DKC1 favorece la progresión del cáncer colorrectal y la resistencia a la terapia al alterar la regulación de la biosíntesis de esfingolípidos.

Los pacientes con cáncer colorrectal (CCR) que presentan tumores con RAS de tipo salvaje a menudo reciben terapias dirigidas contra el EGFR, y la mayoría de ellos muestran una buena respuesta, como se documenta en los ensayos CRYSTAL, PRIME y TAILOR^[1]–^[3]. No obstante, muchos presentan malos resultados debido a mutaciones en los genes KRAS (45%) o NRAS (4%) ^[4],^[5]. Además del EGFR, la señalización WNT, que está anormalmente activa, también desempeña un papel causal en el CCR; por lo tanto, se ha investigado exhaustivamente el tratamiento dirigido a la producción catalítica de ligandos WNT, los antagonistas de sus receptores o los inhibidores de los mensajeros transcripcionales, como la β-catenina, contra los cánceres agresivos, incluido el CCR, y algunos de estos tratamientos se encuentran en ensayos clínicos^[6],^[7]. Sin embargo, las mutaciones en los componentes de la señalización WNT, como APC, AXIN, CTNNB1 y los ligandos WNT, plantean desafíos^[8],^[9]. Además, una proporción significativa de pacientes con CCR recibe con frecuencia un tratamiento multimodal, como el ácido folínico, el 5-fluorouracilo y el irinotecán (FOLFIRI), o el ácido folínico, el 5-fluorouracilo y el oxaliplatino (FOLFOX), como parte de la terapia de primera línea, junto con anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Aunque muchos pacientes no responden o presentan una rápida recaída después del tratamiento debido a mecanismos de resistencia intrínsecos o adquiridos^[10],^[11]. En particular, los estudios clínicos y preclínicos muestran que los tumores resistentes a FOLFIRI/FOLFOX a menudo presentan una respuesta transitoria a los inhibidores de la vía WNT debido a la activación de la señalización compensatoria, lo que subraya la necesidad de estrategias terapéuticas combinadas^[12]–^[14].

La heterogeneidad molecular asociada con el CCR a menudo conduce a una respuesta clínica variable que dificulta la selección de terapias eficaces y plantea desafíos para la evaluación precisa de los indicadores pronósticos y predictivos. Por lo tanto, el Consorcio de Subtipos de CCR (CRCSC) desarrolló criterios para la categorización de los pacientes en cuatro subtipos moleculares de consenso (CMS) con características distintas: CMS1 (inestabilidad de microsatélites e inmune, 14%), que es hipermutado, inestable en los microsatélites y se asocia con una fuerte activación inmune; CMS2 (canónico, 37%), con características epiteliales y una marcada señalización WNT y MYC; CMS3 (metabólico, 13%), también epitelial, que presenta una notable desregulación metabólica; y CMS4 (mesenquimal, 23%), caracterizado por una prominente activación del TGF-β, invasión del estroma, angiogénesis y un fenotipo inflamatorio e inmunosupresor^[15]. Aunque la clasificación CMS ofrece un potencial para la utilidad clínica en la predicción del pronóstico y la respuesta al tratamiento^[16],^[17], se justifica un mayor refinamiento para una comprensión detallada de estos subtipos moleculares. Por ejemplo, la caracterización a nivel de célula única de los subtipos CMS reveló una alta heterogeneidad asociada con CMS2, en la que se observó una variabilidad sustancial y un enriquecimiento de las vías que regulan el metabolismo y el ciclo celular^[18].

Se sabe que el gen Dyskerin pseudouridine synthase 1 (DKC1) está mutado en una enfermedad humana ligada al cromosoma X conocida como disceratosis congénita^[19] y ha estado involucrado en la pseudo-uridilación del ARN ribosómico (ARNr) y el mantenimiento de los telómeros^[20]. Además, la alta expresión de DKC1 en los cánceres de hígado y mama se ha asociado con una menor supervivencia libre de recurrencia y una menor probabilidad de supervivencia, respectivamente^[21],^[22]. Además, el papel multifacético de DKC1, como en la regulación del ciclo celular y el procesamiento del ARNr, lo convierte en un objetivo terapéutico ideal para el cáncer^[23]. En este sentido, se ha demostrado que el tratamiento dirigido a DKC1 junto con la vía MEK/ERK tiene un efecto sinérgico en el CCR^[24]. No obstante, debido a las múltiples funciones celulares, DKC1 requiere una elucidación más exhaustiva y detallada de su función oncogénica, el mecanismo subyacente involucrado en su regulación al alza y las vías moleculares asociadas involucradas en la progresión del CCR.

La desregulación de los lípidos se ha asociado con la proliferación y la progresión tumoral al afectar las interacciones proteína-proteína y la transducción de señales^[25],^[26]. Los esfingolípidos son una clase de lípidos importantes tanto en la composición de la membrana como en la regulación de las vías de señalización que se generan mediante la síntesis de novo y se metabolizan mediante la vía de salvamento^[27]. Además, los esfingolípidos sirven como sustratos para las ceramidas sintasas (CerS) para producir ceramidas, esfingolípidos complejos que actúan de manera específica para la longitud de la cadena y dependiente del contexto^[28],^[29]. En particular, se sabe que las ceramidas de cadena larga, como Cer d18:1/18:0 y Cer d18:1/20:0, están reducidas en el cáncer colorrectal^[30], mientras que otras ceramidas de cadena larga, como C16-Cer, C16-HexCer y SM34, y las de cadena muy larga, como Cer d18:1/22:0, Cer d18:1/24:0 y Cer d18:1/24:1, se sabe que están elevadas en los tejidos tumorales^[30]–^[32]. Si bien las ceramidas específicas en el plasma se han utilizado como biomarcadores para la subtipificación molecular^[33], la compleja interacción entre las ceramidas y las proteínas de señalización celular que pueden establecer su función efectora en la patogénesis del cáncer y un posible objetivo farmacológico no se comprende bien.

Aquí, desciframos el mecanismo molecular subyacente a la regulación al alza de DKC1 en el CCR y descubrimos las características oncogénicas asociadas con él. Informamos que los pacientes con CCR que presentan una alta expresión de DKC1 muestran similitudes con el subtipo CMS2, que está enriquecido con la señalización WNT, y representan una acumulación de ceramidas de cadena muy larga específicas, lo que destaca su utilidad como biomarcadores diagnósticos basados en lípidos. Además, revelamos el papel de DKC1 en la promoción de la resistencia a la terapia de primera línea en pacientes con CCR en etapa avanzada. En particular, utilizando xenoinjertos de ratón y organoides derivados de pacientes (PDO) establecidos a partir de pacientes con resistencia a la terapia, demostramos la eficacia del tratamiento combinado que utiliza inhibidores de DKC1 y WNT. En conjunto, este estudio ofrece una solución para los pacientes con resistencia a la terapia que presentan altos niveles de DKC1 y enfatiza la importancia de las firmas de lípidos basadas en el plasma para el diagnóstico del CCR.

Resultados

Los altos niveles de DKC1 se asocian con un mal pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal

DKC1 es un componente esencial del complejo de la telomerasa que se sabe que se expresa en gran medida en múltiples tipos de cáncer^[21],^[22]. Por lo tanto, para examinar la expresión de DKC1 en el CCR, realizamos una tinción inmunohistoquímica de microarreglos de tejidos (TMA) que comprenden muestras de pacientes con CCR (N = 75) y se observó una alta expresión en aproximadamente el 31% de los tumores primarios en todas las etapas y grados, mientras que se observó una intensidad media en aproximadamente el 45% de los casos y solo el 24% presentó una baja expresión de DKC1 (Fig. 1a–c). También analizamos el conjunto de datos de secuenciación de ARN disponible públicamente para los pacientes con CCR de etnia coreana (GSE6988) y se observó una mayor expresión de DKC1 en los tumores primarios en comparación con los tejidos normales (Fig. 1d). Se observó una tendencia similar en las muestras (N = 13) derivadas de pacientes con CCR de India (Fig. 1e, Fig. S1a y Datos suplementarios 1a). Para fortalecer aún más nuestros hallazgos, se realizó una tinción inmunofluorescente para DKC1 en tejidos tumorales (N = 6) y normales (N = 5) adicionales derivados de pacientes con CCR de India, y, como se esperaba, se observó una mayor expresión de DKC1 en los tumores (Fig. 1f, g, Fig. S1b y Datos suplementarios 1b).

A continuación, preguntamos si DKC1 califica como un objetivo terapéutico en el CCR y analizamos el conjunto de datos de secuenciación de ARN de pán-cáncer disponible públicamente (GDC-PANCAN). Se observaron niveles más altos de DKC1 específicamente en las muestras de CCR en comparación con los tejidos sólidos normales de diferentes órganos, lo que proyecta a DKC1 como un posible objetivo farmacológico con efectos secundarios mínimos (Fig. S1c). Anteriormente, una pantalla de shRNA enriquecida en quinasas en líneas celulares de CCR identificó a DKC1, junto con nueve genes clave, como reguladores de la actividad transcripcional mediada por β-catenina y la proliferación celular^[34]. En línea con esto, reanalizamos los perfiles de expresión génica de estos genes en el conjunto de datos TCGA-Colorectal Adenocarcinoma (TCGA-COADREAD) disponible públicamente y observamos que DKC1 exhibió la expresión más alta en los tumores primarios, lo que destaca su importancia como un mediador crítico en la patogénesis del CCR (Fig. S1d). Para evaluar la expresión de DKC1 en tumores con diferentes antecedentes de mutación, categorizamos a los pacientes con CCR en función de las mutaciones de KRAS y BRAF (GSE2138 y TCGA COADREAD). En particular, se observó una alta expresión de DKC1 independientemente del estado de mutación, lo que enfatiza el potencial de DKC1 como un posible objetivo terapéutico en un espectro más amplio de pacientes con CCR (Fig. S1e). Para determinar si DKC1 tiene relevancia clínica, realizamos un análisis de supervivencia utilizando el conjunto de datos TCGA-COAD para generar una curva de Kaplan-Meier, y se observó una menor supervivencia libre de recurrencia para los pacientes con mayor expresión de DKC1 (Fig. 1h). A continuación, para explorar las vías de señalización posteriores reguladas por DKC1, realizamos un análisis exhaustivo utilizando múltiples conjuntos de datos de CCR disponibles públicamente que comprenden 1538 pacientes, categorizados en función de la expresión de DKC1 de alta a baja, y se examinó la variabilidad intergrupal entre los cuartiles primero y cuarto de estos pacientes (N = 770). En particular, se descubrió que 265 genes estaban significativamente regulados al alza y 51 genes presentaban una baja expresión en el grupo DKC1-alto (Fig. S1f y Datos suplementarios 2a, b), estableciendo así una asociación positiva de estos genes regulados al alza con el grupo DKC1-alto (Fig. S1g). Para identificar las vías biológicas asociadas con DKC1, se realizó un análisis de enriquecimiento de genes y se observó un enriquecimiento de los procesos relacionados con la patogénesis del cáncer, como la regulación del ciclo celular y la proliferación, etc. (Fig. 1i y Datos suplementarios 2c, d). En conjunto, estos hallazgos indican que los altos niveles de DKC1 se asocian con un mal pronóstico en el CCR independientemente de los antecedentes de mutación de KRAS o BRAF y la etnia del paciente.

DKC1 induce propiedades oncogénicas y promueve la progresión del cáncer colorrectal

Para comprender la importancia funcional de DKC1 en el CCR, examinamos la expresión de los genes asociados con DKC1 en las líneas celulares de cáncer (Datos suplementarios 2a), donde SW620 y HT-29 (WiDr) mostraron una mayor expresión de estos genes (Fig. S2a). Asimismo, se examinó el perfil del transcriptoma de las líneas celulares de CCR obtenidas de la enciclopedia de líneas celulares de cáncer (CCLE) y las células SW620 mostraron la expresión más alta de DKC1, seguida de las células Colo320HSR y WiDr (Fig. S2b).

Por lo tanto, para los estudios de pérdida de función, realizamos una silenciamiento estable mediado por shRNA lentiviral de DKC1 en las líneas celulares SW620, Colo320HSR y WiDr, y el silenciamiento se confirmó a los niveles de transcrito y proteína (Fig. S2c). Dado que se sabe que DKC1 regula la traducción mediada por IRES del ARNm ribosomal al desregular la biogénesis de los ribosomas y la actividad de la pseudouridilación^[35], buscamos confirmar las implicaciones funcionales de la supresión de la actividad de DKC1 mediante el empleo de un ensayo de etiquetado de química de clic basado en la fluorescencia de L-homopropargilglicina (HPG), que utiliza un análogo de la metionina para visualizar y cuantificar directamente la síntesis de proteínas nacientes en las células isogénicas SW620 con DKC1 silenciado (shDKC1-2 y shDKC1-3) en comparación con los controles. En particular, el silenciamiento de DKC1 inhibió notablemente la síntesis de proteínas nacientes, como se evidencia por una marcada reducción en la intensidad de la fluorescencia verde (Fig. S2d).

Debido al papel multifacético de DKC1 y su función relativamente poco explorada en la patogénesis del CCR, realizamos a continuación un perfil del transcriptoma de las células SW620 silenciadas con DKC1 (shDKC1-2 y shDKC1-3) y el control de revierte (shSCRM) (Fig. S2e y Datos suplementarios 3a, b). El análisis de enriquecimiento de vías utilizando la base de datos para la anotación, la visualización y el descubrimiento integrado (DAVID) reveló diferentes procesos biológicos relacionados con el cáncer, notablemente, los procesos relacionados con la biosíntesis de esteroles y colesterol se redujeron significativamente (Fig. 2a y Datos suplementarios 3c, d).

Para dilucidar la relevancia funcional de DKC1 en el cáncer colorrectal, realizamos ensayos de proliferación celular, que revelaron una disminución notable en el crecimiento de las células de CRC tras la inhibición de DKC1, lo que destaca su papel fundamental en el mantenimiento de la proliferación de las células tumorales (Fig. 2b y Fig. S2f). Además, se observó una reducción notable en la capacidad de formación de focos de las células de CRC con DKC1 inhibido (Fig. 2c y Fig. S2g). A continuación, para examinar la capacidad de autorrenovación de estas células, se realizó un ensayo de esferoides tumorales, y se observó una reducción significativa en la eficiencia de formación de esferoides y en el área superficial de los esferoides en las células con DKC1 inhibido en comparación con el control (Fig. 2d). También observamos una reducción de la "stemness" (capacidad de célula madre) en las células con DKC1 inhibido, lo que se confirmó mediante una disminución en la expresión de marcadores asociados a la "stemness" (Fig. 2e). Además, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) también reveló un enriquecimiento negativo significativo de la transición del ciclo celular G2/M tras la inhibición de DKC1 (Fig. S2h). Para validar esto, examinamos la expresión de los genes implicados en la transición de la fase G2/M y realizamos citometría de flujo basada en yoduro de propidio para evaluar la progresión del ciclo celular. En consonancia con los hallazgos anteriores, se observó una regulación a la baja significativa de los genes implicados en la transición de la fase G2/M y una acumulación marcada de células en la fase G2/M con la inhibición de DKC1 (Fig. 2f y Fig. S2i). Para dilucidar aún más el mecanismo subyacente asociado con el potencial oncogénico de DKC1, examinamos la expresión de los marcadores de apoptosis y encontramos una reducción posterior en la proteína antiapoptótica, Bcl-xL, mientras que la expresión de los marcadores proapoptóticos, como la Caspasa-3 y la PARP clivadas, se elevó significativamente tras la supresión de DKC1 (Fig. 2g y Fig. S2j).

Anteriormente, se ha demostrado que DKC1 aumenta la actividad de la telomerasa y la integridad genómica^[20],^[36]. Además, la respuesta al daño del ADN (DDR) y las vías de control suelen conducir a la detención del ciclo celular^[37]; por lo tanto, buscamos explorar si la inhibición de DKC1 puede inducir daño en el ADN. Para ello, examinamos la expresión de los genes DDR y se observó una disminución significativa tras la inhibición de DKC1 (Fig. S3a). A continuación, comprobamos la fosforilación de la proteína H2AX, γH2AX, un marcador altamente específico de las roturas de doble cadena del ADN, y se observó un aumento de γH2AX tras la inhibición de DKC1 (Fig. S3b-d).

Para establecer el papel de DKC1 en la tumorigénesis del CRC, implantamos subcutáneamente células SW620-shSCRM y SW620-shDKC1 estables en ratones NOD/SCID y monitorizamos el crecimiento tumoral. Se observó una reducción notable (~81%) en la carga tumoral en los ratones implantados con células SW620-shDKC1 en comparación con el control (Fig. 2h, i). Además, se observó una disminución significativa en la abundancia de núcleos positivos para Ki67, un marcador de las células que se dividen activamente, en los tumores extirpados del grupo con DKC1 inhibido (Fig. 2j). Para dilucidar aún más el papel dependiente del contexto de DKC1 en el CRC, utilizamos un sistema lentiviral shDKC1 inducible con doxiciclina (dox), lo que permite un control temporal preciso de la inhibición de genes en las células cancerosas. Este enfoque nos permitió separar los efectos de la supresión de DKC1 sobre la progresión tumoral in vivo de sus funciones de iniciación tumoral y proliferación, observadas in vitro. Para ello, primero se confirmó la inducción temporal mediada por dox de la actividad de shDKC1 a nivel de transcrito y proteína en las células isogénicas SW620 inducibles con dox (Fig. S3e, f), y se observó una reducción significativa en la tasa de proliferación de las células shDKC1_ tras la inducción con dox en comparación con los controles (Fig. S3g).

Además, se implantaron subcutáneamente células SW620-shSCRM y shDKC1 inducibles con dox en ratones nude atímicos para establecer xenoinjertos tumorales. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño palpable (~40-50 mm3), se administró dox para inducir la inhibición de DKC1. Como se esperaba, se observó una reducción significativa en el volumen tumoral (~78%) en el grupo Dox + shDKC1 en comparación con los controles (Fig. 2k, l). Además, se observó una disminución significativa en la abundancia de los niveles de DKC1 y los núcleos positivos para Ki67 en los tumores extirpados del grupo Dox+ shDKC1 en comparación con los controles (Fig. 2m y Fig. S3h), sin cambios notables en el peso corporal de los ratones durante el curso del tratamiento (Fig. S3i). En conjunto, demostramos que el DKC1 elevado en el CRC promueve el crecimiento, el mantenimiento y la progresión del tumor mediante la modulación de la regulación del ciclo celular y las vías de supervivencia celular.

El cáncer colorrectal positivo para DKC1 se asocia con el subtipo molecular de consenso 2

Teniendo en cuenta la naturaleza altamente heterogénea del CRC, buscamos examinar si la expresión elevada de DKC1 está relacionada con una firma o subtipo molecular definido. El sistema de clasificación ampliamente aceptado para el CRC son los subtipos moleculares de consenso (CMS); por lo tanto, utilizamos las firmas de genes para diferentes clases de CMS como CMS-UP o -DOWN (Datos suplementarios 4) y las analizamos en relación con el conjunto de datos combinado de pacientes con CRC (N = 770) categorizados en grupos DKC1-alto y -bajo. El análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) mostró una regulación al alza de la firma del gen "CMS2 UP" en los pacientes DKC1-alto, mientras que una regulación a la baja en los pacientes DKC1-bajo (Fig. S4a). Además, utilizamos ColoType, una firma de 40 genes para definir la clase CMS basada en los datos del transcriptoma global^[38], y encontramos una asociación similar con la firma del gen "CMS2 UP" (Fig. S4b). Posteriormente, para validar estos hallazgos, examinamos los datos de ARN-seq de una sola célula disponibles públicamente para células no clasificadas (N = 91.103) de dos cohortes de pacientes con CRC de diferentes etnias, belga y coreana, respectivamente (GSE144735 y GSE132465)^[39], y evaluamos la expresión media y el porcentaje de células que expresan DKC1 en diferentes subtipos de CMS. Se encontró un mayor porcentaje de células que se alinean con la subclase CMS2 y una expresión media relativamente alta de DKC1 en comparación con otras subclases en ambas cohortes (Fig. S4c, d). Para fortalecer aún más nuestros hallazgos, realizamos un metaanálisis de conjuntos de datos de ARN-seq de una sola célula de tres estudios independientes (GSE132465, GSE144735 y GSE200997) y aplicamos un enfoque pseudo-bulk con modelado de expresión diferencial basado en DESeq2 bajo un marco de efectos aleatorios. En particular, DKC1 surgió como significativamente regulado al alza en el subtipo CMS2 en comparación con CMS1, CMS3 y CMS4, lo que refuerza su relevancia específica para el subtipo en el cáncer colorrectal (Fig. S4e).

A continuación, analizamos los datos de recuento de ARN-seq del grupo TCGA-COADREAD estratificando a los pacientes en cuatro categorías de CMS utilizando conjuntos de genes representativos ampliados (~20-25 genes por subtipo) para capturar los procesos biológicos característicos asociados con cada subclase, según se definió previamente^[15]. Los niveles de expresión de los genes CMS2 asociados seleccionados, incluido DKC1, se estandarizaron en todos los muestras. En particular, DKC1 exhibió una expresión distintivamente elevada en la mayoría de los pacientes clasificados bajo el subtipo CMS2, lo que subraya aún más su posible papel en este contexto molecular (Fig. 3a). Para corroborar los hallazgos transcripcionales a gran escala con evidencia a nivel de proteínas, analizamos los perfiles proteómicos de los pacientes con CRC del Consorcio de Análisis Proteómico de Tumores Clínicos (CPTAC). Este análisis reveló una fuerte asociación entre la expresión elevada de la proteína DKC1 y el subtipo molecular CMS2, lo que refuerza aún más su relevancia específica para el subtipo (Fig. 3b). Una fracción notable de células con alta expresión de DKC1 también exhibió un fenotipo similar a una célula madre/TA (amplificación transitoria), lo que corrobora nuestros resultados, donde se observó una reducción notable de la "stemness" tras la inhibición de DKC1 (Fig. 2e). Para validar aún más esto, investigamos la asociación de los genes expresados diferencialmente entre los datos completos de los pacientes (N = 770) categorizados en función de la expresión de DKC1 y la firma de genes de tipo celular propuesta en una clasificación previa del CRC^[40]. Se observó una notable superposición del 14% entre la firma de genes regulada al alza en las células TA y los genes regulados al alza en los pacientes DKC1-alto (Fig. S4f y Datos suplementarios 5), mientras que se observó una superposición notable de aproximadamente el 7% de la firma de genes de células madre regulada a la baja con los genes regulados a la baja en los casos DKC1-alto, lo que indica una asociación de los pacientes positivos para DKC1 con el fenotipo TA/célula madre y el subtipo molecular CMS2.

Existe un bucle de retroalimentación positiva entre DKC1 y la señalización canónica de WNT en el cáncer colorrectal

Dado que el subtipo CMS2 del CRC invariablemente muestra la activación de la señalización de WNT^[15], buscamos explorar si los niveles de DKC1 están regulados por la señalización de Wnt/β-catenina. La mayoría de los pacientes con CRC muestran la activación de la señalización de WNT a través de mutaciones inactivadoras en el supresor tumoral APC; por lo tanto, analizamos el conjunto de datos TCGA-COAD y estratificamos a los pacientes en función del estado de mutación de APC y comparamos la expresión de DKC1 junto con otros genes diana de WNT. Curiosamente, la mayoría de los pacientes que albergan mutaciones en APC exhiben una mayor expresión de DKC1 y los genes diana de WNT (Fig. S4g). Además, los pólipos colorrectales de ratones que albergan mutaciones inactivadoras en Apc (Apcmin) mostraron una expresión significativamente alta de Dkc1 en comparación con los tejidos colorrectales normales adyacentes, lo que aumentó progresivamente tras la inducción de la deleción de Apc en los ratones Apc-floxed (Fig. 3c, GSE65461). Se observó una tendencia similar en los pólipos colorrectales de ratones Apc+/Δ716, que mostraron una expresión significativamente mayor de Dkc1 en comparación con los tejidos colorrectales normales derivados de los genotipos Apc+/+ y Apc+/Δ716 (Fig. S4h, GSE89077). Volvimos a analizar los datos de ARN-seq (GSE98496) obtenidos de Apcmin y los ratones tratados con azoximetano/sulfato de dextrano de sodio, que se sabe que inducen una mutación activadora espontánea de Ctnnb1^[41]. Curiosamente, se observó un aumento en la expresión de Dkc1 y los mediadores de la señalización de Wnt en los tejidos de adenoma en comparación con los tejidos no adenoma en ambos grupos, lo que enfatiza el papel de la señalización de WNT en la modulación de DKC1 en el CRC (Fig. S5a).

Para delimitar aún más el control directo de la señalización de WNT sobre la expresión de DKC1, analizamos un conjunto de datos de acceso público (GSE44097) y observamos una reducción significativa en la expresión de DKC1 tras la inhibición de CTNNB1 en células de CRC (Figura S5b). Para confirmar estos hallazgos, se realizó la inhibición de CTNNB1 mediante ARN de interferencia en un panel de líneas celulares de CRC, y se observó una disminución significativa en la expresión de DKC1 (Fig. 3d, e). Además, la estimulación de organoides establecidos a partir de pacientes con CRC, con el ligando canónico de WNT, es decir, WNT3A, condujo a una notable sobreexpresión de DKC1, de forma concomitante con la acumulación nuclear de β-catenina fosforilada, lo que indica una activación robusta de la señalización de WNT/β-catenina (Fig. 3f). Se obtuvieron resultados similares al estimular células inmortalizadas de epitelio del intestino delgado de ratón (MSIE) y células de epitelio colónico de ratón adulto joven (YAMC) ^[42] (Figura S5c). Por el contrario, el tratamiento de células SW620 con un inhibidor de la tanquirasa (XAV939), conocido por alterar la señalización de WNT, redujo notablemente DKC1, lo que destaca la importancia de la señalización de WNT en la regulación de DKC1 (Figura S5d). Para delimitar aún más la maquinaria molecular subyacente que implica la regulación transcripcional mediada por la señalización de WNT de DKC1, examinamos la región promotora/amplificadora ascendente de DKC1 para detectar la presencia de motivos de unión de TCF/LEF utilizando JASPAR ^[43]. Se encontraron varios posibles sitios de unión de TCF7L2 o motivos de unión a la catenina (indicados como CBM1-CBM4) en los promotores proximales y distales de DKC1. Para confirmar la ocupación del complejo β-catenina/TCF, realizamos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)-PCR utilizando un anticuerpo anti-β-catenina. Se observó un enriquecimiento significativo del complejo β-catenina/TCF en los cuatro CBM (Fig. 3g). En concordancia con estos hallazgos, el análisis de los datos de ChIP-seq (GSE31477) reveló un enriquecimiento de la unión de TCF7L2 junto con la ARN polimerasa II en la región promotora de DKC1, lo que indica que la señalización de WNT regula directamente la transcripción de DKC1 (Figura S5e).

Cabe destacar que, previamente, Firestein y colaboradores informaron que DKC1 es uno de los moduladores ascendentes de la actividad de β-catenina; sin embargo, nuestros hallazgos muestran que DKC1 es el objetivo descendente de la señalización de WNT/β-catenina. Basándonos en estos hallazgos, continuamos investigando si existe un bucle de retroalimentación positiva entre los efectores de la señalización de WNT y DKC1. En particular, tras la inhibición de DKC1, observamos una reducción significativa en la expresión de los efectores descendentes de la señalización canónica de WNT, como la β-catenina y TCF7L2 (Figura S5f, g). En conjunto, nuestros hallazgos muestran un control directo de la señalización canónica de WNT en la regulación transcripcional de DKC1 y un bucle de retroalimentación entre DKC1 y la señalización canónica de WNT en el CRC (Fig. 3h).

DKC1 altera la biosíntesis de esfingolípidos en el cáncer colorrectal

Se sabe que la desregulación de los lípidos es una vulnerabilidad metabólica susceptible de ser abordada en el CRC, y se utilizan lípidos específicos como biomarcadores diagnósticos y pronósticos no invasivos ^[44]. El análisis GSEA de nuestros datos de transcriptómica reveló una disminución de los procesos biológicos, como la biosíntesis de esfingolípidos en las células con DKC1 silenciado, lo que indica la participación de DKC1 en el metabolismo de los esfingolípidos (Fig. 4a y Figura S6a). Por lo tanto, realizamos un perfil lipídico de las células con DKC1 silenciado y las células de control utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). El análisis de componentes principales reveló dos grupos distintos, lo que destaca el distinto lipidoma de las células con DKC1 silenciado en comparación con las células de control (Figura S6b). Curiosamente, el perfil lipídico diferencial reveló una disminución de varios ceramidas y esfingosina, mientras que se observó una sobreexpresión concurrente de varios fosfolípidos y esfingomielinas en las células con DKC1 silenciado (FDR ≤ 0,05) (Fig. 4b y Datos suplementarios 6a). A continuación, buscamos identificar los lípidos más significativamente desregulados, y se encontró que varias especies de fosfolípidos, incluidos las fosfatidilcolinas, las fosfatidiletanolaminas y varias isoformas de plasmalógenos, estaban sobreexpresadas, mientras que varias especies de ceramidas, incluidas Gb3(d18:1/16:0), HexCer(d18:1/16:0) y Hex2Cer(d18:1/24:1), estaban disminuidas (puntuación VIP > 1) (Fig. 4c y Datos suplementarios 6b). Además, el análisis de la red de ontología lipídica (LION) reveló una disminución marcada de las ontologías relacionadas con el metabolismo de los esfingolípidos tras la inhibición de DKC1, mientras que las ontologías asociadas a los glicerofosfolípidos se sobreexpresaron (Figura S6c y Datos suplementarios 6c). Estos hallazgos destacan un papel fundamental de DKC1 en la modulación de las vías metabólicas de los ácidos grasos, lo que podría impulsar la progresión del CRC.

DKC1 alto define un subtipo de pacientes con CRC enriquecido en ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga

Basándonos en nuestros datos de lipidómica basados en líneas celulares, a continuación, buscamos determinar la desregulación lipídica mediada por DKC1 en los especímenes de pacientes con CRC. Con este fin, se examinaron los niveles de DKC1 utilizando los especímenes tumorales y los tejidos normales adyacentes pareados (N = 9), clasificándolos como tumores con DKC1 alto o bajo (Figura S6d), seguido de análisis del lipidoma como se describe en otra parte. El perfil lipídico reveló niveles elevados de ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga en pacientes con niveles más altos de DKC1, junto con niveles bajos de esfingomielinas (FDR ≤ 0,05) (Fig. 4d y Datos suplementarios 7a). Previamente, se ha demostrado que estas firmas de ácidos grasos confieren propiedades oncogénicas y se utilizan como biomarcadores clínicos ^[26]. Identificamos ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga, Cer(d18:2/23:0) y Cer(d18:1/24:0), como algunas de las variables más importantes en el perfil lipídico diferencial, en el que ambas ceramidas tenían puntuaciones VIP de > 1,7, lo que destaca su importancia en el diagnóstico y el pronóstico de los casos con DKC1 alto (Fig. 4e y Datos suplementarios 7b). Además, el análisis de la red de ontología lipídica reveló una sobreexpresión de las ontologías relacionadas con la esfingosina y las ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga y una disminución de las ontologías relacionadas con la esfingomielina en los tumores con DKC1 alto (Fig. 4f y Datos suplementarios 7c). A continuación, examinamos si las ceramidas identificadas podrían utilizarse como posibles biomarcadores en el CRC, y se encontró que la abundancia de las mismas estaba presente en los tumores con DKC1 elevado (Fig. 4g). Es importante destacar que ambas ceramidas muestran una alta sensibilidad y especificidad con un área bajo la curva ROC (AUROC) de > 0,9 (Figura S6e). Para confirmar aún más esto, se realizó una evaluación del modelo basada en la curva ROC utilizando el módulo de análisis de biomarcadores de Metaboanalyst 5.0 utilizando el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) para la evaluación del rendimiento. Al evaluar la sensibilidad y la especificidad de ambas ceramidas juntas, exhiben una curva AUROC de 0,855, lo que refuerza su utilidad como biomarcadores no invasivos basados en lípidos para el diagnóstico de pacientes con CRC con DKC1 positivo (Figura S6f).

Basándonos en nuestros hallazgos, en los que las ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga estaban enriquecidas en los tejidos tumorales, a continuación, investigamos si estos niveles elevados de ceramida también podrían detectarse en la sangre periférica de los pacientes con CRC con DKC1 alto en relación con los controles sanos, evaluando así su posible utilidad como biomarcador no invasivo para la carga de la enfermedad y la estratificación pronóstica. Por lo tanto, establecimos un ensayo inmunoenzimático competitivo (ELISA) para la medición cuantitativa de C24 Ceramide en muestras de suero humano. Curiosamente, encontramos niveles significativamente elevados de C24 Ceramide en las muestras de suero de pacientes con CRC con DKC1 positivo (N = 5) en comparación con los individuos sanos (N = 5) (Fig. 4h y Datos suplementarios 7d), lo que indica la importancia de C24 Ceramide como un prometedor biomarcador diagnóstico no invasivo para pacientes con CRC con DKC1 positivo. En conjunto, nuestros hallazgos subrayan un papel crucial de DKC1 en la regulación del metabolismo de los esfingolípidos, específicamente en la modulación de las ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga, que pueden servir como un biomarcador clínicamente relevante para el CRC.

DKC1 activa SGPP2, lo que confiere características oncogénicas en el cáncer colorrectal

Hasta ahora, hemos demostrado que DKC1 exhibe propiedades oncogénicas en el CRC al aumentar la señalización canónica de WNT y desregular el metabolismo de los esfingolípidos, lo que da como resultado la acumulación de ceramidas de cadena muy larga. Sin embargo, es necesario explorar el mecanismo molecular subyacente que implica la sobreexpresión de los niveles de ceramida. Para investigar la importancia del metabolismo lipídico alterado en el contexto de la carcinogénesis mediada por DKC1, realizamos un análisis de vías integrativo utilizando los datos de transcriptómica y el perfil lipídico de las células con DKC1 silenciado y las células de control. En línea con nuestros datos de lipidómica de pacientes, se observó que el metabolismo de los esfingolípidos era la vía más afectada con una alta puntuación de impacto (Figura S7a). Además, se observaron varios resultados metabólicos, como la esfingosina, la lactosilceramida, la digalactosilceramida y la esfingomielina, en el metabolismo de los esfingolípidos. Es importante destacar que también se observó un único resultado genético, a saber, fosfatasa de esfingosina-1-fosfato 2 (SGPP2), una enzima que participa en el metabolismo de la esfingosina-1-fosfato y un metabolito de esfingolípidos que participa en la regulación de varias funciones celulares (Figura S7b).

Para analizar la interacción regulatoria entre DKC1 y SGPP2 en muestras de pacientes clínicos, comprobamos su expresión en muestras de biopsia de CRC (N = 49) (Datos suplementarios 8). Se observó una fuerte correlación positiva entre los transcritos de DKC1 y SGPP2, y niveles más altos de SGPP2 se asociaron con un aumento en el grado tumoral (Fig. 5a y Fig. S7c). Asimismo, se realizó inmunotinción para la expresión de SGPP2 utilizando matrices de tejidos (TMA), que fueron teñidas para DKC1 (Fig. 1a). Alrededor del ~67% de los pacientes mostraron una expresión alta o media tanto de SGPP2 como de DKC1 (Fig. 5b, c). Además, aproximadamente el 82% de los casos con alta expresión de DKC1 mostraron una expresión alta o media de SGPP2, mientras que los pacientes con baja expresión de DKC1 presentaban una expresión baja o negativa de SGPP2 (Fig. 5d). En concordancia con el papel de DKC1 como regulador transcripcional de SGPP2, su expresión se encontró principalmente en el núcleo, y en menor medida en el citosol. Si bien, debido a la función enzimática de SGPP2, su expresión fue predominantemente citoplasmática. Además, se detectó la expresión de SGPP2 en la mayoría de los tumores de CRC (~91%), con niveles altos observados en aproximadamente el 32% de los casos, moderados en aproximadamente el 47% y bajos en aproximadamente el 12%, mientras que solo aproximadamente el 9% de las muestras mostraron una tinción negativa (Fig. S7d-f). Para validar estos hallazgos, se realizó un análisis de inmunofluorescencia en los mismos tejidos tumorales previamente evaluados para la expresión de DKC1 (Fig. 1f). Como se esperaba, los niveles de SGPP2 estaban marcadamente elevados en los tejidos tumorales en comparación con sus contrapartes normales adyacentes (Fig. 5e, f), lo que enfatiza su posible papel en la patobiología del CRC. Considerando la fuerte asociación entre DKC1 y SGPP2, y su papel pragmático en el metabolismo de los esfingolípidos, examinamos la expresión de SGPP2 en células de CRC con DKC1 silenciado. Se observó una reducción significativa en los niveles de SGPP2 en las células con DKC1 silenciado (Fig. 5g), lo que corrobora nuestros datos del perfil lipídico utilizando muestras de pacientes, en los que se observó una reducción significativa en los niveles de esfingosina y ceramida (Fig. 4f). Previamente, se ha demostrado que DKC1 forma un complejo con SOX2/OCT4 y regula la expresión de NANOG en células madre embrionarias ^[45]. Por lo tanto, hipotetizamos que esta vía de señalización transcripcional también podría regular la expresión de SGPP2. Para examinar esto, se realizó un "pull-down" del inmunocomplejo de DKC1 y se realizó un inmunoblot para la expresión de SOX2, lo que mostró una fuerte interacción con DKC1 (Fig. 5h). Además, se examinó la región reguladora de SGPP2 en busca de sitios de unión de factores de transcripción, y se identificaron dos motivos de unión a SOX2 distintos (SBM1 y SBM2) dentro de una región promotora de 5 kb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (TSS). Para verificar la ocupación del complejo DKC1/SOX2 en el promotor de SGPP2, se realizó ChIP-PCR, y se observó una reducción significativa de la unión de SOX2 en las células con DKC1 silenciado en comparación con las células SW620 de control (Fig. 5i).

Para investigar si SGPP2 tiene un posible papel en la oncogenicidad mediada por DKC1, generamos células SW620 con SGPP2 silenciado de forma estable (Fig. S8a). Tras evaluar el efecto fenotípico, se observó una reducción notable en la proliferación, así como en la capacidad de formación de focos de las células con SGPP2 silenciado en comparación con el control (Fig. 5j, k). Además, para dilucidar si la tumorigenicidad asociada a DKC1 se produce explícitamente a través de SGPP2, realizamos un experimento de rescate, en el que SGPP2 se expresó de forma ectópica en células con DKC1 silenciado (Fig. S8b). Como se esperaba, las propiedades oncogénicas disminuidas tras el silenciamiento de DKC1 se recuperaron tras la sobreexpresión de SGPP2 en las células shDKC1 SW620 (Fig. 5l, m). En conjunto, establecimos que el complejo DKC1-SOX2 impulsa la regulación al alza de la expresión de SGPP2, lo que potencia la tumorigenicidad mediada por DKC1 en el CRC.

DKC1 altera la biosíntesis de esfingolípidos y transactiva la señalización canónica de WNT

Se ha establecido previamente el papel de SGPP2 en la vía de salvamento de la biosíntesis de ceramida, en la que cataliza la desfosforilación de esfingosina-1-fosfato (S1P) a esfingosina, que se convierte en diferentes ceramidas mediante varias ceramidas sintasas (Fig. S8c). Para examinar si la expresión reducida de SGPP2 tras el silenciamiento de DKC1 se debe a la desregulación de la vía de salvamento, detectamos los niveles de S1P en las células SW620 con DKC1 silenciado y en las células de control, y se observó una mayor acumulación de S1P en las células con DKC1 silenciado (Fig. 5n). Se obtuvieron resultados similares en las células con SGPP2 silenciado, que se incluyeron como controles positivos (Fig. S8d). Por el contrario, la reexpresión ectópica de SGPP2 en las células con DKC1 silenciado condujo a una reducción significativa de los niveles de S1P (Fig. S8e). Además, la cuantificación basada en ELISA de la ceramida C24 reveló una disminución significativa de sus niveles en las células con DKC1 silenciado en comparación con los controles (Fig. S8f).

Para demostrar que la conversión de esfingosina a ceramidas aguas abajo del eje DKC1-SGPP2 se produce a través de la vía de salvamento, examinamos la expresión de las principales ceramidas sintasas tras el silenciamiento de SGPP2. Se espera que esta alteración reduzca el flujo de esfingosina como sustrato, lo que provocaría niveles metabólicamente ajustados de ceramidas sintasas ^[46]. En particular, las células de CRC con SGPP2 silenciado mostraron una regulación al alza marcada de CERS1 y CERS4, mientras que el silenciamiento de DKC1 condujo a un aumento significativo de estas enzimas, mientras que el rescate de SGPP2 revirtió este efecto, lo que resultó en una disminución concomitante de los niveles de CERS1 y CERS4 (Fig. S8g), lo que sugiere que la regulación de la ceramida sintasa gobierna la biosíntesis de ceramida aguas abajo del eje DKC1-SGPP2 en el CRC. Cabe destacar que los niveles de CERS2, que normalmente participan en la biogénesis de ceramidas con ácidos grasos de cadena muy larga, no cambiaron significativamente tras la alteración de esta vía ^[47]. Nuestros datos revelan una interacción regulatoria inversa entre las ceramidas con ácidos grasos de cadena muy larga, cadena larga y cadena corta, lo que indica un mecanismo de retroalimentación compensatorio que protege la homeostasis de la ceramida en condiciones de expresión alterada de SGPP2 y DKC1. Estos hallazgos subrayan el papel crucial de DKC1 en la orquestación del metabolismo de la esfingosina mediado por SGPP2 a través de la vía de salvamento de la biosíntesis de ceramida. Cabe destacar que se sabe que las ceramidas generan especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de la actividad mitocondrial alterada ^[48]. Nuestro análisis de la red de ontología lipídica también reveló la acumulación de ceramidas con ácidos grasos de cadena muy larga junto con la acumulación de mitocondrias en los casos con DKC1 alto en comparación con los casos con DKC1 bajo (Fig. 4f). Por lo tanto, para confirmar el efecto aguas abajo de la acumulación de ceramida en la generación de ROS y la actividad mitocondrial, teñimos las células con DKC1 silenciado y las células de control con los colorantes dihidroetidio y MitoTracker, respectivamente, y se observó una reducción significativa de los ROS y la actividad mitocondrial en las células con DKC1 silenciado en comparación con el control (Fig. S8h, i). Estos hallazgos implican la desregulación de la biosíntesis de esfingolípidos tras la alteración de DKC1 en el CRC.

Se ha informado que la pérdida de la función de Apc es uno de los eventos iniciales en la progresión del CRC, aunque esta lesión por sí sola es insuficiente para impulsar la carcinogénesis en ratones [49, 50]. Sin embargo, las vías oncogénicas aguas abajo podrían amplificarse alterando el metabolismo de los esfingolípidos junto con la inactivación de APC, lo que daría como resultado un mayor efecto promotor del tumor ^[51]. Además, se ha informado que las ceramidas con ácidos grasos de cadena muy larga, como la C24, transactivan la señalización de WNT en el CRC a través de Gb3 ^[52], que también se descubrió como uno de los objetivos de DKC1 en nuestros datos de lipidómica (Fig. 4b, c). Por lo tanto, buscamos investigar si la alteración del metabolismo de los esfingolípidos mediante el silenciamiento de SGPP2 puede afectar la señalización de WNT en el CRC. Para investigar esto, examinamos el estado de la señalización canónica de WNT tras el silenciamiento de SGPP2 en las células SW620, y se observó una reducción notable en los niveles de CD44, un indicador directo de la vía de señalización de WNT (Fig. 5o). Para confirmar aún más que el efecto observado opera en el contexto del circuito mecanístico DKC1-SGPP2, verificamos la señalización de WNT en las células de CRC con DKC1 silenciado que expresan SGPP2 de forma ectópica, y se observó un aumento notable en la β-catenina activa y los niveles de CD44 (Fig. 5p-r). En conclusión, nuestros hallazgos sugieren que el DKC1 elevado desregula el metabolismo de los esfingolípidos, lo que puede potenciar la progresión del CRC mediante la transactivación de la señalización canónica de WNT.

DKC1 induce resistencia a las terapias de primera línea en el cáncer colorrectal

Descubrimos un bucle de retroalimentación reguladora positiva entre DKC1 y la señalización de WNT en el cáncer colorrectal, en el que la inhibición farmacológica de la señalización de WNT condujo a una reducción significativa de la expresión de DKC1 (Fig. 3h y Fig. S5d). Basándonos en esto, evaluamos a continuación el impacto del tratamiento con XAV939 en la oncogenicidad impulsada por DKC1, y observamos una reducción modesta en la capacidad de proliferación y formación de focos en las células de CRC con DKC1 positivo (Fig. S9a, b), lo que indica la evidencia de un mecanismo de señalización compensatorio, una característica también común en los pacientes resistentes a la terapia, en particular aquellos que no responden a la terapia de primera línea ^[53].

Cabe destacar que existen pruebas cada vez mayores que relacionan la biosíntesis de colesterol desregulada con la resistencia a la terapia en múltiples neoplasias ^[54]. En línea con esto, el perfilaje transcriptómico de las células de CRC con DKC1 silenciado reveló una regulación a la baja significativa de los genes involucrados en la vía de biosíntesis del colesterol (Fig. 2a). Por lo tanto, hipotetizamos que las células de CRC con alto DKC1 pueden inducir resistencia a las terapias estándar de primera línea. Para examinar esto, realizamos un ensayo de quimiosensibilidad, y se observó una mayor sensibilidad al 5-fluorouracilo (5-FU) en las células con DKC1 silenciado en comparación con el control (Fig. S9c), lo que indica un posible papel de DKC1 en la impartición de resistencia a la quimioterapia. Además, también generamos modelos de CRC resistentes a la quimioterapia, en los que las células HCT116 se trataron con 5-FU solo o en combinación con irinotecán (IR) y oxaliplatino (Ox), lo que recapitula los regímenes de tratamiento FOLFIRI y FOLFOX, respectivamente (Fig. S9d). Los valores de CI50 para cada condición de tratamiento confirmaron el nivel deseado de resistencia a la quimioterapia (Fig. S9e). Interesantemente, un panel de células de CRC resistentes a la quimioterapia derivadas de HCT116 mostró una mayor expresión de DKC1 en comparación con el control, con los niveles más altos observados en las células resistentes a 5-FU y Ox (5-FU+Ox) (Fig. S9f).

Para establecer el papel de DKC1 en la mediación de la resistencia a la quimioterapia, generamos células HCT116-(5-FU+Ox)R con DKC1 silenciado de forma estable, y el silenciamiento se confirmó tanto a nivel de transcrito como de proteína (Fig. S9g). Se observó una reducción marcada en la tasa de proliferación de las células con DKC1 silenciado en comparación con el control (Fig. S9h). Además, el ensayo de quimiosensibilidad reveló una reducción notable en la viabilidad celular en las células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R en comparación con los controles tras el tratamiento con 5-fluorouracilo y oxaliplatino, tanto con fármacos individuales como en combinación (Fig. S9i). A continuación, investigamos el papel de DKC1 en la promoción de la resistencia a los fármacos utilizando un modelo de ratón preclínico, e implantamos células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R y shSCRAM-HCT116-(5-FU+Ox)R subcutáneamente en ratones NOD/SCID, seguido de la administración del tratamiento FOLFOX. En particular, si bien el tratamiento FOLFOX fue ineficaz en las células resistentes a la quimioterapia, se observó una reducción notable en la carga tumoral en las células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R en comparación con los controles (Fig. 6a, b). El análisis inmunohistoquímico de los tumores resecados confirmó la disminución de los niveles de DKC1 y SGPP2 solo en las células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R, sin cambios significativos en sus niveles tras el tratamiento con FOLFOX (Fig. 6c y Fig. S9j). Además, se observó una reducción del tinte nuclear de Ki67 y niveles altos de Caspasa-3, un marcador de apoptosis, en las células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R (Fig. 6c).

A continuación, evaluamos los niveles de C24 Ceramida en tumores resecados y observamos una reducción exclusiva en el grupo con DKC1 silenciado, sin cambios significativos después del tratamiento con FOLFOX (Figura suplementaria 9k). Esto refuerza la idea de que la inhibición del eje de señalización DKC1–SGPP2–ceramida sensibiliza a las células de CRC a la terapia con FOLFOX. En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan evidencia convincente de que DKC1 es un mediador clave de la resistencia a la quimioterapia de primera línea en CRC.

La inhibición dual de DKC1 y la señalización de WNT atenúa la tumorigenicidad y la quimiorresistencia en el cáncer colorrectal

Tras establecer el papel dependiente de WNT de DKC1 en la promoción de la tumorigenesis de CRC y la resistencia a la terapia a través de la desregulación de la biosíntesis de esfingolípidos, buscamos identificar estrategias farmacológicas para interrumpir este circuito oncogénico y superar la refractariedad al tratamiento. Si bien estudios previos mostraron que la inhibición de WNT por sí sola produce solo una inhibición modesta de las propiedades oncogénicas, hipotetizamos que la inhibición de la señalización de WNT de forma aislada puede ser insuficiente, ya que DKC1 podría reiniciar la transactivación de la vía. En contraste, se anticipó que la inhibición concurrente de DKC1 y la señalización de WNT aboliera el bucle de retroalimentación compensatoria. Para probar esto, evaluamos la eficacia terapéutica de la inhibición dual en modelos de CRC quimiorresistentes. En consecuencia, observamos que la inhibición de la señalización de WNT por sí sola ejerció solo un efecto marginal sobre la viabilidad de las células de CRC quimiorresistentes, mientras que la inhibición de DKC1 utilizando pirazofurina provocó una respuesta más pronunciada en las células quimiorresistentes en relación con sus contrapartes sensibles. En particular, la inhibición farmacológica combinada de DKC1 y la señalización de WNT condujo a una reducción sustancial de la viabilidad celular en los modelos quimiorresistentes en comparación con los controles parentales (Figura suplementaria 10a), lo que destaca el potencial sinérgico de las estrategias de inhibición dual para superar la resistencia terapéutica.

Para validar estos hallazgos en modelos de ratones preclínicos, evaluamos la eficacia terapéutica de la inhibición de un solo agente frente a la inhibición combinada de DKC1 y la señalización de WNT en ratones xenoinjertados con células HCT116-(5-FU + Ox)R. En particular, el tratamiento de inhibición dual provocó una reducción significativamente mayor del volumen tumoral en comparación con la monoterapia o los controles con vehículo (Figura 6d, e). Además, se confirmó la reducción de la expresión de DKC1 en los tumores extirpados después de la administración del fármaco (Figura suplementaria 10b). Es importante destacar que no se observó toxicidad evidente en las dosis administradas, como lo demuestra el peso corporal estable de los ratones durante el período de tratamiento y los perfiles bioquímicos sanguíneos inalterados al finalizar el estudio (Figura suplementaria 10c, d).

Para explorar la relevancia traslacional de la inhibición dual del eje DKC1–WNT en el CRC resistente a la terapia, establecimos organoides derivados de pacientes a partir de casos de CRC con alta expresión de DKC1/SGPP2 que no habían respondido a los regímenes de quimioterapia de primera línea (Figura 6f y Figura suplementaria 10e). Estos organoides derivados de pacientes se sometieron a concentraciones graduadas de cuatro regímenes de tratamiento: 5-FU solo; 5-FU + pirazofurina; 5-FU + XAV939; 5-FU + pirazofurina + XAV939. Como se esperaba, estos organoides exhibieron una mayor sensibilidad a 5-FU + pirazofurina y 5-FU + XAV939 en comparación con el tratamiento con 5-FU solo (Figura suplementaria 10f). Además, el tratamiento combinado (5-FU + pirazofurina + XAV939) mostró una notable reducción de la viabilidad tumoral, y se observó un efecto sinérgico en torno a una concentración de fármaco de 1 μM (Figura 6g y Figura suplementaria 10g). En conjunto, nuestros hallazgos revelan un papel fundamental de DKC1 en la inducción de la resistencia a la terapia en CRC y ofrecen una prometedora estrategia combinada, dirigida a DKC1 y la señalización de WNT, como una intervención terapéutica eficaz para superar la resistencia en pacientes con CRC.

Los altos niveles de DKC1 se asocian con un mal pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal

DKC1 es un componente esencial del complejo de la telomerasa que se sabe que se expresa en gran medida en múltiples tipos de cáncer^[21],^[22]. Por lo tanto, para examinar la expresión de DKC1 en CRC, realizamos una tinción inmunohistoquímica de microarreglos de tejidos (TMA) que comprendían muestras de pacientes con CRC (N = 75) y se observó una alta expresión en aproximadamente el 31% de los tumores primarios en todas las etapas y grados, mientras que se observó una intensidad media en aproximadamente el 45% de los casos y solo el 24% exhibió una baja expresión de DKC1 (Figura 1a–c). También analizamos el conjunto de datos de RNA-seq disponible públicamente para los pacientes con CRC de etnia coreana (GSE6988), y se observó una mayor expresión de DKC1 en los tumores primarios en comparación con los tejidos normales (Figura 1d). Se observó una tendencia similar en las muestras (N = 13) derivadas de pacientes con CRC de India (Figura 1e, Figura suplementaria 1a y Datos suplementarios 1a). Para fortalecer aún más nuestros hallazgos, se realizó una tinción inmunofluorescente para DKC1 en tejidos tumorales (N = 6) y normales (N = 5) adicionales derivados de pacientes con CRC de India, y, como se esperaba, se observó una mayor expresión de DKC1 en los tumores (Figura 1f, g, Figura suplementaria 1b y Datos suplementarios 1b).

A continuación, preguntamos si DKC1 califica como un objetivo terapéutico en CRC y analizamos el conjunto de datos de RNA-seq de pán-cáncer disponible públicamente (GDC-PANCAN). Se observaron niveles más altos de DKC1 específicamente en las muestras de CRC en comparación con los tejidos sólidos normales de diferentes órganos, lo que proyecta a DKC1 como un posible objetivo farmacológico con efectos secundarios mínimos (Figura suplementaria 1c). Anteriormente, una pantalla de shRNA enriquecida en quinasas en líneas celulares de CRC identificó a DKC1, junto con nueve genes clave, como reguladores de la actividad transcripcional mediada por β-catenina y la proliferación celular^[34]. En línea con esto, reanalizamos los perfiles de expresión génica de estos genes en el conjunto de datos TCGA-Colorectal Adenocarcinoma (TCGA-COADREAD) disponible públicamente y observamos que DKC1 exhibió la expresión más alta en los tumores primarios, lo que destaca su importancia como un mediador crítico en la patogénesis de CRC (Figura suplementaria 1d). Para evaluar la expresión de DKC1 en tumores con diferentes antecedentes mutacionales, categorizamos a los pacientes con CRC en función de las mutaciones de KRAS y BRAF (GSE2138 y TCGA COADREAD). En particular, se observó una alta expresión de DKC1 independientemente del estado mutacional, lo que enfatiza el potencial de DKC1 como un posible objetivo terapéutico en un espectro más amplio de pacientes con CRC (Figura suplementaria 1e). Para determinar si DKC1 tiene relevancia clínica, realizamos un análisis de supervivencia utilizando el conjunto de datos TCGA-COAD para generar una curva de Kaplan-Meier, y se observó una mala supervivencia libre de recurrencia para los pacientes con mayor expresión de DKC1 (Figura 1h). A continuación, para explorar las vías de señalización posteriores reguladas por DKC1, realizamos un análisis exhaustivo utilizando múltiples conjuntos de datos de CRC disponibles públicamente que comprenden 1538 pacientes, categorizados en función de la expresión de DKC1 de alta a baja, y se examinó la variabilidad intergrupal entre los cuartiles primero y cuarto de estos pacientes (N = 770). En particular, se descubrió que 265 genes estaban significativamente sobreexpresados y 51 genes exhibían una baja expresión en el grupo DKC1-alto (Figura suplementaria 1f y Datos suplementarios 2a, b), estableciendo así una asociación positiva de estos genes sobreexpresados con el grupo DKC1-alto (Figura suplementaria 1g). Para identificar las vías biológicas asociadas con DKC1, se realizó un análisis de enriquecimiento de genes y se observó un enriquecimiento de los procesos relacionados con la patogénesis del cáncer, como la regulación del ciclo celular y la proliferación, etc. (Figura 1i y Datos suplementarios 2c, d). En conjunto, estos hallazgos indican que la alta expresión de DKC1 se asocia con un mal pronóstico en CRC independientemente de los antecedentes mutacionales de KRAS o BRAF y la etnia del paciente.

DKC1 induce propiedades oncogénicas y promueve la progresión del cáncer colorrectal

Para comprender la importancia funcional de DKC1 en CRC, examinamos la expresión de los genes asociados a DKC1 en líneas celulares cancerosas (Datos suplementarios 2a), donde SW620 y HT-29 (WiDr) mostraron una mayor expresión de estos genes (Figura suplementaria 2a). Asimismo, se examinó el perfil del transcriptoma de las líneas celulares de CRC obtenidas de la enciclopedia de líneas celulares cancerosas (CCLE) y las células SW620 mostraron la expresión más alta de DKC1, seguida de las células Colo320HSR y WiDr (Figura suplementaria 2b).

Por lo tanto, para los estudios de pérdida de función, realizamos una silenciamiento estable mediado por shRNA lentiviral de DKC1 en las líneas celulares SW620, Colo320HSR y WiDr, y el silenciamiento se confirmó a nivel de transcrito y proteína (Figura suplementaria 2c). Dado que se sabe que DKC1 regula la traducción de ARN ribosómico mediada por IRES al desregular la biogénesis de los ribosomas y la actividad de pseudouridilación^[35], buscamos confirmar las implicaciones funcionales de la supresión de la actividad de DKC1 mediante el empleo de un ensayo de etiquetado de química de clic basado en la fluorescencia L-homopropargilglicina (HPG), utilizando un análogo de la metionina para visualizar y cuantificar directamente la síntesis de proteínas nacientes en las células isogénicas SW620 con DKC1 silenciado (shDKC1-2 y shDKC1-3) en comparación con los controles. En particular, el silenciamiento de DKC1 alteró notablemente la síntesis de proteínas nacientes, como lo demuestra una reducción pronunciada en la intensidad de la fluorescencia verde (Figura suplementaria 2d).

Debido al papel multifacético de DKC1 y su función relativamente poco explorada en la patogénesis de CRC, realizamos a continuación un perfil del transcriptoma de las células SW620 silenciadas con DKC1 (shDKC1-2 y shDKC1-3) y el control de revierte (shSCRM) (Figura suplementaria 2e y Datos suplementarios 3a, b). El análisis de enriquecimiento de vías utilizando la base de datos para la anotación, visualización y descubrimiento integrados (DAVID) reveló diferentes procesos biológicos relacionados con el cáncer, notablemente, los procesos relacionados con la biosíntesis de esteroles y colesterol se redujeron significativamente (Figura 2a y Datos suplementarios 3c, d).

Para dilucidar la relevancia funcional de DKC1 en el cáncer colorrectal, realizamos ensayos de proliferación celular, que revelaron una notable disminución del crecimiento de las células de CRC tras el silenciamiento de DKC1, lo que destaca su papel fundamental en el mantenimiento de la proliferación de las células tumorales (Figura 2b y Figura suplementaria 2f). Además, se observó una notable reducción en la capacidad de formación de focos de las células de CRC silenciadas con DKC1 (Figura 2c y Figura suplementaria 2g). A continuación, para examinar la capacidad de autorrenovación de estas células, se realizó un ensayo de esferoides tumorales y se observó una reducción significativa en la eficiencia de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de la capacidad de formación de esferoides y el área de superficie de los esferoides en las células silenciadas con DKC1 en comparación con el control (Figura 2d). También observamos una reducción de

Anteriormente, se demostró que DKC1 aumenta la actividad de la telomerasa y la integridad genómica^[20],^[36]. Además, la respuesta al daño del ADN (DDR) y las vías de control del ciclo celular a menudo conducen a la detención del ciclo celular^[37]; por lo tanto, buscamos explorar si el silenciamiento de DKC1 puede inducir daño en el ADN. Para ello, examinamos la expresión de los genes DDR y se observó una disminución significativa tras el silenciamiento de DKC1 (Figura suplementaria 3a). A continuación, comprobamos la fosforilación de la proteína H2AX, γH2AX, un marcador altamente específico de las roturas de doble cadena del ADN, y se observó un aumento de γH2AX tras la inhibición de DKC1 (Figura suplementaria 3b-d).

Para establecer el papel de DKC1 en la tumorigénesis del CCRC, implantamos subcutáneamente células SW620-shSCRM y SW620-shDKC1 estables en ratones NOD/SCID y monitoreamos el crecimiento tumoral. Se observó una reducción notable (~81%) en la carga tumoral en los ratones implantados con células SW620-shDKC1 en comparación con el control (Fig. 2h, i). Además, se observó una disminución significativa en la abundancia de núcleos Ki67-positivos, un marcador de células en división activa, en los tumores extirpados del grupo con DKC1 silenciado (Fig. 2j). Para delimitar aún más el papel dependiente del contexto de DKC1 en el CCRC, empleamos un sistema lentiviral shDKC1 inducible con doxiciclina (dox), lo que permite un control temporal preciso del silenciamiento génico en las células cancerosas. Este enfoque nos permitió separar los efectos de la supresión de DKC1 sobre la progresión tumoral in vivo de sus funciones de iniciación tumoral y proliferación, observadas in vitro. Para ello, primero se confirmó la inducción temporal mediada por dox de la actividad de shDKC1 a nivel de transcrito y proteína en células SW620isogénicas inducibles con dox (Figura suplementaria 3e, f), y se observó una reducción significativa en la tasa de proliferación de las células shDKC1_ tras la inducción con dox en comparación con los controles (Figura suplementaria 3g).

Además, se implantaron subcutáneamente células SW620-shSCRM y shDKC1 inducibles con dox en ratones nude atímicos para establecer xenoinjertos tumorales. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño palpable (~40-50 mm3), se administró dox para inducir el silenciamiento de DKC1. Como se esperaba, se observó una reducción significativa en el volumen tumoral (~78%) en el grupo Dox + shDKC1 en comparación con los controles (Fig. 2k, l). Además, se observó una disminución significativa en la abundancia de niveles de DKC1 y núcleos Ki67-positivos en los tumores extirpados del grupo Dox + shDKC1 en comparación con los controles (Fig. 2m y Figura suplementaria 3h), sin cambios notables en el peso corporal de los ratones durante el curso del tratamiento (Figura suplementaria 3i). En conjunto, demostramos que el DKC1 elevado en el CCRC promueve el crecimiento, el mantenimiento y la progresión del tumor al modular la regulación del ciclo celular y las vías de supervivencia celular.

El cáncer colorrectal positivo para DKC1 se asocia con el subtipo molecular de consenso 2

Teniendo en cuenta la naturaleza altamente heterogénea del CCRC, buscamos examinar si la expresión elevada de DKC1 está relacionada con una firma o subtipo molecular definido. El sistema de clasificación ampliamente aceptado para el CCRC es el de los subtipos moleculares de consenso (CMS); por lo tanto, empleamos las firmas génicas para diferentes clases de CMS como CMS-UP o -DOWN (Datos suplementarios 4) y las analizamos en relación con el conjunto de datos combinado de pacientes con CCRC (N= 770) categorizados en grupos DKC1-alto y -bajo. El análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) mostró una sobreexpresión de la firma génica 'CMS2 UP' en los pacientes DKC1-alto, mientras que se observó una subexpresión en los pacientes DKC1-bajo (Figura suplementaria 4a). Además, utilizamos ColoType, una firma de 40 genes para definir la clase CMS basada en los datos del transcriptoma global^[38], y encontramos una asociación similar con la firma génica 'CMS2 UP' (Figura suplementaria 4b). Posteriormente, para validar estos hallazgos, examinamos los datos de ARN de secuencia única disponibles públicamente para células individuales no clasificadas (N= 91.103) de dos cohortes de pacientes con CCRC de diferentes etnias, belga y coreana, respectivamente (GSE144735 y GSE132465)^[39], y evaluamos la expresión promedio y el porcentaje de células que expresan DKC1 en diferentes subtipos CMS. Se encontró un mayor porcentaje de células que se alinean con la subclase CMS2 y una expresión media relativamente alta de DKC1 en comparación con otras subclases en ambas cohortes (Figura suplementaria 4c, d). Para fortalecer aún más nuestros hallazgos, realizamos un metaanálisis de conjuntos de datos de ARN de secuencia única de tres estudios independientes (GSE132465, GSE144735 y GSE200997) y aplicamos un enfoque pseudo-bulk con modelado de expresión diferencial basado en DESeq2 bajo un marco de efectos aleatorios. En particular, DKC1 surgió como significativamente sobreexpresado en el subtipo CMS2 en comparación con CMS1, CMS3 y CMS4, lo que refuerza su relevancia específica para el subtipo en el cáncer colorrectal (Figura suplementaria 4e).

A continuación, analizamos los datos de recuento de ARN-seq del conjunto de datos TCGA-COADREAD estratificando a los pacientes en cuatro categorías CMS utilizando conjuntos de genes representativos expandidos (~20-25 genes por subtipo) para capturar los procesos biológicos característicos asociados con cada subclase, según se definió previamente^[15]. Los niveles de expresión de los genes CMS2 asociados seleccionados, incluido DKC1, se estandarizaron en todos los muestras. En particular, DKC1 exhibió una expresión distintivamente elevada en la mayoría de los pacientes clasificados bajo el subtipo CMS2, lo que subraya aún más su posible papel en este contexto molecular (Fig. 3a). Para corroborar los hallazgos transcripcionales a gran escala con evidencia a nivel de proteínas, analizamos los perfiles proteómicos de pacientes con CCRC del Consorcio de Análisis Proteómico de Tumores Clínicos (CPTAC). Este análisis reveló una fuerte asociación entre la expresión elevada de la proteína DKC1 y el subtipo molecular CMS2, lo que refuerza aún más su relevancia específica para el subtipo (Fig. 3b). Una fracción notable de células con alta expresión de DKC1 también exhibió un fenotipo similar a células madre/TA (amplificación transitoria), lo que corrobora nuestros resultados, donde se observó una reducción notable en la capacidad de formación de células madre tras el silenciamiento de DKC1 (Fig. 2e). Para validar aún más esto, investigamos la asociación de los genes expresados diferencialmente entre los datos completos de los pacientes (N= 770) categorizados en función de la expresión de DKC1 y la firma génica de tipo celular propuesta en una clasificación anterior del CCRC^[40]. Se observó una notable superposición del 14% entre la firma génica sobreexpresada en las células TA y los genes sobreexpresados en los pacientes DKC1-alto (Figura suplementaria 4f y Datos suplementarios 5), mientras que se observó una superposición notable de aproximadamente el 7% de la firma génica de células madre subregulada con los genes subregulados en los casos DKC1-alto, lo que indica una asociación de los pacientes positivos para DKC1 con el fenotipo TA/células madre y el subtipo molecular CMS2.

Existe un bucle de retroalimentación positiva entre DKC1 y la señalización canónica de WNT en el cáncer colorrectal

Dado que el subtipo CMS2 del CCRC invariablemente muestra activación de la señalización de WNT^[15], buscamos explorar si los niveles de DKC1 están regulados por la señalización de Wnt/β-catenina. La mayoría de los pacientes con CCRC muestran activación de la señalización de WNT a través de mutaciones inactivadoras en el supresor tumoral APC; por lo tanto, analizamos el conjunto de datos TCGA-COAD y estratificamos a los pacientes en función del estado de mutación de APC y comparamos la expresión de DKC1 junto con otros genes diana de WNT. Curiosamente, la mayoría de los pacientes que albergan mutaciones en APC exhiben una mayor expresión de DKC1 y los genes diana de WNT (Figura suplementaria 4g). Además, los pólipos colorrectales de ratones que albergan mutaciones inactivadoras en Apc (Apcmin) mostraron una expresión significativamente alta de Dkc1 en comparación con los tejidos colorrectales normales adyacentes, que aumentaron progresivamente tras la inducción de la deleción de Apc en ratones Apc-floxed (Fig. 3c, GSE65461). Se observó una tendencia similar en los pólipos colorrectales de ratones Apc+/Δ716, que mostraron una expresión significativamente mayor de Dkc1 en comparación con los tejidos colorrectales normales derivados de los genotipos Apc+/+ y Apc+/Δ716 (Figura suplementaria 4h, GSE89077). Volvimos a analizar los datos de ARN-seq (GSE98496) obtenidos de Apcmin y los ratones tratados con azoximetano/sulfato de dextrano de sodio, que se sabe que inducen una mutación activadora espontánea de Ctnnb1^[41]. Curiosamente, se observó una mayor expresión de Dkc1 y los mediadores de la señalización de Wnt en los tejidos de adenoma en comparación con los tejidos no adenoma en ambos grupos, lo que enfatiza el papel de la señalización de WNT en la modulación de DKC1 en el CCRC (Figura suplementaria 5a).

Para delimitar aún más el control directo de la señalización de WNT sobre la expresión de DKC1, analizamos un conjunto de datos disponible públicamente (GSE44097) y se observó una reducción significativa en la expresión de DKC1 tras el silenciamiento de CTNNB1 en las células de CCRC (Figura suplementaria 5b). Para confirmar estos hallazgos, se realizó el silenciamiento mediado por siRNA de CTNNB1 en un panel de líneas celulares de CCRC y se observó una disminución significativa en la expresión de DKC1 (Fig. 3d, e). Además, la estimulación de organoides establecidos a partir de pacientes con CCRC con el ligando canónico de WNT, a saber, WNT3A, condujo a una notable sobreexpresión de DKC1, junto con la acumulación nuclear de β-catenina fosforilada, lo que indica una activación robusta de la señalización de WNT/β-catenina (Fig. 3f). Se obtuvieron resultados similares al estimular las células inmortalizadas del epitelio del intestino delgado del ratón (MSIE) y las células del epitelio colónico del ratón adulto joven (YAMC)^[42] (Figura suplementaria 5c). Por el contrario, el tratamiento de las células SW620 con un inhibidor de la tanquirasa (XAV939), que se sabe que altera la señalización de WNT, redujo notablemente DKC1, lo que destaca la importancia de la señalización de WNT en la regulación de DKC1 (Figura suplementaria 5d). Para delimitar aún más la base mecanicista subyacente que implica la regulación transcripcional de DKC1 mediada por la señalización de WNT, examinamos la región promotora/potenciadora ascendente de DKC1 en busca de la presencia de motivos de unión TCF/LEF utilizando JASPAR^[43]. Se encontraron varios posibles sitios de unión TCF7L2 o motivos de unión a la catenina (indicados como CBM1-CBM4) en los promotores proximales y distales de DKC1. Para confirmar la ocupación del complejo β-catenina/TCF, realizamos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)-PCR utilizando el anticuerpo β-catenina. Se observó un enriquecimiento significativo del complejo β-catenina/TCF en los cuatro CBM (Fig. 3g). En conjunto con estos hallazgos, el análisis de los datos de ChIP-seq (GSE31477) reveló un enriquecimiento de la unión de TCF7L2 junto con la ARN polimerasa II en la región promotora de DKC1, lo que indica que la señalización de WNT regula directamente la transcripción de DKC1 (Figura suplementaria 5e).

Cabe destacar que Firestein et al. informaron previamente que DKC1 es uno de los moduladores ascendentes de la actividad de β-catenina; sin embargo, nuestros hallazgos muestran que DKC1 es el objetivo descendente de la señalización de WNT/β-catenina. Teniendo en cuenta estos hallazgos, continuamos para verificar si existe un bucle de retroalimentación positiva entre los efectores de la señalización de WNT y DKC1. En particular, tras el silenciamiento de DKC1, observamos una reducción significativa en la expresión de los efectores descendentes de la señalización canónica de WNT, como β-catenina y TCF7L2 (Figura suplementaria 5f, g). En conjunto, nuestros hallazgos muestran un control directo de la señalización canónica de WNT en la regulación transcripcional de DKC1 y un bucle de retroalimentación entre DKC1 y la señalización canónica de WNT en el CCRC (Fig. 3h).

DKC1 altera la biosíntesis de esfingolípidos en el cáncer colorrectal

La desregulación lipídica se conoce como una vulnerabilidad metabólica susceptible de ser abordada en el CCRC, y se utilizan membranas lipídicas específicas como biomarcadores diagnósticos y pronósticos no invasivos^[44]. El análisis GSEA de nuestros datos de transcriptómica reveló una disminución de los procesos biológicos, como la biosíntesis de esfingolípidos en células silenciadas para DKC1, lo que indica la participación de DKC1 en el metabolismo de los esfingolípidos (Fig. 4a y Fig. S6a). Por lo tanto, realizamos un perfil lipídico de células silenciadas para DKC1 y células de control utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). El análisis de componentes principales reveló dos grupos distintos, lo que destaca el distinto lipioma de las células silenciadas para DKC1 en comparación con las células de control (Fig. S6b). Interesantemente, el perfil lipídico diferencial reveló una disminución de varios ceramidas y esfingosina, mientras que se observó una regulación al alza concurrente de varios fosfolípidos y esfingomielinas en las células silenciadas para DKC1 (FDR ≤ 0,05) (Fig. 4b y Datos suplementarios 6a). A continuación, buscamos identificar las membranas lipídicas más significativamente desreguladas, y se encontró que varias especies de fosfolípidos, incluidos fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas y varias isoformas de plasmalógeno, estaban reguladas al alza, mientras que varias especies de ceramidas, incluidos Gb3(d18:1/16:0), HexCer(d18:1/16:0) y Hex2Cer(d18:1/24:1), estaban reguladas a la baja (puntuación VIP > 1) (Fig. 4c y Datos suplementarios 6b). Además, el análisis de la red de ontología lipídica (LION) reveló una marcada disminución de las ontologías relacionadas con el metabolismo de los esfingolípidos tras el silenciamiento de DKC1, mientras que las ontologías asociadas a los glicerofosfolípidos se regularon a la inversa (Fig. S6c y Datos suplementarios 6c). Estos hallazgos destacan un papel fundamental de DKC1 en la modulación de las vías metabólicas de los ácidos grasos, lo que podría impulsar la progresión del CCRC.

Altos niveles de DKC1 definen un subtipo de pacientes con CCRC enriquecido en ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga

Partiendo de nuestros datos de lipídómica basados en líneas celulares, a continuación, buscamos determinar la desregulación lipídica mediada por DKC1 en muestras de pacientes con CCRC. Para ello, se examinaron los niveles de DKC1 utilizando las muestras de tumor y los tejidos normales adyacentes pareados (N = 9), clasificándolos como tumores con altos o bajos niveles de DKC1 (Fig. S6d), seguido de análisis del lipioma como se describe en otra parte. El perfil lipídico reveló niveles elevados de ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga en pacientes con niveles más altos de DKC1, acompañado de bajos niveles de esfingomielinas (FDR ≤ 0,05) (Fig. 4d y Datos suplementarios 7a). Anteriormente, se ha demostrado que estas firmas de ácidos grasos confieren propiedades oncogénicas y se utilizan como biomarcadores clínicos^[26]. Identificamos ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga, Cer(d18:2/23:0) y Cer(d18:1/24:0), como algunas de las variables más importantes en el perfil lipídico diferencial, en el que ambas ceramidas tenían puntuaciones VIP de > 1,7, lo que destaca su importancia en el diagnóstico y el pronóstico de los casos con altos niveles de DKC1 (Fig. 4e y Datos suplementarios 7b). Además, el análisis de la red de ontología lipídica reveló una regulación al alza de las ontologías relacionadas con la esfingosina y las ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga y una regulación a la baja de las ontologías relacionadas con la esfingomielina en los tumores con altos niveles de DKC1 (Fig. 4f y Datos suplementarios 7c). A continuación, examinamos si las ceramidas identificadas podrían utilizarse como posibles biomarcadores en el CCRC, y se encontró que la abundancia de las mismas estaba presente en los tumores con niveles elevados de DKC1 (Fig. 4g). Es importante destacar que ambas ceramidas muestran una alta sensibilidad y especificidad con un área bajo la curva ROC (AUROC) de > 0,9 (Fig. S6e). Para confirmar aún más esto, se realizó una evaluación del modelo basada en la curva ROC utilizando el módulo de análisis de biomarcadores de Metaboanalyst 5.0 utilizando el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) para la evaluación del rendimiento. Al evaluar la sensibilidad y la especificidad de ambas ceramidas juntas, exhiben una curva AUROC de 0,855, lo que refuerza su utilidad como biomarcadores no invasivos basados en lípidos para el diagnóstico de pacientes con CCRC DKC1-positivo (Fig. S6f).

Basándonos en nuestros hallazgos, en los que las ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga estaban enriquecidas en los tejidos tumorales, a continuación, investigamos si estos niveles elevados de ceramidas también podrían detectarse en la sangre periférica de pacientes con CCRC con altos niveles de DKC1 en relación con los controles sanos, evaluando así su posible utilidad como biomarcador no invasivo para la carga de la enfermedad y la estratificación pronóstica. Por lo tanto, establecimos un ensayo inmunoenzimático competitivo (ELISA) para la medición cuantitativa de la ceramida C24 en muestras de suero humano. Interesantemente, encontramos niveles significativamente elevados de ceramida C24 en las muestras de suero de pacientes con CCRC DKC1-positivo (N = 5) en comparación con individuos sanos (N = 5) (Fig. 4h y Datos suplementarios 7d), lo que indica la importancia de la ceramida C24 como un prometedor biomarcador diagnóstico no invasivo para pacientes con CCRC DKC1-positivo. En conjunto, nuestros hallazgos subrayan un papel crucial de DKC1 en la regulación del metabolismo de los esfingolípidos, específicamente en la modulación de las ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga, que pueden servir como un biomarcador clínicamente relevante para el CCRC.

DKC1 impulsa SGPP2 y confiere características oncogénicas en el cáncer colorrectal

Hasta ahora, hemos demostrado que DKC1 exhibe propiedades oncogénicas en el CCRC al regular al alza la señalización canónica de WNT y desregular el metabolismo de los esfingolípidos, lo que resulta en la acumulación de ceramidas de cadena muy larga. Sin embargo, es necesario explorar el mecanismo molecular subyacente implicado en la regulación al alza de los niveles de ceramida. Para investigar la importancia del metabolismo lipídico alterado en el contexto de la carcinogénesis mediada por DKC1, realizamos un análisis de vías integrativo utilizando los datos de transcriptómica y perfil lipídico de células silenciadas para DKC1 y células de control. En línea con nuestros datos de lipídómica de pacientes, se observó que el metabolismo de los esfingolípidos era la vía más significativamente afectada con una alta puntuación de impacto (Fig. S7a). Además, se observaron varios puntos metabólicos, como esfingosina, lactosilceramida, digalactosilceramida y esfingomielina, en el metabolismo de los esfingolípidos. Es importante destacar que también se observó un único punto genético, a saber, fosfatasa de esfingosina-1-fosfato 2 (SGPP2), una enzima que participa en el metabolismo del esfingosina-1-fosfato y un metabolito de esfingolípido implicado en la regulación de diversas funciones celulares (Fig. S7b).

Para examinar la interacción regulatoria entre DKC1 y SGPP2 en muestras de pacientes clínicos, verificamos su expresión en muestras de biopsia de CCRC (N = 49) (Datos suplementarios 8). Se observó una fuerte correlación positiva entre los transcritos de DKC1 y SGPP2, y los niveles más altos de SGPP2 se asociaron con un aumento del grado tumoral (Fig. 5a y Fig. S7c). Del mismo modo, se realizó inmunotinción para la expresión de SGPP2 utilizando matrices de tejidos tumorales (TMA), que se tiñeron para DKC1 (Fig. 1a). Alrededor del ~67% de los pacientes mostraron una expresión alta o media tanto de SGPP2 como de DKC1 (Fig. 5b, c). Además, aproximadamente el 82% de los casos con altos niveles de DKC1 mostraron una expresión alta o media de SGPP2, mientras que los pacientes con baja expresión de DKC1 albergaron una expresión baja o negativa de SGPP2 (Fig. 5d). En concordancia con el papel de DKC1 como regulador transcripcional de SGPP2, su expresión se encontró principalmente en el núcleo y, en cierta medida, en el citosol. Sin embargo, debido a la función enzimática de SGPP2, su expresión fue predominantemente citoplásmica. Además, se detectó la expresión de SGPP2 en la mayoría de los tumores de CCRC (~91%), con niveles altos observados en ~32% de los casos, moderados en ~47% y bajos en ~12%, mientras que solo ~9% de las muestras exhibieron una tinción negativa (Fig. S7d-f). Para validar estos hallazgos, se realizó un análisis de inmunofluorescencia en los mismos tejidos tumorales evaluados previamente para la expresión de DKC1 (Fig. 1f). Como se esperaba, los niveles de SGPP2 estaban marcadamente elevados en los tejidos tumorales en comparación con sus contrapartes normales adyacentes (Fig. 5e, f), lo que destaca su posible papel en la patobiología del CCRC. Considerando la fuerte asociación entre DKC1 y SGPP2, y su papel pragmático en el metabolismo de los esfingolípidos, examinamos la expresión de SGPP2 en las células de CCRC silenciadas para DKC1. Se observó una reducción significativa de los niveles de SGPP2 en las células silenciadas para DKC1 (Fig. 5g), lo que corrobora nuestros datos de perfil lipídico utilizando muestras de pacientes, en los que se observó una reducción significativa de los niveles de esfingosina y ceramida (Fig. 4f). Anteriormente, se ha demostrado que DKC1 forma un complejo con SOX2/OCT4 y regula la expresión de NANOG en células madre embrionarias^[45]. Por lo tanto, conjeturamos que esta vía de transducción de señales también podría regular la expresión de SGPP2. Para examinar esto, se realizó un inmunoprecipitado del complejo DKC1 y se realizó un inmunoblot para la expresión de SOX2, lo que mostró una fuerte interacción con DKC1 (Fig. 5h). Además, se examinó la región reguladora de SGPP2 en busca de sitios de unión de factores de transcripción, y se identificaron dos motivos de unión a SOX2 distintos (SBM1 y SBM2) dentro de una región promotora de 5 kb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (TSS). Para verificar la ocupación del complejo DKC1/SOX2 en el promotor de SGPP2, se realizó una PCR-ChIP, y se observó una reducción significativa de la unión de SOX2 en las células silenciadas para DKC1 en comparación con las células SW620 de control (Fig. 5i).

Para investigar si SGPP2 tiene un posible papel en la oncogenicidad mediada por DKC1, generamos células SW620 con silenciamiento estable de SGPP2 (Fig. S8a). Tras evaluar el efecto fenotípico, se observó una notable reducción en la proliferación y la capacidad de formación de focos de las células con silenciamiento de SGPP2 en comparación con el control (Fig. 5j, k). Además, para dilucidar si la tumorigenicidad asociada a DKC1 es explícitamente a través de SGPP2, realizamos un experimento de rescate, en el que se expresó ectópicamente SGPP2 en las células silenciadas para DKC1 (Fig. S8b). Como se esperaba, las propiedades oncogénicas disminuidas tras el silenciamiento de DKC1 se rescataron tras la sobreexpresión de SGPP2 en las células SW620 con shDKC1 (Fig. 5l, m). En conjunto, establecimos que el complejo DKC1-SOX2 impulsa la regulación al alza de la expresión de SGPP2, lo que potencia la tumorigenicidad mediada por DKC1 en el CCRC.

DKC1 impulsa SGPP2 y altera la biosíntesis de esfingolípidos y transactiva la señalización canónica de WNT

Se ha establecido previamente el papel de SGPP2 en la vía de salvamento de la biosíntesis de ceramida, en la que cataliza la desfosforilación del esfingosina-1-fosfato (S1P) a esfingosina, que se convierte en diferentes ceramidas mediante varias ceramidas sintasas (Fig. S8c). Para examinar si la expresión reducida de SGPP2 tras el silenciamiento de DKC1 se debe a la desregulación de la vía de salvamento, detectamos los niveles de S1P en las células silenciadas para DKC1 y las células de control, y se observó una mayor acumulación de S1P en las células silenciadas para DKC1 (Fig. 5n). Se obtuvieron resultados similares en las células silenciadas para SGPP2, incluidas como controles positivos (Fig. S8d). Por el contrario, la reexpresión ectópica de SGPP2 en las células silenciadas para DKC1 condujo a una reducción significativa de los niveles de S1P (Fig. S8e). Además, la cuantificación basada en ELISA de la ceramida C24 reveló una disminución significativa de sus niveles en las células silenciadas para DKC1 en comparación con los controles (Fig. S8f).

Para demostrar que la conversión de esfingosina en ceramidas, aguas abajo del eje DKC1-SGPP2, se produce a través de la vía de salvamento, examinamos la expresión de las principales ceramidas sintasas tras la inhibición de SGPP2. Se espera que esta alteración reduzca el flujo de esfingosina como sustrato, lo que provocaría niveles metabólicamente ajustados de las ceramidas sintasas^[46]. Cabe destacar que las células CRC con SGPP2 silenciada mostraron una marcada sobreexpresión de CERS1 y CERS4, mientras que la inhibición de DKC1 condujo a un aumento significativo de estas enzimas, mientras que la recuperación de SGPP2 revirtió este efecto, lo que resultó en una disminución concomitante de los niveles de CERS1 y CERS4 (Figura suplementaria 8g), lo que sugiere que la regulación de la ceramida sintasa controla la biosíntesis de ceramidas aguas abajo del eje DKC1-SGPP2 en CRC. Cabe destacar que los niveles de CERS2, que normalmente participa en la biogénesis de ceramidas con ácidos grasos de cadena muy larga, no cambiaron significativamente al alterar este circuito^[47]. Nuestros datos revelan una interacción regulatoria inversa entre las ceramidas de cadena muy larga, cadena larga y cadena corta, lo que indica un mecanismo de retroalimentación compensatoria que protege la homeostasis de las ceramidas en condiciones de expresión alterada de SGPP2 y DKC1. Estos hallazgos subrayan el papel crucial de DKC1 en la orquestación del metabolismo de la esfingosina mediado por SGPP2 a través de la vía de salvamento de la biosíntesis de ceramidas. Cabe destacar que se sabe que las ceramidas generan especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de una actividad mitocondrial alterada^[48]. Nuestro análisis de la red de ontología lipídica también reveló la acumulación de ceramidas de cadena muy larga junto con una mitocondria enriquecida en DKC1-alto en comparación con los casos de bajo nivel (Figura 4f). Por lo tanto, para confirmar el efecto aguas abajo de la acumulación de ceramidas sobre la generación de ROS y la actividad mitocondrial, teñimos las células DKC1-silenciadas y las células de control con dihidroetidio y colorantes MitoTracker, respectivamente, y se observó una reducción significativa de los ROS y la actividad mitocondrial en las células con DKC1 silenciado en comparación con el control (Figura suplementaria 8h, i). Estos hallazgos implican la desregulación de la biosíntesis de esfingolípidos tras la alteración de DKC1 en CRC.

Se ha informado que la pérdida de la función de Apc es uno de los primeros eventos en la progresión del CRC, aunque esta lesión por sí sola es insuficiente para impulsar la carcinogénesis en ratones^[49],^[50]. Sin embargo, las vías oncogénicas aguas abajo podrían amplificarse alterando el metabolismo de los esfingolípidos junto con la inactivación de APC, lo que daría como resultado un mayor efecto promotor del tumor^[51]. Además, se ha informado que las ceramidas de cadena muy larga, como la C24, transactivan la señalización de WNT en CRC a través de Gb3^[52], que también se descubrió como uno de los objetivos de DKC1 en nuestros datos de lipidómica (Figura 4b, c). Por lo tanto, buscamos investigar si la alteración del metabolismo de los esfingolípidos mediante el silenciamiento de SGPP2 puede afectar la señalización de WNT en CRC. Para investigar esto, examinamos el estado de la señalización canónica de WNT tras la inhibición de SGPP2 en las células SW620, y se observó una notable reducción de los niveles de CD44, un indicador directo de la vía de señalización de WNT (Figura 5o). Para confirmar aún más que el efecto observado opera en el contexto del circuito mecanístico DKC1-SGPP2, verificamos la señalización de WNT en las células CRC con DKC1 silenciado que expresan ectópicamente SGPP2, y se observó un aumento notable en la β-catenina activa y los niveles de CD44 (Figura 5p-r). En conclusión, nuestros hallazgos sugieren que el DKC1 elevado desregula el metabolismo de los esfingolípidos, lo que puede potenciar la progresión del CRC mediante la transactivación de la señalización canónica de WNT.

DKC1 induce quimiorresistencia a las terapias de primera línea en el cáncer colorrectal

Descubrimos un bucle de retroalimentación regulatoria positiva entre DKC1 y la señalización de WNT en el cáncer colorrectal, en el que la inhibición farmacológica de la señalización de WNT condujo a una regulación a la baja significativa de la expresión de DKC1 (Figura 3h y Figura suplementaria 5d). Basándonos en esto, evaluamos a continuación el impacto del tratamiento con XAV939 sobre la oncogenicidad impulsada por DKC1, y observamos una modesta reducción en la proliferación y la capacidad de formación de focos en las células CRC DKC1-positivas (Figura suplementaria 9a, b), lo que indica la evidencia de un mecanismo de señalización compensatorio, una característica también común en los pacientes resistentes a la terapia, particularmente aquellos que no responden a la terapia de primera línea^[53].

Cabe destacar que cada vez hay más evidencia que relaciona la biosíntesis de colesterol desregulada con la resistencia a la terapia en múltiples neoplasias^[54]. En línea con esto, el perfilaje transcriptómico de las células CRC con DKC1 silenciado reveló una regulación a la baja significativa de los genes involucrados en la vía de biosíntesis de colesterol (Figura 2a). Por lo tanto, hipotetizamos que las células CRC con alto DKC1 pueden inducir resistencia a las terapias estándar de primera línea. Para examinar esto, realizamos un ensayo de quimiosensibilidad, y se observó una mayor sensibilidad al 5-fluorouracilo (5-FU) en las células con DKC1 silenciado en comparación con el control (Figura suplementaria 9c), lo que indica un posible papel de DKC1 en la inducción de quimiorresistencia. Además, también generamos modelos de CRC quimiorresistentes, en los que las células HCT116 se trataron con 5-FU solo o en combinación con irinotecán (IR) y oxaliplatino (Ox), lo que reproduce los regímenes de tratamiento FOLFIRI y FOLFOX, respectivamente (Figura suplementaria 9d). Los valores de CI50 para cada condición de tratamiento confirmaron el nivel deseado de quimiorresistencia (Figura suplementaria 9e). Curiosamente, un panel de células CRC quimiorresistentes derivadas de HCT116 mostró una mayor expresión de DKC1 en comparación con el control, con los niveles más altos observados en las células resistentes a 5-FU y Ox (5-FU+Ox)R (Figura suplementaria 9f).

Para establecer el papel de DKC1 en la mediación de la quimiorresistencia, generamos células HCT116-(5-FU+Ox)R con DKC1 silenciado de forma estable, y la inhibición se confirmó tanto a nivel de transcrito como de proteína (Figura suplementaria 9g). Se observó una marcada reducción en la tasa de proliferación de las células con DKC1 silenciado en comparación con el control (Figura suplementaria 9h). Además, el ensayo de quimiosensibilidad reveló una notable reducción en la viabilidad celular en las células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R en comparación con los controles tras el tratamiento con 5-fluorouracilo y oxaliplatino, tanto con fármacos individuales como en combinación (Figura suplementaria 9i). A continuación, investigamos el papel de DKC1 en la promoción de la resistencia a los fármacos utilizando un modelo de ratón preclínico, e implantamos células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R y shSCRM-HCT116-(5-FU+Ox)R subcutáneamente en ratones NOD/SCID, seguido de la administración del tratamiento FOLFOX. Cabe destacar que, si bien el tratamiento FOLFOX fue ineficaz en las células quimiorresistentes, se observó una notable reducción en la carga tumoral en las células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R en comparación con los controles (Figura 6a, b). El análisis inmunohistoquímico de los tumores resecados confirmó la disminución de los niveles de DKC1 y SGPP2 en las células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R solamente, sin cambios significativos en sus niveles tras el tratamiento con FOLFOX (Figura 6c y Figura suplementaria 9j). Además, se observó una reducción del tinte nuclear de Ki67 y niveles altos de Caspasa-3, un marcador de apoptosis, en las células shDKC1-HCT116-(5-FU+Ox)R (Figura 6c).

A continuación, evaluamos los niveles de ceramida C24 en los tumores resecados y encontramos una reducción exclusivamente en el grupo con DKC1 inhibido, sin cambios significativos tras el tratamiento con FOLFOX (Figura suplementaria 9k). Esto refuerza la noción de que la focalización del eje de señalización DKC1-SGPP2-ceramida sensibiliza a las células CRC a la terapia FOLFOX. En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan evidencia convincente de que DKC1 es un mediador clave de la resistencia a la quimioterapia de primera línea en CRC.

La focalización dual de DKC1 y la señalización de WNT atenúa la tumorigenicidad y la quimiorresistencia en el cáncer colorrectal

Tras establecer el papel dependiente de WNT de DKC1 en la conducción de la tumorigenesis del CRC y la resistencia a la terapia a través de la desregulación del metabolismo de los esfingolípidos, buscamos a continuación identificar estrategias farmacológicas para interrumpir este circuito oncogénico y superar la refractariedad al tratamiento. Si bien los hallazgos anteriores mostraron que la inhibición de WNT por sí sola produce solo una inhibición modesta de las propiedades oncogénicas, hipotetizamos que la focalización de la señalización de WNT de forma aislada puede ser insuficiente, ya que DKC1 podría reiniciar la transactivación de la vía. En contraste, se anticipó que la inhibición concurrente de DKC1 y la señalización de WNT aboliría el bucle de retroalimentación compensatoria. Para probar esto, evaluamos la eficacia terapéutica de la focalización dual en modelos de CRC quimiorresistentes. Por lo tanto, observamos que la focalización de la señalización de WNT por sí sola ejerció solo un efecto marginal en la viabilidad de las células CRC quimiorresistentes, mientras que la inhibición de DKC1 utilizando pirazofurina provocó una respuesta más pronunciada en las células quimiorresistentes en relación con sus homólogos sensibles. Cabe destacar que la inhibición farmacológica combinada de DKC1 y la señalización de WNT condujo a una reducción sustancial en la viabilidad celular en los modelos quimiorresistentes en comparación con los controles parentales (Figura suplementaria 10a), lo que destaca el potencial sinérgico de las estrategias de focalización dual para superar la resistencia terapéutica.

Para validar estos hallazgos en modelos de ratón preclínicos, evaluamos la eficacia terapéutica de la inhibición de un solo agente frente a la inhibición combinada de DKC1 y la señalización de WNT en ratones xenotrasplantados con células HCT116-(5-FU+Ox)R. Cabe destacar que el tratamiento de focalización dual provocó una reducción significativamente mayor en el volumen tumoral en comparación con la monoterapia o los controles con vehículo (Figura 6d, e). Además, se confirmó la reducción de la expresión de DKC1 en los tumores extirpados tras la administración del fármaco (Figura suplementaria 10b). Es importante destacar que no se observó toxicidad evidente en las dosis administradas, como lo demuestra el peso corporal estable de los ratones durante el período de tratamiento y los perfiles bioquímicos sanguíneos inalterados al final del estudio (Figura suplementaria 10c, d).

Para explorar la relevancia traslacional de la focalización dual del eje DKC1-WNT en el CRC resistente a la terapia, establecimos organoides derivados de pacientes de casos de CRC de alto nivel de DKC1/SGPP2 que no habían respondido a los regímenes de quimioterapia de primera línea (Figura 6f y Figura suplementaria 10e). Estos organoides derivados de pacientes se sometieron a concentraciones graduadas de cuatro regímenes de tratamiento: 5-FU solo; 5-FU+pirazofurina; 5-FU+XAV939; 5-FU+pirazofurina+XAV939. Como se esperaba, estos organoides mostraron una mayor sensibilidad a 5-FU+pirazofurina y 5-FU+XAV939 en comparación con el tratamiento con 5-FU solo (Figura suplementaria 10f). Además, el tratamiento combinado (5-FU+pirazofurina+XAV939) mostró una notable reducción en la viabilidad tumoral, y se observó un efecto sinérgico en alrededor de 1 μM de concentración de fármaco (Figura 6g y Figura suplementaria 10g). En conjunto, nuestros hallazgos revelan un papel fundamental de DKC1 en la inducción de la resistencia a la terapia en CRC y ofrecen una prometedora estrategia combinada, que consiste en la focalización de DKC1 y la señalización de WNT, como una intervención terapéutica eficaz para superar la resistencia en los pacientes con CRC.

Discusión

Los modos de tratamiento habituales para los pacientes con CRC ofrecen beneficios clínicos limitados debido a su mecanismo de acción no específico, los efectos fuera del objetivo y la resistencia adquirida con el tiempo^[55],^[56]. Los avances recientes en los métodos de detección y los medicamentos han mejorado sustancialmente^[57]; sin embargo, un perfilado molecular completo del tumor y una caracterización funcional de las aberraciones genéticas han sido ventajosos para diseñar un régimen de tratamiento personalizado para una mejor gestión de la enfermedad^[58]. En este estudio, desciframos la importancia funcional de DKC1 en la promoción de la progresión del CRC, mostramos su asociación con el subtipo CMS2 asociado a WNT, descubrimos el mecanismo molecular subyacente a través del metabolismo de los esfingolípidos alterado y su papel en la inducción de la resistencia a la terapia, que puede abordarse mediante una estrategia de focalización dual del eje DKC1-WNT.

Anteriormente, se informó que DKC1 es esencial para el ensamblaje y la estabilización del complejo de la telomerasa, donde se sabe que añade repeticiones teloméricas a los extremos cromosómicos y mantiene la integridad genómica, previniendo así las fusiones cromosómicas y la respuesta al daño del ADN^[20],^[59]. Además, se ha relacionado la atenuación de DKC1 con el arresto del punto de control del ciclo celular G1/S y los puntos de control del daño del ADN G2/M en adenocarcinoma de pulmón y sarcoma, respectivamente^[23],^[60]. Nuestros datos sugieren una asociación contextual de DKC1 con la transición de la fase del ciclo celular G2/M. Además, las mutaciones en DKC1 conducen a una condición patológica conocida como disceratosis congénita, caracterizada por un fenotipo corporal hipomórfico, que se manifiesta como actividad defectuosa de la telomerasa y los ribosomas, lo que resulta en una mayor susceptibilidad a la senescencia celular prematura y la disfunción tisular^[61]–^[63]. En general, no se informa que las mutaciones en DKC1 causen cánceres esporádicos^[64], excepto en algunos casos, como el cáncer de mama, donde se ha relacionado una mutación inactivadora en DKC1 con la reducción de la expresión de p53 a través de una traducción de ARNm defectuosa mediada por IRES^[65]. No obstante, se ha asociado una alta expresión de DKC1 con un mal pronóstico en múltiples tipos de cáncer^[22],^[66]. Anteriormente, Kan et al. demostraron que una DKC1 elevada se asocia con una menor supervivencia global en pacientes chinos con CRC y ejerce oncogenicidad al desregular la biogénesis de los ribosomas y la actividad de la pseudouridilación, lo que destaca su eficacia como un objetivo terapéutico combinatorio junto con la vía RAS/RAF^[24]. Además, Hou et al. demostraron la participación de una DKC1 elevada en pacientes con CRC en la promoción de la progresión tumoral y la metástasis a través de vías de diseminación del cáncer inducidas por la hipoxia^[67]. En consonancia con estos informes, nuestros hallazgos sugieren que una DKC1 elevada en el CRC es un mal pronóstico, independientemente de la etnia y/o el estado mutacional de RAS/RAF. Además, se ha demostrado que el direccionamiento de DKC1 en el adenocarcinoma de pulmón causa senescencia y apoptosis asociadas con el telómero^[60]. En línea con el informe anterior^[24], no se observaron efectos secundarios notables de la inhibición farmacológica de DKC1 en estudios preclínicos en ratones. No obstante, se sabe que un paciente que padece disceratosis congénita debido a una mutación en la línea germinal en DKC1 presenta fibrosis pulmonar progresiva, síndrome mielodisplásico y fibrosis pulmonar^[68], y, por lo tanto, se justifica una evaluación clínica exhaustiva.

Una clasificación CMS distinta requiere una delineación específica de las características moleculares y fenotípicas para identificar posibles objetivos farmacológicos. Nuestros hallazgos destacan una notable superposición en las firmas moleculares de CRC positivo para DKC1 con CMS2, caracterizado por una señalización WNT activa y la amplificación de MYC. Anteriormente, se demostró que el eje WNT-MYC modula la biogénesis de los ribosomas en los cánceres de páncreas y colon^[69]. Firestein et al. demostraron la participación de DKC1 en la regulación de la actividad de la β-catenina^[34]. Sin embargo, demostramos que DKC1 está regulado transcripcionalmente a través de la señalización WNT, lo que enfatiza un bucle de retroalimentación entre DKC1 y la señalización WNT. Por lo tanto, proponemos la importancia de dirigir la señalización WNT para abrogar la carcinogénesis mediada por DKC1. La clase CMS2 también se ha asociado con una alta ploidía cromosómica y la activación de las vías de recombinación homóloga (HR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ)^[70],^[71]. De manera similar, tras el silenciamiento de DKC1, encontramos una disminución de PRKDC, un actor clave en NHEJ, lo que conduce a un aumento del daño del ADN. Además, CMS2 también exhibe una firma inmunogénica deficiente, y los pacientes que pertenecen a esta clase muestran una asociación con adenomas tubulares y firmas epiteliales. Se sabe que esta clase específica alberga una firma de células TA, abundancia de mutaciones en APC y TP53, un patrón de metilación bajo y una mayor traducción de ribosomas^[15]. De manera similar, encontramos una superposición en la firma génica enriquecida en las células TA y los pacientes con alta expresión de DKC1, que a menudo albergan alteraciones en APC. Por lo tanto, nuestros datos revelan una fuerte correlación entre la alta expresión de DKC1 y el subtipo CMS2 de CRC, y puede tener una asociación más amplia con otras categorías de CRC de forma dependiente del contexto.

Curiosamente, encontramos un metabolismo de esfingolípidos desregulado debido a la regulación al alza de SGPP2 a través de la vía transcripcional mediada por DKC1. Se sabe que SGPP2 metaboliza su sustrato, la esfingosina-1-fosfato (S1P), en ceramidas a través de la vía de salvamento^[72], lo que se ha informado que induce colitis ulcerosa y promueve el crecimiento tumoral y la metástasis en el cáncer gástrico^[46],^[73]. Además, demostramos que DKC1 es un coactivador transcripcional que regula SGPP2, confirmando así su participación en el metabolismo de los esfingolípidos. Aunque se ha demostrado que S1P desempeña un papel pleiotrópico en la supervivencia y la metástasis de las células^[74], nuestros resultados destacan el papel dependiente del contexto de S1P en la carcinogénesis mediada por DKC1. Nuestros datos también correlacionan negativamente la expresión de SGPP2 con los niveles de ceramida sintasa 1 (CERS1) y ceramida sintasa 4 (CERS4). Si bien se sabe que CERS1 y CERS4 cambian el sustrato de la vía de salvamento, la esfingosina hacia C16-C20 (ceramidas cortas/largas)^[75],^[76], informes anteriores sugieren que esta regulación al alza puede resultar en una reducción recíproca de los niveles de especies de ceramida de cadena muy larga^[77]. Además, el silenciamiento de DKC1 da como resultado una reducción de los niveles de esfingosina y Hex2Cer(d18:1/24:1), un producto glicosilado de las ceramidas de ácidos grasos de cadena muy larga, lo que indica que la vía de salvamento está operativa y la actividad de CERS2 se mantiene en los tumores con alta expresión de DKC1. Esta compleja interacción recapitula en gran medida las consecuencias fisiológicas de las alteraciones en las proporciones de ceramidas de cadena larga/muy larga que tienen efectos opuestos en el cáncer de mama y colon^[29],^[78],^[79]. Además, nuestro análisis integrativo reveló la presencia de lactosilceramida y galactosilceramidas, lo que indica sus funciones pro-supervivencia en el CRC. Otros esfingolípidos complejos, como las ceramidas, exhiben un efecto pro-apoptótico^[80], sin embargo, las ceramidas de diferentes longitudes de cadena confieren diversos efectos en la predisposición al cáncer^[28]. Cabe destacar que encontramos una acumulación de C24 ceramida en los especímenes tumorales de pacientes positivos para DKC1, lo que indica su posible papel en la evasión de la muerte celular programada^[81]. Anteriormente, se demostró que DKC1 regula la actividad de traducción ribosómica intrínseca en las células epiteliales de mama inmortalizadas^[82]. En corroboración con esto, nuestros hallazgos también destacan el papel fundamental de DKC1 en la síntesis de proteínas mejorada, lo que abre vías para una investigación en profundidad de su impacto en la progresión del CRC.

Se sabe que el metabolismo alterado de las ceramidas contribuye inequívocamente a la resistencia multidroga. Las ceramidas tienen implicaciones en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el aumento del estrés oxidativo mediante mecanismos de señalización, como las balsas especiales de la membrana celular, lo que proporciona una respuesta importante para mediar la interacción entre la ceramida y la señalización redox^[83]. Se ha demostrado que las ceramidas proinflamatorias de cadena larga y muy larga, como C24, inducen la actividad mitocondrial mediada por la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)^[84]. En corroboración con esto, nuestros datos también revelan la desregulación del metabolismo de los lípidos mediada por DKC1, lo que resulta en niveles más altos de ceramidas C24 y generación de ROS. En particular, dirigir el metabolismo de las ceramidas puede revertir la resistencia terapéutica en el cáncer. Específicamente, la glicosilación de la ceramida por la enzima glucosilceramida sintasa (GCS), que forma el metabolito no citotóxico glucosilceramida, se ha observado en algunas líneas celulares resistentes a múltiples fármacos, lo que puede ser una vía importante para evitar la apoptosis^[85]. Por lo tanto, dirigir el metabolismo de las ceramidas puede ayudar a mejorar la eliminación tumoral mediante terapias de rutina.

Anteriormente, se informó que DKC1 es un biomarcador para el cáncer colorrectal en etapa tardía^[86]. Sin embargo, los biomarcadores plasmáticos basados en lípidos son más fiables y no invasivos^[26], y aquí ofrecemos ceramidas de cadena muy larga, como C23 y C24, como posibles biomarcadores basados en lípidos para el CRC positivo para DKC1. Sin embargo, no descartamos la posibilidad de encontrar otras especies de ceramidas y esfingomielina para una mayor validación clínica en una cohorte más grande.

La recurrencia del cáncer después de la administración de la terapia de primera línea es el principal obstáculo en el manejo de los pacientes con cáncer. En nuestro estudio, se asocia una alta expresión de DKC1 con la capacidad de formar tumores y un fenotipo similar al de las células madre/tránsito-amplificadoras, lo que se caracteriza por conferir resistencia a la terapia en el cáncer^[87],^[88]. En particular, FOLFIRI ha demostrado eficacia contra los subtipos de CRC caracterizados por un fenotipo similar al de las células madre o tránsito-amplificadoras. Sin embargo, esta clase exhibe una respuesta diferencial a cetuximab y se ha estratificado aún más en dos subclases distintas, a saber, cetuximab-sensible y -resistente^[40]. Además, la inhibición de la vía WNT produjo una respuesta terapéutica limitada, particularmente en el cáncer colorrectal resistente a la terapia. Este fenómeno refleja tanto los mecanismos de resistencia intrínsecos como los adquiridos que se encuentran con frecuencia en entornos clínicos, especialmente entre los pacientes con CRC que no responden a los regímenes de primera línea. Aunque la resistencia a la vía WNT no define universalmente el fracaso de la terapia de primera línea, se ha implicado que la capacidad de formar tumores y los programas pro-supervivencia impulsados por WNT en la resistencia a los regímenes FOLFIRI y FOLFOX en la clínica^[53]. En conjunto, nuestros hallazgos destacan la inhibición de DKC1 como una opción de tratamiento plausible para superar la resistencia a la quimioterapia en pacientes con CRC. Por lo tanto, dirigir DKC1 junto con la señalización WNT podría proporcionar una mejor estrategia de tratamiento en pacientes con características resistentes a la terapia y similares a las células madre/tránsito-amplificadoras.

En conclusión, este estudio reveló el mecanismo molecular asociado con la tumorigenesis de CRC mediada por DKC1 y la resistencia a la quimioterapia hacia el régimen de tratamiento FOLFOX/FOLFIRI (Fig. 7). Proporcionamos información sobre el potencial oncogénico y el fenotipo similar al de las células madre de DKC1 en el CRC. La asociación de los tumores positivos para DKC1 con la clasificación CMS2 destaca la importancia clínica para predecir el pronóstico de los pacientes y la respuesta a las terapias adyuvantes. Por último, nuestros hallazgos indican la utilidad clínica de esfingolípidos de cadena muy larga específicos como biomarcadores basados en lípidos en pacientes con CRC positivo para DKC1. Demostramos el papel de DKC1 en la orquestación de la resistencia a la quimioterapia de primera línea y proporcionamos la validación preclínica de la inhibición de DKC1 y WNT como una estrategia terapéutica combinatoria, proporcionando así una base convincente para dirigir el eje DKC1/WNT en pacientes con CRC que no responden a la quimioterapia.

Métodos

Declaración ética

Los especímenes de pacientes con CRC se recolectaron de la Universidad de Ciencias Médicas King George, Lucknow, India; Hospital Regency, Kanpur, India, después de obtener la aprobación ética de los respectivos Comités de Ética Institucional y el Instituto de Tecnología de la India Kanpur (81.ª ECM II-A/P6; RHL-IEC-16015 y IITK/IEC/2020-21/II/32, respectivamente). Para los especímenes de CRC recolectados del Centro Avanzado de Tratamiento, Investigación y Educación en Cáncer (ACTREC), Centro Memorial Tata (TMC), se obtuvo la aprobación del Comité de Ética III (IEC III, número de referencia 900912). Se realizó el asesoramiento seguido de la obtención del consentimiento informado de cada paciente antes de la cirugía.

Aprobación del estudio

Las muestras se recolectaron después de obtener el consentimiento informado por escrito y las aprobaciones de la junta de ética institucional de acuerdo con las pautas del Consejo Médico de la India (ICMR). Todos los especímenes de pacientes utilizados en este estudio se recolectaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales Institucional (IITK/IAEC/2022/1149; ACTREC/IAEC/33/2022) y se realizaron de acuerdo con las pautas prescritas.

Especímenes de pacientes con carcinoma colorrectal humano

Se recolectaron muestras de cáncer colorrectal obtenidas por resección quirúrgica y muestras de tejido normal adyacente pareadas del King George’s Medical University, Lucknow, India; y del Regency Hospital, Kanpur, India. Se obtuvieron las aprobaciones éticas de los respectivos Comités de Ética Institucionales y del Instituto de Tecnología de la India en Kanpur (81st ECM II-A/P6; RHL-IEC-16015 y IITK/IEC/2020-21/II/32, respectivamente). Para las muestras de CRC recolectadas del ACTREC, Tata Memorial Center (TMC), se obtuvo la aprobación del Comité de Ética del Instituto III (IEC III, número de referencia 900912). Se realizó el asesoramiento y se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente antes del procedimiento quirúrgico.

Para los experimentos metabólicos, se recolectaron muestras frescas de CRC y se congelaron rápidamente utilizando nitrógeno líquido. Se adquirieron láminas de microarreglos de tejido (TMA) de pacientes (CO1502) que comprendían muestras de cáncer colorrectal (N = 75) con dos núcleos para cada paciente, de Tissuearray.com LLC.### Cuantificación de la tinción por inmunohistoquímica (IHC) basada en el puntaje H de los TMA de pacientes con CRC

Se midieron las intensidades de tinción de todas las muestras de CRC utilizando ImageJ y se cuantificaron utilizando el método del puntaje H ^[89]. Para cada muestra, se seleccionaron dos núcleos con aproximadamente cuatro campos representativos y se midieron los siguientes parámetros: área total, % de área, densidad integrada y valores medios de gris. Se calculó el % de área normalizado para cada campo representativo. Las categorías de intensidad de tinción se definieron en función del valor medio de gris, donde los valores medios de gris más bajos correspondían a una mayor intensidad de tinción. A continuación, se asignaron a las muestras puntajes de 3 (alto), 2 (medio), 1 (bajo) o 0 (negativo) utilizando umbrales de distribución basados en cuartiles. Se calculó un puntaje ponderado multiplicando el porcentaje de área normalizado por el puntaje de intensidad correspondiente. El puntaje H ponderado en todos los campos se sumó para generar un puntaje H general para todas las muestras. Para el análisis posterior, los pacientes se estratificaron en tres grupos de intensidad en función de los puntajes H finales: bajo (0-75), medio (76-225) y alto (226-300).### Análisis de supervivencia

Para evaluar la asociación entre la expresión de DKC1 y la supervivencia general en pacientes con cáncer colorrectal, se recuperó el conjunto de datos TCGA-Colon Adenocarcinoma (TCGA-COAD) del navegador UCSC Xena (https://xenabrowser.net). Se utilizaron los paquetes R Survival, Survminer y SurvMisc para el análisis de datos de supervivencia, la optimización del punto de corte se realizó de acuerdo con el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox y una curva de Kaplan-Meier. La significación estadística se midió utilizando la prueba de rango logarítmico.### Análisis de expresión diferencial de los datos de transcriptoma de los pacientes

Los datos de expresión génica disponibles públicamente para muestras de tumores primarios (n = 1644) en los conjuntos de datos de microarreglos de cáncer colorrectal (GSE2109, GSE13067, GSE13294, GSE14333, GSE17536, GSE20916, GSE33113, GSE35896 y GSE39582) de Gene Expression Omnibus (GEO) se sometieron a normalización utilizando el método RMA de muestra única congelada ^[90] del paquete ‘frma’ de R/Bioconductor. A continuación, estos conjuntos de datos se sometieron a la detección de muestras atípicas para la evaluación de la calidad utilizando el paquete ‘arrayQualityMetrics’ de R ^[91]. Las muestras atípicas se excluyeron en función de los gráficos MA, las distancias de muestra por pares y la distribución de los valores de expresión génica. Se calculó el puntaje de desviación absoluta mediana (MAD) para cada sonda en las muestras restantes (n = 1538). Al convertir las sondas en símbolos de genes, se eliminaron los símbolos duplicados conservando la sonda con el puntaje MAD más alto y rechazando las demás para cada gen. A continuación, las muestras se sometieron a la clasificación por cuartiles en función de la expresión de DKC1 y los primeros y cuartos cuartiles se designaron como casos DKC1-alto y DKC1-bajo (n = 770). Se utilizó el paquete ‘limma’ de R/Bioconductor para identificar los genes expresados de forma diferencial entre los pacientes DKC1-alto y DKC1-bajo. Los genes con log2(cambio de expresión) ≥ 1 se designaron como regulados al alza, y los genes con log2(cambio de expresión) ≤ -1 se denominaron regulados a la baja. Los genes que mostraron una asociación positiva con la expresión de DKC1 se sometieron a un análisis de agrupación de anotación funcional utilizando la Base de Datos para la Anotación, la Visualización y el Descubrimiento Integrado (DAVID) ^[92], y se realizó un análisis de Ontología Génica para analizar los procesos y vías biológicas regulados al alza.### Análisis de datos de CCLE

Se descargaron los datos de expresión disponibles públicamente para DKC1 de la base de datos DEPMAP Cancer Cell Line Encyclopedia (https://depmap.org/portal/). También se recuperaron los puntajes de Chronos y CERES para DKC1 de DEPMAP y se representaron gráficamente en GraphPad Prism 7.0.### Cultivo celular y generación de líneas celulares de cáncer colorrectal modificadas genéticamente

Las células Colo320HSR se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC), y las células WiDr se obtuvieron como un generoso regalo del laboratorio del Dr. Eric Fearon en la Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU. Las células SW620, L-Wnt3a y LM se obtuvieron del repositorio de líneas celulares del National Center for Cell Sciences, Pune, Maharashtra, India. Las células Colo320HSR se mantuvieron en medio RPMI1640, mientras que las células WiDr y SW620 se mantuvieron en medios MEM y Leibovitz’s L-15, respectivamente, suplementados con 10% de FBS y 0,5% de penicilina/estreptomicina y se cultivaron en condiciones de cultivo según las recomendaciones de ATCC. Las células MSIE y YAMC fueron generosamente donadas por el Prof. Robert H Whitehead, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne. Ambas células epiteliales murinas se cultivaron y mantuvieron según las condiciones descritas previamente ^[42]. Se validaron todas las líneas celulares mediante el perfilado STR (Laboratorio de ADN Forense, Nueva Delhi; DNA Labs India, Hyderabad, India; Instalación de ADN recombinante, ACTREC, Navi Mumbai, India) y se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por Mycoplasma utilizando el kit de detección de Micoplasma PlasmoTest (InvivoGen).

El empaquetamiento lentiviral se realizó utilizando el sistema de expresión lentiviral ViraPower (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Para el silenciamiento estable de DKC1, se clonaron el ARN de corta cadena (shDKC1) (Cat# VB170928-1264dkz, Cat# VB170928-1281mcr) y el ARN de corta cadena no dirigido (shSCRM) que se dirige a DKC1 en vectores pLV (Cyagen Biosciences). Para establecer la transducción génica modificada con el silenciamiento de DKC1 inducible con doxiciclina, las células SW620 se transfectaron con el ARN de corta cadena lentiviral inducible Tet-On TRIPZ disponible comercialmente. Las partículas lentivirales se generaron utilizando un vector de control no silencioso (Cat# RHS4743) y un plásmido que contiene la secuencia de destino de DKC1 (Cat# RHS4696-201901845). Las células estables se mantuvieron bajo presión de selección con 1 μg/mL de puromicina. Para generar un silenciamiento estable de SGPP2, se utilizó un vector pLKO que contiene la secuencia de destino de SGPP2, mientras que para la línea celular que expresa ectópicamente SGPP2, se consideró el cDNA de SGPP2 clonado en el vector pLV. Las células estables transfectadas con el vector de la cadena principal (EV) (Cat# VB230128-1150etb) y shDKC1 con expresión ectópica de SGPP2 (VB230124-1164gak) se mantuvieron bajo presión de selección utilizando 2,5 μg/mL de puromicina y 5 μg/mL de blasticidina. Agradecemos al consorcio de ARN de corta cadena (Dr. Subba Rao), IISc Bangalore, India, por proporcionar los constructos de ARN de corta cadena contra SGPP2.### Ensayo de traducción de proteínas

Se examinó la traducción global de proteínas utilizando el kit de ensayo de síntesis de proteínas Click-iT™ (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las células shSCRM y shDKC1 SW620 (~40 000) se cultivaron en una cubierta en un plato de cultivo de 4 pocillos y se colocaron en un medio libre de metionina al día siguiente, después de 4 horas de privación de suero. Se añadió L-homopropargilglicina (HPG) en una dilución de 1:1000 y se incubó durante 30 minutos. Las células se lavaron con PBS y se fijaron en formaldehído al 3,7%, seguido de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizó la reacción Click-iT, seguida de la detección de HPG utilizando Alexa Fluor® 488. Se adquirieron imágenes utilizando microscopía confocal (Nikon, AX/AXR) y se cuantificó el porcentaje de células GFP positivas utilizando el software Fiji.### PCR cuantitativa en tiempo real

Se analizó la expresión génica en tiempo real utilizando PCR cuantitativa según el protocolo establecido ^[93], ^[94]. Brevemente, se aisló el ARN de las células de cáncer colorrectal utilizando el reactivo TRIzol (Ambion, Life Technologies) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante, y se convirtió 1 μg de ARN en cDNA utilizando cebadores aleatorios. Se realizó la qPCR utilizando la mezcla maestra SYBR Green PCR (Genetix Biotech Asia Pvt. Ltd) en el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio (Thermo Fisher Scientific). Las secuencias de los cebadores se proporcionan en los Datos Suplementarios 9.### Secuenciación de ARN y análisis

Se aisló el ARN como se describió anteriormente y se envió a Macrogen Inc. (Corea del Sur). Se evaluó la calidad del ARN utilizando el 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), seguido de la preparación de la biblioteca (utilizando el método Illumina TruSeq Stranded mRNA Library) y el secuenciamiento de apareamiento en NovaSeq con una longitud de lectura de 150 pb, y se registraron más de 25 millones de lecturas para cada muestra. Las muestras se sometieron a análisis de expresión diferencial utilizando DESeq2 ^[95] para identificar los genes desregulados (> o < 0,6 log2(cambio de expresión) y valor p ajustado < 0,05). Esta lista de genes se sometió a un análisis de agrupación de anotación funcional basado en la Ontología Génica utilizando la Base de Datos para la Anotación, la Visualización y el Descubrimiento Integrado (DAVID) ^[92].

Para realizar el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) ^[96], se normalizaron las muestras y se realizó la corrección de lotes utilizando Combat en R. Se consideraron significativos los conjuntos de genes con una puntuación de enriquecimiento normalizada (NES) de > 1 o < -1, y se realizó GSEA con la relación señal-ruido según los parámetros predeterminados.### Inmunotinción

Se realizó la inmunotinción según el protocolo establecido ^[97]. Brevemente, se utilizó un tampón de lisis de radioinmunoensayo (RIPA) con el conjunto de inhibidores de fosfatasas II (Calbiochem) y el inhibidor de proteasas (VWR) para preparar los lisados proteicos de toda la célula. Se realizó la cuantificación de proteínas utilizando BCA y se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE seguido del traslado a una membrana de PVDF (GE Healthcare). A continuación, la membrana se incubó con leche seca descremada al 5% en tampón salino con Tween-20 (TBS-T) al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se proporcionó la exposición del anticuerpo a las diluciones respectivas en TBS-T que contiene leche descremada al 2%: 1:1000 de DKC1 (CST, 53234), Caspasa-3 (CST, 9662), PARP escindida (CST, 9541), γH2AX (CST, 9718), SOX2 (Abcam, ab97959), SGPP2 (Thermo Fisher Scientific, PA5-42767), β-catenina fosforilada (CST, 4176), Histona-3 (CST, 14269), α-tubulina (Abcam, Ab-7291), Bcl-xL (CST, 2764S), CD44 (CST, 3570S), Laminina A (Abcam, Ab-26300), 1:3000 de β-catenina (CST, D10A8) y 1:5000 de β-actina (Abcam, ab6276) seguido de una incubación nocturna a 4 °C. Después de la incubación, se eliminó el anticuerpo y se lavó la membrana con TBS-T al 0,1% e incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario respectivo anti-ratón o anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Cat # 115-035-003 y Cat # 111-035-144). De nuevo, se lavó la membrana con TBS-T al 0,1% y se capturó la señal utilizando un sistema de quimiluminiscencia mejorada (Thermo Fisher Scientific).### Ensayo de proliferación celular

Se utilizaron líneas celulares isogénicas shSCRM (control) y shDKC1 para SW620, WiDr (2 × 103) y Colo320HSR (1 × 103). Estas células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se realizó un ensayo de proliferación. El medio de cultivo se reponía cada dos días. Se añadió resazurina o WST-1 a las células y se midió la intensidad de la fluorescencia en los puntos temporales indicados a 530–590 nm de excitación-emisión utilizando el lector de microplacas SpectraMax® Mini Multi-Mode. Se representó gráficamente la tasa de proliferación celular relativa. Para los experimentos con el inhibidor de WNT, se suplementó el medio con XAV939 (MedChemExpress, HY-15147) y se reemplazó cada 24 h. Para el experimento de silenciamiento de DKC1 inducido por doxiciclina, las células SW620 shSCRM y shDKC1 se pretrataron con doxiciclina (MedChemExpress, HY-N0565B; 1,5 µg/mL) y se sembraron en un recipiente de cultivo de 96 pocillos. Se privó a las células de suero durante 4-6 h antes del tratamiento con doxiciclina. Después de 24 h, se repitió el tratamiento y las células se recogieron 48 h después de la inducción inicial. Se extrajeron ARN y proteínas de las células inducidas con Dox para confirmar la supresión de DKC1. Para el ensayo de proliferación de shSCRM y shDKC1 HCT116-(5-FU + Ox), se sembraron 2 × 103 células por pocillo en un recipiente de cultivo de 96 pocillos. Se utilizó el método descrito anteriormente para los ensayos de proliferación.

Citometría de flujo

Para el análisis del ciclo celular, se lavaron 1 × 106 células con PBS y se fijaron con etanol al 70%. Posteriormente, se tiñeron con yoduro de propidio (BioLegend, Cat # 421301) según el protocolo del fabricante antes de la adquisición. Se evaluó la distribución del ciclo celular utilizando un modelo univariante integrado del software FlowJo. La estrategia de selección se proporciona en la Figura Suplementaria 11. El experimento de citometría de flujo se realizó en el citómetro de flujo BD Accuri™ C6 Plus y los datos adquiridos se analizaron utilizando FlowJo v.10.6.1.

Inmunofluorescencia

Se sembraron 2 × 104 células por portaobjetos por pocillo en recipientes de cultivo celular de 4 pocillos. Al día siguiente, se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con formaldehído al 4% en la oscuridad. Las células se lavaron después de la fijación, se permeabilizaron utilizando 0,3% de Triton X-100 en PBS y se lavaron con PBS que contiene 0,1% de Tween-20 (PBS-T). Posteriormente, se utilizó suero normal de cabra (NGS) al 5% en PBS-T para el enmascaramiento y se eliminó una hora después, seguido de un lavado con PBS-T. Los anticuerpos contra DKC1 (Thermo Fisher Scientific, PA5-28922), SGPP2 (Thermo Fisher Scientific, PA5-42767), γH2AX (Santacruz, sc517348) se diluyeron (1:50) en NGS al 2% en PBS-T y las células se incubaron en él durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se eliminó el anticuerpo primario y las células se lavaron con PBS-T para eliminar el anticuerpo no unido de forma específica. A continuación, las células se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa-fluor-555 contra la cadena pesada del ratón (dilución 1:600) en NGS al 2% en PBS-T. A continuación, se lavó el anticuerpo secundario con PBS-T y las células se incubaron con el colorante de tinción nuclear de Hoechst (5 µg/mL) durante 45 minutos. Las células se lavaron y los portaobjetos se montaron en portaobjetos (Vectashield) y se observaron mediante un microscopio de epifluorescencia Carl Zeiss Axio Z1 observer con un dispositivo Apotome acoplado.

Ensayo de esferoides tumorales

El ensayo de esferoides tumorales se realizó según el protocolo descrito anteriormente^[98]. Brevemente, se sembraron las células en un recipiente de cultivo celular de ultra baja adherencia (Corning) a una densidad de 1,5 × 104 células por pocillo y se cultivaron en medio DMEM-F12 sin suero suplementado con factores de crecimiento (EGF y FGF), insulina y B-27 (todos de Thermo Fisher Scientific). Se permitió que las células crecieran y los esferoides formados se desintegraron mediante pipeteo cada tres días. El experimento se finalizó después de tres semanas y se contaron los esferoides y se observaron mediante un microscopio de campo claro (Leica). Se cuantificó el diámetro (d) de los esferoides utilizando ImageJ y se calculó el área de la superficie utilizando la fórmula πd2. Después de la adquisición de la imagen, se aisló el ARN de estos esferoides tumorales para la cuantificación de los marcadores de troncalidad.

Ensayo de quimiosensibilidad

Las células SW620 control (shSCRM) y las células con supresión de DKC1 (shDKC1) se sembraron (5 × 103) en una placa de 96 pocillos. Las células se trataron con 5-fluorouracilo (MedChemExpress, HY-90006) en un rango de 400 µM a 0,39 µM durante 48 h. Para las líneas celulares HCT116 parentales y resistentes a los fármacos, se sembraron (3 × 103 por pocillo). El tratamiento se realizó durante un máximo de 3 días con 0,1 µM de pirazofurina (MedChemExpress, HY-122502) y 10 µM de XAV939, solos y en combinación. El medio que contenía el fármaco se reponía después de 48 horas. Las células SCRM control y las células HCT116 (5-FU + Ox)R con supresión de DKC1 se sembraron a una densidad de 3 × 103 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se trataron con 5-FU, oxaliplatino (MedChemExpress, HY-17371) y la combinación (5-FU + oxaliplatino) a concentraciones variables que oscilan entre 0,1 µM y 10 µM. El medio que contenía el fármaco se reponía cada dos días y el experimento se finalizó después de 96 h de tratamiento. Al final del experimento, se añadió resazurina y se midió la intensidad de la fluorescencia a 530–590 nm de excitación y emisión utilizando el lector de fluorescencia Synergy Z4 (Biotek). Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 7.0 y se calcularon los valores de CI50 de los fármacos en las líneas celulares mediante el método de regresión no lineal.

Ensayo de formación de focos

Para el ensayo de formación de focos, se sembraron 2 × 103 células en recipientes de cultivo de seis pocillos en un medio de cultivo específico para cada línea celular suplementado con 2% de suero fetal bovino inactivado por calor (Thermo Fisher Scientific) y se incubaron a 37 °C. El medio se cambió cada dos días. Para evaluar el efecto del inhibidor de WNT sobre la capacidad de formación de focos, se utilizó un medio suplementado con XAV939 y se reemplazó cada dos días. El ensayo se finalizó después de 10 días y el recipiente de cultivo que contenía los focos se tiñó con solución de cristal violeta (0,05% p/v). Para la cuantificación, los focos se destiñeron utilizando una solución de ácido acético glacial al 10% y se midió la absorbancia a 550 nm.

Estudios de xenoinjerto en ratones

Los ratones NOD.CB17-Prkdcscid/J (NOD/SCID) se compraron comercialmente a Jackson Laboratory (RRID:IMSRJAX:001303) y los ratones atímicos NU-Foxn1_nu se compraron comercialmente a Hylasco Biotechnology (India) Pvt. Ltd. (licenciatario de Charles River Laboratory). El experimento se realizó según el procedimiento estándar y se siguieron estrictamente las directrices del Comité para el Control y la Supervisión de Experimentos con Animales (CPCSEA). Se mantuvieron estrictamente los estándares regulatorios del Comité de Ética Animal de la Indian Institute of Technology Kanpur durante el experimento, incluido un máximo de carga tumoral de menos de 1500 mm3. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (2,5 mg/kg). Para la evaluación in vivo del silenciamiento constitutivo de DKC1, se recogieron las células SW620 shSCRM control, shDKC1-2 y shDKC1-3, se resuspendieron 1,5 × 106 células en 100 µL de solución salina al 0,9% que contenía 15% de Matrigel y se implantaron por vía subcutánea en los flancos de ratones NOD/SCID macho de 4 a 6 semanas de edad (N = 6 para cada tipo). Para el silenciamiento in vivo temporal de DKC1 en los xenoinjertos de ratones, se utilizaron las células SW620 shSCRM y shDKC1 inducidas por doxiciclina. Brevemente, se resuspendieron 1,5 × 106 células en 100 µL de solución salina al 0,9% que contenía 30% de Matrigel para la implantación subcutánea en los flancos de ratones atímicos NU-Foxn1nu hembra de 4 a 6 semanas de edad. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 40 mm3, se aleatorizaron los ratones (N = 5 por grupo) y se trataron con vehículo control o doxiciclina (MedChemExpress, HY-N0565B) durante el período de tratamiento. La doxiciclina (10 mg/kg) se disolvió en una solución vehículo que contenía 30% de PEG300, 5% de Tween-80 y se administró cada tres días por vía intraperitoneal. Para mantener una inducción sostenida del transgen, se suplementó la doxiciclina (2 mg/mL) con 5% de sacarosa en el agua potable y se reponía cada 5 días durante la duración del estudio.

Para comprobar la quimiorresistencia mediada por DKC1 en el modelo de ratón, se implantaron por vía subcutánea células HCT116-(5-FU + Ox)R shSCRM y shDKC1 (2 × 106) en ratones NOD/SCID macho y hembra de 6 a 8 semanas de edad, como se describió anteriormente. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm3, se aleatorizaron los ratones (N = 5 por grupo) y se trataron con vehículo control o una combinación de 5-FU (MedChemExpress, Cat#HY-90006) y oxaliplatino (MedChemExpress, Cat#HY-17371). Los fármacos se resuspendieron en una solución vehículo que contenía 30% de PEG300 y 5% de Tween-80. Los ratones se trataron con 5-FU (30 mg/kg) dos veces por semana y oxaliplatino (2,5 mg/kg) una vez por semana por vía intraperitoneal.

Para el direccionamiento dual de DKC1 y la señalización de WNT en la línea celular resistente a FOLFOX, se implantaron células HCT116-(5-FU+Ox)R en ratones CD1 Nude macho de 6 a 8 semanas de edad (Crl: CD1-Foxn1nu) como se describió^[99]. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 50 mm3, se aleatorizaron los ratones en cuatro grupos (N = 6 por grupo) y se trataron con vehículo control, pirazofurina (1 mg/kg), XAV939 (10 mg/kg) y la combinación (pirazofurina + XAV939). Ambos fármacos se administraron dos veces por semana por vía intraperitoneal durante todo el período de tratamiento. Para todos los experimentos, se controló la carga tumoral cada dos días utilizando un calibre digital. Se calculó el volumen del tumor utilizando la fórmula: (π/6) (L × W2), (L = longitud; W = anchura). Todos los ratones utilizados en el estudio se alojaron en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) según las directrices institucionales. La temperatura ambiente de la sala de los ratones se mantuvo entre 20 y 24 °C con una humedad de entre el 40 y el 60% y un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 horas.

Tinción por inmunohistoquímica

Los tumores se fijaron primero en formalina tamponada al 10%, se incluyeron en parafina y se obtuvieron cortes de 3 µm utilizando un micrótomo (Leica). Los portaobjetos de xenoinjertos tumorales se incubaron a 60 °C durante 2 h, seguidos de la recuperación del antígeno en un instrumento PT Link (Agilent DAKO, PT200) utilizando la solución de recuperación del antígeno EnVision FLEX, pH alto (Agilent DAKO, K800421-2) para los portaobjetos de DKC1 y la solución de recuperación del antígeno EnVision FLEX, pH bajo (Agilent DAKO, K800521-2) para los portaobjetos de Ki67. Se utilizó 1X de tampón de lavado EnVision FLEX (Agilent DAKO, K800721-2) para lavar los portaobjetos, seguido de tratamiento con Peroxidazed 1 (Biocare Medical, PX968M) y Background Punisher (Biocare Medical, BP974L) durante 5 minutos y 10 minutos respectivamente, con lavado después de cada paso. La tinción inmunológica se realizó utilizando anticuerpos contra DKC1 (Abcam, ab156877; Thermo Fisher Scientific, PA5-28922), SGPP2 (Thermo Fisher Scientific, PA5-42767), Ki67 (clon MIB-1, DAKO M7240) y Caspase-3 (CST, 9662) durante la noche a 4 °C. Posteriormente, se lavaron los portaobjetos y se incubaron en Mach2 Doublestain 1 (portaobjetos de DKC1) (Biocare Medical, MRCT523L) o Mach2 Doublestain 2 (portaobjetos de Ki67) (Biocare Medical, MRCT525L) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron 3 veces en tampón de lavado 1X y se trataron con una solución de DAB Betazoid (Biocare Medical, BDB2004H) durante 5 minutos. A continuación, se enjuagaron los portaobjetos en agua destilada y se trataron con EnVision FLEX Hematoxylin (Agilent DAKO, K800821-2). Después de enjuagar en agua del grifo, se secaron completamente los portaobjetos y luego se deshidrataron con xileno. Se añadió EcoMount (Biocare Medical, EM897L) a cada portaobjetos, que luego se montó con cubreobjetos.

La cuantificación se realizó calculando la densidad integrada para 15 campos histológicos aleatorios utilizando el complemento IHC Toolbox del software ImageJ. Para la cuantificación de los núcleos positivos para Ki67, se calculó la relación de núcleos positivos para Ki67 a núcleos totales para 10-15 campos histológicos aleatorios utilizando la deconvolución de color H&DAB de Fiji o el módulo en línea de ImageJS Ki-67^[100].

Se sometieron a tinción inmunohistoquímica las láminas de microarreglos de tejidos de los pacientes (CO1502, Tissuearray.com LLC) según el protocolo mencionado. Excepto para la inmunohistoquímica de SGPP2, donde la lámina de microarreglo de tejidos se incubó durante la noche a 4 °C con un anticuerpo contra SGPP2 (Thermo Fisher Scientific, PA5-42767). La lámina de SGPP2 se lavó e incubó en Mach2 Doublestain 1 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para la tinción de DKC1 del microarreglo de tejidos, se siguió el mismo protocolo mencionado anteriormente.

Análisis in silico para la clasificación CMS

Los datos de recuento para la secuenciación de ARN (RNA-seq) de las muestras de COADREAD se obtuvieron de TCGA a través del portal GDC utilizando el paquete R TCGA biolinks. Los recuentos brutos se normalizaron a recuentos log2 por millón (log2 CPM) con un pseudorecuento de 1 añadido para evitar problemas de transformación logarítmica. La firma génica del subtipo CMS se definió basándose en la clasificación publicada por Guinney et al. ^[15]. Se definieron cuatro subtipos CMS (CMS1-4) utilizando conjuntos de genes representativos ampliados a aproximadamente 20-25 genes por subtipo para capturar los procesos biológicos clave relevantes para cada clase molecular. Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes en muestras individuales (ssGSEA) sobre la matriz de expresión normalizada utilizando el paquete R GSVA, calculando las puntuaciones de enriquecimiento para cada firma génica CMS por muestra. A cada muestra se le asignó un subtipo CMS correspondiente al conjunto de genes con la puntuación de enriquecimiento más alta. Los pacientes con niveles altos y bajos de DKC1 se sometieron a un análisis de variación de conjuntos de genes (GSVA) para las firmas CMS reguladas al alza y a la baja derivadas de la clasificación CMS ^[15] o una firma más pequeña propuesta para la misma como ‘ColoType’ ^[38]. Para el análisis de datos de proteómica, se utilizaron los datos de proteómica CPTAC para el cáncer colorrectal con el fin de evaluar diferentes parámetros.

Análisis de datos de expresión a nivel de célula única

Las matrices de expresión a nivel de célula única y los metadatos se descargaron de los conjuntos de datos GEO GSE132465 y GSE144735. Los datos de expresión normalizados y los metadatos se combinaron en un objeto anndata utilizando Scanpy. Se realizaron análisis y visualizaciones adicionales, como gráficos de puntos, utilizando las funciones de Scanpy. Los metadatos de los tres conjuntos de datos independientes GSE132465, GSE144735 y GSE200997 se descargaron de GEO. Los datos de recuento y los metadatos se utilizaron para crear los tres objetos Seurat para los tres conjuntos de datos, respectivamente. Utilizando un enfoque de suma de agregados, los recuentos de las células individuales en los objetos Seurat se agregaron para formar un Pseudo Bulk. Se utilizó la función nativa de Seurat AggregateExpression para crear las muestras Pseudo Bulk. Los datos de recuento y los metadatos exportados de los Pseudobulks se utilizaron para crear tres conjuntos de datos DESeq2 independientes. Se realizó un metaanálisis utilizando un script personalizado basado en el paquete metafor. Los gráficos de bosque se crearon utilizando ggplot2.

Transfección con siRNA

Las células se sembraron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 50% en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 30 pmol de siRNA contra CTNNB1 (siCTNNB1) o siRNA no dirigido (siNT) (Dharmacon; Cat#D-001810-10-05) utilizando el reactivo de transfección de siRNA XtremeGENE™ (Roche, Merck) según las instrucciones del fabricante (para SW620, se utilizaron 150 pmol de siRNA). Las células se transfectaron de nuevo después de 24 horas, y la proteína o el ARN se aislaron 36 horas después de la segunda transfección y se analizaron mediante qPCR e inmunoblotting, como se mencionó anteriormente.

Estimulación con WNT3A

El medio acondicionado con WNT3A se recogió según las recomendaciones de ATCC. Brevemente, las células L-Wnt-3A o las células LM de control se sembraron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 50-60%, y se recogieron dos lotes del medio acondicionado el cuarto y el séptimo día, se procesaron y se almacenaron a 4 °C. Las células o organoides murinos colónicos benignos diana se privaron de suero durante 4-6 horas, seguido de la suplementación con un 50% de medio acondicionado. El medio se reemplazó cada 24 horas y el experimento se finalizó después de 60 horas desde el inicio del tratamiento. Las células se recogieron y se realizó un ensayo de inmunoblotting para confirmar la estimulación de la señalización.

Fraccionamiento nuclear y citoplasmático

El fraccionamiento subcelular de la línea celular y los organoides derivados de pacientes se realizó según el protocolo del fabricante del kit de extracción nuclear y citoplasmática NE-PER (Thermo Fisher Scientific, 78833). Brevemente, las células se trataron con tripsina, se lavaron con PBS frío y se centrifugaron a 500 × g durante 5 minutos. El sedimento celular se incubó en un tampón CER I y CER II (proporcionado con el kit), se agitó y se centrifugó. El sobrenadante se recogió en un tubo nuevo y se utilizó como fracción citosólica. El sedimento restante se resuspendió en un tampón NER frío, se agitó intermitentemente (pulsos de 15 segundos) durante 40 minutos. El homogeneizado se centrifugó a 16000 × g durante 10 minutos a 4 °C, y la fracción nuclear se utilizó.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Los niveles de esfingosina-1-fosfato se midieron utilizando ELISA según las instrucciones del fabricante (kit ELISA universal para S1P, fabricante: ImmunoTag, G bioscience, ITLK09484). Brevemente, las células en platos de 100 mm se lisaron utilizando un tampón que contenía 1% de Triton X-100, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1 mM de Na3VO4, 10 mM de HEPES (pH 7,5) junto con inhibidores de proteasas y fosfatasas. La lisis fue seguida de la centrifugación a 15000 × g a 4 °C durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se estimó la cantidad de proteína utilizando el ensayo de ácido bicinquinónico y se incubó en placas de 96 pocillos pre-recubiertas con anticuerpo contra S1P, seguido de la incubación con anticuerpo biotinilado. A continuación, se utilizó la solución de Streptavidina-HRP, seguida del sustrato TMB. La reacción se detuvo utilizando la ‘solución de parada’ y se midió la absorbancia a 450 nm. Los niveles de S1P normalizados a la expresión de proteínas se utilizaron para la evaluación final. Para la ceramida C24, se realizó un ELISA indirecto siguiendo el protocolo estándar de Abcam. La ceramida C24 (Sigma-Aldrich-860524P) se recubrió en los pocillos durante la noche. Se preparó una curva estándar utilizando una dilución en serie del antígeno de ceramida C24 a partir de 1 mM. Los sobrenadantes celulares se procesaron utilizando el método de Folch ^[101] para el enriquecimiento de lípidos, que posteriormente se utilizaron para recubrir placas de 96 pocillos. Se preparó una curva estándar utilizando una dilución en serie del antígeno de ceramida C24 a partir de 1 mM. Para el experimento in vitro, se utilizaron los lípidos enriquecidos de las células lisadas con shSCRM y shDKC1 para recubrir los pocillos. Se utilizó el anticuerpo monoclonal contra ceramida (C8104) como anticuerpo primario a una concentración de 1:100. Se utilizó el anticuerpo secundario anti-ratón a una concentración de 1:1000. Para el experimento in vivo, los tejidos tumorales de los ratones se disociaron mecánicamente y se homogeneizaron utilizando Qiagen TissueLyser, y posteriormente se extrajeron los lisados.

Análisis de datos de secuenciación ChIP

Se utilizaron datos de secuenciación ChIP disponibles públicamente (GSE31477) para TCF7L2 en células HCT116 para explorar la regulación de DKC1 bajo el control de la señalización de WNT. Se realizó una evaluación de la calidad de las lecturas de un solo extremo sin procesar utilizando FASTQC, se recortaron con FASTQ Trimmer, con la configuración predeterminada de la plataforma web Galaxy (usegalaxy.org). Las lecturas se alinearon al genoma de referencia (hg19) utilizando Bowtie para generar archivos de alineación de secuencia/mapa (SAM). Las lecturas no alineadas o no mapeadas se filtraron utilizando FilterSAM, una utilidad de SAMtools. Los archivos SAM se convirtieron en sus archivos de alineación binaria/mapa (BAM) utilizando SAMtools. Además, los picos de secuenciación ChIP para RNA PolII y TCF7L2 se llamaron utilizando el análisis basado en modelos de secuenciación ChIP (MACS; P < 10−5) con la configuración predeterminada en comparación con Input. Los archivos BAM y BED obtenidos se visualizaron mediante el navegador de genoma integrado (IGB).

Inmunoprecipitación

Las células SW620 se cultivaron en un plato de 100 mm y se recogieron cuando alcanzaron una confluencia del 90%; las células se lavaron dos veces con PBS y se centrifugaron a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C. El sedimento celular se incubó en un tampón CER I y CER II (proporcionado con el kit), se agitó y se centrifugó. El sobrenadante se recogió en un tubo nuevo y se utilizó como fracción citosólica. El sedimento restante se resuspendió en un tampón NER frío, se agitó intermitentemente (pulsos de 15 segundos) durante 40 minutos. El homogeneizado se centrifugó a 16000 × g durante 10 minutos a 4 °C, y la fracción nuclear se utilizó.

Inmunoprecipitación

Las células SW620 se cultivaron en un plato de 100 mm y se recogieron cuando alcanzaron una confluencia del 90%; las células se lavaron dos veces con PBS y se centrifugaron a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C. El sedimento celular se incubó en un tampón CER I y CER II (proporcionado con el kit), se agitó y se centrifugó. El sobrenadante se recogió en un tubo nuevo y se utilizó como fracción citosólica. El sedimento restante se resuspendió en un tampón NER frío, se agitó intermitentemente (pulsos de 15 segundos) durante 40 minutos. El homogeneizado se centrifugó a 16000 × g durante 10 minutos a 4 °C, y la fracción nuclear se utilizó.

El voltaje de la pulverización de ionización positiva y el voltaje de la boquilla se ajustaron a 3000 V y 1000 V, respectivamente. Las temperaturas del gas de secado y del gas de protección se mantuvieron en 250 °C. Los caudales del gas de secado y del gas de protección fueron de 14 L/min y 11 L/min, respectivamente. El caudal del gas nitrógeno del nebulizador se ajustó a 35 psi. La presión de radiofrecuencia (RF) alta y baja del iFunnel fue de 150 V y 60 V, respectivamente. Los datos de cuantificación se extrajeron utilizando el software Agilent MassHunter Quantitative Analysis (QQQ). Los datos se revisaron manualmente para garantizar que el software integrara los picos correctos.

El filtrado de control de calidad se basa en las áreas de los picos brutos para todas las especies de lípidos medidas, utilizando las muestras de control de calidad (TQC) agrupadas. Los criterios de filtrado fueron los siguientes:

Baja variación de la señal (CV < 20 %);

Alta relación muestra/blanco (> 10);

Buena linealidad de la señal (R2 > 0,8).

Las especies de lípidos que no superaron el filtrado de control de calidad se marcan como "FALLIDO" y se excluyen del análisis posterior.

Utilizando estándares específicos de la clase de lípidos, la concentración relativa de un analito en la muestra se calcula como se muestra en la ecuación (1): cAnalito: Concentración molar [M o µmol/µL] del analito en la muestra,

AreaAnalito: Área del pico del analito,

AreaISTD: Área del pico del ISTD,

VISTD mix: Volumen del disolvente de extracción (mezcla de ISTD)

Sample Amount: Cantidad de la muestra (p. ej., µL o mg)

cISTD: Concentración del ISTD en el disolvente de extracción (mezcla de ISTD)

Análisis multivariante para la significación estadística

La tasa de falsos descubrimientos para los datos de lipidómica se calculó utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg (BH) aplicado a la lista de valores p brutos ordenados. Para garantizar una monotonicidad válida, se aplicó una corrección de mínimo acumulativo. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) y un análisis de discriminación de proyecciones ortogonales de estructuras latentes (OPLSDA), proporcionando puntuaciones de importancia en la proyección (VIP) para las especies de lípidos desreguladas, utilizando el módulo "Análisis estadístico (un factor)" de Metaboanalyst v5.0^[103].

Análisis de vías integrativo

Los genes y lípidos diferenciales obtenidos de los análisis de RNAseq y UHPLC-MS/MS para los controles revueltos y las células SW620 silenciadas con DKC1 se sometieron al módulo de análisis de vías conjuntas de Metaboanalyst v5.0^[103]. Se realizó un análisis de enriquecimiento utilizando una prueba hipergeométrica, y la centralidad de grado se utilizó como medida de topología para combinar las consultas. El análisis se realizó para identificar las vías metabólicas afectadas de manera significativa.

Análisis de biomarcadores

El perfil lipídico de los tumores de pacientes con CRC se utilizó para identificar biomarcadores utilizando el módulo de análisis de biomarcadores de Metaboanalyst v5.0^[103]. Los datos se escalaron de Pareto para la normalización. Se realizó un análisis univariante clásico para generar una curva de características operativas del receptor (ROC) y calcular el área bajo la curva para diferentes ceramidas. El módulo de evaluación del modelo basado en la curva ROC (Tester) se utilizó para evaluar la eficacia de las ceramidas propuestas como biomarcadores para los tumores DKC1-altos.

Detección de especies de oxígeno reactivo y actividad mitocondrial

Se realizó una tinción fluorescente basada en colorantes utilizando DHE (Thermo Fisher Scientific, D11347) y Mitotracker (Thermo Fisher Scientific, M22425) para detectar la presencia de ROS y mitocondrias, respectivamente, dentro de las células. Brevemente, se sembraron y cultivaron aproximadamente 2,5 x 10^4 células sobre una cubierta en un plato de cultivo de 4 pocillos. Una vez que las células se vuelven confluentes y alcanzan su morfología nativa, se retiró el medio y las cubiertas se enjuagaron suavemente con PBS 1X. Se añadieron los colorantes DHE y Mitotracker a una dilución de 1:4000 y 1:2000, respectivamente. Las células teñidas se incubaron luego a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad, el colorante residual se eliminó lavando con PBS 1X y las cubiertas se montaron sobre un portaobjetos utilizando el medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal (Leica-SP5). Para la cuantificación, la intensidad media de fluorescencia (IMF) se cuantificó utilizando el software ImageJ.

Generación de una línea celular HCT116 resistente a la quimioterapia

Las células resistentes a la quimioterapia se generaron como se describió previamente^[99]. Brevemente, en el día 0, las células HCT116 se sometieron a una dosis IC90 (que causa una inhibición del 90 %) de 5-FU, 5-FU + Iri (FOLFIRI) o 5-FU + Oxa (FOLFOX), respectivamente. El fármaco se reponía cada tres días hasta el día 9 para seleccionar las células resistentes a la quimioterapia. Luego, se permitió que las células se expandieran clonalmente en el medio libre de fármacos. En el día 18, se determinaron los valores de IC50 para confirmar la resistencia a la quimioterapia.

Organoides derivados de pacientes (PDO)

Los organoides derivados de pacientes se establecieron utilizando biopsias de CRC obtenidas de pacientes indios inscritos en ACTREC, TMC, Mumbai, utilizando protocolos descritos previamente^[104]. Brevemente, se recogieron los organoides maduros en un tubo T15 utilizando puntas de corte y se centrifugaron a baja velocidad (100-200 x g) durante 5 minutos. El precipitado se resuspendió en 500 μl de medio completo por pocillo de una placa de seis pocillos. Un pocillo de una placa de 96 pocillos se dividió en cuadrantes. Se añadieron 50 μl de la suspensión de PDO a los pocillos. Los organoides se observaron bajo el microscopio y se contaron cuidadosamente. La concentración de organoides se calculó dividiendo el recuento por el volumen utilizado. El recuento total de esferas se calculó multiplicando la concentración por el volumen total.

Tratamiento farmacológico de los PDO

Se realizó un cribado farmacológico tridimensional de los PDO como se describió^[104]. Brevemente, se contaron los organoides maduros y se recogieron según el procedimiento indicado anteriormente. Se sembraron 200 organoides por pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos, cada una de las cuales contenía una capa base sólida de 20 μl de Matrigel y se añadió 90 μl del medio de PDO con un 5 % (en volumen) de Matrigel. En una placa de 96 pocillos separada, se sembraron 16 pocillos de manera similar para generar controles de siembra del día 0 y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante la noche. Para la placa de control, se añadieron 90 μl del medio de cultivo y se analizaron con Cell Titer Glo 3D (CTG-3D) para generar un valor de control de siembra en el momento de la dosificación. Se preparó una placa de fármacos separada con una dilución serial de ocho puntos de 90 μl de cada condición en cuadruplicado técnico, en una placa de 96 pocillos sembrada. Las placas de PDO tratadas se incubaron durante 96 horas (37 °C y 5 % de CO2) y se analizaron con CTG-3D. Los valores de luminiscencia brutos de cada condición se normalizaron al valor de control de siembra del día 0. El índice de combinación se calculó utilizando el software CompuSyn 1.0, que utiliza el algoritmo de Chou y Talalay^[105].

Análisis bioquímico de la sangre de los ratones

Al final del experimento, se anestesiaron los ratones y se recogió sangre mediante punción cardíaca en un tubo con activador de coágulos, seguido de centrifugación refrigerada a 1500 x g durante 15 minutos. Se recogió el sobrenadante que contenía suero y se sometió a un examen bioquímico para estudios de toxicidad hepática y renal utilizando Siemens Dimension® EXL™ 200.

Estadísticas y reproducibilidad

Se utilizó GraphPad Prism 7.0 para el análisis estadístico. Para todas las comparaciones, se utilizaron pruebas t de Student de dos colas o ANOVA de una vía, a menos que se indique lo contrario en las respectivas figuras. Los valores de FDR y p menores que 0,05 se consideraron significativos.

Resumen del informe

Se puede encontrar información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Declaración ética

Las muestras de pacientes con CRC se recogieron del King George’s Medical University, Lucknow, India; Regency Hospital, Kanpur, India, después de obtener la aprobación ética de los respectivos Comités de Ética Institucional y del Instituto de Tecnología de la India Kanpur (81st ECM II-A/P6; RHL-IEC-16015, y IITK/IEC/2020-21/II/32, respectivamente). Para las muestras de CRC recogidas del Advanced Center for Treatment, Research and Education in Cancer (ACTREC), Tata Memorial Center (TMC), se obtuvo la aprobación del Comité de Ética III (IEC III, número de referencia 900912). Se realizó el asesoramiento y se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente antes de la cirugía.

Aprobación del estudio

Las muestras se recogieron después de obtener el consentimiento informado por escrito y las aprobaciones de la junta de ética institucional, de acuerdo con las directrices del Consejo Médico de la India (ICMR). Todas las muestras de pacientes utilizadas en este estudio se recogieron de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales Institucional (IITK/IAEC/2022/1149; ACTREC/IAEC/33/2022) y se realizaron de acuerdo con las directrices prescritas.

Muestras de pacientes con carcinoma colorrectal humano

Se recogieron muestras de carcinoma colorrectal resecadas quirúrgicamente y muestras de tejido normal adyacente del King George’s Medical University, Lucknow, India; Regency Hospital, Kanpur, India. Se obtuvieron aprobaciones éticas de los respectivos Comités de Ética Institucional y del Instituto de Tecnología de la India Kanpur (81st ECM II-A/P6; RHL-IEC-16015, y IITK/IEC/2020-21/II/32, respectivamente). Para las muestras de CRC recogidas del ACTREC, Tata Memorial Center (TMC), se obtuvo la aprobación del Comité de Ética III (IEC III, número de referencia 900912). Se realizó el asesoramiento y se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente antes del procedimiento quirúrgico.

Para los experimentos metabólicos, se recogieron muestras frescas de CRC y se congelaron rápidamente con nitrógeno líquido. Se adquirieron diapositivas de matriz de tejidos de pacientes (TMA) (CO1502) que comprendían muestras de carcinoma colorrectal (N = 75) con dos núcleos para cada paciente de Tissuearray.com LLC.

Cuantificación de la puntuación H basada en IHC de las TMA de pacientes con CRC

Se midieron las intensidades de tinción de todas las muestras de CRC utilizando ImageJ y se cuantificaron utilizando el método de puntuación H^[89]. Para cada muestra, se seleccionaron dos núcleos con aproximadamente cuatro campos representativos y se midieron los siguientes parámetros: área total, % de área, densidad integrada y valores medios de gris. Se calculó el % de área normalizado para cada campo representativo. Las categorías de intensidad de tinción se definieron en función del valor medio de gris, en el que los valores medios de gris más bajos correspondían a una mayor intensidad de tinción. A continuación, se asignaron a las muestras puntuaciones de 3 (alto), 2 (medio), 1 (bajo) o 0 (negativo) utilizando umbrales de distribución basados en cuartiles. Se calculó una puntuación ponderada multiplicando el porcentaje de área normalizado por la puntuación de intensidad correspondiente. La puntuación H ponderada en todos los campos se sumó para generar una puntuación H general para todas las muestras. Para el análisis posterior, los pacientes se estratificaron en tres grupos de intensidad en función de las puntuaciones H finales: bajo (0-75), medio (76-225) y alto (226-300).

Análisis de supervivencia

Para evaluar la asociación entre la expresión de DKC1 y la supervivencia general en pacientes con cáncer colorrectal, se recuperó el conjunto de datos TCGA-Colon Adenocarcinoma (TCGA-COAD) del navegador UCSC Xena (https://xenabrowser.net). Se utilizaron los paquetes R Survival, Survminer y SurvMisc para el análisis de datos de supervivencia, y la optimización del punto de corte se realizó de acuerdo con el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox y una curva de Kaplan-Meier. La significación estadística se midió utilizando la prueba de rango logarítmico.

Análisis de expresión diferencial de los datos del transcriptoma de los pacientes

Los datos de expresión génica disponibles públicamente para muestras de tumores primarios (n = 1644) en conjuntos de datos de microarrays de cáncer colorrectal (GSE2109, GSE13067, GSE13294, GSE14333, GSE17536, GSE20916, GSE33113, GSE35896 y GSE39582) del Gene Expression Omnibus (GEO) se sometieron a normalización utilizando el método RMA congelado de una sola muestra ^[90] del paquete ‘frma’ de R/Bioconductor. A continuación, estos conjuntos de datos se sometieron a la detección de muestras atípicas para la evaluación de la calidad utilizando el paquete ‘arrayQualityMetrics’ de R ^[91]. Las muestras atípicas se excluyeron en función de los gráficos MA, las distancias entre muestras por pares y la distribución de los valores de expresión génica. Se calculó la puntuación de la desviación absoluta mediana (MAD) para cada sonda en las muestras restantes (n = 1538). Al convertir las sondas en símbolos génicos, se eliminaron los símbolos duplicados conservando la sonda con la puntuación MAD más alta y descartando las demás para cada gen. A continuación, las muestras se sometieron a una clasificación por cuartiles en función de la expresión de DKC1, y los primeros y cuartos cuartiles se designaron como casos DKC1-alto y DKC1-bajo (n = 770). Se utilizó el paquete ‘limma’ de R/Bioconductor para identificar los genes expresados diferencialmente entre los pacientes DKC1-alto y DKC1-bajo. Los genes con log2(cambio de expresión) ≥ 1 se designaron como regulados al alza, y los genes con log2(cambio de expresión) ≤ -1 se denominaron regulados a la baja. Los genes que mostraban una asociación positiva con la expresión de DKC1 se sometieron a un análisis de agrupación de anotación funcional utilizando la Base de Datos para la Anotación, la Visualización y el Descubrimiento Integrado (DAVID) ^[92], y se realizó un análisis de la Ontología Génica para analizar los procesos y vías biológicas regulados al alza.

Análisis de datos de CCLE

Los datos de expresión disponibles públicamente para DKC1 se descargaron de la base de datos DEPMAP Cancer Cell Line Encyclopedia (https://depmap.org/portal/). También se recuperaron las puntuaciones de Chronos y CERES para DKC1 de DEPMAP y se representaron gráficamente en GraphPad Prism 7.0.

Cultivo celular y generación de líneas celulares de cáncer colorrectal modificadas genéticamente

Las células Colo320HSR se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC), y las células WiDr se obtuvieron como un generoso regalo del laboratorio del Dr. Eric Fearon en la Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU. Las células SW620, L-Wnt3a y LM se obtuvieron del repositorio de líneas celulares del National Center for Cell Sciences, Pune, Maharashtra, India. Las células Colo320HSR se mantuvieron en medio RPMI1640, mientras que las células WiDr y SW620 se mantuvieron en medios MEM y Leibovitz’s L-15, respectivamente, suplementados con un 10% de FBS y un 0,5% de penicilina/estreptomicina, y se cultivaron en condiciones según las recomendaciones de ATCC. Las células MSIE y YAMC fueron un generoso regalo del Prof. Robert H Whitehead, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne. Ambas células epiteliales murinas se cultivaron y mantuvieron según las condiciones descritas anteriormente ^[42]. Se validaron todas las líneas celulares mediante el perfilado STR (Laboratorio de ADN Forense, Nueva Delhi; DNA Labs India, Hyderabad, India; Instalación de ADN recombinante, ACTREC, Navi Mumbai, India) y se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por Mycoplasma utilizando el kit de detección de Mycoplasma PlasmoTest (InvivoGen).

El empaquetamiento lentiviral se realizó utilizando el sistema de expresión lentiviral ViraPower (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Para el silenciamiento estable de DKC1, se clonaron el ARN de horquilla corta lentiviral humano que se dirige a DKC1 (shDKC1) (Cat# VB170928-1264dkz, Cat# VB170928-1281mcr) y el ARN de horquilla corta no dirigido (shSCRM) en vectores pLV (Cyagen Biosciences). Para establecer la modificación genética inducible por doxiciclina del silenciamiento mediado por shRNA de DKC1, las células SW620 se transfectaron con el shRNA lentiviral inducible Tet-On disponible comercialmente. Las partículas lentivirales se generaron utilizando un vector de control no silencioso (Cat# RHS4743) y un plásmido que contiene la secuencia de direccionamiento de DKC1 (Cat# RHS4696-201901845). Las células estables se mantuvieron bajo presión de selección con 1 μg/mL de puromicina. Para generar un silenciamiento estable de SGPP2, se utilizó un vector pLKO que contiene la secuencia de direccionamiento de SGPP2, mientras que para la línea celular que expresa ectópicamente SGPP2, se consideró el cDNA de SGPP2 clonado en el vector pLV. Las células estables transfectadas con el vector de base (EV) (Cat# VB230128-1150etb) y shDKC1 con expresión ectópica de SGPP2 (VB230124-1164gak) se mantuvieron bajo presión de selección utilizando 2,5 μg/mL de puromicina y 5 μg/mL de blasticidina. Agradecemos al consorcio de shRNA (Dr. Subba Rao), IISc Bangalore, India, por proporcionar los constructos de shRNA contra SGPP2.

Ensayo de traducción de proteínas

Se examinó la traducción global de proteínas utilizando el kit de ensayo de síntesis de proteínas Click-iT™ (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las células shSCRM y shDKC1 SW620 (~40 000) se cultivaron en una cubierta en un plato de cultivo de 4 pocillos, y se colocaron en un medio libre de metionina al día siguiente, después de la privación de suero durante 4 h. Se añadió L-homopropargilglicina (HPG) en una dilución de 1:1000 y se incubó durante 30 minutos. Las células se lavaron con PBS y se fijaron en formaldehído al 3,7%, seguido de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizó la reacción Click-iT, seguida de la detección de HPG utilizando Alexa Fluor® 488. Se adquirieron imágenes utilizando microscopía confocal (Nikon, AX/AXR) y se cuantificó el porcentaje de células GFP positivas utilizando el software Fiji.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se analizó la expresión génica en tiempo real utilizando PCR cuantitativa según el protocolo establecido ^[93], ^[94]. Brevemente, se aisló el ARN de las células de cáncer colorrectal utilizando el reactivo TRIzol (Ambion, Life Technologies) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante, y se convirtió 1 μg de ARN en cDNA utilizando cebadores aleatorios. Se realizó la qPCR utilizando la mezcla maestra SYBR Green PCR (Genetix Biotech Asia Pvt. Ltd) en el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio (Thermo Fisher Scientific). Las secuencias de los cebadores se proporcionan en los Datos Suplementarios 9.

Secuenciación de ARN y análisis

Se aisló el ARN como se describió anteriormente y se envió a Macrogen Inc. (Corea del Sur). Se evaluó la calidad del ARN utilizando el 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), seguido de la preparación de la biblioteca (utilizando el método Illumina TruSeq Stranded mRNA Library) y el secuenciamiento de apareamiento en NovaSeq con una longitud de lectura de 150 pb, y se registraron más de 25 millones de lecturas para cada muestra. Las muestras se sometieron a análisis de expresión diferencial utilizando DESeq2 ^[95] para identificar los genes desregulados (> o < 0,6 log2(cambio de expresión) y valor p ajustado < 0,05). Esta lista de genes se sometió a un análisis de agrupación de anotación funcional basado en la Ontología Génica utilizando la Base de Datos para la Anotación, la Visualización y el Descubrimiento Integrado (DAVID) ^[92].

Para realizar el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) ^[96], se normalizaron las muestras y se realizó la corrección de lotes utilizando Combat en R. Se consideraron significativos los conjuntos de genes con una puntuación de enriquecimiento normalizada (NES) de > 1 o < -1, y se realizó GSEA con la relación señal-ruido según los parámetros predeterminados.

Inmunoblotting

Se realizó el inmunoblotting según el protocolo establecido ^[97]. Brevemente, se utilizó un tampón de lisis de radioinmunoprecipitación (RIPA) con el conjunto de inhibidores de fosfatasas II (Calbiochem) y el inhibidor de proteasas (VWR) para preparar los lisados proteicos de células enteras. Se realizó la cuantificación de proteínas utilizando BCA, y las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE seguido del traslado a una membrana de PVDF (GE Healthcare). A continuación, la membrana se incubó con un 5% de leche seca descremada en tampón salino con Tween-20 al 0,1% (TBS-T) durante una hora a temperatura ambiente. Se proporcionó la exposición del anticuerpo a las diluciones respectivas en TBS-T que contiene un 2% de leche seca descremada: 1:1000 de DKC1 (CST, 53234), Caspasa-3 (CST, 9662), PARP escindida (CST, 9541), γH2AX (CST, 9718), SOX2 (Abcam, ab97959), SGPP2 (Thermo Fisher Scientific, PA5-42767), β-catenina fosforilada (CST, 4176), Histona-3 (CST, 14269), α-tubulina (Abcam, Ab-7291), Bcl-xL (CST, 2764S), CD44 (CST, 3570S), Lamina A (Abcam, Ab-26300), 1:3000 de β-catenina (CST, D10A8) y 1:5000 de β-actina (Abcam, ab6276) seguido de una incubación durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, se eliminó el anticuerpo y se lavó la membrana con TBS-T al 0,1% e incubó durante 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario respectivo anti-ratón o anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Cat # 115-035-003 y Cat # 111-035-144). De nuevo, se lavó la membrana con TBS-T al 0,1% y se capturó la señal utilizando un sistema de quimioluminiscencia mejorada (Thermo Fisher Scientific).

Ensayo de proliferación celular

Se sembraron líneas celulares isogénicas de control shSCRM y shDKC1 para SW620, células WiDr (2 × 103) y Colo320HSR (1 × 103) en una placa de 96 pocillos, y se realizó un ensayo de proliferación. El medio se reponía cada dos días. Se añadió resazurina o WST-1 a las células y se midió la intensidad de la fluorescencia en los puntos temporales indicados a 530-590 nm de excitación-emisión utilizando el lector de microplacas SpectraMax® Mini Multi-Mode. Se representó gráficamente la tasa de proliferación celular relativa. Para los experimentos con el inhibidor de WNT, se suplementó el medio con XAV939 (MedChemExpress, HY-15147) y se reemplazó cada 24 h. Para el experimento de silenciamiento de DKC1 inducido por doxiciclina, las células shSCRM y shDKC1 SW620 se pretrataron con doxiciclina (MedChemExpress, HY-N0565B; 1,5 μg/mL) y se sembraron en un plato de cultivo de 96 pocillos. Se realizó la privación de suero de las células durante 4-6 h antes del tratamiento con dox. Después de 24 h, se repitió el tratamiento y se recolectaron las células 48 h después de la inducción inicial. Se extrajo el ARN y las proteínas de las células inducidas con Dox para confirmar el silenciamiento de DKC1. Para el ensayo de proliferación de shSCRM y shDKC1 HCT116-(5-FU + Ox), se sembraron 2 × 103 células por pocillo en un plato de cultivo de 96 pocillos. Se utilizó el método mencionado anteriormente para los ensayos de proliferación.

Citometría de flujo

Para el análisis del ciclo celular, se lavaron 1 × 106 células con PBS y se fijaron con etanol al 70%. Posteriormente, se tiñeron con yoduro de propidio (BioLegend, Cat # 421301) según el protocolo del fabricante antes de la adquisición. Se evaluó la distribución del ciclo celular utilizando un modelo univariado incorporado del software FlowJo. La estrategia de selección se proporciona en la Figura Suplementaria 11. El experimento de citometría de flujo se realizó en el citómetro de flujo BD Accuri™ C6 Plus y los datos adquiridos se analizaron utilizando FlowJo v.10.6.1.

Inmunofluorescencia

Se sembraron 2 × 104 células por cubierta por pocillo de platos de cultivo de células de 4 pocillos. Al día siguiente, se lavaron las células con tampón fosfato (PBS) y se fijaron con formaldehído al 4% en la oscuridad. Después de la fijación, se lavaron las células, se permeabilizaron utilizando Triton X-100 al 0,3% en PBS y se lavaron con PBS que contiene Tween-20 al 0,1% (PBS-T). Posteriormente, se utilizó suero normal de cabra (NGS) al 5% en PBS-T para el enmascaramiento y se eliminó una hora después, seguido del lavado con PBS-T. Se diluyeron los anticuerpos contra DKC1 (Thermo Fisher Scientific, PA5-28922), SGPP2 (Thermo Fisher Scientific, PA5-42767), γH2AX (Santacruz, sc517348) (1:50) en NGS al 2% en PBS-T y se incubaron las células en él durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se eliminó el anticuerpo primario y se lavaron las células con PBS-T para eliminar el anticuerpo no unido específicamente. A continuación, se incubaron las células durante 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa-fluor-555 contra la cadena pesada del ratón (dilución 1:600) en NGS al 2% en PBS-T. A continuación, se lavó el anticuerpo secundario con PBS-T y se incubaron las células con el colorante de tinción nuclear de Hoechst (5 μg/mL) durante 45 minutos. Se lavaron las células y se montaron las cubiertas en portaobjetos (Vectashield) seguido de la obtención de imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia Carl Zeiss Axio Z1 observer con un dispositivo Apotome adjunto.

Ensayo de esferoides tumorales

Se realizó un ensayo de esferoides tumorales según el protocolo descrito anteriormente^[98]. Brevemente, las células se sembraron en una placa de cultivo con ultra baja adherencia (Corning) a una densidad de 1,5 × 104 células por pocillo y se cultivaron en medio DMEM-F12 sin suero, suplementado con factores de crecimiento (EGF y FGF), insulina y B-27 (todos de Thermo Fisher Scientific). Se permitió que las células crecieran y los esferoides formados se desintegraron mediante pipeteo cada tres días. El experimento se finalizó después de tres semanas, y se contaron los esferoides y se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de campo claro (Leica). El diámetro (d) de los esferoides se cuantificó utilizando ImageJ, y el área de la superficie se calculó utilizando la fórmula πd2. Después de la adquisición de imágenes, se aisló el ARN de estos esferoides tumorales para la cuantificación de los marcadores de troncalidad.

Ensayo de quimiosensibilidad

Las células de control SW620 (shSCRM) y las células con la expresión de DKC1 reducida (shDKC1) se sembraron (5 × 103) en una placa de 96 pocillos. Las células se trataron con 5-Fluorouracilo (MedChemExpress, HY-90006) en un rango de 400 μM a 0,39 μM, durante 48 h. Para las líneas celulares HCT116 parentales y sus derivados resistentes a la quimioterapia, se sembraron (3 × 103 por pocillo). El tratamiento se realizó durante un máximo de 3 días con concentraciones variables de 0,1 μM de pirazofurina (MedChemExpress, HY-122502) y 10 μM de XAV939, solos o en combinación. El medio que contenía el fármaco se reponía después de 48 horas. Las células de control SCRM y las células HCT116 con la expresión de DKC1 silenciada (5-FU + Ox)R se sembraron a una densidad de 3 × 103 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se trataron con 5-FU, oxaliplatino (MedChemExpress, HY-17371) y la combinación (5-FU + oxaliplatino) a concentraciones variables que oscilan entre 0,1 μM y 10 μM. El medio que contenía el fármaco se reponía cada dos días y el experimento se finalizó después de 96 h de tratamiento. Al final del experimento, se añadió resazurina y se midió la intensidad de la fluorescencia a 530–590 nm de excitación y emisión utilizando el lector de fluorescencia Synergy Z4 (Biotek). Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 7.0 y se calcularon los valores de IC50 de los fármacos en las líneas celulares mediante el método de regresión no lineal.

Ensayo de formación de focos

Para el ensayo de formación de focos, se sembraron 2 × 103 células en placas de cultivo de seis pocillos en medios de cultivo específicos para cada línea celular, suplementados con un 2% de suero fetal bovino inactivado por calor (Thermo Fisher Scientific) y se incubaron a 37 °C. El medio se cambió en días alternos. Para evaluar el efecto del inhibidor de WNT sobre la capacidad de formación de focos, se utilizó un medio suplementado con XAV939 y se reemplazó en días alternos. El ensayo se finalizó después de 10 días, y la placa de cultivo que contenía los focos se tiñó con solución de cristal violeta (0,05% p/v). Para la cuantificación, los focos se destiñeron utilizando una solución de ácido acético glacial al 10% y se midió la absorbancia a 550 nm.

Estudios de xenoinjerto en ratones

Los ratones NOD.CB17-Prkdcscid/J (NOD/SCID) se compraron comercialmente en Jackson Laboratory (RRID:IMSRJAX:001303) y los ratones NU-Foxn1_nu atímicos se compraron comercialmente en Hylasco Biotechnology (India) Pvt. Ltd. (licenciatario de Charles River Laboratory). El experimento se realizó según el procedimiento estándar y se siguieron estrictamente las directrices del Comité para el Control y la Supervisión de Experimentos con Animales (CPCSEA). Se mantuvieron estrictamente los estándares regulatorios del Comité de Ética Animal de la Indian Institute of Technology Kanpur durante el experimento, incluido un máximo de carga tumoral de menos de 1500 mm3. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (2,5 mg/kg). Para la evaluación in vivo de la reducción constitutiva de DKC1, se trataron con tripsina las células SW620 shSCRM de control, shDKC1-2 y shDKC1-3, y se resuspendieron 1,5 × 106 células en 100 μL de solución salina al 0,9% que contenía un 15% de Matrigel y se implantaron por vía subcutánea en los flancos de ratones NOD/SCID macho de 4 a 6 semanas de edad (N = 6 para cada tipo). Para el silenciamiento in vivo temporal de DKC1 en los xenoinjertos de ratones, se utilizaron las células SW620 shSCRM y shDKC1 inducibles por doxiciclina. Brevemente, se resuspendieron 1,5 × 106 células en 100 μL de solución salina al 0,9% que contenía un 30% de Matrigel para la implantación subcutánea en los flancos de ratones NU-Foxn1nu atímicos hembra de 4 a 6 semanas de edad. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 40 mm3, se aleatorizaron los ratones (N = 5 por grupo) y se trataron con vehículo de control o doxiciclina (MedChemExpress, HY-N0565B) durante el período de tratamiento. La doxiciclina (10 mg/kg) se disolvió en una solución vehículo que contenía un 30% de PEG300, un 5% de Tween-80 y se administró cada tres días por vía intraperitoneal. Para mantener una inducción sostenida del transgen, se suplementó la doxiciclina (2 mg/mL) con un 5% de sacarosa en el agua de beber y se reponía cada 5 días durante la duración del estudio.

Para comprobar la quimiorresistencia mediada por DKC1 en el modelo de ratones, se implantaron por vía subcutánea las células HCT116-(5-FU + Ox)R shSCRM y shDKC1 (2 × 106) en ratones NOD/SCID macho y hembra de 6 a 8 semanas de edad, como se describió anteriormente. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm3, se aleatorizaron los ratones (N = 5 por grupo) y se trataron con vehículo de control o una combinación de 5-FU (MedChemExpress, Cat#HY-90006) y oxaliplatino (MedChemExpress, Cat#HY-17371). Los fármacos se resuspendieron en una solución vehículo que contenía un 30% de PEG300 y un 5% de Tween-80. Los ratones se trataron con 5-FU (30 mg/kg) dos veces por semana y oxaliplatino (2,5 mg/kg) una vez por semana por vía intraperitoneal.

Para el direccionamiento dual de DKC1 y la señalización de WNT en la línea celular resistente a FOLFOX, se implantaron las células HCT116-(5-FU+Ox)R en ratones CD1 Nude macho de 6 a 8 semanas de edad (Crl: CD1-Foxn1nu) como se describió^[99]. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 50 mm3, se aleatorizaron los ratones en cuatro grupos (N = 6 por grupo) y se trataron con vehículo de control, pirazofurina (1 mg/kg), XAV939 (10 mg/kg) o la combinación (pirazofurina + XAV939). Ambos fármacos se administraron dos veces por semana por vía intraperitoneal durante todo el período de tratamiento. Para todos los experimentos, se monitorizó la carga tumoral cada dos días utilizando un calibre digital Vernier. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: (π/6) (L × W2), (L = longitud; W = anchura). Todos los ratones utilizados en el estudio se alojaron en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) según las directrices institucionales. La temperatura ambiente de la sala de los ratones se mantuvo entre 20 y 24 °C con una humedad de aproximadamente 40-60% y un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.

Tinción por inmunohistoquímica

Los tumores se fijaron primero en formaldehído tamponado al 10%, se incluyeron en parafina y se obtuvieron cortes de 3 μm utilizando un micrótomo (Leica). Los cortes de xenoinjertos tumorales se incubaron a 60 °C durante 2 h, seguidos de la recuperación del antígeno en un instrumento PT Link (Agilent DAKO, PT200) utilizando la solución de recuperación del antígeno EnVision FLEX, pH alto (Agilent DAKO, K800421-2) para los cortes de DKC1 y la solución de recuperación del antígeno EnVision FLEX, pH bajo (Agilent DAKO, K800521-2) para los cortes de Ki67. Se utilizó 1X de tampón de lavado EnVision FLEX (Agilent DAKO, K800721-2) para lavar los cortes, seguido del tratamiento con Peroxidazed 1 (Biocare Medical, PX968M) y Background Punisher (Biocare Medical, BP974L) durante 5 min y 10 min respectivamente, con lavado después de cada paso. La tinción inmunológica se realizó utilizando anticuerpos contra DKC1 (Abcam, ab156877; Thermo Fisher Scientific, PA5-28922), SGPP2 (Thermo Fisher Scientific, PA5-42767), Ki67 (clon MIB-1, DAKO M7240) y Caspase-3 (CST, 9662) durante la noche a 4 °C. Posteriormente, se lavaron los cortes e incubaron en Mach2 Doublestain 1 (cortes de DKC1) (Biocare Medical, MRCT523L) o Mach2 Doublestain 2 (cortes de Ki67) (Biocare Medical, MRCT525L) durante 30 min a temperatura ambiente, se enjuagaron en 3 veces con tampón de lavado 1X EnVision y se trataron con una solución de Betazoid DAB (Biocare Medical, BDB2004H) durante 5 min. A continuación, se enjuagaron los cortes en agua destilada y se trataron con EnVision FLEX Hematoxylin (Agilent DAKO, K800821-2). Después de enjuagar en agua del grifo, se secaron completamente los cortes y luego se deshidrataron utilizando xileno. Se añadió EcoMount (Biocare Medical, EM897L) a cada corte, que luego se montó con portaobjetos.

La cuantificación se realizó calculando la densidad integrada para 15 campos histológicos aleatorios utilizando el complemento IHC Toolbox del software ImageJ. Para la cuantificación de los núcleos positivos para Ki67, se calculó la relación de núcleos positivos para Ki67 con el total de núcleos para 10-15 campos histológicos aleatorios utilizando la deconvolución de color H&DAB de Fiji o el módulo en línea Ki-67 de ImageJS^[100].

Los cortes de microarreglo de tejido de pacientes (TMA) (CO1502, Tissuearray.com LLC) se sometieron a tinción inmunohistoquímica según el protocolo mencionado. Excepto por la inmunohistoquímica de SGPP2, donde el corte de TMA se incubó con un anticuerpo contra SGPP2 (Thermo Fisher Scientific, PA5-42767) durante la noche a 4 °C. El corte de SGPP2 se lavó e incubó en Mach2 Doublestain 1 durante 30 min a temperatura ambiente. Para la tinción de DKC1 del TMA, se siguió el mismo protocolo que se mencionó anteriormente.

Análisis in silico para la clasificación CMS

Los datos de recuento de RNA-seq para las muestras de COADREAD se obtuvieron de TCGA a través del portal GDC utilizando el paquete R TCGA biolinks. Los recuentos brutos se normalizaron a recuentos log2 por millón (log2 CPM) con un pseudorecuento de 1 añadido para evitar problemas de transformación logarítmica. La firma de genes del subtipo CMS se definió basándose en la clasificación publicada por Guinney et al. ^[15]. Se definieron cuatro subtipos CMS (CMS1-4) utilizando conjuntos de genes representativos ampliados a aproximadamente 20-25 genes por subtipo para capturar los procesos biológicos clave relevantes para cada clase molecular. Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única (ssGSEA) en la matriz de expresión normalizada utilizando el paquete R GSVA, calculando las puntuaciones de enriquecimiento para cada firma de genes CMS por muestra. A cada muestra se le asignó un subtipo CMS correspondiente al conjunto de genes con la puntuación de enriquecimiento más alta. Los pacientes con alta y baja expresión de DKC1 se sometieron a un análisis de variación de conjuntos de genes (GSVA) para las firmas CMS reguladas al alza y a la baja derivadas de la clasificación CMS^[15] o una firma más pequeña propuesta para la misma como 'ColoType'^[38]. Para el análisis de datos de proteómica, se utilizaron los datos de proteómica CPTAC para el cáncer colorrectal para evaluar diferentes parámetros.

Análisis de datos de expresión de una sola célula

Las matrices de expresión de una sola célula y los metadatos se descargaron de los conjuntos de datos GEO GSE132465 y GSE144735. Los datos de expresión normalizados y los metadatos se combinaron en un objeto anndata utilizando Scanpy. Se realizó un análisis y visualizaciones adicionales, como gráficos de puntos, utilizando las funciones de Scanpy. Los metadatos de los tres conjuntos de datos independientes GSE132465, GSE144735 y GSE200997 se descargaron de GEO. Los datos de recuento y los metadatos se utilizaron para crear los tres objetos Seurat para los tres conjuntos de datos, respectivamente. Utilizando un enfoque de suma de agregados, los recuentos de células individuales en los objetos Seurat se agregaron para formar Pseudo Bulk. Se utilizó la función nativa AggregateExpression de Seurat para crear las muestras Pseudo Bulk. Los datos de recuento y los metadatos exportados de Pseudobulks se utilizaron para crear tres conjuntos de datos DESeq2 independientes. Se realizó un metaanálisis utilizando un script personalizado basado en el paquete metafor. Los gráficos de bosque se crearon utilizando ggplot2.

Transfección con siRNA

Las células se sembraron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 50% en placas de seis pocillos y se transfectaron con 30 pmol de siRNA contra CTNNB1 (siCTNNB1) o siRNA no dirigido (siNT) (Dharmacon; Cat#D-001810-10-05) utilizando el reactivo de transfección de siRNA XtremeGENE™ (Roche, Merck) según las instrucciones del fabricante (para SW620, se utilizaron 150 pmol de siRNA). Las células se transfectaron de nuevo después de 24 h, y la proteína o el ARN se aislaron 36 h después de la segunda transfección y se analizaron mediante qPCR e inmunoblotting como se mencionó anteriormente.

Estimulación con WNT3A

Se recolectó el medio acondicionado con WNT3A según las recomendaciones de ATCC. Brevemente, las células L-Wnt-3A o las células de control LM se sembraron a una confluencia de aproximadamente 50-60%, y se recolectaron dos lotes del medio acondicionado en el cuarto y séptimo día, se procesaron y se almacenaron a 4 °C. Las células murinas colónicas benignas y los organoides objetivo se privaron de suero durante 4-6 horas, seguido de la suplementación con un 50% de medio acondicionado. El medio se reemplazó cada 24 horas y el experimento se finalizó después de 60 horas desde el inicio del tratamiento. Las células se recolectaron y se realizó un ensayo de inmunoblot para confirmar la estimulación de la señalización.

Fraccionamiento nuclear y citoplasmático

El fraccionamiento subcelular de la línea celular y los organoides derivados del paciente se realizó según el protocolo del fabricante del kit de extracción nuclear y citoplasmática NE-PER (Thermo Fisher Scientific, 78833). Brevemente, las células se trataron con tripsina, se lavaron con PBS enfriado y se centrifugaron a 500 × g durante 5 minutos. Luego, el sedimento celular se incubó en un tampón CER I y CER II enfriados (proporcionados con el kit), se agitó vigorosamente y se centrifugó. El sobrenadante se recolectó en un tubo nuevo y se utilizó como fracción citosólica. El sedimento restante se resuspendió en un tampón NER enfriado, se agitó vigorosamente de forma intermitente (pulsos de 15 segundos) durante 40 minutos. Luego, el homogeneizado se centrifugó a 16000 × g durante 10 minutos a 4 °C, y se utilizó la fracción nuclear.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Los niveles de esfingosina-1-fosfato se midieron utilizando ELISA según las instrucciones del fabricante (kit ELISA universal para esfingosina-1-fosfato, fabricante: ImmunoTag, G bioscience, ITLK09484). Brevemente, las células en placas de 100 mm se lisaron utilizando un tampón que contenía 1% de Triton X-100, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1 mM de Na3VO4, 10 mM de HEPES (pH 7,5) junto con inhibidores de proteasas y fosfatasas. La lisis fue seguida por centrifugación a 15000 × g a 4 °C durante 10 minutos. El sobrenadante se recolectó y se estimó la cantidad de proteína utilizando el ensayo de ácido bicinquinónico, y se incubó en placas de 96 pocillos pre-recubiertas con anticuerpo contra S1P, seguido de la incubación con anticuerpo biotinilado. A continuación, se utilizó la solución de Streptavidina-HRP, seguida del sustrato TMB. La reacción se detuvo utilizando la solución de detención y se midió la absorbancia a 450 nm. Los niveles de S1P normalizados a la expresión de proteínas se utilizaron para la evaluación final. Para la ceramida C24, se realizó un ELISA indirecto siguiendo el protocolo estándar de Abcam. La ceramida C24 (Sigma-Aldrich-860524P) se recubrió en los pocillos durante la noche. Se estableció una curva estándar utilizando una dilución en serie del antígeno de ceramida C24, comenzando desde 1 mM. Los sobrenadantes celulares se procesaron utilizando el método de Folch ^[101] para el enriquecimiento de lípidos, que luego se utilizaron para recubrir placas de 96 pocillos. Se estableció una curva estándar utilizando una dilución en serie del antígeno de ceramida C24, comenzando desde 1 mM. Para el experimento in vitro, se utilizaron los lípidos enriquecidos de las células lisadas shSCRM y shDKC1 para recubrir los pocillos. Se utilizó el anticuerpo monoclonal contra ceramida (C8104) como anticuerpo primario a una concentración de 1:100. Se utilizó el anticuerpo secundario anti-ratón a una concentración de 1:1000. Para el experimento in vivo, los tejidos tumorales de los ratones se disociaron mecánicamente y se homogeneizaron utilizando Qiagen TissueLyser, y luego se extrajeron los lisados.

Análisis de datos de secuenciación ChIP

Se utilizaron datos de secuenciación ChIP disponibles públicamente (GSE31477) para TCF7L2 en células HCT116 para explorar la regulación de DKC1 bajo el control de la señalización de WNT. Se realizó una evaluación de calidad de las lecturas simples originales utilizando FASTQC, se recortaron con FASTQ Trimmer, con la configuración predeterminada de la plataforma web Galaxy (usegalaxy.org). Las lecturas se alinearon al genoma de referencia (hg19) utilizando Bowtie para generar archivos de alineación de secuencia/mapa (SAM). Las lecturas no alineadas o no mapeadas se filtraron utilizando FilterSAM, una utilidad de SAMtools. Los archivos SAM se convirtieron a sus archivos de alineación binaria/mapa (BAM) utilizando SAMtools. Además, los picos de secuenciación ChIP para RNA PolII y TCF7L2 se identificaron utilizando el análisis basado en modelos de secuenciación ChIP (MACS; P < 10−5) con la configuración predeterminada contra Input. Los archivos BAM y BED obtenidos se visualizaron mediante el Navegador de Genoma Integrativo (IGB).

Inmunoprecipitación

Las células SW620 se cultivaron en una placa de 100 mm y se recolectaron al alcanzar una confluencia del 90%; las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron con tampón de lisis frío que contenía NP-40 (2%, ab142227, Abcam), Triton X-100 (2%), NaCl (100 mM), Tris-Cl (50 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM), 1X inhibidor de proteasas (Genetix) y 1X inhibidor de fosfatasas (524625, Millipore) y se mantuvieron a 4 °C en un agitador rotatorio durante 1 hora, se centrifugaron a 15000 × g, 4 °C durante 10 minutos. El sobrenadante se incubó con 4 µg de DKC1 primario (Santacruz, sc-373956-X, anticuerpo monoclonal de ratón) o anticuerpo de control isotípico (IgG de ratón, Thermo Fisher Scientific, 10400C) a 4 °C durante la noche. Simultáneamente, las cuentas de agarosa recubiertas con proteína A/G (SantaCruz, sc-2003) se bloquearon con albúmina sérica bovina (HiMedia) seguida de la incubación a 4 °C durante la noche. Las cuentas bloqueadas se incubaron durante 24 horas a 4 °C con el lisado para formar conjugados anticuerpo-cuenta. A continuación, estos conjugados se lavaron y el inmunocomplejo se eluyó utilizando un tampón de elución (2X tampón que contiene SDS). Para el inmunoblot, se utilizaron anticuerpos secundarios anti-ratón o Veriblot (Abcam, ab131366).

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Los experimentos de ChIP se realizaron como se describió previamente ^[102]. Brevemente, las células SW620 o las células SW620 de control revuelto y las células con expresión reducida de DKC1 se sembraron en una placa de cultivo de 100 mm y se recolectaron al alcanzar una confluencia del 90%. Primero, las células se fijaron con 1% de formaldehído durante 10 minutos, se apagó la reacción con 125 mM de glicina, se lavaron con PBS y se lisaron utilizando un tampón de lisis que contenía 1% de SDS, Tris-Cl (50 mM, pH 8,0), EDTA (10 mM) y 1X inhibidor de proteasas (Genetix) seguido de la fragmentación del ADN mediante sonicación a una longitud de fragmento promedio de ~ 500 pb utilizando Bioruptor (Diagenode) y la cromatina fragmentada se incubó a 4 °C durante la noche con 4 µg de β-catenina primaria (CST, D10A8) o SOX2 (Abcam, ab97959), o anticuerpos de control isotípico (IgG de conejo, Thermo Fisher Scientific, 10500C). Concomitantemente, las cuentas Dynabead recubiertas con proteína G (Thermo Fisher Scientific) se bloquearon con albúmina sérica bovina (HiMedia) y ADN de esperma de salmón fragmentado (Sigma-Aldrich), seguido de la incubación a 4 °C durante la noche. Las cuentas bloqueadas se incubaron durante 8 horas a 4 °C con el lisado para formar conjugados anticuerpo-cuenta. A continuación, estos conjugados se lavaron y el inmunocomplejo se eluyó utilizando un tampón de elución [1% de SDS, 100 mM de NaHCO3, proteinasa K (Sigma-Aldrich) y RNasa A (500 µg/ml cada una) (Sigma-Aldrich)]. Se utilizó el método de extracción de fenol-cloroformo-isoamil alcohol para aislar el ADN del inmunocomplejo. Se utilizaron los programas JASPAR y MatInspector para predecir los sitios de unión para el complejo β-catenina/TCF en el promotor de DKC1 o SOX2 en el promotor de SGPP2.

Análisis de lípidos (lipidomics)

Para analizar los perfiles lipídicos globales, se homogeneizaron las muestras de tumor de los pacientes en una solución de bicarbonato de amonio de 150 mM en una relación de 1:10 (p/v, mg/µL) con un sistema TissueLyser, 2 ciclos durante 2 minutos a 28 Hz a 4 °C con una cuenta de acero inoxidable de 5 mm, seguido de sonicación para la lisis. Después de esto, se tomaron 200 µL de cada homogeneizado de tejido, se añadió metanol de grado UHPLC en una relación de 1:5 (v/v, µL/µL) y se congeló rápidamente utilizando nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. De manera similar, para las células de control SW620 y las células con expresión reducida de DKC1, se utilizaron aproximadamente 15 millones de células por triplicado. Las células se desprendieron utilizando tripsina, se neutralizó y se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en bicarbonato de amonio de 150 mM. A continuación, se realizó la lisis mediante sonicación y se estimó la concentración de proteína directamente para cada homogeneizado utilizando el método BCA. Las células se centrifugaron nuevamente y se eliminó el sobrenadante, se fijó con 100 µl de 100% de MeOH, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó inmediatamente a -80 °C. Las muestras se enviaron al Incubador de Lipidómica de Singapur, Universidad Nacional de Singapur, donde se procesaron posteriormente para el análisis posterior.

Brevemente, se añadieron 100 µl de butanol enfriado que contenía estándares internos a las muestras, se agitaron vigorosamente durante 2 minutos, se agitaron y se sonicaron a 4 °C durante 30 minutos, respectivamente. Los lisados se centrifugaron dos veces a 18000 g, 4 °C durante 10 minutos, y se recolectó el sobrenadante (BuMe) para el análisis de LC-MS. Para UHPLC: Fase móvil A: 40% de acetonitrilo + 60% de agua + 10 mM de formiato de amonio, y Fase móvil B: 10% de acetonitrilo + 90% de isopropanol + 10 mM de formiato de amonio con Columna: Poroshell 120 C18 (2,1 × 50 mm, 1,9 µm) se utilizaron a una temperatura de columna de 40 °C. La información del gradiente de LC se proporciona en la Tabla Suplementaria 1.

El voltaje de pulverización de ionización positiva y el voltaje de la boquilla se establecieron en 3000 V y 1000 V, respectivamente. Las temperaturas del gas de secado y el gas de la vaina se mantuvieron en 250 °C. Las velocidades de flujo del gas de secado y el gas de la vaina fueron de 14 L/min y 11 L/min, respectivamente. La velocidad de flujo de nitrógeno de la boquilla nebulizadora se estableció en 35 psi. El RF de iFunnel de alta y baja presión fue de 150 V y 60 V, respectivamente. Los datos de cuantificación se extrajeron utilizando el software de análisis cuantitativo Agilent MassHunter (QQQ). Los datos se revisaron manualmente para garantizar que el software integrara los picos correctos.

El filtrado de control de calidad se basa en las áreas de pico brutas para todas las especies lipídicas medidas utilizando las muestras de control de calidad (TQC) agrupadas. Los criterios de filtrado fueron los siguientes:

Baja variación de la señal (CV < 20%);

Alta relación muestra/blanco (> 10);

Buena linealidad de la señal (R2 > 0,8).

Las especies lipídicas que no superaron el filtrado de control de calidad se marcaron como "FALLADO" y se excluyeron del análisis posterior.

Utilizando estándares específicos de la clase de lípidos, la concentración relativa de un analito en la muestra se calcula como se muestra en la ecuación (1): cAnalito: Concentración molar [M o µmol/µL] del analito en la muestra,

AreaAnalito: Área de pico del analito,

AreaISTD: Área de pico del ISTD,

VISTD mix: Volumen del disolvente de extracción (mezcla ISTD)

Cantidad de muestra: Cantidad de la muestra (por ejemplo, µL o mg)

cISTD: Concentración del ISTD en el disolvente de extracción (mezcla ISTD)

Análisis multivariado para la significación estadística

La tasa de descubrimiento falso para los datos de lipidómica se calculó utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg (BH) aplicado a la lista de valores p brutos clasificados. Para garantizar una monotonicidad válida, se aplicó una corrección de mínimo acumulativo. Se realizaron el análisis de componentes principales (PCA) y el análisis discriminante de proyecciones ortogonales de estructuras latentes (OPLSDA), que proporcionan puntuaciones de importancia en la proyección (VIP) para las especies lipídicas desreguladas utilizando el módulo "Análisis estadístico (un factor)" de Metaboanalyst v5.0 ^[103].

Análisis de vías integrativo

Los genes y lípidos diferenciales obtenidos del análisis de RNAseq y UHPLC-MS/MS para las células de control revuelto y las células con expresión reducida de DKC1 se sometieron al módulo de análisis de vías conjuntas de Metaboanalyst v5.0 ^[103]. Se realizó un análisis de enriquecimiento utilizando una prueba hipergeométrica, y la centralidad de grado se utilizó como medida de topología para combinar las consultas. El análisis se realizó para identificar las vías metabólicas afectadas de manera significativa.

Análisis de biomarcadores

El perfil lipídico de los tumores de pacientes con CRC se utilizó para identificar biomarcadores utilizando el módulo de análisis de biomarcadores de Metaboanalyst v5.0 ^[103]. Los datos se escalaron de Pareto para la normalización. Se realizó un análisis univariado clásico para generar una curva de características operativas del receptor (ROC) y calcular el área bajo la curva para diferentes ceramidas. Se utilizó el módulo de evaluación del modelo basado en la curva ROC (Tester) para evaluar la eficacia de las ceramidas propuestas como biomarcadores para los tumores DKC1-altos.

Detección de especies reactivas de oxígeno y actividad mitocondrial

Se realizó una tinción fluorescente basada en colorantes utilizando DHE (Thermo Fisher Scientific, D11347) y Mitotracker (Thermo Fisher Scientific, M22425) para detectar la presencia de ROS y mitocondrias, respectivamente, dentro de las células. Brevemente, se sembraron y cultivaron aproximadamente 2,5 x 10^4 células sobre una cubierta en una placa de cultivo de 4 pocillos. Una vez que las células alcanzan la confluencia y adquieren su morfología nativa, se retiró el medio y las cubiertas se enjuagaron suavemente con PBS 1X. Se añadieron los colorantes DHE y Mitotracker a una dilución de 1:4000 y 1:2000, respectivamente. Las células teñidas se incubaron luego a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad, se eliminó el colorante residual lavando con PBS 1X y las cubiertas se montaron en un portaobjetos utilizando el medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories). Se adquirieron imágenes utilizando un microscopio confocal (Leica-SP5). Para la cuantificación, se cuantificó la intensidad media de fluorescencia (IMF) utilizando el software ImageJ.

Generación de una línea celular HCT116 resistente a la quimioterapia

Las células resistentes a la quimioterapia se generaron como se describió previamente ^[99]. Brevemente, el día 0, las células HCT116 se sometieron a una dosis IC90 (que causa una inhibición del 90%) de los regímenes de tratamiento 5-FU, 5-FU + Iri (FOLFIRI) o 5-FU + Oxa (FOLFOX), respectivamente. El fármaco se reponía cada tres días hasta el día 9 para seleccionar las células resistentes a la quimioterapia. Luego, se permitió que las células se expandieran clonalmente en un medio libre de fármacos. El día 18, se determinaron los valores de IC50 para confirmar la resistencia a la quimioterapia.

Organoides derivados de pacientes (PDO)

Los organoides derivados de pacientes se establecieron utilizando biopsias de CRC obtenidas de pacientes indios inscritos en ACTREC, TMC, Mumbai, utilizando protocolos descritos previamente ^[104]. Brevemente, se recogieron los organoides maduros en un tubo T15 utilizando puntas de corte y se centrifugaron a baja velocidad (100-200 x g) durante 5 minutos. El precipitado se resuspendió en 500 μl de medio completo por pocillo de una placa de seis pocillos. Un pocillo de una placa de 96 pocillos se dividió en cuadrantes. Se añadieron 50 μl de la suspensión de PDO a los pocillos. Los organoides se observaron bajo el microscopio y se contaron cuidadosamente. La concentración de organoides se calculó dividiendo el recuento por el volumen utilizado. El recuento total de esferas se calculó multiplicando la concentración por el volumen total.

Tratamiento farmacológico de los PDO

Se realizó un cribado farmacológico tridimensional de los PDO como se describió ^[104]. Brevemente, se contaron y recogieron los organoides maduros según el procedimiento indicado anteriormente. Se sembraron 200 organoides por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos, cada una de las cuales contenía una capa base sólida de 20 μl de Matrigel y se añadió 90 μl del medio de PDO con un 5% (en volumen) de Matrigel. En una placa de 96 pocillos separada, se sembraron 16 pocillos de manera similar para generar controles de siembra del día 0 y se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche. Para la placa de control, se añadieron 90 μl del medio de cultivo y se analizaron con Cell Titer Glo 3D (CTG-3D) para generar un valor de control de siembra en el momento de la dosificación. Se preparó una placa de fármacos separada con una dilución serial de ocho puntos de 90 μl de cada condición en cuadruplicado técnico, y se sembró en una placa de 96 pocillos. Las placas de PDO tratadas se incubaron durante 96 horas (37 °C y 5% de CO2) y se analizaron con CTG-3D. Los valores de luminiscencia brutos de cada condición se normalizaron al valor de control de siembra del día 0. El índice de combinación se calculó utilizando el software CompuSyn 1.0, que utiliza el algoritmo de Chou y Talalay ^[105].

Análisis bioquímico de la sangre de los ratones

Al final del experimento, se anestesiaron los ratones y se recogió sangre mediante punción cardíaca en un tubo con activador de coágulos, seguido de centrifugación refrigerada a 1500 x g durante 15 minutos. Se recogió el sobrenadante que contenía suero y se sometió a un examen bioquímico para estudios de toxicidad hepática y renal utilizando Siemens Dimension® EXL™ 200.

Estadísticas y reproducibilidad

Se utilizó GraphPad Prism 7.0 para el análisis estadístico. Para todas las comparaciones, se utilizaron pruebas t de Student de dos colas o ANOVA de una vía, a menos que se indique lo contrario en las respectivas figuras. Los valores de FDR y p inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Resumen de la presentación de resultados

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de la presentación de resultados de Nature Portfolio vinculado a este artículo.