Arid3b suprime la infiltración y la función de las células T CD8+ en el cáncer colorrectal con estabilidad de microsatélites a través de Runx3.

El cáncer colorrectal (CCR) representa aproximadamente 1,9 millones de nuevos casos y 930.000 muertes anualmente, ocupando el tercer lugar en incidencia y el segundo en mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial^[1]. Si bien los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICIs) dirigidos al eje PD-1/PD-L1 han transformado el panorama terapéutico para el subconjunto de pacientes con CCR que presentan inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H) o tumores con deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento (dMMR), estos beneficios se limitan en gran medida a este grupo minoritario, que constituye solo alrededor del 15% de los casos de CCR^[2]–^[4]. En contraste, la mayoría de los CCR, caracterizados por estabilidad de microsatélites (MSS) y reparación de errores de emparejamiento eficiente (pMMR), exhiben una respuesta limitada a los ICIs, lo que pone de manifiesto una importante brecha terapéutica y subraya la necesidad de dilucidar los mecanismos que impulsan la evasión inmune en estos tumores "fríos".

La respuesta a los ICIs en el CCR está estrechamente relacionada con el panorama inmunológico del microambiente tumoral (MET)^[5],^[6]. Los tumores MSI-H/dMMR suelen albergar una alta carga mutacional tumoral (TMB), abundantes neoantígenos y una robusta infiltración de linfocitos infiltrantes tumorales (TILs), características que contribuyen colectivamente a su favorable respuesta al bloqueo de PD-1/PD-L1^[7]–^[9]. Por el contrario, los tumores MSS/pMMR generalmente carecen de estas características inmunogénicas y, en cambio, se caracterizan por una baja TMB, una escasa infiltración de células T CD8⁺ y un microambiente inmune supresor^[10],^[11]. Es notable que la densidad de células T CD8⁺ dentro de los tumores se ha asociado consistentemente con mejores resultados clínicos en el CCR^[12],^[13], lo que subraya la importancia de identificar estrategias para mejorar la infiltración de células T CD8⁺ en los tumores MSS como una vía para superar la resistencia a los ICIs.

ARID3B, un miembro de la familia de dominios de interacción AT-rich (ARID), es una proteína asociada a la cromatina que regula la transcripción génica mediante la unión a regiones de ADN ricas en AT^[14]–^[16]. Durante el desarrollo embrionario, ARID3B es esencial para el cierre del tubo neural y la vascularización placentaria, y los ratones knockout exhiben letalidad embrionaria debido a profundas anomalías del desarrollo^[17]. Más allá de sus funciones en el desarrollo, ARID3B ha surgido como un modulador dependiente del contexto de la tumorigénesis. Funciona como un oncogén en varios cánceres, incluidos el neuroblastoma, el cáncer de mama, el cáncer de ovario y el cáncer colorrectal, donde promueve el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis^[18]–^[21]. Curiosamente, en el cáncer gástrico, se ha informado que ARID3B ejerce funciones supresoras de tumores^[22]. A pesar de estos conocimientos sobre su papel en la biología del cáncer, la función de ARID3B en la inmunidad mediada por células T sigue siendo desconocida.

El advenimiento del cribado genético basado en CRISPR/Cas9 ha permitido la disección sistemática de la función génica en diversos contextos biológicos^[23]. En particular, los cribados CRISPR in vivo han demostrado ser fundamentales para descubrir los reguladores del comportamiento de las células inmunitarias dentro del MET, ofreciendo información sobre las interacciones tumor-inmune y revelando nuevos objetivos terapéuticos^[24]. Si bien los estudios recientes han aprovechado esta plataforma para mejorar la inmunidad antitumoral, su aplicación en la identificación de reguladores intrínsecos de las células T CD8⁺ en tumores con exclusión inmune sigue siendo limitada^[25],^[26].

En este estudio, realizamos un cribado CRISPR/Cas9 in vivo dirigido a genes en las células T CD8⁺ dentro de un modelo de tumor colorrectal MSS derivado de CMT93 para identificar los reguladores que limitan la infiltración de células T. Identificamos Arid3b como un supresor clave de la infiltración tumoral y la función antitumoral de las células T CD8⁺. La ablación genética de Arid3b en las células T CD8⁺ conduce a una mayor acumulación intratumoral y una mejor control del tumor. Mecánicamente, la deficiencia de Arid3b da como resultado la regulación al alza de Runx3, un factor de transcripción esencial para la residencia tisular y la diferenciación efectora de las células T CD8⁺. Nuestros hallazgos revelan el eje Arid3b–Runx3 como un punto de control crítico que regula la exclusión de células T en el CCR MSS y ofrece una estrategia potencial para reprogramar el microambiente tumoral "frío" para restaurar la sensibilidad inmunoterapéutica.

Resultados

El cribado CRISPR in vivo identifica a Arid3b como un regulador negativo de la infiltración de células T CD8⁺

Para identificar sistemáticamente los genes que restringen la infiltración de células T CD8⁺ en el microambiente tumoral de los cánceres colorrectales "fríos" con baja respuesta inmune, realizamos un cribado CRISPR/Cas9 in vivo utilizando un modelo de ratón sinérgico. CMT93-OVA, una línea celular de cáncer colorrectal murino estable en microsatélites (MSS), se implantó subcutáneamente en ratones hembra Rag1−/− para establecer tumores. En paralelo, las células T CD8⁺ se aislaron de los bazo y los ganglios linfáticos de ratones hembra OT-I; Cas9, se activaron ex vivo con anticuerpos anti-CD3/CD28, se transducieron con una biblioteca agrupada de sgRNA dirigida a genes reguladores inmunitarios y se cultivaron con IL-2 murina recombinante. Se evaluaron un total de 2236 genes (9444 sgRNA) que representan proteínas de membrana, factores de transcripción y enzimas utilizando un grupo de gRNA que comprende 4 gRNA por gen y 500 gRNA de control negativo. Las células T editadas se transfirieron de forma adoptiva a ratones con tumores por inyección en la vena de la cola el día 7 después de la implantación del tumor (Fig. 1a).

El direccionamiento de los principales reguladores negativos mejoró la infiltración, la proliferación y la supervivencia de las células T dentro de los tumores, lo que condujo al enriquecimiento de los gRNA correspondientes. Siete días después de la transferencia adoptiva, se cosecharon los tumores y se procesaron en suspensiones de células individuales. Las células T CD8⁺ transferidas se identificaron por expresión de GFP y se clasificaron para su análisis posterior. La abundancia de sgRNA en estas células T CD8⁺ infiltrantes tumorales se comparó con las células de entrada previas a la inyección utilizando la secuenciación de alto rendimiento (Fig. 1a). Interesantemente, el análisis basado en modelos de CRISPR/Cas9 de knockout a nivel del genoma (MAGeCK)^[27] reveló que Arid3b fue uno de los principales candidatos enriquecidos en las células T CD8⁺ intratumorales, lo que indica su posible papel como un regulador negativo de la infiltración de células T (Fig. 1b).

Para validar el papel funcional de Arid3b, seleccionamos dos sgRNA con las puntuaciones de enriquecimiento más altas para eliminar el gen en las células T CD8⁺. El análisis de Western blot confirmó la eficiente depleción de la proteína ARID3B (Fig. 1a complementaria). Estas células T editadas se transfirieron luego a ratones hembra Rag1−/− que presentaban tumores CMT93-OVA. En comparación con las células tratadas con sgRNA de control (sg-Int), tanto las células T sg-Arid3b−1 como sg-Arid3b−2 redujeron significativamente el crecimiento tumoral en el tumor CMT93 (Fig. 1c y Fig. 1b complementaria). Este fenotipo se mantuvo consistente cuando se extendió a los ratones Rag1−/− macho que presentaban cáncer colorrectal MC38-OVA (Fig. 1e y Fig. 1c complementaria). El análisis citométrico de flujo reveló un aumento notable en la frecuencia de células T CD8⁺ con Arid3b eliminado entre los TILs (Fig. 1d, f). Para evaluar si estos hallazgos se extienden a un entorno inmunocompetente, realizamos experimentos similares utilizando ratones C57BL/6 hembra de tipo salvaje que presentaban tumores B16F10-OVA. La transferencia adoptiva de células T CD8⁺ deficientes en Arid3b nuevamente resultó en un mejor control tumoral y una mayor proporción de células T CD8⁺ infiltrantes en comparación con las células T de control (Fig. 1g, h y Fig. 1d complementaria). En conjunto, estos resultados identifican a Arid3b como un supresor clave de la infiltración de células T CD8⁺ y demuestran que su ablación genética mejora la acumulación de células T dentro de los tumores.

Arid3b suprime la función efectora, la migración y la infiltración tumoral de las células T CD8⁺

Para caracterizar aún más el papel de Arid3b en la biología de las células T CD8⁺, investigamos sus efectos sobre la activación, el agotamiento, la función efectora, la citotoxicidad y la capacidad de migración de las células T. Primero, evaluamos el estado de activación temprana y el agotamiento examinando la expresión del marcador de activación CD69 y el marcador de agotamiento TIM-3. Ni el knockout ni la sobreexpresión de Arid3b alteraron la expresión de CD69 en las células T CD8⁺, lo que indica que no hay un efecto significativo sobre la activación inicial (Fig. 2a, b complementaria). En contraste, el knockout de Arid3b condujo a una reducción modesta pero consistente en la proporción de células TIM-3⁺, mientras que la sobreexpresión de Arid3b aumentó significativamente la expresión de TIM-3 (Fig. 2c, d complementaria), lo que sugiere un papel en la promoción del agotamiento de las células T.

A continuación, evaluamos el impacto de Arid3b en la producción de citocinas efectoras. La deleción de Arid3b en las células T CD8⁺ aumentó notablemente la expresión de IFN-γ y granzima B (GZMB) después de la estimulación antigénica, mientras que la sobreexpresión de Arid3b suprimió su producción (Fig. 2a–d). Estos hallazgos sugieren que Arid3b restringe la función efectora de las células T CD8⁺. Luego, examinamos si Arid3b modula la capacidad citotóxica de las células T CD8⁺. Las células T CD8⁺ con Arid3b eliminado o sobreexpresando se colocaron en monocultivo con células tumorales que expresaban OVA (CMT93-OVA, MC38-OVA o B16F10-OVA). La deficiencia de Arid3b mejoró significativamente la muerte de las células tumorales en todas las líneas, mientras que su sobreexpresión disminuyó la actividad citotóxica (Fig. 2e, f y Fig. 2e, f complementaria), lo que indica un papel intrínseco de Arid3b en la citotoxicidad.

Para determinar si Arid3b influye en la migración de las células T, realizamos un ensayo de transwell utilizando el medio acondicionado de CMT93-OVA como atrayente (Fig. 2g). Las células T CD8⁺ deficientes en Arid3b exhibieron una migración significativamente mejorada en comparación con las células de control (Fig. 2h). Para reducir la variabilidad entre lotes, se realizaron ensayos de migración competitivos. Específicamente, las células T CD8⁺ de control tdTomato⁺ se mezclaron en una proporción de 1:1 con células T CD8⁺ GFP⁺ sg-Int o GFP⁺ sg-Arid3b−1 y se cargaron en la cámara superior del transwell. En el grupo sg-Int–GFP/control, la proporción GFP:Tomate en la cámara inferior se mantuvo aproximadamente en 1, mientras que en el grupo sg-Arid3b−1–GFP/control, la proporción GFP:Tomate se elevó significativamente, lo que indica una mayor capacidad de migración de las células deficientes en Arid3b (Fig. 2i). Para validar estos hallazgos in vivo, transferimos poblaciones mixtas de células T CD8⁺ GFP⁺ y tdTomato⁺ en una proporción de 1:1 a ratones macho con tumores CMT93-OVA. El análisis citométrico de flujo de los linfocitos infiltrantes tumorales siete días después de la transferencia reveló que las células T CD8⁺ con Arid3b eliminado se acumularon preferentemente en los tumores en comparación con las células de control (Fig. 2j).

Cabe destacar que seleccionamos otro gen de los principales enriquecidos del cribado original, Znf131, para una validación funcional preliminar. Primero, confirmamos la eficiencia del knockout de la proteína ZNF131 en las células T CD8⁺ mediante el análisis de Western blot (Fig. 2g complementaria). Tras la estimulación específica del antígeno, las células T CD8⁺ deficientes en Znf131 exhibieron niveles significativamente elevados de IFN-γ y GZMB en comparación con los controles (Fig. 2h, i complementaria). Además, en los ensayos de cocultivo con líneas celulares tumorales que expresaban OVA (CMT93-OVA o MC38-OVA), la deficiencia de Znf131 mejoró notablemente la capacidad de matar células tumorales de las células T CD8⁺ en todos los modelos probados (Fig. 2j, k complementaria). Estos resultados refuerzan la validez de nuestro enfoque de cribado e indican que Znf131, al igual que Arid3b, funciona como un regulador negativo de la función efectora de las células T CD8⁺.

El análisis integrativo de RNA-seq, ATAC-seq y ChIP-seq revela la regulación dependiente de Arid3b de los programas de activación y efector de las células T CD8⁺

Para obtener una visión completa del programa transcripcional regulado por Arid3b e identificar posibles efectores posteriores que puedan explicar los cambios fenotípicos, realizamos análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq), ensayo para la cromatina accesible a la transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) y secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq). Las células CD8⁺ transducidas con sg-Arid3b o sg-Int se cocultivaron con o sin células tumorales CMT93-OVA durante 4 h, y se extrajo el ARN total para el perfilado transcripcional (n = 3 por grupo). El RNA-seq identificó cambios sustanciales en la expresión génica tras la interacción con el antígeno tumoral. Utilizando un umbral de P 90% de las células T CD8⁺ y que se encontraban entre los 1500 primeros según la abundancia de transcritos. Para garantizar la cobertura de los principales reguladores, se incluyeron todos los factores de transcripción anotados en la base de datos UniProt, independientemente del nivel de expresión, dado su papel central en las redes reguladoras de genes, incluso a baja abundancia^[44]. Además, se incorporaron los genes de proteínas de membrana, los genes con función relacionada con el sistema inmunitario (anotados a través de ImmPort Shared Data^[45]) y los genes expresados de forma diferencial tras la activación de las células T CD8⁺ (basado en conjuntos de datos de GEO). Con el fin de mitigar el posible sesgo de supervivencia, se excluyeron sistemáticamente los genes esenciales y los genes de mantenimiento anidados en la base de datos DepMap^[46]. Todos los genes humanos seleccionados se mapearon a sus ortólogos en ratón. Para cada gen diana, se diseñaron cuatro sgRNA de alta eficiencia utilizando el algoritmo CRISPick^[47],^[48]. Además, se incluyeron 500 sgRNA de control no diana (sg-Intergenic#1–500) que se dirigían a regiones intergénicas. Todas las secuencias de sgRNA se sometieron a la alineación BLAT para confirmar la ausencia de homología fuera del objetivo. La biblioteca final consistió en 2236 genes y 9444 sgRNA. Las secuencias de los sgRNA de control no diana se enumeraron en los Datos Suplementarios 1.### Cribado CRISPR/Cas9 in vivo

El retrovirus se generó mediante la cotransfección de células 293T con plásmidos de la biblioteca retroviral PMYs y plásmidos de empaquetamiento^[49]. En resumen, el plásmido de la biblioteca PMYs y los plásmidos de empaquetamiento se cotransfectaron en una proporción de 1:1 en células 293T de bajo paso a una confluencia del 80% en placas de cultivo de tejidos de 15 cm. El sobrenadante viral se recogió a las 48 h y 72 h después de la transfección, se filtró utilizando un filtro de jeringa de polietetersulfona de 0,45 μm y se concentró utilizando PEG8000. El sobrenadante concentrado se dividió en alícuotas y se almacenó a −80 °C hasta su uso. A las 48 h después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes virales, se concentraron y se congelaron a −80 °C. La línea celular de cáncer colorrectal murino MSS, CMT93-OVA, se implantó por vía subcutánea en ratones Rag1−/− para establecer tumores xenógenos. El mismo día, las células T OT1; Cas9 CD8+ se aislaron de los bazo y los ganglios linfáticos periféricos de los ratones OT1; Cas9. Veinticuatro horas después del aislamiento, las células T OT1; Cas9 CD8+ se transducieron con retrovirus a una multiplicidad de infección de 0,3. Después de 48 h de cultivo, las células T que expresaban GFP se clasificaron mediante citometría de flujo y se expandieron in vitro. El día 7 después de la implantación del tumor, se reservaron 1 × 106 células T OT1; Cas9 CD8+ transducidas como muestra de entrada. En total, se transfirieron 5 × 106 células T OT1; Cas9 transducidas por ratón por vía de la vena caudal en ratones Rag1−/− portadores de tumores CMT93-OVA. Siete días después de la transferencia, se extirparon los tumores subcutáneos, se disociaron en suspensiones de células individuales y se realizó citometría de flujo para aislar las células T GFP+ CD8+, que representaban las células T OT1; Cas9 CD8+ transferidas. El ADN genómico de las células GFP+ clasificadas y las células de referencia de entrada se sometió a secuenciación. Los datos de secuenciación se analizaron utilizando el algoritmo MAGeCK para identificar los sgRNA enriquecidos de forma diferencial.### Estudios de tumores

El tamaño de los tumores se midió cada 2-3 días con un calibre vernier. Los volúmenes tumorales se calcularon como (longitud × ancho × ancho)/2. Se establecieron puntos finales éticos cuando la longitud del tumor alcanzó los 20 mm. No se superó el tamaño tumoral máximo.### Eliminación y sobreexpresión de genes

Se seleccionaron dos sgRNA con el mayor factor de enriquecimiento de Arid3b y Znf131 en la biblioteca CRISPR para eliminar la expresión de Arid3b en las células T CD8+ de ratón. Además, se diseñaron dos sgRNA para eliminar Runx3 en las células T CD8+ de ratón y ARID3B en las células T CD8+ humanas utilizando CRISPOR^[50]. Para la sobreexpresión, se construyeron plásmidos que contenían el gen Arid3b y se transfectaron en las células T CD8+ de ratón. Los niveles de proteína de ARID3B, ZNF131 y RUNX3 se evaluaron mediante Western blot para confirmar la eficiencia de la eliminación y los niveles de sobreexpresión.

El número y la secuencia de sgRNA fueron los siguientes.

sg-Int: AGAGATGAGACAAACTACCC

sg-Arid3b-1: TGATGGGAATCCGGTTGATT

sg-Arid3b-2: TCCATCAGCATCGTCACTCC

sg-Znf131-1: AGAACCTGTGGAAATTGAGG

sg-Znf131-2: AGCAAAACTAATGATACAAG

sg-Runx3-1: GGCAAGATGGGCGAGAACAG

sg-Runx3-2: TCCATCCGGCACATCCCCCA

sg-ARID3B-1: AGTGTTTGAACGGGGCAACA

sg-ARID3B-2: AATTGATGGCAACCGCAGGG.### Western blot

Se prepararon extractos de proteínas de células enteras mediante la lisis de células T tratadas o no con péptido OVA durante 4 h utilizando tampón de lisis RIPA. Los lisados celulares se desnaturalizaron hirviéndolos a 100 °C durante 5 min y se cargaron en geles SDS-PAGE del 7,5-12,5% antes de transferirlos a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche en polvo descremada en tampón salino tamponado con Tris que contenía 0,1% de Tween-20 (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna con anticuerpos primarios a 4 °C bajo una agitación suave. Después del lavado con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteína se visualizaron utilizando un sistema de imagen ChemiDoc™ (Bio-Rad Laboratories) con sustratos de quimioluminiscencia mejorada. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: ARID3B (Bethyl Laboratory#A302-564A, dilución 1:2000), β-actina (Proteintech#20536-1-AP, dilución 1:5000), RUNX3 (Abmart#T55395, dilución 1:2000), H3 (CST#4499, dilución 1:5000), Flag (Proteintech#66008-4-Ig, dilución 1:5000), HA (CST#3724, dilución 1:5000) y ZNF131 (ABclonal#A15331, dilución 1:2000).### Ensayo de eliminación mediada por células T

Las células cancerosas se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 2 × 105 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. A continuación, se añadieron células T CD8+ a las células tumorales en proporciones efector:diana (E:T) que oscilaban entre 1:1 y 1:9. Tras 24-48 h de cocultivo, se recogieron las células cancerosas y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células muertas se tiñeron con DAPI.### Análisis de citometría de flujo

Se utilizó ampliamente la citometría de flujo para analizar la proporción de células T CD8+ transferidas de forma adoptiva en los linfocitos infiltrantes tumorales, la proporción de células CD69+CD103+, las células T IFN-γ+ y los niveles de expresión de varios marcadores, como CD69, GZMB, TIM3 y TIGIT, en los diferentes grupos experimentales. Los anticuerpos utilizados son los siguientes: APC-anti-ratón-CD3 (BioLegend#100235), PE/Cyanine7-anti-ratón-CD8a (BioLegend#100721), Brilliant Violet 421-anti-ratón-CD45 (BioLegend#103133), PE-anti-ratón-Granzima B (BioLegend#372214), Brilliant Violet 421-anti-ratón-CD69 (BioLegend#104527), Brilliant Violet 421-anti-ratón-IFN-γ (BioLegend#505829), APC-anti-ratón-CD103 (BioLegend#110905), PE-anti-ratón-TIGIT (Vstm3) (BioLegend#156103), Brilliant Violet 421-anti-ratón-CD366 (TIM-3) (BioLegend#134019), PE/Cyanine7-anti-humano-CD69 (BioLegend#310911), PE/Cyanine7-anti-humano-IFN-γ (BioLegend#506517), APC-anti-humano/ratón-Granzima B (BioLegend#372203), APC-Annexin-V (BioLegend#640919). Todos los anticuerpos se utilizaron a una dilución de 1:200. Las estrategias de clasificación para todos los experimentos de flujo se muestran en la Figura Suplementaria S7.### Ensayo de migración de células T

Para el ensayo de migración, el sobrenadante de las células CMT93-OVA se colocó en la cámara inferior de un transwell de 5 μm, y las células T OT1; Cas9 CD8+ con eliminación de Arid3b o de control se añadieron a la cámara superior. Después de 24 h, se contó el número de células T CD8+ en la cámara inferior. En el ensayo de migración competitivo, se utilizaron células T CD8+ sg-Int que contenían tdTomato (sg-Int-Tomato) como control, y se mezclaron en proporciones iguales con células T CD8+ que contenían GFP de control (sg-Int-GFP) o células con eliminación de Arid3b (sg-Arid3b-1-GFP) para el experimento de transwell. Se contó la proporción de tdTomato a GFP en la cámara inferior para evaluar la capacidad de migración. Para la validación in vivo, se transfirieron poblaciones mixtas de células T CD8+ sg-Int-GFP/sg-Int-Tomato o sg-Arid3b-1-GFP/sg-Int-Tomato de forma adoptiva en ratones portadores de tumores CMT93-OVA, y se analizaron los linfocitos infiltrantes tumorales mediante citometría de flujo.### RNA-seq

Para investigar las alteraciones transcripcionales en las células T CD8+ en condiciones estimuladas por antígenos y basales, se realizó un perfilado de RNA-seq en las células T CD8+ sg-Int y sg-Arid3b cocultivadas con o sin células tumorales CMT93-OVA en una proporción de 1:1, con 3 muestras en cada grupo. Después de 4 h de cocultivo, se aislaron las células T CD8+ mediante la clasificación citométrica de flujo. Se recogieron un mínimo de 1 × 106 células por muestra en todos los grupos. Se extrajo el ARN total de las células T CD8+ purificadas utilizando protocolos estándar y se sometió a control de calidad. Las muestras de ARN de alta calidad se enviaron a Annoroad Gene Technology para la preparación de bibliotecas y el secuenciamiento de doble extremo en una plataforma Illumina.### RT-qPCR

Se extrajo el ARN total de las células T utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se evaluó la concentración y la pureza del ARN mediante NanoDrop 2000. Se sintetizó el cDNA de cadena simple a partir de 1 μg de ARN utilizando el kit Evo M-MLV RT (Accurate Biology) con cebadores de hexámero aleatorio según las instrucciones del fabricante. La amplificación de qPCR se realizó por triplicado utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Se calculó la expresión génica relativa mediante el método ΔΔCt, normalizada con Actb (β-actina) como control endógeno. Las secuencias de los cebadores utilizados en qPCR se detallan en la Tabla Suplementaria 1.### ATAC-seq

Se construyeron bibliotecas ATAC-seq a partir de células T CD8+ (ya sea con eliminación de Arid3b o de control, con o sin estimulación con antígeno OVA) utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN TruePrep V2 para Illumina (Vazyme, TD501) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se lavaron 50 000 células viables por condición con PBS frío y se lisaron en tampón de lisis ATAC-seq frío (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% IGEPAL CA-630) durante 10 min para aislar los núcleos. Los núcleos se centrifugaron a 500×g durante 5 min a 4 °C. Los núcleos lisiados se resuspendieron en 50 μL de mezcla de etiquetado y se incubaron a 37 °C durante 30 min. El ADN etiquetado se purificó utilizando cuentas de limpieza de ADN VAHTS (Vazyme, N411). La amplificación de la biblioteca se realizó con el kit de índice TruePrep V4 para Illumina (Vazyme, TD204) en las siguientes condiciones de ciclo térmico: 72 °C durante 3 min; 98 °C durante 30 s; seguido de 12-15 ciclos de 98 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s. Las bibliotecas amplificadas se purificaron de nuevo con cuentas de limpieza de ADN VAHTS y se sometieron a control de calidad por Annoroad Gene Technology antes del secuenciamiento de doble extremo en una plataforma Illumina. Los datos de secuenciación ATAC-seq se procesaron con la canalización ENCODE ATAC-seq (v2.2.2). Después del control de calidad y el recorte de adaptadores, las lecturas se alinearon con el genoma GRCm38 para generar archivos BAM, y los picos se identificaron con Genrich en modo ATAC-seq.### Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

Se realizó ChIP-seq utilizando el anticuerpo HA o el anticuerpo IgG correspondiente en células T CD8+ sobreexpresoras de HA en condiciones no tratadas o tratadas con péptido antígeno OVA durante 4 h. Los picos de unión diferencial se visualizaron mediante un mapa de calor, y se realizó la anotación genómica de los picos, seguida del análisis de motivos y el análisis de enriquecimiento KEGG. Se realizó un análisis ChIP-qPCR utilizando el ADN de ChIP para detectar si la proteína Arid3b se une al promotor del gen Runx3 o del gen Gapdh.

La secuencia del cebador utilizada en ChIP-qPCR fue la siguiente.

Runx3-F: TTCTAAGGGGCCGTGACATC

Runx3-R: AGGATGCAAGAAGCCAGCTC

Gapdh-F: GGAGGTGAAGCAGGCTCAAT

Gapdh-R: TCCTGTCCCATTGTCAAGCC.### Ensayo de reportero de luciferasa dual

Se construyó el plásmido pGL4.10-mRunx3-luc2, en el que la transcripción de la luciferasa de luciérnaga se dirigió mediante el promotor del gen Runx3 del ratón. Este plásmido se cotransfectó en células 293T con el plásmido pGL4.74-TK-hRluc y, o bien, el plásmido de sobreexpresión de Arid3b, o el plásmido de control para el ensayo de reportero de luciferasa dual. También se construyeron plásmidos de proteínas truncadas de ARID3B y RUNX3 marcadas con HA y Flag, respectivamente, o los plásmidos de promotor mutante de Runx3, y se utilizaron en el ensayo de reportero de luciferasa dual para analizar la actividad relativa de la luciferasa y determinar los dominios funcionales y los elementos de unión. La etiqueta HA o Flag se expresa en el extremo N-terminal de ARID3B o RUNX3, mientras que la proteína fluorescente EGFP o tdTomato se conecta al extremo C-terminal mediante un enlazador P2A.

Inmunoprecipitación-espectrometría de masas (IP-MS)

La inmunoprecipitación se realizó utilizando el kit de inmunoprecipitación de proteínas A DynabeadsTM (ThermoFisher, CAT#10006D). Las cuentas magnéticas de proteína A (40 µL por muestra) se incubaron con 1 µg de anticuerpo anti-HA o IgG de control en tampón de unión durante 2 h a 4 °C con agitación para permitir la conjugación del anticuerpo. Los gránulos celulares (>1 × 107 células) se lisaron sobre hielo durante 30 min en tampón de lisis suplementado con 1× cóctel de inhibidores de proteasas/fosfatasas. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 15.000×g durante 10 min a 4 °C, y se retuvo el 10% del sobrenadante como control de entrada. El lisado restante se dividió por igual y se incubó con las cuentas conjugadas con HA o IgG durante 3 h a 4 °C con agitación. Las cuentas se lavaron tres veces con tampón de lavado, y las proteínas unidas se eluyeron en 2× tampón de carga, seguido de ebullición a 95 °C durante 5 min. Se cargaron 5 µL de proteínas eluidas en un gel SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con plata para confirmar el enriquecimiento de HA-Arid3b antes del análisis de espectrometría de masas.

Análisis de enriquecimiento de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)

El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG se realizó sobre los genes diferencialmente sobreexpresados identificados entre los grupos sg-Int y sg-Arid3b en condiciones de cocultivo tumoral, utilizando la función "enrichKEGG" del paquete R "clusterProfiler" ^[51]. Los genes diferencialmente sobreexpresados se identificaron mediante los criterios de P < 0,05 y cambio de log2 ≥ 0,4.

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)

Se realizó GSEA para evaluar si los conjuntos de genes predefinidos presentaban diferencias estadísticamente significativas entre los grupos sg-Arid3b y sg-Int utilizando el software GSEA 4.3.3 ^[52]. En este estudio, se empleó la firma de genes sobreexpresados de RUNX3 derivada de GSE50121, junto con las firmas centrales de circulación y residencia tisular definidas por Milner et al. ^[31], ^[53].

Análisis estadísticos

Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías para analizar los datos de crecimiento tumoral. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t de Student de dos colas no pareada. Alternativamente, para las comparaciones que involucran múltiples grupos, se realizó un ANOVA de una o dos vías, seguido de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett, Sidak o Tukey. Los análisis estadísticos se realizaron sobre los datos presentados como media ± SEM. R 4.4.1 y GraphPad Prism 10 se utilizaron para todas las representaciones gráficas y los cálculos estadísticos. La significación estadística se determinó con un valor de P inferior a 0,05.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Líneas celulares y ratones

Las líneas celulares CMT93, MC38, B16F10 y 293T fueron un regalo del laboratorio de Pan (Deng Pan, Universidad de Tsinghua), y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (SFB) y 1% de penicilina/estreptomicina. Las células Caco-2 y SW480, mantenidas en nuestro laboratorio, se cultivaron en DMEM suplementado con 10% o 20% de SFB, respectivamente. Todas las líneas celulares se incubaron a 37 °C con 5% de CO₂.

Se utilizaron ratones, ambos sexos, de entre 6 y 8 semanas de edad para el estudio. Los ratones OT-I; Cas9 y Rag1−/− fueron un regalo del laboratorio de Pan ^[40], ^[41]. Se compraron ratones hembra C57BL/6 WT (N.º N000013) a GemPharmatech, Nanjing, China. Se compraron ratones hembra NOG (N.º 408) a Charles River, Beijing, China. Los animales del mismo sexo se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales. Todos los ratones se mantuvieron en una instalación libre de patógenos específicos en el Centro de Recursos Animales de la Universidad de Pekín. Los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical. Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pekín y se realizó con protocolos aprobados (AAIS-Zengzx-01).

Aislamiento, transducción y cultivo de células CD8+ T del ratón

Las células CD8+ T primarias OT-1; Cas9 se aislaron de los bazo y ganglios linfáticos periféricos de los ratones OT-1; Cas9 utilizando el kit de aislamiento de células CD8+ T de ratón MojoSort™ según el protocolo del fabricante. Las células aisladas se cultivaron en medio completo RPMI-1640 (que contiene 10% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales, 20 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio y 0,05 mM de 2-mercaptoetanol) suplementado con 1 µg/mL de anticuerpo anti-ratón CD28 y 5 µg/mL de anticuerpo anti-ratón CD3 durante 24 h. Luego, las células T se infectaron con retrovirus concentrado en medio completo RPMI-1640 suplementado con 20 ng/mL de IL-2 recombinante de ratón. Dos días después de la transducción, las células T se clasificaron mediante citometría de flujo. Posteriormente, las células T se cultivaron en medio completo RPMI-1640 suplementado con 20 ng/mL de IL-2.

Aislamiento, transducción y cultivo de células CD8+ T humanas

Las células CD8+ T humanas se aislaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) comerciales compradas a Biosource. El día 1, las PBMC congeladas se descongelaron y se reactivaron en medio completo RPMI-1640, suplementado con 10% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de GlutaMAX, 1 mM de piruvato de sodio y 10 ng/mL de IL-2 recombinante humana. Después de 24 h de cultivo, se recogieron las PBMC y se aislaron las células CD8+ T humanas utilizando el kit de aislamiento de células CD8+ T humanas EasySepTM según las instrucciones del fabricante. Las células CD8+ T aisladas se activaron durante 24 h en medio completo RPMI-1640 que contiene 5 µg/mL de anti-CD3 humano, 1 µg/mL de anti-CD28 humano y 5 µg/mL de fibronectina. Después de la activación, las células T se infectaron con vectores lentivirales concentrados en medio fresco. Dos días después de la infección, las células infectadas con éxito se clasificaron mediante citometría de flujo. Posteriormente, las células CD8+ T clasificadas se mantuvieron en medio completo RPMI-1640 a una concentración de 1 × 106 células/mL. El cultivo se mantuvo realizando un reemplazo de la mitad del medio diariamente y pasando las células cada dos días para mantener una densidad y viabilidad celular óptimas.

Diseño de la biblioteca y selección de los objetivos de la pantalla CRISPR

Los genes candidatos para la pantalla CRISPR se seleccionaron mediante una estrategia integrada y de múltiples pasos. En primer lugar, se definieron los genes con una expresión robusta en las células CD8+ T utilizando datos de secuenciación de ARN de una sola célula del portal The Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) ^[42], ^[43]. Se retuvieron los genes expresados en >90% de las células CD8+ T y que se clasificaron entre los 1500 primeros por abundancia de transcritos. Para garantizar la cobertura de los reguladores clave, se incluyeron todos los factores de transcripción anotados en la base de datos UniProt, independientemente del nivel de expresión, dado su papel central en las redes de regulación génica, incluso a baja abundancia ^[44]. Además, se incorporaron los genes de proteínas de membrana, los genes funcionales relacionados con el sistema inmunitario (anotados a través de ImmPort Shared Data ^[45]) y los genes expresados de forma diferencial tras la activación de las células CD8+ T (basados en conjuntos de datos de GEO). Para mitigar el posible sesgo de supervivencia, se excluyeron sistemáticamente los genes esenciales y los genes domésticos anotados en la base de datos DepMap ^[46]. Todos los genes humanos seleccionados se mapearon a sus ortólogos en ratón. Para cada gen objetivo, se diseñaron cuatro sgRNA de alta eficiencia utilizando el algoritmo CRISPick ^[47], ^[48]. Además, se incluyeron 500 sgRNA de control no dirigidos (sg-Intergenic#1-500) que se dirigían a regiones intergénicas. Todas las secuencias de sgRNA se sometieron a alineación BLAT para confirmar la ausencia de homología fuera del objetivo. La biblioteca final consistió en 2236 genes y 9444 sgRNA. Las secuencias de los sgRNA de control no dirigidos se enumeraron en los Datos suplementarios 1.

Cribado CRISPR in vivo

El retrovirus se generó cotransfectando células 293T con plásmidos de la biblioteca PMYs y plásmidos de empaquetamiento ^[49]. En resumen, el plásmido de la biblioteca PMYs y los plásmidos de empaquetamiento se cotransfectaron en una proporción de 1:1 en células 293T de bajo paso a una confluencia del 80% en placas de cultivo de 15 cm. El sobrenadante viral se recogió 48 h y 72 h después de la transfección, se filtró mediante un filtro de jeringa de polietetersulfona de 0,45 µm y se concentró utilizando PEG8000. El sobrenadante concentrado se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. 48 h después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes virales, se concentraron y se congelaron a -80 °C. La línea celular de carcinoma colorrectal murino MSS, CMT93-OVA, se implantó por vía subcutánea en ratones Rag1−/− para establecer tumores xenoinjertados. Al mismo tiempo, se aislaron las células CD8+ T OT1; Cas9 del bazo y los ganglios linfáticos periféricos de los ratones OT1; Cas9. Veinticuatro horas después del aislamiento, las células CD8+ T OT1; Cas9 se transducieron con retrovirus a una multiplicidad de infección de 0,3. Después de 48 h de cultivo, las células T que expresaban GFP se clasificaron mediante citometría de flujo y se expandieron in vitro. Siete días después de la implantación del tumor, se guardaron 1 × 106 células CD8+ T OT1; Cas9 transducidas como control de entrada. En total, se transfirieron 5 × 106 células CD8+ T OT1; Cas9 transducidas por ratón por vía intravenosa en ratones Rag1−/− portadores de tumores CMT93-OVA. Siete días después de la transferencia, se extirparon los tumores subcutáneos, se disociaron en suspensiones de células individuales y se realizó citometría de flujo para aislar las células CD8+ T GFP+, que representan las células CD8+ T OT1; Cas9 transferidas. El ADN genómico de las células GFP+ clasificadas y las células de referencia de entrada se sometió a secuenciación. Los datos de secuenciación se analizaron utilizando el algoritmo MAGeCK para identificar los sgRNA enriquecidos de forma diferencial.

Estudios de tumores

El tamaño de los tumores se midió cada 2-3 días con un calibre de vernier. Los volúmenes tumorales se calcularon como (longitud × ancho × ancho)/2. Se establecieron puntos finales éticos cuando la longitud del tumor alcanzó los 20 mm. No se superó el tamaño máximo del tumor.

Eliminación y sobreexpresión de genes

Se seleccionaron dos sgRNA con el mayor pliegue de enriquecimiento de Arid3b y Znf131 en la biblioteca CRISPR para eliminar la expresión de Arid3b en las células CD8+ T del ratón. Además, se diseñaron dos sgRNA para eliminar Runx3 en las células CD8+ T del ratón y ARID3B en las células CD8+ T humanas utilizando CRISPOR ^[50]. Para la sobreexpresión, se construyeron plásmidos que contenían el gen Arid3b y se transfectaron en las células CD8+ T del ratón. Los niveles de proteína de ARID3B, ZNF131 y RUNX3 se evaluaron mediante Western blot para confirmar la eficiencia de la eliminación y los niveles de sobreexpresión.

El número y la secuencia de sgRNA fueron los siguientes.

sg-Int: AGAGATGAGACAAACTACCC

sg-Arid3b-1: TGATGGGAATCCGGTTGATT

sg-Arid3b-2: TCCATCAGCATCGTCACTCC

sg-Znf131-1: AGAACCTGTGGAAATTGAGG

sg-Znf131-2: AGCAAAACTAATGATACAAG

sg-Runx3-1: GGCAAGATGGGCGAGAACAG

sg-Runx3-2: TCCATCCGGCACATCCCCCA

sg-ARID3B-1: AGTGTTTGAACGGGGCAACA

sg-ARID3B-2: AATTGATGGCAACCGCAGGG.

Western blot

Se prepararon extractos proteicos de células completas mediante la lisis de células T tratadas o no con péptido OVA durante 4 h, utilizando un tampón de lisis RIPA. Los lisados celulares se desnaturalizaron hirviéndolos a 100 °C durante 5 min y se cargaron en geles SDS-PAGE al 7,5–12,5% antes de transferirlos a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche en polvo descremada en solución salina tamponada con Tris que contenía un 0,1% de Tween-20 (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna con anticuerpos primarios a 4 °C bajo una agitación suave. Después del lavado con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un sistema de imagen ChemiDoc™ (Bio-Rad Laboratories) con sustratos de quimiluminiscencia mejorada. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: ARID3B (Bethyl Laboratory#A302-564A, dilución 1:2000), β-actina (Proteintech#20536-1-AP, dilución 1:5000), RUNX3 (Abmart#T55395, dilución 1:2000), H3 (CST#4499, dilución 1:5000), Flag (Proteintech#66008-4-Ig, dilución 1:5000), HA (CST#3724, dilución 1:5000) y ZNF131 (ABclonal#A15331, dilución 1:2000).

Ensayo de citotoxicidad mediada por células T

Las células cancerosas se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 2 × 105 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. A continuación, se añadieron células T CD8+ a las células tumorales a relaciones efector/diálogo (E:T) que oscilaban entre 1:1 y 1:9. Tras 24–48 h de cocultivo, las células cancerosas se recogieron y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células muertas se tiñeron con DAPI.

Análisis por citometría de flujo

Se utilizó ampliamente la citometría de flujo para analizar la proporción de células T CD8+ transferidas adoptivamente en los linfocitos infiltrantes tumorales, la proporción de células CD69+CD103+, las células T IFN-γ+ y los niveles de expresión de varios marcadores, como CD69, GZMB, TIM3 y TIGIT, en diferentes grupos experimentales. Los anticuerpos utilizados son los siguientes: APC-anti-ratón-CD3 (BioLegend#100235), PE/Cyanina7-anti-ratón-CD8a (BioLegend#100721), Violeta brillante 421-anti-ratón-CD45 (BioLegend#103133), PE-anti-ratón-Granzima B (BioLegend#372214), Violeta brillante 421-anti-ratón-CD69 (BioLegend#104527), Violeta brillante 421-anti-ratón-IFN-γ (BioLegend#505829), APC-anti-ratón-CD103 (BioLegend#110905), PE-anti-ratón-TIGIT (Vstm3) (BioLegend#156103), Violeta brillante 421-anti-ratón-CD366 (TIM-3) (BioLegend#134019), PE/Cyanina7-anti-humano-CD69 (BioLegend#310911), PE/Cyanina7-anti-humano-IFN-γ (BioLegend#506517), APC-anti-humano/ratón-Granzima B (BioLegend#372203), APC-Anexina-V (BioLegend#640919). Todos los anticuerpos se utilizaron a una dilución de 1:200. Las estrategias de selección para todos los experimentos de citometría de flujo se muestran en la Figura Suplementaria S7.

Ensayo de migración de células T

Para el ensayo de migración, el sobrenadante de las células CMT93-OVA se colocó en la cámara inferior de un transwell de 5 μm, y se añadieron células T OT1 CD8+ con deleción de Arid3b o células de control en la cámara superior. Después de 24 h, se contó el número de células T CD8+ en la cámara inferior. En el ensayo de migración competitiva, se utilizaron células T CD8+ sg-Int que contenían tdTomato (sg-Int-Tomato) como control, mezcladas en proporciones iguales con células T CD8+ sg-Int que contenían GFP (sg-Int-GFP) o células con deleción de Arid3b (sg-Arid3b-1-GFP) para el experimento en el transwell. Se contó la proporción de tdTomato a GFP en la cámara inferior para evaluar la capacidad de migración. Para la validación in vivo, se transfirieron adoptivamente poblaciones mixtas de células T CD8+ sg-Int-GFP/sg-Int-Tomato o sg-Arid3b-1-GFP/sg-Int-Tomato a ratones portadores de tumores CMT93-OVA, y los linfocitos infiltrantes tumorales se analizaron mediante citometría de flujo.

RNA-seq

Para investigar las alteraciones transcripcionales en las células T CD8+ en condiciones estimuladas por antígenos y basales, se realizó un perfilado de RNA-seq en células T CD8+ sg-Int y sg-Arid3b cocultivadas con o sin células tumorales CMT93-OVA en una proporción de 1:1, con 3 muestras en cada grupo. Después de 4 h de cocultivo, las células T CD8+ se aislaron mediante clasificación por citometría de flujo. Se recogió un mínimo de 1 × 106 células por muestra en todos los grupos. Se extrajo el ARN total de las células T CD8+ purificadas utilizando protocolos estándar y se sometió a control de calidad. Las muestras de ARN de alta calidad se enviaron posteriormente a Annoroad Gene Technology para la preparación de bibliotecas y el secuenciamiento de doble extremo en una plataforma Illumina.

RT-qPCR

Se extrajo el ARN total de las células T utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se evaluó la concentración y la pureza del ARN mediante NanoDrop 2000. Se sintetizó cDNA de cadena simple a partir de 1 μg de ARN utilizando el kit Evo M-MLV RT (Accurate Biology) con cebadores de hexámero aleatorio según las instrucciones del fabricante. La amplificación por qPCR se realizó en triplicado utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Se calculó la expresión génica relativa mediante el método ΔΔCt, normalizada a Actb (β-actina) como control endógeno. Las secuencias de los cebadores utilizados en la qPCR se detallan en la Tabla Suplementaria 1.

ATAC-seq

Las bibliotecas de ATAC-seq se construyeron a partir de células T CD8+ (ya sea con deleción de Arid3b o de control, con o sin estimulación con antígeno OVA) utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN TruePrep V2 para Illumina (Vazyme, TD501) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se lavaron 50 000 células viables por condición en PBS frío y se lisaron en tampón de lisis ATAC-seq frío (10€mM Tris-HCl pH 7,4, 10€mM NaCl, 3€mM MgCl₂, 0,1% IGEPAL CA-630) durante 10 min para aislar los núcleos. Los núcleos se centrifugaron a 500×g durante 5 min a 4 °C. Los núcleos pelleteados se resuspendieron en 50 μL de mezcla de etiquetado y se incubaron a 37 °C durante 30 min. El ADN etiquetado se purificó utilizando cuentas de limpieza de ADN VAHTS (Vazyme, N411). La amplificación de la biblioteca se realizó con el kit de índice TruePrep V4 para Illumina (Vazyme, TD204) bajo las siguientes condiciones de ciclo térmico: 72 °C durante 3 min; 98 °C durante 30 s; seguido de 12–15 ciclos de 98 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s. Las bibliotecas amplificadas se purificaron de nuevo con cuentas de limpieza de ADN VAHTS y se sometieron a control de calidad por Annoroad Gene Technology antes del secuenciamiento de doble extremo en una plataforma Illumina. Los datos de ATAC-seq se procesaron con la canalización ENCODE ATAC-seq (v2.2.2). Después del control de calidad y el recorte de adaptadores, los datos se alinearon con el genoma GRCm38 para generar archivos BAM, y los picos se identificaron con Genrich en modo ATAC-seq.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq)

Se realizó ChIP-seq utilizando el anticuerpo HA o el anticuerpo IgG correspondiente en células T CD8+ con sobreexpresión de HA, en condiciones no tratadas o tratadas con péptido antígeno OVA durante 4 h. Los picos de unión diferencial se visualizaron mediante un mapa de calor, y se realizó la anotación genómica de los picos, seguido del análisis de motivos y el análisis de enriquecimiento KEGG. Se realizó un análisis ChIP-qPCR utilizando el ADN de ChIP para detectar si la proteína Arid3b se une al promotor del gen Runx3 o del gen Gapdh.

La secuencia del cebador utilizada en ChIP-qPCR es la siguiente.

Runx3-F: TTCTAAGGGGCCGTGACATC

Runx3-R: AGGATGCAAGAAGCCAGCTC

Gapdh-F: GGAGGTGAAGCAGGCTCAAT

Gapdh-R: TCCTGTCCCATTGTCAAGCC.

Ensayo de reportero de luciferasa dual

El plásmido pGL4.10-mRunx3-luc2, en el que la transcripción de la luciferasa de luciérnaga está impulsada por el promotor del gen Runx3 del ratón, se construyó. Este plásmido se cotransfectó en células 293T con el plásmido pGL4.74-TK-hRluc y con el plásmido de sobreexpresión de Arid3b o el plásmido de control para el ensayo de reportero de luciferasa dual. También se construyeron plásmidos truncados de ARID3B y RUNX3 con etiqueta HA, o plásmidos mutantes del promotor de Runx3, y se utilizaron en el ensayo de reportero de luciferasa dual para analizar la actividad de la luciferasa relativa y determinar los dominios funcionales y los elementos de unión. La etiqueta HA o Flag se expresa en el extremo N-terminal de ARID3B o RUNX3, mientras que la proteína fluorescente EGFP o tdTomato se conecta al extremo C-terminal mediante un enlazador P2A.

Inmunoprecipitación-espectrometría de masas (IP-MS)

La inmunoprecipitación se realizó utilizando el kit de inmunoprecipitación de proteínas DynabeadsTM Protein A (ThermoFisher, CAT#10006D). Las cuentas magnéticas de proteína A (40 µL por muestra) se incubaron con 1 µg de anticuerpo anti-HA o anticuerpo IgG de control en tampón de unión durante 2 h a 4 °C con rotación para permitir la conjugación del anticuerpo. Los pellets celulares (>1 × 107 células) se lisaron sobre hielo durante 30 min en tampón de lisis suplementado con 1× cóctel de inhibidores de proteasas/fosfatasas. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 15 000×g durante 10 min a 4 °C, y el 10% del sobrenadante se conservó como control de entrada. El lisado restante se dividió por igual y se incubó con cuentas conjugadas con HA o IgG durante 3 h a 4 °C con rotación. Las cuentas se lavaron tres veces con tampón de lavado, y las proteínas unidas se eluyeron en 2× tampón de carga seguido de ebullición a 95 °C durante 5 min. Se cargaron 5 µL de proteínas eluidas en un gel SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con plata para confirmar el enriquecimiento de HA-Arid3b antes del análisis por espectrometría de masas.

Análisis de enriquecimiento de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)

Se realizó un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG en los genes diferencialmente regulados al alza identificados entre los grupos sg-Int y sg-Arid3b en condiciones de cocultivo tumoral, utilizando la función "enrichKEGG" del paquete R "clusterProfiler" ^[51]. Los genes diferencialmente regulados al alza se identificaron mediante los criterios P < 0,05 y log2Fold Change ≥ 0,4.

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)

Se realizó GSEA para evaluar si los conjuntos de genes predefinidos presentaban diferencias estadísticamente significativas entre los grupos sg-Arid3b y sg-Int utilizando el software GSEA 4.3.3 ^[52]. En este estudio, se utilizó la firma de genes regulados al alza de RUNX3 derivada de GSE50121, junto con las firmas centrales de circulación y residencia tisular definidas por Milner et al. ^[31], ^[53].

Análisis estadísticos

Se utilizó ANOVA de dos vías para analizar los datos de crecimiento tumoral. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó la prueba t de Student de dos colas no pareada. Alternativamente, para las comparaciones que involucran múltiples grupos, se realizó ANOVA de una o dos vías, seguida de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett, Sidak o Tukey. Los análisis estadísticos se realizaron en los datos presentados como media ± SEM. R 4.4.1 y GraphPad Prism 10 se utilizaron para todas las representaciones gráficas y los cálculos estadísticos. La significación estadística se determinó con un valor de P inferior a 0,05.

Resumen de la presentación de informes

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de la presentación de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.