El perfil de la microbiota residente en los tejidos en muestras de tejido normal, pólipos y cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) representa una importante carga para la salud a nivel mundial, ocupando el tercer lugar entre los cánceres más diagnosticados y siendo la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer, según las estimaciones de GLOBOCAN 2020^[1]. A pesar de las mejoras terapéuticas, el CCR sigue teniendo una alta tasa de mortalidad, lo que subraya la urgente necesidad de comprender los mecanismos biológicos que inician y sostienen el desarrollo tumoral.

Más allá de los factores de riesgo convencionales, que incluyen la predisposición genética, las modificaciones epigenéticas y las alteraciones del microambiente estromal, la microbiota intestinal ha surgido como un mediador crítico de la susceptibilidad y la progresión del CCR. La evidencia creciente sugiere que la microbiota intestinal influye en la tumorigénesis colorrectal a través de mecanismos multifacéticos, como la producción de metabolitos microbianos, la modulación intrincada del sistema inmunitario y las interacciones directas con el epitelio^[2]–^[7]. Además de la microbiota intestinal, los descubrimientos recientes de la microbiota residente en los tejidos (MRT), definida como comunidades bacterianas que establecen una colonización estable dentro de los tejidos del huésped, han abierto nuevas vías para comprender la tumorigénesis colorrectal. A diferencia de la microbiota luminal, la MRT establece interacciones físicas directas con las células del huésped, lo que sugiere que puede desempeñar un papel más inmediato en la transformación epitelial^[8]–^[10]. Si bien los perfiles de la MRT se han relacionado con la progresión del cáncer en otras neoplasias, sus contribuciones específicas a la iniciación y la progresión del tumor colorrectal siguen siendo poco conocidas^[11]–^[14].

En este estudio, realizamos un análisis exhaustivo multi-cohorte del panorama de la MRT en 1134 muestras clínicas, que abarca mucosa normal, pólipos adenomatosos precancerosos y carcinomas invasivos. Utilizando la secuenciación de ARNr 16S preamplificada, junto con sofisticados algoritmos bioinformáticos, identificamos diferencias distintas en la composición de la comunidad microbiana entre estas categorías de tejidos. En particular, las diferencias en la MRT fueron más pronunciadas entre los grupos de diagnóstico, con una variación mínima en las etapas clínicas posteriores o en la supervivencia del paciente. Estos hallazgos definen los patrones tisulares de la composición de la MRT en los tejidos colorrectales y proporcionan una base para futuras investigaciones mecanicistas destinadas a comprender la relevancia biológica de la MRT en el cáncer colorrectal.

Resultados

El cáncer colorrectal se asocia con diferencias taxonómicas distintas en la MRT

Para perfilar sistemáticamente la MRT en el CCR, realizamos un estudio transversal utilizando muestras de tejido colorrectal y normal del Banco de Bioespecímenes del Hospital Sir Run Run Shaw de la Universidad de Zhejiang. Las características demográficas y clínicas de base de los participantes incluidos se resumen en las Tablas S1 y S2. Después del control de calidad, se retuvieron 1022 muestras, de las cuales 818 (182 normales, 68 pólipos, 568 CCR) se asignaron al conjunto de descubrimiento y 204 (45 normales, 17 pólipos, 142 CCR) al conjunto de validación.

Para caracterizar la MRT, empleamos un protocolo optimizado de secuenciación del gen ARNr 16S en el que la región V4 se preamplificó utilizando cebadores marcados con biotina, seguido de un enriquecimiento basado en cuentas de estreptavidina para mejorar la especificidad. Posteriormente, se realizó una secuenciación de alto rendimiento con estrictos controles de contaminación para garantizar la fiabilidad de los datos (Fig. 1A, B). Los ensayos basados en cultivos paralelos confirmaron la presencia de bacterias viables en los tejidos de control, pólipos y CCR (Fig. 1C). El análisis cuantitativo reveló un aumento estadísticamente significativo de la carga bacteriana en los tejidos de CCR en comparación con los tejidos normales y de pólipos, mientras que no se observó una diferencia significativa entre los tejidos normales y de pólipos (Fig. 1C).

Debido al número relativamente pequeño de muestras de pólipos, primero nos centramos en analizar las diferencias composicionales en la MRT entre los tejidos normales y de CCR. Realizamos análisis multivariados utilizando las distancias de Bray-Curtis. El análisis de coordenadas principales (PCoA) y el análisis de correspondencia atenuada (DCA) revelaron patrones de agrupación distintos que separaron los tejidos intestinales normales de las muestras de CCR a nivel de género (Fig. 1D, E). El perfilaje taxonómico demostró variaciones marcadas en la abundancia bacteriana entre los grupos (Fig. 1F). El análisis discriminante lineal del tamaño del efecto (LEfSe) identificó taxones bacterianos específicos que eran diferencialmente abundantes entre los tejidos normales y de CCR (puntuación del análisis discriminante lineal (LDA) > 2.0, valor q < 0.05; Fig. 1G). En particular, los tejidos normales mostraron un enriquecimiento de Pseudomonadaceae, lo que coincide con informes anteriores que destacan la capacidad supresora de tumores de Pseudomonas aeruginosa^[15],^[16]. En contraste, los tejidos de CCR mostraron un enriquecimiento de varios taxones bacterianos con un papel establecido en la promoción del desarrollo del CCR. Esto incluyó Fusobacterium specie^[17],^[18], especies de Bacteroides^[19] y especies de Enterobacteroides^[20],^[21]. En conjunto, estos hallazgos refuerzan la asociación establecida entre comunidades microbianas específicas y la tumorigénesis colorrectal, al tiempo que proporcionan nuevas perspectivas sobre sus patrones de distribución específicos de los tejidos.

Para distinguir la MRT de la microbiota luminal, comparamos los perfiles microbianos derivados de los tejidos con la microbiota fecal de pacientes con CCR agregados en siete conjuntos de datos públicos^[22]–^[28]. El análisis PCoA reveló una clara separación entre los microbiomas fecal y tisular (PERMANOVA, valor p < 0.001; Figura S1A), acompañado de diferencias significativas en la diversidad alfa (Fig. S1B) y la composición de los géneros dominantes (Fig. S1C). Los análisis de abundancia diferencial paralelos identificaron taxones parcialmente superpuestos pero débilmente correlacionados (ρ = 0.106, valor p = 0.451; Fig. S1D), lo que indica que la MRT representa comunidades microbianas distintas que no se capturan adecuadamente mediante el perfilado fecal.

La MRT muestra una asociación limitada con las características clínicas en el CCR

Si bien existen diferencias sustanciales entre la MRT en los tejidos normales y de CCR, su potencial para discriminar las características clínicas del CCR aún no se ha explorado. Para abordar esto, realizamos un análisis PCoA de la microbiota intratumoral estratificada por múltiples parámetros clínicos a nivel de género. Contrariamente a nuestras expectativas, las comunidades microbianas no mostraron una segregación significativa cuando se analizaron por edad, género, estado de diferenciación, etapas de clasificación de tumor, nódulo y metástasis (TNM), ubicación o estado de supervivencia (Fig. 2A–F). Observamos el mismo patrón después de controlar los factores de confusión interindividuales mediante el análisis de pares de muestras de tumor y tejido normal adyacente (Figuras S2A–F). Estos hallazgos indican que, si bien la composición de la MRT difiere fundamentalmente entre los tejidos normales y cancerosos, estas firmas microbianas no parecen reflejar la heterogeneidad clínica del CCR establecido.

Para investigar posibles asociaciones entre la MRT y las características clínicas, realizamos un análisis de agrupamiento jerárquico de la abundancia de géneros bacterianos en las características clínicas mencionadas anteriormente. El mapa de calor resultante reveló diversos patrones de abundancia de géneros bacterianos específicos en diferentes características clínicas, con algunos taxones que mostraron un enriquecimiento relativo en subgrupos particulares (Fig. 2G). Sin embargo, estas asociaciones no alcanzaron significación estadística, lo que confirmó que no existe una correlación sólida entre la MRT y las características clínicas en el CCR.

Para explorar aún más la relación entre la MRT y las características clínicas en el CCR, desarrollamos modelos de clasificación de bosque aleatorio para los parámetros clínicos clave y evaluamos su rendimiento mediante el análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC). En la cohorte de entrenamiento, los valores del área bajo la curva (AUC) oscilaron entre 0.565 y 0.714 (Fig. 2H). La cohorte de validación mostró limitaciones comparables, con valores de AUC entre 0.541 y 0.762 (Fig. 2I). Los análisis en pares de tejidos tumorales y normales del mismo individuo produjeron resultados similares (Fig. S2G). Esto sugiere que los patrones microbianos observados son independientes de los factores de confusión intraindividuales.

Para evaluar posibles factores de confusión clínicos, realizamos análisis multivariados que incorporaron la edad, el género, la etapa tumoral, la ubicación, el grado de diferenciación y el estado de la quimioterapia. El análisis de riesgos proporcionales de Cox, ajustado por factores de confusión clínicos, reveló que ningún taxón microbiano individual se asoció marginalmente con el resultado de la supervivencia (Fig. S3A). Para investigar aún más el impacto conjunto de la microbiota en el resultado de la supervivencia, se utilizó el modelo Lasso-Cox para seleccionar los taxones importantes, y las características seleccionadas se analizaron posteriormente mediante regresión de Cox multivariable. Los resultados revelaron que sus razones de riesgo (HR) estaban cerca de 1.0, lo que indica una contribución insignificante a la supervivencia en comparación con las covariables clínicas (Fig. S3B). El análisis del resultado de la supervivencia a 5 años mediante el uso de la regresión logística dio resultados similares (Fig. S4A, B). Además, los modelos a nivel de comunidad (Bosque aleatorio) mostraron que la adición de datos microbianos no mejoró el rendimiento predictivo más allá de las variables clínicas por sí solas (Fig. S4C).

En general, estos resultados demuestran que no se observaron asociaciones sólidas entre la composición de la MRT y los resultados de la supervivencia u otras características clínicas en los marcos estadísticos aplicados en nuestra cohorte. El rendimiento subóptimo constante del modelo (AUC < 0.7) indica que la MRT carece de suficiente poder discriminatorio para servir como un biomarcador confiable para las características del tumor de CCR o los resultados clínicos.

La MRT exhibe perfiles distintos en los tejidos normal, pólipo y CCR

Nuestra observación de una composición estable de la MRT en las etapas tumorales establecidas, en contraste con las marcadas diferencias entre los tejidos normales y de CCR, indica diferencias transversales en los perfiles de la MRT entre los tipos de tejidos en lugar de una variación dependiente de la etapa dentro del cáncer colorrectal. Para investigar esta hipótesis, ampliamos nuestro análisis para incluir pólipos precancerosos (68 en la cohorte de descubrimiento, 17 en la cohorte de validación), que abarcan muestras de mucosa normal, pólipos adenomatosos y carcinomas invasivos.

A través de los análisis PCoA y DCA basados en las distancias de Bray-Curtis, revelamos tres ecologías microbianas distintas que corresponden a cada etapa histológica. La microbiota asociada a los pólipos exhibió un perfil distinto en relación con los tejidos normales y de cáncer colorrectal, lo que demostró claras diferencias microbianas entre las muestras normales, de pólipos y de CCR (Fig. 3A, B). El perfilaje taxonómico identificó familias bacterianas específicas con patrones de abundancia distintos en los grupos histológicos (Fig. 3C). Fusobacteriaceae, Streptococcaceae, Prevotellaceae, Leptotrichiaceae y Burkholderiaceae mostraron la menor abundancia relativa en los tejidos normales, una abundancia intermedia en los tejidos de pólipos y la mayor abundancia en los tejidos de CCR. Por el contrario, Coriobacteriaceae, Bifidobacteriaceae y Tannerellaceae fueron más abundantes en los tejidos normales. El análisis a nivel de género confirmó estos patrones, con Fusobacterium, Streptococcus, Peptostreptococcus, Leptotrichia, Massilia y Prevotella que mostraron la menor abundancia en los tejidos normales, niveles intermedios en los pólipos y la mayor abundancia en el CCR, mientras que Phascolarctobacterium, Collinsella, Bifidobacterium, Pseudomonas y Akkermansia se enriquecieron en los tejidos normales, se redujeron en los pólipos y se agotaron aún más en las muestras de CCR (prueba de tendencia de Cochran-Armitage, valor q < 0.05). En particular, varios géneros, incluidos Bacteroides, Porphyromonas y Campylobacter, exhibieron una abundancia marcadamente mayor en el CCR en comparación con los tejidos normales y de pólipos (Fig. 3D, E).

Estos hallazgos demuestran perfiles distintos de la MRT en los tejidos normal, de pólipos y de cáncer colorrectal. Si bien cada categoría histológica se caracteriza por una firma microbiana distinta, la composición de la MRT parece ser relativamente estable entre los pólipos y el carcinoma establecido, lo que destaca la relevancia de los perfiles de la MRT para distinguir las categorías de tejidos de diagnóstico, en lugar de las estratificaciones clínicas dentro del cáncer colorrectal.

Las firmas de la MRT distinguen los estados de los tejidos colorrectales

Basándonos en nuestra observación de perfiles distintos de TRM en tejidos normales, pólipos y CRC, junto con una relativa estabilidad de la composición de TRM en las diferentes etapas del tumor, a continuación, buscamos determinar si estas firmas microbianas podían diferenciar de forma fiable los estados de los tejidos. Inicialmente, desarrollamos un modelo de bosque aleatorio de tres clases (mucosa normal, pólipos, CRC), que logró un rendimiento aceptable (AUC > 0,8; Fig. S5). Sin embargo, el número limitado de muestras de pólipos (n = 68) limitó la precisión de la clasificación. Para abordar esto y capturar mejor las diferencias microbianas entre los tipos de tejido, empleamos modelos por pares. Específicamente, comparamos los pólipos con el CRC en etapa I (n = 61). Estos grupos se seleccionaron debido a tamaños de muestra comparables, lo que permite una comparación transversal equilibrada de los perfiles microbianos entre el tejido de pólipos y el tejido de cáncer colorrectal en etapa temprana.

Para identificar las características microbianas centrales, primero clasificamos los taxones según sus puntuaciones de importancia derivadas del algoritmo de bosque aleatorio y seleccionamos los 10 candidatos principales para una evaluación adicional. Estos taxones se filtraron luego en función de la prevalencia, excluyendo aquellos presentes solo en un pequeño subconjunto de muestras. El refinamiento posterior incorporó análisis de correlación por pares para priorizar los taxones con baja intercorrelación, minimizando así la redundancia. Finalmente, excluimos los taxones con una clasificación taxonómica ambigua, conservando solo aquellos con una clara relevancia biológica para el modelado (destacados en negrita; Fig. 4A, B).

Para optimizar la parsimonia de las características, monitoreamos tanto el rendimiento del entrenamiento como el de la validación (medido por la media de las AUC) utilizando una validación cruzada de 5 pliegues y seleccionamos el número de variables que lograron el mayor rendimiento de validación, al tiempo que controlamos el riesgo de sobreajuste en función del rendimiento del entrenamiento (Fig. 4C; ver Métodos). Se aplicó el mismo protocolo de selección a los modelos normal frente a pólipo (Fig. S6) y normal frente a CRC (Fig. S7). En particular, encontramos que cuatro taxones clave: Pseudomonas, Pigmentiphaga, Parvimonas y Fusobacterium fueron suficientes para lograr una discriminación sólida entre los tejidos de pólipos y CRC en etapa I (destacados en rojo; Fig. 4C). De manera similar, seis taxones: Pseudomonas, Parabacteroides, Bacteroides, Pigmentiphaga, Fusobacterium y Collinsella proporcionaron una discriminación eficaz entre la mucosa normal y los pólipos (destacados en rojo; Fig. 4D).

Los modelos resultantes clasificaron de forma consistente los estados de los tejidos dentro de nuestra cohorte, logrando AUC de 0,911 (entrenamiento) y 0,954 (validación) para normal frente a pólipo, 0,986 y 0,996 para pólipo frente a CRC, y 0,944 y 0,917 para las comparaciones normal frente a CRC (Fig. S8A, B). Para garantizar la solidez de estos hallazgos y reducir el riesgo de sobreajuste, implementamos una estrategia de validación cruzada de 5 pliegues en toda la cohorte de descubrimiento para la evaluación del modelo. Además, se aplicó un sobremuestreo durante el entrenamiento del modelo para abordar los desequilibrios de clase, en particular el número relativamente pequeño de muestras de pólipos, lo que produjo estimaciones más conservadoras y fiables. En todas las tareas de clasificación, esta rigurosa validación produjo AUC medias de 0,87 a 0,90, con desviaciones estándar que reflejan la consistencia entre los pliegues (Fig. 4E), lo que demuestra que los modelos capturan diferencias reproducibles en la composición microbiana asociada al tejido. En particular, 55 pacientes en nuestro conjunto de datos contribuyeron con muestras tanto de tumor como de tejido normal correspondiente. Para evaluar aún más la generalizabilidad del modelo, realizamos una validación de "Dejar un paciente fuera" (LOPO), que garantiza que las muestras del mismo paciente nunca se incluyan tanto en los conjuntos de entrenamiento como de validación. Este análisis produjo resultados coherentes con nuestros hallazgos originales de validación cruzada (Fig. S8C).

El análisis de intersección de los taxones discriminatorios entre los modelos (Fig. S9A) identificó características superpuestas clave: Pseudomonas, Pigmentiphaga y Fusobacterium se compartieron entre los modelos normal frente a pólipo y pólipo frente a CRC en etapa I, mientras que Pseudomonas y Fusobacterium aparecieron de forma consistente en los tres modelos. Los análisis de abundancia diferencial en varias características clínicas mostraron que la mayoría de los taxones microbianos no diferían significativamente, lo que indica que estas firmas son en gran medida independientes de las variables clínicas comunes (Fig. S9B-G). Esta estabilidad en diversas características de los pacientes destaca la solidez de la composición de TRM como discriminador de los estados del tejido colorrectal.

Para evaluar la generalizabilidad, aplicamos nuestros modelos a una cohorte externa independiente que comprende 112 muestras recopiladas de un centro clínico diferente. El modelo demostró un rendimiento sólido, logrando AUC de 0,779 para normal frente a pólipo, 0,796 para pólipo frente a CRC y 0,767 para normal frente a CRC (Fig. 4F). Estas AUC proporcionan una estimación realista del rendimiento del modelo en un entorno clínico externo. Aunque son ligeramente inferiores a las métricas de validación interna, estas reducciones son de esperar en pruebas externas rigurosas y son coherentes con los patrones que se informan en estudios de microbioma a gran escala anteriores ^[27]. Estos hallazgos indican que los patrones microbianos identificados en nuestro estudio son reproducibles en diferentes poblaciones y contextos clínicos.

Para examinar aún más la influencia de la heterogeneidad clínica, estratificamos las muestras de CRC por la ubicación del tumor (derecho frente a izquierdo) y el estado de inestabilidad de microsatélites (MSI). Debido al número limitado de muestras MSI-Alto (n = 28), los análisis se centraron en el subgrupo MSS predominante. Los taxones abundantes de forma diferencial fueron en gran medida consistentes en los subgrupos derecho, izquierdo y MSS, y los modelos reconstruidos utilizando firmas microbianas específicas del estrato mantuvieron un rendimiento similar (Fig. S10). Estos hallazgos indican que las diferencias en la composición de TRM son sólidas y en gran medida independientes de las variables clínicas comunes, como la ubicación del tumor o el estado de MSI, lo que refuerza la generalizabilidad de los patrones microbianos observados en los diferentes subtipos de CRC.

En conjunto, estos hallazgos muestran que la composición de TRM es distinta en los estados normal, pólipo y CRC y permanece estable en los diferentes subgrupos y cohortes clínicos. La presencia recurrente de taxones como Pseudomonas, Pigmentiphaga y Fusobacterium apunta a patrones microbianos reproducibles asociados con la tumorigénesis colorrectal.

Validación de las firmas microbianas identificadas por el modelo en especímenes clínicos

Para validar experimentalmente las firmas microbianas identificadas por nuestros modelos de aprendizaje automático, realizamos una hibridación in situ con fluorescencia (FISH) en especímenes clínicos que representan la mucosa normal, los pólipos y los tejidos de CRC. Este enfoque permitió la visualización y cuantificación directas de los taxones bacterianos de la firma en sus microambientes tisulares nativos.

Para los taxones compartidos entre los modelos normal frente a pólipo y pólipo frente a CRC en etapa I, observamos distintos patrones de colonización coherentes con nuestros resultados de perfilado taxonómico. La intensidad de la fluorescencia de Pseudomonas disminuyó desde el tejido normal hasta los pólipos y el CRC (Fig. 5A, B), mientras que Pigmentiphaga fue menos abundante en los especímenes de pólipos (Fig. 5C, D). En particular, la intensidad de Fusobacterium aumentó en los diferentes tipos de tejido, alcanzando sus niveles más altos en las muestras de CRC (Fig. 5E, F), en línea con su función establecida en el desarrollo del CRC. El análisis FISH de las firmas bacterianas específicas del modelo validó aún más nuestros modelos de aprendizaje automático. En las comparaciones normal frente a pólipo, Parabacteroides, Collinsella y Bacteroides mantuvieron una abundancia significativamente mayor en los tejidos normales, mientras que Parvimonas se enriqueció exclusivamente en los especímenes de CRC (Fig. S11).

Para evaluar la consistencia entre los datos FISH y de secuenciación de ARNr 16S, realizamos un análisis de tendencias comparativas a nivel de grupo. Para cada grupo diagnóstico (normal, pólipo y CRC), comparamos los valores medios de abundancia relativa de la secuenciación con los resultados de cuantificación de FISH correspondientes (Fig. S12A). Ambos métodos revelaron patrones altamente concordantes en los diferentes tipos de tejido. Por ejemplo, la abundancia de Fusobacterium aumentó desde la mucosa normal hasta los tejidos tumorales en ambos conjuntos de datos (Fig. S12B), lo que demuestra la solidez y reproducibilidad de esta trayectoria microbiana en las diferentes plataformas analíticas.

En conjunto, estos resultados experimentales demuestran una fuerte concordancia entre las predicciones computacionales y las observaciones experimentales a nivel de un solo microorganismo. Nuestros hallazgos refuerzan la validez biológica de las firmas microbianas basadas en TRM y proporcionan candidatos con respaldo experimental para futuros estudios mecanicistas sobre las interacciones microbiota-huésped en el desarrollo del cáncer colorrectal.

Para perfilar sistemáticamente el TRM en el CRC, realizamos un estudio transversal que utilizó especímenes de CRC y tejido colorrectal normal del Biobanco del Hospital Sir Run Run Shaw de la Universidad de Zhejiang. Las características demográficas y clínicas de base de los participantes incluidos se resumen en las tablas S1 y S2. Después del control de calidad, se conservaron 1022 muestras, de las cuales 818 (182 normales, 68 pólipos, 568 CRC) se asignaron al conjunto de descubrimiento y 204 (45 normales, 17 pólipos, 142 CRC) al conjunto de validación.

Para caracterizar el TRM, empleamos un protocolo de secuenciación del gen de ARNr 16S optimizado en el que la región V4 se preamplificó utilizando cebadores marcados con biotina, seguido de un enriquecimiento basado en cuentas de estreptavidina para mejorar la especificidad. Posteriormente, se realizó una secuenciación de alto rendimiento con estrictos controles de contaminación para garantizar la fiabilidad de los datos (Fig. 1A, B). Los ensayos basados en cultivos paralelos confirmaron la presencia de bacterias viables en los tejidos de control, pólipos y CRC (Fig. 1C). El análisis cuantitativo reveló un aumento estadísticamente significativo de la carga bacteriana en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales y de pólipos, mientras que no se observó una diferencia significativa entre los tejidos normales y de pólipos (Fig. 1C).

Debido al número relativamente pequeño de muestras de pólipos, primero nos centramos en analizar las diferencias composicionales en el TRM entre los tejidos normales y el CRC. Realizamos análisis multivariados utilizando las distancias de Bray-Curtis. El análisis de coordenadas principales (PCoA) y el análisis de correspondencia atenuada (DAC) revelaron distintos patrones de agrupación que separaron los tejidos intestinales normales de las muestras de CRC a nivel de género (Fig. 1D, E). El perfilado taxonómico demostró variaciones marcadas en la abundancia bacteriana entre los grupos (Fig. 1F). El análisis discriminante lineal del tamaño del efecto (LEfSe) identificó taxones bacterianos específicos que eran abundantes de forma diferencial entre los tejidos normales y el CRC (puntuación del análisis discriminante lineal (LDA) > 2,0, valor q < 0,05; Fig. 1G). En particular, los tejidos normales mostraron un enriquecimiento de Pseudomonadaceae, en línea con informes anteriores que destacan la capacidad supresora de tumores de Pseudomonas aeruginosa [15, 16]. En contraste, los tejidos de CRC mostraron un enriquecimiento de varios taxones bacterianos con un papel establecido en la promoción del desarrollo del CRC. Esto incluyó las especies de Fusobacterium [17, 18], las especies de Bacteroides ^[19] y las especies de Enterobacteroides [20, 21]. En conjunto, estos hallazgos refuerzan la asociación establecida entre las comunidades microbianas específicas y la tumorigénesis colorrectal, al tiempo que proporcionan nuevas perspectivas sobre sus patrones de distribución específicos del tejido.

Para distinguir el TRM de la microbiota luminal, comparamos los perfiles microbianos derivados del tejido con la microbiota fecal de los pacientes con CRC agregados en siete conjuntos de datos públicos ^[22-28]. El análisis PCoA reveló una clara separación entre los microbiomas fecal y tisular (PERMANOVA, valor p < 0,001; Fig. S1A), acompañado de diferencias significativas en la diversidad alfa (Fig. S1B) y la composición de los géneros dominantes (Fig. S1C). Los análisis de abundancia diferencial paralelos identificaron taxones parcialmente superpuestos pero débilmente correlacionados (ρ = 0,106, valor p = 0,451; Fig. S1D), lo que indica que el TRM representa comunidades microbianas distintas que no se capturan adecuadamente mediante el perfilado fecal.

Debido al número relativamente pequeño de muestras de pólipos, primero nos centramos en analizar las diferencias composicionales en el TRM entre los tejidos normales y el CRC. Realizamos análisis multivariados utilizando las distancias de Bray-Curtis. El análisis de coordenadas principales (PCoA) y el análisis de correspondencia atenuada (DAC) revelaron distintos patrones de agrupación que separaron los tejidos intestinales normales de las muestras de CRC a nivel de género (Fig. 1D, E). El perfilado taxonómico demostró variaciones marcadas en la abundancia bacteriana entre los grupos (Fig. 1F). El análisis discriminante lineal del tamaño del efecto (LEfSe) identificó taxones bacterianos específicos que eran abundantes de forma diferencial entre los tejidos normales y el CRC (puntuación del análisis discriminante lineal (LDA) > 2,0, valor q < 0,05; Fig. 1G). En particular, los tejidos normales mostraron un enriquecimiento de Pseudomonadaceae, en línea con informes anteriores que destacan la capacidad supresora de tumores de Pseudomonas aeruginosa [15, 16]. En contraste, los tejidos de CRC mostraron un enriquecimiento de varios taxones bacterianos con un papel establecido en la promoción del desarrollo del CRC. Esto incluyó las especies de Fusobacterium [17, 18], las especies de Bacteroides ^[19] y las especies de Enterobacteroides [20, 21]. En conjunto, estos hallazgos refuerzan la asociación establecida entre las comunidades microbianas específicas y la tumorigénesis colorrectal, al tiempo que proporcionan nuevas perspectivas sobre sus patrones de distribución específicos del tejido.

Para distinguir el TRM de la microbiota luminal, comparamos los perfiles microbianos derivados del tejido con la microbiota fecal de los pacientes con CRC agregados en siete conjuntos de datos públicos ^[22-28]. El análisis PCoA reveló una clara separación entre los microbiomas fecal y tisular (PERMANOVA, valor p < 0,001; Fig. S1A), acompañado de diferencias significativas en la diversidad alfa (Fig. S1B) y la composición de los géneros dominantes (Fig. S1C). Los análisis de abundancia diferencial paralelos identificaron taxones parcialmente superpuestos pero débilmente correlacionados (ρ = 0,106, valor p = 0,451; Fig. S1D), lo que indica que el TRM representa comunidades microbianas distintas que no se capturan adecuadamente mediante el perfilado fecal.

Si bien existen diferencias sustanciales entre la microbiota tumoral (MT) en tejidos normales y en tejidos de cáncer colorrectal (CCR), su potencial para discriminar las características clínicas del CCR aún no se ha explorado. Para abordar esto, realizamos un análisis PCoA de la microbiota intratumoral estratificada por múltiples parámetros clínicos a nivel de género. Contrariamente a nuestras expectativas, las comunidades microbianas no mostraron una segregación significativa cuando se analizaron por edad, género, estado de diferenciación, estadios de clasificación de tumor, nódulo y metástasis (TNM), ubicación anatómica o estado de supervivencia (Fig. 2A-F). Observamos el mismo patrón después de controlar los factores de confusión interindividuales mediante el análisis de muestras de tumores emparejados y tejidos normales adyacentes (Figuras S2A-F). Estos hallazgos indican que, si bien la composición de la MT difiere fundamentalmente entre los tejidos normales y cancerosos, estas firmas microbianas no parecen reflejar la heterogeneidad clínica del CCR establecido.

Para investigar posibles asociaciones entre la MT y las características clínicas, realizamos un análisis de agrupamiento jerárquico de la abundancia de géneros bacterianos en las características clínicas mencionadas. El mapa de calor resultante reveló diversos patrones de abundancia de géneros bacterianos específicos en diferentes características clínicas, con ciertos taxones que mostraron un enriquecimiento relativo en subgrupos particulares (Fig. 2G). Sin embargo, estas asociaciones no alcanzaron significación estadística, lo que confirmó la ausencia de una correlación sólida entre la MT y las características clínicas en el CCR.

Para explorar aún más la relación entre la MT y las características clínicas en el CCR, desarrollamos modelos de clasificación de bosque aleatorio para los parámetros clínicos clave y evaluamos su rendimiento mediante el análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC). En la cohorte de entrenamiento, los valores del área bajo la curva (AUC) oscilaron entre 0,565 y 0,714 (Fig. 2H). La cohorte de validación mostró limitaciones comparables, con valores de AUC entre 0,541 y 0,762 (Fig. 2I). Los análisis de pares de tejidos tumorales y normales emparejados de los mismos individuos arrojaron resultados similares (Fig. S2G). Esto sugiere que los patrones microbianos observados son independientes de los factores de confusión intraindividual.

Para evaluar posibles factores de confusión clínicos, realizamos análisis multivariados que incorporaron la edad, el género, el estadio tumoral, la ubicación, el grado de diferenciación y el estado de la quimioterapia. El análisis de riesgos proporcionales de Cox, ajustado por factores de confusión clínicos, reveló que ningún taxón microbiano individual se asoció marginalmente con el resultado de supervivencia (Fig. S3A). Para investigar aún más el impacto conjunto de la microbiota en el resultado de la supervivencia, se utilizó el modelo Lasso-Cox para seleccionar los taxones importantes, y las características seleccionadas se analizaron posteriormente mediante regresión de Cox multivariable. Los resultados revelaron que sus razones de riesgo (RR) estaban cerca de 1,0, lo que indica una contribución insignificante a la supervivencia en comparación con las covariables clínicas (Fig. S3B). El análisis del resultado de supervivencia a 5 años mediante el uso de regresión logística arrojó resultados similares (Fig. S4A, B). Además, los modelos a nivel de comunidad (Bosque aleatorio) mostraron que la adición de datos microbianos no mejoró el rendimiento predictivo más allá de las variables clínicas por sí solas (Fig. S4C).

En general, estos resultados demuestran que no se observaron asociaciones sólidas entre la composición de la MT y los resultados de supervivencia u otras características clínicas en los marcos estadísticos aplicados en nuestra cohorte. El rendimiento subóptimo constante del modelo (AUC < 0,7) indica que la MT carece de suficiente poder discriminatorio para servir como un biomarcador confiable para las características del tumor de CCR o los resultados clínicos.

La MT exhibe perfiles distintos en tejidos normales, pólipos y CCR

Nuestra observación de una composición estable de la MT en los estadios tumorales establecidos, en contraste con las marcadas diferencias entre los tejidos normales y el CCR, indica diferencias transversales en los perfiles de la MT entre los tipos de tejido en lugar de una variación dependiente del estadio dentro del cáncer colorrectal. Para investigar esta hipótesis, ampliamos nuestro análisis para incluir pólipos precancerosos (68 en la cohorte de descubrimiento, 17 en la cohorte de validación), que abarcan muestras de mucosa normal, pólipos adenomatosos y carcinoma invasivo.

Mediante los análisis PCoA y DCA basados en las distancias de Bray-Curtis, revelamos tres ecologías microbianas distintas que corresponden a cada estadio histológico. La microbiota asociada a los pólipos exhibió un perfil distinto en relación con los tejidos normales y el cáncer colorrectal, lo que demostró claras diferencias microbianas entre las muestras de tejido normal, pólipo y CCR (Fig. 3A, B). El perfilaje taxonómico identificó familias bacterianas específicas con patrones de abundancia distintos en los grupos histológicos (Fig. 3C). Fusobacteriaceae, Streptococcaceae, Prevotellaceae, Leptotrichiaceae y Burkholderiaceae mostraron la menor abundancia relativa en el tejido normal, una abundancia intermedia en el tejido de pólipos y la mayor abundancia en el tejido de CCR. Por el contrario, Coriobacteriaceae, Bifidobacteriaceae y Tannerellaceae fueron más abundantes en el tejido normal. El análisis a nivel de género confirmó estos patrones, con Fusobacterium, Streptococcus, Peptostreptococcus, Leptotrichia, Massilia y Prevotella que mostraron la menor abundancia en el tejido normal, niveles intermedios en los pólipos y la mayor abundancia en el CCR, mientras que Phascolarctobacterium, Collinsella, Bifidobacterium, Pseudomonas y Akkermansia fueron más abundantes en el tejido normal, reducidos en los pólipos y aún más disminuidos en las muestras de CCR (prueba de tendencia de Cochran-Armitage, valor q < 0,05). Cabe destacar que varios géneros, incluidos Bacteroides, Porphyromonas y Campylobacter, exhibieron una abundancia marcadamente mayor en el CCR en comparación con los tejidos normales y de pólipos (Fig. 3D, E).

Estos hallazgos demuestran perfiles distintos de la MT en los tejidos normales, de pólipos y de cáncer colorrectal. Si bien cada categoría histológica se caracteriza por una firma microbiana distinta, la composición de la MT parece ser relativamente estable entre los pólipos y el carcinoma establecido, lo que destaca la relevancia de los perfiles de la MT para distinguir las categorías de tejido diagnóstico, en lugar de entre los estratos clínicos dentro del cáncer colorrectal.

Las firmas de la MT distinguen los estados del tejido colorrectal

Basándonos en nuestra observación de perfiles distintos de la MT en los tejidos normales, de pólipos y de CCR, junto con una estabilidad relativa de la composición de la MT en los estadios tumorales establecidos, buscamos determinar si estas firmas microbianas podrían diferenciar de manera confiable los estados de los tejidos. Inicialmente, desarrollamos un modelo de bosque aleatorio de tres clases (mucosa normal, pólipos, CCR), que logró un rendimiento aceptable (AUC > 0,8; Fig. S5). Sin embargo, el número limitado de muestras de pólipos (n = 68) limitó la precisión de la clasificación. Para abordar esto y capturar mejor las diferencias microbianas entre los tipos de tejido, empleamos modelos por pares. Específicamente, comparamos los pólipos con el CCR en estadio I (n = 61). Estos grupos se seleccionaron debido a tamaños de muestra comparables, lo que permite una comparación transversal equilibrada de los perfiles microbianos entre el tejido de pólipos y el tejido de cáncer colorrectal en estadio temprano.

Para identificar las características microbianas centrales, primero clasificamos los taxones por sus puntajes de importancia derivados del algoritmo de bosque aleatorio y seleccionamos los 10 candidatos principales para una evaluación adicional. Estos taxones se filtraron luego en función de la prevalencia, excluyendo aquellos presentes solo en un pequeño subconjunto de muestras. El refinamiento posterior incorporó análisis de correlación por pares para priorizar los taxones con baja intercorrelación, minimizando así la redundancia. Finalmente, excluimos los taxones con una clasificación taxonómica ambigua, reteniendo solo aquellos con una relevancia biológica clara para el modelado (resaltados en negrita; Fig. 4A, B).

Para optimizar la parsimonia de las características, monitoreamos tanto el rendimiento de entrenamiento como el de validación (medido por la media de las AUC) utilizando una validación cruzada de 5 pliegues y seleccionamos el número de variables que lograron el mayor rendimiento de validación al tiempo que controlaban el riesgo de sobreajuste en función del rendimiento del entrenamiento (Fig. 4C; consulte Métodos). Se aplicó el mismo protocolo de selección a los modelos de normal frente a pólipo (Fig. S6) y normal frente a CCR (Figura S7). Cabe destacar que encontramos que cuatro taxones clave: Pseudomonas, Pigmentiphaga, Parvimonas y Fusobacterium fueron suficientes para lograr una discriminación sólida entre los tejidos de pólipos y CCR en estadio I (resaltados en rojo; Fig. 4C). De manera similar, seis taxones: Pseudomonas, Parabacteroides, Bacteroides, Pigmentiphaga, Fusobacterium y Collinsella proporcionaron una discriminación efectiva entre la mucosa normal y los pólipos (resaltados en rojo; Fig. 4D).

Los modelos resultantes clasificaron consistentemente los estados de los tejidos con un alto rendimiento dentro de nuestra cohorte, logrando AUC de 0,911 (entrenamiento) y 0,954 (validación) para normal frente a pólipo, 0,986 y 0,996 para pólipo frente a CCR, y 0,944 y 0,917 para normal frente a CCR (Fig. S8A, B). Para garantizar la solidez de estos hallazgos y reducir el riesgo de sobreajuste, implementamos una estrategia de validación cruzada de 5 pliegues en la cohorte de descubrimiento para la evaluación del modelo. Además, se aplicó un sobremuestreo durante el entrenamiento del modelo para abordar los desequilibrios de clase, particularmente el número relativamente pequeño de muestras de pólipos, lo que produjo estimaciones más conservadoras y confiables. En todas las tareas de clasificación, esta rigurosa validación arrojó AUC medias de 0,87 a 0,90, con desviaciones estándar que reflejan la consistencia entre los pliegues (Fig. 4E), lo que demuestra que los modelos capturan diferencias reproducibles en la composición microbiana asociada al tejido. Cabe destacar que 55 pacientes en nuestro conjunto de datos contribuyeron con muestras de tumores y muestras normales emparejadas. Para evaluar aún más la generalizabilidad del modelo, realizamos una validación de eliminación de un paciente (LOPO), que garantiza que las muestras del mismo paciente nunca se incluyan tanto en el conjunto de entrenamiento como en el de validación. Este análisis arrojó resultados consistentes con nuestros hallazgos de validación cruzada originales (Fig. S8C).

El análisis de intersección de los taxones discriminatorios en los modelos (Fig. S9A) identificó características superpuestas clave: Pseudomonas, Pigmentiphaga y Fusobacterium se compartieron entre los modelos de normal frente a pólipo y pólipo frente a CCR en estadio I, mientras que Pseudomonas y Fusobacterium aparecieron de manera consistente en los tres modelos. Los análisis de abundancia diferencial en varias características clínicas mostraron que la mayoría de los taxones microbianos no difirieron significativamente, lo que indica que estas firmas son en gran medida independientes de las variables clínicas comunes (Fig. S9B-G). Esta estabilidad en diversas características de los pacientes destaca la solidez de la composición de la MT como discriminador de los estados del tejido colorrectal.

Para evaluar la generalizabilidad, aplicamos nuestros modelos a una cohorte externa independiente que comprende 112 muestras recopiladas de un centro clínico separado. El modelo demostró un rendimiento sólido, logrando AUC de 0,779 para normal frente a pólipo, 0,796 para pólipo frente a CCR y 0,767 para normal frente a CCR (Fig. 4F). Estas AUC proporcionan una estimación realista del rendimiento del modelo en un entorno clínico externo. Si bien son modestamente inferiores a las métricas de validación interna, tales reducciones son de esperar en las pruebas externas rigurosas y son consistentes con los patrones que se informan en estudios de microbioma a gran escala anteriores ^[27]. Estos hallazgos indican que los patrones microbianos identificados en nuestro estudio son reproducibles en diferentes poblaciones y contextos clínicos.

Para examinar más a fondo la influencia de la heterogeneidad clínica, estratificamos las muestras de CRC según la ubicación del tumor (derecho frente a izquierdo) y el estado de inestabilidad de microsatélites (MSI). Debido al número limitado de muestras MSI-Alto (n = 28), los análisis se centraron en el subgrupo MSS predominante. Los taxones diferencialmente abundantes fueron en gran medida consistentes entre los subgrupos de lado derecho, lado izquierdo y MSS, y los modelos reconstruidos utilizando firmas microbianas específicas del estrato mantuvieron un rendimiento similar (Fig. S10). Estos hallazgos indican que las diferencias en la composición de la microbiota residente del tumor (TRM) son robustas y en gran medida independientes de las variables clínicas comunes, como la ubicación del tumor o el estado de MSI, lo que refuerza la generalizabilidad de los patrones microbianos observados en diversos subtipos de CRC.

En conjunto, estos hallazgos demuestran que la composición de la TRM es distinta entre el estado normal, el pólipo y el CRC, y permanece estable en los subgrupos y cohortes clínicos. La presencia recurrente de taxones como Pseudomonas, Pigmentiphaga y Fusobacterium apunta a patrones microbianos reproducibles asociados con la tumorigénesis colorrectal.

Validación de las firmas microbianas identificadas por el modelo en muestras clínicas

Para validar experimentalmente las firmas microbianas identificadas por nuestros modelos de aprendizaje automático, realizamos hibridación in situ por fluorescencia (FISH) en muestras clínicas que representan la mucosa normal, los pólipos y los tejidos de CRC. Este enfoque permitió la visualización y cuantificación directa de los taxones bacterianos de la firma en sus microambientes tisulares nativos.

Para los taxones compartidos entre los modelos normal frente a pólipo y pólipo frente a CRCI, observamos patrones de colonización distintos, coherentes con nuestros resultados de perfilado taxonómico. La intensidad de la fluorescencia de Pseudomonas disminuyó desde el tejido normal hasta los pólipos y el CRC (Fig. 5A, B), mientras que Pigmentiphaga fue menos abundante en las muestras de pólipos (Fig. 5C, D). En particular, la intensidad de Fusobacterium aumentó en los diferentes tipos de tejido, alcanzando sus niveles más altos en las muestras de CRC (Fig. 5E, F), en línea con su función establecida en el desarrollo del CRC. El análisis FISH de las firmas bacterianas específicas del modelo validó aún más nuestros modelos de aprendizaje automático. En las comparaciones entre normal y pólipo, Parabacteroides, Collinsella y Bacteroides mantuvieron una abundancia significativamente mayor en los tejidos normales, mientras que Parvimonas_ se enriqueció exclusivamente en las muestras de CRC (Fig. S11).

Para evaluar la consistencia entre los datos de FISH y el secuenciamiento de ARNr 16S, realizamos un análisis comparativo de tendencias a nivel de grupo. Para cada grupo diagnóstico (normal, pólipo y CRC), comparamos los valores medios de abundancia relativa del secuenciamiento con los resultados de cuantificación de FISH correspondientes (Fig. S12A). Ambos métodos revelaron patrones altamente concordantes en los diferentes tipos de tejido. Por ejemplo, la abundancia de Fusobacterium aumentó desde la mucosa normal hasta los tejidos tumorales en ambos conjuntos de datos (Fig. S12B), lo que demuestra la robustez y reproducibilidad de esta trayectoria microbiana en diferentes plataformas analíticas.

En conjunto, estos resultados experimentales demuestran una fuerte concordancia entre las predicciones computacionales y las observaciones experimentales a nivel de un solo microorganismo. Nuestros hallazgos refuerzan la validez biológica de las firmas microbianas basadas en la TRM y proporcionan candidatos con respaldo experimental para futuros estudios mecanicistas sobre las interacciones microbiota-huésped en el desarrollo del cáncer colorrectal.

Discusión

El CRC sigue siendo uno de los cánceres más prevalentes y letales en todo el mundo, y surge a través de un proceso gradual que va desde la mucosa normal hasta los pólipos adenomatosos y, finalmente, hasta el carcinoma invasivo^[29]. Si bien la genética del huésped y los factores ambientales son contribuyentes bien reconocidos a esta progresión^[30], el papel de la TRM en la configuración del microambiente tumoral aún no se comprende completamente. En este estudio, caracterizamos sistemáticamente la TRM en una gran cohorte de muestras clínicas para mapear su composición en el tejido normal, los pólipos y el CRC. Nuestros hallazgos revelan perfiles microbianos distintos entre los tipos de tejido, estableciendo un marco fundamental para comprender los perfiles de la microbiota asociados con la carcinogénesis colorrectal y proporcionando una base para futuras investigaciones mecanicistas.

Nuestro análisis transversal reveló una clara diferencia en la composición de la TRM entre la mucosa normal, los pólipos y los tejidos de CRC. El aumento de la abundancia de bacterias pro-tumorales conocidas, como Fusobacterium^[31],^[32], Streptococcus^[33],^[34] y Peptostreptococcus^[35],^[36], junto con la disminución de los comensales potencialmente protectores, incluidos Collinsella^[37] y Akkermansia^[38],^[39], destaca los cambios microbianos que se producen a medida que el tejido evoluciona desde la mucosa normal, los pólipos precancerosos y el carcinoma invasivo. Estas firmas específicas del grupo, que se validaron aún más mediante FISH, indican asociaciones consistentes entre la composición de la TRM y la categoría histológica, y son compatibles con los mecanismos propuestos que involucran la modulación inmunitaria y la alteración de la barrera epitelial^[40]–^[42].

En contraste, la composición de la TRM mostró poca variación entre los estadios tumorales establecidos o los subgrupos clínicos, incluida la ubicación del tumor, el estado de diferenciación y la inestabilidad de microsatélites. Este patrón sugiere que la variabilidad en los perfiles de la TRM está más fuertemente asociada con las categorías de tejido diagnóstico que con la heterogeneidad entre los subgrupos de CRC definidos clínicamente. Coherente con esta interpretación, no observamos cambios sistemáticos en la composición microbiana en los estratos de enfermedad en etapa más avanzada o en las variables relacionadas con la supervivencia. En conjunto, estos hallazgos respaldan una asociación entre la composición de la TRM y el tipo de tejido, en lugar de la variación dependiente del estadio dentro del cáncer colorrectal establecido.

Aunque nuestros modelos de aprendizaje automático demostraron un fuerte rendimiento de clasificación dentro de nuestra cohorte, el propósito de este análisis no es proponer el perfilado de la TRM como una herramienta de diagnóstico, ya que requiere muestras de tejido y no se puede realizar de forma no invasiva. Más bien, estos resultados demuestran la consistencia y la robustez de los patrones de la TRM, que podrían servir como un complemento útil para la estratificación del riesgo en contextos donde ya están disponibles muestras de tejido, como los pólipos resecados o las muestras de biopsia. En tales entornos, la caracterización de la TRM podría complementar potencialmente la evaluación histopatológica, ofreciendo información adicional sobre el riesgo biológico del CRC e informando sobre las estrategias de seguimiento o vigilancia. Una dirección clave para la investigación futura es traducir estas firmas microbianas de la TRM derivadas de tejidos en herramientas clínicamente aplicables. Una posibilidad es identificar señales microbianas o microbianas derivadas mensurables correlacionadas en muestras no invasivas, como las heces o la sangre, lo que permitiría evaluaciones basadas en la TRM sin requerir biopsias de tejido. Otra vía importante es integrar las firmas de la TRM con las características clinicopatológicas establecidas, como el grado de diferenciación tumoral, el estado de los ganglios linfáticos o los marcadores moleculares, para construir modelos compuestos que vayan más allá de la morfología. Al vincular las alteraciones de la TRM con los indicadores luminales o sistémicos e integrarlas dentro de marcos de diagnóstico más amplios, el trabajo futuro podría tender un puente entre la biología microbiana a nivel de tejido y las estrategias de detección o estratificación del riesgo clínicamente prácticas, agregando valor a la práctica diagnóstica actual en lugar de reemplazarla.

Se deben reconocer varias limitaciones. El diseño transversal impide la inferencia causal, y se requiere una validación longitudinal para confirmar los cambios microbianos temporales. Además, aunque nuestra cohorte fue relativamente grande e incluyó una validación externa, una mayor replicación en diversas poblaciones y plataformas de secuenciación fortalecerá la generalizabilidad de los hallazgos. Finalmente, la información funcional sigue siendo limitada, ya que el estudio actual establece principalmente relaciones descriptivas y correlativas. Los análisis multiómicos integrados, que combinan la metagenómica, la metatranscriptómica y la metabolómica, serán fundamentales para descubrir los mecanismos moleculares a través de los cuales la TRM influye en la tumorigénesis temprana del cáncer colorrectal.

En conclusión, este estudio proporciona una descripción transversal exhaustiva de las diferencias de la TRM entre la mucosa normal, los pólipos precancerosos y el carcinoma colorrectal, estableciendo una base para futuras investigaciones mecanicistas sobre la interfaz microbiota-huésped en el desarrollo del CRC. Si bien no está destinado a aplicaciones de diagnóstico, el análisis de la TRM representa un enfoque complementario prometedor para la estratificación del riesgo en las evaluaciones basadas en tejidos y un punto de partida valioso para el desarrollo de biomarcadores no invasivos y estrategias microbianas dirigidas para la prevención del cáncer colorrectal.

Métodos

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación (IRB) del Hospital Sir Run Run Shaw (SRRSH) (Número de aprobación: IRB-2022-0423). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la recolección y el análisis de sus muestras.

Recolección de muestras humanas

Este estudio de cohorte retrospectivo utilizó muestras y datos identificados mediante la consulta sistemática del Biobanco y los archivos clínicos del SRRSH para pacientes que se sometieron a colonoscopia o resección quirúrgica entre enero de 2017 y enero de 2018. Los participantes se clasificaron en tres grupos según los informes histopatológicos archivados: CRC, pólipo y controles normales. El grupo de pólipos abarcó varios tipos patológicos, incluidos los pólipos adenomatosos y no adenomatosos.

Criterios de inclusión y exclusión

Se aplicaron los siguientes criterios para seleccionar la cohorte de estudio final:

Criterios de inclusión: Disponibilidad de un diagnóstico histopatológico definitivo de CRC, pólipo (cualquier tipo) o mucosa normal; edad entre 18 y 90 años en el momento del procedimiento; no tener antecedentes documentados de terapia contra el cáncer antes de la adquisición de la muestra; disponibilidad de muestras de tejido congeladas de alta calidad en el Biobanco; y integridad de los datos clínicos y patológicos esenciales.

Criterios de exclusión: Uso documentado de antibióticos, prebióticos o probióticos dentro de un mes antes del procedimiento; codiagnóstico de otras enfermedades gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal); antecedentes de resección colorrectal; y calidad de tejido insuficiente o falta de datos clínicos críticos.

Recolección de muestras, control de calidad y procesamiento

Las muestras de normal, pólipo y CRC se recolectaron de diferentes individuos, cumpliendo con los criterios anteriores. Entre estas muestras, hay 55 pares de tejidos normales y de CRC obtenidos de los mismos pacientes. Los tejidos humanos frescos se recolectaron en la sala de cirugía estéril de los centros médicos del SRRSH. Los tejidos de mucosa intestinal normal fresca (ubicados al menos 10 cm de la lesión de cáncer colorrectal), los tejidos de pólipos y los tejidos de cáncer colorrectal se transfirieron inmediatamente a tubos de centrífuga estériles de 15 ml que contenían medio de cultivo DMEM estéril. El tejido humano congelado a -80 °C se obtuvo del biobanco del SRRSH. Cada muestra de tejido se lavó tres veces con PBS, cada lavado duró 5 minutos. Luego, utilizando pinzas autoclavadas y cuchillas estériles, se disecó el tejido superficial y se retuvo el núcleo central (aproximadamente 200 mg) para la extracción de ADN posterior.

Para minimizar la contaminación ambiental, las regiones centrales de cada muestra de tejido se disecaron cuidadosamente antes de la extracción de ADN. La carga bacteriana en los diferentes tipos de tejido se cuantificó mediante qPCR dirigida al gen de ARNr 16S. Si bien todas las muestras de control ambiental se mantuvieron muy por debajo del umbral de 10³ UFC/g (según el análisis de la curva estándar) (Fig. S13), todas las muestras de tejido examinadas superaron significativamente este nivel. En consecuencia, las muestras por debajo de este umbral se excluyeron del análisis posterior.

Preparación de la muestra de TRM

Existen tres desafíos principales que afectan la extracción de ADN bacteriano: la presencia de un enorme genoma del huésped, la liberación de ADN bacteriano y la contaminación en los reactivos. Para obtener ADN bacteriano de alta calidad, probamos diferentes kits de extracción de ADN, optimizamos la cantidad de tejido y empleamos técnicas de fragmentación con microesferas. Sin embargo, es difícil eliminar por completo la contaminación en los reactivos. Por lo tanto, establecimos controles ambientales estrictos que se sometieron al mismo procedimiento que las muestras, lo que nos permitió generar un perfil completo de la contaminación. Para determinar si se debe eliminar el genoma de las células del huésped, probamos dos kits de extracción de ADN: el kit QIAamp DNA Microbiome (QIAGEN #51704), que puede reducir el ADN del huésped, y el kit QIAamp PowerFecal (pro) DNA (QIAGEN #51804). Todos los kits probados incluyeron un paso de trituración con microesferas, que se realizó en un TissueLyser II (QIAGEN, 85300) durante 10 minutos a 30 Hz. La cantidad de ADN bacteriano disminuyó sin el paso de trituración con microesferas. El kit QIAamp DNA Microbiome contiene pasos para lisar las células del huésped con el tampón AHL y la benzonasa para digerir el ADN del huésped. Sin embargo, estos pasos adicionales disminuyeron constantemente el rendimiento de la muestra para los tejidos, lo que resultó en una menor sensibilidad de la cuantificación por qPCR y frecuentes resultados ambiguos. Por lo tanto, decidimos utilizar el kit QIAamp PowerFecal (pro) DNA, que no incluye un paso de eliminación del genoma del huésped, para la extracción posterior de ADN bacteriano.

Para el procesamiento de tejidos, determinamos que se deben utilizar 150 mg de tejido para la extracción de ADN, ya que cantidades mayores disminuirían la eficiencia de la extracción debido a la capacidad de unión limitada de la columna de centrifugación. Las muestras de tejido tumoral se molieron en 1 ml de PBS estéril. Después de la centrifugación a máxima velocidad durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y el precipitado se extrajo o se congeló a -80 °C.

Para establecer controles, dado que es difícil eliminar por completo la contaminación en los reactivos, establecimos controles negativos adecuados. Utilizamos PBS como sustituto del tejido para que se someta a los mismos pasos de procesamiento que las muestras de tejido. El producto de ADN resultante sirvió como control de bacterias ambientales (EC). Además, utilizamos agua tratada con DEPC como control sin plantilla (NTC) al realizar el ensayo de cuantificación por qPCR.

Cuantificación por qPCR

Se utilizó la mezcla de reacción YEASEN Hieff qPCR para la cuantificación bacteriana. La región V9 del ARNr 16S se amplificó utilizando los siguientes cebadores: 1369 Forward 5’-CGGTGAATACGTTCYCGG-3’, 1492 Reverse 5’-GGWTACCTTGTTACGACTT-3’. Para calcular la concentración de ADN bacteriano en las muestras, generamos una curva estándar utilizando ADN de Escherichia coli. Se incluyeron controles sin plantilla (NTC) en todas las reacciones. El programa de qPCR consistió en una desnaturalización inicial a 94 °C durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos de 94 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 60 segundos. Los valores brutos del ciclo umbral (Ct) se normalizaron con respecto a la curva estándar de ADN de E. coli para una cuantificación precisa.

Construcción de la biblioteca 16S

Para aumentar la eficiencia de recuperación de los productos de PCR en el primer paso durante la preparación de la biblioteca, el extremo del cebador de amplificación se modificó con 5’ biotina. Después de la primera PCR con biotina, se utilizaron las microesferas Dynabeads MyOneTM Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific, #5002) para extraer los productos de PCR con biotina siguiendo las instrucciones del fabricante. Las microesferas de estreptavidina que contienen el producto de PCR de la primera ronda se sometieron directamente a la segunda ronda de PCR de índice. Específicamente, se agregaron índices duales del kit TruePrep® Index Kit V3 para Illumina® (5 ul para cada índice, Vazyme #TD203) a los amplicones objetivo en una segunda ronda de PCR utilizando 23 Kapa HiFi Hotstart ReadyMix DNA polymerase. Luego, se agregaron las microesferas Ampure XP (Beckman, A63881 AMPure XP) para limpiar las bibliotecas finales, y la calidad de estas bibliotecas purificadas se verificó mediante Fragment Analyzer-12/96 (GENE-QC006). Finalmente, las muestras se secuenciaron en el Novaseq con lecturas apareadas de 2×250 pb (Novogene, Tianjin).

Para la construcción de la biblioteca de microbiota residente en el tumor, utilizamos PBS que se sometió a todos los procedimientos de preparación de la muestra como control negativo ambiental y agua tratada con DEPC como control sin plantilla, así como E. coli como control positivo. La región hipervariable V4 del 16S se amplificó con el conjunto de cebadores biotinilados 515 F (0,4 uM, 5¢- TCGTCGGCAGCGTC AGATGTGTATAAGAGA CAGGTGYCAGCMGCCGCGGTAA −3¢) y 805R (0,4 uM, 5¢- GTCTCGTGGGCTCGG AGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACNVGGGTWTCTAAT-3¢), cada uno con secuencias de adaptador de extremo, utilizando 23 Kapa HiFi Hotstart ReadyMix DNA polymerase (Kapa Biosystems). La amplificación se realizó con un paso de calentamiento inicial de 95 °C durante 3 minutos, 25 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C, 30 segundos a 72 °C y una extensión final de 72 °C durante 5 minutos. Los ciclos de PCR se optimizaron a 30 ciclos. Los productos de PCR se purificaron y enriquecieron con las microesferas Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific, #65002) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las microesferas de biotina que contienen los productos de PCR de la primera ronda se sometieron directamente a la segunda ronda de PCR de índice. Se agregaron índices duales del kit TruePrep® Index Kit V3 para Illumina® (5 ul para cada índice, Vazyme #TD203) a los amplicones objetivo en una segunda PCR utilizando 23 Kapa HiFi Hotstart ReadyMix DNA polymerase (25 ul). Las condiciones de PCR fueron 3 minutos a 95 °C, con 8 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C, 30 segundos a 72 °C y una extensión final de 5 minutos a 72 °C. Las bibliotecas se purificaron con AMPure XP (0,8X) antes de la cuantificación utilizando el ensayo Qubit DNA (Thermo Fisher Scientific) o la verificación de la calidad mediante Fragment Analyzer-12/96 (GENE-QC006). Se incluyeron controles negativos, incluidos los controles sin plantilla y los controles ambientales, en todas las ejecuciones de secuenciación. Las muestras se secuenciaron en el Novaseq con lecturas apareadas de 2 × 250 pb (Novogene, Tianjin).

Análisis de datos del microbioma

Procesamiento de los datos de secuenciación de amplicones

Los datos de secuenciación se dividieron utilizando las herramientas de desmultiplexación bcl2fastq2 (verificar con la empresa de servicios de secuenciación el método de desmultiplexación que utilizan) para generar archivos en formato fastq para cada muestra utilizando las secuencias de código de barras. Todas las lecturas se analizaron utilizando una tubería bioinformática de amplicones estandarizada utilizando vsearch v2.14.2^[43] y usearch v10^[44]. Primero, las lecturas apareadas se fusionaron utilizando “vsearch-fastqmergepairs” con los parámetros predeterminados. Luego, el recorte de adaptadores y la eliminación de lecturas de baja calidad se realizaron mediante “vsearch-fastxfilter” con una tasa de error esperada máxima de 0,01. Después del filtrado de control de calidad, se procesaron las lecturas. Se construyeron plantillas de amplicones utilizando las lecturas que pasaron el control de calidad. Las lecturas se desreplicaron utilizando “vsearch-derepfulllength” con las lecturas únicas descartadas. Todas las secuencias únicas restantes se desruidieron mediante el método unoise3 para obtener características de secuencia candidatas, lo que equilibra la resolución y la especificidad^[45]. Por último, se eliminaron las características quiméricas utilizando “vsearchuchimeref” con respecto a la versión de referencia SILVA 123.

La tabla de abundancia se generó mapeando todas las lecturas que pasaron el control de calidad a las características de secuencia de plantilla utilizando “vsearch-usearch_global” con un umbral de identidad del 0,97. Las características de secuencia se clasificaron mediante “vsearch-sintax” con un corte establecido en 0,6. Se eliminaron las características de secuencia no específicas de eucariotas y mitocondrias. Solo se conservaron las muestras con suficientes lecturas específicas de procariotas utilizando el corte de 1000 para las muestras humanas, respectivamente. Todas las muestras conservadas se normalizaron al mismo número de lecturas para una comparación justa (1000 lecturas para humanos) utilizando la función “rrarefy” del paquete R vegan (v2.6-4)^[46].

Corrección de la contaminación

El efecto de la contaminación en cada muestra humana se corrigió numéricamente utilizando los datos del experimento de cuantificación por qPCR. Primero, se obtuvo la abundancia relativa de cada especie bacteriana a partir de los datos de secuenciación del ARNr 16S. Luego, la cantidad absoluta de bacterias por especie por muestra se calculó según el valor de cuantificación por qPCR y la abundancia relativa dentro de la muestra. Las bacterias contaminantes del entorno se midieron como la cantidad absoluta mediana de una especie entre todas las muestras de control negativo, formulada como donde cij es la abundancia relativa de la especie j de la muestra i, es decir, el porcentaje de datos de la especie j entre los datos de todas las especies en la muestra i; Qi es el resultado de la cuantificación por qPCR de la muestra i en unidades de UFC/g. Cj es el efecto de contaminación general de la especie j, como la abundancia relativa mediana de la especie j entre todas las muestras.

La corrección simplemente eliminó el efecto de contaminación general de la especie j de la especie j medida en cada muestra:

donde es la abundancia relativa de la especie j de la muestra i; Qi es la cuantificación del total de bacterias de la muestra i; es la cantidad corregida para la especie j de la muestra i.

La corrección de la contaminación se basó en pruebas binomiales de la abundancia de cada taxón entre las muestras y los controles negativos. La probabilidad p de la distribución binomial se estimó como la frecuencia de ocurrencia del taxón en las muestras de control negativo. El número de muestras de ocurrencia y el número total de muestras se asignaron como x y n en la prueba binomial, respectivamente. Los taxones con un valor de p < 0,05 se conservaron en el análisis posterior.

Análisis de la diversidad beta

Se realizó un análisis de la diversidad beta para evaluar las diferencias composicionales entre las comunidades microbianas a nivel de género. PCoA y el escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) se implementaron utilizando el paquete vegan (v2.6-4) en R (v4.3.1) para visualizar los patrones multivariados en la estructura de la comunidad. Ambos métodos utilizan matrices de disimilitud de Bray-Curtis calculadas a partir de perfiles de abundancia a nivel de género. Si bien PCoA conserva las relaciones de distancia originales a través de la descomposición de eigen^[47], NMDS optimiza la función de estrés para representar las distancias de rango en dimensiones reducidas^[48], proporcionando perspectivas complementarias sobre la disimilitud de la comunidad.

La significación estadística de las diferencias entre grupos se cuantificó utilizando PERMANOVA a través de la función adonis2 (paquete vegan) con 999 permutaciones. Este análisis multivariado no paramétrico de la varianza 03 prueba la dispersión del centroide y las diferencias composicionales entre los grupos predefinidos, al tiempo que tiene en cuenta las posibles covariables^[49]. La construcción del modelo siguió sumas de cuadrados secuenciales (tipo I) para controlar las variables de confusión. Tanto los enfoques de visualización como los resultados de PERMANOVA se interpretaron de forma sinérgica para caracterizar la variación de la comunidad microbiana en las condiciones experimentales.

Análisis de la diversidad alfa

Se realizó un análisis de la diversidad alfa para evaluar la diversidad dentro de la muestra en los diferentes niveles taxonómicos (familia, género y especie). El índice de Shannon (que cuantifica la riqueza y la uniformidad de la comunidad) y el índice de Simpson (que enfatiza las proporciones de los taxones dominantes) se calcularon utilizando la función diversity en el paquete vegan (v2.6-4)^[50]. Las comparaciones estadísticas entre los grupos experimentales se realizaron mediante pruebas t de Student por pares con corrección de Benjamini-Hochberg (BH) para comparaciones múltiples, implementadas mediante la función pairwise.t.test en el paquete base R stats^[51]. Se seleccionó este enfoque paramétrico después de confirmar los supuestos de normalidad utilizando las pruebas de Shapiro-Wilk y la homogeneidad de la varianza mediante la prueba de Levene. Los resultados se visualizaron mediante diagramas de caja anotados con niveles de significación (p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001) para resaltar las diferencias de diversidad entre grupos en las diferentes resoluciones taxonómicas.

Descubrimiento de taxones microbianos diferencialmente abundantes entre los tres grupos

Se realizó el descubrimiento de biomarcadores microbianos utilizando el análisis de discriminante lineal y el tamaño del efecto (LEfSe) a través del paquete microeco (v0.11.0) en R^[52]. El análisis identificó características filogenéticamente discriminativas entre los tejidos normales y los microbiomas tumorales del CRC utilizando un enfoque de tres etapas: (1) las pruebas de Kruskal-Wallis^[53] detectaron diferencias en la abundancia a nivel de género entre los grupos (α = 0,25), (2) las pruebas de Wilcoxon por pares^[54] confirmaron la consistencia de los subgrupos y (3) LDA cuantificó los tamaños del efecto (puntuación LDA log10 > 2,0). Las características de baja abundancia se filtraron (umbral de prevalencia: 5% en todas las muestras mediante filter_thres = 0,05) antes del análisis. Se seleccionaron los 20 taxones discriminativos principales con las puntuaciones LDA más altas para la visualización, y se anotaron con sus distribuciones de abundancia relativa (Fig. 1F, G). Se aplicó la corrección para pruebas múltiples utilizando el procedimiento BH^[55] durante la selección de características.

A continuación, se buscó identificar los géneros microbianos que presentan una tendencia significativa en la abundancia en los grupos normal, pólipo y tumor. Para lograrlo, se realizó una prueba de tendencia de Cochran-Armitage^[56]. Primero, para cada género, se convirtió su abundancia relativa en cada muestra en una variable binaria (por ejemplo, alta frente a baja) basándose en un umbral de cuantiles calculado a partir de su distribución en todas las muestras. La prueba de Cochran-Armitage se aplicó entonces a estos datos binarios para evaluar la significación estadística de cualquier tendencia monotónica en los tres grupos mediante el paquete R DescTools (v 0.99.60). Los valores p resultantes se corrigieron para pruebas de hipótesis múltiples utilizando el método BH.

Composición y distribución de las comunidades bacterianas dominantes

Se construyeron gráficos de barras apilados para ilustrar la abundancia media relativa de las comunidades microbianas en los diferentes grupos, incluido el grupo ambiental, el grupo fecal, el grupo de tejido normal, el grupo de tejido de pólipo y el grupo de pacientes con CRC (Fig. 3C, D). El análisis se centró en los 19 taxones más abundantes a nivel de familia y género, mientras que los taxones restantes se categorizaron colectivamente como "otros". Para cada grupo, se calculó la proporción de la abundancia media que contribuyen estos taxones seleccionados. De manera similar, se presentó la distribución proporcional de los géneros dominantes en nuestro conjunto de datos TRM y en los datos fecales de bases de datos públicas a nivel de género.

Se realizó un perfilado de la firma microbiana para identificar los patrones de abundancia a nivel de género asociados con los fenotipos clínicos. Se seleccionaron los 30 géneros más abundantes en todas las muestras basándose en la abundancia relativa acumulada. Se calcularon los valores medios específicos del grupo de log10(x + 1)-transformadas de las abundancias para los grupos comparativos: 1) tejidos normales frente a tumores de CRC y 2) subgrupos de CRC estratificados por características clínicas (por ejemplo, estadio TNM, grado histológico). La visualización se logró utilizando el paquete pheatmap (v1.0.12)^[57] con la agrupación jerárquica (distancia euclidiana, enlace completo) aplicada tanto a las filas (géneros) como a las columnas (grupos clínicos). Los gradientes de color se escalaron mediante la normalización de la puntuación Z dentro de los géneros para enfatizar las variaciones de la abundancia relativa.

Análisis diferencial entre el conjunto de datos TRM y el conjunto de datos de microbiota fecal

Se agregaron un total de siete cohortes disponibles públicamente de la base de datos NCBI como nuestro conjunto de datos de referencia de la microbiota fecal. Los posibles efectos de lote en los diversos conjuntos de datos públicos y en nuestra propia cohorte se redujeron mediante la función adjustbatch implementada en el paquete R MMUPHin (v1.4.2)^[58]. Realizamos un análisis detallado para investigar la relación entre las señales microbianas asociadas con el cáncer en los conjuntos de datos fecales y de tejidos. Realizamos análisis de abundancia diferencial paralelos utilizando ANCOM (paquete R ANCOMBC, v2.4.0)^[59] en ambos conjuntos de datos para identificar los taxones significativamente asociados con el CRC en cada entorno. Para probar formalmente la relación entre estas señales, generamos un diagrama de dispersión de los valores p del análisis de tejidos frente a los valores p_ del análisis fecal para estos taxones. Se utilizó la prueba de correlación de Spearman para confirmar esta observación.

Análisis multivariado de la microbiota y la supervivencia del paciente

Para controlar los posibles factores de confusión clínicos que puedan influir en los resultados de la supervivencia del paciente, realizamos un análisis multivariado. Este análisis se ajustó para las siguientes covariables: edad del paciente, género, estadio tumoral (I-IV), ubicación del tumor (izquierdo o derecho), grado de diferenciación (MA, PD, MD, HD) y estado de quimioterapia (sí o no). Las edades de los pacientes se dividieron en Jóvenes (≤60) y Mayores (>60).

Para evaluar la asociación entre las características microbianas y los resultados de supervivencia, empleamos principalmente modelos de riesgos proporcionales de Cox para cada bacteria individual a nivel de género, ajustando por todas las covariables clínicas enumeradas. Como análisis complementario, también evaluamos el resultado de supervivencia a 5 años utilizando la regresión logística multivariada. Los valores p resultantes se ajustaron mediante el método BH.

Luego, pasamos a un análisis a nivel de comunidad. Primero, se empleó un modelo de riesgos proporcionales de Cox Lasso (paquete R glmnet, v4.1.10) para la selección de características con el fin de identificar una combinación de variables microbianas y clínicas más fuertemente asociadas con la supervivencia. Estas características seleccionadas se utilizaron luego para construir un modelo de riesgos proporcionales de Cox. Se mostraron los valores p y las razones de riesgo con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% en un diagrama de bosque.

También construimos un modelo de regresión logística multivariada basado en las características seleccionadas por Lasso para el resultado de supervivencia a 5 años. Los coeficientes de regresión, los errores estándar, los valores p y las razones de probabilidad (OR) con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% se mostraron en un diagrama de bosque. A continuación, se empleó un modelo de bosque aleatorio para posibles efectos no lineales y de alta dimensión. Después de dividir los datos en conjuntos de entrenamiento (70%) y prueba (30%), primero construimos un modelo de referencia utilizando solo variables demográficas, clínicas y de tratamiento. Luego, se construyó otro modelo agregando los datos microbianos completos para demostrar su impacto en el modelo.

Flujo de trabajo de modelado de aprendizaje automático

El preprocesamiento de los datos del microbioma antes del modelado de aprendizaje automático se realizó utilizando el paquete metagenomeSeq (v1.44.0)^[60]. Primero, se filtraron las características de baja prevalencia eliminando los géneros con una frecuencia de aparición