Análisis de la huella de la microbiota intestinal humana mediante un conjunto de sensores basados en ácido borónico y su aplicación en la clasificación del cáncer colorrectal.

La microbiota intestinal es un componente esencial para la salud humana, ya que influye en la regulación inmunitaria, el metabolismo y las funciones neurológicas^[1],^[2]. Como un complejo ecosistema microbiano, facilita la digestión de nutrientes y proporciona una defensa crítica contra la invasión de patógenos^[3]. Sin embargo, la alteración de la composición de la microbiota intestinal, denominada disbiosis, se ha relacionado con diversas enfermedades, incluidos los trastornos metabólicos^[4], las enfermedades inflamatorias^[5], la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)^[6] y el cáncer colorrectal (CCR)^[7],^[8]. Entre estas, el CCR es el tercer cáncer más prevalente en el mundo y constituye la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer^[9]. La detección temprana y el cribado preciso son esenciales para mejorar el pronóstico y los resultados clínicos del CCR.

La evidencia emergente indica que la microbiota intestinal contribuye a la patogénesis del CCR al modular la inflamación, inducir daño en el ADN y regular la apoptosis^[10],^[11]. Específicamente, las alteraciones en la composición microbiana pueden exacerbar la inflamación intestinal, promover la producción de carcinógenos y facilitar la tumorigénesis. Estos hallazgos resaltan el potencial de la microbiota intestinal como biomarcador diagnóstico y pronóstico para el CCR^[12],^[13]. Por lo tanto, el perfilado exhaustivo y el monitoreo dinámico de la microbiota intestinal son de gran interés, ofreciendo vías prometedoras para la prevención, el diagnóstico temprano y el tratamiento del CCR a través de terapias basadas en la microbiota y la medicina de precisión.

A pesar de su potencial clínico, la detección de la microbiota intestinal sigue siendo un desafío por dos razones principales. En primer lugar, la microbiota intestinal constituye un ecosistema intrincado y altamente diverso, lo que requiere métodos de detección robustos y fiables^[14],^[15]. Las técnicas de perfilado actuales, como la secuenciación metagenómica (por ejemplo, el análisis del ARNr 16S), se basan en plataformas de secuenciación de última generación (NGS) y requieren experiencia especializada en bioinformática^[16]. Sin embargo, estos métodos son costosos, requieren mucha mano de obra y consumen mucho tiempo, lo que limita su viabilidad para la aplicación clínica de rutina. En segundo lugar, las especies bacterianas exhiben una diversidad morfológica y estructural sustancial, lo que complica aún más la detección^[17],^[18]. Los métodos moleculares, incluido el PCR multiplex^[19], los diagnósticos basados en CRISPR (CRISPR-Dx)^[20] y el microarreglo de ADN^[21], aunque altamente específicos, también se ven limitados por los altos costos, los largos tiempos de procesamiento y la necesidad de operadores capacitados. Estas limitaciones subrayan significativamente la necesidad de una plataforma de detección rápida, de alto rendimiento y rentable para la microbiota intestinal.

Los métodos basados en la fluorescencia han ganado una atención significativa debido a su alta sensibilidad, especificidad y simplicidad operativa. Las sondas fluorescentes tradicionales a menudo emplean un conjugado fluoróforo-ligando^[22],^[23], lo que permite el reconocimiento selectivo de bacterias (Fig. 1a). Por ejemplo, la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se ha utilizado para analizar la organización espacial de la microbiota intestinal^[24]. Sin embargo, estos enfoques generalmente se basan en una estrategia de "cerradura y llave", que carece de versatilidad en entornos complejos con poblaciones bacterianas diversas. En contraste, los conjuntos de sensores químicos inspirados en el sistema olfativo de los mamíferos ofrecen una plataforma versátil para la detección de bacterias^[25]–^[28]. Estos conjuntos aprovechan las interacciones cruzadas entre varias sondas y especies bacterianas para generar patrones de respuesta distintos. Si bien se aplican ampliamente para la discriminación microbiana, los conjuntos de sensores actuales se basan principalmente en la interacción electrostática y/o la interacción hidrofóbica/hidrofílica (Fig. 1b), lo que puede verse afectado por las condiciones ambientales, lo que podría comprometer la precisión de la detección, especialmente en matrices biológicas complejas como la microbiota intestinal. Por lo tanto, el desarrollo de un conjunto de sensores robusto y fiable capaz de una detección precisa de la microbiota intestinal sigue siendo un desafío urgente.

Los derivados del ácido borónico son un candidato ideal para esta tarea debido a su capacidad única para unirse selectivamente a moléculas que contienen cis-diol, lo que constituye el principio fundamental de nuestra plataforma de detección. Esta capacidad es particularmente ventajosa para el perfilado bacteriano, ya que las superficies bacterianas son ricas en moieties de carbohidratos que incluyen cis-dioles^[29], y los sensores basados en ácido borónico proporcionan un enfoque prometedor para la identificación bacteriana^[30],^[31]. La unión se caracteriza típicamente por ser dependiente del pH, lo que se modula mediante su estructura molecular y el pH del medio^[32]. Cuando el pH circundante es mayor que el valor de pKa de los ácidos borónicos, el ácido borónico forma fácilmente ésteres cíclicos de cinco o seis miembros con cis-dioles, lo que resulta en la afinidad de unión entre el derivado del ácido borónico y las estructuras de cis-diol. El ajuste fino de las propiedades electrónicas de los derivados del ácido borónico a través de modificaciones estructurales permite la optimización de su pKa y sus propiedades de unión^[33],^[34]. Además, las variaciones estructurales en los oligosacáridos y polisacáridos de la superficie bacteriana ofrecen una oportunidad para la unión diferencial, lo que facilita la detección específica de especies. Para aprovechar esto, construimos un conjunto de sensores compuesto por sondas de ácido borónico estructuralmente diversas. Este sistema aprovecha eficazmente la variabilidad intrínseca de las glicanas de la superficie en conjunto con los atributos clave de las sondas de ácido borónico: afinidad de unión dependiente del pH y capacidad de adaptación estructural, para producir patrones de respuesta complejos y multidimensionales. Por lo tanto, la construcción de un conjunto de sensores basado en ácido borónico representa una estrategia altamente prometedora para un perfilado preciso de la microbiota intestinal en un entorno biológico complejo.

Aquí, presentamos GUT-SCAN (Gut Unique Typing via Spectral and Chemical Analysis using Boronic Acid Nanosensor), un conjunto de sensores basado en ácido borónico para el perfilado rápido y robusto de la microbiota intestinal humana. El sistema GUT-SCAN consta de seis derivados de ácido borónico diseñados (BP1–BP6) con diferentes afinidades por las estructuras de cis-diol, que exhiben respuestas de fluorescencia dependientes del pH. Al incorporar tres entornos de pH distintos (6.0, 7.4 y 8.2), generamos una plataforma de detección de 18 canales, lo que mejora significativamente la resolución de la detección. La pirena (Py), un hidrocarburo aromático policíclico con un sistema conjugado extendido, se utiliza como reportero de la señal fluorescente. Tras la exposición a bacterias derivadas del intestino, la intensidad de la fluorescencia aumenta debido a la adhesión de las sondas de ácido borónico en las superficies bacterianas, generando "huellas dactilares" de fluorescencia únicas para diferentes especies bacterianas (Fig. 1c). Este conjunto de sensores de 18 canales logra una precisión de clasificación del 100% y una identificación correcta del 98% de las muestras desconocidas. Además, el sistema GUT-SCAN propuesto detecta y diferencia con éxito la microbiota intestinal humana de las muestras de heces humanas y demuestra una discriminación robusta de los pacientes con CCR en diferentes etapas de la enfermedad. Estos hallazgos establecen a GUT-SCAN como una herramienta potente y rentable para el análisis de la microbiota intestinal, con potencial para avanzar en el diagnóstico y la detección del CCR basados en la microbiota.

Resultados

Diseño y síntesis de la biblioteca de sondas

Los ácidos borónicos pueden formar enlaces covalentes reversibles con los cis-dioles y se han utilizado ampliamente para detectar moléculas que contienen cis-diol, como los sacáridos^[29], los nucleósidos^[35], las glicoproteínas^[36] y así sucesivamente^[37],^[38]. La afinidad de unión entre los ácidos borónicos y los cis-dioles se ve fuertemente influenciada por el pKa del ácido borónico (Figura suplementaria 1). El pKa del ácido borónico se puede ajustar con precisión mediante la modificación del microentorno del átomo de boro^[39]. En este trabajo, el principio de diseño central es ajustar con precisión la densidad de electrones del centro de boro a través de los sustituyentes de fenilo para optimizar el rendimiento de la sonda. Por ejemplo, los ácidos fenilborónicos con grupos que retiran electrones poseen una mayor acidez y un valor de pKa más bajo^[40]. Por el contrario, la presencia del grupo donador de electrones puede aumentar el valor de pKa^[41]. Por lo tanto, nuestro objetivo fue regular el microentorno de los átomos de boro en los ácidos borónicos, ajustando su pKa y, por lo tanto, influyendo en su afinidad de unión con las estructuras de cis-diol. Se espera que los derivados del ácido borónico interactúen con las estructuras de cis-diol presentes en las paredes celulares bacterianas. Cada sonda está dotada de una afinidad de unión diferente y se espera que produzca una afinidad de unión distinta a los cis-dioles en la superficie de las bacterias derivadas del intestino. Debido a las características de la superficie, el tamaño y la morfología de las bacterias derivadas del intestino, lo que conduce a señales de fluorescencia diferenciales del conjunto de sensores. El empleo de algoritmos de aprendizaje automático para analizar las huellas dactilares puede lograr una clasificación eficaz de las muestras de microbiota intestinal.

El conjunto de sensores del presente estudio se basa en el uso de seis sondas diferentes, BP1–BP6, cada sonda incorpora una Py y una unidad de ácido borónico modificada (Fig. 2a). Entre ellas, la unidad de ácido borónico exhibe diferentes afinidades de unión para los grupos cis-diol, lo que se espera que produzca diferentes afinidades de unión a los cis-dioles en la superficie de las bacterias derivadas del intestino^[42]. La Py, un hidrocarburo aromático policíclico con una gran estructura conjugada, exhibe excelentes propiedades ópticas y ejerce un efecto de atracción de electrones^[43]. Las seis sondas se sintetizaron mediante rutas sintéticas sencillas con rendimientos satisfactorios (Figura suplementaria 2). Las estructuras químicas de las sondas se caracterizaron completamente mediante RMN de 1H, RMN de 13C y espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) (Figuras suplementarias 3–15).

Para comprender mejor los efectos electrónicos de estas modificaciones, se realizaron cálculos de energía electrostática sobre las estructuras moleculares. Los cálculos demostraron que la distribución de la densidad de la nube de electrones se alteró significativamente mediante las modificaciones del grupo funcional (Fig. 2b), lo que corrobora aún más la capacidad de ajustar el pKa mediante modificaciones estructurales. Además, la hidrofobicidad de las sondas también se vio influenciada por estas modificaciones, lo que podría afectar aún más su solubilidad e interacción con los entornos biológicos. Para validar experimentalmente estos efectos, detectamos los valores de pKa y ClogP de BP1–BP6 que se muestran en la Fig. 2c y la Figura suplementaria 16. Los resultados indicaron que los derivados del ácido borónico con los grupos que retiran electrones poseen una mayor acidez y un valor de pKa más bajo, mientras que la introducción del grupo donador de electrones aumenta ligeramente el valor de pKa. Además, las modificaciones estructurales también influyeron en la hidrofobicidad general de las sondas, lo que podría afectar la afinidad de unión hacia las biomoléculas objetivo. El diseño racional de estas sondas permite un control preciso sobre el pKa, lo que permite que potencialmente reconozcan las características complejas de las superficies bacterianas.

Además, las afinidades de unión entre los derivados del ácido borónico y las moléculas que contienen cis-diol también muestran dependencia del pH (Figura S1). Para validar la respuesta al pH de la unión entre las sondas BP1 y BP6 y los sacáridos que contienen cis-diol, probamos las constantes de unión entre una serie de sacáridos y BP1–BP6 a diferentes valores de pH circundante (ver detalles en la información complementaria). En el presente estudio, seleccionamos cinco monosacáridos representativos (Figura 2d) como analitos objetivo debido a su relevancia biológica, especialmente su presencia en la superficie de las células bacterianas^[44],^[45]. Como se esperaba, se encontró que las afinidades de unión (es decir, Keq) entre BP1–BP6 y diferentes monosacáridos oscilan entre 12,1 y 3985,5 M−1 (Figuras S17–34 y Tabla S1). El valor de Keq se ve afectado por el pH circundante. A niveles de pH más bajos, los ácidos borónicos están menos ionizados y las afinidades de unión tienden a disminuir. Por el contrario, a niveles de pH más altos, los ácidos borónicos están más completamente ionizados y son capaces de formar ésteres de boronato, y las constantes de unión aumentan (Figura 2e). Las afinidades de unión de los derivados del ácido borónico se pueden modular eficazmente ajustando el pKa mediante modificaciones estructurales. Además, el pH sirve como una importante variable ambiental que afina aún más estas interacciones. En conjunto, estas estrategias ofrecen información valiosa para el diseño de una matriz de sensores basada en ácido borónico para el reconocimiento de patrones de cepas bacterianas derivadas del intestino.

Respuesta de fluorescencia de la bacteria derivada del intestino

Con las sondas BP1–BP6 disponibles, se investigaron las propiedades fotofísicas de las sondas. Se observaron picos de absorción UV-vis centrados en 320–350 nm para todas las sondas BP (Figura S35), lo que indica las características de los compuestos Py^[46]. Se observó un pico a aproximadamente 400 nm en los espectros de fluorescencia de todas las sondas BP (Figura S36), que sirven como unidades de informe de la señal. Las paredes celulares bacterianas contienen cantidades de peptidoglicanos y glicopolímeros, que contienen muchas estructuras de cis-diol^[47],^[48]. Hipotetizamos que la interacción entre nuestras sondas BP y la bacteria derivada del intestino puede estar impulsada por la unión a la estructura de cis-diol de la pared celular bacteriana. Por lo tanto, probamos el efecto de las bacterias sobre la intensidad de emisión de fluorescencia de BP1–BP6. Se utilizó una bacteria probiótica derivada del intestino, Lactobacillus plantarum (L. pl) ^[49], como analito objetivo (Figura 3a). Al aumentar las concentraciones de L. pl (OD600 = 0,4–1,0) en las soluciones de las sondas, se observó un aumento gradual en la intensidad de fluorescencia en todos los casos (Figuras S37–39). El resultado se puede interpretar en términos de interacciones entre las sondas BP y la estructura de cis-diol en las bacterias, lo que lleva a la adhesión de las sondas en la superficie bacteriana y a una mayor intensidad de fluorescencia.

Para facilitar el estudio de las relaciones de unión al pH, comparamos la respuesta de fluorescencia de L. pl a varias concentraciones y diferentes valores de pH circundante (pH 6,0, 7,4 y 8,2). Como se muestra en la Figura 3b, se observó un aumento gradual en la respuesta de fluorescencia de L. pl en comparación con la concentración adicional a diferentes valores de pH. La respuesta de fluorescencia de L. pl en diferentes sondas BP muestra una intensidad de respuesta diferente a varios valores de pH. Específicamente, las sondas BP1–BP3 muestran una mayor respuesta a un pH de 6,0, mientras que la sonda BP4–BP6 muestra una mayor respuesta a un pH de 7,4, lo que se puede explicar por la modificación del átomo de boro, que se une directamente al cis-diol. Estos hallazgos proporcionan evidencia convincente de que la modificación del átomo de boro en el ácido borónico puede mediar sus interacciones con el cis-diol y que el pH sirve como una importante variable ambiental que afina aún más estas interacciones. Luego, investigamos el efecto del pH en la fisiología bacteriana; el crecimiento posterior en un medio estándar fue idéntico en todos los grupos (pH 6,0, 7,4 y 8,2), lo que confirma que la exposición a corto plazo al pH no afecta la viabilidad o el estado metabólico de las bacterias en nuestras condiciones experimentales (Figura S40).

Para validar la unión de las sondas BP en la superficie de las bacterias, se investigaron las diversas propiedades de la superficie entre L. pl mediante la prueba de la hidrofobicidad de la superficie y la imagen de fluorescencia. En consecuencia, se utilizó la adhesión bacteriana a los hidrocarburos (BATH) para evaluar los cambios en la hidrofobicidad de la superficie bacteriana (Figura 3c). Los resultados indicaron que se observó un aumento significativo en los niveles de BATH de L. pl después de la incubación con las sondas BP, lo que sugiere la adhesión exitosa de las sondas a la superficie bacteriana^[50]. El aumento de la hidrofobicidad se debe a la interacción entre el ácido borónico y los compuestos que contienen cis-diol en la superficie de la célula bacteriana, lo que facilita una mayor adhesión de la sonda. En consecuencia, se utilizan bacterias inactivadas por calor o fijadas para distinguir eficazmente la unión específica de la superficie de las sondas BP de las respuestas biológicas activas de las bacterias. Nuestros resultados revelan que las sondas BP se unen principalmente a las estructuras de cis-diol de la superficie independientemente de la viabilidad o la actividad metabólica de las bacterias (Figura S41). Para validar aún más el mecanismo de adhesión entre las bacterias y las sondas BP, L. pl se trató con tunicamicina (que degrada el glicosilo)^[51] y lisozima (que degrada la pared celular)^[52], y la intensidad de fluorescencia mostró diferentes grados de disminución después de estos tratamientos (Figura S42). Además, después del tratamiento con concavavalina A (que se une a las glicoproteínas en la pared celular)^[53] y urea (que interrumpe las interacciones hidrofóbicas)^[54], la intensidad de fluorescencia de L. pl fue más negativa que sin tratamiento (Figuras S43 y S44), lo que sugiere que las características de fluorescencia de las sondas basadas en ácido borónico dependen principalmente de la interacción con las bacterias que contienen cis-diol. Además, se empleó microscopía confocal de barrido láser (CLSM) para confirmar aún más la unión de las sondas a la superficie bacteriana. Como se muestra en la Figura 3d, las sondas BP no solo pueden teñir eficazmente L. pl, sino que también muestran diversas señales de respuesta. Se presentaron diversas respuestas de fluorescencia cuando una cepa se incubó con diferentes sondas (Figura 3e), lo que es un requisito previo para la construcción de una matriz de sensores para la discriminación de la microbiota intestinal.

Aplicación de matrices de sensores para cepas bacterianas derivadas del intestino

Debido a las diferencias en la composición de los glicanos de la superficie de varias especies bacterianas, hipotetizamos que la interacción entre las sondas BP y las bacterias varía. Desarrollamos una matriz de sondas BP que distingue las bacterias derivadas del intestino. La matriz se diseñó deliberadamente con 18 canales que constituyen una combinación de diseño ortogonal de seis sondas de ácido borónico (BP1–BP6) y tres condiciones de pH (6,0, 7,4 y 8,2) (Figura 4a y Tabla S2). Según las características de la microbiota intestinal, se seleccionaron seis bacterias representativas, que incluyen cuatro probióticos (B. longum, B. breve, L. a y L. pl), dos bacterias comensales (E. coli y E. cloacae) y cuatro bacterias patógenas (F. nucleatum, B. fragilis, S. aureus y C. k), como analitos objetivo (Tabla S3). Entre ellas, F. nucleatum, B. fragilis y E. coli están relacionadas con la tumorigénesis a través de la inflamación, el daño del ADN y la modulación inmunitaria. Las sondas BP se incubaron ortogonalmente con las bacterias derivadas del intestino en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se registró la respuesta de fluorescencia resultante de cada pocillo. Como se muestra en la Figura 4b y la Figura S45, después de la incubación con las sondas BP, las bacterias derivadas del intestino mostraron una tendencia creciente en la intensidad de fluorescencia, y se produjeron patrones de respuesta de fluorescencia. El análisis de agrupamiento jerárquico (HCA) de las respuestas de fluorescencia indicó que cada bacteria derivada del intestino exhibió grupos bien separados, lo que sugiere que las diferencias entre los patrones de las diez cepas bacterianas evaluadas son estadísticamente significativas (Figura 4b). Las respuestas de fluorescencia se analizaron mediante un algoritmo de reconocimiento de patrones supervisado, el análisis discriminante lineal (LDA). Como se muestra en la Figura 4c, las diez bacterias están bien separadas espacialmente en el espacio 2D. En particular, todas las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas formaron grupos distintos en ambos lados del diagrama LDA, sin regiones de superposición. Curiosamente, todos los probióticos pueden agruparse bien, lo que puede distinguir las otras bacterias patógenas de los extremos opuestos. Además, nuestra matriz de sondas BP también puede discriminar las bacterias derivadas del intestino a diferentes concentraciones (OD600 = 0,4 y OD600 = 0,6) (Figura S46). Todos los resultados revelaron que este sistema de detección identificó con éxito las bacterias derivadas del intestino.

Además, comparamos el rendimiento predictivo de los algoritmos de aprendizaje automático (ML) para la clasificación de la respuesta de fluorescencia. Los algoritmos de ML incluyen GPC (clasificador de procesos gaussianos), KNN (vecino más cercano K), LDA (análisis discriminante lineal), SVM (máquina de vectores de soporte), DT (árbol de decisión) y LR (regresión logística). LDA, GPC y LR exhibieron la mayor precisión del modelo (100%) (Figura 4d). Mientras tanto, el análisis de Jackknife (Figura 4e) en el conjunto de datos de entrenamiento (6 sondas × 3 valores de pH × 10 cepas bacterianas × 5 réplicas) reveló una precisión de validación cruzada entre grupos del 100%, lo que indica que el método LDA es una herramienta estadística robusta para este sistema. Además, para evaluar la reproducibilidad de la matriz de sensores BP, 42 muestras desconocidas se sometieron a una validación adicional. La evaluación de la reproducibilidad indicó que la precisión de solo un valor de pH fue del 83% (pH 6,0), 76% (pH 7,4) y 81% (pH 8,2), respectivamente (Figura 4f, Figura S47 y Datos complementarios 1). Sin embargo, al combinar los tres valores de pH, 41 muestras ciegas se predijeron con un 98% de identificación correcta de muestras desconocidas mediante la matriz de sensores de 18 canales (Figura S47 y Datos complementarios 1). El resultado mostró que nuestra matriz de sondas BP distinguió con precisión y fiabilidad las bacterias derivadas del intestino.

Estudios anteriores han demostrado que el desequilibrio entre los probióticos y las bacterias patógenas altera directamente el entorno microbiano y media en el proceso de CRC^[55],^[56]. En comparación con los controles sanos, los pacientes con CRC exhiben un aumento significativo en la abundancia de E. coli y una reducción de las poblaciones de probióticos^[57]. Entre los probióticos, la especie probiótica más utilizada es L. pl^[58]. Por lo tanto, L. pl y E. coli se seleccionaron para validar las capacidades de análisis cuantitativo de la matriz de sensores BP. Como se ilustra en la Figura 4g y las Figuras S48 y S49, los diagramas de dispersión LDA 2D mostraron una variación significativa entre las bacterias a diferentes concentraciones (OD600 que oscila entre 0,4 y 1,0). Además, los valores del Factor 1 exhibieron una relación lineal con las concentraciones de L. pl y E. coli (Figuras S48 y S49). Los resultados indican que la matriz de sensores propuesta puede cuantificar eficazmente las bacterias individuales derivadas del intestino.

Además, para simular la composición de la microbiota intestinal de pacientes con CRC, es crucial identificar con precisión las proporciones mixtas de probióticos y bacterias patógenas. En el presente estudio, L. pl y E. coli se seleccionaron como modelos de la microbiota intestinal para verificar la precisión del conjunto de sensores. Las muestras modelo se prepararon mezclando L. pl y E. coli en diferentes proporciones (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9), diseñadas para abarcar perfiles microbianos desde poblaciones afectadas por CRC hasta poblaciones sanas ^[59]. Se registró la respuesta de fluorescencia de estas nueve mezclas binarias (la concentración total de bacterias es OD600 = 0,5) (Figura suplementaria 50). El análisis LDA reveló una agrupación clara de las nueve combinaciones en el gráfico de puntuaciones (Fig. 4h). Además, utilizando mezclas ternarias de E. coli, S. aureus y L. pl en diferentes proporciones, el conjunto de sensores BP resolvió con éxito nueve grupos distintos en el espacio LDA bidimensional (Fig. 4i y Figura suplementaria 51). Estos resultados demuestran la capacidad de nuestro conjunto de sondas BP para diferenciar consorcios bacterianos con sutiles diferencias composicionales, lo que destaca su potencial para analizar la compleja microbiota intestinal en muestras clínicas.

Para verificar aún más la viabilidad del conjunto de sensores propuesto, se realizó un análisis de las bacterias derivadas del intestino en muestras reales (orina humana, muestras de suero bovino fetal, extracto intestinal y fluido intestinal simulado). Como resultado, la orina y el suero producen patrones de respuesta únicos, y el mismo tipo de bacteria se agrupa en siete grupos no superpuestos, mientras que el extracto intestinal y el fluido intestinal simulado producen patrones de respuesta únicos, y el mismo tipo de bacteria se agrupa en once grupos no superpuestos (Figura suplementaria 52). El resultado indicó que el conjunto de sensores BP tiene una excelente selectividad para las bacterias derivadas del intestino, lo que demuestra la capacidad de discriminación del conjunto de sensores en muestras reales y su potencial para aplicaciones clínicas prácticas.

Para explorar aún más el potencial diagnóstico del conjunto de sensores propuesto, se analizaron muestras de microbiota fecal de voluntarios sanos y pacientes con CRC en diferentes etapas patológicas (Fig. 5a). La identificación se centró en las comunidades microbianas totales del intestino en lugar de especies bacterianas individuales. Se recolectaron muestras de heces de pacientes con CRC en el Hospital de Cáncer de Hunan (Changsha, Hunan) con el consentimiento informado y la aprobación del Comité de Ética Científica local.

Las muestras de heces de pacientes con CRC se estratificaron en dos grupos según el sistema de estadificación de tumor, nódulo y metástasis (TNM): CRC en etapa temprana (I, II) y CRC en etapa avanzada (III, IV) ^[63]. El análisis histopatológico, el método de diagnóstico estándar de oro para la estadificación del CRC, confirmó la clasificación clínica de las muestras (Fig. 5b). Se prepararon suspensiones de microbiota según los protocolos detallados descritos en la información complementaria. Posteriormente, el conjunto de sensores evaluó las muestras de la microbiota intestinal a la misma concentración (OD600 = 0,5). La respuesta de fluorescencia de 15 muestras (información del voluntario en la Tabla suplementaria 4) pudo generar eficazmente una huella fluorescente (Figura suplementaria 53). Después de ser analizadas mediante algoritmos LDA, los voluntarios sanos, los pacientes con CRC en etapa temprana y los pacientes con CRC en etapa avanzada se separaron en un gráfico de puntuaciones bidimensional (Fig. 5c). Además, la puntuación del Factor 1 en el gráfico LDA difiere significativamente entre los voluntarios sanos, los pacientes con CRC en etapa temprana y los pacientes con CRC en etapa avanzada (Fig. 5d). Los resultados sugieren que nuestro conjunto de sondas BP puede ser eficaz para el diagnóstico clínico del CRC.

Para verificar aún más el método basado en el conjunto de sondas BP, se investigó la composición de la microbiota intestinal de voluntarios sanos y pacientes con CRC en diferentes etapas mediante la tecnología de secuenciación del ARNr 16S. Como se muestra en la Fig. 5e, tanto la riqueza bacteriana como la diversidad de la microbiota en las heces de los pacientes con CRC se redujeron drásticamente. Además, hubo cambios notables en la abundancia relativa de la microbiota entre las muestras fecales de CRC en etapa temprana y avanzada. Los resultados mostraron variaciones en la diversidad de la microbiota en las diferentes etapas del desarrollo del CRC. A nivel de filo, el grupo de CRC disminuyó significativamente la abundancia relativa de Firmicutes y aumentó la abundancia relativa de Proteobacteria (Fig. 5f), lo que indica disbiosis en los pacientes con CRC. Además, la agrupación distinta observada en los gráficos de análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) (Fig. 5g) indicó alteraciones significativas en la composición de la microbiota entre las muestras fecales de CRC en etapa temprana y avanzada, lo que nos permite identificar patrones microbianos distintos asociados con las diferentes etapas del CRC. La validación ortogonal mediante el análisis de microarrays de lectinas ^[64] con FITC-ConA confirmó diferencias significativas en el glicoma de la superficie entre las muestras (Figura suplementaria 54). Todos los resultados respaldan la hipótesis de que las variaciones específicas de la microbiota se corresponden con la progresión del CRC, lo que refuerza el potencial de la composición microbiana como biomarcador para el diagnóstico y la estadificación del CRC, y destaca tanto la consistencia como la fiabilidad de la diferenciación basada en la microbiota en la clasificación del CRC utilizando nuestro conjunto de sensores.

Nuestra investigación tuvo como objetivo crear un método portátil, de bajo costo y no invasivo para identificar a individuos sanos y pacientes con CRC en varias etapas. Para evaluar la fiabilidad clínica y la precisión diagnóstica del conjunto de sondas BP, se analizaron 147 muestras ciegas (40 CRC en etapa avanzada (Adv.), 50 CRC en etapa temprana (Ear.), 30 controles sanos (Hea.), 12 controles inflamatorios y 15 controles de adenoma; detalles en la Tabla suplementaria 5). Como resultado, el conjunto de sensores BP generó huellas fluorescentes únicas para cada muestra (Figura suplementaria 55 y Datos suplementarios 2). El análisis LDA revela que las muestras individuales son identificables en el gráfico de puntuaciones bidimensional con una superposición mínima, mientras que se observa una separación inicial entre las muestras de CRC y los controles inflamatorios/de adenoma (Fig. 5h). Aunque existieron algunas superposiciones menores entre las etapas del CRC, sus distribuciones mostraron una separación estadísticamente significativa, como se esperaba. El Factor 1, que explica más del 60% de la varianza en el modelo LDA, permitió una diferenciación eficaz entre las muestras de CRC en etapa temprana y avanzada (Fig. 5i). Para validar aún más el rendimiento diagnóstico, se realizó un análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC) ^[65] en tres modelos construidos: (Modelo 1: Hea. VS. Adv., Modelo 2: Hea. VS. Ear., y Modelo 3: Ear. VS. Adv.). Como se ilustra en la Fig. 5j, estos modelos demostraron un poder discriminatorio excepcional con valores de área bajo la curva (AUC) de 1,00, 0,99 y 0,92, respectivamente, muy por encima del umbral de significación clínica de 0,80 ^[66]. Estos resultados establecen el conjunto de sensores BP como una herramienta prometedora para la detección y estadificación temprana no invasiva del CRC.

Diseño y síntesis de la biblioteca de sondas

Los ácidos borónicos pueden formar enlaces covalentes reversibles con los cis-dioles y se han utilizado ampliamente para detectar moléculas que contienen cis-dioles, como los sacáridos ^[29], los nucleósidos ^[35], las glicoproteínas ^[36] y así sucesivamente [37, 38]. La afinidad de unión entre los ácidos borónicos y los cis-dioles se ve fuertemente influenciada por el pKa del ácido borónico (Figura suplementaria 1). El pKa del ácido borónico se puede ajustar con precisión modificando el microentorno del átomo de boro ^[39]. En este trabajo, el principio de diseño central es ajustar con precisión la densidad electrónica del centro de boro a través de sustituyentes fenilo para optimizar el rendimiento de la sonda. Por ejemplo, los ácidos fenilborónicos con grupos que retiran electrones poseen una mayor acidez y un valor de pKa más bajo ^[40]. Por el contrario, la presencia del grupo donador de electrones puede aumentar el valor de pKa ^[41]. Por lo tanto, nuestro objetivo fue regular el microentorno de los átomos de boro en los ácidos borónicos, ajustando su pKa y, por lo tanto, influyendo en su afinidad de unión con las estructuras de cis-diol. Se espera que los derivados de ácido borónico interactúen con las estructuras de cis-diol presentes en las paredes celulares bacterianas. Cada sonda está dotada de una afinidad de unión diferente y se espera que produzca una afinidad de unión distinta a los cis-dioles en la superficie de las bacterias derivadas del intestino. Debido a las características de la superficie, el tamaño y la morfología de las bacterias derivadas del intestino, lo que conduce a señales de fluorescencia diferenciales del conjunto de sensores. Al emplear algoritmos de aprendizaje automático para analizar las huellas dactilares, se puede lograr una clasificación eficaz de las muestras de la microbiota intestinal.

El conjunto de sensores del presente estudio se basa en el uso de seis sondas diferentes, BP1 a BP6, cada sonda incorpora un Py y una unidad de ácido borónico modificada (Fig. 2a). Entre ellas, la unidad de ácido borónico exhibe diferentes afinidades de unión para los grupos cis-dioles, que se espera que produzcan diferentes afinidades de unión a los cis-dioles en la superficie de las bacterias derivadas del intestino ^[42]. El Py, un hidrocarburo policíclico aromático con una gran estructura conjugada, exhibe excelentes propiedades ópticas y ejerce un efecto de atracción de electrones ^[43]. Las seis sondas se sintetizaron mediante rutas sintéticas sencillas con rendimientos satisfactorios (Figura suplementaria 2). Las estructuras químicas de las sondas se caracterizaron completamente mediante RMN de 1H, RMN de 13C y espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) (Figuras suplementarias 3 a 15).

Para comprender mejor los efectos electrónicos de estas modificaciones, se realizaron cálculos de energía electrostática en las estructuras moleculares. Los cálculos demostraron que la distribución de la densidad de la nube de electrones se alteró significativamente mediante las modificaciones del grupo funcional (Fig. 2b), lo que corrobora aún más la capacidad de ajustar el pKa mediante modificaciones estructurales. Además, la hidrofobicidad de las sondas también se vio influenciada por estas modificaciones, lo que podría afectar aún más su solubilidad e interacción con los entornos biológicos. Para validar experimentalmente estos efectos, detectamos los valores de pKa y ClogP de BP1 a BP6 que se muestran en la Fig. 2c y la Figura suplementaria 16. Los resultados indicaron que los derivados de ácido borónico con los grupos que retiran electrones poseen una mayor acidez y un valor de pKa más bajo, mientras que la introducción del grupo donador de electrones aumenta ligeramente el valor de pKa. Además, las modificaciones estructurales también influyeron en la hidrofobicidad general de las sondas, lo que podría afectar la afinidad de unión hacia las biomoléculas objetivo. El diseño racional de estas sondas permite un control preciso sobre el pKa, lo que permite que potencialmente reconozcan las características complejas de las superficies bacterianas.

Además, las afinidades de unión entre los derivados del ácido borónico y las moléculas que contienen grupos cis-diol también muestran dependencia del pH (Figura S1). Para validar la respuesta al pH de la unión entre las sondas BP1 y BP6 y los sacáridos que contienen grupos cis-diol, probamos las constantes de unión entre una serie de sacáridos y BP1–BP6 a diferentes valores de pH circundante (ver detalles en la información complementaria). En este estudio, seleccionamos cinco monosacáridos representativos (Figura 2d) como analitos objetivo debido a su relevancia biológica, especialmente su presencia en la superficie de las células bacterianas^[44],^[45]. Como se esperaba, se encontró que las afinidades de unión (es decir, Keq) entre BP1–BP6 y diferentes monosacáridos oscilan entre 12,1 y 3985,5 M−1 (Figuras S17–34 y Tabla S1). El valor de Keq se ve afectado por el pH circundante. A niveles de pH más bajos, los ácidos borónicos están menos ionizados y las afinidades de unión tienden a disminuir. Por el contrario, a niveles de pH más altos, los ácidos borónicos están más completamente ionizados y son capaces de formar ésteres de boronato, y las constantes de unión aumentan (Figura 2e). Las afinidades de unión de los derivados del ácido borónico se pueden modular eficazmente ajustando el pKa mediante modificaciones estructurales. Además, el pH sirve como una variable ambiental importante que afina aún más estas interacciones. En conjunto, estas estrategias ofrecen información valiosa para el diseño de un conjunto de sensores basado en ácido borónico para el reconocimiento de patrones de cepas bacterianas derivadas del intestino.

Respuesta de fluorescencia de bacterias derivadas del intestino

Con las sondas BP1–BP6 disponibles, se investigaron las propiedades fotofísicas de las sondas. Se observaron picos de absorción UV-vis centrados en 320–350 nm para todas las sondas BP (Figura S35), lo que indica las características de los compuestos Py^[46]. Se observó un pico a aproximadamente 400 nm en los espectros de fluorescencia de todas las sondas BP (Figura S36), que sirven como unidades de informe de la señal. Las paredes celulares bacterianas contienen cantidades de peptidoglicanos y glicopolímeros, que contienen muchas estructuras de cis-diol^[47],^[48]. Hipotetizamos que la interacción entre nuestras sondas BP y las bacterias derivadas del intestino puede estar impulsada por la unión a la estructura de cis-diol de la pared celular bacteriana. Por lo tanto, probamos el efecto de las bacterias en la intensidad de emisión de fluorescencia de BP1–BP6. Se utilizó una bacteria probiótica típica derivada del intestino, Lactobacillus plantarum (L. pl) ^[49], como analito objetivo (Figura 3a). Al aumentar las concentraciones de L. pl (OD600 = 0,4–1,0) en las soluciones de las sondas, se observó un aumento gradual en la intensidad de fluorescencia en todos los casos (Figuras S37–39). El resultado se puede interpretar en términos de interacciones entre las sondas BP y la estructura de cis-diol en las bacterias, lo que lleva a la adhesión de las sondas a la superficie bacteriana y al aumento de la intensidad de fluorescencia.

Para facilitar el estudio de las relaciones de unión al pH, comparamos la respuesta de fluorescencia de L. pl a varias concentraciones y diferentes valores de pH circundante (pH 6,0, 7,4 y 8,2). Como se muestra en la Figura 3b, se observó un aumento gradual en la respuesta de fluorescencia de L. pl en comparación con la concentración adicional a diferentes valores de pH. La respuesta de fluorescencia de L. pl en diferentes sondas BP muestra una intensidad de respuesta diferente a varios valores de pH. Específicamente, las sondas BP1–BP3 muestran una mayor respuesta a un pH de 6,0, mientras que la sonda BP4–BP6 muestra una mayor respuesta a un pH de 7,4, lo que se puede explicar por la modificación del átomo de boro, que se une directamente al grupo cis-diol. Estos hallazgos proporcionan evidencia convincente de que la modificación del átomo de boro en el ácido borónico puede mediar sus interacciones con el cis-diol y que el pH sirve como una variable ambiental importante que afina aún más estas interacciones. Luego, investigamos el efecto del pH en la fisiología bacteriana; el crecimiento posterior en un medio estándar fue idéntico en todos los grupos (pH 6,0, 7,4 y 8,2), lo que confirma que la exposición a corto plazo al pH no afecta la viabilidad o el estado metabólico de las bacterias en nuestras condiciones experimentales (Figura S40).

Para validar la unión de las sondas BP a la superficie de las bacterias, se investigaron las diversas propiedades de la superficie entre L. pl mediante la prueba de la hidrofobicidad de la superficie y la imagen de fluorescencia. En consecuencia, se utilizó la adhesión bacteriana a los hidrocarburos (BATH) para evaluar los cambios en la hidrofobicidad de la superficie bacteriana (Figura 3c). Los resultados indicaron que se observó un aumento significativo en los niveles de BATH de L. pl después de la incubación con las sondas BP, lo que sugiere la adhesión exitosa de las sondas a la superficie bacteriana^[50]. El aumento de la hidrofobicidad se debe a la interacción entre el ácido borónico y los compuestos que contienen cis-diol en la superficie de la célula bacteriana, lo que facilita una adhesión más fuerte de la sonda. En consecuencia, se utilizan bacterias inactivadas por calor o fijadas para distinguir eficazmente la unión específica de la superficie de las sondas BP de las respuestas biológicas activas de las bacterias. Nuestros resultados revelan que las sondas BP se unen principalmente a las estructuras de cis-diol de la superficie independientemente de la viabilidad o la actividad metabólica de las bacterias (Figura S41). Para validar aún más el mecanismo de adhesión entre las bacterias y las sondas BP, L. pl se trató con tunicamicina (que degrada el glicosilo)^[51] y lisozima (que degrada la pared celular)^[52], y la intensidad de fluorescencia mostró diferentes grados de disminución después de estos tratamientos (Figura S42). Además, después del tratamiento con concavavalina A (que se une a las glicoproteínas en la pared celular)^[53] y urea (que interrumpe las interacciones hidrofóbicas)^[54], la intensidad de fluorescencia de L. pl fue más negativa que sin tratamiento (Figuras S43 y S44), lo que sugiere que las características de fluorescencia de las sondas basadas en ácido borónico dependen principalmente de la interacción con las bacterias que contienen cis-diol. Además, se empleó microscopía confocal de barrido láser (CLSM) para confirmar aún más la unión de las sondas a la superficie bacteriana. Como se muestra en la Figura 3d, las sondas BP no solo pueden teñir eficazmente L. pl, sino que también muestran diversas señales de respuesta. Se presentaron diversas respuestas de fluorescencia cuando una cepa se incubó con diferentes sondas (Figura 3e), lo cual es un requisito previo para la construcción de un conjunto de sensores para la discriminación de la microbiota intestinal.

Aplicación de conjuntos de sensores para cepas bacterianas derivadas del intestino

Debido a las diferencias en la composición de los glicanos de la superficie de varias especies bacterianas, hipotetizamos que la interacción entre las sondas BP y las bacterias varía. Desarrollamos un conjunto de sondas BP que distingue las bacterias derivadas del intestino. El conjunto se diseñó deliberadamente con 18 canales que constituyen una combinación de diseño ortogonal de seis sondas de ácido borónico (BP1–BP6) y tres condiciones de pH (6,0, 7,4 y 8,2) (Figura 4a y Tabla S2). Según las características de la microbiota intestinal, se seleccionaron seis bacterias representativas, que incluyen cuatro probióticos (B. longum, B. breve, L. a y L. pl), dos bacterias comensales (E. coli y E. cloacae) y cuatro bacterias patógenas (F. nucleatum, B. fragilis, S. aureus y C. k), como analitos objetivo (Tabla S3). Entre ellas, F. nucleatum, B. fragilis y E. coli están relacionadas con la tumorigénesis a través de la inflamación, el daño del ADN y la modulación inmunitaria. Las sondas BP se incubaron ortogonalmente con las bacterias derivadas del intestino en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se registró la respuesta de fluorescencia resultante de cada pocillo. Como se muestra en la Figura 4b y la Figura S45, después de la incubación con las sondas BP, las bacterias derivadas del intestino mostraron una tendencia creciente en la intensidad de fluorescencia, y se produjeron patrones de respuesta de fluorescencia. El análisis de agrupamiento jerárquico (HCA) de las respuestas de fluorescencia indicó que cada bacteria derivada del intestino exhibió grupos bien separados, lo que sugiere que las diferencias entre los patrones de las diez cepas bacterianas evaluadas son estadísticamente significativas (Figura 4b). Las respuestas de fluorescencia se analizaron mediante un algoritmo de reconocimiento de patrones supervisado, el análisis discriminante lineal (LDA). Como se muestra en la Figura 4c, las diez bacterias están bien separadas espacialmente en el espacio 2D. En particular, todas las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas formaron grupos distintos en ambos lados del diagrama LDA, sin regiones de superposición. Curiosamente, todos los probióticos pueden agruparse bien, lo que puede distinguir las otras bacterias patógenas de los extremos opuestos. Además, nuestro conjunto de sondas BP también puede discriminar las bacterias derivadas del intestino a diferentes concentraciones (OD600 = 0,4 y OD600 = 0,6) (Figura S46). Todos los resultados revelaron que este sistema de detección identificó con éxito las bacterias derivadas del intestino.

Además, comparamos el rendimiento predictivo de los algoritmos de aprendizaje automático (ML) para la clasificación de la respuesta de fluorescencia. Los algoritmos de ML incluyen GPC (clasificador de procesos gaussianos), KNN (vecino más cercano K), LDA (análisis discriminante lineal), SVM (máquina de vectores de soporte), DT (árbol de decisión) y LR (regresión logística). LDA, GPC y LR exhibieron la mayor precisión del modelo (100%) (Figura 4d). Mientras tanto, el análisis de Jackknife (Figura 4e) en el conjunto de datos de entrenamiento (6 sondas × 3 valores de pH × 10 cepas bacterianas × 5 réplicas) reveló una precisión de validación cruzada entre grupos del 100%, lo que indica que el método LDA es una herramienta estadística robusta para este sistema. Además, para evaluar la reproducibilidad del conjunto de sensores BP, 42 muestras desconocidas se sometieron a una validación adicional. La evaluación de la reproducibilidad indicó que la precisión de solo un valor de pH fue del 83% (pH 6,0), 76% (pH 7,4) y 81% (pH 8,2), respectivamente (Figura 4f, Figura S47 y Datos complementarios 1). Sin embargo, al combinar los tres valores de pH, 41 muestras ciegas se predijeron con un 98% de identificación correcta de muestras desconocidas mediante el conjunto de sensores de 18 canales (Figura S47 y Datos complementarios 1). El resultado mostró que nuestro conjunto de sondas BP distinguió con precisión y fiabilidad las bacterias derivadas del intestino.

Estudios anteriores han demostrado que el desequilibrio entre los probióticos y las bacterias patógenas altera directamente el entorno microbiano y media en el proceso de CRC^[55],^[56]. En comparación con los controles sanos, los pacientes con CRC exhiben una abundancia significativamente mayor de E. coli y una población reducida de probióticos^[57]. Entre los probióticos, la especie probiótica más utilizada es L. pl^[58]. Por lo tanto, L. pl y E. coli se seleccionaron para validar las capacidades de análisis cuantitativo del conjunto de sensores BP. Como se ilustra en la Figura 4g y las Figuras S48 y S49, los diagramas de dispersión LDA 2D mostraron una variación significativa entre las bacterias a diferentes concentraciones (OD600 que oscila entre 0,4 y 1,0). Además, los valores del Factor 1 exhibieron una relación lineal con las concentraciones de L. pl y E. coli (Figuras S48 y S49). Los resultados indican que el conjunto de sensores propuesto puede cuantificar eficazmente las bacterias individuales derivadas del intestino.

Además, para simular la composición de la microbiota intestinal de pacientes con CRC, es fundamental identificar con precisión las proporciones de la mezcla de probióticos y bacterias patógenas. En el presente estudio, L. pl y E. coli se seleccionaron como modelos de la microbiota intestinal para verificar la precisión del conjunto de sensores. Las muestras modelo se prepararon mezclando L. pl y E. coli en diferentes proporciones (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9), diseñadas para abarcar perfiles microbianos desde poblaciones afectadas por CRC hasta poblaciones sanas ^[59]. Se registró la respuesta de fluorescencia de estas nueve mezclas binarias (la concentración total de bacterias es OD600 = 0,5) (Figura suplementaria 50). El análisis LDA reveló una clara agrupación de las nueve combinaciones en el gráfico de puntuaciones (Figura 4h). Además, utilizando mezclas ternarias de E. coli, S. aureus y L. pl en diferentes proporciones, el conjunto de sensores BP resolvió con éxito nueve grupos distintos en el espacio LDA bidimensional (Figura 4i y Figura suplementaria 51). Estos resultados demuestran la capacidad de nuestro conjunto de sondas BP para diferenciar consorcios bacterianos con sutiles diferencias composicionales, lo que destaca su potencial para analizar la compleja microbiota intestinal en muestras clínicas.

Para verificar aún más la viabilidad del conjunto de sensores propuesto, se realizó un análisis de las bacterias derivadas del intestino en muestras reales (orina humana, muestras de suero bovino fetal, extracto intestinal y fluido intestinal simulado). Como resultado, la orina y el suero producen patrones de respuesta únicos, y el mismo tipo de bacteria se agrupa en siete grupos no superpuestos, mientras que el extracto intestinal y el fluido intestinal simulado producen patrones de respuesta únicos, y el mismo tipo de bacteria se agrupa en once grupos no superpuestos (Figura suplementaria 52). El resultado indicó que el conjunto de sensores BP tiene una excelente selectividad para las bacterias derivadas del intestino, lo que demuestra la capacidad de discriminación del conjunto de sensores en muestras reales y su potencial para aplicaciones clínicas prácticas.

Aplicación para el diagnóstico de CRC

Estudios recientes muestran que los pacientes con CRC tienen una composición microbiana única en comparación con los individuos sanos, con variaciones significativas en la diversidad de la microbiota en diferentes etapas de la progresión de la enfermedad ^[60], ^[61]. Evaluar las diferencias en la microbiota intestinal presenta una estrategia prometedora para el diagnóstico y la estadificación del CRC ^[62]. Por lo tanto, para explorar el potencial diagnóstico del conjunto de sensores propuesto, se analizaron muestras de microbiota fecal de voluntarios sanos y pacientes con CRC en diferentes etapas patológicas (Figura 5a). La identificación se centró en las comunidades microbianas totales del intestino en lugar de en especies bacterianas individuales. Se recolectaron muestras de heces de pacientes con CRC en el Hospital Oncológico de Hunan (Changsha, Hunan) con el consentimiento informado y la aprobación del Comité de Ética Científica local.

Las muestras de heces de pacientes con CRC se estratificaron en dos grupos según el sistema de estadificación de tumor, nódulo y metástasis (TNM): CRC en etapa temprana (I, II) y CRC en etapa avanzada (III, IV) ^[63]. El análisis histopatológico, el método de diagnóstico estándar de oro para la estadificación del CRC, confirmó la clasificación clínica de las muestras (Figura 5b). Se prepararon suspensiones de microbiota según los protocolos detallados descritos en la información complementaria. Posteriormente, el conjunto de sensores evaluó las muestras de la microbiota intestinal a la misma concentración (OD600 = 0,5). La respuesta de fluorescencia de 15 muestras (información del voluntario en la Tabla suplementaria 4) pudo generar eficazmente una huella fluorescente (Figura suplementaria 53). Después de ser analizadas mediante algoritmos LDA, los voluntarios sanos, los pacientes con CRC en etapa temprana y los pacientes con CRC en etapa avanzada se separaron en un gráfico de puntuaciones bidimensional (Figura 5c). Además, la puntuación del Factor 1 en el gráfico LDA difiere significativamente entre los voluntarios sanos, los pacientes con CRC en etapa temprana y los pacientes con CRC en etapa avanzada (Figura 5d). Los resultados sugieren que nuestro conjunto de sondas BP puede ser eficaz para el diagnóstico clínico del CRC.

Para verificar aún más el método basado en las sondas BP, se investigó la composición de la microbiota intestinal de voluntarios sanos y pacientes con CRC en diferentes etapas mediante la tecnología de secuenciación del ARNr 16S. Como se muestra en la Figura 5e, tanto la riqueza bacteriana como la diversidad de la microbiota en las heces de los pacientes con CRC se redujeron drásticamente. Además, hubo cambios notables en la abundancia relativa de la microbiota entre las muestras de heces de CRC en etapa temprana y avanzada. Los resultados mostraron variaciones en la diversidad de la microbiota en las diferentes etapas del desarrollo del CRC. A nivel de filo, el grupo de CRC disminuyó significativamente la abundancia relativa de Firmicutes y aumentó la abundancia relativa de Proteobacteria (Figura 5f), lo que indica disbiosis en los pacientes con CRC. Además, la agrupación distinta observada en los gráficos de análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) (Figura 5g) indicó alteraciones significativas en la composición de la microbiota entre las muestras de heces de CRC en etapa temprana y avanzada, lo que nos permite identificar patrones microbianos distintos asociados con las diferentes etapas del CRC. La validación ortogonal mediante el análisis de microarrays de lectinas ^[64] con FITC-ConA confirmó diferencias significativas en el glicoma de la superficie entre las muestras (Figura suplementaria 54). Todos los resultados respaldan la hipótesis de que las variaciones específicas de la microbiota corresponden a la progresión del CRC, lo que refuerza el potencial de la composición microbiana como biomarcador para el diagnóstico y la estadificación del CRC, y destaca tanto la consistencia como la fiabilidad de la diferenciación basada en la microbiota en la clasificación del CRC utilizando nuestro conjunto de sensores.

Nuestra investigación tuvo como objetivo crear un método portátil, de bajo costo y no invasivo para identificar a individuos sanos y pacientes con CRC en varias etapas. Para evaluar la fiabilidad clínica y la precisión diagnóstica del conjunto de sondas BP, se analizaron 147 muestras ciegas (40 CRC en etapa avanzada (Adv.), 50 CRC en etapa temprana (Ear.), 30 controles sanos (Hea.), 12 controles inflamatorios y 15 controles de adenoma; detalles en la Tabla suplementaria 5). Como resultado, el conjunto de sensores BP generó huellas fluorescentes únicas para cada muestra (Figura suplementaria 55 y Datos suplementarios 2). El análisis LDA revela que las muestras individuales son identificables en el gráfico de puntuaciones bidimensional con una superposición mínima, mientras que se observa una separación inicial entre las muestras de CRC y los controles inflamatorios/de adenoma (Figura 5h). Aunque existieron algunas superposiciones menores entre las etapas del CRC, sus distribuciones mostraron una separación estadísticamente significativa, como se esperaba. El Factor 1, que explica más del 60% de la varianza en el modelo LDA, permitió una diferenciación eficaz entre las muestras de CRC en etapa temprana y avanzada (Figura 5i). Para validar aún más el rendimiento diagnóstico, se realizó un análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC) ^[65] en tres modelos construidos: (Modelo 1: Hea. VS. Adv., Modelo 2: Hea. VS. Ear., y Modelo 3: Ear. VS. Adv.). Como se ilustra en la Figura 5j, estos modelos demostraron un poder discriminatorio excepcional con valores de área bajo la curva (AUC) de 1,00, 0,99 y 0,92, respectivamente, muy por encima del umbral de significación clínica de 0,80 ^[66]. Estos resultados establecen el conjunto de sensores BP como una herramienta prometedora para la detección y estadificación temprana no invasiva del CRC.

Discusión

En este estudio, desarrollamos GUT-SCAN, un conjunto de sensores basado en ácido borónico que permite un perfilado rápido y rentable de la microbiota intestinal y la clasificación del cáncer colorrectal (CRC). Al aprovechar las interacciones de ácido borónico-cis-diol sensibles al pH, generamos con éxito "huellas" de fluorescencia que diferencian probióticos, comensales y bacterias patógenas con una precisión del 100% y clasifican mezclas bacterianas desconocidas con una precisión del 98%. Lo que es más importante, GUT-SCAN identifica las firmas microbianas asociadas al CRC y distingue las diferentes etapas del CRC, lo que demuestra su potencial como herramienta de diagnóstico no invasiva. Estos resultados destacan las ventajas de la detección basada en la fluorescencia codificada químicamente como alternativa a las técnicas actuales de perfilado de la microbiota dependientes del secuenciamiento.

Los métodos de detección basados en la fluorescencia se han utilizado ampliamente para la clasificación bacteriana debido a su alta sensibilidad y facilidad de implementación. Entre ellos, las sondas moleculares fluorescentes, como la bodipirrometeno (BODIPY) ^[67], los colorantes cianina ^[68] y los puntos cuánticos (QDs) ^[69], se han empleado para el etiquetado y la imagen bacteriana ^[69], ^[70]. Si bien estos enfoques ofrecen señales de fluorescencia brillantes y propiedades espectrales ajustables, sus mecanismos de detección a menudo se basan en interacciones electrostáticas, permeabilidad de la membrana o captación metabólica, lo que puede verse influenciado por la fisiología bacteriana, las condiciones de crecimiento y la heterogeneidad de la muestra. Por ejemplo, las sondas basadas en BODIPY tiñen selectivamente las bacterias Gram-negativas debido a las diferencias en la estructura de la membrana celular, pero tienen dificultades para distinguir las especies bacterianas dentro de la misma clasificación Gram ^[67]. De manera similar, los QDs ofrecen una fluorescencia fuerte y ajustable, pero requieren la funcionalización con ligandos específicos de bacterias, lo que aumenta la complejidad y el costo ^[71]. En comparación con estas sondas fluorescentes convencionales, la estrategia de detección basada en ácido borónico de GUT-SCAN proporciona un enfoque más versátil y selectivo químicamente. En lugar de depender únicamente de interacciones basadas en la carga o hidrofóbicas, los derivados del ácido borónico se unen a los carbohidratos que contienen cis-diol en la superficie bacteriana, lo que permite la detección específica de especies sin la necesidad de modificación genética o captación metabólica. Además, nuestro conjunto de sensores sensible al pH introduce una capa adicional de selectividad, lo que mejora significativamente la precisión de la clasificación bacteriana. Si bien la mayoría de los métodos de detección basados en la fluorescencia proporcionan señales binarias de "encendido-apagado", GUT-SCAN genera patrones de fluorescencia distintos y multidimensionales en diferentes entornos de pH, lo que permite la detección simultánea de múltiples especies bacterianas en muestras de microbiota complejas.

El secuenciamiento de última generación (NGS), incluido el secuenciamiento del ARNr 16S y la metagenómica de escopeta, sigue siendo el estándar de oro para el perfilado de la microbiota. Estos métodos proporcionan una alta resolución taxonómica y permiten la identificación de bacterias cultivables y no cultivables. Sin embargo, sufren de altos costos, largos tiempos de procesamiento y la necesidad de experiencia en bioinformática. Además, los enfoques de secuenciamiento analizan típicamente la composición microbiana estática, sin capturar el estado funcional y bioquímico de las bacterias en tiempo real. En contraste, GUT-SCAN evalúa directamente la química de la superficie bacteriana, proporcionando una lectura fenotípica instantánea que refleja los estados metabólicos y las diferencias estructurales de los microorganismos, que a menudo son críticos en la patogénesis de la enfermedad. El secuenciamiento metagenómico también requiere un manejo cuidadoso de las muestras, la extracción de ADN y la preparación de bibliotecas, todo lo cual introduce sesgos y puede provocar la pérdida de poblaciones bacterianas raras. Por otro lado, GUT-SCAN es una plataforma sin etiquetado y sin amplificación que preserva el estado nativo de la microbiota y permite un análisis rápido y de alto rendimiento. Esto lo hace particularmente atractivo para aplicaciones clínicas, donde la velocidad y la facilidad de uso son primordiales. A diferencia de los métodos basados en el secuenciamiento, que a menudo requieren el procesamiento por lotes de muestras, GUT-SCAN proporciona respuestas de fluorescencia casi instantáneas, lo que lo hace adecuado para el diagnóstico en tiempo real y las aplicaciones de atención médica.

Uno de los hallazgos más significativos de este estudio es la capacidad de GUT-SCAN para distinguir las firmas microbianas asociadas al CRC y clasificar las diferentes etapas del CRC. La composición de la microbiota intestinal se reconoce cada vez más como un biomarcador del riesgo de CRC, y se ha relacionado con la tumorigenesis a través de la inflamación, el daño al ADN y la modulación inmunitaria, con taxones bacterianos específicos como F. nucleatum, B. fragilis y E. coli. Si bien los estudios anteriores han empleado el secuenciamiento del ARNr 16S y la qPCR para evaluar las poblaciones bacterianas asociadas al CRC, estos métodos requieren flujos de trabajo largos y equipos especializados, lo que limita su potencial para el cribado a gran escala.

En comparación con las técnicas convencionales de detección de CRC, como la colonoscopia y las pruebas de sangre oculta en heces (TSOH), GUT-SCAN ofrece una alternativa rápida y no invasiva. La colonoscopia, aunque muy eficaz, es invasiva, costosa y a menudo se asocia con bajas tasas de cumplimiento. Las TSOH, por otro lado, sufren de baja sensibilidad, especialmente para el CRC en etapas tempranas. Al detectar los cambios microbianos asociados con el CRC en muestras de heces, GUT-SCAN tiene el potencial de servir como un sistema de alerta temprana para el CRC, lo que permite realizar pruebas de detección basadas en la microbiota a nivel poblacional con una carga mínima para el paciente.

A pesar de su buen rendimiento, GUT-SCAN tiene varias limitaciones que justifican una mayor investigación. Uno de los desafíos es la resolución taxonómica; si bien la matriz de sensores clasifica eficazmente las bacterias a nivel de género, su capacidad para diferenciar cepas estrechamente relacionadas sigue siendo limitada. Ampliar la biblioteca de sondas de ácido borónico e incorporar condiciones de pH adicionales podría mejorar la discriminación a nivel de cepa. Otro factor a considerar es la variabilidad de las muestras, ya que la composición de la microbiota intestinal se ve influenciada por la dieta, los medicamentos y la genética del huésped. Los estudios futuros deberían incluir cohortes clínicas más amplias y diversas para validar la robustez de GUT-SCAN en diferentes poblaciones. Otro aspecto es que no se recopiló información detallada sobre la dieta individual. Sin embargo, todos los voluntarios fueron reclutados de una sola región geográfica (provincia de Hunan, China), lo que puede minimizar la variabilidad significativa derivada de las diferencias dietéticas regionales. No obstante, los hábitos alimenticios individuales siguen siendo un posible factor de confusión. Los estudios prospectivos futuros deberían recopilar sistemáticamente estos datos para un análisis más completo.

La precisión cuantitativa es otra área que requiere mejoras. Si bien GUT-SCAN puede evaluar semicuantitativamente la abundancia bacteriana, el refinamiento de la correlación entre la señal y las bacterias mejorará la estimación absoluta de la carga microbiana. La integración de algoritmos de aprendizaje automático para el análisis de patrones de fluorescencia podría mejorar aún más la precisión de la clasificación y permitir el modelado predictivo de enfermedades relacionadas con la microbiota. Estos hallazgos ofrecen vías para aprovechar el conocimiento de la microbiota intestinal en aplicaciones clínicas, incluida el análisis de la microbiota como biomarcador para la detección, el pronóstico o la predicción, y la modulación de la microbiota para prevenir el cáncer, mejorar las terapias y mitigar los efectos secundarios del tratamiento. Además, la miniaturización de la matriz de sensores para aplicaciones portátiles o de atención en el punto de atención será un paso clave hacia la traslación clínica. Más allá de la detección del CRC, GUT-SCAN tiene amplias aplicaciones potenciales en la investigación del microbioma, el diagnóstico de enfermedades infecciosas y la medicina personalizada. La capacidad de caracterizar rápidamente la microbiota podría ayudar a diagnosticar la enfermedad inflamatoria intestinal, los trastornos metabólicos y las enfermedades neurodegenerativas, en las que cada vez se relaciona más la disbiosis intestinal. Además, el monitoreo de la microbiota en tiempo real podría utilizarse para evaluar las respuestas al tratamiento en las terapias probióticas, los antibióticos y las intervenciones dietéticas.

Además de su potencial diagnóstico, el mecanismo de detección basado en el ácido borónico podría adaptarse para los biosensores bacterianos diseñados, el análisis de la microbiota ambiental y las aplicaciones de la biología sintética. Al diseñar derivados de ácido borónico con valores de pKa personalizados, es posible que se puedan desarrollar sensores bacterianos altamente específicos para terapias dirigidas y enfoques de medicina de precisión.

Este estudio establece GUT-SCAN como una herramienta rápida, rentable y clínicamente relevante para el diagnóstico basado en la microbiota y la detección del CRC. Al integrar las interacciones de ácido borónico sensible al pH con la detección de fluorescencia, GUT-SCAN supera a las sondas bacterianas tradicionales basadas en la fluorescencia y a los métodos basados en la secuenciación en términos de velocidad, accesibilidad y clasificación en tiempo real. La detección exitosa de los cambios microbianos asociados con el CRC subraya aún más su potencial como una herramienta de detección del cáncer no invasiva. Si bien persisten los desafíos, los avances continuos en el diseño de sensores, el análisis impulsado por la IA y la validación clínica allanarán el camino para su traslación a aplicaciones de diagnóstico de rutina.

Métodos

Materiales

El ácido 4-boronobenzoico, el ácido 1-hidroxi-1,3-dihidrobenzo[c]-^[1,2]oxaborol-6-carboxílico, el ácido 4-borono-3-metoxibenzoico, el ácido 4-borono-3-fluorobenzoico, el ácido 4-borono-3-clorobenzoico y el ácido 3-borono-5-fluorobenzoico se compraron a proveedores de laboratorio comerciales (Bide Pharm.). El pirren-1-ilmetanol se compró a proveedores de laboratorio comerciales (Energy Chemical). Todos los productos químicos y reactivos se compraron comercialmente con grado analítico, a menos que se indique lo contrario. Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli) y Citrobacter koseri (C. k) se obtuvieron del Centro General de Cultivos Microbiológicos de China. Lactobacillus acidophilus (L. a) se compró al Centro de Cultivos Microbiológicos de Guangdong. Enterobacter cloacae (E. cloacae) y Lactobacillus plantarum (L. pl) se obtuvieron del Laboratorio Central de la Universidad Agrícola de Hunan (Changsha, China). Todas las soluciones se prepararon con agua ultrapura (18,25 MΩ·cm−1) del sistema Millipore.

Caracterización de los materiales

Los espectros de RMN de 1H y 13C se registraron en un espectrómetro Bruker Avance-500 (Bruker, Suiza) en DMSO-d6 con TMS como estándar interno. Los espectros de absorción y fluorescencia se adquirieron en un espectrofotómetro UV-vis 2600 (Shimadzu, Japón) y un espectrofotómetro F-7100 (Hitachi, Japón), respectivamente. Todos los experimentos de imagen se realizaron en un microscopio confocal TCS-SP8 (Leica, Alemania). La intensidad de fluorescencia de la matriz de sensores BP para la respuesta bacteriana se registró en un lector de microplacas Biotek (SynergyMX, EE. UU.). La espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) se registró en un espectrómetro de masas TOF MS ES+, y se utilizó acetonitrilo para disolver la muestra.

Determinación de las constantes de asociación aparentes de ARS-ácido borónico (KARS)

Para determinar espectroscópicamente la constante de asociación de ARS con un ácido borónico^[72],^[73], se tituló cada ácido borónico en soluciones de concentración constante de ARS. Se preparó una solución madre de ARS en agua desionizada (9,0 × 10−5 M), junto con soluciones madre de tampones de fosfato de sodio (PBS, 0,1 M, pH 6,0, 7,4 o 8,2). Se prepararon soluciones madre en DMSO para cada ácido borónico (2,0 × 10−2 M). A partir de estas soluciones, se prepararon dos soluciones separadas en agua desionizada, una que contenía un ácido borónico (2,0 × 10−3 M), ARS (9,0 × 10−6 M) y PBS (0,1 M), y la segunda que contenía lo mismo. Estas soluciones se utilizaron para realizar titulaciones de concentración constante de ARS y concentración decreciente de ácido borónico. Se preparó un estándar de ARS no fluorescente como una solución de ARS y PBS en ausencia de ácido borónico y se utilizó como blanco de fluorescencia. Las mediciones de fluorescencia se adquirieron con el espectrofotómetro F-7100, con las muestras excitadas a 468 nm y la emisión medida a 570 nm. Una presentación completa de las concentraciones de los componentes para cada medición se puede encontrar en la Tabla S1.

Determinación de las constantes de asociación aparentes de diol-ácido borónico (Keq)

Para determinar la constante de asociación diol-ácido borónico de cada diol y ácido borónico^[72], se prepararon tres soluciones a partir de las soluciones madre mencionadas anteriormente. La primera solución contenía el ácido borónico (2,0 × 10−3 M), ARS (9,0 × 10−6 M) y PBS (0,1 M), mientras que la segunda solución también contenía el diol en cuestión. La concentración del diol variaba con cada combinación de ácido borónico-diol y a cada pH. Se preparó una tercera solución estándar de ARS que contenía solo ARS (9,0 × 10−6 M) y PBS (0,1 M). Luego, la primera solución se tituló en la segunda para preparar soluciones de concentración constante de ARS y ácido borónico, pero con una concentración variable de diol. La solución de ARS solamente se utilizó como blanco de fluorescencia. Las mediciones de fluorescencia se adquirieron con el espectrofotómetro F-7100, con las muestras excitadas a 468 nm y la emisión medida a 570 nm.

Cepas bacterianas y cultivo

Medio de caldo Luria-Bertani

Los recipientes y el material de vidrio se esterilizaron a 121 °C durante 30 min. Aproximadamente 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de triptona y 0,25 g de extracto de levadura se disolvieron en 50 mL de agua ultrapura para preparar el medio de cultivo Luria-Bertani (pH 7,0). Medio de cultivo MRS: 1 g de peptonas, 0,5 g de extracto de carne, 0,1 mL de polisorbato 80, 0,2 g de fosfato dipotásico, 0,4 g de extracto de levadura, 0,02 g de sulfato de magnesio, 0,2 g de citrato de triamonio, 2 g de glucosa, 0,005 g de sulfato de manganeso y 0,5 g de acetato de sodio se disolvieron en 100 mL de agua ultrapura para preparar el medio de cultivo MRS (pH 7,0).

E. coli, S. aureus, C. k y E. cloacae se cultivaron en medio LB a 37 °C con agitación continua durante 12 h. L. pl se cultivó en medio MRS a 37 °C con agitación continua durante 48 h. L. a se cultivó en medio MRS a 37 °C y se incubó durante 48 h en reposo.

Respuesta de fluorescencia a las bacterias

Medición de la fluorescencia

Una solución de DMSO de BP (1 mM) se diluyó en agua desionizada para obtener una concentración final de 5 μM, y los respectivos espectros UV-vis se registraron utilizando un espectrofotómetro UV-vis 2600 con una longitud de onda de 280-360 nm, y los espectros de fluorescencia de las soluciones resultantes se registraron en un espectrofotómetro de fluorescencia F-7100 con excitación a 347 nm.

Respuesta bacteriana

El L. pl cultivado se centrifugó a 2170×g durante 5 min, y luego se eliminó el sobrenadante, y los gránulos bacterianos obtenidos se resuspendieron en 4 mL de PBS, con el objetivo de obtener diferentes OD600. Para la respuesta de fluorescencia, las soluciones de BP con diferentes concentraciones de suspensiones de células bacterianas (OD600 = 0,4-1,0) durante 30 min o sin, se registraron con excitación a 347 nm.

Adhesión bacteriana a hidrocarburos (BATH) de las bacterias

La hidrofobicidad de la superficie bacteriana se midió mediante el ensayo de adhesión bacteriana a hidrocarburos (BATH) ^[51]. Específicamente, se añadieron 0,1 mL de suspensión bacteriana, 0,9 mL de agua y 1,0 mL de xileno en los tubos de 5 mL, y la mezcla se agitó en un vórtice durante 15 min. Después de permanecer inmóvil durante 5 min, las bacterias en el xileno y el agua se cuantificaron mediante la absorbancia del microorganismo a 600 nm. El valor de BATH se puede obtener como:

C
Bacteria (Agua Antes): la absorbancia de la solución a 600 nm, la solución bacteriana antes del tratamiento con xileno;

C
Bacteria (Agua Después): la absorbancia de la solución a 600 nm, la solución bacteriana después del tratamiento con xileno;

C
Bacteria (Agua Blanco): la absorbancia de la solución a 600 nm, la solución en blanco sin bacterias;

Tinción bacteriana e imagen mediante microscopía

El L. pl cultivado se centrifugó a 2170×g durante 5 min, y se eliminó el sobrenadante. Las bacterias se resuspendieron en agua desionizada para obtener una densidad de OD600 = 0,5. Para la imagen, las bacterias se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con BP1–BP6 (5 μM) durante 30 min, respectivamente. Después de la incubación, cada suspensión se centrifugó a 2170×g durante 5 min. Luego se eliminó el sobrenadante. Las bacterias obtenidas de esta manera se lavaron tres veces con agua desionizada, se suspendieron en agua desionizada, se colocaron 10 μL de las soluciones en un plato de cultivo confocal y luego se utilizaron para la imagen. Las imágenes de microscopía se registraron en un microscopio de superresolución Leica TCS-SP8. Los canales de excitación y emisión utilizados para el BP fueron 405 nm y 415-520 nm, respectivamente.

Investigación de la fuerza de unión bacteriana

El L. pl cultivado se centrifugó a 2170×g durante 5 min, y luego se eliminó el sobrenadante. L. pl se resuspendió en agua desionizada para obtener una densidad de OD600 = 0,5. Para la investigación de la fuerza de unión, las suspensiones de células bacterianas, ya sea pretratadas con tunicamicina (2 μg mL−1), lisozima (10 mg mL−1) durante 1, 4 h o sin, se centrifugaron a 2010×g durante 5 min. Las bacterias se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con BP1–BP6 (5 μM) durante 30 min, respectivamente. Después de la incubación, cada suspensión se centrifugó a 2170×g durante 5 min. Luego se eliminó el sobrenadante. Las bacterias obtenidas de esta manera se midieron y la intensidad de fluorescencia se registró en un espectrofotómetro de fluorescencia F-7100 con excitación a 347 nm.

Investigación

Para una mayor investigación de la fuerza de unión, las suspensiones de células bacterianas, ya sea pretratadas con Concanavalina A (0,5, 1,0 mg mL−1), Urea (5%, 10%), 1,6-hexanodiol (1 M, 2 M) y NaCl (1 M, 2 M) durante 1 h o sin, se centrifugaron a 2010×g durante 5 min. Las bacterias se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con BP1–BP6 (5 μM) durante 30 min, respectivamente. Después de la incubación, cada suspensión se centrifugó a 2170×g durante 5 min. Luego se eliminó el sobrenadante. Las bacterias obtenidas de esta manera se midieron y la intensidad de fluorescencia se registró en un espectrofotómetro de fluorescencia F-7100 con excitación a 347 nm.

Algoritmos de aprendizaje automático

Análisis discriminante lineal

El análisis discriminante lineal (LDA) se realizó utilizando la clase de análisis discriminante lineal de la biblioteca scikit-learn (versión 1.0.2) en Python 3.8 (distribución Anaconda). Todas las variables se incluyeron en el modelo (modelo completo) con una tolerancia de 0,001. Los patrones de respuesta de fluorescencia se transformaron en variables canónicas. Se calcularon las distancias de Mahalanobis de cada muestra al centroide de cada grupo en el espacio transformado por LDA, y la clasificación se basó en la distancia más corta.

Clasificador de árbol de decisión

El árbol de decisión, un algoritmo de aprendizaje supervisado, emplea una estructura de árbol para facilitar la toma de decisiones. Dentro de esta estructura, cada nodo correspondía a una característica, mientras que los bordes simbolizaban las reglas de decisión. Los nodos terminales, o hojas, representaban los resultados de salida. En nuestro trabajo, el árbol de decisión utilizó "entropía" como criterio, lo que permitió que cada árbol tomara decisiones sobre los valores de las características. Este criterio guio el proceso de toma de decisiones, asignando finalmente etiquetas de decisión como resultados. Además, asignó puntuaciones basadas en la precisión de la clasificación.

Máquina de vectores de soporte

La máquina de vectores de soporte (SVM) sirve como un algoritmo de aprendizaje supervisado utilizado para la clasificación y la regresión. Funcionó encontrando el hiperplano que maximizaba el margen entre las dos clases. Al ingerir datos, la SVM se entrena utilizando un kernel polinómico con el clasificador de vectores de soporte (SVC), lo que le permite identificar el hiperplano apropiado para cada clasificación.

Regresión logística

La regresión logística, un método estadístico utilizado para problemas de clasificación binaria, estima la probabilidad de que ocurra un evento. En este contexto, el modelo de regresión logística se entrenó utilizando los parámetros predeterminados.

Clasificador de vecinos más cercanos

El algoritmo de vecinos más cercanos (KNN) es un método simple de aprendizaje basado en instancias. Predijo la categoría de un nuevo punto de datos seleccionando los k puntos de entrenamiento más cercanos a ese punto.

Clasificador de procesos gaussianos

El clasificador de procesos gaussianos utiliza procesos gaussianos para la clasificación probabilística. Un proceso gaussiano es un proceso estocástico de dimensión infinita, utilizado para la inferencia bayesiana no paramétrica de funciones. En las tareas de clasificación, el proceso gaussiano se utiliza para predecir la probabilidad de que un punto de datos pertenezca a una categoría específica. Ofreció un enfoque flexible basado en el kernel, que permitió que el modelo se adaptara automáticamente a la complejidad de los datos. El código para el análisis está disponible como Nota complementaria 1.

Basado en matrices para la detección multi-bacteriana

Construcción de la matriz de sensores

BP1, BP2, BP3, BP4, BP5 y BP6 se disolvieron en solución de DMSO, respectivamente, para formar un stock con una concentración final de 1 mM, y se diluyeron agregando tampón PBS (pH = 7,4) para obtener cinco diluciones y la concentración de BP1–BP6 fue de 5 μM, es decir, seis canales de fluorescencia BP1–BP6-7.4. Luego, el tampón PBS (pH = 7,4) se ajustó con el tampón PBS (pH = 6,0 y 8,2); de esta manera, se obtuvieron BP1-BP6-6.0 y BP1-BP6-8.2. Las seis sondas (BP1–BP6) combinadas con 3 pH (6,0, 7,4 y 8,2) se excitaron respectivamente a longitudes de onda de 347 nm, lo que resultó en la recopilación de la señal de fluorescencia distinta a 400 nm. Por lo tanto, para cada bacteria analizada, las 6 sondas combinadas con 3 pH produjeron colectivamente un total de 18 lecturas de fluorescencia. El análisis de datos se realizó utilizando el análisis discriminante lineal (LDA) y el análisis de conglomerados jerárquicos (HCA) en Anaconda Prompt.

Detección de diferentes tipos de bacterias

Las seis cepas bacterianas distintas se sometieron a múltiples pasos de lavado y luego se diluyeron a varias concentraciones de OD600 = 0,5 con PBS. Para la detección bacteriana, se mezclaron 100 μL de suspensiones bacterianas de cada bacteria con 100 μL de sondas BP en placas de pocillos negros de 96 pocillos (5 réplicas). Con la longitud de onda de excitación a 347 nm, se obtuvieron los cambios de fluorescencia de BP a 400 nm. Después de la adición de bacterias, el cambio en la intensidad de fluorescencia se expresó como F.

Detección bacteriana a diferentes concentraciones

L. pl y E. coli cultivadas se diluyeron a varias concentraciones (OD600 = 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 y 1,0). Posteriormente, se mezclaron 100 μL de suspensiones bacterianas de dos concentraciones diferentes de bacterias con 100 μL de sondas BP en placas de pocillos negros de 96 pocillos (5 réplicas). Los parámetros para la configuración del instrumento se mantuvieron como se describió anteriormente.

Identificación de bacterias mixtas

Modelos de bacterias mixtas binarias Al mezclar L. pl y E. coli (cada una con OD600 = 0,5) en varias proporciones, se prepararon distintas mezclas bacterianas. Se añadieron aproximadamente 100 μL de la mezcla bacteriana y 100 μL de sondas BP a una placa de pocillos negros de 96 pocillos (cinco réplicas).

Modelos de bacterias mixtas ternarias

Al mezclar L. pl, E. coli y S. aureus (cada una con OD600 = 0,5) en varias proporciones, se prepararon distintas mezclas bacterianas. Se añadieron 100 μL de mezclas bacterianas con 100 μL de sondas BP a placas de pocillos negros de 96 pocillos (cinco réplicas). Los parámetros para la configuración del instrumento se mantuvieron como se describió anteriormente.

Aplicación para el diagnóstico del CRC

Las muestras fecales de pacientes con CRC se recogieron en el Hospital del Cáncer de Hunan (Changsha, Hunan). La suspensión de la microbiota intestinal ^[25] se preparó con modificaciones menores. Las muestras recogidas se resuspendieron en PBS, se agitaron en un vórtice durante 1 min y este procedimiento de lavado se repitió cinco veces. La fracción bacteriana se sedimentó mediante centrifugación a 2850×g durante 10 min, y los sobrenadantes se descartaron después de cada centrifugación. La capa intermedia blanca resultante se recogió cuidadosamente, se resuspendió en PBS fresco y se filtró a través de una malla de 40 μm para eliminar los agregados grandes, lo que dio como resultado una suspensión microbiana homogénea. Las muestras de microbioma intestinal obtenidas se ajustaron a OD600 = 0,5 utilizando PBS antes de su uso experimental. Para las mediciones de fluorescencia, se mezclaron 100 μL de la suspensión de la microbiota intestinal con 5 μL de sondas BP y 95 μL de DMSO en una placa de pocillos negros de 96 pocillos durante 30 min (cinco réplicas biológicas), siguiendo el mismo protocolo que el ensayo de cultivo bacteriano.

Secuenciación del gen 16S rRNA de las muestras fecales

Recogida y procesamiento de las muestras fecales

Las muestras fecales frescas (0,25-0,5 g) se colocaron en tubos de centrífuga estériles de 2 mL; se utilizaron 200 μL para las muestras líquidas. Luego, se añadieron 500 μL de tampón SA, 100 μL de tampón SC y 0,25 g de cuentas de molienda. Para la eliminación del ARN, se añadieron 10 μL de RNasa A (TIANGEN, RT405-02) (Datos complementarios 3). La mezcla se homogeneizó, se calentó a 70 °C durante 15 min, se centrifugó a 13 400×g durante 1 min y se transfirieron aproximadamente 500 μL de sobrenadante a un tubo nuevo. Las muestras no procesadas se almacenaron a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Extracción del ADN fecal total

Se extrajo el ADN total utilizando el kit TGuide S96 Magnetic Universal DNA Kit (Tiangen, DP812) con modificaciones menores: se añadieron 200 μL de tampón SH al sobrenadante, se agitó vigorosamente durante 5 s y se incubó a 4 °C durante 10 min. Tras la centrifugación a 13.400×g durante 3 min, el sobrenadante se mezcló con 500 μL de tampón GFA (se confirmó la adición de isopropanol). A continuación, se añadieron 10 μL de suspensión de microesferas magnéticas G, se agitó durante 5 min y las microesferas magnéticas se adsorbieron en un soporte magnético para eliminar el líquido. Tras el lavado con 700 μL de tampón de proteinasa K RD (se comprobó el etanol) y dos veces con 700 μL de tampón de lavado PWD (se comprobó el etanol), las microesferas se secaron al aire durante 5-10 min. Finalmente, se añadieron 50-100 μL de tampón de elución TB, se incubó a 56 °C durante 5 min (agitando tres veces) y se recogió el ADN. La calidad del ADN (A260/A280 = 1,8-2,0) y su integridad se detectaron mediante un lector de ELISA (GeneCompany, Synergy HTX) y electroforesis en gel de agarosa al 1,8%, respectivamente, y se almacenó a -20 °C.

Amplificación por PCR del gen 16S rRNA

La región V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificó por PCR utilizando ADN purificado como molde con los cebadores 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') y 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'). El sistema de 10 μL contenía 2,5-4 ng de ADN genómico, 0,3 μL de cada uno de los 10 μM de VnF/VnR, 5 μL de tampón KOD FX Neo, 2 μL de dNTP (2 mM cada uno), 0,2 μL de KOD FX Neo (TOYOBO) y ddH₂O. Cada muestra tuvo tres réplicas y un control en blanco. Condiciones de la PCR: 95 °C de pre-desnaturalización durante 5 min; 25 ciclos de 95 °C (30 s), 50 °C (30 s), 72 °C (40 s); 72 °C de extensión final durante 7 min; 4 °C de mantenimiento. Los productos de la PCR se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% (banda objetivo ~468 pb).

Purificación del producto de la PCR

Los productos de la PCR de la misma muestra se juntaron y se purificaron con las microesferas VAHTSTM DNA Clean Beads (Vazyme) en una proporción de 10:8 (producto:microesferas). Después de una incubación de 5 min a temperatura ambiente, las microesferas se adsorbieron, se eliminó el sobrenadante, se lavó dos veces con 200 μL de etanol al 80%, se secó al aire durante 3 min y se eluyó con 8-10 μL de ddH₂O. Los productos purificados se cuantificaron mediante ImageJ y se almacenaron a -20 °C.

Construcción de la biblioteca y secuenciación

Las bibliotecas se construyeron a partir de los productos de la PCR purificados mediante reparación de extremos, adición de cola 3'-A y ligación de adaptadores utilizando KOD FX Neo (TOYOBO), Phusion HF MM (Biolink) y los cebadores VnF/VnR (SYNBIO). Los fragmentos objetivo (500-600 pb) se seleccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% y se purificaron con el kit Monarch DNA Gel Extraction Kit (Hongyue). Tras el enriquecimiento de la PCR Solexa, se detectó la calidad de la biblioteca y se realizó la secuenciación en Illumina NovaSeq 6000 (PE 250).

Procesamiento y análisis de los datos de secuenciación

Los datos de secuenciación brutos se filtraron para eliminar las lecturas de baja calidad (Q < 20 > 50%), los adaptadores y las lecturas ricas en N para obtener lecturas limpias. Las lecturas de doble extremo se unieron mediante FLASH (se descartaron las que no tuvieron éxito). Las secuencias con ≥97% de similitud se agruparon en OTU (se eliminaron los singletes). La anotación de especies se realizó mediante la alineación con la base de datos Silva. Se calcularon la α-diversidad (Shannon, Chao1) y la β-diversidad (PCoA, NMDS) para analizar la composición de la comunidad microbiana.

Estadística y reproducibilidad

El tamaño de la muestra se determinó mediante análisis de potencia (G*Power, α = 0,05, potencia = 0,80, tamaño del efecto d = 0,6), lo que requirió ≥30 muestras por grupo. No se excluyeron datos. Todos los experimentos clave se replicaron de forma independiente al menos tres veces con resultados consistentes. Se aplicó la asignación aleatoria y el enmascaramiento durante la recopilación y el análisis de los datos. El análisis de datos y las ilustraciones se realizaron utilizando Origin 2021. Las intensidades de fluorescencia se cuantificaron utilizando el software ImageJ para el análisis de la región de interés. Las comparaciones estadísticas entre dos grupos se determinaron mediante una prueba t de Student de dos colas. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 9.0. Se consideró significativo un valor de P < 0,05, y los valores de P se proporcionan de la siguiente manera: **P < 0,0001, *P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns no significativo.

Declaración ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Oncológico Afiliado a la Facultad de Medicina de Xiangya, China (Número de aprobación: KYJJ-2030-080). Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras antes de su inclusión en el estudio. La investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Materiales

Ácido 4-boronobenzoico, ácido 1-hidroxi-1,3-dihidrobenzo[c]-^[1,2]oxaborol-6-carboxílico, ácido 4-borono-3-metoxibenzoico, ácido 4-borono-3-fluorobenzoico, ácido 4-borono-3-clorobenzoico y ácido 3-borono-5-fluorobenzoico se compraron a proveedores de laboratorios comerciales (Bide Pharm.). El alcohol pirren-1-ilo se compró a proveedores de laboratorios comerciales (Energy Chemical). Todos los productos químicos y reactivos se compraron comercialmente en grado analítico, a menos que se indique lo contrario. Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli) y Citrobacter koseri (C. k) se obtuvieron del Centro General de Cultivos Microbiológicos de China. Lactobacillus acidophilus (L. a) se compró al Centro de Cultivos Microbiológicos de Guangdong. Enterobacter cloacae (E. cloacae) y Lactobacillus plantarum (L. pl) se obtuvieron del Laboratorio Central de la Universidad Agrícola de Hunan (Changsha, China). Todas las soluciones se prepararon con agua ultrapura (18,25 MΩ·cm−1) del sistema Millipore.

Caracterización de los materiales

Los espectros de RMN de 1H y 13C se registraron en un espectrómetro Bruker Avance-500 (Bruker, Suiza) en DMSO-d6 con TMS como estándar interno. Los espectros de absorción y fluorescencia se adquirieron en un espectrofotómetro UV-vis 2600 (Shimadzu, Japón) y un espectrofotómetro F-7100 (Hitachi, Japón), respectivamente. Todos los experimentos de imagen se realizaron en un microscopio confocal TCS-SP8 (Leica, Alemania). La intensidad de fluorescencia del conjunto de sensores BP para la respuesta bacteriana se registró en un lector de microplacas Biotek (SynergyMX, EE. UU.). La espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) se registró en un espectrómetro de masas TOF MS ES+, y se utilizó acetonitrilo para disolver la muestra.

Procedimiento general para la síntesis de ácido fenilborónico (BP1-BP6)

Síntesis de BP1-BP6

Se mezcló el ácido fenilborónico correspondiente (0,10 mmol), EDC (77,60 mg, 0,50 mmol) y DMAP (24,43 mg, 0,20 mmol) y se agitó en un co-solvente de DMF durante 0,5 h, y luego se añadió el alcohol pirren-1-ilo (46,46 mg, 0,20 mmol) a la solución anterior y se agitó durante 24 h a 25 °C. Una vez finalizada la reacción, se añadió agua ultrapura a la solución, y los sólidos crudos blancos se filtraron y se lavaron con abundante MeOH. Los sólidos crudos se purificaron posteriormente mediante cromatografía en columna de Al₂O₃, y los sólidos blancos fueron las sondas correspondientes BP1-BP6. BP1: Rendimiento: 66,4%. RMN de 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,91 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,78 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,62 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,54 (s, 2H), 7,47 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,24 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,84-6,75 (m, 2H), 4,95 (s, 2H). RMN de 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ 166,31, 134,80, 131,66, 131,24, 131,19, 130,71, 129,79, 129,49, 128,68, 128,54, 128,43, 128,27, 127,82, 126,96, 126,15, 126,06, 125,26, 124,50, 124,26, 123,64, 65,35. HRMS (m/z): [M + H]+ calcd. para C₂₄H₁₈BO₄+, 381,1293; encontrado, 381,2936. BP2: Rendimiento: 69,2%. RMN de 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,48-8,38 (m, 2H), 8,37-8,29 (m, 5H), 8,25 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 8,11 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,09-8,06 (m, 1H), 7,54-7,49 (m, 1H), 6,10 (s, 2H), 5,02 (s, 2H). RMN de 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ 165,13, 136,63, 134,46, 131,72, 131,63, 131,19, 131,19, 130,69, 129,51, 128,87, 128,71, 128,51, 128,33, 127,82, 127,21, 126,99, 126,19, 126,10, 125,27, 124,49, 124,23, 123,63, 65,77. HRMS (m/z): [M+ Na]+ calcd. para C₂₄H₁₆BFKO₄+, 437,0722; encontrado, 437,2305. BP5: Rendimiento: 69,2%. RMN de 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,55 (s, 2H), 8,46 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 8,33 (d, J = 6,8 Hz, 4H), 8,27-8,15 (m, 4H), 8,11 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,91-7,81 (m, 2H), 7,53 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 6,10 (s, 2H). RMN de 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ 165,13, 136,63, 134,46, 131,72, 131,63, 131,19, 131,19, 130,69, 129,51, 128,87, 128,71, 128,51, 128,33, 127,82, 127,21, 126,99, 126,19, 126,10, 125,27, 124,49, 124,23, 123,63, 65,77. HRMS (m/z): [M+ Na]+ calcd. para C₂₄H₁₆BFKO₄+, 437,0722; encontrado, 437,2305.

Síntesis de BP1-BP6

Se mezcló una solución que contenía el ácido fenilborónico correspondiente (0,10 mmol), EDC (77,60 mg, 0,50 mmol) y DMAP (24,43 mg, 0,20 mmol) y se agitó en un cosolvente de DMF durante 0,5 h, y luego se añadió el pirren-1-ilmetanol (46,46 mg, 0,20 mmol) a la solución anterior y se agitó durante 24 h a 25 °C. Una vez completada la reacción, se añadió agua ultrapura a la solución, y los sólidos crudos blancos se filtraron y se lavaron con abundante MeOH. Los sólidos crudos se purificaron posteriormente mediante cromatografía en columna de Al2O3, y los sólidos blancos resultantes fueron las sondas correspondientes BP1–BP6. BP1: Rendimiento: 66,4 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,91 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,78 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,62 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,54 (s, 2H), 7,47 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,24 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,84-6,75 (m, 2H), 4,95 (s, 2H). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ 166,31, 134,80, 131,66, 131,24, 131,19, 130,71, 129,79, 129,49, 128,68, 128,54, 128,43, 128,27, 127,82, 126,96, 126,15, 126,06, 125,26, 124,50, 124,26, 123,64, 65,35. HRMS (m/z): [M + H]+ calcd. para C24H18BO4+, 381,1293; encontrado, 381,2936. BP2: Rendimiento: 69,2 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,48-8,38 (m, 2H), 8,37-8,29 (m, 5H), 8,25 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 8,11 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,09-8,06 (m, 1H), 7,54-7,49 (m, 1H), 6,10 (s, 2H), 5,02 (s, 2H). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ 166,38, 159,62, 132,38, 132,00, 131,69, 131,18, 130,70, 129,77, 129,52, 128,89, 128,89, 128,74, 128,49, 128,30, 127,82, 126,99, 126,18, 126,08, 125,29, 124,50, 124,24, 123,59, 122,49, 70,49, 65,35. HRMS (m/z): [M + H]+ calcd. para C25H18BO4+ [M + H]+, 395,1449; encontrado, 395,1601. BP3: Rendimiento: 80,4 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,47 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,34 (ddd, J = 12,6, 8,4, 4,9 Hz, 4H), 8,23 (dd, J = 8,4, 6,0 Hz, 3H), 8,11 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,96 (s, 2H), 7,59-7,51 (m, 2H), 7,48 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 6,11 (s, 2H), 3,80 (s, 3H). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ 166,15, 163,35, 135,44, 132,42, 131,65, 131,20, 130,71, 129,80, 129,44, 128,64, 128,34, 128,27, 127,82, 126,97, 126,15, 126,07, 125,26, 124,51, 124,25, 123,65, 121,60, 110,58, 65,46, 55,84. HRMS (m/z): [M + H]+ calcd. para C25H20BO5+, 411,1398; encontrado, 411,4252. BP4: Rendimiento: 85,1 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,47 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 8,34 (dd, J = 10,1, 6,8 Hz, 3H), 8,30 (s, 1H), 8,26 (s, 2H), 8,21 (d, J = 4,1 Hz, 2H), 8,15-8,08 (m, 2H), 7,73 (d, J = 9,3 Hz, 3H), 6,12 (s, 2H). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ 166,36, 165,21, 136,22, 131,71, 131,18, 130,69, 129,53, 129,49, 128,71, 128,48, 128,31, 127,81, 126,98, 126,17, 126,09, 125,26, 124,88, 124,86, 124,49, 124,24, 123,62, 115,70, 65,72. HRMS (m/z): [M + K]+ calcd. para C24H16BFKO4+, 437,0757; encontrado, 437,2306. BP5: Rendimiento: 69,2 %. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,55 (s, 2H), 8,46 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 8,33 (d, J = 6,8 Hz, 4H), 8,27-8,15 (m, 4H), 8,11 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,91-7,81 (m, 2H), 7,53 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 6,10 (s, 2H). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ 165,13, 136,63, 134,46, 131,72, 131,63, 131,19, 131,19, 130,70, 129,77, 129,52, 128,89, 128,89, 128,74, 128,49, 128,31, 127,82, 126,99, 126,18, 126,08, 125,26, 124,50, 124,24, 123,59, 122,49, 70,49, 65,35.

Investigación

Medida de fluorescencia

Se diluyó una solución de DMSO de BP (1 mM) en agua desionizada para obtener una concentración final de 5 μM, y se registraron los respectivos espectros UV-vis utilizando un espectrofotómetro UV-vis 2600 con una longitud de onda de 280-360 nm, y se registraron los espectros de fluorescencia de las soluciones resultantes en un espectrofotómetro de fluorescencia F-7100 con una excitación a 347 nm.

Respuesta bacteriana

El L.pl obtenido se centrifugó a 2170×g durante 5 min, y luego se eliminó el sobrenadante, y los gránulos bacterianos obtenidos se resuspendieron en 4 mL de PBS, con el objetivo de obtener diferentes OD600. Para la respuesta de fluorescencia, se registraron soluciones de BP con diferentes concentraciones de suspensiones de células bacterianas (OD600 = 0,4-1,0) durante 30 min o sin ellas, con una excitación a 347 nm.

Medida de fluorescencia

Se diluyó una solución de DMSO de BP (1 mM) en agua desionizada para obtener una concentración final de 5 μM, y se registraron los respectivos espectros UV-vis utilizando un espectrofotómetro UV-vis 2600 con una longitud de onda de 280-360 nm, y se registraron los espectros de fluorescencia de las soluciones resultantes en un espectrofotómetro de fluorescencia F-7100 con una excitación a 347 nm.

Respuesta bacteriana

El L.pl obtenido se centrifugó a 2170×g durante 5 min, y luego se eliminó el sobrenadante, y los gránulos bacterianos obtenidos se resuspendieron en 4 mL de PBS, con el objetivo de obtener diferentes OD600. Para la respuesta de fluorescencia, se registraron soluciones de BP con diferentes concentraciones de suspensiones de células bacterianas (OD600 = 0,4-1,0) durante 30 min o sin ellas, con una excitación a 347 nm.

BATH de bacterias (adhesión bacteriana a hidrocarburos)

La hidrofobicidad de la superficie bacteriana se midió mediante el ensayo de adhesión bacteriana a hidrocarburos (BATH) ^[51]. Específicamente, se añadieron 0,1 mL de suspensión bacteriana, 0,9 mL de agua y 1,0 mL de xileno en los tubos de 5 mL, y la mezcla se agitó en un vórtice durante 15 min. Después de permanecer inmóvil durante 5 min, las bacterias en el xileno y el agua se cuantificaron mediante la absorbancia del microorganismo a 600 nm. El valor de BATH se puede obtener como:

C
Bacteria (Agua Antes): la absorbancia de la solución a 600 nm, la solución bacteriana antes del tratamiento con xileno;

C
Bacteria (Agua Después): la absorbancia de la solución a 600 nm, la solución bacteriana después del tratamiento con xileno;

C
Bacteria (Agua Blanco): la absorbancia de la solución a 600 nm, la solución en blanco sin bacterias;

Tinción e imagen bacteriana mediante microscopía

El L.pl obtenido se centrifugó a 2170×g durante 5 min, y se eliminó el sobrenadante. Las bacterias se resuspendieron en agua desionizada para obtener una densidad de OD600 = 0,5. Para la imagen, las bacterias se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con BP1–BP6 (5 μM) durante 30 min, respectivamente. Después de la incubación, cada suspensión se centrifugó a 2170×g durante 5 min. Luego se eliminó el sobrenadante. Las bacterias obtenidas de esta manera se lavaron tres veces con agua desionizada, se suspendieron en agua desionizada, se colocaron 10 μL de las soluciones en un plato de cultivo confocal y luego se utilizaron para la imagen. Las imágenes de microscopía se registraron en un microscopio de superresolución Leica TCS-SP8. Los canales de excitación y emisión utilizados para el BP fueron 405 nm y 415-520 nm.

Investigación de la fuerza de unión bacteriana

El L.pl obtenido se centrifugó a 2170×g durante 5 min, y luego se eliminó el sobrenadante. El L.pl se resuspendió en agua desionizada para obtener una densidad de OD600 = 0,5. Para la investigación de la fuerza de unión, se centrifugaron suspensiones de células bacterianas, ya sea pretratadas con tunicamicina (2 μg mL−1), lisozima (10 mg mL−1) durante 1, 4 h, o sin pretratamiento, a 2010×g durante 5 min. Las bacterias se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con BP1–BP6 (5 μM) durante 30 min, respectivamente. Después de la incubación, cada suspensión se centrifugó a 2170×g durante 5 min. Luego se eliminó el sobrenadante. Las bacterias obtenidas de esta manera se midieron y se registró la intensidad de fluorescencia en un espectrofotómetro de fluorescencia F-7100 con una excitación a 347 nm.

Para una mayor investigación de la fuerza de unión, se prepararon suspensiones de células bacterianas, ya sea pretratadas con Concanavalina A (0,5, 1,0 mg/mL), Urea (5%, 10%), 1,6-Hexanodiol (1 M, 2 M) y NaCl (1 M, 2 M) durante 1 h o sin pretratamiento, y se centrifugaron a 2010 × g durante 5 min. Las bacterias se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con BP1–BP6 (5 μM) durante 30 min. Después de la incubación, cada suspensión se centrifugó a 2170 × g durante 5 min. Luego, se eliminó el sobrenadante. Las bacterias obtenidas de esta manera se midieron y la intensidad de la fluorescencia se registró en un espectrofotómetro de fluorescencia F-7100 con una excitación a 347 nm.

Investigación

Para una mayor investigación de la fuerza de unión, se prepararon suspensiones de células bacterianas, ya sea pretratadas con Concanavalina A (0,5, 1,0 mg/mL), Urea (5%, 10%), 1,6-Hexanodiol (1 M, 2 M) y NaCl (1 M, 2 M) durante 1 h o sin pretratamiento, y se centrifugaron a 2010 × g durante 5 min. Las bacterias se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con BP1–BP6 (5 μM) durante 30 min. Después de la incubación, cada suspensión se centrifugó a 2170 × g durante 5 min. Luego, se eliminó el sobrenadante. Las bacterias obtenidas de esta manera se midieron y la intensidad de la fluorescencia se registró en un espectrofotómetro de fluorescencia F-7100 con una excitación a 347 nm.

Algoritmos de aprendizaje automático

Análisis discriminante lineal

El análisis discriminante lineal (LDA) se realizó utilizando la clase de análisis discriminante lineal de la biblioteca scikit-learn (versión 1.0.2) en Python 3.8 (distribución Anaconda). Todas las variables se incluyeron en el modelo (modelo completo) con una tolerancia de 0,001. Los patrones de respuesta de fluorescencia se transformaron en variables canónicas. Se calcularon las distancias de Mahalanobis de cada muestra al centroide de cada grupo en el espacio transformado por LDA, y la clasificación se basó en la distancia más corta.

Clasificador de árbol de decisión

El árbol de decisión, un algoritmo de aprendizaje supervisado, emplea una estructura de árbol para facilitar la toma de decisiones. Dentro de esta estructura, cada nodo correspondía a una característica, mientras que los bordes simbolizaban las reglas de decisión. Los nodos terminales, o hojas, representaban los resultados de salida. En nuestro trabajo, el árbol de decisión utilizó "entropía" como criterio, lo que permitió que cada árbol tomara decisiones con respecto a los valores de las características. Este criterio guió el proceso de toma de decisiones, asignando en última instancia etiquetas de decisión como resultados. Además, asignó puntuaciones basadas en la precisión de la clasificación.

Máquina de vectores de soporte

La máquina de vectores de soporte (SVM) sirve como un algoritmo de aprendizaje supervisado utilizado para la clasificación y la regresión. Funcionó encontrando el hiperplano que maximizaba el margen entre las dos clases. Tras la ingestión de datos, la SVM se entrena utilizando un kernel polinómico con el clasificador de vectores de soporte (SVC), lo que le permite identificar el hiperplano apropiado para cada clasificación.

Regresión logística

La regresión logística, un método estadístico utilizado para problemas de clasificación binaria, estima la probabilidad de que ocurra un evento. En este contexto, el modelo de regresión logística se entrenó utilizando parámetros predeterminados.

Clasificador de vecinos más cercanos

El algoritmo de vecinos más cercanos (KNN) es un método simple de aprendizaje basado en instancias. Predijo la categoría de un nuevo punto de datos seleccionando los k puntos de entrenamiento más cercanos a ese punto.

Clasificador de proceso gaussiano

El clasificador de proceso gaussiano utiliza procesos gaussianos para la clasificación probabilística. Un proceso gaussiano es un proceso estocástico de dimensión infinita, utilizado para la inferencia bayesiana no paramétrica de funciones. En las tareas de clasificación, el proceso gaussiano se utiliza para predecir la probabilidad de que un punto de datos pertenezca a una categoría específica. Ofreció un enfoque flexible basado en el kernel, que permite que el modelo se adapte automáticamente a la complejidad de los datos. El código para el análisis está disponible como Nota complementaria 1.

Análisis discriminante lineal

El análisis discriminante lineal (LDA) se realizó utilizando la clase de análisis discriminante lineal de la biblioteca scikit-learn (versión 1.0.2) en Python 3.8 (distribución Anaconda). Todas las variables se incluyeron en el modelo (modelo completo) con una tolerancia de 0,001. Los patrones de respuesta de fluorescencia se transformaron en variables canónicas. Se calcularon las distancias de Mahalanobis de cada muestra al centroide de cada grupo en el espacio transformado por LDA, y la clasificación se basó en la distancia más corta.

Clasificador de árbol de decisión

El árbol de decisión, un algoritmo de aprendizaje supervisado, emplea una estructura de árbol para facilitar la toma de decisiones. Dentro de esta estructura, cada nodo correspondía a una característica, mientras que los bordes simbolizaban las reglas de decisión. Los nodos terminales, o hojas, representaban los resultados de salida. En nuestro trabajo, el árbol de decisión utilizó "entropía" como criterio, lo que permitió que cada árbol tomara decisiones con respecto a los valores de las características. Este criterio guió el proceso de toma de decisiones, asignando en última instancia etiquetas de decisión como resultados. Además, asignó puntuaciones basadas en la precisión de la clasificación.

Máquina de vectores de soporte

La máquina de vectores de soporte (SVM) sirve como un algoritmo de aprendizaje supervisado utilizado para la clasificación y la regresión. Funcionó encontrando el hiperplano que maximizaba el margen entre las dos clases. Tras la ingestión de datos, la SVM se entrena utilizando un kernel polinómico con el clasificador de vectores de soporte (SVC), lo que le permite identificar el hiperplano apropiado para cada clasificación.

Regresión logística

La regresión logística, un método estadístico utilizado para problemas de clasificación binaria, estima la probabilidad de que ocurra un evento. En este contexto, el modelo de regresión logística se entrenó utilizando parámetros predeterminados.

Clasificador de vecinos más cercanos

El algoritmo de vecinos más cercanos (KNN) es un método simple de aprendizaje basado en instancias. Predijo la categoría de un nuevo punto de datos seleccionando los k puntos de entrenamiento más cercanos a ese punto.

Clasificador de proceso gaussiano

El clasificador de proceso gaussiano utiliza procesos gaussianos para la clasificación probabilística. Un proceso gaussiano es un proceso estocástico de dimensión infinita, utilizado para la inferencia bayesiana no paramétrica de funciones. En las tareas de clasificación, el proceso gaussiano se utiliza para predecir la probabilidad de que un punto de datos pertenezca a una categoría específica. Ofreció un enfoque flexible basado en el kernel, que permite que el modelo se adapte automáticamente a la complejidad de los datos. El código para el análisis está disponible como Nota complementaria 1.

Enfoque basado en matrices para la detección de múltiples bacterias

Construcción del conjunto de sensores

BP1, BP2, BP3, BP4, BP5 y BP6 se disolvieron en solución de DMSO, respectivamente, para formar un stock con una concentración final de 1 mM, y se diluyeron añadiendo tampón PBS (pH = 7,4) para obtener cinco diluciones y la concentración de BP1–BP6 fue de 5 μM, es decir, seis canales de fluorescencia BP1–BP6-7.4. A continuación, el tampón PBS (pH = 7,4) se ajustó con el tampón PBS (pH = 6,0 y 8,2); de esta manera, se obtuvieron BP1-BP6-6.0 y BP1-BP6-8.2. Las seis sondas (BP1–BP6) combinadas con 3 pH (6,0, 7,4 y 8,2) se excitaban respectivamente a longitudes de onda de 347 nm, lo que daba como resultado la recolección de la señal de fluorescencia distinta a 400 nm. Por lo tanto, para cada bacteria analizada, las 6 sondas combinadas con 3 pH producían colectivamente un total de 18 lecturas de fluorescencia. El análisis de datos se realizó utilizando el análisis discriminante lineal (LDA) y el análisis de conglomerados jerárquicos (HCA) en Anaconda Prompt.

Detección de diferentes tipos de bacterias

Las seis cepas bacterianas distintas se sometieron a múltiples pasos de lavado y, posteriormente, se diluyeron a concentraciones variables de OD600 = 0,5 con PBS. Para la detección bacteriana, se mezclaron 100 μL de suspensiones bacterianas de cada bacteria con 100 μL de sondas BP en placas de pocillos negros de 96 pocillos (5 réplicas). Bajo la longitud de onda de excitación a 347 nm, se obtuvieron los cambios de fluorescencia de BP a 400 nm. Después de la adición de bacterias, el cambio en la intensidad de la fluorescencia se expresó como F.

Detección bacteriana a diferentes concentraciones

Las bacterias L. pl y E. coli cultivadas se diluyeron a varias concentraciones (OD600 = 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 y 1,0). Posteriormente, se mezclaron 100 μL de suspensiones bacterianas de dos concentraciones diferentes de bacterias con 100 μL de sondas BP en placas de pocillos negros de 96 pocillos (5 réplicas). Los parámetros para la configuración del instrumento se mantuvieron como se describió anteriormente.

Identificación de bacterias mixtas

Modelos de bacterias mixtas binarias. Al mezclar L. pl y E. coli (cada una con OD600 = 0,5) en varias proporciones, se prepararon distintas mezclas bacterianas. Se añadieron aproximadamente 100 μL de la mezcla bacteriana y 100 μL de sondas BP a una placa de pocillos negros (cinco réplicas).

Modelos de bacterias mixtas ternarias

Al mezclar L. pl, E. coli y S. aureus (cada una con OD600 = 0,5) en varias proporciones, se prepararon distintas mezclas bacterianas. Se añadieron 100 μL de mezclas bacterianas con 100 μL de sondas BP a placas de pocillos negros (cinco réplicas). Los parámetros para la configuración del instrumento se mantuvieron como se describió anteriormente. Los parámetros para la configuración del instrumento se mantuvieron como se describió anteriormente.

Aplicación para el diagnóstico del CCRC

Las muestras fecales de pacientes con CRC se recolectaron en el Hospital Oncológico de Hunan (Changsha, Hunan). La suspensión de microbiota intestinal ^[25] se preparó con modificaciones menores. Las muestras recolectadas se resuspendieron en PBS, se agitaron en un vórtice durante 1 minuto y este procedimiento de lavado se repitió cinco veces. La fracción bacteriana se precipitó mediante centrifugación a 2850 × g durante 10 minutos, descartándose los sobrenadantes después de cada centrifugación. La capa intermedia blanca resultante se recolectó cuidadosamente, se resuspendió en PBS fresco y se filtró a través de una malla de 40 μm para eliminar los agregados grandes, obteniendo una suspensión microbiana homogénea. Las muestras de microbioma intestinal obtenidas se ajustaron a OD600 = 0,5 utilizando PBS antes de su uso experimental. Para las mediciones de fluorescencia, se mezclaron 100 μL de la suspensión de microbiota intestinal con 5 μL de sondas BP y 95 μL de DMSO en una placa de 96 pocillos negra durante 30 minutos (cinco réplicas biológicas), siguiendo el mismo protocolo que el ensayo de cultivo bacteriano.

Secuenciación del gen 16S rRNA de las muestras fecales

Recolección y procesamiento de las muestras fecales

Las muestras fecales frescas (0,25–0,5 g) se colocaron en tubos de centrífuga estériles de 2 ml; se utilizaron 200 μL para las muestras líquidas. Luego, se agregaron 500 μL de tampón SA, 100 μL de tampón SC y 0,25 g de perlas de molienda. Para la eliminación del ARN, se agregaron 10 μL de RNasa A (TIANGEN, RT405-02) (Datos suplementarios 3). La mezcla se homogeneizó, se calentó a 70 °C durante 15 minutos, se centrifugó a 13 400 × g durante 1 minuto y se transfirieron aproximadamente 500 μL de sobrenadante a un tubo nuevo. Las muestras no procesadas se almacenaron a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Extracción del ADN fecal total

El ADN total se extrajo utilizando el kit TGuide S96 Magnetic Universal DNA Kit (Tiangen, DP812) con modificaciones menores: se agregaron 200 μL de tampón SH al sobrenadante, se agitó en un vórtice durante 5 segundos y se incubó a 4 °C durante 10 minutos. Después de la centrifugación a 13 400 × g durante 3 minutos, el sobrenadante se mezcló con 500 μL de tampón GFA (se confirmó la adición de isopropanol). Luego, se agregaron 10 μL de suspensión de perlas magnéticas G, se agitó durante 5 minutos y las perlas magnéticas se adsorbieron en un soporte magnético para eliminar el líquido. Después de lavar con 700 μL de tampón de proteinasa K RD (se verificó el etanol) y dos veces con 700 μL de tampón de lavado PWD (se verificó el etanol), las perlas se secaron al aire durante 5-10 minutos. Finalmente, se agregaron 50-100 μL de tampón de elución TB, se incubó a 56 °C durante 5 minutos (agitando tres veces) y se recolectó el ADN. La calidad del ADN (A260/A280 = 1,8-2,0) y la integridad se detectaron mediante un lector ELISA (GeneCompany, Synergy HTX) y electroforesis en gel de agarosa al 1,8%, respectivamente, y se almacenaron a -20 °C.

Amplificación por PCR del gen 16S rRNA

La región V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificó por PCR utilizando ADN purificado como plantilla con los cebadores 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') y 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'). El sistema de 10 μL contenía 2,5-4 ng de ADN genómico, 0,3 μL de cada uno de 10 μM de VnF/VnR, 5 μL de tampón KOD FX Neo, 2 μL de dNTP (2 mM cada uno), 0,2 μL de KOD FX Neo (TOYOBO) y ddH₂O. Cada muestra tuvo tres réplicas y un control en blanco. Condiciones de PCR: 95 °C de pre-desnaturalización durante 5 minutos; 25 ciclos de 95 °C (30 s), 50 °C (30 s), 72 °C (40 s); 72 °C de extensión final durante 7 minutos; 4 °C de espera. Los productos de PCR se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% (banda objetivo ~468 pb).

Purificación del producto de PCR

Los productos de PCR de la misma muestra se agruparon y se purificaron con VAHTSTM DNA Clean Beads (Vazyme) en una relación de 10:8 (producto:perlas). Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, las perlas se adsorbieron, se eliminó el sobrenadante, se lavó dos veces con 200 μL de etanol al 80%, se secó al aire durante 3 minutos y se eluyó con 8-10 μL de ddH₂O. Los productos purificados se cuantificaron mediante ImageJ y se almacenaron a -20 °C.

Construcción de la biblioteca y secuenciación

Las bibliotecas se construyeron a partir de los productos de PCR purificados mediante reparación de extremos, adición de cola 3'-A y ligación de adaptadores utilizando KOD FX Neo (TOYOBO), Phusion HF MM (Biolink) y los cebadores VnF/VnR (SYNBIO). Los fragmentos objetivo (500-600 pb) se seleccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% y se purificaron con el kit Monarch DNA Gel Extraction Kit (Hongyue). Después del enriquecimiento por PCR de Solexa, se detectó la calidad de la biblioteca y se realizó la secuenciación en Illumina NovaSeq 6000 (PE 250).

Procesamiento y análisis de los datos de secuenciación

Los datos de secuenciación brutos se filtraron para eliminar las lecturas de baja calidad (Q < 20 > 50%), los adaptadores y las lecturas ricas en N para obtener lecturas limpias. Las lecturas de doble extremo se unieron mediante FLASH (las que no tuvieron éxito se descartaron). Las secuencias con ≥97% de similitud se agruparon en OTU (se eliminaron los singletes). La anotación de especies se realizó mediante la alineación con la base de datos Silva. La α-diversidad (Shannon, Chao1) y la β-diversidad (PCoA, NMDS) se calcularon para analizar la composición de la comunidad microbiana.

Tamaño de la muestra y análisis estadístico

El tamaño de la muestra se determinó mediante análisis de potencia (G*Power, α = 0,05, potencia = 0,80, tamaño del efecto d = 0,6), lo que requirió ≥30 muestras por grupo. No se excluyeron datos. Todos los experimentos clave se replicaron de forma independiente al menos tres veces con resultados consistentes. Se aplicó la asignación aleatoria y el enmascaramiento durante la recolección y el análisis de datos. El análisis de datos y las ilustraciones se realizaron utilizando Origin 2021. Las intensidades de fluorescencia se cuantificaron utilizando el software ImageJ para el análisis de la región de interés. Las comparaciones estadísticas entre dos grupos se determinaron mediante una prueba t de Student de dos colas. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 9.0. Se consideró que P < 0,05 era significativo, y los valores de P se proporcionan de la siguiente manera: **P < 0,0001, *P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns no significativo.

Declaración ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Oncológico Afiliado de la Escuela de Medicina Xiangya, China (Número de aprobación: KYJJ-2030-080). Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito para la recolección de muestras antes de su inclusión en el estudio. La investigación cumple con todas las regulaciones éticas pertinentes.

Resumen de la información

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de información de Nature Portfolio vinculado a este artículo.