El aumento del lactato mediado por la quinasa NEK8 perjudica la inmunidad antitumoral y disminuye la sensibilidad a la radioterapia en el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es una neoplasia altamente letal, que se encuentra entre las tres primeras en cuanto a incidencia y tasas de mortalidad a nivel mundial. Aproximadamente el 22% de los pacientes con cáncer colorrectal ya presentan metástasis distantes avanzadas en el momento del diagnóstico inicial. Para estos casos metastásicos, las principales modalidades de tratamiento clínico son principalmente la radioterapia y la quimioterapia. Sin embargo, a pesar de los avances continuos en el tratamiento, muchos pacientes aún sufren un fracaso del tratamiento debido a la radioresistencia local. El efecto citotóxico de la radiación ionizante (RI) se basa principalmente en la inducción de daño en el ADN de las células tumorales^[1]. Como resultado, la mayoría de las estrategias de radiosensibilización se centran en inhibir la reparación del ADN o en potenciar el daño del ADN^[2]. El contexto inmunitario es vital para la curación por radiación^[3]. La radiación potencia la inmunidad antitumoral a través de varios mecanismos. Por ejemplo, el estrés celular y la muerte causados por la radiación liberan señales como los DAMP (moléculas asociadas a daños), el ADN, las quimiocinas y las citocinas, que conectan la inmunidad innata y adaptativa^[4]–^[6]. Por lo tanto, la radioterapia dirigida al tumor puede considerarse como una "vacunación tumoral in situ". Aquí, las células presentadoras de antígenos (APC) activadas procesan los antígenos tumorales asociados (ATA) que han fagocitado para activar de forma cruzada a las células T CD8+, lo que puede impulsar el rechazo sistémico del cáncer, conocido como el efecto abscopal^[7]–^[9]. Sin embargo, aproximadamente el 30% de los pacientes con CCR desarrollarán resistencia a la radioterapia^[10], y la incidencia de las respuestas abscopales inducidas por la radioterapia sigue siendo extremadamente baja ( 20 % del peso corporal con respecto al valor basal; (iv) signos de obstrucción intestinal, ascitis o anemia grave (mucosas pálidas); (v) incapacidad para acceder a los alimentos/agua, letargo o postura encorvada que persista > 24 h. Estos puntos finales humanitarios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y se aplicaron a todos los modelos.

Análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA)

Para obtener un número suficiente de leucocitos CD45+ y réplicas biológicas para la secuenciación de ARN de una sola célula, aislamos las células CD45+ mediante citometría de flujo. Se evaluó la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripan y se confirmó que era superior al 90 %. La captura de una sola célula y la construcción de bibliotecas se realizaron por Novogene Co., Ltd. (Pekín, China). La secuenciación se realizó utilizando la plataforma Illumina 10x Genomics. Las lecturas de secuenciación sin procesar de cada muestra se procesaron utilizando Cell Ranger para generar matrices de expresión génica.

Estos datos procesados se analizaron utilizando R versión 4.4.0. La canalización de análisis se implementó con el paquete Seurat (v5.0.0) y otras herramientas complementarias según se describe a continuación.

Para garantizar la calidad de los datos de una sola célula y eliminar posibles dobletes, utilizamos el paquete DoubletFinder para identificar y eliminar los dobletes basándonos en los perfiles de expresión génica. La matriz de expresión génica sin procesar se limpió eliminando los genes mitocondriales, ribosomales y de hemoglobina.

Después de la integración de datos y la eliminación de los efectos de lote mediante el algoritmo Harmony, se utilizó la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) para la reducción de dimensionalidad no lineal, con los primeros 25 componentes principales (PC) como entrada. Se realizó un análisis de expresión génica diferencial para identificar los genes marcadores de cada grupo utilizando la función FindAllMarkers, con un umbral de cambio de registro de 0,25 y un porcentaje mínimo de células que expresan el conjunto de genes del 25 %.

Las células se anotaron basándose en sus perfiles de expresión y los genes marcadores conocidos. Este proceso de anotación manual implicó la comparación de los patrones de expresión de las células con los marcadores específicos de cada tipo de célula. La anotación se refinó de forma iterativa para garantizar la coherencia y la precisión.

Cultivo celular

En este estudio, utilizamos tres líneas celulares: dos líneas celulares de CRC (MC38 y CT26), una línea celular de melanoma (B16) y una línea celular de cáncer de mama (4T1), todas ellas obtenidas del Banco de Cultivos de Células Americano (ATCC). Las células, incluidas MC38, IR-MC38, CT26, 4T1 y B16, se mantuvieron en medio DMEM (Gibco) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (SFB) y se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5 % de CO₂. Se realizó un control rutinario de la contaminación por micoplasma y se comprobó que estaba ausente.

Plásmidos y transfecciones celulares

Los genes Nek8 y Ldha se desactivaron mediante shRNA suministrado a través de un plásmido pLKO.1 y su sobreexpresión se logró mediante un plásmido pCDH. Los genes Ldha se desactivaron mediante sgRNA suministrado a través de un plásmido lentiCRISPR v2, y el plásmido mutante Ldha que incluye Ldha
S196A y Ldha
S196D se logró mediante un plásmido pCDH. Las secuencias de shRNA y sgRNA se enumeran en la Tabla Suplementaria 1. Se generaron líneas celulares MC38 estables que expresan OVA y luciferasa mediante infección lentiviral. En resumen, el lentivirus se produjo mediante la transfección de células 293 T con los vectores de empaquetamiento psPAX2 y pMD2.G utilizando Lipofectamina 3000 (Invitrogen). El sobrenadante viral se recogió después de 48 horas, se filtró a través de un filtro de 0,45 µm (Millipore) y se concentró. Se confirmó la expresión de NEK8, LDHA y OVA mediante Western blot.

Citometría de flujo

Para investigar la infiltración de células inmunitarias, primero aislamos los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL). Los tejidos tumorales se disecaron, se cortaron en pequeños trozos y se digirieron en un medio RPMI 1640 que contenía DNasa I (100 U/mL, Sigma, D5025), colagenasa VI (210 U/mL, Thermo, 17104019) e hialuronidasa (0,5 mg/mL, Sigma, H3506) durante 30 minutos a 37 °C. Las células disociadas se pasaron a través de un tamiz de 70 µm, y el sobrenadante se recogió y centrifugó a 1000 × g durante 10 minutos. A continuación, el sedimento celular se resuspendió y se sometió a una centrifugación de gradiente de densidad utilizando Percoll al 40 % y 70 %. La interfase que contenía los TIL se recogió y se centrifugó a 1000 × g durante 5 minutos. Los TIL aislados se incubaron con los anticuerpos indicados, incluidos CD4 (BioLegend, 100434, RRID: AB893324), CD8a (BioLegend, 1623043, RRID: AB2894434), granzima B (BioLegend, 515403, RRID: AB2114575), perforina (BioLegend, 154304, RRID: AB2721463), TNF-α (BioLegend, 506339, RRID: AB2563127), IL-2 (BioLegend, 503825, RRID: AB10895901), IFN-γ (BioLegend, 505825, RRID: AB1595591), CD152 (BioLegend, 106316, RRID: AB2564474), TIM-3 (BioLegend, 134019, RRID: AB2814028), PD-1 (BioLegend, 109119, RRID: AB2566640), CD45 (BioLegend, 103116, RRID: AB312981), CD3ε (BioLegend, 100357, RRID: AB3662378), FOXP3 (BioLegend, 118904, RRID: AB2936574), CD25 (BioLegend, 113709, RRID: AB3674974), TCF7 (BD Biosciences, 566692, RRID: AB2869822), CCR7 (BioLegend, 120124, RRID: AB2616688), Ki67 (BioLegend, 151212, RRID: AB2814055), CD11c (BioLegend, 117343, RRID: AB10897814), CD11b (BioLegend, 101211, RRID: AB312794), LY6C (BioLegend, 128005, RRID: AB10639728), LY6G (BioLegend, 127607, RRID: AB1186099), IA/IE (BioLegend, 107641, RRID: AB2565975), F4/80 (BioLegend, 123113, RRID: AB893478), CD19 (BioLegend, 115549, RRID: AB3106188), CD45.1 (BioLegend, 110731, RRID: AB10896425), CD45.2 (BioLegend, 109837, RRID: AB2561393), y luego se resuspendieron y se analizaron mediante citometría de flujo.

Para evaluar la eficiencia de eliminación de las células T CD8+, las células se aislaron triturando tejidos de bazo a través de filtros de 70 µm. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS, se tiñeron con una dilución de 1:200 de anticuerpos marcados con fluorescencia, incluidos CD4 y CD8a, durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad, y se analizaron mediante citometría de flujo.

Para determinar la expresión de la clase I del MHC, las células se tiñeron con los anticuerpos primarios respectivos, seguidos de anti-MHC de clase I (H-2Kb) conjugado con APC (BioLegend, 116518, RRID: AB_10564404). Todos los datos se adquirieron utilizando un citómetro Fortessa (BD) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star). La estrategia de selección de la citometría de flujo se muestra en la Figura Suplementaria 8.

Análisis de Western blot

Se realizó Western blot como se describió anteriormente ^[55]. Los anticuerpos utilizados fueron: NEK8 (Abcam, ab116721, RRID: AB1090250, reactivo discontinuado); α-tubulina (Proteintech, 11224-1-AP, RRID: AB2210206); LDHA (Proteintech, 19987-1-AP, RRID: AB10646429); L-lactil lisina (PTMBIO, PTM-1401RM, RRID: AB2942013); H3K9la (PTMBIO, PTM-1419RM, RRID: AB3076695); H3K14la (PTMBIO, PTM-1414RM, RRID: AB3076697); H3K18la (PTMBIO, PTM-1427RM, RRID: AB3076698); histona H3 (PTMBIO, PTM-1001RM, RRID: AB3676032); H4K5la (PTMBIO, PTM-1407RM, RRID: AB3096309); H4K8la (PTMBIO, PTM-1415RM, RRID: AB3101829); H4K12la (PTMBIO, PTM-1411RM, RRID: AB2941896), H4K16la (PTMBIO, PTM-1417RM, RRID: AB3101830); histona H4 (PTMBIO, PTM-1015RM, RRID: AB_3101866); Anti-Rabbit IgG (Cell Signaling Technology, 7074), Anti-Rabbit LDHA (Ser196) (HUABIO, hecho en casa) y HLA-A (Boster, M00194-4).

RT–qPCR

Se aisló el ARN total utilizando un reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.). El ADNc se sintetizó a partir de las muestras de ARN utilizando el HiScript III RT SuperMix para qPCR (+ limpiador de ADN genómico; Vazyme, R323-01). La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó con ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Q311-03) en un sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, EE. UU.). Los niveles de expresión génica relativos se normalizaron a GAPDH y se calcularon utilizando el método 2^(-ΔΔCT). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.

Inmunofluorescencia multiplexada (mfIHC)

La tinción de inmunofluorescencia multiplexada se realizó utilizando el kit Opal™ de 4 colores para inmunohistoquímica manual (PerkinElmer, NEL810001KT) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos primarios se aplicaron secuencialmente: anti-CD8 (HUABIO, ET1606-31) y anti-NEK8 (Bioss, bs-7815R). A continuación, se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con HRP y amplificación de la señal de tiramida (TSA). Las láminas se calentaron en el microondas después de cada ciclo de TSA, y los núcleos se tiñeron con DAPI durante 30 minutos. El escaneo de la muestra, la separación espectral y la cuantificación de la señal se realizaron utilizando un microscopio confocal LSM 880 (Zeiss) y el software ZEN (Zeiss). La intensidad de fluorescencia media se calculó dividiendo la fluorescencia total por el área de interés.

Inmunohistoquímica (IHC)

La tinción de IHC se realizó como se describió anteriormente utilizando anticuerpos específicos ^[55]. Los anticuerpos primarios utilizados incluyeron CD8α Rabbit mAb (cell signaling technology, 98941), CD3ε Rabbit mAb (cell signaling technology, 78588), H3K18la (PTMBIO, PTM-1406RM, RRID: AB_2909438), Anti-Rabbit LDHA (Ser196) (HUABIO, hecho en casa) y NEK8 mAb (Bioss, 7815 R). La intensidad de la tinción se puntuó de la siguiente manera: 0 (sin tinción), 1 (débil, amarillo claro), 2 (moderada, amarillo-marrón) y 3 (fuerte, marrón). La proporción de células tumorales positivas se puntuó de la siguiente manera: 0 (< 25 %), 1 (26–50 %), 2 (51–75 %) y 3 (> 75 %). El índice de tinción se calculó multiplicando la puntuación de intensidad por la puntuación de proporción. Los resultados fueron revisados y puntuados de forma independiente por dos observadores. La densidad de las células T CD3+ y CD8+ en las regiones tumorales y del estroma se evaluó contando el número de células positivas bajo un objetivo de 40×.

Ensayo de clonogenicidad por radiación

El ensayo de clonogenicidad por radiación se realizó como se describió anteriormente ^[18]. Brevemente, las células se sembraron en placas de seis pocillos a densidades de 4 × 10², 8 × 10², 1 × 10³, 5 × 10³ y 8 × 10³ células por pocillo y se expusieron a 0, 2, 4, 6 y 8 Gy de radiación, respectivamente. Después de 14 días de incubación a 37 °C, las células se lavaron con PBS, se fijaron con formaldehído al 4 % durante 30 minutos y se tiñeron con cristal violeta durante 20 minutos. A continuación, se contaron las colonias manualmente. La fracción de supervivencia (SF) se calculó y se representó gráficamente como una curva de respuesta a la dosis, que se ajustó al modelo de un solo golpe con múltiples objetivos utilizando la fórmula: SF = 1- (1-e^(-D/D₀))^N.

Ensayo de kit de recuento de células-8 (CCK-8)

La proliferación celular en los grupos indicados se evaluó utilizando el ensayo CCK-8 (Glpbio, GK10001) según las instrucciones del fabricante. Después de que las células se adhirieron al plato de cultivo, se irradiaron con 4 Gy utilizando rayos X de 6 MV de un acelerador lineal Varian 2300 C/D o se trataron con una concentración graduada de fármacos. Posteriormente, se añadieron 10 µL de solución CCK-8 y 90 µL de medio DMEM (total 100 µL) a cada pocillo, y las células se cultivaron durante 2 horas más. La absorbancia (valor de OD) de cada pocillo se midió diariamente durante 5 días consecutivos.

Inmunofluorescencia

Se utilizó formaldehído al 4 % para fijar las células durante aproximadamente 10 minutos, seguido de la incubación con Triton X-100 al 0,1 % durante aproximadamente 30 minutos. Todas las muestras se colocaron en una solución de BSA al 1 % y se agitaron en un agitador horizontal durante 30 minutos. Se añadió la solución del anticuerpo primario (marcador del axonema: tubulina acetilada (sigma, T7451), un marcador del cuerpo basal: gamma-tubulina (Boster, BM4273)) y se incubó durante la noche a 4 °C. A continuación, se añadió el anticuerpo secundario conjugado con un colorante fluorescente y se incubó en la oscuridad durante 1 hora, y se añadieron 10 µL de DAPI durante 15 minutos. Por último, se recogieron las imágenes utilizando microscopía de fluorescencia o microscopía confocal.

Ensayo de co-cultivo de células T

Las células tumorales MC38-OVA con NEK8 desactivado o sobreexpresado se sembraron en una placa de 96 pocillos con o sin 4 Gy de irradiación 24 horas antes y se pre-incubaron durante 2 horas. Las células T CD8+ OT-1 se aislaron del bazo de ratones OT-1 utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+ de ratón EasySep (Stemcell, 19853 A). Las células T CD8+ OT-1 purificadas se co-cultivaron con células tumorales en una proporción de 10:1 durante 24 horas en un medio completo que contenía IL-2. Cuatro horas antes de la recogida, se añadió brefeldina A (BioLegend, 420601) para inhibir la secreción de citocinas. A continuación, las células T se lavaron, se resuspendieron en un tampón de tinción y se tiñeron con anti-CD8a-PE (BioLegend, 162304) durante 30 minutos sobre hielo. Después del lavado, se realizó la tinción intracelular con anti-perforina-APC (BioLegend, 154304) y anti-granzima B-FITC (BioLegend, 515403) como se describió anteriormente. Para otros tratamientos, se añadió ácido L-láctico de sodio (20 mM) u oxamato (10 mM) al co-cultivo de células tumorales y células T.

Ensayos de co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Los lisados celulares se prepararon a partir de las células indicadas utilizando un tampón de lisis (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 1 % NP-40). A continuación, los lisados se incubaron con anticuerpos de conejo anti-NEK8 o anti-LDHA y cuentas de agarosa conjugadas con proteína G, o con agarosa de afinidad Flag (Sigma–Aldrich) a 4 °C durante la noche. Las cuentas que contenían las proteínas unidas por afinidad se lavaron seis veces con un tampón de lavado de IP (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 0,1 % NP-40) y se eluyeron con glicina 1 M (pH 3,0). Los eluatos se neutralizaron, se mezclaron con un tampón de muestra, se desnaturalizaron y se analizaron mediante Western blot.

Análisis de espectrometría de masas (MS)

Para identificar las proteínas que se unen a NEK8, las células MC38 y CT26 se transfectaron con NEK8 marcado con Flag. Los lisados se inmunoprecipitaron utilizando cuentas Flag. Las cuentas que contenían las proteínas unidas por afinidad se lavaron seis veces con un tampón de lavado (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 0,1 % NP-40) y se eluyeron con glicina 1 M (pH 3,0). Los datos se depositaron en la base de datos NGDC (número de acceso: OMIX009336).

Además, se realizó otro ensayo de quinasa in vitro por Nanjing RuiGan Biotechnology Co., Ltd. (Nanjing, China), según se describió previamente^[56]. Brevemente, se incubaron 2 μg de NEK8 o NEK8 inactivo (NEK8 Lys33Met) y 4 μg de proteínas LDHA en el tampón de reacción de la quinasa (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 1 mM DTT y 100 μM ATP) en presencia de 5 μCi [32P]-γ-ATP durante 2 horas a temperatura ambiente, con o sin inhibidor de la quinasa. Las reacciones se detuvieron añadiendo tampón de muestra SDS y la fosforilación de las proteínas se visualizó mediante autorradiografía (Typhoon 9410) en SDS-PAGE al 10%. Cinética de fosforilación in vitro de NEK8 por LDHA. Se incubaron 2 μg de NEK8 con 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2,5 y 5 μM de LDHA durante 5 minutos. La fosforilación se detectó mediante autorradiografía y las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ. Km y Vmax se determinaron ajustando los datos a la ecuación de Michaelis-Menten en GraphPad Prism 9.

Ensayo de ATP acoplado a luciferasa

Se utilizó un ensayo de luminiscencia basado en luciferasa para medir la actividad de la ATPasa de NEK8, siguiendo los protocolos del fabricante (Beyotime, S0150M). Brevemente, la proteína NEK8 se incubó con 10 mM de ATP, en presencia o ausencia de CX6258, a 37 °C en tampón de quinasa (25 mM Tris-HCl [pH 7,5], 5 mM de beta-glicerofosfato, 2 mM de DTT, 0,1 mM de Na3VO4 y 10 mM de MgCl2). La reacción se detuvo añadiendo el reactivo Kinase-Glo (Beyotime, S0150M) y la actividad de la ATPasa se evaluó mediante mediciones de luminiscencia utilizando un lector de microplacas.

Ensayo de actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH)

La actividad de la LDH se midió utilizando un kit de ensayo de LDH (Abbkine KTB1110) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 50 μL de tampón de lisis celular o de tejido a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, se añadió 50 μL de reactivo de trabajo de LDH a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos. Todos los estándares y las muestras se prepararon por triplicado y los ensayos se realizaron tres veces.

Ensayo de concentración de lactato

Siguiendo el protocolo del fabricante, la muestra de sobrenadante celular, el tampón de lisis celular o el tampón de lisis de tejido se procesaron utilizando un kit de ensayo de lactato CheKine™ (Abbkine, KTB1100). La concentración de lactato se midió por absorbancia a 450 nm.

Ensayo de resonancia plasmónica de superficie (SPR)

La interacción entre CX6258 y NEK8 se cuantificó utilizando la tecnología de resonancia plasmónica de superficie (SPR) en un sistema BIAcore T200 (GE Healthcare). Las proteínas NEK8 se inmovilizaron covalentemente en chips sensores CM5 y la cinética de unión resultante se analizó utilizando el software de evaluación BIAcore T200, siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante.

Cut&Tag y Cut&Tag qPCR

El ensayo Cut&Tag se realizó utilizando el kit de preparación de bibliotecas in situ hiperactivo para Illumina (pG-Tn5) (Vazyme Biotech, TD904) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se recogieron después del tratamiento experimental y se unieron a cuentas de concanavalina A. Las muestras se incubaron a continuación con un anticuerpo primario anti-H3K18la (PTM Bio, PAP™−599-16), seguido de anticuerpos secundarios. Se añadió la transposasa pA-Tn5 y se activó la transposición mediada por la transposasa Tn5. El ADN se extrajo y se amplificó para construir la biblioteca, que se purificó utilizando cuentas de limpieza de ADN VAHTS (Vazyme Biotech, N411). La biblioteca se cuantificó utilizando el kit de cuantificación de bibliotecas VAHTS para Illumina (Vazyme Biotech) y se secuenció en la plataforma Illumina NovaSeq con lecturas emparejadas de 150 pb. El análisis de datos se realizó por Epibiote (Guangzhou, China).

Para qPCR, los fragmentos de ADN inmunoprecipitados se purificaron y se sometieron a RT-qPCR utilizando cebadores específicos para los promotores de Tapbp, Psmb4 y Calr. Se utilizó IgG como control negativo. Las secuencias de los cebadores se enumeraron en la Tabla Suplementaria 1.

Análisis bioinformático

Los datos de expresión génica y la información clínica correspondiente se obtuvieron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga). Para evaluar la inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+ en pacientes con TCGA-COADREAD, calculamos una puntuación que refleja la infiltración de células T CD8+ y la respuesta inmune para cada muestra. Esta puntuación se generó mediante el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (ssGSEA) de una sola muestra en la plataforma GenePattern (https://cloud.genepattern.org/), utilizando conjuntos de genes publicados previamente asociados con la actividad de las células T CD8+^[31]. Se realizó un análisis de expresión génica diferencial entre tumores de cáncer colorrectal (CCR) que presentaban puntuaciones altas (10% superior, n = 64) y bajas (10% inferior, n = 64) de células T CD8+.

Nuestro estudio analizó dos cohortes GEO (GSE133057 y GSE119409) para identificar genes expresados diferencialmente (DEG) en muestras resistentes a la irradiación en comparación con muestras sensibles a la irradiación. Además, utilizamos las pruebas de Kaplan-Meier y log-rank, implementadas con el paquete R survival, para evaluar la asociación entre la expresión de NEK8 y la supervivencia general en la cohorte TCGA-COADREAD.

Para investigar la correlación entre NEK8 y la radiosensibilidad, el índice de radiosensibilidad (RSI) se calculó utilizando la fórmula informada^[32]: RSI = −0,0098009 × AR + 0,0128283 × JUN + 0,0254552 × STAT1 − 0,0017589 × PRKCB − 0,0038171 × RELA + 0,1070213 × ABL1 − 0,0002509 × SUMO − 0,0092431 × CDK1 + 0,0204469 × HDAC1 − 0,0441683 × IRF1. El RSI se calculó y los pacientes se dividieron en grupos RSI-bajo y RSI-alto según el valor medio del RSI en TCGA-COADREAD.

Para investigar la correlación entre NEK8 y la infiltración inmune en el CCR, se utilizó el algoritmo TIMER para estimar las proporciones de células inmunitarias y generar puntuaciones inmunitarias para cada paciente en la cohorte TCGA-COADREAD.

Para determinar si NEK8 se une a LDHA, se obtuvieron las estructuras de las proteínas LDHA y NEK8 de la base de datos UniProt. Se realizó el acoplamiento molecular de LDHA y NEK8 utilizando el servidor HDOCK (http://hdock.phys.hust.edu.cn/). Las interacciones dentro del complejo proteico LDHA-NEK8 se analizaron en detalle utilizando PDBePISA y se visualizaron con el software PyMOL.

Secuenciación de ARN y análisis del conjunto de datos

Los ratones C57BL/6 portadores de tumores, trasplantados con tumores shNC o shNEK8, se sometieron a 15 Gy de radiación y luego se anestesiaron. Se recogieron los tumores y las células, y se extrajo el ARN utilizando Trizol. Se realizó la secuenciación de ARN como se describió previamente^[18]. Se determinaron los recuentos de lectura de genes utilizando Feature Counts y se realizó un análisis de expresión génica diferencial utilizando el paquete R limma para comparar los grupos MC38 e IR-MC38, así como los tumores shNC+IR y shNek8+IR. Se generaron gráficos de dispersión de los DEG utilizando el paquete ggplot2 y la expresión de los 30 DEG principales se visualizó en un mapa de calor creado con el paquete pheatmap.

Cribado virtual de alto rendimiento (HTVS)

Para identificar posibles inhibidores de NEK8, este estudio realizó un cribado virtual informático dirigido al sitio de unión a ATP de la proteína humana NEK8 (base de datos UniProt), centrándose en los aminoácidos clave VAL10, VAL18 y LYS33. La proteína se preparó utilizando el módulo Protein Preparation Wizard, que añadió átomos de hidrógeno y optimizó la energía (campo de fuerza OPLS2005, RMSD = 0,3 Å). Se generó una rejilla de receptor centrada en los residuos VAL10, VAL18 y LYS33 con un tamaño de caja de 20 Å × 20 Å × 20 Å. Las estructuras 2D de 50 000 compuestos de la biblioteca de diversidad MCE 50K se procesaron utilizando el módulo LigPrep en el software Schrödinger para la hidrogenación y la optimización de la energía, y luego se convirtieron en estructuras 3D para el cribado virtual. El proceso de cribado implicó tres etapas: (1) modo HTVS para cribar los 50 000 compuestos iniciales; (2) modo SP para cribar el 10% superior de HTVS; y (3) modo XP para cribar el 10% superior de SP, lo que dio como resultado la clasificación final de las moléculas pequeñas. Se seleccionaron las 5 moléculas principales con las puntuaciones de acoplamiento absolutas más altas como candidatos para una validación experimental adicional (Figura Suplementaria 7A). Una puntuación de acoplamiento absoluta más alta indicó una mayor afinidad de unión. Los modos de acoplamiento 2D y 3D se visualizaron utilizando PyMOL.

Cuantificación y análisis estadístico

Todos los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9.0 y IBM SPSS Statistics 20. Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron utilizando pruebas t de Student no pareadas de dos colas. Se utilizó ANOVA de una o dos vías seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey para las comparaciones múltiples. Las curvas de crecimiento tumoral se analizaron utilizando ANOVA de dos vías de medidas repetidas (modelo mixto) con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los coeficientes de correlación se calcularon utilizando la prueba de correlación de rango de Spearman. Las curvas de supervivencia se trazaron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon con la prueba de log-rank. Niveles de significación: *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001, ns = no significativo.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Ratones

Las cepas de ratones C57BL/6 y BALB/c se adquirieron del Centro de Animales de Laboratorio Médico de Guangdong, mientras que los ratones CD45.1 se adquirieron de Cyagen Biosciences. Los ratones OT-1 se obtuvieron de Shanghai Model Organisms. Todos los animales experimentales, de entre 4 y 7 semanas de edad, se mantuvieron en instalaciones libres de patógenos específicos (SPF) en la Universidad de Medicina del Sur. Los ratones inducidos por AOM/DSS con cáncer colorrectal eran machos y los demás ratones eran hembras. No se consideró el sexo como una variable biológica en el diseño y el análisis del estudio. El estudio utilizó exclusivamente ratones hembra para mantener la coherencia entre los experimentos y reducir la variabilidad en los análisis del microambiente inmunitario. Se utilizaron ratones macho en el modelo AOM/DSS, ya que son más propensos a modelar con éxito. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas y los protocolos aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Medicina del Sur, de acuerdo con las directrices ARRIVE (Número de aprobación: SMUL202404004).

Muestras clínicas

Entre enero de 2017 y enero de 2022, se recogieron 54 muestras patológicas de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) en el Departamento de Patología, Hospital Nanfang, Universidad de Medicina del Sur. Las muestras se obtuvieron de biopsias de colon pretratamiento de pacientes que se sometían a quimiorradioterapia neoadyuvante, sin terapias antitumorales previas. Las respuestas terapéuticas se evaluaron utilizando el sistema de clasificación de regresión tumoral (TRG) de la 8ª edición del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC)^[52]. Los pacientes con TRG 0 o TRG 1 se clasificaron como respondedores, mientras que los pacientes con TRG 2 o TRG 3 se consideraron no respondedores. Todas las muestras se recogieron con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Nanfang, Universidad de Medicina del Sur (Guangzhou, China), de acuerdo con la Declaración de Helsinki (Número de aprobación: NFEC-2024-507).

Establecimiento de modelos de ratón de radioresistencia y estudios con animales

Para establecer un modelo in vivo de radioterapia resistente, se inocularon 5 × 10⁵ células MC38 en el flanco derecho de los ratones. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 100 mm³, se irradiaron con 8 Gy en tres dosis, con un intervalo de un día entre cada irradiación. Después de 7 días, se sacrificaron los ratones, se disociaron los tumores y se clasificaron las células tumorales utilizando anti-ratón-EPCAM (BioLegend, 118213, RRID:AB_1134105) y se cultivaron. Este ciclo de tratamiento se repitió cuatro veces más para obtener células MC38 resistentes a la radioterapia (células IR-MC38). La radiosensibilidad de estas células se evaluó a continuación utilizando ensayos de supervivencia clonogénica in vitro, experimentos CCK8 y experimentos con tumores subcutáneos in vivo.

Implantación tumoral y tratamiento: Se inyectaron células MC38, CT26, IR-MC38 o B16 (5 × 10⁵) por vía subcutánea (unilateral o bilateral). Para el modelo de fragmento tumoral, se extirparon tumores MC38, se cortaron en fragmentos y se implantaron por vía subcutánea en ratones receptores. Para el modelo ortotópico, se implantaron 1 × 10⁶ células MC38-luciferasa o IR-MC38-luciferasa en 25 µL de Matrigel al 100% de alta concentración (Corning) en el ciego, siguiendo el protocolo descrito^[53]. El modelo de metástasis hepática en ratón se generó mediante la inyección de 2 × 10⁵ células MC38-luciferasa en el bazo. El modelo de colitis asociada a CRC inducida por AOM/DSS se desarrolló como se describió previamente^[54]. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm³ (subcutáneo/fragmento) o después de que la bioluminiscencia confirmara el injerto (ortotópico/metastásico), los ratones se asignaron aleatoriamente para recibir radiación focal de 15 Gy o un tratamiento simulado. En los experimentos de tratamiento con FTY720, se administró FTY720 (TargetMol, 162359-55-9) por sonda a 20 µg por dosis, una vez al día, durante 7 días. Para los experimentos de depleción de células T CD8+ o macrófagos, se inyectaron 200 µg de anticuerpo anti-CD8α (BioXCell, BE0061) o anti-CSF1 (BioXCell, BE0204) por vía intraperitoneal, comenzando un día antes de los demás tratamientos y continuando dos veces por semana. Para los experimentos de tratamiento con 2-desoxi-D-glucosa (2-DG), oxamato y lactato, se administraron inyecciones intraperitoneales diarias de la siguiente manera: 2-DG (TargetMol, 154-17-6) a 10 mg/kg, oxamato (TargetMol, 565-73-1) a 5 mg/kg o lactato de sodio (Sigma-Aldrich, 71718-10 G) a 1 g/kg. En los experimentos de tratamiento con C646, se administró C646 (TargetMol, 328968-36-1) por vía intraperitoneal a 6 mg/kg por dosis, una vez al día, durante 8 días. Para los experimentos de tratamiento anti-PD1, se inyectaron 200 µg de anticuerpo anti-PD1 (BioXCell, BE0146) por vía intraperitoneal dos veces por semana, para un total de cuatro dosis. Para el tratamiento con el inhibidor de NEK8, se inyectaron 25 mg/kg de CX6258 (TargetMol, 1202916-90-2) por vía intravenosa, una vez al día.

Monitorización de la enfermedad y puntos finales: Se midieron los tumores subcutáneos cada 2 días con un calibrador (volumen = longitud × ancho²/2). La carga tumoral cecal ortotópica y la metástasis hepática se cuantificaron mediante imagenología de bioluminiscencia (Bruker In-Vivo Xtreme) 10 minutos después de la inyección intraperitoneal de luciferina (200 µL, 15 mg/mL). La imagenología se realizó al inicio y 7 días después del tratamiento, o semanalmente hasta el punto final. Para el modelo AOM/DSS, se pesaron los ratones dos veces por semana; se sacrificaron los ratones y se recolectaron los colones para el recuento de tumores después del período de tratamiento.

Criterios de punto final: Se sacrificaron los animales cuando se cumplió alguno de los siguientes criterios: (i) volumen tumoral subcutáneo ≥ 2000 mm³ o diámetro máximo ≥ 1,5 cm; (ii) la señal de bioluminiscencia ortotópica/metastásica aumentó ≥ 10 veces con respecto al valor basal o mostró un crecimiento exponencial a pesar de la terapia; (iii) pérdida de > 20 % del peso corporal con respecto al valor basal; (iv) signos de obstrucción intestinal, ascitis o anemia grave (mucosas pálidas); (v) incapacidad para acceder a alimentos/agua, letargo o postura encorvada que persista > 24 h. Estos puntos finales humanitarios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y se aplicaron en todos los modelos.

Análisis de ARN de célula única (scRNA)

Para obtener un número suficiente de leucocitos CD45+ y réplicas biológicas para el secuenciamiento de ARN de célula única, aislamos células CD45+ mediante citometría de flujo. Se evaluó la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano y se confirmó que era superior al 90 %. La captura de células únicas y la construcción de bibliotecas se realizaron por Novogene Co., Ltd. (Pekín, China). El secuenciamiento se realizó utilizando la plataforma Illumina 10x Genomics. Las lecturas de secuenciamiento sin procesar de cada muestra se procesaron utilizando Cell Ranger para generar matrices de expresión génica.

Estos datos procesados se analizaron utilizando R versión 4.4.0. La secuencia de análisis se implementó con el paquete Seurat (v5.0.0) y otras herramientas complementarias, como se describe a continuación.

Para garantizar la calidad de los datos de célula única y eliminar posibles dobletes, utilizamos el paquete DoubletFinder para identificar y eliminar dobletes basándonos en los perfiles de expresión génica. La matriz de expresión génica sin procesar se limpió eliminando los genes mitocondriales, ribosomales y de hemoglobina.

Después de la integración de datos y la eliminación del efecto de lote mediante el algoritmo Harmony, se utilizó la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) para la reducción de dimensionalidad no lineal, con los primeros 25 componentes principales (PC) como entrada. Se realizó un análisis de expresión génica diferencial para identificar genes marcadores para cada grupo utilizando la función FindAllMarkers, con un umbral de cambio de pliegue logarítmico de 0,25 y un porcentaje mínimo de células que expresan el conjunto de genes del 25 %.

Las células se anotaron en función de sus perfiles de expresión y los genes marcadores conocidos. Este proceso de anotación manual implicó la comparación de los patrones de expresión de las células con los marcadores específicos de tipo celular conocidos. La anotación se refinó de forma iterativa para garantizar la coherencia y la precisión.

Cultivo celular

En este estudio, utilizamos tres líneas celulares: dos líneas celulares de CRC (MC38 y CT26), una línea celular de melanoma (B16) y una línea celular de cáncer de mama (4T1), todas obtenidas del Banco de Cultivos de Células Americano (ATCC). Las células, incluidas MC38, IR-MC38, CT26, 4T1 y B16, se mantuvieron en medio DMEM (Gibco) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (SFB) y se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5 % de CO₂. Se controló rutinariamente la contaminación por micoplasma y se comprobó que estaba ausente.

Plásmidos y transfecciones celulares

Los genes Nek8 y Ldha se desactivaron mediante shRNA administrado a través de un plásmido pLKO.1 y su sobreexpresión se logró mediante un plásmido pCDH. Los genes Ldha se desactivaron mediante sgRNA administrado a través de un plásmido lentiCRISPR v2, y el plásmido mutante Ldha que incluye Ldha S196A y Ldha S196D se logró mediante un plásmido pCDH. Las secuencias de shRNA y sgRNA se enumeran en la Tabla Suplementaria 1. Se generaron líneas celulares MC38 estables que expresan OVA y luciferasa mediante infección lentiviral. Brevemente, el lentivirus se produjo mediante la cotransfección de células 293T con los vectores de empaquetamiento psPAX2 y pMD2.G utilizando Lipofectamina 3000 (Invitrogen). El sobrenadante viral se recogió después de 48 horas, se filtró a través de un filtro de 0,45 µm (Millipore) y se concentró. Se confirmó la expresión de NEK8, LDHA y OVA mediante Western blot.

Citometría de flujo

Para investigar la infiltración de células inmunitarias, primero aislamos los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL). Se disecaron los tejidos tumorales, se cortaron en trozos pequeños y se digirieron en medio RPMI 1640 que contenía DNasa I (100 U/mL, Sigma, D5025), colagenasa VI (210 U/mL, Thermo, 17104019) e hialuronidasa (0,5 mg/mL, Sigma, H3506) durante 30 minutos a 37 °C. Las células disociadas se pasaron a través de un tamiz de 70 µm, y el sobrenadante se recogió y se centrifugó a 1000 × g durante 10 minutos. El sedimento celular se resuspendió y se sometió a centrifugación de gradiente de densidad utilizando Percoll al 40 % y al 70 %. Se recogió la interfase que contenía los TIL y se centrifugó a 1000 × g durante 5 minutos. Los TIL aislados se incubaron con los anticuerpos indicados, incluidos CD4 (BioLegend, 100434, RRID: AB893324), CD8a (BioLegend, 1623043, RRID: AB2894434), granzima B (BioLegend, 515403, RRID: AB2114575), perforina (BioLegend, 154304, RRID: AB2721463), TNF-α (BioLegend, 506339, RRID: AB2563127), IL-2 (BioLegend, 503825, RRID: AB10895901), IFN-γ (BioLegend, 505825, RRID: AB1595591), CD152 (BioLegend, 106316, RRID: AB2564474), TIM-3 (BioLegend, 134019, RRID: AB2814028), PD-1 (BioLegend, 109119, RRID: AB2566640), CD45 (BioLegend, 103116, RRID: AB312981), CD3ε (BioLegend, 100357, RRID: AB3662378), FOXP3 (BioLegend, 118904, RRID: AB2936574), CD25 (BioLegend, 113709, RRID: AB3674974), TCF7 (BD Biosciences, 566692, RRID: AB2869822), CCR7 (BioLegend, 120124, RRID: AB2616688), Ki67 (BioLegend, 151212, RRID: AB2814055), CD11c (BioLegend, 117343, RRID: AB10897814), CD11b (BioLegend, 101211, RRID: AB312794), LY6C (BioLegend, 128005, RRID: AB10639728), LY6G (BioLegend, 127607, RRID: AB1186099), IA/IE (BioLegend, 107641, RRID: AB2565975), F4/80 (BioLegend, 123113, RRID: AB893478), CD19 (BioLegend, 115549, RRID: AB3106188), CD45.1 (BioLegend, 110731, RRID: AB10896425), CD45.2 (BioLegend, 109837, RRID: AB2561393), luego se resuspendieron y se analizaron mediante citometría de flujo.

Para evaluar la eficiencia de eliminación de las células T CD8+, se aislaron las células moliendo tejidos del bazo a través de filtros de 70 µm. Las células se lavaron dos veces con PBS, se tiñeron con una dilución de 1:200 de anticuerpos fluorescentes, incluidos CD4 y CD8a, durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad y se analizaron mediante citometría de flujo.

Para determinar la expresión de MHC de clase I, se tiñeron las células con los anticuerpos primarios respectivos, seguidos de anti-MHC de clase I (H-2Kb) conjugado con APC (BioLegend, 116518, RRID: AB_10564404). Todos los datos se adquirieron utilizando un citómetro Fortessa (BD) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star). La estrategia de selección de la citometría de flujo se muestra en la Figura Suplementaria 8.

Análisis de Western blot

Se realizó Western blot como se describió previamente^[55]. Los anticuerpos utilizados fueron: NEK8 (Abcam, ab116721, RRID: AB1090250, reactivo discontinuado); α-tubulina (Proteintech, 11224-1-AP, RRID: AB2210206); LDHA (Proteintech, 19987-1-AP, RRID: AB10646429); L-lactil lisina (PTMBIO, PTM-1401RM, RRID: AB2942013); H3K9la (PTMBIO, PTM-1419RM, RRID: AB3076695); H3K14la (PTMBIO, PTM-1414RM, RRID: AB3076697); H3K18la (PTMBIO, PTM-1427RM, RRID: AB3076698); Histona H3 (PTMBIO, PTM-1001RM, RRID: AB3676032); H4K5la (PTMBIO, PTM-1407RM, RRID: AB3096309); H4K8la (PTMBIO, PTM-1415RM, RRID: AB3101829); H4K12la (PTMBIO, PTM-1411RM, RRID: AB2941896); H4K16la (PTMBIO, PTM-1417RM, RRID: AB3101830); Histona H4 (PTMBIO, PTM-1015RM, RRID: AB_3101866); Anti-Rabbit IgG (Cell Signaling Technology, 7074), Anti-Rabbit LDHA (Ser196) (HUABIO, Hecho en casa) y HLA-A (Boster, M00194-4).

RT–qPCR

Se aisló el ARN total utilizando un reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.). El ADNc se sintetizó a partir de muestras de ARN utilizando el HiScript III RT SuperMix para qPCR (+ gDNA wiper; Vazyme, R323-01). Se realizó una reacción de PCR cuantitativa (qPCR) con ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Q311-03) en un sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, EE. UU.). Los niveles de expresión génica relativos se normalizaron con GAPDH y se calcularon utilizando el método 2^(-ΔΔCT). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.

Inmunofluorescencia multiplexada (mfIHC)

Se realizó la tinción de inmunofluorescencia multiplexada utilizando el kit manual de inmunohistoquímica Opal™ de 4 colores (PerkinElmer) según las instrucciones del fabricante. Los tejidos se cortaron en secciones de 4 µm de grosor y se colocaron en portaobjetos recubiertos de polilisina. Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a recuperación del antígeno mediante cocción en un amortiguador citrato (pH 6.0) durante 20 minutos. Las secciones se bloquearon con suero de cabra normal al 5 % en PBS que contenía 0,3 % de Triton X-100 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en un amortiguador de bloqueo durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-NEK8 (Abcam, ab137230) y anti-CD3 (Dako, M7247). Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con fluorocromo (PerkinElmer) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron con PBS y se contratiñeron con DAPI (Vector Laboratories) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se montaron con un medio de montaje (Vectashield, Vector Laboratories) y se visualizaron mediante un microscopio de fluorescencia. Las imágenes se adquirieron utilizando el software ImageJ.

Inmunohistoquímica

Se realizó la inmunohistoquímica (IHC) en secciones de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina. Los tejidos se cortaron en secciones de 4 µm de grosor y se colocaron en portaobjetos recubiertos de polilisina. Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a recuperación del antígeno mediante cocción en un amortiguador citrato (pH 6.0) durante 20 minutos. Las secciones se bloquearon con suero de cabra normal al 5 % en PBS que contenía 0,3 % de Triton X-100 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en un amortiguador de bloqueo durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-CD3 (Dako, M7247) y anti-CD8 (Dako, M7103). Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron con el sistema de detección de polímeros HRP (Dako) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron con PBS y se visualizaron utilizando el sustrato DAB (Dako). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron. Las secciones se examinaron mediante un microscopio óptico. La densidad de las células CD3+ y CD8+ en las regiones tumoral y del estroma se evaluó contando el número de células positivas bajo un objetivo de 40×.

Ensayo clonogénico de irradiación

El ensayo clonogénico de irradiación se realizó como se describió previamente^[18]. Brevemente, las células se sembraron en placas de seis pocillos a densidades de 4 × 10², 8 × 10², 1 × 10³, 5 × 10³ y 8 × 10³ células por pocillo y se expusieron a 0, 2, 4, 6 y 8 Gy de radiación, respectivamente. Después de 14 días de incubación a 37 °C, las células se lavaron con PBS, se fijaron con formaldehído al 4% durante 30 minutos y se tiñeron con cristal violeta durante 20 minutos. Luego, las colonias se contaron manualmente. La fracción de supervivencia (SF) se calculó y se representó gráficamente como una curva de respuesta a la dosis, que se ajustó al modelo de un solo impacto y múltiples objetivos utilizando la fórmula: SF = 1 - (1 - e^(-D/D₀))^N.

Ensayo de kit de recuento celular-8 (CCK-8)

La proliferación celular en los grupos indicados se evaluó utilizando el ensayo CCK-8 (Glpbio, GK10001) según las instrucciones del fabricante. Después de que las células se adhirieron al plato de cultivo, se irradiaron con 4 Gy utilizando rayos X de 6 MV de un acelerador lineal Varian 2300 C/D o se trataron con una concentración gradual de fármacos. Posteriormente, se añadieron 10 µL de solución CCK-8 y 90 µL de medio DMEM (total 100 µL) a cada pocillo, y las células se cultivaron durante 2 horas adicionales. La absorbancia (valor de OD) de cada pocillo se midió diariamente durante 5 días consecutivos.

Inmunofluorescencia

Se utilizó formaldehído al 4% para fijar las células durante aproximadamente 10 minutos, seguido de incubación con Triton X-100 al 0,1% durante aproximadamente 30 minutos. Todas las muestras se colocaron en una solución de BSA al 1% y se agitaron horizontalmente durante 30 minutos. Se añadió la solución del anticuerpo primario (marcador del axonema: tubulina acetilada (sigma, T7451), un marcador del cuerpo basal: gamma-tubulina (Boster, BM4273)) y se incubó durante la noche a 4 °C. Se añadió el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con un colorante fluorescente y se incubó en la oscuridad durante 1 hora, y se añadieron 10 µL de DAPI durante 15 minutos. Finalmente, se obtuvieron imágenes utilizando microscopía de fluorescencia o microscopía confocal.

Ensayo de co-cultivo de células T

Las células tumorales MC38-OVA con expresión reducida o sobreexpresión de NEK8 se sembraron en una placa de 96 pocillos con o sin irradiación de 4 Gy 24 horas antes y se pre-incubaron durante 2 horas. Las células T CD8+ OT-1 se aislaron del bazo de ratones OT-1 utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+ de ratón EasySep (Stemcell, 19853 A). Las células T CD8+ OT-1 purificadas se co-cultivaron con células tumorales en una proporción de 10:1 durante 24 horas en un medio completo que contenía IL-2. Cuatro horas antes de la recolección, se añadió brefeldina A (BioLegend, 420601) para inhibir la secreción de citocinas. Luego, las células T se lavaron, se resuspendieron en un tampón de tinción y se tiñeron con anti-CD8a-PE (BioLegend, 162304) durante 30 minutos sobre hielo. Después del lavado, se realizó la tinción intracelular con anti-Perforina-APC (BioLegend, 154304) y anti-Granzima B-FITC (BioLegend, 515403) como se describió previamente. Para otros tratamientos, se añadió ácido L-láctico de sodio (20 mM) u oxamato (10 mM) al co-cultivo de células tumorales y células T.

Ensayos de co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Se prepararon lisados celulares de las células indicadas utilizando un tampón de lisis (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 1% NP-40). Luego, los lisados se incubaron con anticuerpos anti-NEK8 o anti-LDHA de conejo y cuentas de agarosa conjugadas con proteína G, o con agarosa de afinidad Flag (Sigma–Aldrich) a 4 °C durante la noche. Las cuentas que contenían las proteínas unidas por afinidad se lavaron seis veces con un tampón de lavado IP (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 0,1% NP-40) y se eluyeron con glicina 1 M (pH 3,0). Los eluídos se neutralizaron, se mezclaron con un tampón de muestra, se desnaturalizaron y se analizaron mediante Western blotting.

Análisis de espectrometría de masas (MS)

Para identificar las proteínas que se unen a NEK8, las células MC38 y CT26 se transfectaron con NEK8 marcado con Flag. Los lisados se inmunoprecipitaron utilizando cuentas flag. Las cuentas que contenían las proteínas unidas por afinidad se lavaron seis veces con un tampón de lavado (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 0,1% NP-40) y se eluyeron con glicina 1 M (pH 3,0). Los eluídos se analizaron mediante espectrometría de masas (MS), y los datos se depositaron en la base de datos NGDC (número de acceso OMIX009338). Los datos suplementarios 3 proporcionan el recuento de péptidos e información detallada sobre las proteínas que se unen a NEK8 identificadas por IP/MS, así como una lista completa de las vías enriquecidas para las proteínas que interactúan con NEK8.

Expresión y purificación de proteínas

Las células competentes derivadas de BL21 (Rosetta) infectadas con baculovirus humano Bub1 se recolectaron 48 horas después de la infección y se lisaron por sonicación. His6-Bub1740–1085 se purificó e incubó con la proteasa TEV y 1 mM de ATP durante la noche a 4 °C. La Bub1740–1085 fosforilada se purificó aún más utilizando las columnas Resource S y Superdex 200 (GE Healthcare). Los mutantes Bub1740–1085 se expresaron y se purificaron utilizando el mismo protocolo. La Bub1740–1085 purificada se incubó luego con 10 mM de ATP en un tampón de almacenamiento (20 mM Tris-HCl [pH 7,7], 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se concentró a 6 mg/ml para la cristalización.

Ensayo de quinasa NEK8 in vitro

El ensayo de quinasa in vitro se realizó como se describió previamente^[37]. Brevemente, la proteína LDHA se compró a Abcam (ab93699), y la quinasa NEK8-His y la quinasa NEK8 inactiva (NEK8 Lys33Met) se expresaron en células competentes BL21 (Rosetta) y se purificaron utilizando resina Ni²⁺-NTA (QIAGEN). La proteína LDHA recombinante se incubó con NEK8-His en un tampón de quinasa (25 mM Tris-HCl [pH 7,5], 5 mM beta-glicerofosfato, 2 mM DTT, 0,1 mM Na₃VO₄ y 10 mM MgCl₂) que contenía 10 mM de ATP en una mezcla de reacción de 50 µL a 37 °C durante 20 minutos. La reacción se detuvo con un tampón de muestra y se analizó mediante MS. Los datos se depositaron en la base de datos NGDC (número de acceso OMIX009336).

Además, se realizó otro ensayo de quinasa in vitro por Nanjing RuiGan Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China) como se describió previamente^[56]. Brevemente, se incubaron 2 µg de NEK8 o quinasa NEK8 inactiva (NEK8 Lys33Met) y 4 µg de proteínas LDHA en el tampón de reacción de quinasa (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 1 mM DTT y 100 µM ATP) en presencia de 5 µCi de [32 P]-γ-ATP durante 2 horas a temperatura ambiente con o sin inhibidor de quinasa. Las reacciones se detuvieron añadiendo tampón de muestra SDS, y la fosforilación de proteínas se visualizó mediante autorradiografía (Typhoon 9410) en SDS-PAGE al 10%. La cinética de fosforilación in vitro de NEK8 por LDHA. Se incubaron 2 µg de NEK8 con 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2,5 y 5 µM de LDHA durante 5 minutos. La fosforilación se detectó mediante autorradiografía, y las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ. Km y Vmax se determinaron ajustando los datos a la ecuación de Michaelis-Menten en GraphPad Prism 9.

Ensayo de ATP acoplado a luciferasa

Se utilizó un ensayo de luminiscencia basado en luciferasa para medir la actividad de la ATPasa de NEK8, siguiendo los protocolos del fabricante (Beyotime, S0150M). Brevemente, la proteína NEK8 se incubó con 10 mM de ATP, en presencia o ausencia de CX6258, a 37 °C en un tampón de quinasa (25 mM Tris-HCl [pH 7,5], 5 mM beta-glicerofosfato, 2 mM DTT, 0,1 mM Na₃VO₄ y 10 mM MgCl₂). La reacción se detuvo añadiendo el reactivo Kinase-Glo (Beyotime, S0150M), y la actividad de la ATPasa se evaluó mediante mediciones de luminiscencia utilizando un lector de microplacas.

Ensayo de actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH)

La actividad de la LDH se midió utilizando un kit de ensayo de LDH (Abbkine KTB1110) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 50 µL de tampón de lisis celular o tampón de lisis de tejido a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Luego, se añadió 50 µL de reactivo de trabajo de LDH a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos. Todos los estándares y las muestras se prepararon por triplicado, y los ensayos se realizaron tres veces.

Ensayo de concentración de lactato

Siguiendo el protocolo del fabricante, se procesó el sobrenadante celular, el tampón de lisis celular o el tampón de lisis de tejido utilizando un kit de ensayo de lactato CheKine™ (Abbkine, KTB1100). La concentración de lactato se midió por absorbancia a 450 nm.

Ensayo de resonancia plasmónica de superficie (SPR)

La interacción entre CX6258 y NEK8 se cuantificó utilizando la tecnología de resonancia plasmónica de superficie (SPR) en un sistema BIAcore T200 (GE Healthcare). Las proteínas NEK8 se inmovilizaron covalentemente en chips sensores CM5, y la cinética de unión resultante se analizó utilizando el software de evaluación BIAcore T200, siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante.

Cut&Tag y Cut&Tag qPCR

El ensayo Cut&Tag se realizó utilizando el kit de preparación de biblioteca in situ hiperactiva para Illumina (pG-Tn5) (Vazyme Biotech, TD904) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se recolectaron después del tratamiento experimental y se unieron a cuentas de concavavalina A. Luego, las muestras se incubaron con un anticuerpo primario anti-H3K18la (PTM Bio, PAP™−599-16), seguido de anticuerpos secundarios. Se añadió la transposasa pA-Tn5, y la transposición mediada por la transposasa Tn5 se activó. El ADN se extrajo y se amplificó para construir la biblioteca, que se purificó utilizando cuentas de limpieza de ADN VAHTS (Vazyme Biotech, N411). La biblioteca se cuantificó utilizando el kit de cuantificación de bibliotecas VAHTS para Illumina (Vazyme Biotech) y se secuenció en la plataforma Illumina NovaSeq con lecturas emparejadas de 150 pb. El análisis de datos se realizó por Epibiote (Guangzhou, China).

Para qPCR, los fragmentos de ADN inmunoprecipitados se purificaron y se sometieron a RT-qPCR utilizando cebadores específicos para los promotores de Tapbp, Psmb4 y Calr. Se utilizó IgG como control negativo. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla suplementaria 1.

Análisis bioinformático

Los datos de expresión génica y la información clínica correspondiente se obtuvieron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga). Para evaluar la inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+ en pacientes con TCGA-COADREAD, calculamos una puntuación que refleja la infiltración de células T CD8+ y la respuesta inmune para cada muestra. Esta puntuación se generó mediante el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (ssGSEA) de una sola muestra en la plataforma GenePattern (https://cloud.genepattern.org/), utilizando conjuntos de genes publicados previamente asociados con la actividad de las células T CD8+^[31]. Se realizó un análisis de expresión génica diferencial entre tumores de cáncer colorrectal (CRC) que presentaban puntuaciones altas (10% superior, n = 64) y bajas (10% inferior, n = 64) de células T CD8+.

Nuestro estudio analizó dos cohortes GEO (GSE133057 y GSE119409) para identificar genes expresados diferencialmente (DEG) en muestras resistentes a la radiación en comparación con muestras sensibles a la radiación. Además, utilizamos las pruebas de Kaplan-Meier y de rango logarítmico, implementadas con el paquete R survival, para evaluar la asociación entre la expresión de NEK8 y la supervivencia general en la cohorte TCGA-COADREAD.

Para investigar la correlación entre NEK8 y la radiosensibilidad, el índice de radiosensibilidad (RSI) se calculó utilizando la fórmula informada^[32]: RSI = −0,0098009 × AR + 0,0128283 × JUN + 0,0254552 × STAT1 − 0,0017589 × PRKCB − 0,0038171 × RELA + 0,1070213 × ABL1 − 0,0002509 × SUMO − 0,0092431 × CDK1 + 0,0204469 × HDAC1 − 0,0441683 × IRF1. El RSI se calculó, y los pacientes se dividieron en grupos RSI-bajo y RSI-alto según el valor mediano del RSI en TCGA-COADREAD.

Para investigar la correlación entre NEK8 y la infiltración inmune en CRC, se utilizó el algoritmo TIMER para estimar las proporciones de células inmunitarias y generar puntuaciones inmunitarias para cada paciente en la cohorte TCGA-COADREAD.

Para determinar si NEK8 se une a LDHA, se obtuvieron las estructuras de las proteínas LDHA y NEK8 de la base de datos UniProt. Se realizó el acoplamiento molecular de LDHA y NEK8 utilizando el servidor HDOCK (http://hdock.phys.hust.edu.cn/). Las interacciones dentro del complejo de proteínas LDHA-NEK8 se analizaron en detalle utilizando PDBePISA y se visualizaron con el software PyMOL.

Secuenciación de ARN y análisis del conjunto de datos

Se sometieron a 15 Gy de radiación ratones C57BL/6 J portadores de tumores, a los que se les había trasplantado tumores shNC o shNEK8, y luego se anestesiaron. Se recogieron los tumores y las células, y se extrajo el ARN utilizando Trizol. Se realizó la secuenciación del ARN como se describió previamente^[18]. Se determinaron los recuentos de lectura de genes utilizando Feature Counts, y se realizó un análisis de expresión génica diferencial utilizando el paquete R limma para comparar los grupos MC38 e IR-MC38, así como los tumores shNC+IR y shNek8+IR. Se generaron gráficos de dispersión de los genes expresados diferencialmente (DEGs) utilizando el paquete ggplot2, y la expresión de los 30 DEGs principales se visualizó en un mapa de calor creado con el paquete pheatmap.

Cribado virtual de alto rendimiento (HTVS)

Para identificar posibles inhibidores de NEK8, este estudio realizó un cribado virtual basado en ordenador dirigido al sitio de unión al ATP de la proteína humana NEK8 (base de datos UniProt), centrándose en los aminoácidos clave VAL10, VAL18 y LYS33. La proteína se preparó utilizando el módulo Protein Preparation Wizard, que añadió átomos de hidrógeno y optimizó la energía (campo de fuerza OPLS2005, RMSD = 0,3 Å). Se generó una rejilla de receptor centrada en los residuos VAL10, VAL18 y LYS33 con un tamaño de caja de 20 Å × 20 Å × 20 Å. Las estructuras 2D de 50 000 compuestos de la biblioteca de diversidad MCE 50 K se procesaron utilizando el módulo LigPrep en el software Schrödinger para la hidrogenación y la optimización de la energía, y luego se convirtieron en estructuras 3D para el cribado virtual. El proceso de cribado implicó tres etapas: (1) modo HTVS para cribar los 50 000 compuestos iniciales; (2) modo SP para cribar el 10% superior del HTVS; y (3) modo XP para cribar el 10% superior del SP, lo que dio como resultado la clasificación final de las moléculas pequeñas. Se seleccionaron las 5 moléculas principales con las puntuaciones de acoplamiento absolutas más altas como candidatos para una validación experimental adicional (Figura suplementaria 7A). Una puntuación de acoplamiento absoluta más alta indicó una mayor afinidad de unión. Los modos de acoplamiento 2D y 3D se visualizaron utilizando PyMOL.

Cuantificación y análisis estadístico

Todos los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9.0 e IBM SPSS Statistics 20. Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron utilizando pruebas t de Student no pareadas de dos colas. Se utilizó un ANOVA de una o dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para las comparaciones múltiples. Las curvas de crecimiento tumoral se analizaron utilizando un ANOVA de dos vías de medidas repetidas (modelo mixto) con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los coeficientes de correlación se calcularon utilizando la prueba de correlación de rango de Spearman. Las curvas de supervivencia se trazaron utilizando el método de Kaplan–Meier y se compararon con la prueba de rango logarítmico. Niveles de significación: *p