Cuantificación a nivel de panel de la metilación en múltiples loci en ADN nativo libre de células mediante un procesamiento enzimático secuencial compatible con PCR.

La metilación del ADN proporciona información útil para la biopsia líquida, pero la baja abundancia de la muestra, la distribución de las señales de metilación y la complejidad del flujo de trabajo limitan su aplicación. Aquí presentamos Delta-HLD, una plataforma de análisis de metilación compatible con PCR que cuantifica la metilación directamente en el ADN nativo mediante hibridación secuencial, ligación y digestión sensible a la metilación. El ensayo informa simultáneamente sobre las señales dependientes de la metilación de múltiples loci a través de una arquitectura de amplificación compartida, generando una única lectura de PCR a nivel de panel. Establecimos la química, optimizamos el tamaño y la composición del panel mediante experimentos guiados por modelos e implementamos el ensayo como un flujo de trabajo de qPCR triplex con controles internos del proceso por muestra.

Los análisis de prueba de concepto en plasma mostraron una señal discriminatoria en el CCRC y demostraron la posibilidad de aplicar el ensayo a un modelo de carcinoma hepatocelular. Experimentos adicionales con retención de plaquetas identificaron una estrategia para aumentar la recuperación de las muestras circulantes analizables y, al mismo tiempo, reducir el reconocimiento del ADN genómico. Delta-HLD proporciona un marco compacto compatible con PCR para el análisis de metilación con baja cantidad de muestra, sin necesidad de conversión de bases.