La composición temporal y espacial del microambiente tumoral predice la respuesta a la inhibición de los puntos de control inmunitario en el cáncer de mama triple negativo metastásico.

La inhibición de los puntos de control inmunitario (ICI) ha transformado la terapia contra el cáncer, pero las tasas de respuesta a la monoterapia siguen siendo bajas en el cáncer de mama metastásico en comparación con el melanoma o el cáncer de pulmón^[1]–^[7]. En consecuencia, ensayos recientes han evaluado la quimio-inmunoterapia, y el ensayo IMpassion130 proporcionó la primera evidencia de fase III de beneficio en el cáncer de mama triple negativo metastásico (mTNBC)^[8]. El ensayo KEYNOTE-355 confirmó aún más la eficacia, estableciendo la quimio-inmunoterapia combinada como el estándar de atención para el mTNBC con PD-L1 positivo^[9].

Numerosos estudios han intentado identificar predictores clínicos y traslacionales de la respuesta a la ICI en el cáncer de mama^[10]–^[16]. Identificar biomarcadores robustos para distinguir a los pacientes que responden de los que no, sigue siendo un desafío, en gran medida debido a los complejos efectos de las inmunoterapias. A diferencia de las terapias dirigidas a proteínas específicas del tumor, las inmunoterapias activan una diversidad de tipos de células inmunitarias, lo que requiere un análisis multidimensional. Los ensayos convencionales que miden parámetros limitados no logran capturar esta complejidad, que se ve aún más influenciada por el contexto espacial y las interacciones dentro del microambiente tumoral^[17]. Como tal, los ensayos que carecen de información espacial no pueden resolver completamente esta complejidad.

El perfilado espacial ha proporcionado información clave en el microambiente tumoral (TME) del TNBC. Por ejemplo, la citometría de masas por imagen reveló una organización espacial distinta con una mayor infiltración inmune en el TNBC en comparación con los tumores de mama ER+HER2- y HER+, y nuestro trabajo anterior mostró la separación del TNBC primario por la mezcla de células inmunitarias y cancerosas^[18]–^[19]. Si bien estudios recientes identificaron predictores de respuesta a la quimio-inmunoterapia antes y durante el tratamiento^[13], su relevancia para la enfermedad metastásica sigue sin estar clara. El muestreo longitudinal, especialmente en el cáncer de mama metastásico, sigue siendo poco frecuente, lo que limita la comprensión de la dinámica tisular, la progresión y los resultados.

Presentamos un conjunto de datos espaciotemporales de TNBC con tumores primarios coincidentes y biopsias metastásicas longitudinales recolectadas antes y durante la terapia anti-PD1 en un ensayo prospectivo. Generamos datos de imagen multiplexada de secciones de patología para cada paciente en diferentes puntos temporales y los combinamos con datos de genómica y transcriptómica generados previamente^[15] para permitir una caracterización multimodal del TME. El análisis reveló características de imagen y transcriptómicas asociadas con la respuesta, incluida la infiltración de células T en el borde del cáncer, la diversidad de los vecindarios celulares y las células mieloides PD-L1+. Por el contrario, el secuenciamiento del exoma completo de las biopsias previas al tratamiento no mostró correlaciones robustas con la respuesta. Al analizar los diferentes puntos temporales, encontramos que los aumentos en la diversidad celular se asociaron constantemente con un mejor resultado. Por el contrario, otras características, como la densidad de células T CD8 y los niveles de expresión de PD-L1, no fueron universalmente predictivas, y su asociación con el resultado dependió del punto temporal. Los modelos multivariados mostraron que las muestras durante el tratamiento proporcionaron el poder predictivo más fuerte, mientras que los tumores primarios ofrecieron poca información. Estos hallazgos subrayan la importancia de la caracterización longitudinal y multimodal para definir los determinantes de la respuesta a la ICI y guiar futuros ensayos clínicos.

Resultados

Caracterización multimodal del TNBC metastásico longitudinal

Analizamos muestras histológicas longitudinales de 103 pacientes con TNBC metastásico (mTNBC) tratados con nivolumab (anti-PD-1) en el ensayo TONIC (NCT02499367; Tabla suplementaria 1)^[15],^[20]. Los pacientes fueron incluidos en la etapa I (n=65) o etapa II (n=38) de TONIC, con un promedio de 43,5 meses desde el diagnóstico hasta la inclusión y 30,1 meses desde el tumor primario hasta la recurrencia. Para comprender la evolución del TME, las muestras tumorales abarcaron cuatro puntos temporales: 1) tumor primario (recopilación retrospectiva), 2) biopsia basal metastásica al inicio del ensayo TONIC, 3) pre-nivolumab (después de la inducción) y durante el nivolumab (después de 3 ciclos de nivolumab) (Fig. 1a). Un patólogo seleccionó regiones representativas para matrices de tejidos (Extended Data Fig. 1a), y se diseñó un panel de anticuerpos de 37 plex para capturar los tipos de células del TME, los estados funcionales y la arquitectura tisular (Tabla suplementaria 2, Métodos). La imagen de haz de iones multiplexada (MIBI) permitió una imagen cuantitativa y de alta dimensión ^[21] (Métodos).

Generamos imágenes multiplexadas de 620 núcleos de matrices de tejidos distintos (Extended Data Fig. 1b–c), incluidos 59 tumores primarios, 79 biopsias basales, 70 biopsias pre-nivolumab y 62 biopsias durante el nivolumab de 101 pacientes únicos (Fig. 1a, Extended Data Fig. 1d, Tablas suplementarias 3–4). Las imágenes MIBI sin procesar se sometieron a la sustracción del fondo, la eliminación del ruido y la normalización antes del análisis (Métodos). Las imágenes procesadas se segmentaron con Mesmer^[22], identificando un promedio de 2905 células por núcleo (Fig. 1e; Métodos). Luego, las células se clasificaron utilizando Pixie^[23], lo que resultó en 22 grupos que se agruparon en ocho linajes principales del TME (Fig. 1f), resumiendo los componentes principales del TME (Extended Data Fig. 2a–d).

Para complementar la información proteómica resuelta espacialmente, analizamos el secuenciamiento del exoma completo (WES) y el secuenciamiento de ARN del transcriptoma completo (RNA-seq) a granel previamente publicados de las mismas muestras basales metastásicas y las mismas muestras basales metastásicas, pre-nivolumab y durante el nivolumab (Fig. 1b), utilizando una canalización bioinformática armonizada (Métodos). En total, el WES estuvo disponible para 74 pacientes, el RNA-seq para 191 muestras de 89 pacientes y el MIBI para 270 muestras de 101 pacientes, lo que resultó en datos multimodales en 103 pacientes (Fig. 1b–c, Extended Data Fig. 1e–g).

Cuantificamos la abundancia de grupos de células a partir de los datos de MIBI en los tumores metastásicos basales, encontrando que las células cancerosas eran la población más prevalente (46,3% de todas las células). Estas se dividieron en tres subgrupos: Cáncer 1 (73,8% de las células cancerosas) y Cáncer 2 (11,7%), ambos ECAD+/CK17+ con niveles elevados de Ki67 y GLUT1; y Cáncer 3 (14,4%), definido por una expresión tenue de ECAD y CK17 (Fig. 1f, Extended Data Fig. 2g).

Las células inmunitarias fueron el siguiente tipo de célula más abundante (32,1% de todas las células, Fig. 1f, Extended Data Fig. 2i), con las células T CD4+ (16,5% de las células inmunitarias) y las células T CD8+ (17,4%) como los subconjuntos más abundantes, ambos expresando con frecuencia PD-1. Las células Tregs (4,7%) fueron la población de células inmunitarias más proliferativa, con un 15% expresando Ki67^[24], y las células presentadoras de antígenos (APCs) tenían la mayor expresión de IDO1. Se identificaron cuatro subconjuntos de macrófagos/monocitos, muchos de los cuales expresaban PD-L1 y TIM3. Las células asesinas naturales (NK), aunque raras (0,7%), expresaban con frecuencia T-BET y TIM3, lo que indica un estado de maduración e inmunosupresión^[25]–^[27].

Las células estructurales (18,1%) incluían fibroblastos (77%), endoteliales (15%) y musculares lisas (7%; Extended Data Fig. 2h). Los fibroblastos incluían fenotipos de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) similares a CAF-S1, que se han relacionado previamente con la supresión inmune y la interacción de las células Tregs en el TNBC^[28], y la población CAF-Otros negativa para FAP o SMA. Otros grupos incluían Inmune Otros (3% del total) y células negativas para marcadores (0,8%). En general, las abundancias de población celular se alinearon con los análisis espaciales previos del TNBC^[19],^[29].

A continuación, examinamos los cambios en la prevalencia de la población celular en las lesiones metastásicas desde la línea de base hasta el tratamiento con nivolumab. Los tumores metastásicos de la línea de base (n=79) y los tumores metastásicos durante el nivolumab (n=62) tenían proporciones celulares similares (Extended Data Fig. 2e), lo que persistió con un agrupamiento más fino en 22 tipos de células (Extended Data Fig. 2f). Las modestas diferencias temporales en la abundancia nos llevaron a desarrollar métricas para capturar la dinámica espacial en el TME.

Cuantificación del microambiente tumoral con SpaceCat

Los datos de imagen altamente multiplexados son una fuente rica de información para definir las relaciones espaciales entre los tipos de células, pero cuantificar esta información a escala es un desafío. Para abordar esta brecha, desarrollamos SpaceCat, una canalización computacional de código abierto que genera un catálogo espacial de características informativas a partir de datos de imagen multiplexados. SpaceCat se puede aplicar a cualquier conjunto de datos de imagen multiplexados procesados, generando 903 características que capturan la abundancia, la ubicación, el fenotipo y la organización celular y acelular (Fig. 2a, Extended Data Fig. 3, Tabla suplementaria 5, Métodos). Las características incluyen métricas de densidad celular tanto a nivel de linaje como de subconjunto (por ejemplo, total frente a células T CD8+), puntajes de diversidad que reflejan el equilibrio entre las poblaciones y métricas de mezcla que cuantifican la partición entre los tipos de células (Fig. 2a). Aplicado a todos los 620 núcleos de tejidos, SpaceCat permite la extracción escalable y estandarizada de métricas espaciales a partir de datos de imagen multiplexados.

Para evaluar los efectos específicos de la ubicación, definimos cuatro compartimentos tumorales: núcleo del cáncer (alta densidad de cáncer), borde del cáncer (borde exterior del cáncer), borde del estroma (el borde no canceroso circundante) y núcleo del estroma (el área restante de la imagen) (Extended Data Fig. 3a, Métodos). Las características de SpaceCat se calcularon tanto en imágenes completas como en compartimentos individuales. Algunas características, como las células cancerosas Ki67+ y los macrófagos PD-L1+, fueron consistentes en los compartimentos, mientras que la relación CD8/CD4 de las células T fue significativamente mayor en el núcleo del cáncer, lo que sugiere la migración dirigida de las células CD8+ (Extended Data Fig. 4a, f–g)^[30],^[31]. En total, el 28% de las características variaron según el compartimento (Extended Data Fig. 4c), principalmente entre el tumor y el estroma (Extended Data Fig. 4b), lo que destaca la importancia del contexto espacial.

De las 903 características de SpaceCat, las más comunes fueron aquellas que capturaron los fenotipos celulares (n=444, es decir, proporción de células cancerosas Ki67+) y la abundancia celular (n=236, es decir, densidad de células T), lo que refleja tanto lo informativo que son estas características (ya que las características altamente correlacionadas se eliminan) como la selección de marcadores (Fig. 2b). Otras categorías de características incluyeron la estructura espacial (n=103), la diversidad celular (n=65) y las interacciones celulares (n=45). Debido al enfoque inmunológico de nuestro panel de anticuerpos, pudimos definir las células inmunitarias con el mayor grado de granularidad, y por lo tanto fueron el tipo de célula más representado en las características de SpaceCat (Fig. 2b, 42,3%). También identificamos características que involucraron múltiples tipos de células, células cancerosas y la matriz extracelular (MEC).

Comparamos las características de la MEC con los fenotipos de las células vecinas clasificando los parches de imagen en tres perfiles de MEC: sin MEC, frío (solo colágeno) e inflamado (colágeno, FAP, fibronectina) Extended Data Fig. 4h). Encontramos una mayor proporción de fibroblastos y macrófagos con expresión de la proteína inmunosupresora TIM3 en las regiones frías en comparación con las regiones inflamadas (Extended Data Fig. 4i–j), y los macrófagos en las regiones frías mostraron además una mayor expresión de PDL1 (Extended Data Fig. 4k).

Una matriz de correlación de las distintas características reveló grupos de características biológicamente relacionadas (Fig. 2c), incluidos amplios categorías como la diversidad inmune (por ejemplo, vecindarios de células T CD4+, proporciones de macrófagos, diversidad global), junto con módulos más estrechos como la hipoxia (células GLUT1+) y la morfología (relación núcleo-citoplasma, concavidades de la membrana; Fig. 2c). Al definir y cuantificar los componentes principales del TME, SpaceCat genera características interpretables que permiten la separación de poblaciones de pacientes.

Para evaluar los cambios asociados al tratamiento previo y posterior, clasificamos cada característica según la magnitud del cambio. Encontramos 19 características que difirieron entre los dos puntos temporales (Extended Data Fig. 5a), incluida la relación de células T a células cancerosas en el borde del estroma, que aumentó significativamente durante el tratamiento (Extended Data Fig. 5b). Esto corresponde a un aumento de la infiltración de células T que es independiente del resultado del paciente y que se comparte entre todos los pacientes. Otras características, incluida la positividad de CD45RO y la diversidad asociada a los macrófagos, mostraron cambios numéricos, pero no se separaron claramente entre los puntos temporales (Extended Data Fig. 5c–d).

Repetimos el análisis en muestras emparejadas (Figura 5e del Material Suplementario) y, nuevamente, encontramos un aumento significativo en la proporción de células T con respecto a las células cancerosas en el borde del estroma (Figura 5f del Material Suplementario). Otras características, como la proporción de células no clasificadas con respecto a las células cancerosas y las proporciones de células NK con respecto a las células T (Figuras 5g y 5h del Material Suplementario), mostraron tendencias similares, pero carecían de una clara separación, lo que sugiere diferencias temporales limitadas independientes del resultado. Esto motivó un análisis estratificado por la respuesta del paciente.

Vinculación de las características transcriptómicas y espaciales del microambiente tumoral (MET)

Para complementar los datos de MIBI, integramos perfiles de RNA-seq^[32], extrayendo firmas de señalización de citocinas, conjuntos de genes asociados con el resultado y frecuencias celulares predichas (CIBERSORTx) (Figura 6a del Material Suplementario, ver Métodos). Encontramos fuertes relaciones entre las diferentes modalidades (Figura 6b del Material Suplementario, Tabla 6 del Material Suplementario), incluida la concordancia entre las puntuaciones de RNA de MHCI y la expresión basada en MIBI de HLA1 (Figura 6c del Material Suplementario) y nuevas asociaciones, como la señalización de TGFβ^[33] con las células CD45RB+ CD4+ T en el borde del cáncer (r=0,88, Figura 6d del Material Suplementario). Las vías de RNA-seq relacionadas con el sistema inmunitario, que incluyen MDA5/IRF7/IRF3 (r=0,74) y RIGI/IRF7/IRF3 (r=0,72), se correlacionaron fuertemente con las células cancerosas HLA1+ (Figura 6e del Material Suplementario), y las principales asociaciones de RNA-seq estuvieron todas relacionadas con la señalización de los interferones. Identificamos una relación inversa entre la diversidad celular alrededor de las células CD8 T en el núcleo del cáncer y una firma de agotamiento de las células T (Figura 6f del Material Suplementario). Luego, evaluamos qué categorías de características de MIBI se correlacionaron más fuertemente con RNA-seq. Los pares de características significativas (correlación de Spearman r ≥ 0,6, p ajustada ≤ 0,05) se enriquecieron en el núcleo del cáncer y en el borde del cáncer, mientras que las características del estroma mostraron menos correlaciones (Figura 6g del Material Suplementario).

Predictores de la respuesta al bloqueo de los puntos de control inmunitario

Para vincular la estructura del MET con el beneficio de la inmunoterapia de bloqueo de los puntos de control inmunitario (ICI), probamos cada característica de SpaceCat para asociarla con la respuesta a nivolumab en el ensayo TONIC (Figura 3a, Métodos). Cuantificamos la fuerza de la asociación utilizando una puntuación de importancia que combina la significación estadística y el tamaño del efecto (0 = menos predictivo, 1 = más predictivo) y nos centramos en los 100 principales características (Métodos).

Entre las 100 características principales, las proporciones celulares se enriquecieron en comparación con las densidades de una sola población (Figura 7a del Material Suplementario). Las proporciones también obtuvieron una puntuación más alta que sus densidades de componentes (prueba t no pareada, p