TMEM87A suprime la ferroptosis e incrementa la resistencia a la inmunoterapia contra el cáncer al mantener la homeostasis del pH del aparato de Golgi.

La ferroptosis es una forma de muerte celular desencadenada por la acumulación excesiva de peroxidación lipídica^[1],^[2]. La membrana plasmática (MP) es el sitio principal donde los fosfolípidos que contienen ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) se peroxidan, lo que conduce a la ruptura de la membrana y a la ejecución de la ferroptosis^[3]. Además de la MP, múltiples membranas de orgánulos subcelulares contribuyen a la ferroptosis. Se ha demostrado que la acumulación de peroxidación lipídica en la membrana mitocondrial o el aumento de la permeabilidad de la membrana modulan la sensibilidad a la ferroptosis^[4],^[5]. Recientemente, se identificó la membrana del retículo endoplásmico (RE) como el sitio inicial donde se produce la peroxidación lipídica antes que en la MP^[6],^[7]. Curiosamente, el aparato de Golgi, un orgánulo delimitado por membranas responsable del procesamiento y la clasificación de proteínas y lípidos, participa en la regulación del estrés oxidativo y presenta peroxidación lipídica en su membrana^[8]–^[10]. Sin embargo, no está claro cómo el aparato de Golgi responde a la inducción de la ferroptosis y si las proteínas localizadas en el Golgi pueden regular la ejecución de la ferroptosis.

Como mecanismo supresor de tumores, la ferroptosis puede desencadenarse sin inductores químicos sintéticos, como la privación de cistina^[11],^[12] o metionina^[13] o la suplementación de lípidos PC-PUFA2^[14]. Es interesante destacar que se ha demostrado que las células T CD8+ promueven la ferroptosis de las células tumorales mediante la inhibición de la captación de cistina^[15] o el aumento del metabolismo del ácido araquidónico^[16]. Múltiples intentos de combinar el bloqueo de puntos de control inmunitarios (ICB) con diferentes inductores de la ferroptosis han indicado una eficacia antitumoral sinérgica en varios modelos de cáncer^[17],^[18]. Por lo tanto, la focalización de la ferroptosis no solo puede eliminar directamente las células tumorales, sino también superar la resistencia a la inmunoterapia.

TMEM87A es una proteína transmembrana conservada evolutivamente que se localiza predominantemente en el aparato de Golgi y participa en el tráfico retrógrado^[19]. Contiene un dominio de dinámica del Golgi y siete dominios de hélice transmembrana^[20],^[21]. Recientemente, se identificó TMEM87A como un canal catiónico dependiente del voltaje que contribuye a la homeostasis del pH del Golgi en los astrocitos humanos, y su deficiencia conduce a déficits de memoria dependientes del hipocampo en ratones^[21]. Además, se ha descubierto que TMEM87A se localiza en la MP de las células de melanoma para apoyar la transducción mecanoelectrica^[22] y se ha caracterizado como un canal iónico expresado en las neuronas sensoriales para mediar la transducción del tacto ligero^[23]. Sin embargo, no se han estudiado los papeles de TMEM87A en la muerte celular y la inmunidad contra el cáncer.

Aquí, encontramos que la peroxidación lipídica acumulada en la membrana del Golgi provoca la elevación del pH del Golgi, lo que a su vez protege a las células tumorales de la ejecución de la ferroptosis. TMEM87A, localizada en el Golgi, puede regular la ferroptosis mediante la amortiguación del pH del Golgi. In vivo, la pérdida de TMEM87A promueve la ferroptosis tumoral, potencia las respuestas de las células T antitumorales y se sinergiza con la terapia ICB. En conjunto, nuestro estudio revela las funciones de TMEM87A en la regulación de la ferroptosis y la inmunidad contra el cáncer.

Resultados

El pH del Golgi se altera en la fase temprana de la ferroptosis

Dado que el aparato de Golgi está cerca del RE, propenso a la peroxidación^[6], especulamos que la membrana del Golgi también podría acumular peróxidos lipídicos durante la ferroptosis. Para monitorear esto, etiquetamos el Golgi con proteína fluorescente azul (BFP) fusionada a la secuencia de orientación al Golgi de la β-1,4-galactosiltransferasa 1 (B4galt1). B4galt1–BFP se colocalizó con el marcador del Golgi Tgoln1 (TGN38) y esta colocalización permaneció sin cambios después del tratamiento con RSL3 (Figura de datos suplementarios 1a). No se colocalizó con lisosomas marcados con Lysotracker (Figura de datos suplementarios 1b). Utilizando el sensor de peroxidación lipídica BODIPY C11, observamos una rápida acumulación de su señal de oxidación en las membranas del Golgi BFP+ dentro de los 30 minutos posteriores al tratamiento con RSL3 en las células murinas B16F10 (Fig. 1a,b). Se observaron acumulaciones similares de BODIPY C11 oxidado en el Golgi BFP+ en las células murinas CT26 (Fig. 1c,d) y Hepa1-6 (Figura de datos suplementarios 1c,d) durante la fase temprana de la ferroptosis inducida por RSL3, y esta señal era distinta del tinte de lisosomas (Figura de datos suplementarios 1e).

El aparato de Golgi mantiene un entorno de pH único. Para investigar si el pH del Golgi se ve afectado por la peroxidación lipídica, construimos un sensor de pH ratiométrico dirigido al Golgi fusionando la super-ecliptic pHluorin (SEP) sensible al pH y la mCherry insensible al pH a B4galt1. Confirmamos nuevamente que este sensor de pH se localizaba en el aparato de Golgi TGN38+ (Figura de datos suplementarios 1f) pero no en los lisosomas marcados con Lysotracker (Figura de datos suplementarios 1g) y su localización permaneció sin cambios durante la fase temprana de la ferroptosis. En las células B16F10 que expresan este sensor, la fluorescencia de SEP aumentó drásticamente después de 2 horas de tratamiento con RSL3 (Fig. 1e). Bafilomicina A1 (BafA1), un inhibidor de la adenosina trifosfatasa vacuolar (V-ATPasa)^[24], también pudo aumentar el brillo de SEP (Figura de datos suplementarios 1h). Al cuantificar la relación de SEP con mCherry para el cálculo del pH (Figura de datos suplementarios 1i–k), encontramos que el pH del Golgi aumentó rápida y continuamente dentro de las 4 horas posteriores al tratamiento con RSL3 (Fig. 1f). La elevación del pH del Golgi también se observó en las células CT26 (Fig. 1g) y Hepa1-6 (Figura de datos suplementarios 1l) tratadas con RSL3 o BafA1.

Dado que los peróxidos lipídicos se acumulan rápidamente en la membrana del Golgi tras la inducción de la ferroptosis, buscamos determinar la relación temporal entre la peroxidación lipídica y la elevación del pH del Golgi. Tras el tratamiento con RSL3, la peroxidación lipídica aumentó rápidamente y alcanzó su punto máximo 1 hora después (Fig. 1h), mientras que el pH del Golgi comenzó a aumentar 1 hora después y se mantuvo alto hasta las 12 horas (Fig. 1i). Sorprendentemente, el pretratamiento con el antioxidante que atrapa radicales, ferrostatin 1 (Fer1), abolió la mejora inducida por RSL3 de la señal de SEP (Fig. 1j) y la elevación del pH del Golgi (Fig. 1k,l y Figura de datos suplementarios 1m). Por lo tanto, concluimos que la elevación del pH del Golgi es causada por los peróxidos lipídicos acumulados en la membrana del Golgi tras la inducción de la ferroptosis.

TMEM87A residente en el Golgi regula la ferroptosis mediante la amortiguación del pH del Golgi

Luego, nos preguntamos si este evento temprano de elevación del pH del Golgi afectaría la ejecución de la ferroptosis. Elevar el pH del Golgi con BafA1 suprimió la ferroptosis inducida por RSL3 en las células B16F10 (Figura de datos suplementarios 2a). NH4Cl, otro agente alcalinizante del Golgi^[25], también pudo aumentar el pH del Golgi e inhibir la ferroptosis inducida por RSL3 (Figura de datos suplementarios 2b,c). Luego, intentamos disminuir el pH del Golgi incubando las células en un medio ácido (pH 6,5) (Figura de datos suplementarios 2d,e) y encontramos que tanto las células B16F10 como las CT26 se volvieron más sensibles a RSL3 (Figura de datos suplementarios 2f,g). Estos datos sugieren que la elevación del pH del Golgi puede regular la susceptibilidad de las células tumorales a la ejecución de la ferroptosis.

La homeostasis del pH del Golgi está mantenida por los sistemas de transporte de iones residentes en el Golgi^[25]. Razonamos que algunas proteínas localizadas en el Golgi podrían regular el pH del Golgi y la ferroptosis. El Portal de respuesta terapéutica contra el cáncer (CTRP) informa sobre las correlaciones entre la expresión génica y la sensibilidad celular a varios inductores clásicos de la ferroptosis^[26]. Entre los genes cuya mayor expresión se correlaciona con la resistencia a RSL3, ML210, ML162 y erastina (Fig. 2a y Figura de datos suplementarios 2h), solo TMEM87A se localizaba principalmente en el Golgi y tiene el potencial de regular el pH del Golgi^[21]. Por lo tanto, seleccionamos TMEM87A para una mayor investigación. Primero, confirmamos que tanto Tmem87a endógeno como Tmem87a–Flag expresado ectópicamente se localizaban en el Golgi etiquetado con B4galt1–GFP (Fig. 2b,c). Luego, exploramos el efecto de Tmem87a en la ejecución de la ferroptosis. El silenciamiento de Tmem87a con ARN de horquilla corta (shRNA) hizo que las células B16F10 fueran susceptibles a la citotoxicidad inducida por RSL3, ML210, ML162 o imidazol cetona erastina (IKE), lo que pudo ser completamente rescatado por Fer1 (Fig. 2d,e y Figura de datos suplementarios 2i). Luego, ablamos Tmem87a con la edición CRISPR–Cas9 y confirmamos su pérdida mediante inmunoblot (Fig. 2f). Aunque se informó que los astrocitos y las neuronas del hipocampo deficientes en Tmem87a tenían pilas de Golgi más interrumpidas^[21], no observamos diferencias significativas en la integridad estructural y las dimensiones del Golgi entre las células de tipo salvaje (WT) y las células Tmem87a-eliminadas (KO) (Figura de datos suplementarios 3a–d). Luego, tratamos estas células con RSL3 y observamos un mayor aumento de la muerte celular en las células KO en comparación con las células WT (Fig. 2g). De manera similar, las células CT26 (Figura de datos suplementarios 3e) y Hepa1-6 (Figura de datos suplementarios 3f) deficientes en Tmem87a también se volvieron más sensibles a RSL3, como se reveló por el aumento de la muerte celular (Fig. 2h,i) y la reducción de la viabilidad celular (Figura de datos suplementarios 3g,h). De manera consistente con esto, el tratamiento con RSL3 desencadenó un mayor aumento de la peroxidación lipídica en estas células KO que en las células WT (Fig. 2j y Figura de datos suplementarios 3i,j). Las células Tmem87a-KO también fueron más sensibles a la ferroptosis inducida por ML162, ML210 e IKE, y estos fenotipos pudieron ser rescatados por Fer1 (Figura de datos suplementarios 3g,h). Además, tanto el silenciamiento como la ablación de TMEM87A en las células de cáncer de colon humano SW48 mejoraron notablemente la ferroptosis inducida por RSL3 (Figura de datos suplementarios 3k–n). Para confirmar aún más que la sensibilización a la ferroptosis en las células Tmem87a-KO se debió específicamente a la ausencia de Tmem87a, reexpresamos Tmem87a–Flag en las células Tmem87a-KO B16F10, CT26 o Hepa1-6 (Figura de datos suplementarios 3o–q) y encontramos que su resistencia a RSL3 se restauró en gran medida (Fig. 2k–m). Por lo tanto, concluimos que la deficiencia de TMEM87A sensibiliza tanto a las células tumorales humanas como a las murinas a la ferroptosis.

A continuación, estudiamos si Tmem87a regulaba la ferroptosis modulando el pH del Golgi. Al expresar el sensor de pH del Golgi B4galt1–mCherry–SEP en las células WT y Tmem87a-KO B16F10, observamos la disminución del pH del Golgi en reposo en las células KO (Figura de datos suplementarios 4a–c). Tras el tratamiento con RSL3, el pH del Golgi de las células KO no aumentó en comparación con las células WT (Fig. 2n y Figura de datos suplementarios 4d). La reexpresión de Tmem87a–Flag en las células Tmem87a-KO pudo restaurar la regulación ascendente del pH del Golgi en respuesta a RLS3 (Fig. 2o). Se observaron resultados similares en las células CT26 Tmem87a-KO (Figura de datos suplementarios 4e,f). Luego, preguntamos si la sensibilización a la ferroptosis causada por la deficiencia de Tmem87a podría ser abolida al elevar el pH del Golgi. Las células Tmem87a-KO que reexpresaban el vector de control fueron más sensibles a RSL3 en comparación con las que reexpresaban Tmem87a–Flag (Fig. 2p) y el tratamiento con NH4Cl pudo eliminar las diferencias entre las dos células (Fig. 2p). Se ha identificado que TMEM87A es un canal iónico y el motivo GYG (aminoácidos 318–320) es necesario para mantener su actividad^[21]. Construimos una mutante de Tmem87a con sustitución de GYG a AAA y la reintrodujimos en WT en las células Tmem87a-KO B16F10 (Figura de datos suplementarios 4g). La reintroducción de Tmem87a WT pero no de la mutante GYG-AAA pudo elevar el pH del Golgi y, posteriormente, suprimir la ferroptosis inducida por RSL3 (Fig. 2q,r), aunque ambos casos mostraron una localización del Golgi idéntica (Figura de datos suplementarios 4h). En general, estos resultados indican que TMEM87A localizada en el Golgi con actividad de canal media la resistencia a la ferroptosis mediante la amortiguación del pH del Golgi.

TMEM87A protege los tejidos de la ferroptosis in vivo

Nuestros hallazgos celulares nos llevaron a investigar más a fondo el papel de TMEM87A en las condiciones patológicas relacionadas con la ferroptosis in vivo. La lesión por isquemia-reperusión renal (LIRR) es un modelo patológico clásico en el que interviene la ferroptosis celular^[27]. Generamos ratones Tmem87a-KO (Tmem87a−/−) e inducimos LIRR renal (Figura de datos suplementarios 5a–c). Se incluyó el tratamiento con liproxstatina 1 para confirmar la aparición de la ferroptosis (Figura de datos suplementarios 5b,c). Coherente con informes previos^[28], la LIRR renal provocó un aumento significativo de la creatinina sérica (CRE) y la urea nitrogenada en sangre (BUN) en comparación con los controles simulados. Además, estos niveles aumentaron aún más en los ratones Tmem87a−/− en comparación con los ratones WT (Tmem87a+/+ ) (Figura de datos suplementarios 5d,e). La LIRR también causó daño tubular renal y aumentó la tinción de 4-hidroxinoneno (4-HNE), lo que se agravó aún más en los riñones de los ratones Tmem87a−/− (Figura de datos suplementarios 5f–h). En particular, la administración de liproxstatina 1 redujo todos los parámetros patológicos y eliminó las diferencias entre los grupos KO y WT (Figura de datos suplementarios 5d–h). Por lo tanto, concluimos que Tmem87a protege el riñón de la ferroptosis renal inducida por la LIRR.

La lesión hepática aguda inducida por la concanavalina A (ConA) es otro modelo que implica la ferroptosis hepática^[29]. A continuación, generamos ratones Tmem87a-KO específicos de hepatocitos (Tmem87af/fAlbcre) y los tratamos a ellos y a los ratones Tmem87af/f de control con una dosis subletal de ConA (Figura de datos suplementarios 5i–k). El daño hepático de los ratones se reveló mediante el aumento de los niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT), y sus niveles fueron aún más altos en el suero de los ratones Tmem87af/fAlbcre en comparación con el de los ratones Tmem87af/f (Figura de datos suplementarios 5l,m). Coherente con esto, los análisis histológicos revelaron un área necrótica más extensa en el tejido hepático de los ratones Tmem87af/fAlbcre (Figura de datos suplementarios 5n). Además, el tratamiento con ConA en ratones Tmem87af/fAlbcre provocó un aumento del contenido de malondialdehído (MDA) (Figura de datos suplementarios 5o) y la expresión de un marcador de ferroptosis, Ptgs2 (Figura de datos suplementarios 5p), en comparación con los ratones Tmem87af/f. En conjunto, estos datos sugieren que la deficiencia de Tmem87a hepática agrava el daño hepático relacionado con la ferroptosis.

También examinamos si Tmem87a KO afectaba al daño hepático mediado por la apoptosis mediante la administración de un anticuerpo monoclonal anti-Fas (Jo2)^[30] (Figura de datos suplementarios 6a). El tratamiento con Jo2 provocó aumentos significativos de los niveles de AST y ALT (Figura de datos suplementarios 6b,c). Sin embargo, no se detectaron diferencias entre los ratones Tmem87a+/+ y Tmem87a−/− (Figura de datos suplementarios 6b,c). Además, examinamos la patología, la muerte celular y la escisión de la caspasa 3 y Parp en los tejidos hepáticos tratados con Jo2 y no se observaron diferencias entre los dos grupos (Figura de datos suplementarios 6d–g). Por lo tanto, la deficiencia de Tmem87a puede no afectar a la muerte celular apoptótica inducida por la activación de Fas.

La ablación de TMEM87A promueve la ferroptosis al provocar la condensación de FSP1

Para dilucidar cómo TMEM87A regula la resistencia a la ferroptosis, primero analizamos las abundancias relativas de las proteínas y los metabolitos clave que se sabe que regulan la ferroptosis en las células WT y Tmem87a-KO. Los niveles de proteína de Gpx4, Acsl4 y Fsp1 fueron similares entre las células WT y Tmem87a-KO (Figura de datos suplementarios 7a–c). El contenido intracelular de GSH y los iones de hierro(II) lábiles (Fe2+) no se vio afectado por la deficiencia de Tmem87a (Figura de datos suplementarios 7d–f). Sorprendentemente, se detectó una reducción pronunciada del contenido intracelular de CoQH2, como lo indican las menores proporciones de CoQ10H2/CoQ10 y CoQ9H2/CoQ9, en las células Tmem87a-KO en comparación con las células WT (Figura 3a,b). FSP1 es la única oxidorreductasa conocida que reduce la ubiquinona a su forma de hidroquinona^[31],^[32]. Dado que la deficiencia de Tmem87a no tiene efecto sobre la expresión de Fsp1, especulamos que la actividad enzimática de Fsp1 podría estar alterada. Dada la importancia de la localización subcelular de FSP1 en su actividad antiferrotótica^[33], examinamos la distribución de Fsp1–GFP de ratón en células WT y Tmem87a-KO. Aunque las cantidades de proteína Fsp1–GFP fueron similares entre las células WT y Tmem87a-KO (Figura de datos suplementarios 7g,h), se observaron más puntos de Fsp1–GFP en las células Tmem87a-KO (Figura 3c,d y Figura de datos suplementarios 7i,j). Además, la incubación de las células con un medio de cultivo ácido provocó un aumento de la formación de puntos de Fsp1–GFP (Figura 3e,f). Dado que la FSP1 humana forma condensados a través de la separación de fases^[33] y la Fsp1 de ratón también contiene dos regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) predichas (Figura de datos suplementarios 7k), especulamos que los puntos de Fsp1–GFP anteriores podrían ser condensados de separación de fases. Tras el fotoblanqueo, la fluorescencia de los condensados de Fsp1–GFP se recuperó en cuestión de segundos (Figura 3g,h). El tratamiento con 1,6-hexanodiol (1,6-HEX), un producto químico conocido por interrumpir generalmente los condensados similares a líquidos^[34], provocó una reducción evidente de los condensados de Fsp1–GFP (Figura 3i,j). Además, una Fsp1ΔIDR truncada en IDR no formó puntos en las células Tmem87a-KO (Figura 3k,l y Figura de datos suplementarios 7l). Estos datos sugieren que la deficiencia de Tmem87a provoca la condensación de la Fsp1 de ratón.

Para examinar más a fondo si Tmem87a regula la ferroptosis a través de Fsp1, desactivamos Fsp1 en las células B16F10 seguido de la supresión de Tmem87a (Figura de datos suplementarios 7m). Si bien la supresión de Tmem87a sensibilizó a las células WT a RSL3 (Figura 3m), este efecto se eliminó en gran medida en las células Fsp1-KO (Figura 3n). Se obtuvieron resultados coherentes en las células CT26 (Figura 3o,p y Figura de datos suplementarios 7n). Dado que los inhibidores de FSP1 disponibles actualmente son selectivos para la FSP1 humana, también realizamos los experimentos en las células tumorales humanas SW48. La supresión de TMEM87A pudo aumentar la ferroptosis inducida por RSL3, pero no tuvo efecto sobre la muerte celular inducida por un inhibidor de FSP1 humano bien documentado (iFSP1) (Figura de datos suplementarios 7o,p). Estos hallazgos indican que FSP1 es necesario para la sensibilización a la ferroptosis mediada por la inhibición de TMEM87A.

La pérdida de TMEM87A perjudica el crecimiento tumoral in vivo

Para investigar más a fondo la función de TMEM87A en la progresión tumoral, inoculamos células B16F10 con Tmem87a suprimida o Tmem87a-KO en ratones C57BL/6 inmunocompetentes. La supresión o la desactivación de Tmem87a suprimieron significativamente el crecimiento tumoral, como lo demuestra tanto el volumen tumoral (Figura 4a,b) como el peso (Figura de datos suplementarios 8a,b) en comparación con los tumores de control. El efecto supresor tumoral de la ablación de Tmem87a se observó de forma constante en múltiples modelos tumorales, incluidos CT26 y Panc02 (Figura 4c y Figura de datos suplementarios 8c–f). Como confirmación adicional, la reexpresión de Tmem87a–Flag en las células B16F10 Tmem87a-KO restauró el crecimiento tumoral (Figura 4d y Figura de datos suplementarios 8g). A continuación, probamos si Tmem87a es necesario para el desarrollo del carcinoma hepatocelular (CHC) ortotópico, en el que tres plásmidos que codifican AKT miristoilada, NRAS(V12) y el transposón Sleeping Beauty se codeliveron en el hígado mediante inyección hidrodinámica en la vena de la cola (Figura 4e). Observamos menos tumores en los tejidos hepáticos de los ratones Tmem87af/fAlbcre en comparación con los ratones Tmem87af/f (Figura 4f–h). En consecuencia, los ratones Tmem87af/fAlbcre con CHC mostraron una mayor supervivencia (Figura 4i). Además, probamos si la desactivación inducible de Tmem87a después del establecimiento del CHC podría retrasar aún más la progresión del cáncer. La administración de AAV8-hTBG-iCre logró la desactivación inducible específica del hígado de Tmem87a en los ratones Tmem87af/f (Figura de datos suplementarios 8h) y provocó una reducción significativa de la carga tumoral, como lo demuestra la menor proporción de masa hepática a masa corporal (Figura 4j,k). En conjunto, estos resultados indican que la ablación de Tmem87a inhibe la progresión en múltiples tipos de tumores in vivo.

A continuación, para examinar si la susceptibilidad a la ferroptosis contribuye a la supresión tumoral mediada por la pérdida de Tmem87a, tratamos a los ratones con tumores B16F10 Tmem87a-KO con liproxstatina 1 y descubrimos que el crecimiento tumoral se promovió (Figura 4l). Para inhibir específicamente la ferroptosis de las células tumorales, desactivamos la acil-CoA sintetasa de cadena larga 4 (Acsl4), que es necesaria para la iniciación de la ferroptosis^[35], en las células B16F10 Tmem87a-KO (Figura de datos suplementarios 8i). La deficiencia de Acsl4 pudo restaurar la resistencia celular a RSL3 (Figura de datos suplementarios 8j). In vivo, la deficiencia de Acsl4 neutralizó por completo el efecto supresor tumoral mediado por la desactivación de Tmem87a (Figura 4m y Figura de datos suplementarios 8k) e invirtió la inducción del contenido de MDA tumoral (Figura 4n). Lo que es más importante, dado que el motivo GYG de Tmem87a es necesario para su regulación de la ferroptosis, descubrimos que la reexpresión de WT, pero no del mutante GYG-AAA, pudo restaurar el crecimiento de los tumores Tmem87a-KO in vivo (Figura 4o). Estos datos indican que la deficiencia de Tmem87a perjudica el crecimiento tumoral al promover la ferroptosis tumoral.

Por último, nos preguntamos si la deficiencia de Tmem87a podría aumentar la terapia dirigida a la ferroptosis. Establecimos tumores de CHC ortotópicos con desactivación inducible de Tmem87a en el hígado en ratones Tmem87af/f, seguidos de tratamiento con IKE. IKE inhibió significativamente el crecimiento del tumor de CHC con Tmem87a desactivado, pero no tuvo efecto sobre los tumores de control que expresaban Tmem87a (Figura 4p,q), lo que sugiere que la ablación de Tmem87a se sinergiza con el inductor de la ferroptosis para ejercer una actividad antitumoral.

La ablación de TMEM87A aumenta la respuesta de las células T CD8+ antitumorales

Dado el potencial proinflamatorio de la ferroptosis, investigamos si la pérdida de Tmem87a remodela el microentorno inmunitario tumoral mediante la realización de una secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en las células CD45+ enriquecidas de los tumores Tmem87a-KO + vector vacío y Tmem87a-KO + Tmem87a–Flag (Figura 5a). Los tumores Tmem87a-KO + vector vacío exhibieron un panorama inmunitario desplazado, caracterizado por una expansión de las células T CD8+ antitumorales y una reducción de las células supresoras derivadas de la médula ósea polimorfonucleares (PMN-MDSC) (Figura 5b,c). Las puntuaciones de activación, migración y función efectora de las células T CD8+ también fueron más altas en el grupo Tmem87a-KO + vector vacío (Figura 5d–f). El análisis de citometría de flujo validó el aumento de las células T CD8+ y la mayor producción de IFNγ en los tumores Tmem87a-KO + vector vacío (Figura 5g,h), así como en los tumores con Tmem87a desactivada (Figura 5i,j). Estos datos sugieren que la ablación tumoral de Tmem87a da como resultado una respuesta de células T CD8+ antitumoral más fuerte.

A continuación, probamos la inmunogenicidad de las células tumorales deficientes de Tmem87a que sufren ferroptosis. Inmunizamos ratones con células B16F10 tratadas con congelación-descongelación o inducidas con RSL3 para que sufrieran ferroptosis y los volvimos a desafiar con células tumorales vivas (Figura de datos suplementarios 9a). Al controlar el crecimiento del tumor en el desafío, encontramos una reducción significativa en los ratones inmunizados con células que sufrían ferroptosis en comparación con el grupo tratado con congelación-descongelación (Figura de datos suplementarios 9b,c). A continuación, comparamos la inmunogenicidad de los tumores B16F10 WT y Tmem87a-KO utilizando un diseño experimental similar (Figura de datos suplementarios 9d). Los resultados mostraron que la inmunización con células Tmem87a-KO fue más eficaz para suprimir el crecimiento del tumor en el desafío (Figura de datos suplementarios 9e,f). En general, estos resultados sugieren que la inducción de la ferroptosis, ya sea mediante el tratamiento con RSL3 o la ablación de Tmem87a, aumenta la inmunogenicidad tumoral, lo que puede contribuir a una mejor respuesta inmunitaria antitumoral.

Las células T CD8+ pueden promover la ferroptosis tumoral, lo que subyace a su actividad antitumoral^[15],^[16]. A continuación, probamos si las células tumorales deficientes de Tmem87a serían más sensibles al ataque de las células T CD8+. Establecimos células B16F10 WT y Tmem87a-KO que coexpresan ovalbúmina (OVA) y luciferasa (Luc). Después de cocultivarlas con células T CD8+ específicas de OVA (OT-I), se evaluó la viabilidad de las células tumorales mediante la cuantificación de la actividad de Luc (Figura de datos suplementarios 9g). Las células tumorales Tmem87a-KO fueron más vulnerables al ataque mediado por OT-I en comparación con las células WT (Figura de datos suplementarios 9h), lo que sugiere que la deficiencia de Tmem87a sensibiliza a las células tumorales a las células T CD8+.

La deficiencia de TMEM87A sensibiliza al tumor a la terapia de bloqueo de PD1

Para finalizar, probamos si la deficiencia de Tmem87a podría aumentar la terapia dirigida a la ferroptosis. Establecimos tumores de CHC ortotópicos con desactivación inducible de Tmem87a en el hígado en ratones Tmem87af/f, seguidos de tratamiento con IKE. IKE inhibió significativamente el crecimiento del tumor de CHC con Tmem87a desactivado, pero no tuvo efecto sobre los tumores de control que expresaban Tmem87a (Figura 4p,q), lo que sugiere que la ablación de Tmem87a se sinergiza con el inductor de la ferroptosis para ejercer una actividad antitumoral.

La terapia dirigida a la ferroptosis, combinada con la inmunoterapia con inhibidores de puntos de control inmunitario (ICB), ha demostrado una actividad antitumoral sinérgica^[15],^[36]–^[38]. Por lo tanto, pusimos a prueba si la ablación tumoral de Tmem87a aumentaría la eficacia de la terapia de bloqueo de PD1. Inoculamos tumores B16F10 Tmem87a-KO, en los que se reexpresó un vector vacío o Tmem87a–Flag, en ratones C57BL/6 y los tratamos con anticuerpo anti-PD1. Como se esperaba, los tumores Tmem87a-KO + vector vacío fueron más sensibles a la terapia, como lo demostró la disminución significativa del volumen tumoral y la mejora de la supervivencia de los animales (Fig. 6a,b). En consonancia con esto, los tumores Tmem87a-KO + vector vacío mostraron un aumento de la infiltración de células T CD8+ y una disminución de las PMN-MDSC en comparación con los tumores Tmem87a-KO + Tmem87a–Flag, y la terapia de bloqueo de PD1 elevó aún más la infiltración de células T, al tiempo que reducía las PMN-MDSC en los tumores Tmem87a-KO + vector vacío (Fig. 6c,d). Además, tanto las células T CD8+ como las CD4+ de los tumores Tmem87a-KO + vector vacío tratados con bloqueo de PD1 mostraron la mayor producción de IFNγ (Fig. 6e). Estos resultados indican que la ablación de Tmem87a aumenta la eficacia de la terapia de bloqueo de PD1.

Para confirmar aún más si la eficacia terapéutica anterior depende del sistema inmunitario, eliminamos las células T CD8+, las células T CD4+ o las células asesinas naturales (NK) utilizando anticuerpos específicos en los tumores B16F10 Tmem87a-KO tratados con bloqueo de PD1 (Fig. 6f y Fig. 10a del Material Suplementario). Como se muestra por el volumen y el peso del tumor, el bloqueo de PD1 suprimió significativamente el crecimiento de los tumores Tmem87a-KO. El anti-CD8α, pero no el anti-CD4 o el anti-NK1.1, abolió en gran medida el efecto terapéutico del bloqueo de PD1 (Fig. 6g,h y Fig. 10b del Material Suplementario), lo que sugiere que las células T CD8+ son la población principal que media en la eficacia terapéutica. También investigamos el efecto del inhibidor de la ferroptosis, liproxstatin 1, sobre la terapia de bloqueo de PD1 en los tumores Tmem87a-KO y descubrimos que la administración de liproxstatin 1 resultó en un aumento del volumen y el peso del tumor en comparación con el grupo de control (Fig. 10c–f del Material Suplementario). Estos datos sugieren que la ferroptosis contribuye a la eficacia terapéutica del bloqueo de PD1 en los tumores deficientes en Tmem87a.

Un alto nivel de TMEM87A se correlaciona con la resistencia a la inmunoterapia

Por último, evaluamos la relevancia clínica de TMEM87A en la supervivencia de personas con cáncer, centrándonos en los tipos de tumores que corresponden a nuestros modelos murinos. El análisis de conjuntos de datos de secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq) disponibles públicamente reveló que el ARNm de TMEM87A estaba elevado en las células malignas en comparación con las poblaciones de células inmunitarias y estromales (Fig. 7a). Los datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) también mostraron una mayor expresión del ARNm de TMEM87A en el tumor en comparación con los tejidos adyacentes al tumor (Fig. 10g del Material Suplementario) y los altos niveles de TMEM87A se correlacionaron negativamente con la supervivencia general (OS) en múltiples tipos de cáncer (Fig. 10h–k del Material Suplementario). Luego, evaluamos la posible relevancia de TMEM87A tumoral en la inmunoterapia del cáncer. En los participantes con melanoma tratados con bloqueo de PD1, los tejidos tumorales de los respondedores mostraron una menor expresión de TMEM87A en comparación con los no respondedores (Fig. 7b). Para evaluar aún más la expresión de TMEM87A a nivel de proteína, realizamos una matriz de tejidos que contenía 100 muestras de biopsia de participantes con cáncer de pulmón que recibieron inmunoterapia, con o sin quimioterapia y terapia antiangiogénica (Tabla Suplementaria 1). Descubrimos que la proteína TMEM87A se expresaba de niveles bajos a altos en las muestras y se localizaba predominantemente cerca del núcleo dentro de las células cancerosas (Fig. 7c). Se encontró que una mayor expresión de la proteína TMEM87A en la cohorte cuyo estado de la enfermedad progresó después de recibir inmunoterapia (Fig. 7d) y también se correlacionó con una menor OS (Fig. 7e) y una menor supervivencia libre de progresión (PFS) (Fig. 7f). En otra cohorte que consistía en 57 pares de tejidos cancerosos y normales emparejados de participantes con carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) (Tabla Suplementaria 2), una mayor expresión de TMEM87A predijo nuevamente una peor OS (Fig. 7g y Fig. 10l del Material Suplementario). Estos hallazgos demuestran que TMEM87A promueve la progresión tumoral y confiere resistencia a la inmunoterapia.

El pH del Golgi se altera en la fase temprana de la ferroptosis

Dado que el aparato de Golgi está cerca del RE propenso a la peroxidación^[6], especulamos que la membrana del Golgi también podría acumular lípidos peroxidados durante la ferroptosis. Para monitorear esto, etiquetamos el Golgi con proteína fluorescente azul (BFP) fusionada a la secuencia de orientación al Golgi de la β-1,4-galactosiltransferasa 1 (B4galt1). B4galt1–BFP se colocalizó con el marcador del Golgi Tgoln1 (TGN38) y esta colocalización no cambió después del tratamiento con RSL3 (Fig. 1a del Material Suplementario). No se colocalizó con lisosomas teñidos con Lysotracker (Fig. 1b del Material Suplementario). Utilizando el sensor de peroxidación lipídica BODIPY C11, observamos una rápida acumulación de su señal de oxidación en las membranas del Golgi BFP+ dentro de los 30 minutos posteriores al tratamiento con RSL3 en las células murinas B16F10 (Fig. 1a,b). Se observaron acumulaciones similares de BODIPY C11 oxidado en el Golgi BFP+ en las células CT26 (Fig. 1c,d) y Hepa1-6 (Fig. 1c,d del Material Suplementario) durante la fase temprana de la ferroptosis inducida por RSL3, y esta señal fue distinta del tinte de lisosomas (Fig. 1e del Material Suplementario).

El aparato de Golgi mantiene un entorno de pH único. Para investigar si el pH del Golgi se ve afectado por la peroxidación lipídica, construimos un sensor de pH ratiométrico dirigido al Golgi fusionando la proteína supereclíptica sensible al pH (SEP) y la mCherry insensible al pH a B4galt1. Confirmamos nuevamente que este sensor de pH se localizaba en el aparato de Golgi TGN38+ (Fig. 1f del Material Suplementario), pero no en los lisosomas teñidos con Lysotracker (Fig. 1g del Material Suplementario), y su localización no cambió durante la fase temprana de la ferroptosis. En las células B16F10 que expresan este sensor, la fluorescencia de SEP aumentó drásticamente después de 2 horas de tratamiento con RSL3 (Fig. 1e). La bafilomicina A1 (BafA1), un inhibidor de la ATPasa vacuolar (V-ATPasa)^[24], también pudo aumentar el brillo de SEP (Fig. 1h del Material Suplementario). Al cuantificar la relación de SEP con mCherry para el cálculo del pH (Fig. 1i–k del Material Suplementario), encontramos que el pH del Golgi aumentó rápida y continuamente dentro de las 4 horas posteriores al tratamiento con RSL3 (Fig. 1f). El aumento del pH del Golgi también se observó en las células CT26 (Fig. 1g) y Hepa1-6 (Fig. 1l del Material Suplementario) tratadas con RSL3.

Dado que los lípidos peroxidados se acumulan rápidamente en la membrana del Golgi tras la inducción de la ferroptosis, buscamos determinar la relación temporal entre la peroxidación lipídica y el aumento del pH del Golgi. Tras el tratamiento con RSL3, la peroxidación lipídica aumentó rápidamente y alcanzó su punto máximo 1 hora después (Fig. 1h), mientras que el pH del Golgi comenzó a aumentar 1 hora después y se mantuvo alto hasta las 12 horas (Fig. 1i). Sorprendentemente, el pretratamiento con el antioxidante que atrapa radicales, ferrostatin 1 (Fer1), abolió el aumento de la señal de SEP inducido por RSL3 (Fig. 1j) y el aumento del pH del Golgi (Fig. 1k,l y Fig. 1m del Material Suplementario). Por lo tanto, concluimos que el aumento del pH del Golgi es causado por los lípidos peroxidados acumulados en la membrana del Golgi tras la inducción de la ferroptosis.

TMEM87A residente en el Golgi regula la ferroptosis al amortiguar el pH del Golgi

Luego, nos preguntamos si este evento temprano de aumento del pH del Golgi afectaría la ejecución de la ferroptosis. El aumento del pH del Golgi con BafA1 suprimió la ferroptosis inducida por RSL3 en las células B16F10 (Fig. 2a del Material Suplementario). NH4Cl, otro agente alcalinizante del Golgi^[25], también pudo aumentar el pH del Golgi e inhibir la ferroptosis inducida por RSL3 (Fig. 2b,c del Material Suplementario). Luego, intentamos disminuir el pH del Golgi incubando las células en un medio ácido (pH 6,5) (Fig. 2d,e del Material Suplementario) y descubrimos que tanto las células B16F10 como las CT26 se volvieron más sensibles a RSL3 (Fig. 2f,g del Material Suplementario). Estos datos sugieren que el aumento del pH del Golgi puede regular la susceptibilidad de las células tumorales a la ejecución de la ferroptosis.

La homeostasis del pH del Golgi está mantenida por los sistemas de transporte de iones residentes en el Golgi^[25]. Razonamos que algunas proteínas localizadas en el Golgi podrían regular el pH del Golgi y la ferroptosis. El Cancer Therapeutics Response Portal (CTRP) informa sobre las correlaciones entre la expresión génica y la sensibilidad celular a varios inductores clásicos de la ferroptosis^[26]. Entre los genes cuya mayor expresión se correlaciona con la resistencia a RSL3, ML210, ML162 y erastina (Fig. 2a y Fig. 2h del Material Suplementario), solo TMEM87A se localizaba principalmente en el Golgi y tiene el potencial de regular el pH del Golgi^[21]. Por lo tanto, seleccionamos TMEM87A para una mayor investigación. Primero, confirmamos que tanto Tmem87a endógeno como Tmem87a–Flag expresado ectópicamente se ubicaban en el Golgi etiquetado con B4galt1–GFP (Fig. 2b,c). Luego, exploramos el efecto de Tmem87a en la ejecución de la ferroptosis. La eliminación de Tmem87a con ARN de interferencia corta (shRNA) hizo que las células B16F10 fueran susceptibles a la citotoxicidad inducida por RSL3, ML210, ML162 o imidazol cetona erastina (IKE), lo que pudo ser completamente rescatado por Fer1 (Fig. 2d,e y Fig. 2i del Material Suplementario). Luego, ablamos Tmem87a con la edición CRISPR–Cas9 y confirmamos su pérdida mediante inmunoblot (Fig. 2f). Aunque se informó que los astrocitos y las neuronas de hipocampo deficientes en Tmem87a tenían pilas de Golgi más interrumpidas^[21], no observamos diferencias significativas en la integridad estructural y las dimensiones del Golgi entre las células de tipo salvaje (WT) y las células Tmem87a-KO (Fig. 3a–d del Material Suplementario). Luego, tratamos estas células con RSL3 y observamos un aumento de la muerte celular en las células KO en comparación con las células WT (Fig. 2g). De manera similar, las células CT26 (Fig. 3e del Material Suplementario) y Hepa1-6 (Fig. 3f del Material Suplementario) deficientes en Tmem87a también se volvieron más sensibles a RSL3, como lo demostró el aumento de la muerte celular (Fig. 2h,i) y la reducción de la viabilidad celular (Fig. 3g,h del Material Suplementario). En consonancia con esto, el tratamiento con RSL3 desencadenó un mayor aumento de la peroxidación lipídica en estas células KO que en las células WT (Fig. 2j y Fig. 3i,j del Material Suplementario). Las células Tmem87a-KO también fueron más sensibles a la ferroptosis inducida por ML162, ML210 e IKE, y estos fenotipos pudieron ser rescatados por Fer1 (Fig. 3g,h del Material Suplementario). Además, tanto la eliminación como la ablación de TMEM87A en las células de cáncer de colon humano SW48 mejoraron notablemente la ferroptosis inducida por RSL3 (Fig. 3k–n del Material Suplementario). Para confirmar aún más que la sensibilización a la ferroptosis en las células Tmem87a-KO se debió específicamente a la ausencia de Tmem87a, reexpresamos Tmem87a–Flag en las células B16F10, CT26 o Hepa1-6 Tmem87a-KO (Fig. 3o–q del Material Suplementario) y descubrimos que su resistencia a RSL3 se restauró en gran medida (Fig. 2k–m). Por lo tanto, concluimos que la deficiencia de TMEM87A sensibiliza tanto a las células tumorales humanas como a las murinas a la ferroptosis.

A continuación, estudiamos si Tmem87a regulaba la ferroptosis modulando el pH del Golgi. Al expresar el sensor de pH del Golgi B4galt1–mCherry–SEP en células B16F10 WT y Tmem87a-KO, observamos la disminución del pH basal del Golgi en las células KO (Figura S4a–c). Tras el tratamiento con RSL3, el pH del Golgi de las células KO no aumentó en comparación con las células WT (Figura 2n y Figura S4d). La reexpresión de Tmem87a–Flag en células Tmem87a-KO pudo restaurar el aumento del pH del Golgi en respuesta a RLS3 (Figura 2o). Se observaron resultados similares en las células CT26 Tmem87a-KO (Figura S4e,f). Luego, investigamos si la sensibilización a la ferroptosis causada por la deficiencia de Tmem87a podría verse anulada al elevar el pH del Golgi. Las células Tmem87a-KO que reexpresaban el vector de control fueron más sensibles a RSL3 en comparación con las que reexpresaban Tmem87a–Flag (Figura 2p) y el tratamiento con NH4Cl pudo eliminar las diferencias entre las dos células (Figura 2p). Se ha identificado que TMEM87A es un canal iónico y el motivo GYG (aminoácidos 318-320) es necesario para mantener su actividad^[21]. Construimos una mutante de Tmem87a con sustitución de GYG a AAA (GYG-AAA) y la reintrodujimos en células WT y Tmem87a-KO B16F10 (Figura S4g). La reintroducción de Tmem87a WT, pero no de la mutante GYG-AAA, pudo elevar el pH del Golgi y, posteriormente, suprimir la ferroptosis inducida por RSL3 (Figura 2q,r), aunque ambos casos exhibieron una localización del Golgi idéntica (Figura S4h). En general, estos resultados indican que TMEM87A localizada en el Golgi, con actividad de canal, media la resistencia a la ferroptosis a través de la regulación del pH del Golgi.

TMEM87A protege los tejidos de la ferroptosis in vivo

Nuestros hallazgos celulares nos impulsaron a investigar más a fondo el papel de TMEM87A en las condiciones patológicas relacionadas con la ferroptosis in vivo. La lesión por isquemia-reperfusion renal (IRI) es un modelo patológico clásico en el que interviene la ferroptosis celular^[27]. Generamos ratones Tmem87a-KO (Tmem87a−/−) e inducimos IRI renal (Figura S5a–c). Se incluyó el tratamiento con liproxstatina 1 para confirmar la aparición de la ferroptosis (Figura S5b,c). Coherente con informes anteriores^[28], la IRI renal resultó en un aumento significativo de la creatinina sérica (CRE) y la urea en sangre (BUN) en comparación con los controles simulados. Además, estos niveles aumentaron aún más en los ratones Tmem87a−/− en comparación con los ratones WT (Tmem87a+/+) (Figura S5d,e). La IRI también causó daño tubular renal y aumentó la tinción de 4-hidroxinonal (4-HNE), lo que se agravó aún más en los riñones de los ratones Tmem87a−/− (Figura S5f–h). En particular, la administración de liproxstatina 1 redujo todos los parámetros patológicos y eliminó las diferencias entre los grupos KO y WT (Figura S5d–h). Por lo tanto, concluimos que Tmem87a protege el riñón de la ferroptosis renal inducida por IRI.

La lesión hepática aguda inducida por la concanavalin A (ConA) es otro modelo que implica la ferroptosis hepática^[29]. Luego, generamos ratones Tmem87a-KO específicos de hepatocitos (Tmem87af/fAlbcre) y los tratamos a ellos y a los ratones de control Tmem87af/f con una dosis subletal de ConA (Figura S5i–k). El daño hepático de los ratones se reveló por el aumento de los niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT), y sus niveles fueron aún más altos en el suero de los ratones Tmem87af/fAlbcre en comparación con el de los ratones Tmem87af/f (Figura S5l,m). Coherente con esto, los análisis histológicos revelaron un área necrótica más extensa en el tejido hepático de los ratones Tmem87af/fAlbcre (Figura S5n). Además, el tratamiento con ConA en ratones Tmem87af/fAlbcre resultó en un aumento del contenido de malondialdehído (MDA) (Figura S5o) y la expresión de un marcador de ferroptosis, Ptgs2 (Figura S5p), en comparación con los ratones Tmem87af/f. En conjunto, estos datos sugieren que la deficiencia hepática de Tmem87a agrava el daño hepático relacionado con la ferroptosis.

También examinamos si Tmem87a KO afectaba el daño hepático mediado por la apoptosis mediante la administración de un anticuerpo monoclonal anti-Fas (Jo2)^[30] (Figura S6a). El tratamiento con Jo2 causó aumentos significativos en los niveles de AST y ALT (Figura S6b,c). Sin embargo, no se detectaron diferencias entre los ratones Tmem87a+/+ y Tmem87a−/− (Figura S6b,c). Además, examinamos la patología, la muerte celular y la escisión de la caspasa 3 y Parp en los tejidos hepáticos tratados con Jo2 y no se observaron diferencias entre los dos grupos (Figura S6d–g). Por lo tanto, la deficiencia de Tmem87a puede no afectar la muerte celular apoptótica inducida por la activación de Fas.

La ablación de TMEM87A promueve la ferroptosis al causar la condensación de FSP1

Para dilucidar cómo TMEM87A regula la resistencia a la ferroptosis, primero analizamos las abundancias relativas de proteínas y metabolitos clave que se sabe que regulan la ferroptosis en células WT y Tmem87a-KO. Los niveles de proteína de Gpx4, Acsl4 y Fsp1 fueron similares entre las células WT y Tmem87a-KO (Figura S7a–c). Los contenidos intracelulares de GSH y iones de hierro(II) lábiles (Fe2+) no se vieron afectados por la deficiencia de Tmem87a (Figura S7d–f). Sorprendentemente, se detectó una reducción pronunciada del CoQH2 intracelular, como se reveló por las menores proporciones de CoQ10H2/CoQ10 y CoQ9H2/CoQ9, en las células Tmem87a-KO en comparación con las células WT (Figura 3a,b). FSP1 es la única oxidorreductasa conocida que reduce la ubiquinona a su forma de hidroquinona^[31],^[32]. Dado que la deficiencia de Tmem87a no tiene efecto sobre la expresión de Fsp1, especulamos que la actividad enzimática de Fsp1 podría estar alterada. Dada la importancia de la localización subcelular de FSP1 en su actividad antiferrotótica^[33], examinamos la distribución de Fsp1–GFP de ratón en células WT y Tmem87a-KO. Aunque las cantidades de proteína Fsp1–GFP fueron similares entre las células WT y Tmem87a-KO (Figura S7g,h), se observaron más puntos de Fsp1–GFP en las células Tmem87a-KO (Figura 3c,d y Figura S7i,j). Además, la incubación de las células con un medio de cultivo ácido resultó en el aumento de la formación de puntos de Fsp1–GFP (Figura 3e,f). Dado que FSP1 humano forma condensados a través de la separación de fases^[33] y Fsp1 de ratón también contiene dos regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) predichas (Figura S7k), especulamos que los puntos de Fsp1–GFP anteriores podrían ser condensados de separación de fases. Tras el fotoblanqueo, la fluorescencia de los condensados de Fsp1–GFP se recuperó en cuestión de segundos (Figura 3g,h). El tratamiento con 1,6-hexanodiol (1,6-HEX), un producto químico conocido por interrumpir generalmente los condensados similares a líquidos^[34], resultó en una reducción obvia de los condensados de Fsp1–GFP (Figura 3i,j). Además, una Fsp1ΔIDR truncada en IDR no formó puntos en las células Tmem87a-KO (Figura 3k,l y Figura S7l). Estos datos sugieren que la deficiencia de Tmem87a causa la condensación de Fsp1 de ratón.

Para examinar más a fondo si Tmem87a regula la ferroptosis a través de Fsp1, desactivamos Fsp1 en células B16F10 seguido de la supresión de Tmem87a (Figura S7m). Si bien la supresión de Tmem87a sensibilizó las células WT a RSL3 (Figura 3m), este efecto se eliminó en gran medida en las células Fsp1-KO (Figura 3n). Se obtuvieron resultados coherentes en las células CT26 (Figura 3o,p y Figura S7n). Dado que los inhibidores de FSP1 disponibles actualmente son selectivos para FSP1 humano, también realizamos los experimentos en células tumorales humanas SW48. La supresión de TMEM87A pudo aumentar la ferroptosis inducida por RSL3, pero no tuvo efecto sobre la muerte celular inducida por un inhibidor de FSP1 humano bien documentado (iFSP1) (Figura S7o,p). Estos hallazgos indican que FSP1 es necesario para la sensibilización a la ferroptosis mediada por la inhibición de TMEM87A.

La ablación de TMEM87A mejora el crecimiento tumoral in vivo

Para investigar más a fondo la función de TMEM87A en la progresión tumoral, inoculamos células B16F10 con supresión de Tmem87a o Tmem87a-KO en ratones C57BL/6 inmunocompetentes. La supresión o la desactivación de Tmem87a suprimieron significativamente el crecimiento tumoral, como lo demostraron tanto el volumen tumoral (Figura 4a,b) como el peso (Figura S8a,b) en comparación con los tumores de control. El efecto supresor tumoral de la ablación de Tmem87a se observó de manera consistente en múltiples modelos tumorales, incluidos CT26 y Panc02 (Figura 4c y Figura S8c–f). Como confirmación adicional, la reexpresión de Tmem87a–Flag en células B16F10 Tmem87a-KO restauró el crecimiento tumoral (Figura 4d y Figura S8g). A continuación, probamos si Tmem87a es necesario para el desarrollo de carcinoma hepatocelular ortotópico (HCC), en el que tres plásmidos que codifican AKT miristoilada, NRAS(V12) y el transposón Sleeping Beauty se codeliveron en el hígado mediante inyección de la cola por vía hidroдинаmica (Figura 4e). Observamos menos tumores en los tejidos hepáticos de los ratones Tmem87af/fAlbcre en comparación con los ratones Tmem87af/f (Figura 4f–h). En consecuencia, los ratones Tmem87af/fAlbcre con HCC mostraron una mayor supervivencia (Figura 4i). Además, probamos si la desactivación inducible de Tmem87a después del establecimiento de HCC aún podría retrasar la progresión del cáncer. La administración de AAV8-hTBG-iCre logró la desactivación inducible específica del hígado de Tmem87a en ratones Tmem87af/f (Figura S8h) y causó una reducción significativa de la carga tumoral, como lo demuestra la menor proporción de masa hepática a masa corporal (Figura 4j,k). En conjunto, estos resultados indican que la ablación de Tmem87a inhibe la progresión en múltiples tipos de tumores in vivo.

A continuación, para examinar si la susceptibilidad a la ferroptosis contribuye a la supresión tumoral mediada por la pérdida de Tmem87a, tratamos a los ratones con tumores B16F10 Tmem87a-KO con liproxstatina 1 y descubrimos que el crecimiento tumoral se promovió (Figura 4l). Para inhibir específicamente la ferroptosis de las células tumorales, desactivamos la acil-CoA sintetasa de cadena larga 4 (Acsl4), que es necesaria para la iniciación de la ferroptosis^[35], en las células B16F10 Tmem87a-KO (Figura S8i). La deficiencia de Acsl4 pudo restaurar la resistencia celular a RSL3 (Figura S8j). In vivo, la deficiencia de Acsl4 neutralizó por completo el efecto supresor tumoral mediado por la desactivación de Tmem87a (Figura 4m y Figura S8k) e invirtió la inducción del contenido de MDA tumoral (Figura 4n). Lo que es más importante, dado que el motivo GYG de Tmem87a es necesario para su regulación de la ferroptosis, descubrimos que la reexpresión de Tmem87a WT, pero no de la mutante GYG-AAA, pudo restaurar el crecimiento de los tumores Tmem87a-KO in vivo (Figura 4o). Estos datos indican que la deficiencia de Tmem87a perjudica el crecimiento tumoral al promover la ferroptosis tumoral.

Por último, nos preguntamos si la deficiencia de Tmem87a podría aumentar la terapia dirigida a la ferroptosis. Se establecieron tumores de HCC ortotópicos con desactivación inducible de Tmem87a hepático en ratones Tmem87af/f, seguido de tratamiento con IKE. IKE inhibió significativamente el crecimiento del tumor de HCC con Tmem87a KO, pero no tuvo efecto sobre los tumores de control que expresaban Tmem87a (Figura 4p,q), lo que sugiere que la ablación de Tmem87a se sinergiza con el inductor de ferroptosis para ejercer actividad antitumoral.

La ablación de TMEM87A aumenta la respuesta de las células T CD8+ antitumorales

Dado el potencial proinflamatorio de la ferroptosis, investigamos si la pérdida de Tmem87a remodela el microambiente inmunitario tumoral mediante la realización de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células CD45+ enriquecidas de tumores Tmem87a-KO + vector vacío y Tmem87a-KO + Tmem87a–Flag (Figura 5a). Los tumores Tmem87a-KO + vector vacío exhibieron un panorama inmunitario desplazado, caracterizado por una expansión de las células T CD8+ antitumorales y una reducción de las células supresoras mieloides polimorfonucleares (PMN-MDSC) inmunosupresoras (Figura 5b,c). Las puntuaciones de activación, migración y función efectora de las células T CD8+ también fueron más altas en el grupo Tmem87a-KO + vector vacío (Figura 5d–f). El análisis de citometría de flujo validó el aumento de las células T CD8+ y la mayor producción de IFNγ en los tumores Tmem87a-KO + vector vacío (Figura 5g,h), así como en los tumores con supresión de Tmem87a (Figura 5i,j). Estos datos sugieren que la ablación tumoral de Tmem87a da como resultado una respuesta de células T CD8+ antitumoral más fuerte.

A continuación, probamos la inmunogenicidad de las células tumorales deficientes en Tmem87a que sufren ferroptosis. Inmunizamos ratones con células B16F10 que habían sido sometidas a ciclos de congelación-descongelación o que habían sufrido ferroptosis inducida por RSL3, y luego las reexponimos a células tumorales vivas (Figura extendida 9a). Al controlar el crecimiento tumoral tras la reexposición, observamos una reducción significativa en los ratones inmunizados con células que sufrían ferroptosis, en comparación con el grupo sometido a ciclos de congelación-descongelación (Figura extendida 9b, c). A continuación, comparamos la inmunogenicidad de los tumores B16F10 de tipo salvaje (WT) y Tmem87a-KO utilizando un diseño experimental similar (Figura extendida 9d). Los resultados mostraron que la inmunización con células Tmem87a-KO fue más eficaz para suprimir el crecimiento del tumor tras la reexposición (Figura extendida 9e, f). En general, estos resultados sugieren que la inducción de la ferroptosis, ya sea mediante el tratamiento con RSL3 o la ablación de Tmem87a, aumenta la inmunogenicidad tumoral, lo que puede contribuir a una mejor respuesta inmune antitumoral.

Las células T CD8+ pueden promover la ferroptosis tumoral, lo que subyace a su actividad antitumoral^[15],^[16]. A continuación, probamos si las células tumorales deficientes en Tmem87a se volverían más sensibles a la citotoxicidad mediada por las células T CD8+. Establecimos células B16F10 de tipo salvaje (WT) y Tmem87a-KO que coexpresaban ovoalbúmina (OVA) y luciferasa (Luc). Después de cocultivarlas con células T CD8+ específicas para OVA (OT-I), se evaluó la viabilidad de las células tumorales mediante la cuantificación de la actividad de Luc (Figura extendida 9g). Las células tumorales Tmem87a-KO fueron más vulnerables a la citotoxicidad mediada por OT-I en comparación con las células de tipo salvaje (WT) (Figura extendida 9h), lo que sugiere que la deficiencia de Tmem87a sensibiliza a las células tumorales a las células T CD8+.

La deficiencia de TMEM87A sensibiliza al tumor a la terapia de bloqueo de PD1

La terapia dirigida a la ferroptosis combinada con la ICB ha demostrado tener una actividad antitumoral sinérgica^[15],^[36]–^[38]. Por lo tanto, probamos si la ablación tumoral de Tmem87a aumentaría la eficacia de la terapia de bloqueo de PD1. Inoculamos tumores B16F10 Tmem87a-KO en ratones C57BL/6, reexpresando un vector vacío o Tmem87a-Flag, y los tratamos con un anticuerpo anti-PD1. Como se esperaba, los tumores Tmem87a-KO + vector vacío fueron más sensibles a la terapia, como lo demostró la disminución significativa del volumen tumoral y la mejora de la supervivencia de los animales (Figura 6a, b). En consonancia con esto, los tumores Tmem87a-KO + vector vacío mostraron un aumento de la infiltración de células T CD8+ y una disminución de las PMN-MDSC en comparación con los tumores Tmem87a-KO + Tmem87a-Flag, y la terapia de bloqueo de PD1 elevó aún más la infiltración de células T, al tiempo que reducía las PMN-MDSC en los tumores Tmem87a-KO + vector vacío (Figura 6c, d). Además, tanto las células T CD8+ como las CD4+ de los tumores Tmem87a-KO + vector vacío tratados con bloqueo de PD1 exhibieron la mayor producción de IFNγ (Figura 6e). Estos resultados indican que la ablación de Tmem87a aumenta la eficacia de la terapia de bloqueo de PD1.

Para confirmar aún más si la eficacia terapéutica anterior depende de la respuesta inmune, agotamos las células T CD8+, las células T CD4+ o las células asesinas naturales (NK) utilizando anticuerpos específicos en los tumores B16F10 Tmem87a-KO tratados con bloqueo de PD1 (Figura 6f y Figura extendida 10a). Como se muestra por el volumen y el peso del tumor, el bloqueo de PD1 suprimió significativamente el crecimiento de los tumores Tmem87a-KO. El anti-CD8α, pero no el anti-CD4 o el anti-NK1.1, abolió en gran medida el efecto terapéutico del bloqueo de PD1 (Figura 6g, h y Figura extendida 10b), lo que sugiere que las células T CD8+ son la población principal que media en la eficacia terapéutica. También investigamos el efecto del inhibidor de la ferroptosis, liproxstatin 1, sobre la terapia de bloqueo de PD1 en los tumores Tmem87a-KO y descubrimos que la administración de liproxstatin 1 resultó en un aumento del volumen y el peso del tumor en comparación con el grupo de control (Figura extendida 10c-f). Estos datos sugieren que la ferroptosis contribuye a la eficacia terapéutica del bloqueo de PD1 en los tumores deficientes en Tmem87a.

Un alto nivel de TMEM87A se correlaciona con la resistencia a la inmunoterapia

Por último, evaluamos la relevancia clínica de TMEM87A en la supervivencia de las personas con cáncer, centrándonos en los tipos de tumores que corresponden a nuestros modelos murinos. El análisis de conjuntos de datos de secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq) disponibles públicamente reveló que el ARNm de TMEM87A estaba elevado en las células malignas en comparación con las poblaciones de células inmunes y estromales (Figura 7a). Los datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) también mostraron una mayor expresión del ARNm de TMEM87A en el tumor en comparación con los tejidos adyacentes al tumor (Figura extendida 10g) y los altos niveles de TMEM87A se correlacionaron negativamente con la supervivencia general (OS) en múltiples tipos de cáncer (Figura extendida 10h-k). A continuación, evaluamos la posible relevancia del TMEM87A tumoral en la inmunoterapia del cáncer. En los participantes con melanoma tratados con bloqueo de PD1, los tejidos tumorales de los respondedores mostraron una menor expresión de TMEM87A en comparación con los no respondedores (Figura 7b). Para evaluar aún más la expresión de TMEM87A a nivel de proteína, realizamos una matriz de tejidos que contenía 100 muestras de biopsia de participantes con cáncer de pulmón que recibieron inmunoterapia, con o sin quimioterapia y terapia antiangiogénica (Tabla suplementaria 1). Descubrimos que la proteína TMEM87A se expresaba en niveles bajos a altos en las muestras y se localizaba predominantemente cerca del núcleo dentro de las células cancerosas (Figura 7c). Se encontró que una mayor expresión de la proteína TMEM87A en la cohorte cuya enfermedad progresó después de recibir inmunoterapia (Figura 7d) también se correlacionó con una menor OS (Figura 7e) y una menor supervivencia libre de progresión (PFS) (Figura 7f). En otra cohorte que consistía en 57 pares de tejidos cancerosos y normales emparejados de participantes con carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) (Tabla suplementaria 2), una mayor expresión de TMEM87A predijo nuevamente una peor OS (Figura 7g y Figura extendida 10l). Estos hallazgos demuestran que TMEM87A promueve la progresión tumoral y confiere resistencia a la inmunoterapia.

Discusión

Además de la membrana plasmática (PM), se ha descubierto que múltiples membranas subcelulares son susceptibles a la peroxidación lipídica durante la ferroptosis, incluido el mitocondrion^[4],^[5],^[14], el lisosoma^[39] y el RE^[6]. El aparato de Golgi, a pesar de su asociación directa con el RE, no había sido investigado a fondo. Aquí demostramos que la peroxidación lipídica se acumula en la membrana del Golgi en la fase temprana de la ferroptosis. Esta peroxidación inmediata de los lípidos de la membrana del Golgi condujo a una elevación del pH del Golgi, que pudo ser completamente revertida por Fer1. Estos resultados sugieren que la elevación del pH del Golgi puede servir como un marcador temprano para la iniciación de la ferroptosis. Posteriormente, cuando el pH del Golgi se redujo o elevó, la ejecución de la ferroptosis se promovió o suprimió, respectivamente, lo que sugiere que el pH del Golgi también es un mecanismo regulador para la ejecución de la ferroptosis. De hecho, la evidencia emergente ha sugerido que el aparato de Golgi está conectado con la ferroptosis^[9],^[40]. Se informó que un inductor del estrés del Golgi, la brefeldina A, desencadenó la ferroptosis en las células Hela^[40]. Se demostró que UBIAD1, una enzima antioxidante localizada en el Golgi que regula la síntesis de CoQ10^[41], alivia la muerte neuronal ferroptótica en respuesta a la lesión isquémica-reperfusión cerebral (IRI)^[9]. En consonancia con nuestros hallazgos, también se observó la sensibilización a la ferroptosis inducida por la acidosis (pH 6,5) en varias células tumorales humanas, aunque se explicó por la acumulación intracelular de PUFA^[42]. Dado que el aparato de Golgi mantiene un pH de reposo único para facilitar sus funciones eficientes, que incluyen el tráfico de membrana, la selección de carga, la glicosilación de proteínas y la clasificación^[25],^[43],^[44], vale la pena explorar más a fondo si estas funciones se verían alteradas durante la ocurrencia de la ferroptosis.

Identificamos que el TMEM87A localizado en el Golgi tiene un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del pH del Golgi. TMEM87A se identificó recientemente como un componente de las vías de transducción mecanoelectrónica y fue necesario para la sensación del tacto en los ratones^[22]. La expresión ectópica de TMEM87A humano en células 293T presentó tanto la localización en la PM como en el Golgi^[22]. Los estudios anteriores sugirieron que el TMEM87A residente en el Golgi podría mediar en el proceso de transporte retrógrado del endosoma a la red del Golgi trans^[19],^[45]. El análisis estructural reveló que TMEM87A es similar a una proteína de transporte WNT canónica, WLS, y podría funcionar en el tráfico de cargas asociadas a la membrana^[20]. Sin embargo, un estudio reciente informó que TMEM87A podría ser un canal catiónico no selectivo que media en la homeostasis del pH del Golgi^[21], lo que se alinea con nuestros resultados. El motivo GYG en los dominios transmembrana (TMD) de TMEM87A se identificó como crítico para su actividad de canal^[21]. También descubrimos que el mutante TMEM87A-GYG-AAA no logró mantener el pH del Golgi, mediar la resistencia a la ferroptosis y apoyar el crecimiento tumoral. Por lo tanto, la homeostasis del pH del Golgi mediada por TMEM87A depende de su actividad de canal, pero el mecanismo detallado por el cual TMEM87A se activa para regular el pH del Golgi sigue sin estar claro. Vale la pena señalar que se encontró que una fosfatidiletanolamina (PE) se unía en el TMD de TMEM87A humano y podría regular su actividad de canal^[21]. Dado que la PE que contiene cadenas de PUFA se peroxidará preferentemente durante la ferroptosis^[3],^[46], es posible que la peroxidación lipídica inducida por la ferroptosis pueda afectar su actividad de canal. El trabajo futuro podría centrarse en identificar inhibidores farmacológicos para bloquear su actividad de canal. Sin embargo, dada su localización en el aparato de Golgi, este esfuerzo probablemente será un desafío.

Descubrimos que la ablación de TMEM87A resultó en una sobreacidificación del Golgi, lo que provocó la condensación de Fsp1-GFP y sensibilizó a las células tumorales a la ferroptosis. Se informó que la separación de fases de la FSP1 humana inducida por iFSP1 promueve la ferroptosis^[33]. Sin embargo, iFSP solo puede desencadenar la condensación de la proteína FSP1 humana, pero no de la proteína Fsp1 del ratón^[33]. No está claro si y bajo qué condiciones la proteína Fsp1 sufriría una separación de fases, aunque se informó que el IDR puede impulsar la separación de fases en respuesta a las alteraciones del pH o la temperatura^[47],^[48]. Nuestros hallazgos indicaron que la ablación de TMEM87A o un ambiente acidótico podrían ser un factor iniciador que resulta en la condensación de Fsp1. Se ha demostrado que la ferroptosis tumoral inducida por inductores de ferroptosis o manipulaciones genéticas beneficia la inhibición del crecimiento tumoral y la activación de las respuestas inmunes^[18],^[49],^[50]. Identificamos que la focalización de TMEM87A también podría promover la ferroptosis tumoral, suprimir la progresión tumoral y mejorar la eficacia de la inmunoterapia. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la ferroptosis en los neutrófilos asociados al tumor podría limitar la actividad de las células T^[51] y las propias células T también son susceptibles a la ferroptosis^[52]. Por lo tanto, si la ablación de TMEM87A afecta la respuesta de ferroptosis y las funciones efectoras de estas células inmunes merece una mayor investigación.

En resumen, descubrimos que la peroxidación lipídica ferroptótica conduce a una elevación del pH del Golgi e identificamos que el TMEM87A localizado en el Golgi actúa como un supresor de la ferroptosis al amortiguar el pH del Golgi. La pérdida de TMEM87A puede inhibir el crecimiento tumoral y mejorar la inmunidad de las células T CD8+ antitumorales. Nuestros hallazgos prometen mejorar la terapia ICB mediante la focalización de TMEM87A o la modulación del pH del Golgi.

Métodos

Declaración ética

Todos los estudios informados en este artículo cumplen con las normas éticas pertinentes. La recolección de tejidos fue aprobada por la junta de ética institucional del Hospital Tongji de la Facultad de Medicina Tongji (TJ-IRB202412103). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes humanos para la publicación de los resultados del estudio. Los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Comités Institucionales para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (número IACUC 4293). Para los experimentos con tumores en ratones, todas las dimensiones y cargas tumorales fueron permitidas por el IACUC. La carga tumoral máxima de 2 cm3 permitida por el IACUC no se excedió en este estudio.

Recursos clave

Se proporcionan listas de recursos para todas las diluciones de anticuerpos (Tabla suplementaria 3), reactivos (Tabla suplementaria 4), líneas celulares y plásmidos (Tabla suplementaria 5) y oligonucleótidos (Tabla suplementaria 6) en la información suplementaria.

KO génico mediado por CRISPR-Cas9

La inactivación de Tmem87a o Fsp1 en líneas celulares se realizó con el sistema CRISPR-Cas9. Las secuencias de ARN guía único (sgRNA) se diseñaron utilizando la herramienta de diseño CRISPR en línea pública Synthego. Los sgRNA se clonaron en el vector LentiCRISPR-V2. Los plásmidos LentiCRISPR, junto con los plásmidos psPAX2 y pMD2.G, se transfectaron en células 293T para producir lentivirus. Las células cancerosas se infectaron con lentivirus y luego se seleccionaron con puromicina durante 3 a 4 días. Los clones unicelulares se clasificaron en placas de 96 pocillos para la proliferación. La deleción del gen en cada clon celular se verificó mediante inmunoblotting.

Se construyeron células tumorales Tmem87a-KO que reexpresaban Tmem87a marcada con Flag mediante la transfección transitoria de células tumorales con plásmidos sgRNA de Tmem87a, la selección con puromicina y el aislamiento de clones individuales. La deleción del gen en cada clon celular se verificó mediante inmunoblotting para obtener células Tmem87a-KO sin resistencia a la puromicina. El ADNc de Tmem87a se amplificó mediante PCR. La mutante Tmem87a-GYG-AAA se generó mediante mutagénesis dirigida por PCR utilizando la plantilla Tmem87a WT. El Tmem87a WT o mutante se clonó en el vector pLenti-CMV-3×Flag para producir lentivirus. Tras la infección con lentivirus de las células Tmem87a-KO, se aplicó la selección con puromicina para garantizar que las células supervivientes expresaran Tmem87a WT o mutante. La eficiencia de la sobreexpresión se verificó mediante inmunoblotting y la localización se determinó mediante inmunofluorescencia.

Para obtener células Tmem87a y Acsl4 doblemente KO, las células Tmem87a-KO sin resistencia a la puromicina se infectaron con lentivirus que expresaba sgRNA de Acsl4, se seleccionaron con puromicina y se aislaron para obtener clones individuales. La deleción de Ascl4 en cada clon celular se verificó mediante inmunoblotting. Todas las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla Suplementaria 6.### Supresión génica mediada por shRNA

La supresión de Tmem87a en líneas celulares se realizó con shRNA. Las secuencias de shRNA se diseñaron utilizando la herramienta en línea pública Sigma Predesigned. Los shRNA se clonaron en el vector pLKO.1. La producción de lentivirus y la infección de células cancerosas se realizaron de manera similar al método descrito anteriormente. La eficiencia de la supresión se verificó mediante inmunoblotting o qPCR.### Mediciones del pH del Golgi y adquisición de imágenes

Las células cancerosas se infectaron con reporteros raciométricos lentivirales dirigidos a la proteína B4galt1 del Golgi, construidos sobre la base de diseños previamente informados ^[24] con SEP y mCherry.

Para los experimentos de calibración del pH, se generaron curvas de calibración del pH como se describió anteriormente ^[53]. En resumen, las células cancerosas que expresaban B4galt1-mCherry-SEP se recolectaron y se lavaron dos veces con uno de los tampones de la curva de calibración del pH. Los tampones de la curva de calibración del pH contenían 125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 µM monensina y 25 mM HEPES (pH 7,5 o 7,0) o 25 mM MES (pH 7,0, 6,5, 6,0 o 5,5). Cada solución tampón se ajustó al pH final apropiado utilizando 1 N NaOH o 1 N HCl. Después del lavado, las células se resuspendieron en 200 µl de tampón de la curva de calibración del pH y se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo. Se calculó la relación de intensidad de fluorescencia media de la señal SEP a la señal mCherry para cada tampón de la curva de calibración del pH y se trazó para generar una curva de calibración del pH para experimentos posteriores para determinar los valores del pH del Golgi. Para determinar los valores del pH del Golgi, las células cancerosas que expresaban B4galt1-mCherry-SEP se estimularon con BafA1 o NH4Cl durante 1 h o RSL3 durante el tiempo indicado. Las células se recolectaron y se resuspendieron en 200 µl de PBS y luego se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo.

Para los ensayos de imagen dinámica (Fig. 1e y Fig. 1h de los datos suplementarios), las células B16F10 que expresaban B4galt1-mCherry-SEP se sembraron en placas de fondo de vidrio y se tiñeron con 1 µg/ml de Hoechst 33342 durante 30 min a 37 °C y luego se lavaron con PBS. Las células se estimularon con 2 µM de RSL3 durante 2 h o 1 µM de BafA1 durante 1 h, y se mantuvieron en una incubadora ajustada a 37 °C con 5% de CO2. Las imágenes de fluorescencia dinámica se adquirieron mediante un sistema de imagen confocal láser multimodo (con estación de trabajo de células vivas) (Leica) equipado con un objetivo CS2 Water MotCORR ×63 (apertura numérica (NA): 1,20). Se mostraron imágenes de un solo plano representativas.

Para otras imágenes que muestran el pH del Golgi (Fig. 1j y Fig. 1f, g y 4d de los datos suplementarios), las células B4galt1-mCherry-SEP que se sembraron en placas de fondo de vidrio se trataron con RSL3 o Fer1 durante el tiempo indicado. Posteriormente, las células se tiñeron con Hoechst 33342, se lavaron y se visualizaron en un medio fresco. Las imágenes se adquirieron utilizando un sistema de microscopía confocal de escaneo láser Olympus FV3000 equipado con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45) y detectores de tubos fotomultiplicadores. Se mostraron imágenes de un solo plano representativas.### Medición de la peroxidación lipídica

Las células que se trataron con RSL3 durante la concentración y el tiempo indicados se tiñeron con 5 µM de BODIPY 581/591 C11 durante 30 min a 37 °C, se lavaron y se resuspendieron en 200 µl de PBS. La peroxidación lipídica se evaluó inmediatamente en un citómetro de flujo. Se analizaron un mínimo de 10 000 células individuales por muestra.

Para la imagen de células vivas de la peroxidación lipídica, las células cancerosas que expresaban B4galt1-BFP se sembraron en placas de fondo de vidrio, se trataron con RSL3 y luego se tiñeron con 5 µM de BODIPY 581/591 C11, antes de lavarlas y visualizarlas en un medio fresco. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia media de BODIPY C11 oxidado en el Golgi se realizó con ImageJ. El área B4galt1-BFP+ se seleccionó como la región de interés (ROI) y el valor medio de gris de la señal de BODIPY C11 oxidado en la ROI seleccionada se calculó con el software.### Inmunofluorescencia

Para la localización de B4galt1-BFP, las células B16F10 que expresaban B4galt1-BFP se sembraron en placas de fondo de vidrio y se trataron con o sin RSL3, seguido de la tinción con Tgn38. Las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15 min y se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 15 min. Posteriormente, las células se lavaron con PBS, se bloquearon en suero de cabra al 5% y luego se incubaron con el anticuerpo anti-Tgn38 a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, las membranas se lavaron en TBST e incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron con TBST y se visualizaron en PBS fresco.

Para la localización de Tmem87a endógena, las células B4galt1-GFP se tiñeron con el anticuerpo anti-Tmem87a seguido de la incubación con ABflo 647-conjugado de cabra anti-conejo IgG (H+L). Para la localización de Tmem87a-Flag exógena, las células que expresaban tanto B4galt1-GFP como Tmem87a-Flag se tiñeron con el anticuerpo anti-Flag seguido de la incubación con anticuerpo anti-ratón IgG (H+L), fragmento F(ab')2 (conjugado con Alexa Fluor 647). Luego, los núcleos se contratiñeron con DAPI (5 µg/ml). Finalmente, las células se enjuagaron con PBST y se visualizaron.

Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45). Se mostraron imágenes de un solo plano representativas (Fig. 2b, c y Fig. 1a de los datos suplementarios). Los análisis de colocalización entre B4galt1-BFP y Tgn38 se realizaron con ImageJ (versión 1.54f) y se analizaron utilizando el perfil de escaneo de línea que enumeró el valor de gris de la señal a diferentes distancias.### Imagen de Fsp1 y ensayo de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)

Para la imagen de Fsp1, las células cancerosas que expresaban Fsp1-GFP o Fsp1ΔIDR1-GFP se sembraron en placas de fondo de vidrio, se trataron con 10% de 1,6-HEX durante 5 min (o sin ningún tratamiento) y se visualizaron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45). Se mostraron imágenes de un solo plano representativas (Fig. 3c, e, i, k y Fig. 7i de los datos suplementarios).

Para el ensayo FRAP, las células cancerosas que expresaban Fsp1-GFP se sembraron en placas de fondo de vidrio y se visualizaron para identificar las puntuaciones antes del inicio del blanqueo. Las ROI de estimulación se establecieron para cubrir las puntuaciones objetivo en múltiples campos de visión. Después de adquirir una imagen de línea de base, las ROI se blanquearon utilizando una línea láser de 488 nm durante 500 ms con una potencia láser del 15%. Se adquirieron imágenes para ocho ciclos con un intervalo de ejecución libre después del blanqueo. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45). El análisis de la intensidad de fluorescencia se midió utilizando el software ImageJ.### Análisis de la morfología del Golgi mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Para examinar la morfología del Golgi a nivel ultraestructural, las muestras se procesaron para TEM siguiendo protocolos estandarizados. En resumen, las células se fijaron en 2,5% de glutaraldehído en un tampón de fosfato de 0,1 M, se lavaron a fondo y se volvieron a fijar utilizando 1% de tetróxido de osmio. La deshidratación se realizó dos veces utilizando una serie graduada de etanol. La infiltración implica un tratamiento secuencial con mezclas de acetona-resina epoxi (2:1, 1:1) y resina epoxi pura. Luego, las muestras se incluyeron en resina epoxi y se cortaron en secciones ultrafinas. Finalmente, las secciones se tiñeron dos veces con 2% de acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron en un instrumento TEM FEI Tecnai G20 Twin.### Ensayo de viabilidad celular

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 4 × 103 células por pocillo y se trataron con reactivos durante la concentración y el tiempo indicados. Luego, se añadieron 10 µl de reactivo CCK-8 al medio de cultivo y se incubaron durante 4-6 h a 37 °C, 5% de CO2. La absorbancia a una longitud de onda de 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas multimodales.### Ensayo de muerte celular

Para los ensayos de muerte celular, las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se trataron con diferentes reactivos. Las células, incluidas las células muertas en suspensión, se recolectaron y se resuspendieron en 200 µl de PBS que contenía 1 µg/ml de yoduro de propidio (PI) durante 15 min a temperatura ambiente. La muerte celular se evaluó inmediatamente en un citómetro de flujo. La población PI+ representó el porcentaje de células muertas.### Inmunoblotting

Los grumos celulares se recolectaron y se lisaron con tampón RIPA suplementado con cóctel de inhibidores de proteasas. La concentración de proteína se cuantificó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA. Excepto para las muestras de proteína para analizar Tmem87a, se utilizaron cantidades iguales de lisados de proteínas y se calentaron a 95 °C durante 10 min. Las muestras de proteína se separaron en geles SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon en tampón salino tamponado con Tween-20 (TBST) que contenía 5% de leche descremada durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, las membranas se lavaron en TBST e incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 1 h a temperatura ambiente. Los inmunoblot se visualizaron utilizando un sistema de imagen ChemiDoc. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla Suplementaria 3.### Mediciones de CoQ

Las células para las mediciones del contenido de CoQ se recolectaron y se congelaron. Luego, se añadieron 200 µl de 96% de etanol que contenía 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol y 800 µl de 1-propanol a las células congeladas. La suspensión celular se trató con cinco ciclos de sonicación y reposo, se congeló a -40 °C durante 30 min y a 4 °C durante 10 min y luego se centrifugó a 15 000 g durante 15 min. El sobrenadante se secó y se resuspendió en etanol (con el estándar interno CoQ10-D9) antes de realizar la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). Luego, se mezclaron isométricamente de 5 a 5000 ng/ml de ubiquinona y ubiquinol con 200 ng/ml de CoQ10-d9 para generar curvas de calibración. El análisis UHPLC-MS/MS se realizó utilizando un sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity II acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6470A. Se aplicó el modo de monitoreo de reacciones múltiples para determinar la ubiquinona (880,7→197 para la cuantificación y 880,7→95 para la cualificación) y el ubiquinol (882,7→197 para la cuantificación y 882,7→95 para la cualificación). El software Agilent MassHunter se utilizó para adquirir y analizar los datos. La concentración de CoQ oxidado y reducido se calculó sobre la base de la curva de calibración y se normalizó a la concentración de proteína en cada muestra.### Animales

Se obtuvieron ratones hembra WT C57BL/6JNifdc (de 6 a 8 semanas de edad) del Laboratorio de Tecnología Animal Beijing Vital River. Los ratones C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J fueron amablemente proporcionados por N. Wu (Colegio de Medicina Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (HUST)). Los ratones Tmem87af/+, Albcre y Tmem87a+/− se obtuvieron de Shanghai Biomodel Organism Science and Technology Development. Los ratones Tmem87a KO de todo el cuerpo (Tmem87a−/−) se generaron mediante el cruce de ratones Tmem87a+/− con ratones Tmem87a+/−. Los ratones Tmem87af/f se generaron mediante el cruce de ratones Tmem87af/+ con ratones Tmem87af/+. Los ratones Tmem87a-KO específicos de hepatocitos (Tmem87af/fAlbcre) se generaron mediante el cruce de Tmem87af/f con ratones Albcre. Los cebadores para la genotipificación se enumeran en la Tabla Suplementaria 6.

Todos los animales se alojaron en instalaciones de patógenos específicos. El sexo no se consideró en el diseño y el análisis del estudio porque este estudio no fue diseñado para detectar diferencias de sexo. Para el modelo espontáneo de HCC, solo se utilizaron ratones machos. Para otros modelos de tumores subcutáneos, se utilizaron ratones hembra.

Modelos de ratón de lesión hepática inducida por ConA o anticuerpo anti-Fas

Para la lesión hepática inducida por ConA, se inyectaron 15 mg/kg de ConA en ratones Tmem87af/fAlbcre y ratones Tmem87af/f a través de la vena caudal, mientras que se inyectó un volumen igual de solución salina normal como control. Los ratones se sacrificaron 24 horas después de la inyección. Para la lesión hepática inducida por el anticuerpo anti-Fas, se inyectaron 0,5 μg/g de anticuerpo anti-Fas en ratones Tmem87a+/+ y ratones Tmem87a−/− a través de la vena caudal y los ratones se sacrificaron 5 horas después de la inyección. Se recolectó la sangre de los ratones para detectar ALT y AST. Los tejidos hepáticos se prepararon en secciones de parafina para realizar la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y el ensayo TUNEL o se homogeneizaron para realizar inmunotransferencias y detectar los niveles de proteína de Tmem87a, caspasa 3 y Parp clivada.

Modelos de ratón de lesión renal isquémica (IRI)

Los pedículos renales bilaterales de los ratones Tmem87a−/− se sujetaron con un fórceps hemostático durante 45 minutos y luego se retiraron los sujetadores, lo que provocó una lesión renal isquémica. Se realizó la misma operación o una operación simulada (en la que se realizó una laparotomía en los ratones, pero no se sujetaron los pedículos renales) en ratones WT. Se inyectó liproxstatina 1 (10 mg/kg) por vía intraperitoneal 1 hora antes de la sujeción. Después de 24 horas, se sacrificaron los ratones. Se recolectó la sangre de los ratones para detectar CRE y BUN. Partes de los tejidos renales de los ratones se homogeneizaron para detectar el nivel de proteína de Tmem87a mediante análisis de inmunotransferencia. Partes de los tejidos renales de los ratones se prepararon en secciones de parafina para la tinción con H&E y la tinción de inmunohistoquímica (IHC) de 4-HNE.

Modelos de tumores subcutáneos

Para los modelos de tumores subcutáneos, se suspendieron células B16F10 (3 × 105 células por ratón) y células Panc02 (6 × 106 células por ratón) en PBS y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones WT C57BL/6. Se suspendieron células CT26 (2 × 106 células por ratón) en PBS y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones BALB/c. El volumen del tumor se midió cada 2 días cuando los tumores eran palpables utilizando un calibrador y se calculó como longitud × ancho2/2. Al final del estudio, se extirparon y pesaron los tumores de los ratones. Se inyectó liproxstatina 1 (10 mg/kg) por vía intraperitoneal en los ratones todos los días. Se inyectó el anticuerpo anti-PD1 por vía intraperitoneal los días 5, 8 y 11 después de la inyección de células tumorales a una dosis de 100 μg por ratón. Se inyectaron el anticuerpo anti-CD8a, el anticuerpo anti-CD4 y el anticuerpo anti-NK1.1 por vía intraperitoneal cada 3 días, comenzando el día 4 después de la inyección de células tumorales, a una dosis de 100 μg por ratón.

Para el modelo de tumor preinmunizado, primero se obtuvieron células B16F10 tratadas con ciclos de congelación-descongelación o con RSL3 in vitro. Para el tratamiento con ciclos de congelación-descongelación, las células B16F10 se sometieron a cinco ciclos completos de congelación-descongelación que consistieron en la congelación rápida en nitrógeno líquido (5 minutos) seguida de la descongelación rápida en un baño de agua a 37 °C (5 minutos). Para el tratamiento con RSL3, las células B16F10 se expusieron a 2 μM de RSL3 durante 24 horas para inducir la muerte celular, con la posterior recolección de las células muertas desprendidas. Las células B16F10 tratadas con ciclos de congelación-descongelación o con RSL3 (5 × 105 células por ratón) y las células B16F10 WT o Tmem87a-KO (3 × 105 células por ratón) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo de ratones C57BL/6. Luego, 7 días después de la inyección de inmunización, se inyectaron por vía subcutánea células B16F10 normales (3 × 105 células por ratón) en el flanco derecho. Los volúmenes tumorales en el flanco derecho se midieron cada 2 días cuando los tumores eran palpables.

Modelo espontáneo de HCC

Se generó el HCC espontáneo inducido por la inyección hidroдинаmica de AKT-NRAS en la vena caudal, como se describió previamente^[54]. Brevemente, se diluyeron 5 μg de RAS/pT3EF1a, 5 μg de AKT/pT3EF1a y 0,67 μg de transposasa Sleeping Beauty en 1,5 ml de solución salina al 0,9% y se inyectaron por vía hidroдинаmica a través de la vena caudal en ratones Tmem87af/f de 4 semanas de edad y ratones Tmem87af/fAlbcre. Se recolectaron y pesaron los hígados de los ratones a las 5 semanas después de la inyección.

Para la KO específica de hígado inducible de Tmem87a, 7 días después de la inyección hidroдинаmica de RAS/pT3EF1a, AKT/pT3EF1a y transposasa Sleeping Beauty en ratones Tmem87af/f, se inyectaron 1 × 1011 copias de genoma viral de AAV8-hTBG-iCre o virus de control AAV8-hTBG-GFP (AAV8-control) diluidos en 100 μl de solución salina a través de la vena caudal. Los ratones se sacrificaron el día 35 y se recolectaron los hígados para verificar la KO de Tmem87a mediante inmunotransferencia.

scRNA-seq

Se disecaron los tumores Tmem87a-KO B16F10 que reexpresaban el vector vacío o Tmem87a-Flag de ratones C57BL/6 y se obtuvieron suspensiones de células individuales. Se extrajeron las células CD45+ mediante clasificación citométrica de flujo. La suspensión celular se codificó por barras y el ARN de las células codificadas por barras se transcribió inversamente para construir bibliotecas de secuenciación (10x Genomics). La secuenciación se realizó con Illumina NovaSeq.

Los datos de secuenciación se desmultiplexaron y se alinearon al genoma de referencia mediante Cell Ranger. Los análisis se realizaron utilizando Cell Ranger y Seurat. Se contaron los identificadores de moléculas únicas para construir matrices de expresión digital. Se aplicó un filtrado de control de calidad para retener los genes detectados en al menos cinco células y las células que expresaban un mínimo de 300 genes. Se realizó la función ‘find variable features’, la función ‘normalize data’, el análisis de componentes principales (PCA) y la reducción de dimensionalidad de aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP) para identificar 14 grupos distintos. Se realizó un análisis de expresión diferencial entre cada grupo y todas las demás células utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon. La función ‘add module score’ en Seurat se utilizó para calcular las puntuaciones de módulo de las firmas de genes del estado celular público. Las características de los 14 grupos de células inmunitarias y la activación, migración y función efectora de las células T CD8+ se resumen en las Tablas Suplementarias 7 y 8.

Análisis de citometría de flujo

Se recolectaron los tumores o los bazo de diferentes grupos de ratones al final del estudio, se molieron utilizando un molinillo y se prepararon en una suspensión de células individuales utilizando tamices de células de 70 μm. Las suspensiones de células individuales se tiñeron con el tinte de infrarrojo cercano (NIR) Zombie, se bloquearon con CD16/CD32 y luego se etiquetaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo anti-CD45, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8a, anti-CD25, anti-NK1.1, anti-CD11b, anti-Ly6G, anti-Ly6C, anti-F4/80 y anti-CD11c. Para la tinción de transcriptos, las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando el conjunto de tampones de factores de transcripción y se tiñeron con anti-FOXP3. Para la detección de citocinas, las células se suspendieron en un medio de cultivo completo y se estimularon con monensina (1:1000), ionóforo (1 μg/ml), brefeldina A (1:1000) y forbol 12-miristato 13-acetato (20 ng/ml) a 37 °C durante 4 horas en una incubadora. Las células se lavaron, se tiñeron con el tinte Zombie NIR y luego se etiquetaron con anti-CD45, anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8a. Las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando un tampón de fijación y un tampón de permeabilización/lavado, respectivamente, y luego se tiñeron con anti-IFNγ y anti-TNF diluidos en el tampón de permeabilización/lavado. Finalmente, las células se resuspendieron en 500 μl de PBS y se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo. Los datos de citometría de flujo se analizaron mediante el software FlowJo.

IHC

Se realizó la IHC utilizando el kit de preparación y detección de IHC según las instrucciones del fabricante. Para la tinción de 4-HNE en los riñones de ratón y la tinción de TMEM87A en las microarrays de tejido de carcinoma de pulmón humano, se utilizaron los anticuerpos enumerados en la Tabla Suplementaria 3. Se seleccionaron tres campos de cada muestra de tumor para determinar la puntuación H, que se midió automáticamente mediante el perfilador de IHC de FIJI para obtener el porcentaje de alta positividad, positividad, baja positividad y negatividad. La puntuación H se calculó como 1 × (% de baja positividad) + 2 × (% de positividad) + 3 × (% de alta positividad). Según la clasificación de la puntuación H, las muestras de tumor se dividieron en grupos con alta y baja expresión de TMEM87A.

Cocultivo de OT-I y células tumorales

Se extirparon el bazo y los ganglios linfáticos de ratones C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J (ratones OT-I) y se prepararon en una suspensión de células individuales utilizando tamices de células de 70 μm. Las células T CD8+ OT-I se expandieron y se activaron en un medio de cultivo que contenía 10% de FBS, 5 μg/ml de péptido OVA257-264, β-mercaptoetanol (1:1000) y penicilina-estreptomicina (1:100). Luego, se añadieron 10 ng/ml de IL-2 recombinante de ratón el segundo día y las células se cosecharon el cuarto día.

Las células B16F10 WT y Tmem87a-KO se transfectaron de forma estable con un lentivirus que expresaba OVA-Luc y se seleccionaron con blasticidina durante 1 o 2 semanas. Antes del cocultivo con las células OT-I, se cuantificó la intensidad de la luciferasa en las células tumorales WT y Tmem87a-KO para garantizar una eficiencia de transfección comparable. Las células tumorales OVA+Luc+ se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se añadieron diferentes proporciones de células T CD8+ OT-I para el cocultivo. Después del tiempo indicado, se cuantificó la intensidad de la luciferasa de las células tumorales adheridas utilizando el reactivo de ensayo de luciferasa Nano-Glo para representar la viabilidad de las células tumorales.

Muestras humanas

Se recolectaron especímenes de tejido de participantes clínicos con cáncer de pulmón contenidos en dos microarrays de tejido independientes en el Hospital Tongji (HUST). Un grupo de microarray de tejido consistió en 100 núcleos evaluables con el diagnóstico patológico de carcinoma de pulmón. Los participantes recibieron inmunoterapia, con o sin quimioterapia y terapia antiangiogénica. Los datos incluyeron la supervivencia general (OS) de 100 participantes y la supervivencia libre de enfermedad de 96 participantes. El segundo grupo comprendió 114 núcleos para pares de tejido tumoral y tejido normal coincidentes de 57 participantes con carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC), junto con la OS. Todas las muestras y la información se recolectaron con el consentimiento informado de los participantes. La distribución del sexo y las características de los participantes se detallan en las Tablas Suplementarias 1 y 2. La raza, la etnia y otras categorizaciones socialmente relevantes no se consideraron ni se recolectaron en este estudio. Por lo tanto, dichas variables no se utilizaron como indicadores.

Estadísticas y reproducibilidad

Se realizaron análisis estadísticos utilizando el software GraphPad Prism8. Todos los datos cuantitativos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM). Las comparaciones se analizaron utilizando una prueba t de Student de dos colas no pareada o análisis de varianza (ANOVA). Se asumió que la distribución de los datos era normal al utilizar las pruebas t, pero esto no se comprobó formalmente. Se muestran los puntos de datos individuales. Las curvas de Kaplan-Meier se generaron mediante pruebas de rango logarítmico. Los valores P exactos se indican en las figuras correspondientes. Los experimentos en este estudio se diseñaron utilizando de 3 a 10 muestras por grupo, condición o repetición independiente. Las réplicas biológicas y los análisis estadísticos se indican en las leyendas. Los experimentos de imagen de fluorescencia y de inmunoblotaje se muestran como resultados representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra, pero el tamaño de nuestra muestra es similar a los que se informan en publicaciones anteriores^[13],^[15],^[55]. No se excluyeron datos de los análisis. Para los experimentos con animales, todos los ratones se emparejaron por sexo y edad antes de asignarlos aleatoriamente a diferentes grupos, mientras que los demás experimentos no se aleatorizaron. La recopilación y el análisis de datos no se realizaron de forma ciega con respecto a las condiciones de los experimentos, excepto para la evaluación de la puntuación de inmunohistoquímica (IHC).### Resumen de la información

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de información de Nature Portfolio, que se vincula a este artículo.

Declaración ética

Todos los estudios que se informan en este artículo cumplieron con las normas éticas pertinentes. La recolección de tejido fue aprobada por el comité de ética institucional del Hospital Tongji de la Facultad de Medicina Tongji (TJ-IRB202412103). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes humanos para la publicación de los resultados del estudio. Los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Comités Institucionales para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (número IACUC 4293). Para los experimentos con tumores de ratón, todos los tamaños y cargas tumorales fueron permitidos por el IACUC. No se excedió la carga tumoral máxima de 2 cm3 permitida por el IACUC en este estudio.

Recursos clave

Se proporcionan listas de recursos para todas las diluciones de anticuerpos (Tabla suplementaria 3), reactivos (Tabla suplementaria 4), líneas celulares y plásmidos (Tabla suplementaria 5) y oligonucleótidos (Tabla suplementaria 6) en la información suplementaria.

KO de genes mediado por CRISPR-Cas9

El KO de Tmem87a o Fsp1 en líneas celulares se realizó con el sistema CRISPR-Cas9. Las secuencias de ARN guía único (sgRNA) se diseñaron utilizando la herramienta de diseño CRISPR en línea pública Synthego. Los sgRNA se clonaron en el vector LentiCRISPR-V2. Los plásmidos LentiCRISPR junto con los plásmidos psPAX2 y pMD2.G se transfectaron en células 293T para producir lentivirus. Las células cancerosas se infectaron con lentivirus y luego se seleccionaron con puromicina durante 3 a 4 días. Las células individuales se clasificaron en placas de 96 pocillos para la proliferación. La deleción del gen en cada clon celular se verificó mediante inmunoblotaje.

Se construyeron células tumorales Tmem87a-KO que reexpresaban Tmem87a marcada con Flag mediante la transfección transitoria de células tumorales con plásmidos de sgRNA Tmem87a, la selección con puromicina y el aislamiento de clones individuales. La deleción del gen en cada clon celular se verificó mediante inmunoblotaje para obtener células Tmem87a-KO sin resistencia a la puromicina. El ADNc de Tmem87a se amplificó mediante PCR. La mutante Tmem87a-GYG-AAA se generó mediante mutagénesis dirigida por PCR utilizando la plantilla Tmem87a WT. La WT o la mutante Tmem87a se clonaron en el vector pLenti-CMV-3×Flag para producir lentivirus. Después de la infección con lentivirus de las células Tmem87a-KO, se aplicó la selección con puromicina para garantizar que las células supervivientes expresaran Tmem87a WT o mutante. La eficiencia de la sobreexpresión se verificó mediante inmunoblotaje y la localización se determinó mediante inmunofluorescencia.

Para obtener células doble-KO Tmem87a y Acsl4, las células Tmem87a-KO sin resistencia a la puromicina se infectaron con lentivirus que expresaban sgRNA Acsl4, se seleccionaron con puromicina y se aislaron para obtener clones individuales. La deleción de Ascl4 en cada clon celular se verificó mediante inmunoblotaje. Todas las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla suplementaria 6.

Supresión de la expresión génica mediada por shRNA

La supresión de la expresión de Tmem87a en líneas celulares se realizó con shRNA. Las secuencias de shRNA se diseñaron utilizando la herramienta en línea pública Sigma Predesigned. Los shRNA se clonaron en el vector pLKO.1. La producción de lentivirus y la infección de células cancerosas se realizaron de manera similar al método descrito anteriormente. La eficiencia de la supresión se verificó mediante inmunoblotaje o qPCR.

Medidas del pH del Golgi y adquisición de imágenes

Las células cancerosas se infectaron con reporteros ratiométricos lentivirales dirigidos a la proteína B4galt1 del Golgi, construidos sobre la base de diseños informados previamente^[24] con SEP y mCherry.

Para los experimentos de calibración del pH, las curvas de calibración del pH se generaron como se describió anteriormente^[53]. En resumen, las células cancerosas que expresan B4galt1–mCherry–SEP se recogieron y se lavaron dos veces con uno de los tampones de la curva de calibración del pH. Los tampones de la curva de calibración del pH contenían 125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 µM monensina y 25 mM HEPES (pH 7,5 o 7,0) o 25 mM MES (pH 7,0, 6,5, 6,0 o 5,5). Cada solución tampón se ajustó al pH final apropiado utilizando 1 N NaOH o 1 N HCl. Después del lavado, las células se resuspendieron en 200 µl de tampón de la curva de calibración del pH y se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo. La relación de intensidad de fluorescencia media de la señal SEP a la señal mCherry para cada tampón de la curva de calibración del pH se calculó y se trazó para generar una curva de calibración del pH para experimentos posteriores para determinar los valores del pH del Golgi. Para determinar los valores del pH del Golgi, las células cancerosas que expresan B4galt1–mCherry–SEP se estimularon con BafA1 o NH4Cl durante 1 h o RSL3 durante el tiempo indicado. Las células se recogieron y se resuspendieron en 200 µl de PBS y luego se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo.

Para los ensayos de imagen dinámica (Fig. 1e y Fig. 1h de los datos suplementarios), las células B16F10 que expresan B4galt1–mCherry–SEP se sembraron en placas de fondo de vidrio y se tiñeron con 1 µg/ml de Hoechst 33342 durante 30 min a 37 °C y luego se lavaron con PBS. Las células se estimularon con 2 µM de RSL3 durante 2 h o 1 µM de BafA1 durante 1 h, se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2. Las imágenes de fluorescencia dinámicas se adquirieron mediante un sistema de imagen confocal láser multimodelo (con estación de trabajo de células vivas) (Leica) equipado con un objetivo CS2 Water MotCORR ×63 (apertura numérica (NA): 1,20). Se mostraron imágenes de un solo plano representativas.

Para otras imágenes que muestran el pH del Golgi (Fig. 1j y Fig. 1f, g y 4d de los datos suplementarios), las células B4galt1–mCherry–SEP que se sembraron en placas de fondo de vidrio se trataron con RSL3 o Fer1 durante el tiempo indicado. Posteriormente, las células se tiñeron con Hoechst 33342, se lavaron y se visualizaron en medio fresco. Las imágenes se adquirieron utilizando un sistema de microscopía confocal de escaneo láser Olympus FV3000 equipado con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45) y detectores de tubos fotomultiplicadores. Se mostraron imágenes de un solo plano representativas.

Medición de la peroxidación lipídica

Las células que se trataron con RSL3 durante la concentración y el tiempo indicados se tiñeron con 5 µM de BODIPY 581/591 C11 durante 30 min a 37 °C, se lavaron y se resuspendieron en 200 µl de PBS. La peroxidación lipídica se evaluó inmediatamente en un citómetro de flujo. Se analizaron un mínimo de 10 000 células individuales por muestra.

Para la imagen de células vivas de la peroxidación lipídica, las células cancerosas que expresan B4galt1–BFP se sembraron en placas de fondo de vidrio, se trataron con RSL3 y luego se tiñeron con 5 µM de BODIPY 581/591 C11, antes de lavarlas y visualizarlas en medio fresco. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia media de BODIPY C11 oxidado en el Golgi se realizó con ImageJ. El área B4galt1–BFP+ se seleccionó como la región de interés (ROI) y el valor medio de gris de la señal de BODIPY C11 oxidado en la ROI seleccionada se calculó con el software.

Inmunofluorescencia

Para la localización de B4galt1–BFP, las células B16F10 que expresan B4galt1–BFP se sembraron en placas de fondo de vidrio y se trataron con o sin RSL3, seguido de la tinción con Tgn38. Las células se fijaron con 4 % de paraformaldehído durante 15 min y se permeabilizaron con 0,1 % de Triton X-100 durante 15 min. Posteriormente, las células se lavaron con PBS, se bloquearon en suero de cabra al 5 % y luego se incubaron con el anticuerpo anti-Tgn38 a 4 °C durante la noche. Después del lavado con PBS con Tween-20 (PBST), las células se incubaron con anti-IgG H+L de conejo (Alexa Fluor 488) durante 2 h a temperatura ambiente, se lavaron con PBST y se visualizaron en PBS fresco.

Para la localización de Tmem87a endógena, las células B4galt1–GFP que se sembraron en placas de fondo de vidrio se tiñeron con el anticuerpo anti-Tmem87a seguido de la incubación con ABflo 647-conjugado de cabra anti-IgG (H+L). Para la localización de Tmem87a–Flag exógena, las células que expresan tanto B4galt1–GFP como Tmem87a–Flag se tiñeron con el anticuerpo anti-Flag seguido de la incubación con anti-IgG de ratón (H+L), fragmento F(ab')2 (conjugado con Alexa Fluor 647). Luego, los núcleos se contratiñeron con DAPI (5 µg/ml). Finalmente, las células se enjuagaron con PBST y se visualizaron.

Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45). Se mostraron imágenes de un solo plano representativas (Fig. 2b, c y Fig. 1a de los datos suplementarios). Los análisis de colocalización entre B4galt1–BFP y Tgn38 se realizaron con ImageJ (versión 1.54f) y se analizaron utilizando el perfil de escaneo de línea que enumeró el valor de gris de la señal a diferentes distancias.

Imagen de Fsp1 y ensayo de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)

Para la imagen de Fsp1, las células cancerosas que expresan Fsp1–GFP o Fsp1ΔIDR1–GFP se sembraron en placas de fondo de vidrio, se trataron con 10 % de 1,6-HEX durante 5 min (o sin ningún tratamiento) y se visualizaron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45). Se mostraron imágenes de un solo plano representativas (Fig. 3c, e, i, k y Fig. 7i de los datos suplementarios).

Para el ensayo FRAP, las células cancerosas que expresan Fsp1–GFP se sembraron en placas de fondo de vidrio y se visualizaron para identificar las puntuaciones antes de iniciar el blanqueamiento. Las ROI de estimulación se establecieron para cubrir las puntuaciones objetivo en múltiples campos de visión. Después de adquirir una imagen de línea de base, las ROI se blanquearon utilizando una línea láser de 488 nm durante 500 ms con una potencia láser del 15 %. Se adquirieron imágenes para ocho ciclos con un intervalo de ejecución libre después del blanqueamiento. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de aceite de silicona ×100 (NA: 1,45). El análisis de la intensidad de fluorescencia se midió utilizando el software ImageJ.

Análisis de microscopía electrónica de transmisión (MET) de la morfología del Golgi

Para examinar la morfología del Golgi a nivel ultraestructural, las muestras se procesaron para MET siguiendo protocolos estandarizados. En resumen, las células se fijaron en 2,5 % de glutaraldehído en un tampón de fosfato de 0,1 M, se lavaron a fondo y se volvieron a fijar utilizando 1 % de tetróxido de osmio. La deshidratación se realizó dos veces utilizando una serie graduada de etanol. La infiltración implica un tratamiento secuencial con mezclas de acetona-resina epoxi (2:1, 1:1) y resina epoxi pura. Luego, las muestras se incluyeron en resina epoxi y se cortaron en secciones ultrafinas. Finalmente, las secciones se tiñeron dos veces con 2 % de acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron en un MET FEI Tecnai G20 Twin.

Ensayo de viabilidad celular

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 4 × 103 células por pocillo y se trataron con reactivos durante la concentración y el tiempo indicados. Luego, se añadieron 10 µl de reactivo CCK-8 al medio de cultivo y se incubaron durante 4 a 6 h a 37 °C, 5 % de CO2. La absorbancia a una longitud de onda de 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas multimodelo.

Ensayo de muerte celular

Para los ensayos de muerte celular, las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se trataron con diferentes reactivos. Las células, incluidas las células muertas en suspensión, se recogieron y se resuspensionaron en 200 μl de PBS que contenía 1 μg/ml de yoduro de propidio (YP) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La muerte celular se evaluó inmediatamente en un citómetro de flujo. La población YP+ representó el porcentaje de células muertas.

Inmunoblotting

Los sedimentos celulares se recogieron y se lisaron con tampón RIPA suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas. La concentración de proteína se cuantificó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA. Excepto para las muestras de proteína que se analizaron para Tmem87a, cantidades iguales de lisados de proteínas se calentaron a 95 °C durante 10 minutos. Las muestras de proteína se separaron en geles SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST) que contenía un 5% de leche descremada durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, las membranas se lavaron en TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente. Los inmunoblot se visualizaron utilizando un sistema de imagen ChemiDoc. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla Suplementaria 3.

Mediciones de CoQ

Las células para las mediciones del contenido de CoQ se recogieron y se congelaron. A continuación, se añadieron 200 μl de etanol al 96% que contenía 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol y 800 μl de 1-propanol a las células congeladas. La suspensión celular se trató con cinco ciclos de sonicación y reposo, se congeló a -40 °C durante 30 minutos y a 4 °C durante 10 minutos y, a continuación, se centrifugó a 15.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se secó y se redisolvió en etanol (con el estándar interno CoQ10-D9) antes de realizar la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). A continuación, se mezclaron isométricamente de 5 a 5.000 ng/ml de ubiquinona y ubiquinol con 200 ng/ml de CoQ10-d9 para generar curvas de calibración. El análisis UHPLC-MS/MS se realizó utilizando un sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity II acoplado a un instrumento de espectrometría de masas de triple cuadrupolo 6470A. Se aplicó el modo de monitorización de reacciones múltiples para determinar la ubiquinona (880,7→197 para la cuantificación y 880,7→95 para la cualificación) y el ubiquinol (882,7→197 para la cuantificación y 882,7→95 para la cualificación). El software Agilent MassHunter se utilizó para adquirir y analizar los datos. La concentración de CoQ oxidada y reducida se calculó en función de la curva de calibración y se normalizó a la concentración de proteína en cada muestra.

Animales

Se obtuvieron ratones hembra WT C57BL/6JNifdc (de 6 a 8 semanas de edad) del Laboratorio de Tecnología Animal Beijing Vital River. Los ratones C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J fueron amablemente proporcionados por N. Wu (Colegio de Medicina Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (HUST)). Los ratones Tmem87af/+, Albcre y Tmem87a+/− se obtuvieron de Shanghai Biomodel Organism Science and Technology Development. Los ratones Tmem87a con deleción total (Tmem87a−/−) se generaron mediante el cruce de ratones Tmem87a+/− con ratones Tmem87a+/−. Los ratones Tmem87af/f se generaron mediante el cruce de ratones Tmem87af/+ con ratones Tmem87af/+. Los ratones Tmem87a-KO específicos del hepatocito (Tmem87af/fAlbcre) se generaron mediante el cruce de Tmem87af/f con ratones Albcre. Los cebadores para la genotipificación se enumeran en la Tabla Suplementaria 6.

Todos los animales se alojaron en instalaciones libres de patógenos específicos. No se consideró el sexo en el diseño y el análisis del estudio porque este estudio no fue diseñado para detectar diferencias de sexo. Para el modelo espontáneo de HCC, solo se utilizaron ratones macho. Para otros modelos de tumores subcutáneos, se utilizaron ratones hembra.

Modelos de ratón de lesión hepática inducida por ConA o anticuerpo anti-Fas

Para la lesión hepática inducida por ConA, se inyectaron 15 mg/kg de ConA en ratones Tmem87af/fAlbcre y ratones Tmem87af/f a través de la vena caudal, mientras que se inyectó un volumen igual de solución salina normal como control. Los ratones se sacrificaron 24 horas después de la inyección. Para la lesión hepática inducida por anticuerpo anti-Fas, se inyectaron 0,5 μg/g de anticuerpo anti-Fas en ratones Tmem87a+/+ y ratones Tmem87a−/− a través de la vena caudal y los ratones se sacrificaron 5 horas después de la inyección. Se recogió la sangre de los ratones para detectar ALT y AST. Los tejidos hepáticos se prepararon en secciones de parafina para realizar la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y el ensayo TUNEL o se homogeneizaron para realizar inmunoblot para detectar los niveles de proteína de Tmem87a, caspasa 3 y Parp escindida.

Modelos de ratón de lesión renal isquémica-reperfusión (LIR)

Los pedículos renales bilaterales de ratones Tmem87a−/− se sujetaron con un fórceps hemostático durante 45 minutos y, a continuación, se retiraron los sujetadores, lo que provocó una LIR. Se realizó la misma operación o una operación simulada (en la que se realizó una laparotomía en los ratones, pero no se sujetaron los pedículos renales) en ratones WT. Se inyectó liproxstatina 1 (10 mg/kg) por vía intraperitoneal 1 hora antes de la oclusión. Después de 24 horas, se sacrificaron los ratones. Se recogió la sangre de los ratones para detectar CRE y BUN. Se homogeneizaron partes de los tejidos renales de los ratones para detectar el nivel de proteína Tmem87a mediante análisis de inmunoblot. Se prepararon partes de los tejidos renales de los ratones en secciones de parafina para la tinción de H&E y la tinción de inmunohistoquímica (IHC) de 4-HNE.

Modelos de tumores subcutáneos

Para los modelos de tumores subcutáneos, se suspendieron células B16F10 (3 × 105 células por ratón) y células Panc02 (6 × 106 células por ratón) en PBS y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones WT C57BL/6. Se suspendieron células CT26 (2 × 106 células por ratón) en PBS y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones BALB/c. El volumen del tumor se midió cada 2 días cuando los tumores eran palpables utilizando un calibrador y se calculó como longitud × ancho2/2. Al final del estudio, se extirparon y pesaron los tumores de los ratones. Se inyectó liproxstatina 1 (10 mg/kg) por vía intraperitoneal en los ratones todos los días. El anticuerpo anti-PD1 se inyectó por vía intraperitoneal en los días 5, 8 y 11 después de la inyección de células tumorales a una dosis de 100 μg por ratón. El anticuerpo anti-CD8a, el anticuerpo anti-CD4 y el anticuerpo anti-NK1.1 se inyectaron por vía intraperitoneal cada 3 días a partir del día 4 después de la inyección de células tumorales a una dosis de 100 μg por ratón.

Para el modelo de tumor preinmunizado, primero se obtuvieron células B16F10 tratadas con ciclos de congelación-descongelación o RSL3 in vitro. Para el tratamiento de congelación-descongelación, las células B16F10 se sometieron a cinco ciclos completos de congelación-descongelación que consistieron en la congelación rápida en nitrógeno líquido (5 minutos) seguida de la descongelación rápida en un baño de agua a 37 °C (5 minutos). Para el tratamiento con RSL3, las células B16F10 se expusieron a 2 μM de RSL3 durante 24 horas para inducir la muerte celular, con la posterior recogida de las células muertas desprendidas. Las células B16F10 tratadas con congelación-descongelación o RSL3 (5 × 105 células por ratón) y las células B16F10 WT o Tmem87a-KO (3 × 105 células por ratón) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo de ratones C57BL/6. A continuación, 7 días después de la inyección de inmunización, se inyectaron por vía subcutánea células B16F10 normales (3 × 105 células por ratón) en el flanco derecho. Los volúmenes tumorales en el flanco derecho se midieron cada 2 días cuando los tumores eran palpables.

Modelo espontáneo de HCC

Se generó HCC espontáneo inducido por la inyección hidroдинаmica de AKT-NRAS en la vena caudal, como se describió anteriormente^[54]. Brevemente, se diluyeron 5 μg de RAS/pT3EF1a, 5 μg de AKT/pT3EF1a y 0,67 μg de transposasa Sleeping Beauty en 1,5 ml de solución salina al 0,9% y se inyectaron por vía hidroдинаmica a través de la vena caudal en ratones Tmem87af/f de 4 semanas de edad y ratones Tmem87af/fAlbcre. Se recogieron los hígados de los ratones y se pesaron 5 semanas después de la inyección.

Para la deleción inducible específica del hígado de Tmem87a, 7 días después de la inyección hidroдинаmica de RAS/pT3EF1a, AKT/pT3EF1a y Sleeping Beauty transposase en ratones Tmem87af/f, se inyectaron 1 × 1011 copias de genoma viral de AAV8-hTBG-iCre o virus de control AAV8-hTBG-GFP (AAV8-control) diluidos en 100 μl de solución salina a través de la vena caudal. Los ratones se sacrificaron el día 35 y se recogieron los hígados para verificar la deleción de Tmem87a mediante inmunoblotting.

scRNA-seq

Se disecaron los tumores Tmem87a-KO B16F10 que reexpresaban el vector vacío o Tmem87a-Flag de ratones C57BL/6 y se obtuvieron suspensiones de células individuales. Las células CD45+ se extrajeron mediante clasificación citométrica de flujo. La suspensión celular se etiquetó con códigos de barras y el ARN de las células con código de barras se transcribió inversamente para construir bibliotecas de secuenciación (10x Genomics). La secuenciación se realizó con Illumina NovaSeq.

Los datos de secuenciación se desmultiplexaron y se alinearon al genoma de referencia mediante Cell Ranger. Los análisis se realizaron utilizando Cell Ranger y Seurat. Se contaron los identificadores de moléculas únicas para construir matrices de expresión digital. Se aplicó un filtrado de control de calidad para retener los genes detectados en al menos cinco células y las células que expresaban un mínimo de 300 genes. Se realizaron la función ‘find variable features’, la función ‘normalize data’, el análisis de componentes principales (PCA) y la reducción de dimensionalidad mediante aproximación y proyección uniforme de múltiples (UMAP) para identificar 14 grupos distintos. Se realizó un análisis de expresión diferencial entre cada grupo y todas las demás células utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon. La función ‘add module score’ en Seurat se utilizó para calcular las puntuaciones de módulo de las firmas de genes de estado celular público. Las características de los 14 grupos de células inmunitarias y la activación, la migración y la función efectora de las células T CD8+ se resumen en la Tabla Suplementaria 7 y la Tabla Suplementaria 8.

Análisis citométrico de flujo

Se recogieron los tumores o los bazo de diferentes grupos de ratones al final del estudio, se molieron utilizando un molinillo y se prepararon en una suspensión de células individuales utilizando tamices de células de 70 μm. Las suspensiones de células individuales se tiñeron con el colorante Zombie de infrarrojo cercano (NIR), se bloquearon con CD16/CD32 y, a continuación, se etiquetaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo anti-CD45, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8a, anti-CD25, anti-NK1.1, anti-CD11b, anti-Ly6G, anti-Ly6C, anti-F4/80 y anti-CD11c. Para la tinción de transcritos, las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando el conjunto de tampones de factores de transcripción y se tiñeron con anti-FOXP3. Para la detección de citocinas, las células se suspendieron en un medio de cultivo completo y se estimularon con monensina (1:1.000), ionomicina (1 μg/ml), brefeldina A (1:1.000) y forbol 12-miristato 13-acetato (20 ng/ml) a 37 °C durante 4 horas en una incubadora. Las células se lavaron, se tiñeron con el colorante Zombie NIR y, a continuación, se etiquetaron con anti-CD45, anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8a. Las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando tampón de fijación y tampón de permeabilización/lavado, respectivamente, y, a continuación, se tiñeron con anti-IFNγ y anti-TNF diluidos en el tampón de permeabilización/lavado. Por último, las células se resuspendieron en 500 μl de PBS y se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo. Los datos de citometría de flujo se analizaron mediante el software FlowJo.

IHC

La IHC se realizó utilizando el kit de preparación e inmunodetección IHC según las instrucciones del fabricante. Para la tinción de 4-HNE en los riñones de ratón y la tinción de TMEM87A en las microarreglos de tejido de carcinoma de pulmón humano, se utilizaron los anticuerpos enumerados en la Tabla Suplementaria 3. Se seleccionaron tres campos de cada muestra de tumor para determinar la puntuación H, que se midió automáticamente mediante el perfilador de IHC de FIJI para obtener el porcentaje de alta positividad, positividad, baja positividad y negatividad. La puntuación H se calculó como 1 × (% de baja positividad) + 2 × (% de positividad) + 3 × (% de alta positividad). Según la clasificación de la puntuación H, las muestras de tumor se dividieron en grupos con alta y baja expresión de TMEM87A.

Cocultivo de OT-I y células tumorales

Se extirparon el bazo y los ganglios linfáticos de ratones C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J (ratones OT-I) y se prepararon en una suspensión de células individuales utilizando tamices de células de 70 μm. Las células T CD8+ OT-I se expandieron y se activaron en un medio de cultivo que contenía un 10% de FBS, 5 μg/ml de péptido OVA257-264, β-mercaptoetanol (1:1.000) y penicilina-estreptomicina (1:100). A continuación, se añadieron 10 ng/ml de IL-2 recombinante de ratón el segundo día y las células se recogieron el cuarto día.

Las células B16F10 WT y Tmem87a-KO se transfectaron de forma estable con lentivirus que expresaba OVA–Luc y se seleccionaron con blasticidina durante 1 o 2 semanas. Antes del cocultivo con células OT-I, se cuantificó la intensidad de la luciferasa en las células tumorales WT y Tmem87a-KO para garantizar una eficiencia de transfección comparable. Las células tumorales OVA+Luc+ se sembraron en placas de 96 pocillos e incubaron durante la noche. Al día siguiente, se añadieron diferentes proporciones de células T CD8+ OT-I para el cocultivo. Después del tiempo indicado, se cuantificó la intensidad de la luciferasa de las células tumorales adheridas utilizando el reactivo del ensayo de luciferasa Nano-Glo para representar la viabilidad de las células tumorales.

Muestras humanas

Se recogieron especímenes de tejido de participantes clínicos con cáncer de pulmón incluidos en dos microarreglos de tejidos independientes en el Hospital Tongji (HUST). Un microarreglo de tejidos consistió en 100 núcleos evaluables con el diagnóstico patológico de carcinoma de pulmón. Los participantes recibieron inmunoterapia, con o sin quimioterapia y terapia antiangiogénica. Los datos incluyeron la supervivencia global (OS) de 100 participantes y la supervivencia libre de enfermedad de 96 participantes. El segundo grupo comprendió 114 núcleos para pares de tejido tumoral y tejido normal de 57 participantes con carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC), junto con la OS. Todas las muestras y la información se recogieron con el consentimiento informado de los participantes. La distribución por sexo y las características de los participantes se detallan en las Tablas Suplementarias 1 y 2. No se consideraron ni se recogieron la raza, la etnia ni otras categorías socialmente relevantes en este estudio. Por lo tanto, dichas variables no se utilizaron como indicadores.

Estadística y reproducibilidad

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism8. Todos los datos cuantitativos se presentan como la media ± SEM. Las comparaciones se analizaron utilizando una prueba t de Student de dos colas no pareada o análisis de varianza (ANOVA). Se asumió que la distribución de los datos era normal cuando se utilizaron las pruebas t, pero esto no se comprobó formalmente. Se muestran los puntos de datos individuales. Las curvas de Kaplan-Meier se generaron mediante pruebas de rango logarítmico. Los valores P exactos se indican en las figuras correspondientes. Los experimentos de este estudio se diseñaron utilizando de 3 a 10 muestras por grupo, condición o repetición independiente. Las réplicas biológicas y los datos estadísticos se indican en las leyendas. Los experimentos de imagen de fluorescencia y de inmunoblotting se muestran como resultados representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra, pero nuestros tamaños de muestra son similares a los que se informaron en publicaciones anteriores ^[13], ^[15], ^[55]. No se excluyeron datos de los análisis. Para los experimentos con animales, todos los ratones se emparejaron por sexo y edad antes de asignarlos aleatoriamente a diferentes grupos, mientras que los demás experimentos no se aleatorizaron. La recogida y el análisis de los datos no se realizaron de forma ciega a las condiciones de los experimentos, excepto para la evaluación de la puntuación de la inmunohistoquímica (IHC).

Resumen de la información

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de información de Nature Portfolio vinculado a este artículo.