Las células linfoides innatas inmaduras que se infiltran en el tumor en el cáncer colorrectal muestran una tendencia hacia la diferenciación en ILC1/células NK residentes en los tejidos.

El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer a nivel mundial^[1]. Alrededor del 5% de los pacientes con CCR presentan metástasis peritoneales (MP) en el momento del diagnóstico^[2],^[3], y alrededor del 5% de los pacientes con CCR desarrollan MP posteriormente^[3],^[4]. Los pacientes con cáncer de colon derecho, CCR localmente avanzado, especialmente aquellos con tumores obstructivos o perforados, o aquellos que se someten a resecciones de emergencia o no radicales, tienen un riesgo aún mayor^[3]. Históricamente, los pacientes con CCR-MP eran tratados de forma paliativa, pero ahora la quimioterapia intraperitoneal hiperérmica (QHIP) combinada con la cirugía citoreductora (CCR) ofrece una posible cura para un subgrupo de pacientes^[5]. Sin embargo, la eficacia de la QHIP es objeto de debate^[6] y hasta el 25% de los pacientes experimentan complicaciones postoperatorias graves, y el riesgo de recurrencia es alto^[7]. El bloqueo de los puntos de control inmunitario ha mostrado resultados prometedores para los pacientes con CCR metastásico con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-alto)^[8], pero solo alrededor del 8% de los pacientes con CCR metastásico tienen tumores MSI-alto^[9]. Por lo tanto, se necesita más investigación sobre las inmunoterapias para los pacientes con CCR con microsatélites estables (MSS) y, especialmente, para los pacientes con CCR metastásico MSS debido a su mal pronóstico. Si bien la infiltración de células T, en particular de células T citotóxicas de memoria CD8+, es un determinante importante de la supervivencia del CCR^[10]–^[12] y la respuesta a la inmunoterapia^[13], el papel de las células linfoides innatas (CLI), incluidas las células asesinas naturales (NK), en el CCR y el CCR-MP es menos claro.

La familia de las CLI está compuesta por cinco subconjuntos principales^[14]. Las células NK poseen un arsenal de receptores activadores e inhibidores que regulan sus funciones citotóxicas y la secreción de citoquinas y quimioquinas, con el objetivo final de eliminar las células infectadas por virus y las células tumorales^[15]. Relacionados con las células NK se encuentran los subconjuntos de CLI tipo 1 (CLI1), que carecen de algunas características prototípicas de las células NK, incluido Eomes y la perforina, pero que aún producen interferón (IFN)-γ^[16]. Las CLI3 y las células inductoras del tejido linfoide (CLI-T) son, a través de su producción de interleucina (IL)-22 y la formación de tejidos linfoides secundarios, respectivamente, importantes para la homeostasis inmunitaria del intestino^[14]. Las CLI2 producen citoquinas tipo 2 y, por lo tanto, contribuyen a la defensa contra parásitos, pero también a la inflamación tipo 2^[17].

La infiltración tumoral de células inmunitarias que expresan CD57, un marcador presente en ciertas células T y células NK, está relacionada con un pronóstico favorable en el CCR^[18]. Esto es probablemente porque CD57 marca células NK y células T altamente diferenciadas, educadas y citotóxicas con un alto potencial de función antitumoral^[19]. Sin embargo, la mayoría de las células NK y otras CLI en los tumores de CCR son CD57−^[18]. De hecho, se ha demostrado que las células NK reducen rápidamente sus funciones citotóxicas al entrar en el microambiente tumoral del CCR (MET) en ratones^[20]. Los factores como el factor de crecimiento tumoral (FGT)-β, producido por las células cancerosas y otras células en el MET, incluidos los fibroblastos asociados al cáncer^[21], son importantes en la modulación del panorama inmunitario en el CCR^[22]. El FGT-β atenúa la citotoxicidad de las células NK y la expresión del factor de transcripción de las células NK Eomes^[23], induce características de células NK residentes en los tejidos (trNK)^[23] y desempeña un papel clave en la diferenciación de subconjuntos de CLI1^[23], incluidas las CLI1 intraepiteliales (ie)^[24]. De hecho, las células CLI1-similares están enriquecidas en el CCR primario, junto con las CLI2, en comparación con el colon no afectado^[25]. Las CLI2 desempeñan funciones ambiguas en modelos animales de CCR, mostrando efectos antitumorales en algunos entornos de CCR^[26], mientras que muestran efectos protumorales y son objetivos del bloqueo de puntos de control en otros^[26],^[27].

Los estudios previos centrados en abordar el papel de las CLI y las células NK en el CCR primario no han logrado capturar la gran diversidad de estas células en el intestino humano^[16] y sus posibles funciones en el CCR-MP aún no se han abordado. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue determinar el panorama de las CLI y las células NK del CCR primario y metastásico con MP a alta resolución.

Aquí, utilizamos la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) para analizar muestras de colon sano, CCR primario y CCR-MP y descubrimos que tanto los tumores de CCR primario como los de MP contienen poblaciones heterogéneas de CLI y células NK y están enriquecidos con subconjuntos de CLI1 y células trNK. También identificamos subconjuntos de CLI intratumorales menos diferenciadas (CLI-n) y células NK tempranas (cNK-e) con características transcripcionales que indican que son precursoras de las CLI y células NK intratumorales más diferenciadas. De hecho, los cultivos de diferenciación in vitro revelan que las CLI-n intratumorales están preparadas para la diferenciación en CLI1 y células NK con un fenotipo residente en los tejidos, lo que posiblemente contribuye a su acumulación en los tumores. Estos hallazgos contribuyen a la comprensión de la patogénesis inmunitaria del CCR-MP y nuestros amplios datos de una sola célula podrían utilizarse para el diseño racional de futuras terapias basadas en CLI1 y células NK destinadas a aumentar su actividad antitumoral.

Resultados

Heterogeneidad de las CLI en el colon no afectado, el CCR y los tumores de MP

Primero, evaluamos la infiltración de linfocitos en el colon humano no afectado (en adelante, "colon"), el CCR primario y los tumores de MP. Las células T dominaron tanto el CCR primario como, como se informó previamente^[28], los tumores de MP, mientras que las CLI y las células NK fueron igualmente frecuentes en los tumores en comparación con el colon (Figura S1A). Las CLI y las células NK (CLI NKG2A−CD127+, células NK CD56+ y CLI no convencionales CD56−CD7+, total n = 23407) de 11 pacientes en nuestra cohorte traslacional que contribuyeron con muestras de tejido de colon humano, tumores primarios de CCR y/o tumores de MP (Tabla 1) se clasificaron mediante citometría de flujo (Figura S1A, B) y se analizaron mediante scRNAseq para evaluar su heterogeneidad transcripcional (Figura 1A). Dado que el espectro de alta resolución de las CLI y las células NK en el intestino humano sigue siendo poco explorado, y los informes que existen desafían la nomenclatura dogmática previa de las CLI y las células NK^[16],^[29], prestamos especial atención a anclar nuestras anotaciones en la literatura existente.

La agrupación jerárquica de 14 grupos definidos transcripcionalmente permitió la identificación de tres ramas principales de grupos (Figura 1B, C) presentes en el colon, el CCR primario y los tumores de MP (Figura S1C, D). El análisis de expresión diferencial (DE) seguido de la agrupación jerárquica reveló módulos de genes (Figura 1D) que identificaron la rama 1 como células NK convencionales (cNK) (módulo 6, que incluye GZMB, FCGR3A, GZMH y CCL3), la rama 2 como CLI CD127+ (módulo 8, que incluye KIT y IL4I1 y el módulo 9 que incluye IL7R, LTB y GPR183) y la rama 3 como CLI1/células trNK, ya que los grupos de esta rama compartieron similitudes con las CLI CD127+ y las cNK (Figura 1C, D). El grupo 10 no se agrupó con ninguna de las tres ramas en la agrupación jerárquica (Figura 1B) pero se incluyó en la rama 3 debido a la alta similitud con otros grupos de la rama 3, incluido la ausencia de genes del módulo 6, 8 y 9 expresados en cualquiera de los grupos de la rama 1 o 2 (Figura 1C). Más específicamente, los grupos de CLI1/células trNK expresaron genes asociados con la residencia en los tejidos (módulo 1: CXCR6, ITGAE) así como con la citotoxicidad (módulo 1: GZMA y GZMK), mientras que los grupos de CLI1/células trNK 1 y 7 expresaron genes en el módulo 10 (CD83, NFKB1 y ICAM1), también expresados por las CLI CD127+. Cabe destacar que los grupos 1 y 8 expresaron genes del módulo 9, incluido SELL, que normalmente se expresa en linfocitos residentes/residiendo en los tejidos, como las células T ingenuas, las CLI-n y las células NK CD56 brillantes^[16],^[30],^[31]. Junto con los genes DE (Figura 1D), utilizamos además un conjunto de factores de transcripción que definen la línea y la etapa de diferenciación para anotar los grupos (Figura 1E, F). Tanto las células NK tempranas (cNK-e) (grupo 1) como las CLI ingenuas (CLI-n) (grupo 8) se definieron por la expresión de TCF7 y ID2, mientras que las CLI3 expresaban además RORC, AHR, BCL6 y MAF (Figura 1E). Las CLI2 y todos los grupos de CLI1 y células NK expresaron ZBTB16 (PLZF) y PRDM1 (BLIMP-1), mientras que las CLI2 mostraron la mayor expresión de GATA3 (Figura 1E). TBX21 e IKZF3 se expresaron en todos los grupos de la rama CLI1/células trNK, mientras que EOMES se restringió a las CLI1, las CLI1 CD160+, las CLI1 IFN+ y las células NK A y las células NK HLA-DR+ (Figura 1E). ZNF683 se expresó de forma única en las CLI1 ie (Figura 1E). Para alinear aún más con la nomenclatura actual, realizamos un conjunto de puntuaciones de nuestros grupos en comparación con los módulos de perfiles de genes de células NK descritos recientemente. La puntuación de módulos para las células NK circulantes y las células trNK^[32] mostró que las CLI1 y las células trNK obtuvieron la puntuación más alta para una firma de células trNK (Figura 1G), mientras que las cNK obtuvieron la puntuación más alta para una firma de células NK circulantes (Figura 1H). De manera similar, la puntuación en comparación con las firmas de NK1, NK2 y NK3 descritas recientemente (Figura S1E) mostró que las cNK eran más similares a las células NK1, particularmente NK1B y NK1C, mientras que las células NK HLA-DR+ obtuvieron la puntuación más alta para la firma NK3, lo que sugiere que podrían ser de tipo adaptativo^[29]. Las CLI CD127+ y las cNK-e obtuvieron la puntuación más alta para la firma NK2, mientras que las CLI1 y las células trNK mostraron una puntuación intermedia para las firmas NK1 y NK2 (Figura S1E). También comparamos nuestros grupos con los perfiles transcripcionales de CLI1 y células NK publicados recientemente en el intestino, las amígdalas, los pulmones y la sangre periférica humanos^[16] (Figura S1F, G), lo que respaldó nuestras anotaciones de las cNK, las CLI CD127+, las CLI1 y las células trNK. En particular, confirmamos la identidad de las CLI1 ie como CLI1 que expresan PRDM1 (Figura 1E) y las cNK-e (grupo 1) como muy similares a las células NK CD56 brillantes (Figura S1F, G), pero con un perfil residente en los tejidos (Figura 1G).

Dos subconjuntos de CLI con firmas inmaduras en el colon y los tumores

Si bien se han descrito las CLI-n en el colon sano e inflamado^[31], y las células NK similares a CD56 brillantes, que comparten similitudes con las cNK-e identificadas en este estudio, observadas en el cáncer de cabeza y cuello^[33], sus funciones como precursoras de las CLI y células NK más maduras en el CCR primario y metastásico siguen sin explorarse. Para definir estas dos poblaciones con más detalle, realizamos un análisis DE. Varios de los principales genes DE de las cNK-e y las CLI-n se compartieron entre los dos grupos, incluidos IL7R, SELL, GPR183 y CD55 (Figura 2A), que se describieron previamente en las células NK CD56 brillantes^[16] y las CLI-n y los progenitores de CLI (CLI-p)^[31],^[34]. La expresión DE de XCL1 y XCL2 también se compartió entre las cNK-e y las CLI-n, así como con la rama de las CLI1/células trNK (Figura 2A). Sin embargo, las cNK-e fueron claramente distintas de las CLI-n, ya que se parecían a las células NK CD56 brillantes en su expresión de IL12RB, CRTAM, IRAK3, GNLY, COTL1, TNFSF9 y KLRC1 (Figura 2B) y obtuvieron la puntuación más alta para un perfil de células NK SELL+ (Figura S1F). El grupo de CLI-n mostró una expresión única de TNFRSF4 y MFGE8, pero también compartió varios transcritos con las cNK-e (TCF7, TNFRSF18) así como con las CLI2 y las CLI3, incluidos KIT, LTB, ICOS, TIMP1, SCN1B, SSBP2 y CDKN1A (Figura 2C). Si bien las CLI-n compartieron algunas similitudes con las CLI CD127+ maduras, y las cNK-e se parecían a las células NK CD56 brillantes, el análisis de pseudotiempo reveló que ambos grupos se ubicaron en la base de la trayectoria, mientras que los grupos más diferenciados, las CLI2, las CLI1 ie y las células NK HLA-DR+, terminaron al final de la trayectoria predicha (Figura 2D y Figura S2A), independientemente del tejido del que se derivaran (Figura S2B–D). Esto respaldó la hipótesis de que las CLI-n y las cNK-e son las menos diferenciadas de los subconjuntos analizados, junto con las CLI3 NKp44-, esta última mostrando una gran similitud con las CLI3p descritas recientemente (Figura S1F). De hecho, en el análisis de velocidad de ARN proyectado en UMAP, tanto las CLI3 NKp44- como las CLI-n parecían diferenciarse en CLI3 NKp44+, mientras que las cNK-e parecían más propensas a diferenciarse en CLI1 y células trNK (Figura 2E y Figura S2E). El tiempo latente de la velocidad fue el más alto en las CLI3 NKp44+, las CLI1 ie, las células NK CD16+ B y las células NK LIGHT+, lo que indica que estos grupos son los más diferenciados (Figura 2F).

A continuación, observamos los cambios en la composición de los ILC CD127+ y las células NK en los tumores en comparación con el tejido colónico no afectado. Si bien los grupos de ILC3 NKp44+ y NKp44− se derivaban predominantemente del tejido colónico (Fig. 3A, B), los tumores primarios y las metástasis eran las principales fuentes de células en los grupos ieILC1, ILC1, CD16+ NK B, HLA-DR+ NK, IFN+ ILC1 y LIGHT+ ILC1 (Fig. 3A). La evaluación de las frecuencias totales y la contribución de los pacientes de estos grupos reveló una disminución estadísticamente significativa de los ILC3 NKp44+ y un enriquecimiento significativo del grupo HLA-DR+ NK en los tumores primarios y las metástasis en comparación con el tejido colónico no afectado (Fig. 3C). Las pruebas de abundancia diferencial (DA) confirmaron estas diferencias, y las células DA en los grupos ILC3 NKp44+ y NKp44− fueron más abundantes en el colon, y las células DA en la rama cNK e ILC1/trNK, incluidos los grupos HLA-DR+ NK, pero también CD16+ NK A, CD16+ NK B, ILC1, ieILC1 y LIGHT+ ILC1, fueron más frecuentes en los tumores primarios y las metástasis (Fig. S3A–C). Si bien las frecuencias de los nILC y las células eNK no difirieron entre el colon, el CRC primario o los tumores de CRC-PM, detectamos una correlación inversa entre la frecuencia de nILC y una tendencia a una correlación inversa entre la frecuencia de las células eNK y la etapa del tumor de CRC primario (Fig. S4A, B). También validamos la existencia de nuestros grupos de células identificados, incluidos los nILC y las células similares a las eNK, en un conjunto de datos scRNAseq disponible públicamente (GSE178341) derivado de 62 tumores de CRC primario (Fig. S4C–G). Debido al bajo número de células en este conjunto de datos (aproximadamente 5600 ILC y células NK) en comparación con el nuestro (aproximadamente 23400 ILC y células NK), los nILC y las células eNK se combinaron en una sola población para la correlación con las variables clínicas. En particular, no pudimos validar la correlación inversa entre la frecuencia de nILC y la etapa del tumor de CRC primario (Fig. S4H), lo que podría deberse al bajo número de células provenientes principalmente de etapas tumorales tempranas en estos datos. Además, la frecuencia de nILC y células eNK fue similar independientemente del estado de MMR, el sexo biológico y la ubicación del tumor (Fig. S4I–K).

Para comprender si los cambios en la composición de los tumores podrían ser causados por cambios en la diferenciación local de las células progenitoras intratumorales, realizamos un análisis de velocidad en cada tejido por separado. Esto reveló un cambio en la velocidad dentro del grupo de células eNK en los tumores, que fue más pronunciado en PM (Fig. 3D). En contraste con el colon no afectado, donde los cambios en la expresión génica de las células eNK se dirigieron hacia el grupo ILC3 NKp44+ (Fig. 3D), la velocidad génica de las células eNK se dirigió hacia los grupos LIGHT+ ILC1 y CD16+ NK B en los tumores primarios de CRC y PM (Fig. 3D).

Los nILC y las células eNK son transcripcionalmente distintos en los tumores de CRC

A continuación, buscamos identificar las diferencias transcripcionales entre los nILC y las células eNK en el colon frente a los tumores, lo que podría ayudar a explicar el cambio en la trayectoria de diferenciación prevista en los tumores identificada por la velocidad del ARN (Fig. 3D). El análisis DE de los nILC y las células eNK en el colon frente a los tumores de CRC primario (Datos suplementarios 1 y 2) reveló una posible desviación hacia ILC1 y células NK de los nILC intratumorales, con una mayor expresión de GNLY, KLRC1, RGS2, CTSW y CEBPB en comparación con los nILC en el colon (Fig. 4A, B). En contraste, los nILC en el colon parecían estar desviados hacia ILC3 con una mayor expresión de LTB, PTGER4, TIPARP, IL4I1 y IL1R1 (Fig. 4A, C), lo que coincide con informes anteriores sobre la propensión de los ILC3 en los nILC del colon ^[31]. También hubo cambios transcripcionales en las células eNK intratumorales con una mayor expresión de GNLY, CRTAM, que normalmente se expresa por las células NK CD56bright, SELL y TCF7, que se expresan en las células trNK ^[35], y IL10R y HIF1A, lo que indica la influencia del microambiente tumoral en estas células ^[36] (Fig. 4D, E). Las células eNK en el colon expresaron transcritos de células en etapa temprana y trNK (CD3E, ZBTB16, EOMES, IRF8) así como de ILC3 (LTB, AHR) (Fig. 4D, F), lo que podría explicar su trayectoria de diferenciación prevista hacia ILC3 en el colon (Fig. 3D).

Identificación y aislamiento de nILC y células eNK intratumorales y colónicas

Para validar la existencia y explorar la capacidad de diferenciación de los nILC y las células eNK intratumorales, desarrollamos un panel de citometría de flujo basado en transcritos y expresiones de proteínas de superficie seleccionadas en los datos de scRNAseq. El grupo de nILC se pudo distinguir de otros ILC CD127+ por la expresión de IL7R y KIT, pero la falta de NCR2, HLA-DRA, HLA-DRB y PTGDR2, y de los grupos ILC1 y trNK por la ausencia de expresión de KLRD1 y NCAM1 (Fig. 5A y características del paciente en la Tabla 2). Este fenotipo se pudo confirmar a nivel de proteínas mediante el uso de las bibliotecas de proteínas de superficie en el conjunto de datos de una sola célula, identificando los nILC como que expresan CD127 y CD117, pero carecen de CD94 y CD336 (NKp44) (Fig. 5B). Las células eNK expresaron KLRD1 y NCAM1, pero también expresaron IL7R, lo que las distingue de los grupos ILC1 y trNK. Además, en contraste con las células cNK, carecían de la expresión de FCGR3A (Fig. 5A). A nivel de proteínas de superficie, el grupo eNK expresó niveles intermedios de CD94 y CD127 (Fig. 5B). Además, tanto los nILC como las células eNK expresaron niveles intermedios de la proteína CD45RA (Fig. 5B).

Los ILC convencionales Lin-CD127+CD94−, los ILC no convencionales Lin− CD94+/−CD56−CD7+ y las células NK Lin− CD94+/−CD56+ en tumores de CRC primario y colon emparejados se analizaron mediante citometría de flujo en un grupo diferente de ocho pacientes que contribuyeron con siete muestras de colon y siete tumores primarios (Tabla 2), lo que permitió la identificación de 17 grupos, incluidos los que tienen fenotipos compatibles con los grupos de células eNK y nILC en los datos de scRNAseq (Fig. 5C). Las células se anotaron en función del agrupamiento no supervisado seguido de la confirmación mediante la clasificación manual para la anotación (Fig. S5). Las células eNK representaron el 8% de la fracción total de células NK e ILC (Fig. S6) y tenían un perfil identificado como Lin−CD56+CD94+CD16−CD127lowCD45RA+ (Fig. 5C–E). En particular, las células eNK se caracterizaron por una expresión intermedia de CD127, lo que las distingue de las células NK de la etapa 4b ^[37] (Fig. 5D, E). Los nILC representaron el 7,5% de la fracción total de células NK e ILC (Fig. S6) y tenían un perfil identificado como Lin-CD127+CD94-CD117+CRTH2-NKp44−HLA-DR−CD45RA+ (Fig. 5C–E). En particular, de manera similar a nuestros datos de scRNAseq (Fig. S4A, B), detectamos una tendencia a una correlación inversa entre la frecuencia de nILC y las células eNK y la etapa del tumor de CRC primario (Fig. S7A, B).

Impulsados por las características transcripcionales específicas del tumor de los nILC y las células eNK (Fig. 3D y 4), probamos a continuación la hipótesis de que los nILC y las células eNK intratumorales podrían tener una mayor capacidad para la diferenciación de células ILC1 y trNK, contribuyendo así al enriquecimiento de dichas células en los tumores (Fig. 3A–C). Con este fin, los nILC, las células eNK CD127+, las células eNK CD127− (definidas como en la Fig. 5E), los ILC3 NKp44+ y las células NK CD16+ de 14 tumores primarios de CRC y colon emparejados (Tabla 3) se clasificaron mediante citometría de flujo (Fig. S8). Cabe señalar que, debido al espacio limitado en nuestro panel de clasificación de citometría de flujo, las células CD49a+, que potencialmente representan las células NK CD49a+ de la etapa 4b, no se excluyeron en la clasificación de las células eNK y podrían representar aproximadamente el 30% de la población clasificada (Fig. 4C, D). Basándonos en la expresión de los receptores de citocinas en los grupos de nILC y células eNK (Fig. S9), co-cultivamos las células clasificadas con células OP9-DL1 durante 14 días con IL-2, IL-7, IL-1β, IL-12, IL-18 y TGF-β o IL-2, IL-7, IL-1β y IL-23 (siete pares de pacientes para cada mezcla de citocinas) para evaluar su capacidad de diferenciación (Fig. 6A). OP9 es una línea de células estromales de ratón que sobreexpresa el ligando Notch delta-like 1, que se sabe que apoya el desarrollo de las células T ^[38]. Sin embargo, también se ha demostrado que el cultivo de ILCp de sangre o amígdala con células OP9, OP9-DL4 u OP9-DL1 y IL-2, IL-7, IL-1β e IL-23 apoya la diferenciación de ILC3 e ILC1/células NK [31, 34].

Los co-cultivos de nILC, células eNK CD127+ o células eNK CD127− con células OP9-DL1 e IL-2, IL-7, IL-1β, IL-12, IL-18 y TGF-β revelaron la generación extensa de células que expresan CD49a, CD103, NKp44, perforina y granzima B, compatibles con un fenotipo ieILC1 (Fig. S10A, B). Sin embargo, no detectamos ningún cambio en la expresión de las proteínas asociadas a la citotoxicidad, perforina, granzima B o K, granulina, CD16, citocinas (IFN-γ, IL-22 e IL-13) o el marcador de residencia tisular CD49a para ninguno de los cultivos de nILC o células eNK derivados del tumor o del colon (Fig. S10A, B). En contraste, los co-cultivos de nILC con células OP9-DL1 e IL-2, IL-7, IL-1β e IL-23 mostraron que los nILC del tumor generaron más células que expresan CD117 (Fig. S11), que normalmente se expresa en los ILC3. Sin embargo, el análisis del marcador ILC3 CD300F y la producción de IL-22 no reveló ninguna diferencia en la capacidad de los nILC del colon para generar células ILC3 similares que expresan CD300F+, IL-22+ o IL-22+ (Fig. 6B). En comparación con los nILC del colon, los nILC intratumorales generaron significativamente más ILC que expresan IL-13 (Fig. 6C). Además, los nILC intratumorales generaron significativamente más ILC que expresan perforina (Fig. 6D) y también parecían generar más células que expresan granzima B, aunque no de manera estadísticamente significativa (Fig. 6E). Además, la expresión del marcador de residencia tisular CD49a mostró una tendencia a ser mayor (Fig. 6F), mientras que la expresión de CD16 pareció ser menor en los cultivos de nILC intratumorales, aunque no de manera estadísticamente significativa (Fig. 6G). Ninguno de los otros marcadores analizados mostró ninguna diferencia clara después del cultivo de nILC intratumorales y del colon (Fig. S11).

Para evaluar la coexpresión de estas moléculas en las células derivadas de nILC después del co-cultivo con células OP9-DL1 e IL-2, IL-7, IL-1β e IL-23, recurrimos a un análisis multidimensional visualizado mediante UMAP, que reveló 13 grupos (Fig. 6H). Los grupos 0 y 2, que expresan los marcadores ILC3 NKp44 y CD300F, de los cuales uno expresaba niveles intermedios de IL-22 (grupo 2) (Fig. 6I), se enriquecieron con células derivadas de nILC del colon (Fig. 6J). Sin embargo, un pequeño grupo con alta expresión de IL-22, que carecía de NKp44 y CD300F (grupo 10), se enriqueció con células derivadas de nILC intratumorales. Por lo tanto, la evaluación de la capacidad de ILC3 de los nILC intratumorales fue inconclusa y probablemente no cambió.

En contraste, los grupos que expresan perforina se enriquecieron claramente en los cultivos de nILC derivados del tumor (grupos 4, 5, 9, 11; Fig. 6J). En particular, el grupo 4 mostró la mayor expresión de CD49a, con coexpresión de niveles intermedios de granzima B, granzima K y perforina (Fig. 6I). El grupo 9 mostró la mayor expresión de CD103, con coexpresión de NKp44 y niveles intermedios de IFN-γ, NKp80 y perforina (Fig. 6I). Los grupos 5 y 11 coexpresaron IFN-γ y perforina, con o sin CD49a (Fig. 6I). Estos datos indicaron una mayor capacidad de los nILC intratumorales para generar células que expresan proteínas citotóxicas y marcadores de residencia tisular. Los datos provienen de un total de 14 muestras de tejido de 7 pacientes analizados en 4 experimentos independientes (1-2 pacientes por experimento). Además, los nILC intratumorales mostraron una mayor capacidad para generar células que expresan altos niveles de IL-13 (grupo 8) (Fig. 6I, J).

En conjunto, estos resultados indican que, si bien tanto los nILC como las células eNK pueden generar células ILC1/trNK, en comparación con los nILC del colon no afectado, los nILC intratumorales tienen una mayor propensión a la diferenciación en células con un perfil de células ILC1/trNK o un fenotipo similar a ILC2.

Los nILC y las células eNK intratumorales generan preferentemente células ILC1/trNK en el co-cultivo con células Caco-2.

Para explorar la capacidad de diferenciación de las células nILC y eNK en un entorno más relevante para el tumor y que favorezca a las células NK, co-cultivamos las células eNK y nILC con la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano Caco-2 y con IL-2, IL-7, IL-1β, IL-23 e IL-15, esta última para promover la diferenciación de las células NK (Fig. 7A). Las células se aislaron del colon sano y del tumor primario de CRC de 10 pacientes con CRC (Tabla 3). Las células eNK se aislaron como células CD49a– para evitar la inclusión de células CD49a+ en etapa 4b (Fig. 4C, D y Fig. S12). De manera similar a los co-cultivos con células OP9-DL1, las células nILC intratumorales y eNK generaron células que expresan granzima B (Fig. 7B), a menudo en combinación con la expresión de perforina, CD49a y CD103 (Fig. 7C–E y Fig. S13A, B), lo que indica la diferenciación de células ILC1/trNK. Sin embargo, la expresión de IFN-γ y granzima K fue baja en estos cultivos (Fig. S13C, D), posiblemente como resultado de factores supresores como TGF-β u otros factores producidos por las células Caco-2 y/o la ausencia de IL-12 e IL-18. Cabe destacar que observamos una alta expresión de NKp44 y NKG2D (Fig. 7F–I) y, en menor medida, de NKp46 y NKp80 (Fig. 7J–M) en las células nILC y eNK después del cultivo, lo que proporciona pistas sobre cómo estas células ILC1/trNK podrían activarse en el microambiente tumoral (TME).

Las células nILC intratumorales generaron además células ILC3+ (Fig. S13E). Sin embargo, observamos una baja expresión de IL-13 en las células nILC después del co-cultivo (Fig. S13F) y no hubo divergencia en la capacidad de diferenciación de las células ILC1 o NK entre las células nILC del colon y las células nILC intratumorales (Fig. 7B, D). Esto contrastó con nuestros hallazgos con las células estromales OP9-DL1, donde las células nILC intratumorales generaron más células ILC2, así como células ILC1/NK (Fig. 6), lo último en concordancia con su mayor expresión de genes de células NK en los tumores (Fig. 4A). Por lo tanto, es posible que el microambiente de las células tumorales Caco-2, en combinación con IL-15, contribuyera con señales que compensaran la menor capacidad intrínseca de las células ILC1/NK del colon, al tiempo que anulaban el potencial ILC2 de las células nILC tumorales. Esto sugiere que el TME desempeña un papel importante en la programación del destino de las células nILC.

Heterogeneidad de las células ILC en el colon sano, CRC y tumores PM

Primero evaluamos la infiltración de linfocitos en el colon humano sano (en adelante, denominado "colon"), el tumor primario de CRC y los tumores PM. Las células T dominaron tanto el tumor primario de CRC como, como se informó previamente^[28], los tumores PM, mientras que las células ILC y NK fueron igualmente frecuentes en los tumores en comparación con el colon (Fig. S1A). Las células ILC y NK (células ILC NKG2A−CD127+, células NK CD56+ y células ILC no convencionales CD56−CD7+, total n = 23407) de 11 pacientes en nuestra cohorte traslacional que contribuyeron con muestras de tejido del colon humano, tumores primarios de CRC y/o tumores PM (Tabla 1) se aislaron mediante citometría de flujo (Fig. S1A, B) y se analizaron mediante secuenciación de ARN de célula única (scRNAseq) para evaluar su heterogeneidad transcripcional (Fig. 1A). Dado que el espectro de alta resolución de las células ILC y NK en el intestino humano sigue siendo poco conocido, y que los informes existentes cuestionan la nomenclatura dogmática previa de las células ILC y NK^[16],^[29], prestamos especial atención a anclar nuestras anotaciones en la literatura existente.

La agrupación jerárquica de 14 grupos definidos transcripcionalmente permitió la identificación de tres ramas principales de grupos (Fig. 1B, C) presentes en el colon, el tumor primario de CRC y los tumores PM (Fig. S1C, D). El análisis de expresión diferencial (DE) seguido de la agrupación jerárquica reveló módulos de genes (Fig. 1D) que identificaron la rama 1 como células NK convencionales (cNK) (módulo 6, que incluye GZMB, FCGR3A, GZMH y CCL3), la rama 2 como células ILC CD127+ (módulo 8, que incluye KIT y IL4I1 y el módulo 9 que incluye IL7R, LTB y GPR183) y la rama 3 como células ILC1/trNK, ya que los grupos de esta rama compartieron similitudes tanto con las células ILC CD127+ como con las células cNK (Fig. 1C, D). El grupo 10 no se agrupó con ninguna de las tres ramas en la agrupación jerárquica (Fig. 1B) pero se incluyó en la rama 3 debido a la alta similitud con otros grupos de la rama 3, incluido la ausencia de los genes de los módulos 6, 8 y 9 expresados en cualquiera de los grupos de la rama 1 o 2 (Fig. 1C). Más específicamente, los grupos ILC1/trNK expresaron genes asociados con la residencia tisular (módulo 1: CXCR6, ITGAE) así como con la citotoxicidad (módulo 1: GZMA y GZMK), mientras que los grupos ILC1/trNK 1 y 7 expresaron genes en el módulo 10 (CD83, NFKB1 y ICAM1), también expresados por las células ILC CD127+. Cabe destacar que los grupos 1 y 8 expresaron ambos genes del módulo 9, incluido SELL, que normalmente se expresa en linfocitos de homing/residencia, como las células T naive, las células nILC y las células NK CD56bright^[16],^[30],^[31]. Junto con los genes DE (Fig. 1D), también utilizamos un conjunto de factores de transcripción que definen la línea y la etapa de diferenciación para anotar los grupos (Fig. 1E, F). Tanto las células NK tempranas (eNK) (grupo 1) como las células ILC naive (nILC) (grupo 8) se definieron por la expresión de TCF7 y ID2, mientras que ILC3 expresó adicionalmente RORC, AHR, BCL6 y MAF (Fig. 1E). ILC2 y todos los grupos de ILC1 y células NK expresaron ZBTB16 (PLZF) y PRDM1 (BLIMP-1), mientras que ILC2 mostró la mayor expresión de GATA3 (Fig. 1E). TBX21 e IKZF3 se expresaron en todos los grupos de la rama ILC1/trNK, mientras que EOMES se restringió a ILC1, ILC1 CD160+, ILC1 IFN+ y células NK A y células NK HLA-DR+. ZNF683 se expresó de forma exclusiva en ieILC1 (Fig. 1E). Para alinear aún más con la nomenclatura actual, realizamos un conjunto de puntuaciones de nuestros grupos en comparación con los módulos de perfiles de genes de células NK descritos recientemente. La puntuación del módulo para las células NK circulantes y las células trNK^[32] mostró que las células ILC1 y trNK obtuvieron la puntuación más alta para una firma trNK (Fig. 1G), mientras que las células cNK obtuvieron la puntuación más alta para una firma de células NK circulantes (Fig. 1H). De manera similar, la puntuación en comparación con las firmas NK1, NK2 y NK3 descritas recientemente^[29] (Fig. S1E) mostró que las células cNK eran más similares a las células NK1, particularmente NK1B y NK1C, mientras que las células NK HLA-DR+ obtuvieron la puntuación más alta para la firma NK3, lo que sugiere que podrían ser de tipo adaptativo^[29]. Las células ILC CD127+ y eNK obtuvieron la puntuación más alta para la firma NK2, mientras que las células ILC1 y trNK mostraron una puntuación intermedia para las firmas NK1 y NK2 (Fig. S1E). También comparamos nuestros grupos con perfiles transcripcionales de ILC1 y células NK en el intestino humano, la amígdala, el pulmón y la sangre periférica publicados recientemente^[16] (Fig. S1F, G), lo que respaldó nuestras anotaciones de las células cNK, ILC CD127+, ILC1 y trNK. En particular, confirmamos la identidad de ieILC1 como ILC que expresa PRDM1 (Fig. 1E) y eNK (grupo 1) como muy similar a las células NK CD56bright (Fig. S1F, G), pero con un perfil de residencia tisular (Fig. 1G).

Dos subconjuntos de células ILC con firmas inmaduras en el colon y los tumores

Si bien se han descrito las células nILC en el colon sano e inflamado^[31], y las células NK de tipo CD56bright, que comparten similitudes con las células eNK identificadas en este estudio, observadas en el cáncer de cabeza y cuello^[33], sus funciones como precursoras de células ILC y NK más maduras en el CRC primario y metastásico siguen sin explorarse. Para definir estas dos poblaciones con más detalle, realizamos un análisis DE. Varios de los principales genes DE de las células eNK y nILC se compartieron entre los dos grupos, incluidos IL7R, SELL, GPR183 y CD55 (Fig. 2A), que se describieron previamente en las células NK CD56bright^[16] y las células nILC y los precursores de células ILC (ILCp)^[31],^[34]. La expresión DE de XCL1 y XCL2 también se compartió entre las células eNK y nILC, así como con la rama de células ILC1/trNK (Fig. 2A). Sin embargo, las células eNK fueron claramente distintas de las células nILC, ya que se parecían a las células NK CD56bright en su expresión de IL12RB, CRTAM, IRAK3, GNLY, COTL1, TNFSF9 y KLRC1 (Fig. 2B) y obtuvieron la puntuación más alta para un perfil de células NK SELL+ ^[16] (Fig. S1F). El grupo nILC mostró una expresión única de TNFRSF4 y MFGE8, pero también compartió varios transcritos con las células eNK (TCF7, TNFRSF18) así como con ILC2 e ILC3, incluidos KIT, LTB, ICOS, TIMP1, SCN1B, SSBP2 y CDKN1A (Fig. 2C). Si bien las células nILC compartieron algunas similitudes con las células ILC CD127+ maduras, y eNK se parecían a las células NK CD56bright, el análisis de pseudotiempo reveló que ambos grupos se ubicaron en la base de la trayectoria, mientras que los grupos más diferenciados ILC2, ieILC1 y NK HLA-DR+ terminaron al final de la trayectoria predicha (Fig. 2D y Fig. S2A), independientemente del tejido del que se derivaran (Fig. S2B–D). Esto respaldó la hipótesis de que las células nILC y eNK son las menos diferenciadas de los subconjuntos analizados, junto con ILC3 NKp44-, esta última mostrando una gran similitud con las células ILC3p descritas recientemente (Fig. S1F). De hecho, en el análisis de velocidad de ARN proyectado en UMAP, tanto el grupo de células ILC3 NKp44- como el grupo de células nILC parecían diferenciarse en el grupo de células ILC3 NKp44+, mientras que las células eNK parecían tener más probabilidades de diferenciarse en los grupos de células ILC1 y trNK (Fig. 2E y Fig. S2E). El tiempo latente de la velocidad fue el más alto en ILC3 NKp44+, ieILC1, NK B CD16+ y NK LIGHT+, lo que indica que estos grupos son los más diferenciados (Fig. 2F).

Los tumores de CRC y PM están enriquecidos con células ILC1 y trNK

A continuación, observamos los cambios composicionales de las células ILC CD127+ y NK en los tumores en comparación con el tejido del colon sano. Si bien los grupos de células ILC3 NKp44+ y NKp44- se derivaron predominantemente del tejido del colon (Fig. 3A, B), los tumores primarios y las metástasis fueron las fuentes dominantes de células en los grupos ieILC1, ILC1, NK B CD16+, NK HLA-DR+, ILC1 IFN+ y ILC1 LIGHT+ (Fig. 3A). La evaluación de las frecuencias totales y la contribución de los pacientes de estos grupos reveló una disminución estadísticamente significativa de ILC3 NKp44+ y un enriquecimiento significativo del grupo de células NK HLA-DR+ en los tumores primarios y las metástasis en comparación con el tejido del colon sano (Fig. 3C). Las pruebas de abundancia diferencial (DA) confirmaron estas diferencias, con las células DA en los grupos ILC3 NKp44+ y NKp44- que fueron más abundantes en el colon, y las células DA en la rama cNK e ILC1/trNK, incluidos los grupos NK HLA-DR+ pero también NK B CD16+, ILC1, ieILC1 y ILC1 LIGHT+, que fueron más frecuentes en los tumores primarios y las metástasis (Fig. S3A–C). Si bien las frecuencias de las células nILC y eNK no difirieron entre el colon, el CRC primario o los tumores CRC-PM, detectamos una correlación inversa entre la frecuencia de las células nILC y una tendencia a una correlación inversa entre la frecuencia de las células eNK y la etapa del tumor primario de CRC (Fig. S4A, B). También validamos la existencia de nuestros grupos de células identificados, incluidas las células nILC y las células eNK, en un conjunto de datos de scRNAseq disponible públicamente (GSE178341) derivado de 62 tumores primarios de CRC (Fig. S4C–G). Debido al bajo número de células en este conjunto de datos (aproximadamente 5600 células ILC y NK) en comparación con el nuestro (aproximadamente 23400 células ILC y NK), las células nILC y eNK se combinaron en una sola población para la correlación con las variables clínicas. Cabe destacar que no pudimos validar la correlación inversa entre la frecuencia de las células nILC y la etapa del tumor primario de CRC (Fig. S4H), lo que podría deberse al bajo número de células de las etapas tumorales predominantemente tempranas en estos datos. Además, la frecuencia de las células nILC y eNK fue similar independientemente del estado de MMR, el sexo biológico y la ubicación del tumor (Fig. S4I–K).

Para comprender si los cambios composicionales en los tumores podrían ser causados por cambios en la diferenciación local de las células progenitoras intratumorales, realizamos un análisis de velocidad en cada tejido por separado. Esto reveló un cambio en la velocidad dentro del grupo de células eNK en los tumores, que fue más pronunciado en PM (Fig. 3D). En contraste con el colon sano, donde los cambios en la expresión génica de las células eNK se dirigieron hacia el grupo de células ILC3 NKp44+ (Fig. 3D), la velocidad génica de las células eNK se dirigió hacia los grupos ILC1 LIGHT+ y NK B CD16+ en los tumores primarios de CRC y las metástasis (Fig. 3D).

Las cILCs y las células NK efectoras (eNK) presentan características transcripcionales distintas en los tumores de CRC

A continuación, buscamos identificar las diferencias transcripcionales entre las cILCs y las células NK efectoras en el colon y en los tumores, lo que podría ayudar a explicar el cambio en la trayectoria de diferenciación predicha en los tumores, tal como se identificó mediante el análisis de la velocidad del ARN (Fig. 3D). El análisis de expresión diferencial (DE) de las cILCs y las células NK efectoras en el colon frente a los tumores primarios de CRC (Datos suplementarios 1 y 2) reveló un posible sesgo hacia el perfil ILC1 y de células NK de las cILCs intratumorales, con una mayor expresión de GNLY, KLRC1, RGS2, CTSW y CEBPB en comparación con las cILCs del colon (Fig. 4A, B). En contraste, las cILCs del colon parecían tener un sesgo hacia el perfil ILC3, con una mayor expresión de LTB, PTGER4, TIPARP, IL4I1 y IL1R1 (Fig. 4A, C), lo que coincide con informes previos sobre la propensión de las cILCs del colon al perfil ILC3^[31]. También se observaron cambios transcripcionales en las células NK efectoras intratumorales, con una mayor expresión de GNLY, CRTAM, que normalmente se expresa en las células NK CD56bright, SELL y TCF7, que se expresan en las células NK tr^[35], y IL10R y HIF1A, lo que indica la influencia del microambiente tumoral en estas células^[36] (Fig. 4D, E). Las células NK efectoras en el colon expresaban transcritos de las células en etapa temprana y de las células NK tr (CD3E, ZBTB16, EOMES, IRF8) así como de las ILC3 (LTB, AHR) (Fig. 4D, F), lo que podría explicar su trayectoria de diferenciación predicha hacia el perfil ILC3 en el colon (Fig. 3D).

Identificación y aislamiento de las cILCs y las células NK efectoras intratumorales y del colon

Para validar la existencia y explorar la capacidad de diferenciación de las cILCs y las células NK efectoras intratumorales, desarrollamos un panel de citometría de flujo basado en transcritos y en la expresión de proteínas de superficie seleccionadas en los datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq). El grupo de cILCs se pudo distinguir de otras ILCs CD127+ por la expresión de IL7R y KIT, pero por la ausencia de NCR2, HLA-DRA, HLA-DRB y PTGDR2, y de las células ILC1 y NK tr por la ausencia de la expresión de KLRD1 y NCAM1 (Fig. 5A y características del paciente en la Tabla 2). Este fenotipo se pudo confirmar a nivel de proteínas mediante el uso de las bibliotecas de proteínas de superficie en el conjunto de datos de una sola célula, identificando las cILCs como células que expresan CD127 y CD117, pero que carecen de CD94 y CD336 (NKp44) (Fig. 5B). Las células NK efectoras expresaban KLRD1 y NCAM1, pero también expresaban IL7R, lo que las distinguía de los grupos de células ILC1 y NK tr. Además, en contraste con las células NK convencionales (cNK), carecían de la expresión de FCGR3A (Fig. 5A). A nivel de proteínas de superficie, el grupo de células NK efectoras expresaba niveles intermedios de CD94 y CD127 (Fig. 5B). Además, tanto las cILCs como las células NK efectoras expresaban niveles intermedios de la proteína CD45RA (Fig. 5B).

Las ILCs convencionales Lin-CD127+CD94−, las ILCs no convencionales Lin− CD94+/−CD56−CD7+ y las células NK Lin− CD94+/−CD56+ en los tumores primarios de colon y CRC emparejados se analizaron mediante citometría de flujo en un grupo diferente de ocho pacientes, que aportaron siete muestras de colon y siete tumores primarios (Tabla 2), lo que permitió la identificación de 17 grupos, incluidos los que presentaban fenotipos compatibles con los grupos de células NK efectoras y cILCs en los datos de scRNAseq (Fig. 5C). Las células se anotaron en función del agrupamiento no supervisado, seguido de la confirmación mediante la delimitación manual para la anotación (Fig. S5). Las células NK efectoras representaron el 8% de la fracción total de células NK e ILC (Fig. S6) y presentaban un perfil identificado como Lin−CD56+CD94+CD16−CD127lowCD45RA+ (Fig. 5C–E). En particular, las células NK efectoras se caracterizaron por una expresión intermedia de CD127, lo que las distingue de las células NK en etapa 4b^[37] (Fig. 5D, E). Las cILCs representaron el 7,5% de la fracción total de células NK e ILC (Fig. S6) y presentaban un perfil identificado como Lin-CD127+CD94-CD117+CRTH2-NKp44−HLA-DR−CD45RA+ (Fig. 5C–E). En particular, de forma similar a nuestros datos de scRNAseq (Fig. S4A, B), detectamos una tendencia a una correlación inversa entre la frecuencia de las cILCs y las células NK efectoras y la etapa del tumor primario de CRC (Fig. S7A, B).

Las cILCs intratumorales tienen una mayor propensión a la diferenciación hacia las células ILC1/NK tr en el sistema OP9-DL1

Impulsados por las características transcripcionales específicas del tumor de las cILCs y las células NK efectoras (Fig. 3D y 4), a continuación, pusimos a prueba la hipótesis de que las cILCs y las células NK efectoras intratumorales podrían tener una mayor capacidad de diferenciación hacia las células ILC1 y NK tr, lo que contribuiría al enriquecimiento de dichas células en los tumores (Fig. 3A–C). Con este fin, las cILCs, las células NK efectoras CD127+, las células NK efectoras CD127− (definidas como en la Fig. 5E), las células ILC3 NKp44+ y las células NK CD16+ de 14 tumores primarios de colon y CRC emparejados (Tabla 3) se clasificaron mediante citometría de flujo (Fig. S8). Cabe destacar que, debido al espacio limitado en nuestro panel de clasificación por citometría de flujo, las células CD49a+, que potencialmente representan las células NK CD49a+ en etapa 4b, no se excluyeron en la clasificación de las células NK efectoras y podrían representar aproximadamente el 30% de la población clasificada (Fig. 4C, D). Basándonos en la expresión de los receptores de citoquinas en los grupos de cILCs y células NK efectoras (Fig. S9), co-cultivamos las células clasificadas con células OP9-DL1 durante 14 días con IL-2, IL-7, IL-1β, IL-12, IL-18 y TGF-β o con IL-2, IL-7, IL-1β e IL-23 (siete pares de muestras de pacientes para cada mezcla de citoquinas) para evaluar su capacidad de diferenciación (Fig. 6A). OP9 es una línea celular estromal de ratón que sobreexpresa el ligando Notch delta-like 1, que se sabe que favorece el desarrollo de las células T^[38]. Sin embargo, también se ha demostrado que el cultivo de ILCp de sangre o amígdala con células OP9, OP9-DL4 u OP9-DL1 e IL-2, IL-7, IL-1β e IL-23 favorece la diferenciación tanto de las ILC3 como de las células ILC1/NK^[31],^[34].

Los co-cultivos de cILCs, células NK efectoras CD127+ o células NK efectoras CD127− con células OP9-DL1 e IL-2, IL-7, IL-1β, IL-12, IL-18 y TGF-β revelaron la generación extensa de células que expresan CD49a, CD103, NKp44, perforina y granzima B, compatibles con un fenotipo ieILC1 (Fig. S10A, B). Sin embargo, no detectamos ningún cambio en la expresión de las proteínas asociadas a la citotoxicidad, perforina, granzima B o K, granulina, CD16, citoquinas (IFN-γ, IL-22 e IL-13) o el marcador de residencia tisular CD49a para ninguna de las cILCs ni para ninguno de los cultivos de células NK efectoras derivadas del tumor o del colon (Fig. S10A, B). En contraste, los co-cultivos de cILCs con células OP9-DL1 e IL-2, IL-7, IL-1β e IL-23 mostraron que las cILCs del tumor generaban más células que expresaban CD117 (Fig. S11), que normalmente se expresa en las ILC3. Sin embargo, el análisis del marcador ILC3 CD300F y la producción de IL-22 no reveló ninguna diferencia en la capacidad de las cILCs del colon para generar células ILC3 similares que expresan CD300F+, IL-22+ o que secretan IL-22 (Fig. 6B). En comparación con las cILCs del colon, las cILCs intratumorales generaron significativamente más células IL-13+ (Fig. 6C). Además, las cILCs intratumorales generaron significativamente más células que expresan perforina (Fig. 6D) y también parecían generar más células que expresan granzima B, aunque no de forma estadísticamente significativa (Fig. 6E). Además, la expresión del marcador de residencia tisular CD49a mostró una tendencia a ser mayor (Fig. 6F), mientras que la expresión de CD16 pareció ser menor en los cultivos de cILCs intratumorales, aunque no de forma estadísticamente significativa (Fig. 6G). Ninguno de los otros marcadores analizados mostró ninguna diferencia clara tras el cultivo de cILCs intratumorales y del colon (Fig. S11).

Para evaluar la coexpresión de estas moléculas en las células derivadas de cILCs tras el co-cultivo con células OP9-DL1 e IL-2, IL-7, IL-1β e IL-23, recurrimos a un análisis multidimensional visualizado mediante UMAP, que reveló 13 grupos (Fig. 6H). El grupo 0 y el grupo 2, que expresan los marcadores ILC3 NKp44 y CD300F, de los cuales uno expresaba niveles intermedios de IL-22 (grupo 2) (Fig. 6I), se enriquecieron con células derivadas de las cILCs del colon (Fig. 6J). Sin embargo, un pequeño grupo con alta expresión de IL-22, que carecía de NKp44 y CD300F (grupo 10), se enriqueció con células derivadas de las cILCs intratumorales. Por lo tanto, la evaluación de la capacidad ILC3 de las cILCs intratumorales fue poco concluyente y probablemente no cambió.

En contraste, los grupos que expresan perforina se enriquecieron claramente en los cultivos de cILCs derivadas del tumor (grupos 4, 5, 9, 11; Fig. 6J). En particular, el grupo 4 mostró la mayor expresión de CD49a, con coexpresión de niveles intermedios de granzima B, granzima K y perforina (Fig. 6I). El grupo 9 mostró la mayor expresión de CD103, con coexpresión de NKp44 y niveles intermedios de IFN-γ, NKp80 y perforina (Fig. 6I). Los grupos 5 y 11 coexpresaron IFN-γ y perforina, con o sin CD49a (Fig. 6I). Estos datos indicaron una mayor capacidad de las cILCs intratumorales para generar células que expresan tanto proteínas citotóxicas como marcadores de residencia tisular. Los datos provienen de un total de 14 muestras de tejido de 7 pacientes analizados en 4 experimentos independientes (1 o 2 pacientes por experimento). Además, las cILCs intratumorales mostraron una mayor capacidad para generar células que expresan altos niveles de IL-13 (grupo 8) (Fig. 6I, J).

En conjunto, estos resultados indican que, si bien tanto las cILCs como las células NK efectoras pueden generar células ILC1/NK tr, en comparación con las cILCs del colon no afectado, las cILCs intratumorales tienen una mayor propensión a la diferenciación hacia células con un perfil ILC1/NK tr o un fenotipo similar a ILC2.

Las cILCs y las células NK efectoras intratumorales generan preferentemente células ILC1/NK tr en el co-cultivo con células Caco-2

Para explorar la capacidad de diferenciación de las cILCs y las células NK efectoras en un entorno más relevante para el tumor y que favorezca las células NK, co-cultivamos las células NK efectoras y las cILCs con la línea celular de adenocarcinoma de colon humano Caco-2 y IL-2, IL-7, IL-1β, IL-23 e IL-15, esta última para promover la diferenciación de las células NK (Fig. 7A). Las células se clasificaron a partir del colon no afectado y del tumor primario de CRC de 10 pacientes con CRC (Tabla 3). Las células NK efectoras se clasificaron como células CD49a− para evitar la inclusión de células CD49a+ en etapa 4b (Fig. 4C, D y Fig. S12). De forma similar a los co-cultivos con células OP9-DL1, las cILCs y las células NK efectoras intratumorales generaron células que expresan granzima B (Fig. 7B), a menudo en combinación con la expresión de perforina, CD49a y CD103 (Fig. 7C–E y Fig. S13A, B), lo que indica la diferenciación de células ILC1/NK tr. Sin embargo, la expresión de IFN-γ y granzima K fue baja en estos cultivos (Fig. S13C, D), posiblemente como resultado de factores supresores como el TGF-β u otros factores producidos por las células Caco-2 y/o la ausencia de IL-12 e IL-18. En particular, observamos una alta expresión de NKp44 y NKG2D (Fig. 7F–I) y, en menor medida, de NKp46 y NKp80 (Fig. 7J–M) en las cILCs y las células NK efectoras tras el cultivo, lo que proporciona pistas sobre cómo estas células ILC1/NK tr podrían activarse en el microambiente tumoral (TME).

Las cILCs intratumorales también generaron células ILC3 similares a IL-22+ (Fig. S13E). Sin embargo, observamos una baja expresión de IL-13 en las cILCs tras el co-cultivo (Fig. S13F) y no observamos ninguna divergencia en la capacidad de diferenciación de las células ILC1 o NK del colon frente a las cILCs intratumorales (Fig. 7B, D). Esto contrastó con nuestros hallazgos con las células estromales OP9-DL1, en los que las cILCs intratumorales generaron más células similares a ILC2, así como células ILC1/NK (Fig. 6), lo que último coincidió con su mayor expresión de genes de células NK en los tumores (Fig. 4A). Por lo tanto, es posible que el microambiente de las células tumorales Caco-2, en combinación con IL-15, proporcionara señales que compensaran la menor capacidad intrínseca de las células ILC1/NK de las cILCs del colon, al tiempo que anulaban el potencial ILC2 de las cILCs del tumor. Esto sugiere que el TME desempeña un papel importante en la programación del destino de las cILCs.

Discusión

El CRC es la tercera forma de cáncer más común^[1] y los pacientes que desarrollan PM tienen un pronóstico particularmente desfavorable^[39]. La mayoría de los pacientes no se consideran aptos para el tratamiento quirúrgico de PM y el tratamiento quimioterapéutico actual del CRC-PM suele ser ineficaz^[39]. Una alta infiltración intratumoral de células T se asocia con una mejor supervivencia^[10]–^[12]. Sin embargo, el bloqueo de los puntos de control inmunitario solo beneficia a un pequeño número de pacientes^[8],^[9]. Por lo tanto, existe una gran necesidad de una mayor comprensión del panorama inmunitario en el CRC y el CRC-PM, y del descubrimiento de objetivos terapéuticos.

Aquí, mostramos que los tumores primarios de CRC y el CRC metastásico peritoneal (CRC-PM) están infiltrados por una población heterogénea de ILCs que incluye subconjuntos de ILC3, ILC1, células trNK y células cNK. También abarca dos poblaciones de ILCs inmaduras, una identificable como las nILCs descritas previamente^[31],^[34] y la otra similar a las células NK CD56bright de la sangre, aunque con un perfil de residente tisular^[16], a las que nos referimos como células eNK. Nuestro estudio amplía la literatura existente sobre el paisaje intratumoral de ILCs y células NK en el CRC primario^[40]–^[43] al CRC-PM. Nuestros datos se alinean aún más con la creciente literatura sobre la heterogeneidad de ILCs y células NK en otros cánceres sólidos, por ejemplo, mama^[43], vejiga^[44], cabeza y cuello^[33] y cáncer de pulmón^[45].

Mientras que la población de ILCs en el colon no afectado está, como es de esperar, dominada por las ILC3^[40], reconocidas por su papel clave en la homeostasis intestinal y la prevención del CRC en modelos de ratón^[46], los tumores primarios de CRC y el CRC-PM estaban enriquecidos con células de la rama cNK de los grupos (NK A CD16+, NK B CD16+ y células NK HLA-DR+). Estas expresaban GZMB, FGFBP2, FCGR3A, GZMH y CCL3, y mostraban una alta similitud con las células NK circulantes, y el análisis de trayectoria reveló que estaban relacionadas transcripcionalmente entre sí. Por lo tanto, es factible que estas células cNK se deriven de la sangre. Cabe destacar que los grupos de células cNK con la expresión más pronunciada de estos genes de citotoxicidad, NK A CD16+ y NK B CD16+, no se acumularon significativamente en los tumores, posiblemente debido a una transición al otro grupo de células cNK (NK HLA-DR+), que estaban enriquecidas en los tumores, pero con una expresión más variable de los genes de citotoxicidad. Interesantemente, el grupo de células NK A CD16+ fue más común en el CRC-PM que en los tumores primarios de CRC. De hecho, la afluencia de células NK al entorno tumoral local del CRC está bien documentada en ratones y se acompaña de cambios rápidos en la transcripción y la función, incluida la disminución de las moléculas asociadas con la recirculación y la citotoxicidad^[20]. Por lo tanto, es probable que el microentorno tumoral (TME) esté moldeando la heterogeneidad de las células cNK que observamos en los tumores, incluidas las diferencias observadas entre el CRC-PM y los tumores primarios de CRC, pero en ambos tipos de tejido, lo que lleva a una acumulación de células cNK con un transcriptoma citotóxico menos pronunciado.

Además, los tumores estaban enriquecidos con células de la rama de grupos de células ILC1/trNK (ILC1, ieILC1 y ILC1 LIGHT+), que carecían de la expresión de los genes de las células cNK. Las ILC1 eran similares a las ieILC1 descritas previamente^[24] y el análisis de trayectoria confirmó, de hecho, una estrecha relación entre estas dos poblaciones celulares. En consonancia con esta observación, se ha demostrado previamente que las ieILCs están enriquecidas en los tumores primarios de CRC^[41] y en el cáncer de cabeza y cuello^[33], donde median el reclutamiento de células T a través de la inducción mediada por IFN-γ de CXCL10^[47]. Se ha descrito previamente la presencia de LIGHT en las células NK responsivas a los tumores y su capacidad para mediar la activación y la maduración de las células dendríticas^[48]. El análisis de velocidad mostró que las ILC1 LIGHT+ estaban relacionadas transcripcionalmente con las células NK B mCD16+, pero también con las ILC1 CD160+, que a su vez estaban relacionadas con las células eNK. Si bien las ieILC1 pueden generarse a partir de las células NK CD56bright en la sangre^[33], posiblemente a medida que entran en los tumores y el TME, nuestros datos sugieren que los subconjuntos de ILC1 y células trNK podrían derivarse potencialmente de precursores locales en los tumores. Para abordar esto, clasificamos y cultivamos tanto las nILCs, que han demostrado previamente la capacidad de diferenciarse en ILC1 y células NK Eomes+ y IFN-γ+ en el colon sano e inflamado^[31],^[34], como las células eNK, con una conocida capacidad de diferenciación de ILC1 y células NK en las amígdalas y la sangre^[33],^[49]. Cabe destacar que las células eNK en los tumores, que expresan altos niveles de SELL y TCF7, son similares a las células trNK Tcf1high descritas recientemente en un modelo de infección cutánea^[35]. Estas células trNK Tcf1high, que, en contraste con las células eNK, expresan Eomes, se derivaron de las células NK circulantes, mostraron características de memoria inmunológica y podrían dar lugar a células efectoras tras una nueva exposición. De hecho, las células eNK generaron células ieILC1 similares en presencia de IL-1β, IL-12, IL-18 y TGF-β, así como con IL-1β e IL-23. Por lo tanto, de manera similar a las células trNK Tcf1high en el ratón, las células eNK pueden considerarse precursores intratumorales de las células ILC1 y NK citotóxicas.

En contraste con la predicción del análisis de velocidad y DE, no detectamos ningún cambio en la capacidad de diferenciación de las células eNK intratumorales. Es posible que la definición citométrica de flujo de nILC y células eNK no estuviera absolutamente alineada con las firmas transcripcionales, lo que provocó que algunas células eNK de la definición transcripcional se clasificaran como nILCs. De hecho, notamos una mayor capacidad de las nILCs intratumorales para generar células con un fenotipo de ILC1/trNK en presencia de IL-β e IL-23, expresando moléculas de citotoxicidad como la perforina y la granzima B, al tiempo que expresan marcadores de residencia tisular CD49a y CD103. Estas células carecían de CD16, lo que indica que las nILCs intratumorales no generan células cNK completamente maduras. Sin embargo, detectamos la expresión de NKp44 y NKp80 en estas células, y también detectamos NKG2D y NKp46 en las células ILC1/trNK generadas en cocultivos con células Caco-2. Por lo tanto, nuestros datos respaldan el concepto de que las células ILC1/trNK intratumorales con características citotóxicas pueden generarse no solo a partir de las células NK CD56bright de la sangre, como se informó previamente^[33], sino también a través de la diferenciación local de las células eNK y nILCs intratumorales. De hecho, tanto Notch como IL-23, utilizados en nuestro sistema de diferenciación OP9-DL1, cooperan para promover la diferenciación de ILC1 a partir de nILCs en la sangre periférica^[50]. Cabe destacar que el sistema OP9-DL1 también activa la señalización de WNT/β-catenina a través de la activación de Notch, y ambas vías se sabe que regulan la diferenciación de las células NK y ILC3^[51]. Sin embargo, si bien la señalización de Notch promueve tanto la diferenciación de las células NK como de las ILC3, la señalización de WNT/β-catenina inhibe la función de las ILC3^[52]. Para las células NK, el papel de la señalización de WNT/β-catenina es más complejo, ya que promueve la diferenciación de las células NK en algunos estudios, mientras que inhibe la diferenciación de las células NK en otros estudios^[51]. Interesantemente, se ha informado un aumento de la señalización de WNT/β-catenina en las ILC3 en el CRC^[52]. Es posible que esta vía también se altere en las nILCs y las células eNK. En apoyo de esto, TCF7, un gen aguas abajo de la señalización de WNT/β-catenina, se sobreexpresó significativamente en las células eNK intratumorales en comparación con las células eNK del colon, lo que indica la modulación de las células eNK inducida por WNT/β-catenina en el CRC.

Si bien los cocultivos OP9-DL1 proporcionan información importante sobre la capacidad de diferenciación de las nILCs intratumorales, es posible que se necesiten sistemas más fisiológicamente relevantes para capturar la influencia del TME, especialmente en la diferenciación de las células NK. Para abordar esto, cocultivamos nILCs y células eNK con la línea celular humana de CRC Caco-2, junto con IL-15 para promover la diferenciación de las células NK. En este sistema, las nILCs del colon y las nILCs intratumorales mostraron una capacidad similar para generar células ILC1/trNK, lo que sugiere que el TME desempeña un papel clave en la configuración de la capacidad de diferenciación de las nILCs. Los recientes avances en los sistemas de organoides de CRC ofrecen una plataforma alternativa atractiva para modelar la diferenciación de ILCs^[53].

Además, en el sistema OP9-DL1, observamos una mayor capacidad de las nILCs intratumorales para generar ILC2s IL-13+. Sin embargo, el potencial de ILC2 de las nILCs intratumorales no fue tan evidente en los cocultivos con las células tumorales de CRC Caco-2, lo que podría deberse al sesgo de las células NK de este sistema con IL-15. De hecho, detectamos una pequeña población de ILC2s tanto en el CRC primario como en el CRC-PM, pero no observamos ningún enriquecimiento, independientemente de la etapa del tumor, en comparación con el colon no afectado. Esto se alinea con nuestra observación en el sistema de cocultivo Caco-2. Sin embargo, esto contrasta con un estudio previo en el que la infiltración de ILC2 se correlacionó negativamente con la etapa del tumor^[25]. No obstante, la mayor capacidad de ILC2 de las nILCs intratumorales en el entorno OP9-DL1 merece una mayor exploración, ya que se ha descrito que las ILC2 tanto promueven^[27],^[54] como inhiben^[26] el crecimiento tumoral en el CRC, y ejercen funciones citotóxicas^[55]. Cabe destacar que no observamos características citotóxicas, como la expresión de la granzima B, de las ILC2 intratumorales o de las ILC2 generadas por las nILCs intratumorales en nuestro estudio.

Una de las fortalezas de este estudio es el análisis en profundidad de más de 23.000 ILCs y células NK en los tumores de CRC primario y CRC-PM utilizando scRNAseq, que, según nuestro conocimiento, representa el conjunto de datos discreto de CRC más grande sobre ILCs y células NK humanas y el único conjunto de datos que incluye células no convencionales CD7+CD56-CD127-. También es el primer estudio de ILCs y células NK en el CRC-PM humano, lo que amplía nuestro conocimiento de los infiltrados de células inmunitarias innatas en este grupo de pacientes con mal pronóstico. Si bien el tamaño de la cohorte de pacientes de este estudio es pequeño y no permite una correlación confiable con los parámetros clínicos, permite el estudio de ILCs y células NK con una granularidad sin precedentes, lo que no se puede lograr mediante la secuenciación del tumor completo. Por lo tanto, nuestro estudio abre una vía para futuras investigaciones clínicas a mayor escala. El diseño del estudio incluyó a todos los pacientes programados para la cirugía de CRC y CRC-PM, sin quimioterapia neoadyuvante, en el Hospital Universitario de Karolinska, lo que mejora la generalizabilidad de los resultados y representa una cohorte de pacientes de un hospital universitario. Sin embargo, la cohorte es heterogénea en términos de sexo biológico, edad, ubicación del tumor y seguimiento (ocurrencia/muerte de la enfermedad) y es demasiado pequeña para abordar de manera confiable el impacto de estos factores. Otra limitación es que las comparaciones entre el CRC primario y las metástasis peritoneales podrían haberse visto afectadas por el estado de MMR, ya que faltan datos sobre el estado de MMR para algunas muestras y el MSI-alto era más común en el CRC en etapa temprana que en el CRC-PM, en línea con investigaciones previas^[56]. El estado de MMR está asociado con la infiltración de células NK, por ejemplo, la expresión de puntos de control tumoral y marcadores de residencia tisular^[57]. Para abordar algunas de estas limitaciones, utilizamos un conjunto de datos de scRNAseq disponible públicamente, obtenido de 62 muestras de tumores de CRC. Pudimos validar los grupos de células identificados, pero no encontramos ninguna correlación entre las frecuencias celulares y la etapa del tumor o el estado de MMR, lo que podría deberse al bajo número de células en este conjunto de datos. Por lo tanto, un área de investigación futura en un conjunto de datos más grande podría ser investigar si los resultados difieren por subgrupos clínicos o moleculares. En resumen, los tumores de CRC estudiados aquí estaban sesgados hacia etapas más avanzadas, metástasis y CRC con MMR competente, grupos que se beneficiarían más del descubrimiento de objetivos terapéuticos.

La transferencia adoptiva de células NK ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de diversas neoplasias hematológicas^[58],^[59]. Sin embargo, todavía existen desafíos importantes con las terapias celulares en tumores sólidos, incluido el CCRC^[60]. Una de las razones podría ser la falta de homing tumoral de estos productos celulares, que a menudo se derivan de la sangre o se basan en líneas celulares, por ejemplo, NK92 o células madre pluripotentes inducidas (iPSC)^[60]. Por lo tanto, nuestros resultados abren posibilidades terapéuticas al modificar el microambiente tumoral local (TME) para mejorar la generación local de ILC1 intratumorales y células trNK con función antitumoral. Alternativamente, las ILCs y las células eNK intratumorales podrían obtenerse para generar posibles ILC1 y células NK con homing tisular en casos de CCRC localmente avanzado o metastásico, que presenta un alto riesgo de recurrencia. Un estudio reciente demostró que la generación de células NK de tipo memoria a partir de células NK sanguíneas en presencia de IL-12/15/18 promovió la inmunidad antitumoral contra el CCRC dependiente de NKG2D^[61]. Sin embargo, aún no está claro si estas células se pueden derivar de las ILCs y las células eNK. También es importante señalar que observamos que las ILCs y las células eNK, junto con las ILC1 y las células trNK, expresan las quimiocinas XCL1 y XCL2, y por lo tanto, potencialmente capaces de atraer a otras células inmunitarias, incluidas las células dendríticas CXCR1+^[62] y las células T CD8+^[63], a los tumores. Si bien aún queda mucha investigación por realizar, nuestro trabajo sienta las bases científicas para la idea de aprovechar el potencial de las ILCs y las células eNK intratumorales como precursoras de ILC1 y células trNK antitumorales en el CCRC y el CCRC con metástasis peritoneales. De hecho, nuestros amplios datos de secuenciación de una sola célula proporcionan información que se puede utilizar para el diseño racional de futuras terapias basadas en ILC1 y células NK, con el objetivo de aumentar la actividad antitumoral de estas células.

Métodos

Participantes y muestras

En este estudio de cohorte traslacional, aprobado por la Autoridad de Revisión Ética Sueca para garantizar el cumplimiento de todas las normas éticas pertinentes, los pacientes que se sometían a una resección electiva de adenocarcinomas colorrectales y/o metástasis peritoneales de CCRC en la unidad de CCRC del Hospital Universitario de Karolinska eran elegibles para la inclusión. A partir de abril de 2020, se consideró para la inclusión a pacientes consecutivos con cáncer de colon primario o metástasis peritoneales originarias de CCRC. La recolección de muestras incluyó el tumor primario, las metástasis peritoneales y el tejido de referencia no afectado, cuando fue posible. Por razones prácticas, solo se incluyeron en el estudio las muestras que se podían recolectar antes de las 16:00 los lunes a viernes y cuando el personal de laboratorio estuviera disponible. Los criterios de exclusión fueron (i) quimioterapia neoadyuvante o adyuvante en los seis meses previos a la cirugía, (ii) incapacidad para leer y dar consentimiento informado para el estudio, (iii) antecedentes de trasplante de órganos y (iv) imposibilidad de recolectar la muestra según la evaluación de los cirujanos. Las razones incluyeron el riesgo de afectar la evaluación patológica del espécimen resecado debido a, por ejemplo, tumores pequeños o crecimiento excesivo de los tumores, y/o razones logísticas prácticas. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. La participación en el estudio no afectó a la propia cirugía. En caso de resección de un tumor de colon, las muestras de tejido fueron obtenidas por un cirujano después de la extracción del espécimen. El procedimiento de muestreo se desarrolló en colaboración con los patólogos del Hospital Universitario de Karolinska para no comprometer la evaluación patológica. Todos los cirujanos recibieron capacitación y, como recordatorio, recibieron instrucciones escritas antes de cada caso. El espécimen quirúrgico se abrió cuidadosamente a lo largo del borde antimesentérico desde el extremo distal o proximal hacia el tumor. Si había alguna evidencia macroscópica de crecimiento tumoral, se tuvo especial cuidado de no comprometer la posibilidad de que el patólogo evaluara el espécimen. Cuando el tumor era visible desde el lumen, se tomó una biopsia del tumor utilizando un pequeño instrumento de biopsia o tijeras. La muestra de tejido del colon no afectado se tomó como una pieza circular (aproximadamente 1 cm) del margen colónico proximal o distal del espécimen resecado, según el tipo de resección. A continuación, se realizó la evaluación patológica del resto del espécimen resecado, lo que permitió la evaluación del estadio tumoral que se informó en las tablas de los pacientes. La recolección de datos para las tablas de características de los pacientes (Tablas 1-3) comenzó de forma prospectiva y se recopiló información adicional sobre la evaluación patológica del tumor y el tratamiento oncológico después de que se registrara en las historias clínicas. La evaluación patológica se basó en la clasificación Tumor-Nódulo-Metástasis de la Unión Internacional contra el Cáncer, 8ª edición^[64]. Para los pacientes con metástasis peritoneales, las muestras de tejido de las metástasis peritoneales macroscópicas fueron obtenidas por un cirujano consultor con amplia experiencia intraoperatoriamente después de la evaluación inicial de la carga tumoral peritoneal. Solo se incluyeron las muestras de tejido con tejido canceroso macroscópico visible. Las muestras de tejido se colocaron en un tampón de lavado que contenía solución salina tamponada de Hanks suplementada con antibióticos tan pronto como se retiraron del paciente y se transportaron a 3-5 °C hasta el procesamiento. La cirugía continuó según la evaluación médica con la resección del cáncer planificada y/o la citoreducción quirúrgica (CRS) con o sin quimioterapia hiperérmica intraoperatoria (HIPEC). Algunos pacientes se sometieron a procedimientos de apertura/cierre debido a una carga tumoral demasiado avanzada.

La selección de las muestras para cada experimento se basó en la disponibilidad de las muestras, aunque se procuró obtener una mezcla representativa de pacientes (estadio tumoral, edad, sexo biológico). Un paciente donó muestras que se utilizaron en varias modalidades experimentales. Los experimentos de secuenciación de ARN de una sola célula requirieron muestras obtenidas el mismo día, mientras que las muestras crioconservadas se pudieron utilizar para los otros experimentos.

Aislamiento de células del colon, tumores primarios del colon y metástasis peritoneales

Las muestras de colon se disecaron para eliminar las capas de grasa y músculo. Las metástasis peritoneales se disecaron para aislar el tumor del tejido circundante no afectado, es decir, el peritoneo/el epiplón. Todas las muestras se cortaron en trozos delgados de 1-2 mm antes de la digestión enzimática posterior en 5 ml de medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM) (suplementado con antibióticos), colagenasa II (0,25 mg/ml; Sigma) y desoxirribonucleasa (0,25 mg/ml; Roche). Se realizó agitación magnética a 37 °C y 450 rpm durante 30 minutos. La digestión enzimática se detuvo agregando medio IMDM suplementado con 10% de FBS y las muestras se pasaron a través de un filtro celular de 40 μM antes de contarlas.

Para el biobanco, se congelaron un máximo de 40 millones de células por vial. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 800 μL de FBS helado y se agregaron 800 μL de FBS 20% DMSO por goteo antes de transferir las células a un recipiente de congelación celular y se almacenaron durante la noche a -80 °C. Luego, las células se transfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Las células se descongelaron siguiendo el protocolo demostrado de 10X Genomics CG00039, Rev E, cuando fue necesario para el análisis de citometría de flujo o la diferenciación in vitro posterior.

Clasificación celular

Las células aisladas recientemente se clasificaron el mismo día de la cirugía para la secuenciación de una sola célula y a partir de muestras congeladas/descongeladas para el análisis de citometría de flujo y los ensayos de diferenciación in vitro. Para la clasificación, las células se incubaron con el marcador de células vivas/muertas NIR (Invitrogen) y los anticuerpos de proteínas de superficie a 4 °C durante 30 minutos, se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón FACS (PBS con 2% de FBS). Las células se clasificaron en tubos de Eppendorf de 1,5 ml que contenían FBS en un clasificador FACSAria III (BD Biosciences), con el software FACS Diva versión 9.

Secuenciación de una sola célula

Se agruparon un máximo de 15 000 ILCs clasificadas CD127+ (CD45+, CD3−, CD19−, Lin− y CD127+), células NK (CD45+, CD3−, CD19−, Lin−, CD94+/− y CD56+) y ILCs no convencionales (nc) (CD45+, CD3−, CD19−, Lin−, CD94+/−, CD56− y CD7+) en una reacción 10× y 15 000 células T (CD45+, CD3+) en otra reacción 10× siempre que fuera posible. La estrategia de clasificación está disponible en la Figura S1A. Para dos muestras (metástasis peritoneales), todas las células se agruparon en una reacción 10× debido a un pequeño número de células clasificadas. Las células se tiñeron con los anticuerpos TotalSeqC CD127, CD304 (NRP1), CD94, CD161, CD196 (CCR6), CD336 (NKp44), TCR Va7-2, CD294 (CRTH2), CD1d, CD45RA y CD117 junto con la tinción con anticuerpos de superficie para la clasificación celular. Se generó una biblioteca 5' y una biblioteca de proteínas de superficie celular utilizando el kit de células individuales Chromium Next GEM 5', el kit de células individuales Chromium Next GEM y el kit de construcción de bibliotecas (10× Genomics). Se siguieron todos los pasos según las instrucciones del fabricante. Específicamente, la guía del usuario CG000331 Rev E y F.

Las bibliotecas se secuenciaron en SciLIfeLab (NGI; Estocolmo, Suecia) utilizando un secuenciador NovaSeq 6000 y una celda de flujo SP-100 v1.5 (Illumina) con una configuración de lectura de 26 ciclos para la lectura 1, 10 ciclos para el índice i7, 10 ciclos para el índice i5 y 90 ciclos para la lectura 2.

Análisis de los datos de secuenciación de una sola célula

Se generaron matrices de conteo a partir de los archivos FASTQ utilizando CellRanger versión 7.0.1 (10× Genomics), se alinearon con GRCh38 y el análisis posterior se realizó utilizando el paquete R Seurat (versión 4.3)^[65]–^[69]. Se realizó la corrección de los efectos de lote en los donantes con Harmony v0.1.1^[70]. Para el análisis del transcriptoma, se utilizó Seurat para el control de calidad de las células, la normalización de los datos, el escalado de los datos, la reducción de la dimensionalidad (tanto lineal como no lineal), la agrupación, el análisis de expresión diferencial (DE) y la visualización de los datos. Se eliminaron las células de baja calidad según el número de genes detectables (se eliminaron las células con un número de genes 3000) y el porcentaje de genes mitocondriales para cada célula (≥8%). Los datos se normalizaron mediante una función de transformación logarítmica con un factor de escala de 10 000. Utilizamos genes variables en el análisis de componentes principales (PCA) y utilizamos los 20 principales componentes principales (PC) en la reducción de la dimensionalidad no lineal y la agrupación. Luego, las células de alta calidad se agruparon mediante el algoritmo de Louvain implementado en Seurat con una resolución de 0,6. Los grupos de células T, células NK y ILCs CD127+ se identificaron y se separaron. Para aislar las células NK y las ILCs CD127+ de las células T, las células se filtraron según su muestra 10x original (solo células NK y ILCs CD127+ y reacción mixta con células T, pero se excluyeron las reacciones solo con células T) y las células con una biblioteca VDJ productiva de las muestras de reacción mixta se excluyeron. Luego, se realizó una reclasificación con una resolución de 1,5 y se identificaron y excluyeron posteriormente las células muertas, los dobletes y las células que no eran ILCs o NKs según el porcentaje de genes mitocondriales, el número de características y los recuentos, y la alta expresión de CD3D, MS4A o MZB1, respectivamente. Finalmente, las células se agruparon nuevamente con una resolución de 0,85.

Se identificaron genes expresados diferencialmente mediante una prueba de Wilcoxon utilizando la función FindMarkers de Seurat, y se definieron como aquellos expresados en al menos el 25% del grupo y con un cambio logarítmico (log Fold change) >0,25. Para el análisis comparativo de nILC y células eNK frente a CRC en colon, solo se incluyeron los genes con un cambio logarítmico 0,5, expresados en al menos el 25% del grupo y con un valor de p