La activación tumoral localizada de CD40 con MP0317, un DARPin FAP x CD40, reprograma el microambiente tumoral en pacientes con tumores sólidos avanzados: un estudio de fase 1, abierto, no aleatorizado y de escalada de dosis.

CD40 es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) que actúa como puente entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo al unirse a las células presentadoras de antígenos (APC), como las células B, las células dendríticas (DC), los monocitos y los macrófagos. La unión y activación de CD40 por su ligando correspondiente, CD40L, conducen a la regulación al alza de moléculas costimuladoras esenciales para la activación y proliferación de las células T. En concierto con la señalización del receptor de las células B, CD40 estimula directamente la generación de células productoras de anticuerpos, el brazo efector humoral de la inmunidad adaptativa^[1]–^[3]. Además, la activación de CD40 convierte los macrófagos asociados al tumor en macrófagos activados con propiedades antitumorales, independientemente de las células T, y altera el estroma tumoral^[4],^[5].

Debido a su potente actividad inmunoestimulante, CD40 es un objetivo atractivo para aprovechar el potencial terapéutico de una respuesta inmune antitumoral, pero también conlleva el riesgo de toxicidad sistémica. De hecho, los anticuerpos agonistas de CD40 administrados sistémicamente mostraron signos de actividad en pacientes con cáncer, pero su dosificación se vio afectada por la toxicidad limitante de la dosis (TLD) con manifestaciones clínicas del síndrome de liberación de citoquinas, elevación de las enzimas hepáticas o una serie de otras reacciones adversas relacionadas con el sistema inmunitario^[6]–^[8]. La toxicidad hepática observada puede surgir potencialmente de la activación de las células de Kupffer FcγR+, macrófagos hepáticos residentes y células endoteliales sinusoidales^[9] por el fragmento Fc de los anticuerpos anti-CD40 sistémicos para mediar una respuesta inflamatoria^[10]–^[12]. Además, estos anticuerpos terapéuticos pueden estimular la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos hacia las APC, como parte de las funciones efectoras de Fc, lo que podría atenuar la respuesta inmune^[13].

Otro obstáculo en el desarrollo de agonistas sistémicos de CD40 es la disposición del fármaco mediada por el objetivo (DMO), que conduce a una rápida eliminación del fármaco de la sangre (es decir, vida media corta) y limita la distribución del fármaco en los ganglios linfáticos y otros tejidos, incluido el microambiente tumoral (MET)^[14],^[15]. Es posible que se requieran dosis más altas para superar este efecto de "sumidero" de CD40 y lograr una saturación relevante del receptor CD40 dentro del MET^[7]. A su vez, tales dosis de agonistas sistémicos de CD40 no se pueden alcanzar debido a las toxicidades relacionadas con el objetivo.

Por el contrario, varios estudios preclínicos que utilizan inyecciones intratumorales o peritumorales de agentes activadores de CD40 han demostrado que la focalización de CD40 específicamente en el sitio tumoral es bien tolerada y desencadena eficazmente respuestas antitumorales^[16],^[17]. Aunque el agonismo de CD40 se limitó al tumor primario, aún generó respuestas sistémicas específicas del tumor por parte de las células T, lo que condujo a la eliminación de tumores secundarios distantes y proporcionó protección contra la recurrencia del tumor. Estos hallazgos respaldan firmemente la estrategia de dirigir el agonismo anti-CD40 específicamente al tumor.

MP0317 (FAP x CD40) es una bispecífica diseñada como una proteína de repetición anquirina (DARPin)^[18]. MP0317 incluye cuatro dominios DARPin unidos covalentemente que se unen a la proteína de activación de fibroblastos humanos (FAP), CD40 humano (dos dominios DARPin idénticos) y albúmina sérica humana (para prolongar la vida media) (Figura de datos ampliados 1). Es un agonista de CD40 no basado en anticuerpos, por lo tanto, sin fragmento Fc ni función efectora de Fc, diseñado para activar las células inmunitarias específicamente dentro del MET, lo que podría reducir potencialmente la toxicidad en comparación con los enfoques de anticuerpos agonistas de CD40 sistémicos y, en consecuencia, permitir una ventana terapéutica más amplia para lograr una dosificación eficaz. MP0317 activa CD40 selectivamente en las APC dentro del MET, independientemente del entrecruzamiento mediado por FcR, al interactuar con FAP expresado en los fibroblastos asociados al cáncer en el estroma tumoral. Por lo tanto, MP0317 tiene como objetivo inducir la activación inmunitaria solo cuando se agrupa en el MET^[19] o posiblemente en los ganglios linfáticos, que pueden expresar FAP en su red reticular^[20],^[21]. FAP está involucrado en varios de los sellos distintivos del cáncer, incluida la proliferación y la invasividad, la remodelación de la matriz extracelular, la vascularización tumoral y la evasión de la vigilancia inmunitaria^[19]. Está muy presente en las lesiones neoplásicas, pero tiene una expresión limitada en los tejidos sanos^[22]–^[25], lo que lo convierte en un candidato ideal para la terapia dirigida contra el cáncer. Se confirmó in vitro que el diseño DARPin FAP x CD40 activa condicionalmente la vía de CD40 en las células B, las DC y los macrófagos solo en presencia de células que expresan FAP. In vivo, un DARPin sustituto que se une a FAP y CD40 mostró una potente actividad antitumoral en un modelo de tumor de colon MC38 que expresa FAP en ratones inmunocompetentes. En contraste con un anticuerpo anti-CD40, este DARPin sustituto FAP x CD40 no indujo la elevación de las enzimas hepáticas ni la liberación sistémica de citoquinas en ratones^[18].

En este artículo, presentamos los resultados del primer estudio en humanos de fase 1 de escalada de dosis (NCT05098405) que evalúa la monoterapia con MP0317 en pacientes con tumores sólidos avanzados.

Resultados

Población de pacientes y tratamiento

Se seleccionaron sesenta y un pacientes con tumores sólidos avanzados recurrentes/refráctarios (Figura 1; se muestran los detalles adicionales sobre los criterios de elegibilidad en Métodos). De estos, 15 pacientes no cumplieron los criterios de elegibilidad; los 46 restantes se incluyeron y recibieron tratamiento hasta la progresión de la enfermedad (n = 42), la retirada por parte del paciente (n = 2), una toxicidad inaceptable (n = 1) o la decisión del investigador (n = 1).

Los 46 pacientes (n = 24 mujeres, n = 22 hombres; edad media: 63 años (rango 35–79)) tenían un estado de rendimiento del Grupo de Oncología Cooperativa del Este (ECOG PS) de 0 (n = 22) a 1 (n = 24) y estaban muy pretratados con una mediana de cuatro (rango: 1–13) líneas de tratamiento previas (incluidos 15 pacientes con tratamiento previo con inhibidores de puntos de control inmunitario (CPI)). Los tipos de tumores más comunes fueron el cáncer colorrectal (n = 12, incluidos n = 11 con estado microsatelital estable y n = 1 con estado microsatelital inestable-alto), el cáncer de páncreas (n = 9), el mesotelioma (n = 6) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) (n = 4) (Tabla 1).

MP0317 se administró por vía intravenosa cada 3 semanas (Q3S); se exploraron seis niveles de dosis: 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 y 10 mg/kg. Además, basándose en los datos farmacocinéticos (PK) emergentes, se exploraron tres niveles de dosis en un régimen semanal (Q1S): 0,5, 1,5 y 5 mg/kg. Los pacientes permanecieron en tratamiento durante un tiempo medio de 5 semanas (rango: 1–21).

Seguridad

Los 46 pacientes recibieron al menos una dosis de MP0317 (conjunto de análisis de seguridad) y se administraron un total de 228 infusiones. En general, se informaron 415 eventos adversos relacionados con el tratamiento (EAR) en los 46 pacientes, y la mayoría no fueron relacionados con el tratamiento. En total, se informaron 118 EAR en 37 pacientes (Tabla 2). De estos, seis (5%) fueron de grado 3 según los Criterios Comunes de Terminología para Eventos Adversos del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTCAE), y ocurrieron en cuatro pacientes (9%). No hubo EAR de grado superior a 3. Los EAR más frecuentes fueron fatiga (informados en 15 pacientes (33%), grados 1 y 2), reacciones relacionadas con la infusión (RRI) (informadas en ocho pacientes (17%), grado 2), náuseas (informadas en siete pacientes (15%), grados 1 y 2), elevación de las transaminasas (informadas en cinco pacientes (11%), grados 1–3), anorexia (informada en cinco pacientes (11%), grados 1 y 2) y vómitos (informados en cuatro pacientes (9%), grados 1 y 2). Un paciente interrumpió el tratamiento del estudio debido a un EAR: una RRI recurrente de grado 2.

Se informaron cinco eventos adversos graves (EAG) relacionados con el fármaco del estudio en cuatro (9%) pacientes. Dos de estos EAG fueron RRI de grado 2 informadas en dos pacientes, lo que llevó a la hospitalización de los pacientes para su control. Un EAG fue una insuficiencia cardíaca asintomática de grado 1, identificada durante las evaluaciones rutinarias del protocolo como una reducción de la fracción de eyección ventricular izquierda del 59% al 52% en una paciente con carcinoma de mama, que había sido tratada previamente con una serie de tratamientos sistémicos, incluidos los antraciclicos, así como con radioterapia. La paciente había ingresado en el estudio con una insuficiencia cardíaca leve asintomática, estadio II de la Asociación Cardíaca de Nueva York. Los dos EAG restantes fueron aumentos asintomáticos de grado 3 de la aspartato aminotransferasa y la alanina aminotransferasa, ambos informados simultáneamente en un único paciente tratado con la dosis más alta de MP0317 de 10 mg/kg Q3S. Estos aumentos de las enzimas hepáticas de grado 3 se informaron como no graves por el investigador tratante, pero se clasificaron como graves por el patrocinador y se calificaron como DLT. No se observaron más DLT en el estudio. La dosis máxima tolerada (DMT) de MP0317 no se alcanzó en el estudio.

Actividad antitumoral

Los 46 pacientes tratados del conjunto de análisis de seguridad se incluyeron en el análisis de la actividad antitumoral. Un paciente con tumor del estroma gastrointestinal (GIST) en la cohorte 5b (MP0317 1,5 mg/kg Q1S) logró una respuesta parcial no confirmada (RP), lo que resultó en una tasa de respuesta objetiva (TRO) general no confirmada del 2% (intervalo de confianza (IC) del 90%: 0,1 a 11,5). Catorce pacientes (30%) lograron una enfermedad estable (EE), de los cuales dos también mostraron una reducción cuantificable del tamaño de la lesión diana, lo que resultó en una tasa de control de la enfermedad (TCE) del 33% en la primera evaluación del tumor (ET) durante el tratamiento (aproximadamente a las 4–6 semanas; Figura 2a). Cinco pacientes continuaron mostrando control de la enfermedad en el día 90 (4 EE, 1 RP; TCE 11%). En el día 180, todos los pacientes habían progresado o interrumpido el estudio. El cambio relativo del tamaño de la lesión diana desde el inicio por paciente se muestra en la Figura 2b. Veintinueve pacientes (63%) presentaron progresión de la enfermedad, mientras que dos (4%) pacientes no fueron evaluables. La supervivencia libre de progresión (SLP) media fue similar en los dos esquemas de dosificación, con 38,5 días (IC del 95%: 35,0 a 80,0 días) en los pacientes con dosis Q1S y 36,0 días (IC del 95%: 35,0 a 39,0) en los pacientes con dosis Q3S.

PK e inmunogenicidad

Después de infusiones intravenosas repetidas, las concentraciones séricas de MP0317 disminuyeron de forma monoexponencial en la mayoría de las cohortes y permanecieron detectables hasta el final del intervalo de dosificación con una variabilidad interindividual moderada (Figura 3). Los parámetros farmacocinéticos (PK) obtenidos mediante el análisis no compartimental confirmaron que la PK sérica de MP0317 fue lineal para la concentración máxima sérica (Cmáx) en los rangos de dosis probados de 0,03 a 10 mg/kg Q3S y 0,5 a 5 mg/kg Q1S, mientras que el área bajo la curva (AUC) mostró un aumento mayor que proporcional a la dosis, lo que era consistente con el impacto de un "sumidero" de CD40 en los niveles de exposición en dosis más bajas. El volumen de distribución medio en estado estacionario (Vss) se mantuvo constante en las diferentes dosis, con valores que se aproximaban al volumen sérico, lo que sugiere que la biodistribución de MP0317 en los tejidos sanos se limitó principalmente al sistema circulatorio. Las estimaciones medias de la vida media terminal (t1/2) de MP0317 aumentaron con la dosis, con valores que oscilaron entre 21,8 h (0,03 mg/kg) y 120 h (10 mg/kg) en las cohortes Q3S y entre 60,2 h (0,5 mg/kg) y 103 h (5 mg/kg) en las cohortes Q1S, lo que confirmó las propiedades de vida media prolongada de MP0317 (ref. ^[18]), que confieren un perfil farmacocinético adecuado para la dosificación Q1S o Q3S.

En el 85% de la población del estudio (93% en las cohortes Q3S y 75% en las cohortes Q1S), se detectaron anticuerpos antidrogas (ADA) contra MP0317 al menos una vez durante el tratamiento del estudio (Tabla S2). No hubo correlación entre el título de ADA y la dosis de MP0317. Además, en las dos dosis más altas del régimen Q3S (3 mg/kg y 10 mg/kg) y en las tres cohortes de dosificación Q1S (0,5 mg/kg, 1,5 mg/kg y 5 mg/kg), se observó una exposición sostenida a MP0317, lo que superó la DMO y el impacto de los ADA. Los ADA, cuando ocurrieron, se detectaron hasta la interrupción del estudio.

Farmacodinámica

Se evaluó el efecto de MP0317 sobre los biomarcadores solubles mediante inmunoensayos. Los niveles de FAP soluble libre (sFAP) y CD40 (sCD40) en el suero de los pacientes después del tratamiento se modificaron de una manera que indica la interacción de MP0317 con su diana en la periferia (Fig. 4a). Los niveles de sFAP disminuyeron poco después de la administración de MP0317, de forma dependiente de la dosis. En las dosis de MP0317 de 1,5 mg/kg y superiores, los niveles de sFAP se mantuvieron suprimidos, lo que indicaba la saturación de la diana en la periferia. Los niveles de sCD40 se mantuvieron estables en dosis inferiores a 5 mg/kg, mientras que las dosis de 5 mg/kg y superiores indujeron un aumento transitorio pronunciado en sCD40, lo que posiblemente refleja la inducción de la liberación de CD40 ^[26].

El análisis de inmunofluorescencia multiplex (mIF) demostró que MP0317 estaba presente en las biopsias tumorales del 85% de los pacientes (22 de 26) con biopsias tumorales emparejadas evaluables. Se observó la colocalización de MP0317 con FAP y CD40 en el 81% de estos pacientes (21 de 26) (Fig. 4b).

Para explorar los efectos dinámicos de MP0317 sobre el entorno inmunitario tumoral, los pacientes se dividieron en dos grupos según un plan de análisis exploratorio a priori. El primer grupo (en adelante, denominado "dosis baja de MP0317") consistió en seis pacientes tratados con dosis no farmacológicamente activas según el modelado de farmacocinética/farmacodinámica (PK/PD) (≤0,1 mg/kg, cohortes 1 y 2, n= 4) o aquellos que no presentaban niveles detectables de MP0317 en la biopsia tumoral después de la administración (cohorte 4, 1 mg/kg cada 3 semanas, n= 2), según se evaluó mediante mIF. El segundo grupo (en adelante, denominado "dosis más alta de MP0317") consistió en pacientes tratados con la dosis de ≥0,3 mg/kg (cohortes 3 y superiores) y que presentaban una detección confirmada de MP0317 en la biopsia tumoral después de la administración (n= 20). Los pacientes del grupo de dosis más alta de MP0317 demostraron un aumento significativo en la abundancia tumoral de células dendríticas (DCs) (P= 0,0266), según se evaluó mediante el análisis de mIF de células CD11c+ (Fig. 4c). En consonancia con esto, los análisis transcriptómicos globales de biopsias emparejadas evaluables (n= 19) indicaron una tendencia no estadísticamente significativa a un aumento en las puntuaciones de enriquecimiento del conjunto de genes de DCs maduras en las biopsias después del tratamiento del grupo de dosis más alta de MP0317 (n= 14; Fig. 4d). También se observaron tendencias adicionales de aumento en la puntuación de enriquecimiento de las firmas genéticas asociadas con las células plasmáticas y las células T foliculares (Tfh), así como con la activación de la vía del interferón-γ (IFNγ) en el grupo de dosis más alta de MP0317. La falta de significación estadística de estas lecturas de expresión génica podría explicarse potencialmente por el tamaño de muestra relativamente pequeño (el 30% de las muestras no fueron evaluables) y la heterogeneidad de la población de pacientes. Los cambios en las firmas genéticas relacionadas con todas las principales poblaciones de células inmunitarias en el microentorno tumoral (TME) para el grupo de dosis más alta de MP0317 se muestran en la Figura 2 de los datos suplementarios.

Se observaron de forma consistente niveles elevados de CXCL10, un marcador quimioatrayente, en el suero después del tratamiento con MP0317 en todos los pacientes (n= 46; Fig. 5a). Los aumentos observados fueron más pronunciados en los pacientes del grupo de dosis más alta de MP0317. Las concentraciones de CXCL10 en suero se correlacionaron significativamente (P= 0,045) con la expresión del gen CXCL10 en el tumor, lo que sugiere que las células dentro del TME que han sido moduladas por MP0317 pueden ser la fuente de este factor circulante (Figura 3 de los datos suplementarios).

La inmunofenotipificación sanguínea indicó una reducción transitoria en la abundancia de células B periféricas 1 semana después de la administración en el grupo de dosis más alta de MP0317 (Fig. 5b). Esto se acompañó de una regulación al alza significativa (P < 0,05) y sostenida de los marcadores de activación CD54 y CD69 en las células B periféricas (n= 43; Figura 4 de los datos suplementarios). El aumento de la puntuación de enriquecimiento de la firma génica de células plasmáticas en los tumores después del tratamiento con MP0317, descrito anteriormente, sugiere que la homing tumoral puede explicar potencialmente esta reducción en la abundancia de células B periféricas. La abundancia de células T periféricas, células asesinas naturales (NK) y monocitos no se alteró significativamente con el tratamiento con MP0317. En consonancia con el perfil de seguridad aceptable de MP0317 descrito anteriormente, no se observó una inducción pronunciada de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, TNF, interleucina-6) en el suero (Figura 5 de los datos suplementarios).

Dosis recomendada para la fase 2

Basándose en la totalidad de los datos, incluida la tolerabilidad, la eficacia clínica, la respuesta de PK y PD, la dosis recomendada para una mayor exploración de MP0317 es a dosis iguales o superiores a 1,5 mg/kg cada semana (Q1W) y 3 mg/kg cada 3 semanas (Q3W), con una frecuencia de dosificación ajustable para que coincida con un esquema de dosificación combinado.

Población de pacientes y tratamiento

Se seleccionaron sesenta y un pacientes con tumores sólidos avanzados recurrentes/refráctarios (Fig. 1; se muestran los detalles adicionales sobre los criterios de elegibilidad en Métodos). De estos, 15 pacientes no cumplieron los criterios de elegibilidad; los 46 restantes se incluyeron y recibieron tratamiento hasta la progresión de la enfermedad (n= 42), la retirada por parte del paciente (n= 2), una toxicidad inaceptable (n= 1) o la decisión del investigador (n= 1).

Los 46 pacientes (n= 24 mujeres, n= 22 hombres; edad media: 63 años (rango: 35-79)) presentaban un índice de rendimiento del Grupo de Oncología Cooperativa del Este (ECOG PS) de 0 (n= 22) a 1 (n= 24) y estaban muy pretratados, con una mediana de cuatro (rango: 1-13) líneas de tratamiento previas (incluidos 15 pacientes con tratamiento previo con inhibidores de puntos de control inmunitarios (CPI)). Los tipos de tumores más comunes fueron el cáncer colorrectal (n= 12, incluidos n= 11 con estado microsatelital estable y n= 1 con estado microsatelital inestable-alto), el cáncer de páncreas (n= 9), el mesotelioma (n= 6) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (n= 4) (Tabla 1).

MP0317 se administró por vía intravenosa cada 3 semanas (Q3W); se exploraron seis niveles de dosis: 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 y 10 mg/kg. Además, basándose en los datos farmacocinéticos (PK) emergentes, se exploraron tres niveles de dosis en un régimen semanal (Q1W): 0,5, 1,5 y 5 mg/kg. Los pacientes permanecieron en tratamiento durante un tiempo medio de 5 semanas (rango: 1-21).

Seguridad

Los 46 pacientes recibieron al menos una dosis de MP0317 (conjunto de análisis de seguridad) y se administraron un total de 228 infusiones. En general, se informaron 415 eventos adversos relacionados con el tratamiento en los 46 pacientes, y la mayoría no se consideraron relacionados con el tratamiento. En total, se informaron 118 eventos adversos relacionados con el tratamiento (TRAE) en 37 pacientes (Tabla 2). De estos, seis (5%) fueron de grado 3 según los Criterios Comunes de Terminología para Eventos Adversos del Instituto Nacional del Cáncer, y se produjeron en cuatro pacientes (9%). No hubo TRAE de grado superior a 3. Los TRAE más frecuentes fueron fatiga (informados en 15 pacientes (33%), grados 1 y 2), reacciones relacionadas con la infusión (IRR) (informadas en ocho pacientes (17%), grado 2), náuseas (informadas en siete pacientes (15%), grados 1 y 2), elevación de las transaminasas (informadas en cinco pacientes (11%), grados 1-3), anorexia (informada en cinco pacientes (11%), grados 1 y 2) y vómitos (informados en cuatro pacientes (9%), grados 1 y 2). Un paciente interrumpió el tratamiento del estudio debido a un TRAE: una IRR recurrente de grado 2.

Se informaron cinco eventos adversos graves (SAE) relacionados con el fármaco del estudio en cuatro (9%) pacientes. Dos de estos SAE fueron IRR de grado 2 informados en dos pacientes, lo que llevó a la hospitalización de los pacientes para su monitorización. Un SAE fue una insuficiencia cardíaca asintomática de grado 1, identificada durante las evaluaciones rutinarias del protocolo como una reducción de la fracción de eyección ventricular izquierda del 59% al 52%, en una paciente con carcinoma de mama, que había sido tratada previamente con una variedad de tratamientos sistémicos, incluidos los antraciclinicos, así como con radioterapia. La paciente había ingresado en el estudio con una insuficiencia cardíaca leve asintomática, estadio II de la Asociación Cardíaca de Nueva York. Los dos SAE restantes fueron aumentos asintomáticos de grado 3 de la aspartato aminotransferasa y la alanina aminotransferasa, ambos informados simultáneamente en un único paciente tratado con la dosis más alta de MP0317 de 10 mg/kg Q3W. Estos aumentos de las enzimas hepáticas de grado 3 se informaron como no graves por el investigador tratante, pero se clasificaron como graves por el patrocinador y se calificaron como DLT. No se observaron más DLT en el estudio. La dosis máxima tolerada (MTD) de MP0317 no se alcanzó en el estudio.

Actividad antitumoral

Los 46 pacientes tratados del conjunto de análisis de seguridad se incluyeron en el análisis de la actividad antitumoral. Un paciente con tumor del estroma gastrointestinal (GIST) en la cohorte 5b (MP0317 1,5 mg/kg Q1W) logró una respuesta parcial (PR) no confirmada, lo que resultó en una tasa de respuesta general (ORR) no confirmada del 2% (intervalo de confianza (IC) del 90%: 0,1 a 11,5). Catorce pacientes (30%) lograron una enfermedad estable (SD), de los cuales dos también mostraron una reducción cuantificable del tamaño de la lesión diana, lo que resultó en una tasa de control de la enfermedad (DCR) del 33% en la primera evaluación del tumor (TA) durante el tratamiento (aproximadamente a las 4-6 semanas; Fig. 2a). Cinco pacientes continuaron mostrando control de la enfermedad en el día 90 (4 SD, 1 PR lograda; DCR 11%). En el día 180, todos los pacientes habían progresado o interrumpido el estudio. El cambio relativo del tamaño de la lesión diana desde el inicio por paciente se muestra en la Fig. 2b. Veintinueve pacientes (63%) presentaban enfermedad progresiva, mientras que dos (4%) pacientes no fueron evaluables. La supervivencia libre de progresión (PFS) media fue similar en los dos esquemas de dosificación, con 38,5 días (IC del 95%: 35,0 a 80,0 días) en los pacientes con dosis Q1W y 36,0 días (IC del 95%: 35,0 a 39,0) en los pacientes con dosis Q3W.

Farmacocinética e inmunogenicidad

Después de infusiones intravenosas repetidas, las concentraciones séricas de MP0317 disminuyeron de forma monoexponencial en la mayoría de las cohortes y se mantuvieron detectables hasta el final del intervalo de dosificación con una variabilidad interindividual moderada (Fig. 3). Los parámetros farmacocinéticos (PK) (Tabla 1 del suplemento) obtenidos mediante el análisis no compartimental confirmaron que la farmacocinética sérica de MP0317 fue lineal para la concentración máxima sérica (Cmax) en los rangos de dosis probados de 0,03 a 10 mg/kg Q3W y de 0,5 a 5 mg/kg Q1W, mientras que el área bajo la curva (AUC) mostró un aumento mayor que proporcional a la dosis, lo que era consistente con el impacto de un "sumidero" de antígeno impulsado por CD40 sobre los niveles de exposición en dosis más bajas. El volumen de distribución medio en estado estacionario (Vss) se mantuvo constante en las diferentes dosis, con valores que se aproximaban al volumen sérico, lo que sugiere que la biodistribución de MP0317 en los tejidos sanos se limitó principalmente al sistema circulatorio. Las estimaciones medias de la vida media terminal (t1/2) de MP0317 aumentaron con la dosis, con valores que oscilaron entre 21,8 h (0,03 mg/kg) y 120 h (10 mg/kg) en las cohortes Q3W, y entre 60,2 h (0,5 mg/kg) y 103 h (5 mg/kg) en las cohortes Q1W, lo que confirma las propiedades de vida media prolongada de MP0317 (ref. ^[18]), que confieren un perfil farmacocinético adecuado para la dosificación Q1W o Q3W.

En el 85% de la población del estudio (93% en las cohortes Q3W y 75% en las cohortes Q1W), se detectaron anticuerpos antidrogas (ADA) contra MP0317 al menos una vez durante el tratamiento del estudio (Tabla 2 del suplemento). No hubo correlación entre el título de ADA y la dosis de MP0317. Además, en las dos dosis más altas del régimen Q3W (3 mg/kg y 10 mg/kg) y en las tres cohortes de dosificación Q1W (0,5 mg/kg, 1,5 mg/kg y 5 mg/kg), se observó una exposición sostenida a MP0317, lo que superó la eliminación mediada por el título de ADA (TMDD) y el impacto de los ADA. Los ADA, en caso de producirse, se detectaron hasta la interrupción del estudio.

Farmacodinamia

El efecto de MP0317 sobre los biomarcadores solubles se evaluó mediante inmunoensayos. Los niveles de FAP soluble libre (sFAP) y CD40 (sCD40) en el suero de los pacientes después del tratamiento se modificaron de una manera que indica la interacción de MP0317 con su diana en la periferia (Fig. 4a). Los niveles de sFAP disminuyeron poco después de la administración de MP0317, de forma dependiente de la dosis. En las dosis de MP0317 de 1,5 mg/kg y superiores, los niveles de sFAP se mantuvieron suprimidos, lo que indicaba la saturación de la diana en la periferia. Los niveles de sCD40 se mantuvieron estables en dosis inferiores a 5 mg/kg, mientras que las dosis de 5 mg/kg y superiores indujeron un aumento transitorio pronunciado en sCD40, lo que posiblemente refleja la inducción de la liberación de CD40 ^[26].

El análisis por inmunofluorescencia multiplex (mIF) demostró que MP0317 estaba presente en las biopsias tumorales del 85% de los pacientes (22 de 26) con biopsias tumorales emparejadas evaluables. Se observó colocalización de MP0317 con FAP y CD40 en el 81% de estos pacientes (21 de 26) (Fig. 4b).

Para explorar los efectos dinámicos de MP0317 sobre el microambiente inmunitario tumoral, los pacientes se dividieron en dos grupos según un plan de análisis exploratorio a priori. El primer grupo (en adelante, denominado ‘dosis baja de MP0317’) consistió en seis pacientes tratados con dosis no farmacológicamente activas según el modelado de PK/PD (≤0,1 mg/kg, cohortes 1 y 2, n= 4) o aquellos que no presentaban niveles detectables de MP0317 en la biopsia tumoral después de la administración (cohorte 4, 1 mg/kg cada 3 semanas, n= 2), según lo evaluado mediante mIF. El segundo grupo (en adelante, denominado ‘dosis más alta de MP0317’) consistió en pacientes tratados con la dosis ≥0,3 mg/kg (cohortes 3 y superiores) y que presentaban una detección confirmada de MP0317 en la biopsia tumoral después de la administración (n= 20). Los pacientes del grupo de dosis más alta de MP0317 mostraron un aumento significativo en la abundancia tumoral de células dendríticas (DCs) (P= 0,0266), según lo evaluado mediante el análisis mIF de células CD11c+ (Fig. 4c). En consonancia con esto, los análisis transcriptómicos globales de las biopsias emparejadas evaluables (n= 19) indicaron una tendencia no estadísticamente significativa a un aumento en las puntuaciones de enriquecimiento del conjunto de genes de DCs maduras en las biopsias después del tratamiento del grupo de dosis más alta de MP0317 (n= 14; Fig. 4d). También se observaron tendencias adicionales de aumento en la puntuación de enriquecimiento de las firmas genéticas asociadas con las células plasmáticas y las células T auxiliares foliculares (Tfh), así como con la activación de la vía del interferón-γ (IFNγ) en el grupo de dosis más alta de MP0317. La falta de significación estadística de estos resultados de expresión génica podría explicarse potencialmente por el tamaño de muestra relativamente pequeño (el 30% de las muestras no fueron evaluables) y la heterogeneidad de la población de pacientes. Los cambios en las firmas genéticas relacionadas con todas las principales poblaciones de células inmunitarias en el microambiente tumoral (TME) para el grupo de dosis más alta de MP0317 se muestran en la Figura 2 de los datos suplementarios.

Se observaron niveles elevados de CXCL10, un marcador quimioatrayente, en el suero después del tratamiento con MP0317 en todos los pacientes (n= 46; Fig. 5a). Los aumentos observados fueron más pronunciados en los pacientes del grupo de dosis más alta de MP0317. Las concentraciones de CXCL10 en suero se correlacionaron significativamente (P= 0,045) con la expresión del gen CXCL10 en el tumor, lo que sugiere que las células dentro del TME que han sido moduladas por MP0317 pueden ser la fuente de este factor circulante (Figura 3 de los datos suplementarios).

La inmunofenotipificación sanguínea indicó una reducción transitoria en la abundancia de células B periféricas 1 semana después de la administración en el grupo de dosis más alta de MP0317 (Fig. 5b). Esto se acompañó de una regulación al alza significativa (P < 0,05) y sostenida de los marcadores de activación CD54 y CD69 en las células B periféricas (n= 43; Figura 4 de los datos suplementarios). El aumento de la puntuación de enriquecimiento de la firma génica de las células plasmáticas en los tumores después del tratamiento con MP0317, descrito anteriormente, sugiere que la homing tumoral podría explicar potencialmente esta reducción en la abundancia de células B periféricas. La abundancia de células T periféricas, células asesinas naturales (NK) y monocitos no se alteró significativamente con el tratamiento con MP0317. En consonancia con el perfil de seguridad aceptable de MP0317 descrito anteriormente, no se observó una inducción pronunciada de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, TNF, interleucina-6) en el suero (Figura 5 de los datos suplementarios).

Dosis recomendada para la fase 2

Basado en la totalidad de los datos, incluyendo la tolerabilidad, la eficacia clínica, la respuesta farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD), la dosis recomendada para una mayor exploración de MP0317 es a dosis iguales o superiores a 1,5 mg/kg cada semana y 3 mg/kg cada 3 semanas, con una frecuencia de dosificación ajustable para que coincida con un esquema de dosificación combinado.

Discusión

Se han evaluado varios anticuerpos agonistas anti-CD40 como monoterapia en ensayos clínicos en oncología. Sin embargo, la mayoría de estos no progresaron más allá de las primeras fases de los ensayos clínicos, en particular debido a la toxicidad, incluyendo toxicidad hepática, síndrome de liberación de citocinas, reacciones relacionadas con la infusión y trombocitopenia, y actividad antitumoral limitada en monoterapia^[4],^[27]–^[29]. Para evitar las toxicidades sistémicas, se implementó la inyección intratumoral^[30],^[31] y se realizaron esfuerzos adicionales para permitir el agonismo de CD40 a nivel local en el sitio tumoral, ya sea en un enfoque específico del tumor, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos bispecíficos contra un antígeno asociado al tumor^[32], como la mesotelina^[33] o el antígeno carcinoembrionario^[34], o un direccionamiento no específico del tumor del TME^[35]. MP0317, una DARPin FAP x CD40, utiliza este enfoque mediante la activación de CD40 dependiente del entrecruzamiento de FAP. FAP es una serina proteasa de superficie celular sobreexpresada en los fibroblastos del estroma dentro de varios tumores sólidos^[23],^[24], como lo demuestra la amplia y robusta captación de trazadores inhibidores de FAP en la imagen de tomografía por emisión de positrones en una amplia gama de tipos de tumores, lo que destaca su potencial como un objetivo universal en oncología^[23],^[36]. Su expresión en los tejidos sanos es limitada, principalmente a los tejidos que experimentan un remodelado fisiológico, como durante la cicatrización de heridas.

En este primer estudio en humanos de fase 1, investigamos la seguridad, la PK, la PD y la actividad clínica preliminar de MP0317 administrado por vía intravenosa cada 3 semanas o cada semana en dosis de 0,03 a 10 mg/kg en 46 adultos con tumores sólidos avanzados. Nuestros hallazgos mostraron un perfil de seguridad favorable para MP0317 en todas las nueve cohortes de escalada de dosis. La mayoría de los eventos adversos relacionados con el tratamiento (TRAE) fueron leves (grados 1 y 2), y no se alcanzó la dosis máxima tolerada (MTD). Esto se compara favorablemente con el perfil de seguridad de varios anticuerpos agonistas anti-CD40 sistémicos, que se enfrentaron a eventos relacionados con la dosis limitante (DLT) en sus primeras etapas de desarrollo^[8]. Por ejemplo, para mitazalimab y sotigalimab, se informó de hepatotoxicidad limitante de la dosis en ensayos clínicos (lesión hepática inducida por fármacos^[37], elevación de las enzimas hepáticas^[38]). La toxicidad cardíaca no fue destacada en los ensayos clínicos con agonistas sistémicos de CD40^[8]. Sin embargo, los modelos cardíacos de lesión preclínica mostraron que la exposición a anticuerpos agonistas anti-CD40 podría, de hecho, provocar inflamación cardíaca al desencadenar un bucle inflamatorio de retroalimentación entre los macrófagos CCR2+ cardíacos y las células T CD8+, lo que sensibiliza el corazón a una lesión posterior, identificando un posible riesgo cardiovascular de los agonistas de CD40^[39]. El direccionamiento del agonismo de CD40 al sitio tumoral utilizando FAP, que no se expresa en los tejidos sanos, debería evitar estas toxicidades sistémicas. Aún así, se observó insuficiencia cardíaca asintomática de grado 1 en un paciente en el ensayo. No se puede descartar que, debido a la quimioterapia y radioterapia cardiotóxicas previas, existiera un daño y fibrosis cardíacos preexistentes en este paciente (estadio II de la Asociación Cardíaca de Nueva York en la línea de base), con regulación al alza de FAP en el corazón^[40],^[41]. La activación del CD40 en el sitio objetivo, fuera del tumor, con la consiguiente inflamación cardíaca, podría haber contribuido a la toxicidad cardíaca observada.

En general, los resultados informados confirman que la activación del CD40 localizada en el tumor en el TME es un enfoque seguro y puede evitar la toxicidad sistémica observada con los agonistas de CD40 no dirigidos^[35].

La tasa de respuesta objetiva (ORR) y la tasa de control de la enfermedad (DCR) fueron del 2% y del 33%, respectivamente, con un paciente con GIST que logró una respuesta parcial no confirmada y se observó enfermedad estable (SD) en 14 pacientes adicionales. Si bien, en modelos preclínicos, el agonismo de CD40 dirigido a FAP indujo una robusta eficacia antitumoral en modelos específicos^[18], la eficacia clínica con MP0317 como terapia única fue limitada, lo que, según nuestra hipótesis, podría atribuirse a la etapa avanzada de la enfermedad de la población de pacientes y al estado comprometido de su sistema inmunitario, lo que sugiere que las líneas de tratamiento más tempranas o un entorno neoadyuvante podrían ser más ventajosos. Además, la falta de respuesta podría reflejar la complejidad de la presentación del antígeno tumoral y la variabilidad de las respuestas antitumorales intrínsecas entre la población del ensayo. Aunque los tumores surgen de tejidos preexistentes, en general, las malignidades pueden ser reconocidas como ‘no propias’ por el sistema inmunitario del cuerpo. Diversos parámetros pueden influir en la respuesta antitumoral adaptativa, incluyendo la carga mutacional tumoral, el repertorio HLA del huésped, la heterogeneidad tumoral, la expresión de PD-L1 y la composición del microbioma^[42].

En consonancia con nuestros estudios anteriores en modelos animales^[18], los análisis de biomarcadores de las biopsias tumorales emparejadas confirmaron la localización tumoral deseada y la activación de la vía de CD40 por MP0317. El TME se remodeló tras el tratamiento con MP0317, con aumentos en las DCs, las células plasmáticas y las células Tfh. Hubo evidencia de activación de la vía de IFNγ y un aumento en la puntuación de enriquecimiento del conjunto de genes de maduración de DCs. Se ha descrito que las DCs y las células Tfh producen IFNγ^[43],^[44] y pueden explicar potencialmente la inducción de la firma descendente de IFNγ por MP0317. Alternativamente, dado que esta firma incluye varios genes relacionados con la presentación de antígenos (por ejemplo, HLA-DRA)^[45], su inducción después del tratamiento con MP0317 también puede reflejar la activación de las APC. También se observaron efectos periféricos en la PD, como el aumento del quimioatrayente CXCL10 y la reducción transitoria en la abundancia de células B periféricas, que también estaban en línea con el modo de acción deseado de MP0317. No observamos cambios evidentes en la infiltración y activación de las células T citotóxicas, lo que sugiere que la activación de CD40 y la modulación del TME por sí solas no son suficientes para inducir la inmunidad antitumoral mediada por células T, y deben combinarse con enfoques complementarios (por ejemplo, la activación de células T)^[46].

Es tentador especular que el aumento de la infiltración y activación de DCs y células plasmáticas intratumorales es indicativo de la formación de estructuras linfoides terciarias (TLS). Las TLS son órganos linfoides ectópicos compuestos por células inmunitarias (células T, DCs y células B) y células no inmunitarias (vénulas endoteliales altas y células del estroma) que se han propuesto recientemente como sitios privilegiados para la infiltración de células inmunitarias, la presentación de antígenos tumorales y la activación y proliferación de células T y B CD8+^[42],^[47]–^[49]. Varios estudios han asociado la presencia de TLS con un mejor pronóstico en varios tipos de cáncer^[50],^[51] y con una mejora de las respuestas a las inmunoterapias^[52],^[53]. Sin embargo, existen datos limitados sobre las vías precisas que median la inducción de novo de TLS por las inmunoterapias^[54],^[55]. Será de considerable interés en futuros estudios preclínicos, mecanicistas y clínicos, examinar si la activación del CD40 dirigida al tumor con MP0317 induce la formación de TLS, y si tales efectos proporcionan una mayor respuesta a este agente en combinación con otras inmunoterapias o vacunas.

Las principales limitaciones de este estudio son su pequeño tamaño de muestra, su diseño no aleatorizado y su enfoque en pacientes con enfermedad avanzada y muy tratados, lo que puede subestimar la posible eficacia en entornos más tempranos. El ensayo no estaba diseñado para evaluar el beneficio clínico, por lo que las conclusiones sobre la actividad antitumoral siguen siendo preliminares. Además, los hallazgos de los biomarcadores, aunque son consistentes con la activación de la vía de CD40, fueron exploratorios, y en algunos casos, no tenían suficiente potencia estadística debido al número limitado de muestras evaluables. Por lo tanto, esta investigación aún no puede establecer la eficacia clínica definitiva de MP0317 ni predecir los resultados en los regímenes combinados; estas preguntas requieren estudios más amplios y controlados.

En conclusión, el perfil de seguridad alentador y la remodelación profunda del microambiente tumoral (TME) observados en este estudio son coherentes con el mecanismo previsto de agonismo de CD40 localizado en el tumor por MP0317. La activación constante de la vía de CD40 en una población de pacientes heterogénea, junto con la expresión de FAP en una amplia gama de tipos de tumores, sugiere que MP0317 podría tener aplicación en diversos entornos de tumores sólidos. La combinación con modalidades terapéuticas dirigidas a las células T (por ejemplo, CPI, células CAR, activadores de células T) podría representar un enfoque complementario atractivo para aprovechar el mecanismo de remodelación tumoral de MP0317 y mejorar la respuesta de los pacientes. En estudios preclínicos, la combinación de la activación de CD40 con el bloqueo de los puntos de control inmunitario indujo la generación de células T polifuncionales y proporcionó una eficacia antitumoral robusta en un modelo de cáncer de páncreas refractario a la terapia ^[56]. Hasta la fecha, el pequeño número de estudios clínicos en etapas más avanzadas que examinan este concepto de combinación se ha limitado a agonistas de CD40 no dirigidos al tumor. Nuestro estudio con MP0317 indicó que la activación de CD40 dirigida al tumor es susceptible de regímenes de dosificación flexibles y se asocia con una propensión relativamente baja a las toxicidades sistémicas relacionadas con el sistema inmunitario, lo que apoya aún más la investigación de MP0317 en combinación con dichas terapias complementarias en estudios futuros.

Métodos

Diseño del estudio, criterios de elegibilidad de los pacientes y tratamiento

Este fue un estudio de fase 1, el primero en humanos, de etiqueta abierta, no aleatorizado y de escalada de dosis, diseñado para evaluar la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinética (PK) y el perfil farmacodinámico (PD) de MP0317 (NCT05098405). La parte de escalada de dosis se diseñó para determinar la dosis recomendada para la expansión (RDE) o la dosis máxima tolerada (MTD) para la monoterapia con MP0317, mientras que la parte de expansión de seguridad se diseñó para confirmar la seguridad en una población más amplia. El esquema de escalada de dosis utilizó un diseño de estudio adaptativo que siguió un modelo de regresión logística bayesiana (BLRM). El protocolo del estudio clínico fue aprobado por los comités de ética independientes Sud-Ouest et Outre-Mer II y The Medical Research Ethics Committee NedMec. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios éticos establecidos en la Declaración de Helsinki. Los 61 participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Un comité de revisión de la escalada de dosis supervisó la seguridad y determinó todas las decisiones de dosificación de los grupos. La parte de expansión de seguridad no se llevó a cabo en última instancia porque se consideró que el perfil de seguridad de MP0317 en monoterapia estaba adecuadamente caracterizado. El estudio se llevó a cabo en dos centros en Francia (Centre Léon Bérard en Lyon e IUCT-Oncopole en Toulouse) y en los Países Bajos (The Netherlands Cancer Institute en Ámsterdam y el Departamento de Oncología Médica UMC Utrecht). Los pacientes adultos eran elegibles para la inclusión si tenían un ECOG PS de 0 o 1 y una esperanza de vida de 12 semanas o más, según el criterio del investigador. No se requería que los pacientes fueran FAP+, pero debían tener una enfermedad medible según RECIST v.1.1 de un tumor sólido avanzado, con confirmación histológica, de uno de los tipos especificados en el protocolo, según la expresión de FAP informada ^[19], ^[23], y para el cual las terapias aprobadas se habían agotado o para el cual el investigador consideraba que el paciente no era elegible o no podía tolerar otros tratamientos: cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer anal, cáncer cervical, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, mesotelioma, cáncer de próstata, CPN, melanoma, cáncer urotelial o de vejiga, cáncer de alta inestabilidad de microsatélites de cualquier tipo, cáncer de células escamosas cutáneo o cáncer de mama. Excepcionalmente, se podrían incluir pacientes con otros tipos de tumores después de una discusión con el patrocinador, en función de la expresión de FAP informada y el posible beneficio de la inmunoterapia. Se solicitó un período de suspensión de 21 días antes de la primera administración del fármaco del estudio para el tratamiento antitumoral previo, incluido el tratamiento quimioterapéutico, hormonal o radioterápico, o 28 días para el tratamiento investigacional previo. Se recogieron biopsias tumorales emparejadas obligatorias al inicio y durante el tratamiento para evaluar la activación local de CD40 dentro del TME, según el modo de acción propuesto.

MP0317 se administró por vía intravenosa en nueve grupos de dosis ascendentes. Inicialmente, se planificó un régimen cada 3 semanas con hasta seis niveles de dosis. Estos niveles de dosis se seleccionaron en función de un modelo PK/PD traslacional que relaciona los niveles de exposición sérica de MP0317 y el curso temporal previsto de ocupación del objetivo CD40 tumoral, en función de las estimaciones de potencia de un ensayo de cocultivo in vitro que utiliza células B humanas y células CHO transfectadas con FAP ^[18]. Se introdujeron tres niveles de dosis adicionales cada 1 semana con una modificación del estudio, en función de los datos clínicos emergentes de PK de agonistas de CD40 sistémicos, que no se tuvieron en cuenta en el modelo de PK y PD, pero que sugirieron un sumidero de antígenos mediado por CD40 más fuerte y una mayor DLT de lo previsto ^[37]. El régimen cada 1 semana tenía como objetivo lograr tanto una mayor magnitud como una mayor duración de la activación de CD40 dentro del TME durante el intervalo de dosificación. Los pacientes recibieron tratamiento en ciclos de 21 días hasta la progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable, retirada del consentimiento u otras razones para interrumpir el tratamiento, lo que ocurriera primero.

El protocolo del estudio se incluye en el archivo complementario 1.

Puntos finales y evaluaciones

Los puntos finales primarios del estudio fueron la seguridad y la tolerabilidad, y la identificación de la MTD y la RDE. Se recopilaron datos sobre los eventos adversos (EA) y los eventos adversos graves (EAG) desde la firma del formulario de consentimiento informado hasta 28 días después de la última administración del fármaco del estudio o el final del estudio del paciente. Los puntos finales secundarios fueron el perfil de PK y la actividad antitumoral de MP0317. Las evaluaciones para este último incluyeron la ORR y el DCR según RECIST v.1.1 e iRECIST (RECIST modificado en estudios de inmunoterapia contra el cáncer), así como la PFS. Se consideró que la enfermedad de un paciente estaba controlada en puntos de tiempo predefinidos si la evaluación de la respuesta daba como resultado un CR/iCR, PR/iPR o SD/iSD. El DCR se evaluó en la primera evaluación durante el tratamiento (aproximadamente a las 4-6 semanas) y en los días 90, 180 y 270 del estudio. Los puntos finales exploratorios evaluaron los efectos de la PK y la inmunogenicidad de MP0317.

El comité de revisión de la escalada de dosis revisó los parámetros de seguridad antes de cada escalada de dosis. El período de evaluación de la DLT fue de 28 días. La respuesta tumoral se controló mediante tomografías computarizadas cada 6-8 semanas, con evaluación según RECIST v.1.1 e iRECIST.

Ensayos bioanalíticos

Las concentraciones de MP0317 en suero se evaluaron utilizando un inmunoensayo de quimioluminiscencia desarrollado y validado en Molecular Partners, que utiliza como reactivo de captura la CD40 humana recombinante biotinilada (Acrobiosystems) y como reactivo de detección un anticuerpo monoclonal anti-MP0317 Sulfotag (CePower). El límite de cuantificación del ensayo de PK es de 5 ng/ml.

La detección de ADA contra MP0317 se realizó con un método validado desarrollado en Molecular Partners (ensayo basado en quimioluminiscencia), utilizando como control positivo el anticuerpo monoclonal humanizado anti-DARPin (Evitria).

Análisis de datos de PK

Se calcularon los siguientes parámetros de PK a partir de los datos brutos de PK de MP0317 en suero: Cmáx, tiempo para alcanzar Cmáx (tmáx), concentración mínima en suero (Cmín), AUC, aclaramiento total, volumen de distribución en estado estacionario (Vss) y vida media (t1/2).

Específicamente, para los grupos de dosificación cada 3 semanas (grupos 1-6 con administración intravenosa a 0,03, 0,10, 0,30, 1,0, 3,0 y 10 mg/kg), se utilizaron los datos de PK de los ciclos 1 y 3 para realizar un análisis no compartimental, mientras que para los grupos de dosificación cada 1 semana (grupos 4b-6b con administración intravenosa a 0,5, 1,5 y 5 mg/kg), se utilizaron el día 1 del ciclo 1 y el día 15 del ciclo 1.

Los parámetros de PK se calcularon utilizando un análisis de PK no compartimental estándar utilizando el software Phoenix WinNonlin (v.8.4 o superior). También se realizó un resumen integrado de ADA utilizando Phoenix.

Para el análisis de PK, se utilizó el conjunto de análisis de PK.

Para la determinación de los parámetros de PK utilizando el análisis no compartimental, se aplicaron las siguientes reglas para los datos de PK por debajo del límite de cuantificación (BLQ) del ensayo de PK: los valores de BLQ previos a la dosis (antes de la primera dosis del estudio en el día 1 del ciclo 1) se establecieron en "0". Los valores de BLQ previos a la dosis en las visitas posteriores al día 1 del ciclo 1 se establecieron en el límite inferior de cuantificación (0,005 μg/ml) (LLOQ)/2. Para todas las visitas, el primer valor de BLQ posterior a la dosis se estableció en LLOQ/2, mientras que los valores de BLQ posteriores se trataron como datos faltantes. Los valores de BLQ incrustados (entre dos concentraciones medibles) se trataron como datos faltantes.

Análisis de inmunogenicidad

Los resultados de los ADA contra MP0317 se integraron en función de los resultados del ensayo de ADA para determinar el potencial de inmunogenicidad de MP0317. Se utilizó el conjunto de análisis de inmunogenicidad para integrar el resumen de ADA. Para integrar los resultados de la inmunogenicidad, se derivó la tasa de incidencia de ADA. Se informó el número de pacientes ADA+ (incluidos los inducidos por el tratamiento y los potenciados por el tratamiento como subcategorías) y los pacientes ADA- (incluidos los ADA- y los no afectados por el tratamiento como subcategorías) durante el estudio para cada grupo, para cada frecuencia de dosificación (cada 1 semana o cada 3 semanas) y en general, según la terminología de Shankar et al. ^[57]. Se informó la tasa de incidencia de ADA como el número de pacientes en cada categoría dividido por el número de pacientes en el grupo.

El inicio de la aparición de ADA se definió como el punto de tiempo en el que se observó la primera muestra ADA+. El inicio de la respuesta de ADA se resumió en función de estadísticas básicas (mediana, rango) para cada grupo, según la frecuencia de dosificación y en general. Por último, se evaluó la asociación de ADA y PK para determinar si los ADA eran de naturaleza eliminadora.

PD (análisis de biomarcadores)

Se analizaron muestras de biopsias tumorales emparejadas (n= 26) pretratamiento y durante el tratamiento tomadas en el día 8 del ciclo 2 (es decir, 28 días después de la primera dosis de MP0317) mediante inmunohistoquímica multiplexada (mIF) y secuenciación de ARN masiva en un laboratorio central. El suero periférico y la sangre fresca recogidos según el programa de evaluaciones del protocolo se analizaron utilizando un ensayo inmunoenzimático y un inmunoensayo Meso Scale Discovery y citometría de flujo, respectivamente, en un laboratorio central.

Análisis de mIF

Se desarrolló un método personalizado para detectar ocho biomarcadores (FAP, CD40, a-DARPin, CD3, CD68, CD11c, CD163 y pancitoqueratina) mediante mIF en muestras de tejido tumoral fijadas en formalina y incluidas en parafina, y fue validado por Precision for Medicine. Para cada muestra de paciente, se realizó una tinción con hematoxilina y eosina en un portaobjetos de tejido, que luego se digitalizó utilizando el sistema PhenoImager HT (Akoya, anteriormente Vectra Polaris); se evaluó y anotó la calidad del tejido por un patólogo. Las anotaciones de la biopsia tumoral incluyeron tumor, no tumor y posibles áreas de exclusión (como necrosis, hemorragia). Los portaobjetos se cargaron en el instrumento de tinción automática Leica BOND Rx y se tiñeron con un panel de 9 colores con los anticuerpos primarios para cada biomarcador; se utilizó la tinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol para determinar el número de núcleos y la morfología. Una vez teñidos y cubiertos, los portaobjetos se escanearon utilizando el sistema PhenoImager HT, se desmezclaron utilizando el software inForm y se analizaron utilizando el software de análisis de imágenes HALO. Los anticuerpos utilizados para mIF se proporcionan en las tablas complementarias.

Análisis de secuenciación de ARN

SPANISH TRANSLATION:

Se realizó la secuenciación de ARN de biopsias utilizando un Illumina Novaseq 6000 por Neogenomics. Los resultados de la secuenciación se convirtieron utilizando bcl2fastq y luego se alinearon utilizando STAR^[58]; se calcularon los transcritos normalizados por millón utilizando TPMCalculator^[59]. Para el control de calidad de la secuenciación de ARN y la alineación, se evaluaron las siguientes medidas: origen génico de las lecturas; puntuación de calidad por secuencia; contenido de secuencia por base; contenido de GC por secuencia; distribución de la longitud de la secuencia; y niveles de duplicación de la secuencia. A continuación, se calcularon las puntuaciones de enriquecimiento del conjunto de genes utilizando el paquete R GSVA. Las firmas génicas^[45],^[60],^[61] utilizadas se proporcionan en las Tablas Suplementarias. El análisis se realizó en grupos preespecificados, como para los datos de mIF. El análisis estadístico de los cambios en las puntuaciones de GSVA se realizó utilizando una prueba de Wilcoxon de rangos con signo pareada, utilizando el paquete ggpubr.

Citometría de flujo

Se enviaron muestras de sangre total en tubos de heparina sódica de 4 ml a temperatura ambiente para la preparación de la muestra y el análisis de citometría de flujo, de acuerdo con los protocolos de ensayo validados para uso en investigación. Se utilizó un panel de citometría de flujo personalizado y validado multicolor, diseñado para identificar y enumerar los subconjuntos de células T, B y NK, para el seguimiento de los recuentos de células sanguíneas (Q2 Solutions). Las muestras se tiñeron con anticuerpos primarios para CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD45 y CD56, y se analizaron en citómetros de flujo BD FACS Canto II (BD Biosciences). Los linfocitos se identificaron mediante CD45+ y dispersión lateral (SSC), excluyendo los desechos y los monocitos. Las células T (CD3+), las células B (CD19+) y las células NK (CD3−CD16+CD56+) se identificaron dentro de la población de linfocitos, con CD4/CD8 que define los subconjuntos de células T. Se diseñó un panel de citometría de flujo multicolor para identificar y enumerar los subconjuntos de células inmunitarias de interés (es decir, células B, T y DC) descritos a continuación. Las muestras se adquirieron utilizando el Cytek Aurora (Cytek Biosciences). La combinación de tinte de viabilidad fijable y SSC-A se utilizó para excluir las células muertas del análisis y la expresión de CD45 para determinar la población de leucocitos CD45+. La expresión de CD19, HLA-DR y CD14 se utilizó para definir los monocitos y las células B, con CD56, CD16 y CD3 utilizados para definir las células NK, NKT y T, respectivamente. A continuación, se utilizaron CD8 y CD4 para definir aún más las células T citotóxicas y las células T colaboradoras, respectivamente. Los subconjuntos de células DC se definieron por la expresión de CD123 y CD11c y se clasificaron aún más por la expresión de CD1c y CD141. Se evaluaron los marcadores CD86, CD69, CD54, CD40, CD25 y HLA-DR en los subconjuntos definidos anteriormente. El análisis de datos se realizó con el software BD FACSDiva o SpectroFlo y los paquetes ggplot2 y ggpubr en R v.4.5.

Los paneles de citometría de flujo y los anticuerpos utilizados para la inmunofenotipificación se proporcionan en las Tablas Suplementarias.

Ensayos de quimioluminiscencia electroquímica

Se almacenaron alícuotas de suero de muestras clínicas (hasta 0,5 ml por vial) a −80 °C hasta que se realizaron los análisis a continuación por Precision for Medicine. La concentración (pg/ml) de IFNγ, interleucina-10 (IL-10), IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF, IP-10 (CXCL10), MIG (CXCL9) en suero se midió utilizando un método de quimioluminiscencia electroquímica (ECL) validado (MSD). Se utilizaron los siguientes kits listos para usar: V-PLEX Plus Proinflammatory Panel 1 (human) Kit (núm. de catálogo K150496-2), V-PLEX Plus Human IP10 Kit (núm. de catálogo K151NVG), R-PLEX Human MIG Assay, SECTOR (núm. de catálogo K1510IR) con Antibody Set (núm. de catálogo B210I-3). Los kits V-PLEX Plus están desarrollados y validados por el fabricante, que proporciona las especificaciones del número de lote, incluidos los valores de referencia LLOQ y ULOQ. Los análisis se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El R-PLEX Human MIG Assay es un ensayo desarrollado en una etapa temprana dentro de la plataforma MSD y se validó aún más por Precision for Medicine.

Las concentraciones de sFAP y sCD40 se determinaron en suero humano utilizando inmunoensayos sándwich basados en ECL, validados en Molecular Partners. Para analizar sFAP, se recubrió una placa SECTOR de 96 pocillos MSD GOLD con anticuerpo humano biotinilado contra FAP (núm. de catálogo DY3715, R&D Systems). El material de referencia utilizado para los estándares de calibración y la preparación del control de calidad fue FAP humano recombinante (núm. de catálogo 3715-SE, R&D Systems). Se utilizó un anticuerpo D8 etiquetado con SulfoTag (núm. de catálogo MABS1001, Vitatex) para la detección. Para analizar sCD40, se recubrió una placa SECTOR de 96 pocillos Small Spot MSD GOLD (núm. de catálogo L45SA, Meso Scale Discovery) con anticuerpo humano biotinilado contra CD40 (núm. de catálogo C217B-3, Meso Scale Discovery). El material de referencia utilizado para los estándares de calibración y la preparación del control de calidad fue CD40 humano recombinante (núm. de catálogo C017B-2, Meso Scale Discovery). Se utilizó un anticuerpo humano CD40 etiquetado con SulfoTag (núm. de catálogo D217B-3, Meso Scale Discovery) para la detección.

Estadísticas y reproducibilidad

Se probaron nueve niveles de dosis con al menos dos a nueve pacientes por nivel de dosis. Se definieron los siguientes conjuntos de análisis en el plan de análisis estadístico: El conjunto de análisis de seguridad (SAS) incluyó a todos los pacientes que recibieron al menos una administración de MP0317 y que tuvieron al menos una evaluación de seguridad posdosis. El SAS fue la población principal para todos los puntos finales relacionados con la demografía, la seguridad, la inmunogenicidad, la eficacia y la respuesta. El conjunto de determinación de dosis (DDS) incluyó a todos los pacientes en el SAS que cumplieron con los criterios de evaluabilidad de la DLT. El DDS se utilizó para estimar la relación dosis-DLT en la parte de escalada de dosis. El conjunto de análisis de farmacocinética (PK) consistió en todos los pacientes que recibieron al menos una dosis de MP0317 y que tuvieron al menos una medición de PK posdosis. El conjunto de análisis de inmunogenicidad consistió en todos los pacientes en el SAS que tuvieron al menos una muestra de sangre posbasal recolectada para evaluar la inmunogenicidad.

Para la parte de escalada de dosis, se utilizó un BLRM adaptativo de dos parámetros para determinar la RDE o la DTM. El BLRM se guió por el principio de escalada con control de sobredosis, que estableció que cualquier dosis de MP0317 que tuviera más del 25% de probabilidad de estar en la categoría de toxicidad excesiva no se consideraría para la siguiente cohorte.

Los eventos adversos (EA) se codificaron utilizando MedDRA v.24.1 y actualizaciones. Las evaluaciones de laboratorio de seguridad se realizaron en un laboratorio local y se analizaron según el paciente y la visita. Los signos vitales y la oximetría de pulso, el electrocardiograma, el examen físico y el ECOG PS se analizaron según el grupo de tratamiento y la visita.

Los análisis de eficacia se realizaron según los criterios de respuesta evaluados por el investigador: la ORR se resumió con intervalos de confianza exactos de dos caras del 90% para proporciones binomiales. Además, se crearon gráficos de cascada que mostraban el cambio porcentual máximo en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana en comparación con la línea de base y la mejor respuesta general según RECIST v.1.1/iRECIST. La DCR se resumió con intervalos de confianza exactos de dos caras del 90% para proporciones binomiales según el grupo de tratamiento.

Para todas las evaluaciones de respuesta, se crearon gráficos de nadador que mostraban las evaluaciones de RECIST v.1.1/iRECIST por paciente a lo largo del tiempo.

Los datos demográficos de los pacientes y otros datos de selección se enumeraron y resumieron utilizando estadísticas descriptivas. La exposición al tratamiento del estudio se resumió con estadísticas descriptivas para el número total de infusiones recibidas.

Se asumió que la distribución de los datos era normal, pero esto no se probó formalmente.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Diseño del estudio, criterios de elegibilidad de los pacientes y tratamiento

Este fue un estudio de fase 1, de primera administración en humanos, de etiqueta abierta, no aleatorizado y de escalada de dosis, diseñado para evaluar la seguridad, la tolerabilidad, el perfil farmacocinético (PK) y farmacodinámico (PD) de MP0317 (NCT05098405). La parte de escalada de dosis se diseñó para determinar la dosis recomendada para la expansión (RDE) o la DTM para la monoterapia con MP0317, mientras que la parte de expansión de seguridad se diseñó para confirmar la seguridad en una población más amplia. El esquema de escalada de dosis utilizó un diseño de estudio adaptativo que siguió un modelo de regresión logística bayesiano (BLRM). El protocolo del estudio clínico fue aprobado por los comités de ética independientes Sud-Ouest et Outre-Mer II y The Medical Research Ethics Committee NedMec. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki. Los 61 participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. Un comité de revisión de la escalada de dosis supervisó la seguridad y gobernó todas las decisiones de dosificación de la cohorte. La parte de expansión de seguridad no se llevó a cabo en última instancia porque se consideró que el perfil de seguridad de MP0317 en monoterapia estaba adecuadamente caracterizado. El estudio se llevó a cabo en dos centros en Francia (Centre Léon Bérard en Lyon y IUCT-Oncopole en Toulouse) y en los Países Bajos (The Netherlands Cancer Institute en Ámsterdam y el Departamento de Oncología Médica UMC Utrecht). Los pacientes adultos eran elegibles para la inclusión si tenían un ECOG PS de 0 o 1 y una esperanza de vida de 12 semanas o más según el juicio del investigador. No se requería que los pacientes fueran FAP+, pero debían tener una enfermedad medible según RECIST v.1.1 de un tumor sólido avanzado, histológicamente probado, de uno de los tipos especificados en el protocolo, según la expresión de FAP informada^[19],^[23], y para el cual las terapias aprobadas se habían agotado o para el cual el investigador consideraba que el paciente no era elegible o no podía tolerar otros tratamientos: cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer anal, cáncer de cuello uterino, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, mesotelioma, cáncer de próstata, CPN, melanoma, cáncer de urotelio o vejiga, cáncer de alta inestabilidad de microsatélites de cualquier tipo, cáncer de células escamosas cutáneas o cáncer de mama. Excepcionalmente, se podrían incluir pacientes con otros tipos de tumores después de la discusión con el patrocinador, en función de la expresión de FAP informada y el posible beneficio del tratamiento inmunológico. Se solicitó un período de lavado de 21 días antes de la primera administración del fármaco del estudio para el tratamiento antitumoral previo, incluido el tratamiento quimioterapéutico, hormonal o radioterápico, o 28 días para el tratamiento de investigación previo. Se recolectaron biopsias tumorales emparejadas obligatorias en la línea de base y durante el tratamiento para evaluar la activación local de CD40 dentro del microambiente tumoral (TME) según el modo de acción propuesto.

MP0317 se administró por vía intravenosa en nueve cohortes de dosis ascendentes. Inicialmente, se planificó un régimen cada 3 semanas con hasta seis niveles de dosis. Estos niveles de dosis se seleccionaron en función de un modelo PK/PD traslacional que vinculaba los niveles de exposición sérica de MP0317 y el curso temporal previsto de la ocupación del objetivo tumoral CD40, en función de las estimaciones de potencia de un ensayo de co-cultivo in vitro que utilizaba células B humanas y células CHO transgénicas con FAP^[18]. Se introdujeron tres niveles de dosis adicionales cada 1 semana con una modificación del estudio, en función de los datos clínicos emergentes de PK de los agonistas de CD40 sistémicos, que no se tuvieron en cuenta en el modelo de PK y PD, pero que sugirieron un sumidero de antígeno mediado por CD40 más fuerte y una DTM más alta de lo previsto^[37]. El régimen cada 1 semana tenía como objetivo lograr tanto una mayor magnitud como una mayor duración de la activación de CD40 dentro del TME durante el intervalo de dosificación. Los pacientes recibieron tratamiento en ciclos de 21 días hasta la progresión de la enfermedad, una toxicidad inaceptable, la retirada del consentimiento u otras razones para interrumpir el tratamiento, lo que ocurriera primero.

El protocolo del estudio se incluye en el Archivo Suplementario 1.

Puntos finales y evaluaciones

Los criterios de valoración principales del estudio fueron la seguridad y la tolerabilidad, así como la identificación de la dosis máxima tolerada (DMT) y la dosis óptima para la eficacia (DOE). Se recopilaron datos sobre las reacciones adversas (RA) y las reacciones adversas graves (RAG) desde la firma del formulario de consentimiento informado hasta 28 días después de la administración de la última dosis del fármaco del estudio o el final del estudio para el paciente. Los criterios de valoración secundarios fueron el perfil farmacocinético (PK) y la actividad antitumoral de MP0317. Las evaluaciones para este último incluyeron la tasa de respuesta objetiva (TRO) y la tasa de control de la enfermedad (TCE) según RECIST v.1.1 e iRECIST (RECIST modificado en estudios de inmunoterapia contra el cáncer), así como la supervivencia libre de progresión (SLP). Se consideró que la enfermedad de un paciente estaba controlada en puntos temporales predefinidos si la evaluación de la respuesta daba como resultado una respuesta completa/respuesta completa iRECIST (RC/iRC), una respuesta parcial/respuesta parcial iRECIST (RP/iRP) o una enfermedad estable/enfermedad estable iRECIST (EE/iEE). La TCE se evaluó en la primera evaluación de la respuesta durante el tratamiento (aproximadamente a las 4-6 semanas) y en los días 90, 180 y 270 del estudio. Los criterios de valoración exploratorios evaluaron los efectos farmacocinéticos e inmunogénicos de MP0317.

Los parámetros de seguridad fueron revisados por el comité de revisión de la escalada de dosis antes de cada escalada de dosis. El período de evaluación de la dosis limitante de toxicidad (DLT) fue de 28 días. La respuesta tumoral se monitorizó mediante tomografías computarizadas cada 6-8 semanas, con evaluación según RECIST v.1.1 e iRECIST.

Ensayos bioanalíticos

Las concentraciones de MP0317 en suero se evaluaron utilizando un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL) desarrollado y validado en Molecular Partners, que utiliza como reactivo de captura CD40 humano recombinante biotinilado (Acrobiosystems) y como reactivo de detección un anticuerpo monoclonal anti-MP0317 Sulfotag (CePower). El límite de cuantificación del ensayo de PK es de 5 ng/mL.

La detección de anticuerpos anti-MP0317 (ADA) se realizó con un método validado desarrollado en Molecular Partners (ensayo basado en ECL), utilizando como control positivo el anticuerpo monoclonal anti-DARPin humanizado (Evitria).

Análisis de datos de PK

Los siguientes parámetros de PK se calcularon a partir de los datos brutos de PK de MP0317 en suero: Cmáx, tiempo hasta Cmáx (tmáx), concentración mínima en suero (Cmín), AUC, aclaramiento total, volumen de distribución en estado estacionario (Vss) y semivida (t1/2).

Específicamente, para los grupos de dosis Q3W (cohortes 1-6 con administración intravenosa a 0,03, 0,10, 0,30, 1,0, 3,0 y 10 mg/kg), se utilizaron los datos de PK de los ciclos 1 y 3 para realizar un análisis no compartimental, mientras que para los grupos de dosis Q1W (cohortes 4b-6b con administración intravenosa a 0,5, 1,5 y 5 mg/kg), se utilizaron el día 1 del ciclo 1 y el día 15 del ciclo 1.

Los parámetros de PK se calcularon utilizando un análisis de PK no compartimental estándar utilizando el software Phoenix WinNonlin (v.8.4 o superior). También se realizó un resumen integrado de ADA utilizando Phoenix.

Para el análisis de PK, se utilizó el conjunto de análisis de PK.

Para la determinación de los parámetros de PK utilizando el análisis no compartimental, se utilizaron las siguientes reglas para los datos de PK por debajo del límite de cuantificación (BLQ) del ensayo de PK: los valores de BLQ pre-dosis (antes de la primera dosis del estudio en el día 1 del ciclo 1) se establecieron en "0". Los valores de BLQ pre-dosis en las visitas posteriores al día 1 del ciclo 1 se establecieron en el límite inferior de cuantificación (0,005 μg/mL) (LLOQ)/2. Para todas las visitas, el primer valor de BLQ post-dosis se estableció en LLOQ/2, mientras que los valores de BLQ posteriores se trataron como datos faltantes. Los valores de BLQ incrustados (entre dos concentraciones medibles) se trataron como datos faltantes.

Análisis de inmunogenicidad

Los resultados de los ADA contra MP0317 se integraron en función de los resultados del ensayo de ADA para determinar el potencial inmunogénico de MP0317. Se utilizó el conjunto de análisis de inmunogenicidad para integrar el resumen de ADA. Para integrar los resultados de la inmunogenicidad, se derivó la tasa de incidencia de ADA. Se informó el número de pacientes ADA+ (incluidos los inducidos por el tratamiento y los potenciados por el tratamiento como subcategorías) y los pacientes ADA- (incluidos los ADA- y los no afectados por el tratamiento como subcategorías) durante todo el estudio para cada cohorte, para cada frecuencia de dosificación (Q1W o Q3W) y en general, según la terminología de Shankar et al. ^[57]. La tasa de incidencia de ADA se informó como el número de pacientes en cada categoría dividido por el número de pacientes en la cohorte.

El inicio de la aparición de ADA se definió como el punto temporal en el que se observó la primera muestra ADA+. El inicio de la respuesta de ADA se resumió en función de estadísticas básicas (mediana, rango) para cada cohorte, según la frecuencia de dosificación y en general. Finalmente, se evaluó la asociación de ADA y PK para determinar si los ADA eran de naturaleza eliminadora.

PD (análisis de biomarcadores)

Se analizaron biopsias tumorales pareadas (n = 26) pretratamiento y durante el tratamiento tomadas en el día 8 del ciclo 2 (es decir, 28 días después de la primera dosis de MP0317) con inmunohistoquímica (mIF) y secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq) en un laboratorio central. El suero periférico y la sangre fresca recolectados según el programa de evaluaciones del protocolo se analizaron utilizando un ensayo inmunoenzimático y un inmunoensayo Meso Scale Discovery y citometría de flujo, respectivamente, en un laboratorio central.

Análisis de mIF

Un método personalizado para detectar ocho biomarcadores (FAP, CD40, a-DARPin, CD3, CD68, CD11c, CD163 y citoqueratina pan) mediante mIF en muestras de tejido tumoral fijadas en formalina e incluidas en parafina fue validado por Precision for Medicine. Para cada muestra de paciente, se realizó una tinción con hematoxilina y eosina en un portaobjetos de tejido, que luego se digitalizó utilizando el sistema PhenoImager HT (Akoya, anteriormente Vectra Polaris); se evaluó y anotó la calidad del tejido por un patólogo. Las anotaciones de la biopsia tumoral incluyeron tumor, no tumor y áreas de exclusión eventual (como necrosis, hemorragia). Los portaobjetos se cargaron en el instrumento de tinción automática Leica BOND Rx y se tiñeron con un panel de 9 colores con los anticuerpos primarios para cada biomarcador; se utilizó la tinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol para determinar el número de núcleos y la morfología. Una vez teñidos y cubiertos, los portaobjetos se escanearon utilizando el sistema PhenoImager HT, se desmezclaron utilizando el software inForm y se analizaron utilizando el software de análisis de imágenes HALO. Se puntuó el porcentaje total de células nucleadas positivas para un biomarcador específico sobre el total de células nucleadas y la densidad celular (recuento por μm2) en dos regiones por muestra. Los anticuerpos utilizados para mIF se proporcionan en las tablas suplementarias.

Análisis de RNA-seq

La secuenciación de ARN de las biopsias se realizó utilizando un Illumina Novaseq 6000 por Neogenomics. Los resultados de la secuenciación se convirtieron utilizando bcl2fastq y luego se alinearon utilizando STAR ^[58]; se calcularon los transcritos normalizados por millón utilizando TPMCalculator ^[59]. Para el control de calidad de la secuenciación de ARN y la alineación, se evaluaron las siguientes medidas: origen genético de las lecturas; puntuación de calidad de la secuencia por secuencia; contenido de la secuencia por base; contenido de GC de la secuencia; distribución de la longitud de la secuencia; y niveles de duplicación de la secuencia. Luego, se calcularon las puntuaciones de enriquecimiento del conjunto de genes utilizando el paquete R GSVA. Las firmas genéticas ^[45], ^[60], ^[61] utilizadas se proporcionan en las tablas suplementarias. El análisis se realizó en grupos preespecificados, como para los datos de mIF. Se realizó un análisis estadístico de los cambios en las puntuaciones de GSVA utilizando una prueba de rango firmado de Wilcoxon pareada, utilizando el paquete ggpubr.

Citometría de flujo

Las muestras de sangre total en tubos de heparina de sodio de 4 ml se enviaron a temperatura ambiente para la preparación de la muestra y el análisis de citometría de flujo según los protocolos de ensayo validados para uso en investigación. Se utilizó un panel de citometría de flujo personalizado y validado de múltiples colores, diseñado para identificar y enumerar los subconjuntos de células T, B y NK para el monitoreo de los recuentos de células sanguíneas (Q2 Solutions). Las muestras se tiñeron con anticuerpos primarios para CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD45 y CD56, y se analizaron en citómetros de flujo BD FACS Canto II (BD Biosciences). Los linfocitos se identificaron mediante la expresión de CD45+ y la dispersión lateral (SSC), excluyendo los desechos y los monocitos. Las células T (CD3+), las células B (CD19+) y las células NK (CD3−CD16+CD56+) se identificaron dentro de la puerta de linfocitos, con CD4/CD8 que define los subconjuntos de células T. Se diseñó un panel de citometría de flujo de múltiples colores para identificar y enumerar los subconjuntos de células inmunitarias de interés (es decir, células B, T y dendríticas) descritas a continuación. Las muestras se adquirieron utilizando el Cytek Aurora (Cytek Biosciences). La combinación de tinte de viabilidad fijable y SSC-A se utilizó para excluir las células muertas del análisis y la expresión de CD45 para determinar la población de leucocitos CD45+. La expresión de CD19, HLA-DR y CD14 se utilizó para definir monocitos y células B, con CD56, CD16 y CD3 utilizados para definir células NK, NKT y T, respectivamente. CD8 y CD4 se utilizaron luego para definir aún más las células T citotóxicas y las células T colaboradoras, respectivamente. Los subconjuntos de células dendríticas se definieron por la expresión de CD123 y CD11c y se clasificaron aún más por la expresión de CD1c y CD141. Los marcadores CD86, CD69, CD54, CD40, CD25 y HLA-DR se evaluaron en los subconjuntos definidos anteriormente. El análisis de datos se realizó con el software BD FACSDiva o SpectroFlo y los paquetes ggplot2 y ggpubr en R v.4.5.

Los paneles de citometría de flujo y los anticuerpos utilizados para la inmunotipificación se proporcionan en las tablas suplementarias.

Ensayos de electroquimioluminiscencia

Los aliquots de suero de muestras clínicas (hasta 0,5 ml por vial) se almacenaron a -80 °C hasta que se realizaron los análisis a continuación por Precision for Medicine. La concentración (pg/ml) de IFNγ, interleucina-10 (IL-10), IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF, IP-10 (CXCL10), MIG (CXCL9) en suero se midió utilizando un método de electroquimioluminiscencia (ECL) validado (MSD). Se utilizaron los siguientes kits listos para usar: V-PLEX Plus Proinflammatory Panel 1 (human) Kit (núm. de catálogo K150496-2), V-PLEX Plus Human IP10 Kit (núm. de catálogo K151NVG), R-PLEX Human MIG Assay, SECTOR (núm. de catálogo K1510IR) con Antibody Set (núm. de catálogo B210I-3). Los kits V-PLEX Plus están desarrollados y validados por el fabricante, que proporciona especificaciones del número de lote, incluidos los valores de referencia LLOQ y ULOQ. Los análisis se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El R-PLEX Human MIG Assay es un ensayo desarrollado anteriormente dentro de la plataforma MSD y fue validado aún más por Precision for Medicine.

Las concentraciones de sFAP y sCD40 se determinaron en suero humano utilizando inmunoensayos sándwich basados en ECL, validados en Molecular Partners. Para analizar sFAP, se recubrió una placa SECTOR de 96 pocillos MSD GOLD con anticuerpo humano biotinilado contra FAP (núm. de catálogo DY3715, R&D Systems). El material de referencia utilizado para los estándares de calibración y la preparación del control de calidad fue el FAP humano recombinante (núm. de catálogo 3715-SE, R&D Systems). Se utilizó un anticuerpo D8 Sulfotag (núm. de catálogo MABS1001, Vitatex) para la detección. Para analizar sCD40, se recubrió una placa SECTOR de pozos pequeños de 96 pocillos MSD GOLD (núm. de catálogo L45SA, Meso Scale Discovery) con anticuerpo humano biotinilado contra CD40 (núm. de catálogo C217B-3, Meso Scale Discovery). El material de referencia utilizado para los estándares de calibración y la preparación del control de calidad fue el CD40 humano recombinante (núm. de catálogo C017B-2, Meso Scale Discovery). Se utilizó un anticuerpo humano SulfoTag contra CD40 (núm. de catálogo D217B-3, Meso Scale Discovery) para la detección.

Estadísticas y reproducibilidad

Se probaron nueve niveles de dosis con al menos dos a nueve pacientes por nivel de dosis. Se definieron los siguientes conjuntos de análisis en el plan de análisis estadístico: el conjunto de análisis de seguridad (SAS) incluyó a todos los pacientes que recibieron al menos una administración de MP0317 y que tuvieron al menos una evaluación de seguridad post-dosis. El SAS fue la población principal para todos los criterios de valoración relacionados con la demografía, la seguridad, la inmunogenicidad, la eficacia y el PD, excepto para la determinación de la relación dosis-DLT. El conjunto de determinación de dosis (DDS) incluyó a todos los pacientes en el SAS que cumplieron con los criterios de evaluabilidad de la DLT. El DDS se utilizó para estimar la relación dosis-DLT en la parte de escalada de dosis del estudio. El conjunto de análisis de PK consistió en todos los pacientes que recibieron al menos una dosis de MP0317 y que tuvieron al menos una medición de PK post-dosis. El conjunto de análisis de inmunogenicidad consistió en todos los pacientes en el SAS que tuvieron al menos una muestra de sangre post-basal recolectada para evaluar la inmunogenicidad.

Para la fase de escalada de dosis, se utilizó un modelo BLRM adaptativo de dos parámetros para determinar la dosis óptima o la dosis máxima tolerada (MTD). El modelo BLRM se basó en el principio de escalada con control de sobredosis, que establecía que cualquier dosis de MP0317 con más del 25% de probabilidad de estar en la categoría de toxicidad excesiva no se consideraría para la siguiente cohorte.

Los eventos adversos (EA) se codificaron utilizando MedDRA v.24.1 y sus actualizaciones. Las evaluaciones de seguridad en el laboratorio se realizaron en un laboratorio local y se analizaron según el paciente y la visita. Los signos vitales y la oximetría de pulso, el electrocardiograma, el examen físico y el ECOG PS se analizaron según el grupo de tratamiento y la visita.

Los análisis de eficacia se realizaron según los criterios de respuesta evaluados por el investigador: la tasa de respuesta objetiva (ORR) se resumió con intervalos de confianza (IC) exactos del 90% de dos lados para proporciones binomiales. Además, se crearon gráficos de cascada que mostraban el cambio porcentual máximo en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana en comparación con el valor basal y la mejor respuesta general según RECIST v.1.1/iRECIST. La tasa de control de la enfermedad (DCR) se resumió con intervalos de confianza exactos del 90% de dos lados para proporciones binomiales según el grupo de tratamiento.

Para todas las evaluaciones de respuesta, se crearon gráficos de "swimmer" que mostraban las evaluaciones RECIST v.1.1/iRECIST por paciente a lo largo del tiempo.

Las características demográficas de los pacientes y otros datos de cribado se enumeraron y resumieron utilizando estadísticas descriptivas. La exposición al tratamiento del estudio se resumió con estadísticas descriptivas para el número total de infusiones recibidas.

Se asumió que la distribución de los datos era normal, pero esto no se comprobó formalmente.

Resumen de la información presentada

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de información de Nature Portfolio, que está vinculado a este artículo.