido por sicircRAB5A. En conjunto, estos datos demostraron que el eje circRAB5A/BIP modula la radioresistencia al regular la vía p-Akt/Beclin1, que coordina la autofagia protectora y la apoptosis en las células de CRC.

El eje circRAB5A/BIP promueve la radioresistencia en modelos de xenoinjerto de CRC

Para validar los hallazgos anteriores in vivo, establecimos modelos de xenoinjerto subcutáneo utilizando células SW480 que expresan de forma estable shRNA dirigida a circRAB5A (sh-circRAB5A), BIP (sh-BIP) o un control no dirigido (sh-NC) como grupo control. El crecimiento tumoral se controló semanalmente y la radioterapia se inició cuando los tumores alcanzaron los 75–100 mm³ (día 7 después de la inyección). En los ratones del control sh-NC, la irradiación local (3 Gy × 2 fracciones) redujo significativamente el volumen y el peso del tumor (Figura 7A). Sin embargo, en el grupo sh-circRAB5A, la irradiación tuvo un efecto mínimo, ya que el volumen del tumor y el peso del tumor fueron mayores que los del grupo sh-NC irradiado, pero no mostraron diferencias significativas en comparación con el grupo sh-NC no irradiado.

El análisis histológico confirmó estos resultados. La tinción TUNEL reveló una reducción de las células apoptóticas en los tumores sh-circRAB5A en comparación con los tumores sh-NC después de la irradiación, mientras que la tinción Ki67 mostró un aumento de las células proliferantes (Figura 7C). El Western blot de los lisados tumorales demostró que sh-circRAB5A aumentó los niveles de BIP y la expresión de LC3-II, lo que fue consistente con una mayor autofagia protectora (Figura S7 complementaria).

Para probar el potencial terapéutico de dirigir BIP, se trató a los ratones sh-BIP con una dosis baja de radiación (2 Gy × 1 fracción). Los tumores sh-BIP mostraron una reducción significativa en el volumen y el peso del tumor en comparación con los ratones sh-NC (Figura 7B). El análisis histológico de la tinción TUNEL y Ki67 también mostró que el porcentaje de células apoptóticas y proliferantes cambió de manera consistente con el fenotipo (Figura 7D). En conjunto, estos datos in vivo demuestran que el eje circRAB5A/BIP promueve la radioresistencia al mejorar la autofagia protectora e inhibir la apoptosis y que dirigir BIP sensibiliza los tumores de CRC a la radioterapia.

CircRAB5A está significativamente disminuido en los tejidos y líneas celulares de cáncer colorrectal radioresistentes

Para identificar los circARN asociados con la radioresistencia, analizamos el conjunto de datos GEO GSE186940, que incluye los perfiles transcriptómicos de ocho tejidos de CRC radiosensibles y ocho radioresistentes. Los criterios de selección se establecieron de la siguiente manera: (1) umbral de expresión diferencial (|log₂(cambio de pliegue)| > 1, FDR < 0,05). (2) El recuento de expresión original no era todo cero. (3) poseer características típicas de circARN: secuencias disponibles en circBase y longitudes adecuadas (200–500 nt) y formadas por el empalme inverso de exones. (4) No reportado. Con base en esto, se centró en hsa-circ-0123297 (designado circRAB5A), que fue el circARN más significativamente disminuido en las muestras radioresistentes (Figura 1A). Para validar este hallazgo, examinamos la expresión de circRAB5A en 40 pares de muestras de tejido de CRC clínicas (20 radiosensibles, 20 radioresistentes y tejidos mucosos normales adyacentes). La qRT-PCR confirmó que los niveles de circRAB5A se redujeron significativamente en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos mucosos normales adyacentes y disminuyeron aún más en las muestras radioresistentes en comparación con las muestras de CRC radiosensibles (Figura 1B). Estos resultados fueron consistentes con el conjunto de datos GEO que mostró que circRAB5A se redujo en los tejidos de CRC radioresistentes.

A continuación, evaluamos la expresión de circRAB5A en líneas celulares de CCRC. La qRT-PCR mostró que circRAB5A se encontraba disminuida en las líneas celulares de CCRC (SW480, SW620, HCT116 y Caco-2) en comparación con la línea celular de epitelio normal del colon, NCM460 (Figura 1C). Para confirmar su naturaleza circular, realizamos una PCR con cebadores divergentes, en la que los cebadores divergentes amplificaron la unión de retro-empalme en el ADNc, pero no en el ADN genómico (ADNg), y la secuenciación de Sanger verificó la secuencia de retro-empalme (Figura 1D y E). La fraccionamiento subcelular y los ensayos de FISH demostraron que circRAB5A se localizaba predominantemente en el citoplasma (Figura 1F y G). El tratamiento con ACT-D reveló que circRAB5A tenía una vida media más larga que el RAB5A lineal (Figura S1A del material suplementario), lo que confirmó su estabilidad. Los ensayos de digestión con RNase R mostraron que circRAB5A era resistente a la degradación por exonucleasas, a diferencia del ARNm lineal de RAB5A (Figura S1B del material suplementario). Además, circRAB5A no fue transcrito inversamente por los cebadores oligo (dT), lo que indica una estructura no poliadenilada (Figura S1C del material suplementario). En conjunto, estos datos confirman que circRAB5A es un ARN circular estable, enriquecido en el citoplasma, que se identificó inicialmente como disminuido en el CCRC resistente a la radiación.

ADAR1 suprime la biogénesis de circRAB5A a través de la unión al elemento Alu Jo/Jr

Para investigar el mecanismo subyacente a la disminución de circRAB5A en la radioresistencia, establecimos células SW480 resistentes a la radiación (SW480-IR) mediante 10 fracciones de irradiación de 2 Gy (total de 20 Gy en 5 semanas), lo que se validó mediante un ensayo de supervivencia clonogénica (Figura 2A y Figura S1D del material suplementario). La qRT-PCR confirmó que los niveles de circRAB5A eran notablemente más bajos en las células SW480-IR que en las células SW480 parentales, mientras que la expresión del ARNm lineal de RAB5A permaneció sin cambios (Figura 2B), lo que indica una eficiencia reducida del retro-empalme en lugar de una disminución de la transcripción del gen huésped.

A continuación, para dilucidar el mecanismo molecular subyacente a la disminución de circRAB5A, realizamos un ensayo mecanístico. Dado que las secuencias conservadas de Alu en los intrones adyacentes eran responsables de la formación de circARN, exploramos los elementos Alu Jo y Alu Jr alrededor de la secuencia lineal de circRAB5A y si participan en la biogénesis de circRAB5A. Construimos vectores de expresión que contenían el pre-ARNm de RAB5A de longitud completa o variantes truncadas de Alu Jo/Jr (Figura 2C). La qRT-PCR reveló que solo el vector de longitud completa (que contenía tanto Jo como Jr) aumentaba significativamente la biogénesis de circRAB5A (Figura 2D). A continuación, mediante el software en línea catRAPID, los resultados predijeron que las proteínas de unión al ARN (RBPs) ADAR1 y DHX9 podrían interactuar con las secuencias Alu Jo y Jr (Tablas S3 y S4 del material suplementario). Primero, realizamos una qRT-PCR para explorar si la expresión de estas RBPs se alteraba durante la radiación, incluyendo ADAR1, DHX9 y QKI (control negativo). Los resultados mostraron que solo la expresión de ADAR1 se incrementó significativamente en las células SW480-IR, mientras que los niveles de DHX9 y QKI permanecieron sin cambios (Figura 2E). En segundo lugar, para probar si ADAR1 modula circRAB5A a través de Alu Jo/Jr, realizamos una inmunoprecipitación de ARN (RIP) y encontramos que los anticuerpos anti-ADAR1 enriquecieron significativamente las secuencias Alu Jo/Jr en comparación con el control IgG (Figura 2F), lo que confirmó la unión directa. La sobreexpresión de ADAR1 en las células SW480 parentales redujo los niveles de circRAB5A (Figura 2G), mientras que el silenciamiento de ADAR1 en las células SW480-IR restauró la expresión de circRAB5A (Figura 2H). Finalmente, para dilucidar la relación entre ADAR1 y circRAB5A en los tejidos de CCRC, también validamos la expresión de ADAR1 en 20 muestras de CCRC radiosensibles y 20 muestras de CCRC radioresistentes. El resultado de la PCR mostró que, aunque ADAR1 se encontraba sobreexpresado en el grupo radioresistente (Figura S1E del material suplementario), el análisis de correlación no mostró una relación significativa entre ADAR1 y circRAB5A en las muestras de CCRC (Figura S1F del material suplementario; R = -0,173, p = 0,283). Esto indica que ADAR1 probablemente no es la única RBP que regula la biogénesis de circRAB5A. En conjunto, estos datos demuestran que la sobreexpresión de ADAR1 en el CCRC radioresistente suprime la biogénesis de circRAB5A al unirse a los elementos Alu Jo/Jr, lo que reduce la eficiencia del retro-empalme.

El agotamiento de circRAB5A confiere radioresistencia al promover la autofagia protectora e inhibir la apoptosis

Para determinar el papel funcional de circRAB5A en la radioresistencia, realizamos ensayos de supervivencia clonogénica utilizando células de CCRC con expresión alterada de circRAB5A. En las células SW620, la transfección con sicircRAB5A (eficiencia de silenciamiento > 50%, Figura S2A del material suplementario) aumentó significativamente la supervivencia de las colonias de 0 a 8 Gy y elevó la viabilidad celular a 4 Gy (Figura 3A y Figura S2C del material suplementario). Por el contrario, la sobreexpresión de circRAB5A en las células SW480 redujo la supervivencia de las colonias, redujo la viabilidad celular a 4 Gy y sensibilizó las células a la radiación (Figura 3B y Figuras S2B y S2D del material suplementario). Estos resultados confirmaron que circRAB5A regula negativamente la radioresistencia en las células de CCRC. A continuación, evaluamos la apoptosis mediante la tinción con Annexin V/PI. Después de 4 Gy de radiación, las células SW620 transfectadas con sicircRAB5A mostraron una reducción significativa de las células apoptóticas, mientras que las células SW480 con sobreexpresión de circRAB5A exhibieron un aumento de la apoptosis (Figura 3D y E).

Dado el papel de la autofagia en el mantenimiento de la homeostasis intracelular en respuesta a diversos estímulos, evaluamos el papel protector de la autofagia en la radioresistencia de las células de CCRC y el mecanismo subyacente de circRAB5A. Tratamos las células SW480 con el inhibidor de la autofagia cloroquina (CQ, 10 μM), y se analizaron las alteraciones en las proteínas LC3-II y p62 mediante Western blot (Figura S3D del material suplementario). Además, los resultados mostraron que CQ disminuyó notablemente la viabilidad celular y aumentó las células apoptóticas después del tratamiento con radiación en comparación con el grupo de control (DMSO) (Figuras S3A-C del material suplementario), lo que confirmó el papel protector de la autofagia contra la radiación en las células de CCRC. A continuación, evaluamos el flujo autofágico mediante el uso de Western blot y los reporteros de doble fluorescencia mCherry-GFP-LC3. En las células SW620, sicircRAB5A disminuyó p62 y aumentó LC3-II (Figura 3C). Por el contrario, en las células SW480, la sobreexpresión de circRAB5A redujo la expresión de LC3-II, lo que indica una inhibición de la autofagia, lo que se confirmó aún más mediante la reducción de la formación de autolisosomas (puntos mCherry+GFP−) (Figura 3F y G). Para revelar aún más el papel de circRAB5A en la regulación de la autofagia y su mecanismo de enlace con la radioresistencia, realizamos un ensayo funcional utilizando CQ o rapamicina (Rapa, un inductor de la autofagia, 25 nM) tras la sobreexpresión o el silenciamiento de circRAB5A. El ensayo CCK8 y el ensayo de apoptosis demostraron que CQ abolió la radioresistencia inducida por sicircRAB5A, mientras que Rapa contrarrestó la disminución de la radioresistencia inducida por la sobreexpresión de circRAB5A (Figura S4 del material suplementario). En conjunto, estos datos indican que el agotamiento de circRAB5A mejora la radioresistencia al promover la autofagia protectora y suprimir la apoptosis.

El agotamiento de circRAB5A regula la estabilidad de la proteína BIP a través de la ubiquitinación mediada por TRIM21

Para investigar el mecanismo molecular de circRAB5A, realizamos ensayos de extracción de ARN utilizando sondas de circRAB5A biotiniladas. La tinción con plata de las proteínas eluidas reveló una banda prominente de aproximadamente 70 kDa en el grupo circRAB5A (Figura 4A), que se identificó como BIP (GRP78) mediante espectrometría de masas (10 péptidos únicos, cobertura de secuencia del 22%). El Western blot confirmó que BIP se enriqueció específicamente en las extracciones de circRAB5A (Figura 4B). La inmunoprecipitación de ARN recíproca (RIP) con anticuerpos anti-BIP mostró que circRAB5A se enriqueció significativamente en las fracciones unidas a BIP en comparación con el control IgG (Figura 4C), lo que confirmó la interacción directa. Para dilucidar la base molecular de la interacción circRAB5A-BIP, se realizó un experimento de truncamiento. Como se muestra en la Figura 4D, dividimos la proteína BIP en cuatro dominios principales y construimos proteínas de tipo salvaje (de longitud completa) y truncadas individualmente en vectores de expresión. El resultado mostró que la sonda circRAB5A no pudo extraer la proteína truncada Del3 (que carece de un enlazador interno y del dominio SBD, posición: 409-500) (Figura 4E). Además, la RIP con un anticuerpo anti-Flag no pudo precipitar circRAB5A en el grupo Del3 (Figura 4F). Esto indica que circRAB5A interactúa con el enlazador interno y el dominio SBD de la proteína BIP.

A continuación, examinamos los efectos de circRAB5A sobre la expresión de BIP. El Western blot mostró que la sobreexpresión de circRAB5A redujo los niveles de proteína BIP, mientras que sicircRAB5A aumentó BIP (Figura 5A y B). Para probar si esta regulación se produce a nivel postraduccional, realizamos ensayos de persecución con cicloheximida (CHX), y los resultados mostraron que la vida media de BIP se prolongó en las células sicircRAB5A y se acortó en las células con sobreexpresión de circRAB5A (Figura 5C y D), lo que indica que circRAB5A desestabiliza BIP. Para determinar si la vía ubiquitina-proteasoma media la degradación de BIP, tratamos las células con el inhibidor del proteasoma MG132 (10 μM, 6 h). MG132 rescató la disminución de BIP en las células con sobreexpresión de circRAB5A (Figura 5E), lo que confirmó la degradación por proteasomas. Los ensayos de ubiquitinación mostraron que la sobreexpresión de circRAB5A aumentó la ubiquitinación de BIP, mientras que sicircRAB5A la redujo (Figura 5F). Dado que TRIM21 es una E3 ligasa de ubiquitina de BIP,^[26] probamos su papel. La sobreexpresión de TRIM21 en las células SW480 mejoró la ubiquitinación de BIP (Figura S5B del material suplementario), lo que se incrementó aún más mediante la co-sobreexpresión de circRAB5A (Figura 5G). Por el contrario, el silenciamiento de TRIM21 (siTRIM21, eficiencia > 75%, Figura S5A del material suplementario) abolió la ubiquitinación de BIP inducida por circRAB5A (Figura 5H). Estos datos confirmaron que circRAB5A promueve la ubiquitinación de BIP mediada por TRIM21, lo que reduce la estabilidad de BIP.

El eje circRAB5A/BIP modula el equilibrio de la autofagia-apoptosis inducida por la radiación a través de la vía p-Akt/Beclin1

Para validar el vínculo funcional entre circRAB5A y BIP en la radioresistencia, realizamos experimentos de rescate al cotransfectar las células SW620 con sicircRAB5A y siBIP (eficiencia de silenciamiento de BIP > 65%, Figura S5C del material suplementario). Los ensayos de supervivencia clonogénica mostraron que el silenciamiento combinado de BIP abolió la radioresistencia inducida por sicircRAB5A y disminuyó la viabilidad celular a 4 Gy (Figura 6A y Figura S6A del material suplementario). Por el contrario, la sobreexpresión de BIP en las células SW480 con sobreexpresión de circRAB5A restauró la radioresistencia y la viabilidad celular a 4 Gy (Figura 6B y Figuras S5D y S6B del material suplementario). Estos resultados confirmaron que BIP es un efector aguas abajo crítico de circRAB5A en la regulación de la radioresistencia.

A continuación, evaluamos el efecto del eje circRAB5A/BIP sobre la apoptosis y la autofagia. La tinción con Annexin V/PI reveló que la reducción de la apoptosis inducida por sicircRAB5A se revirtió con siBIP, mientras que la sobreexpresión de BIP atenuó el aumento de la apoptosis causado por la sobreexpresión de circRAB5A (Figura 6C y D). El Western blot mostró que sicircRAB5A aumentó la expresión de LC3-II y disminuyó los niveles de p62, lo que se abolió con siBIP (Figura 6E). Por el contrario, la sobreexpresión de BIP restauró el flujo autofágico en las células con sobreexpresión de circRAB5A (Figuras S6C y S6D del material suplementario). La imagen de mCherry-GFP-LC3 confirmó estos hallazgos. El porcentaje de autolisosomas se redujo mediante la sobreexpresión de circRAB5A, pero se restauró con la co-sobreexpresión de BIP (Figura 6F).

Para identificar la vía de señalización que media esta interacción, examinamos el eje p-Akt/Beclin1, un regulador clave del equilibrio de la autofagia-apoptosis. El Western blot mostró que la sobreexpresión de circRAB5A disminuyó los niveles de p-Akt y Beclin1, mientras que sicircRAB5A los aumentó (Figura 6G). La sobreexpresión de BIP rescató los niveles de p-Akt y Beclin1 en las células con sobreexpresión de circRAB5A, y el silenciamiento de BIP revirtió el aumento de p-Akt/Beclin1 inducido por sicircRAB5A. En conjunto, estos datos demostraron que el eje circRAB5A/BIP modula la radioresistencia al regular la vía p-Akt/Beclin1, que coordina la autofagia protectora y la apoptosis en las células de CCRC.

El eje circRAB5A/BIP promueve la radioresistencia en los modelos de xenoinjerto de CCRC

Para validar los hallazgos anteriores in vivo, establecimos modelos de xenoinjerto subcutáneo utilizando células SW480 que expresaban de forma estable shRNA dirigida a circRAB5A (sh-circRAB5A), BIP (sh-BIP) o un control no dirigido (sh-NC) como grupo control. El crecimiento tumoral se monitorizó semanalmente, y se inició la radioterapia cuando los tumores alcanzaron los 75-100 mm³ (día 7 después de la inyección). En los ratones control sh-NC, la irradiación local (3 Gy × 2 fracciones) redujo significativamente el volumen y el peso del tumor (Figura 7A). Sin embargo, en el grupo sh-circRAB5A, la irradiación tuvo un efecto mínimo, ya que el volumen y el peso del tumor fueron mayores que los del grupo sh-NC irradiado, pero no mostraron diferencias significativas en comparación con el grupo sh-NC no irradiado.

El análisis histológico confirmó estos resultados. La tinción TUNEL reveló una reducción de las células apoptóticas en los tumores sh-circRAB5A en comparación con los tumores sh-NC después de la irradiación, mientras que la tinción Ki67 mostró un aumento de las células proliferantes (Figura 7C). El análisis por Western blot de los lisados tumorales demostró que sh-circRAB5A aumentó los niveles de BIP y la expresión de LC3-II, lo que era consistente con una mayor autofagia protectora (Figura S7 suplementaria).

Para probar el potencial terapéutico de dirigir la atención hacia BIP, se trató a los ratones sh-BIP con una dosis baja de radiación (2 Gy × 1 fracción). Los tumores sh-BIP mostraron una reducción significativa del volumen y el peso del tumor en comparación con los ratones sh-NC (Figura 7B). El análisis histológico de la tinción TUNEL y Ki67 también mostró que el porcentaje de células apoptóticas y proliferantes cambió de manera consistente con el fenotipo (Figura 7D). En conjunto, estos datos in vivo demuestran que el eje circRAB5A/BIP promueve la radioresistencia al mejorar la autofagia protectora e inhibir la apoptosis, y que dirigir la atención hacia BIP sensibiliza los tumores de CRC a la radioterapia.

Discusión

La radioterapia ha atraído una considerable atención en los tratamientos del CRC en los últimos años; sin embargo, la radioresistencia sigue siendo un importante desafío clínico, y sus mecanismos reguladores aún no están claros. El papel de los circRNAs, moléculas de ARN reguladoras novedosas, ha despertado interés en los últimos años.^[27] La expresión diferencial de ciertos circRNAs se asocia con la resistencia adquirida a la radioterapia.^[28] Sin embargo, los circRNAs relacionados con la radioresistencia y sus mecanismos no se han dilucidado en el CRC. Aquí, identificamos un nuevo eje molecular "ADAR1/circRAB5A/BIP" que regula la radioresistencia al coordinar la autofagia protectora y la apoptosis. Nuestros hallazgos proporcionan información fundamental sobre los mecanismos subyacentes a la adaptación a la radiación en el CRC y destacan posibles objetivos terapéuticos para mejorar la eficacia del tratamiento.

En primer lugar, demostramos que circRAB5A es un ARN circular previamente no caracterizado, enriquecido en el citoplasma, que está significativamente reducido en los tejidos y líneas celulares de CRC radioresistentes. En los 40 pares de muestras clínicas recogidas, también se observó una reducción de circRAB5A, lo que indica que la disminución de circRAB5A podría ser un biomarcador asociado con la radioresistencia. Se espera que este hallazgo cubra una laguna en la literatura. Por ejemplo, Lee et al. informaron que la proteína LRP-1 es un marcador radioresistente^[29] y Munakata et al. demostraron que la expresión de SCGB2A1 fue un marcador pronóstico para el CRC asociado con la radioresistencia.^[30] Una mayor exploración de nuestro trabajo proporcionará nuevas pruebas de que los circRNAs son biomarcadores asociados con la radioresistencia y el pronóstico en los pacientes con CRC.^[31] En conjunto, proporcionará una red de biomarcadores relacionados con la radioresistencia que estará disponible para el uso clínico y la evaluación de las respuestas a la radiación.^[32]

A continuación, dilucidamos que la reducción de circRAB5A no se debió a una reducción de la transcripción de su gen huésped RAB5A, sino más bien a una alteración de la eficacia del retro-splicing, impulsada por la sobreexpresión de ADAR1 en las células de CRC radioresistentes. ADAR1, una enzima de edición de ARN, se une a los elementos Alu Jo/Jr en los intrones flanqueantes del locus de circRAB5A, suprimiendo así su biogénesis. Este mecanismo amplía nuestra comprensión del papel de ADAR1 en el cáncer, y la sobreexpresión aberrante de ADAR1 contribuye en gran medida a la carcinogénesis y la progresión del cáncer desde múltiples aspectos.^[33] Aunque los estudios anteriores se han centrado en su regulación del splicing del ARNm^[34] o la focalización del microARN^[35], nuestro trabajo reveló una nueva capa de regulación en la que ADAR1 modula la biogénesis del circRNA a través de los elementos Alu, una vía por la cual ADAR1 podría regular la radioresistencia al modular la expresión de circRNAs clave.^[36]

Funcionalmente, la depleción de circRAB5A confiere radioresistencia al promover la autofagia protectora e inhibir la apoptosis. El equilibrio entre la autofagia y la apoptosis es un determinante crítico de la respuesta celular a la radiación.^[37] En las células de CRC, la sobreactivación de la autofagia mostró fuertes efectos protectores contra la radioresistencia. Esto se alinea con la evidencia emergente de que la autofagia actúa como un mecanismo de supervivencia bajo el estrés de la radiación. Durante este proceso, la estabilidad de la proteína BIP es crucial porque la expresión sostenida de BIP promueve la autofagia y conduce a la resistencia. En nuestro estudio, demostramos que circRAB5A interactúa directamente con BIP, una chaperona del RE que modula la homeostasis de las proteínas. Al interactuar con el dominio del enlazador interno y el SBD de la proteína BIP, circRAB5A mejora la ubiquitinación mediada por TRIM21 y desestabiliza la proteína BIP, lo que reduce la expresión de la vía de señalización p-Akt/Beclin1 mediada por BIP, que regula la interacción entre la autofagia y la apoptosis. Nuestros resultados demostraron que el eje circRAB5A/BIP inclinó el equilibrio entre la autofagia y la apoptosis hacia la supervivencia autofágica, lo que condujo a una mayor radioresistencia en el CRC. Este hallazgo amplía la comprensión del equilibrio entre la autofagia y la apoptosis durante la formación de la radioresistencia en el CRC y demuestra la importancia del circRNA en este proceso.

Cabe destacar que, en los últimos años, la administración dirigida de ARN no codificante, especialmente circRNA, ha mostrado prometedores efectos terapéuticos, ya que los circRNA son más estables y participan en la transducción de señales desde múltiples aspectos.^[38]
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^[39] Por ejemplo, Ding et al. informaron que la administración de circRERE-AAV inhibió significativamente el crecimiento tumoral del CRC a través del eje miR-6837-3p/MAVS, activando así la señalización del tipo I IFN. El tratamiento combinado con circRERE-AAV y anticuerpos anti-PD-1 también exhibió efectos sinérgicos.^[40] Wang et al. informaron que la administración de si-ciRS-122 en células de CRC resistentes a los fármacos a través de exosomas podría suprimir la glucólisis y aliviar la resistencia al oxaliplatino mediante la modulación de la vía "ciRS-122/miR-122/PKM2".^[41] En nuestro estudio, cuando desactivamos la expresión de circRAB5A en un modelo de xenoinjerto en ratones, observamos un aumento significativo de la radioresistencia en los tumores de CRC. Esto indica que la administración dirigida de circRAB5A sensibiliza las células de CRC a la radioterapia e inhibe la radioresistencia adquirida. Además, nuestros datos in vivo también respaldaron que la desactivación de BIP mejoró la radiosensibilidad de los xenoinjertos de CRC, incluso a dosis bajas. Esto indica que las proteínas BIP también tienen un potencial como objetivos terapéuticos antitumorales.^[42]
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^[43] Estos hallazgos también son particularmente relevantes en combinación con la inmunoterapia, ya que el estrés del RE y la autofagia se han relacionado con la evasión inmune en el CRC.^[44-46] Una mayor exploración de nuestro trabajo revelará más funciones de circRAB5A y destacará su importancia en la terapia antitumoral.

Este estudio tiene varias limitaciones que justifican una mayor investigación. En primer lugar, validamos el eje "ADAR1/circRAB5A/BIP" en las líneas celulares SW480 y SW620; sin embargo, en otros subtipos de CRC, como los tumores de alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H) o los tumores con mutación de KRAS, la función y la generalizabilidad de este eje se están investigando actualmente. En segundo lugar, nuestros modelos animales utilizaron xenoinjertos subcutáneos, que carecen del microambiente tumoral del CRC primario. En tercer lugar, utilizamos un modelo de desactivación de circRAB5A en un estudio con animales. Teniendo en cuenta el bajo nivel endógeno de circRAB5A, un modelo de sobreexpresión de circRAB5A proporcionaría una información más significativa. Los estudios futuros en modelos de ratón ortotópicos o transgénicos reproducirían mejor la biología de la enfermedad. Un modelo de sobreexpresión de circRAB5A sería mejor. Además, el tamaño de la muestra clínica actual fue limitado, y la duración del seguimiento fue corta. No pudimos dilucidar completamente la importancia clínica de circRAB5A y revelamos su correlación con el pronóstico. Para abordar estas preocupaciones, se diseñó y llevó a cabo un estudio de cohorte amplio de pacientes con CRC con un seguimiento a largo plazo.

En resumen, nuestro estudio define un nuevo circuito regulador, "ADAR1/circRAB5A/BIP", que regula la radioresistencia del CRC al coordinar la autofagia y la apoptosis. Identificamos circRAB5A como un regulador clave de este proceso. Mecánicamente, encontramos que circRAB5A interactúa directamente con el dominio del enlazador interno y el SBD de la proteína BIP, una proteína chaperona del RE para la homeostasis de las proteínas. Al mejorar la ubiquitinación mediada por TRIM21, circRAB5A desestabiliza la proteína BIP, lo que reduce la expresión de la vía de señalización p-Akt/Beclin1 mediada por BIP, que modula la interacción entre la autofagia y la apoptosis. Esto amplió el trabajo de Wang et al.^[26] sobre la regulación de BIP al identificar un ARN no codificante (circRAB5A) como un nuevo modulador ascendente de la estabilidad de BIP. Este eje proporciona un marco mecanístico para comprender el inicio de la radioresistencia adquirida e identificar posibles objetivos terapéuticos para mejorar la eficacia de la radioterapia. También proporciona evidencia para la administración dirigida de circRNAs como una estrategia antitumoral.