Los hepatocitos, reprogramados funcionalmente por células de cáncer colorrectal con alta expresión de KIAA1199, favorecen la acumulación de neutrófilos Egr1+ con potencial metastásico.

El cáncer colorrectal (CCR) representa un desafío importante para la salud mundial, siendo el segundo cáncer más diagnosticado y la quinta causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial^[1],^[2]. La evolución clínica del CCR se ve drásticamente alterada por la diseminación metastásica, con metástasis hepáticas que ocurren en más del 50% de los pacientes y que constituyen la causa predominante de mortalidad específica por cáncer^[3]. A pesar de los avances en la terapia multimodal, el pronóstico para la metástasis hepática de cáncer colorrectal (MCCR) sigue siendo desfavorable, con una tasa de supervivencia a 5 años de solo el 12-30%^[4]. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos celulares y moleculares que rigen el tropismo metastásico hacia el hígado es fundamental para identificar objetivos terapéuticos y mejorar los resultados de los pacientes.

El éxito de la colonización metastásica representa la culminación de una compleja cascada que va más allá de las propiedades intrínsecas de las células tumorales circulantes (CTC). Antes de que se produzca la siembra metastásica, los tumores primarios orquestan la formación de un nicho premetastásico (NPM), un microambiente receptivo que facilita el injerto y el crecimiento de las células tumorales diseminadas en sitios distantes^[5]. El NPM se caracteriza por múltiples características distintivas, que incluyen la inmunosupresión, la inflamación crónica, la remodelación de la matriz extracelular y las alteraciones vasculares^[6]. Entre estas, la angiogénesis y la remodelación vascular surgen como eventos tempranos particularmente críticos^[7]. La neovascularización mejorada no solo proporciona oxígeno y nutrientes esenciales, sino que también aumenta la permeabilidad vascular, lo que promueve el tráfico celular y el intercambio molecular dentro del nicho y permite la extravasación y la supervivencia de las células tumorales^[8],^[9]. Sin embargo, una pregunta fundamental sigue sin respuesta: ¿cómo transmiten los tumores primarios distantes señales para remodelar con precisión el parénquima hepático y el paisaje metabólico para respaldar estos cambios vasculares e inmunitarios?

La evidencia emergente sugiere que el microambiente metabólico hepático desempeña un papel decisivo en la formación del NPM. El hígado funciona como un centro metabólico central, y las alteraciones en el metabolismo de los hepatocitos pueden alterar drásticamente el secretoma local, influyendo así en el reclutamiento de células inmunitarias. Estudios recientes destacan a los neutrófilos asociados al tumor (NAT) como orquestadores clave del establecimiento del NPM. Estas células mieloides especializadas son reclutadas a los órganos diana a través de mecanismos complejos que involucran gradientes de quimiocinas y un aumento de la permeabilidad vascular^[10]–^[12]. Una vez localizados dentro del NPM incipiente, los NAT promueven la metástasis a través de la remodelación de la matriz (MMP-8/9), la angiogénesis (VEGF, FGF, IL-8), la inmunosupresión a través de la cooperación con otras células mieloides (TAM, MDSC)^[13] y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)^[14],^[15]. Sin embargo, los ejes de señalización intercelular ascendentes que vinculan los factores derivados del tumor primario con la reprogramación metabólica hepática y el posterior reclutamiento de neutrófilos siguen poco definidos.

KIAA1199, también conocido como proteína de unión al hialuronano que induce la migración celular (CEMIP)^[16], ha surgido como un regulador clave de la modulación inmunitaria y la evasión inmunitaria en el CCR^[16]–^[18]. Nuestros estudios previos establecieron que KIAA1199 está significativamente sobreexpresado en los tejidos de CCR y está fuertemente asociado con la invasión, la metástasis, la resistencia a la quimioterapia y los malos resultados clínicos^[19]–^[23]. Si bien se sabe que KIAA1199 facilita la invasión local, su capacidad para condicionar remotamente el nicho premetastásico en el hígado a través de mediadores secretados, como las vesículas extracelulares (VE), merece ser investigada.

En este trabajo, informamos sobre un subconjunto distinto de neutrófilos Egr1⁺ que emergen dentro del NPM hepático orquestado por el CCR con alta expresión de KIAA1199. Mecánicamente, desciframos una cascada de señalización en varios pasos en la que KIAA1199 impulsa la secreción de vesículas extracelulares (VE) ricas en Granulina (GRN) de las células de CCR. Tras la internalización por los hepatocitos, estos componentes funcionales inducen un subconjunto de hepatocitos funcionalmente reprogramados, caracterizados por una profunda reprogramación metabólica y la supresión de la señalización de PPARγ. Este cambio metabólico mejora directamente la expresión y secreción de SAA2. La SAA2 derivada de los hepatocitos se une a los receptores FPR2 en los neutrófilos residentes, activando la señalización PI3K-AKT que estabiliza un programa transcripcional impulsado por EGR1, lo que promueve una supervivencia prolongada y una mayor capacidad proangiogénica, lo que a su vez promueve la remodelación vascular dentro del NPM. Al definir el eje KIAA1199/GRN-PPARγ/SAA2-FPR2/EGR1 como un orquestador central del establecimiento del NPM, nuestro trabajo proporciona información mecanicista sobre cómo las células de CCR reprograman remotamente el microambiente metabólico e inmunitario hepático para respaldar la colonización metastásica. Además, identificamos la normalización metabólica a través de la activación de PPARγ como una posible estrategia terapéutica para interrumpir la formación del nicho metastásico hepático.

Resultados

La sobreexpresión de KIAA1199 establece un nicho premetastásico hepático que impulsa la metástasis de cáncer colorrectal en el hígado

Nuestros estudios previos demostraron que la expresión elevada de KIAA1199 es una característica del cáncer colorrectal (CCR) y está fuertemente asociada con un mayor riesgo de metástasis y un mal pronóstico^[19],^[20],^[24]. Validamos aún más estos hallazgos utilizando tanto los conjuntos de datos TCGA-CCR como nuestra cohorte clínica independiente (Fig. 1A–E, Fig. S1A–C). El análisis transcriptómico espacial proporcionó una confirmación adicional, revelando niveles significativamente más altos de KIAA1199 en los tejidos tumorales en comparación con los tejidos normales adyacentes, tanto en los tumores primarios de colon como en las metástasis hepáticas correspondientes (Fig. 1F). Estas validaciones de múltiples plataformas refuerzan colectivamente la solidez de nuestras observaciones anteriores. Nuestras investigaciones funcionales previas establecieron que los tumores primarios de CCR con alta expresión de KIAA1199 exhiben una mayor capacidad invasiva y potencial metastásico^[19],^[20]. En los últimos años, el nicho premetastásico (NPM) ha surgido como un contribuyente fundamental a la colonización metastásica^[6]. Por lo tanto, más allá de conferir una invasividad intrínseca a las células tumorales, investigamos si KIAA1199 contribuye a la progresión metastásica modulando el microambiente premetastásico hepático en la metástasis de cáncer colorrectal en el hígado (MCCR).

Para examinar sistemáticamente esta posibilidad, desarrollamos un modelo de ratón de doble tumor. Primero, se establecieron tumores ortotópicos utilizando células de CCR diseñadas para expresar niveles altos o bajos de KIAA1199. Cuando se estableció el tumor primario, pero antes de que ocurriera cualquier metástasis espontánea, introdujimos un modelo estandarizado de metástasis hepática mediante la inyección esplénica de células de CCR (Fig. 1G). Este enfoque nos permitió evaluar cómo la expresión de KIAA1199 en el tumor primario influye en la posterior colonización metastásica. Sorprendentemente, los ratones con tumores ortotópicos con baja expresión de KIAA1199 mostraron una carga metastásica limitada y una supervivencia prolongada, mientras que aquellos que portaban tumores con alta expresión de KIAA1199 exhibieron una colonización metastásica marcadamente mejorada y una supervivencia general reducida (Fig. 1H–M, Fig. S2A). Además, los experimentos de etiquetado fluorescente con células de CCR etiquetadas con mCherry/GFP demostraron que todas las lesiones hepáticas se originan a partir de las inyecciones intrasplénicas, no del tumor primario ortotópico (Fig. S2B). En conjunto, estos resultados demuestran que los tumores primarios de CCR con sobreexpresión de KIAA1199 promueven la formación de un nicho premetastásico funcional en el hígado, lo que facilita la MCCR.

La formación del nicho premetastásico se caracteriza por la infiltración de un subconjunto de neutrófilos Egr1⁺

Para dilucidar los mecanismos por los cuales la alta expresión de KIAA1199 en los tumores primarios de CCR remodela el microambiente hepático, establecimos modelos de ratón ortotópicos pareados con alta y baja expresión de KIAA1199. El análisis a los catorce días posteriores a la implantación, cuando no se detectaron metástasis por resonancia magnética, reveló un aumento significativo de los neutrófilos infiltrantes en el hígado en los ratones con alta expresión de KIAA1199 en comparación con los controles, lo que es consistente con nuestros hallazgos anteriores (Fig. 2A, B; Fig. S3A–E)^[22]. El análisis de secuenciación de ARN de una sola célula seguido de un análisis de agrupamiento no supervisado identificó un subconjunto distinto de neutrófilos, designado Neu-C2 (Fig. 2C; Fig. S4A–E). El análisis de la trayectoria de pseudotiempo posicionó a Neu-C2 en una etapa de diferenciación terminal, y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes reveló una regulación al alza significativa de los programas que gobiernan la adhesión celular, la angiogénesis y la regulación del ciclo celular (Fig. 2D, E), lo que indica colectivamente un fenotipo pro-metastásico especializado.

Para identificar los reguladores transcripcionales ascendentes de este subconjunto de neutrófilos, aplicamos pySCENIC (Inferencia y agrupamiento de redes regulatorias de una sola célula) para derivar los principales factores de transcripción (FT) vinculados a Neu-C2 e intersectarlos con los genes expresados diferencialmente (DEG) (Fig. S5A, B). Early Growth Response 1 (EGR1) surgió como un regulador clave, que se sobreexpresó específicamente en los neutrófilos infiltrantes en el hígado de los ratones con alta expresión de KIAA1199 (Fig. 2F; Fig. S5C, D). Para validar la importancia funcional de EGR1, realizamos experimentos de ganancia de función en células HL-60 diferenciadas (dHL60, una línea celular humana similar a los neutrófilos) y en sistemas de cocultivo (que contienen células de CCR, hepatocitos AML12 y neutrófilos), simulando el microambiente hepático donde los neutrófilos residen in vivo. La sobreexpresión de EGR1 en las células dHL-60 y la expresión de EGR1 impulsada por KIAA1199 en los neutrófilos recapitularon la firma transcriptómica de Neu-C2, lo que respalda su identificación como neutrófilos Egr1⁺ (Fig. S5E, F).

En estudios de validación adicionales, la acumulación de neutrófilos Egr1⁺ en el hígado aumentó significativamente en los ratones que portaban tumores con alta expresión de KIAA1199 y en pacientes con MCCR (Fig. 2G–I; Fig. S5G; Fig. S6A–F). En particular, en las lesiones metastásicas, los neutrófilos Egr1⁺ se localizaron predominantemente en las regiones peritumorales en lugar de en los núcleos tumorales y se superpusieron espacialmente con las áreas de angiogénesis activa (Fig. 2J, K)^[25]. Funcionalmente, el medio acondicionado de los neutrófilos Egr1⁺ promovió directamente la formación de tubos endoteliales in vitro (Fig. 2L; Fig. S6G)^[26]. En conjunto, estos datos demuestran que el CCR con alta expresión de KIAA1199 establece un nicho pro-metastásico en el hígado al reclutar y programar neutrófilos impulsados por EGR1, que a su vez facilitan la MCCR a través de una angiogénesis mejorada (Fig. 2M).

Los hepatocitos funcionalmente reprogramados orquestan el posicionamiento de los neutrófilos Egr1⁺ en la interfaz tumor-hígado a través del eje SAA2-FPR2

Para rastrear el origen de los neutrófilos Egr1⁺, realizamos un perfilado temporal y espacial sistemático en múltiples tejidos. Observamos que los neutrófilos Egr1⁺ se acumularon progresivamente específicamente en el hígado de los ratones que portaban tumores con sobreexpresión de KIAA1199, mientras que su frecuencia se mantuvo constantemente baja en todos los sitios periféricos, incluido el hueso, el bazo y la sangre periférica (Fig. 3A, B; Fig. S7A–C). Dada su condición de diferenciación terminal (Fig. 2D), estos datos sugieren que los neutrófilos Egr1⁺ probablemente se reprograman localmente en el hígado en lugar de reclutarse desde la circulación.

El análisis de la comunicación célula-célula reveló interacciones hepatocito-neutrófilo significativamente aumentadas en el grupo con alta expresión de KIAA1199 en comparación con los controles, acompañado de cambios notables en la composición de los grupos de hepatocitos (Fig. 2B; Fig. S8A). Estos hallazgos sugieren que las señales derivadas de los hepatocitos influyen en la conformación del fenotipo de los neutrófilos y respaldan un modelo de reprogramación in situ de neutrófilos Egr1⁺ impulsada por el hígado. En consonancia con las características espaciales y funcionales de los neutrófilos Egr1⁺, identificamos una subpoblación de hepatocitos distinta, denominada Hepa-C11, presente casi exclusivamente en ratones que portaban tumores de CRC ortotópicos con sobreexpresión de KIAA1199 (Fig. 3C; Fig. S8B–D). El análisis de la trayectoria de pseudotiempo posicionó este grupo en una etapa intermedia a lo largo de la trayectoria de desarrollo, mientras que el análisis de la variación del número de copias (CNV) reveló patrones de inestabilidad genómica característicos de un alto potencial maligno, lo que nos llevó a designar este grupo como "hepatocitos funcionalmente reprogramados" (Fig. S9A, B). Funcionalmente, los hepatocitos funcionalmente reprogramados exhibieron un perfil transcriptómico significativamente enriquecido en angiogénesis, adhesión celular y vías inmunorreguladoras, lo que refleja estrechamente las características pro-tumorales de los neutrófilos Egr1⁺ (Fig. 3D). El análisis de la interacción ligando-receptor identificó una fuerte señalización SAA2-FPR2 entre los hepatocitos funcionalmente reprogramados y los neutrófilos Egr1⁺ (Fig. S9C–G). Los análisis de transcriptómica espacial y de inmunofluorescencia multiplex de muestras de pacientes con CRLM revelaron que estas dos poblaciones celulares se localizaron de forma conjunta específicamente en la interfaz tumor-hígado, superponiéndose a las regiones que exhiben marcadores de transición epitelio-mesenquimal (EMT). Esta relación espacial se observó de forma consistente tanto en especímenes humanos de CRLM como en modelos de ratón (Fig. 3E–G, Fig. S9H, Fig. S10A–D).

Para validar la importancia funcional de esta interacción celular, co-cultivamos hepatocitos con células de CRC con sobreexpresión de KIAA1199, lo que condujo a una regulación al alza y secreción robustas de SAA2. Este fenómeno también se observó in vivo en modelos de CRC ortotópicos (Fig. S10E–I). Es importante destacar que el SAA2 recombinante fue suficiente para inducir la generación de neutrófilos Egr1⁺ en el hígado, tanto in vitro como in vivo, en lugar de en la sangre periférica, el bazo, los tumores primarios o los ganglios linfáticos. Mientras que el bloqueo farmacológico de FPR2 utilizando el antagonista selectivo de FPR2, WRW4, abolió este efecto, confirmando así la importancia funcional del eje SAA2-FPR2 en la promoción de la adquisición local del fenotipo de neutrófilos Egr1⁺ (Fig. 3H–J; Fig. S10J–M). En modelos de doble tumor, la inhibición de la señalización SAA2-FPR2 utilizando WRW4 redujo significativamente la metástasis hepática y prolongó la supervivencia, sin afectar el crecimiento del tumor primario ortotópico (Fig. 3K–O; Fig. S11A–D).

En conjunto, estos hallazgos demuestran que los hepatocitos funcionalmente reprogramados orquestan el posicionamiento y la activación fenotípica de los neutrófilos Egr1⁺ a través del eje de señalización SAA2-FPR2 en la interfaz tumor-hígado. Además, nuestros resultados identifican a FPR2 como un prometedor objetivo terapéutico para prevenir la metástasis del cáncer colorrectal en el hígado.

La granulina vesicular impulsada por KIAA1199 induce la reprogramación de los hepatocitos y la regulación al alza de SAA2 a través de la supresión de PPARγ

Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la regulación al alza de SAA2 en los hepatocitos funcionalmente reprogramados, realizamos un análisis transcriptómico exhaustivo con un perfil de expresión génica clasificado y revelamos una marcada supresión de la vía de señalización PPAR dentro de esta subpoblación específica de hepatocitos (Fig. 4A, B). Dado el papel central de los PPAR (PPARα, PPARβ, PPARγ) en la regulación metabólica hepática, realizamos un análisis metabolómico dirigido, que demostró un cambio significativo desde la síntesis/almacenamiento de lípidos hacia una vía metabólica asociada a la malignidad, incluido el aumento de la glucólisis y la glutaminólisis. Esta reprogramación metabólica respalda el aumento de la producción de energía y la adaptación al estrés, un sello distintivo de la transformación maligna (Fig. 4C). Entre los miembros de PPAR, PPARγ fue el más significativamente regulado a la baja en los hepatocitos funcionalmente reprogramados (Fig. 4D). Para investigar la relación funcional entre PPARγ y SAA2, activamos PPARγ utilizando rosiglitazona (Rog), un agonista selectivo. Esta intervención redujo significativamente la expresión y la secreción de proteínas de SAA2, lo que sugiere una relación reguladora negativa (Fig. 4E; Fig. S12A–C). Esta relación inversa se vio respaldada aún más por su colocalización espacial en el tejido hepático de CRLM y por los datos transcripcionales de los hepatocitos funcionalmente reprogramados (Fig. 4F).

Para determinar si PPARγ regula directamente la transcripción de SAA2, realizamos un análisis bioinformático utilizando UCSC Genome Browser y JASPAR, identificando dos motivos de unión a PPARγ conservados evolutivamente dentro de la región promotora de SAA2 (de –2000 a +100 pb) (Fig. 4G). Para probar la importancia funcional de estos sitios de unión, realizamos ensayos de reportero de luciferasa dual, que confirmaron que PPARγ suprime la actividad del promotor de SAA2. Específicamente, la sobreexpresión de PPARγ redujo significativamente la actividad de la luciferasa impulsada por el promotor de tipo salvaje, mientras que el constructo SAA2-MT2 (mutación en el sitio de unión 2) abolió esta represión. En contraste, SAA2-MT1 (mutante del sitio de unión 1) conservó la capacidad de respuesta a PPARγ, lo que indica que el sitio 2 es esencial para la inhibición transcripcional mediada por PPARγ (Fig. 4H). El ChIP-qPCR demostró además la unión directa de PPARγ al promotor de SAA2 en los hepatocitos, lo que confirma la especificidad de este eje regulador (Fig. 4I). Funcionalmente, la activación de PPARγ por rosiglitazona no solo suprimió la producción de SAA2, sino que también redujo la generación de neutrófilos Egr1⁺ in vitro e in vivo (Fig. 4J–M; Fig. S12D, E). Para evaluar el potencial terapéutico de la focalización de esta vía, tratamos modelos de CRC ortotópicos con rosiglitazona (Rog). Esta intervención atenuó significativamente la metástasis hepática impulsada por KIAA1199 y prolongó la supervivencia general (Fig. 4N–S; Fig. S12F).

Para descifrar el eje de señalización intercelular que conecta las células de CRC con alta expresión de KIAA1199 y los hepatocitos, realizamos análisis proteómicos y transcriptómicos integrados. Este enfoque multi-ómico implicó a KIAA1199 como un potente impulsor de la biogénesis y secreción de vesículas extracelulares (VE) (Fig. S13A). En consonancia con esto, la caracterización cuantitativa de las VE purificadas confirmó que la sobreexpresión de KIAA1199 aumenta significativamente la liberación de VE. El análisis de seguimiento de partículas (NTA) demostró un aumento marcado en la concentración de partículas en el grupo con alta expresión de KIAA1199 en comparación con el grupo con baja expresión (Fig. S13B), un hallazgo corroborado aún más por la abundancia elevada del marcador clave de la biogénesis de ESCRT, TSG101 (Fig. S13C). Morfológicamente, si bien las VE de ambos grupos mantuvieron un rango de tamaño exosómico estándar (30-150 nm), el grupo con alta expresión de KIAA1199 exhibió un ligero cambio hacia un diámetro promedio más pequeño, lo que posiblemente refleja una subpoblación distinta de vesículas secretadas preferentemente tras la inducción de KIAA1199. En última instancia, la internalización de estas VE derivadas de CRC con alta expresión de KIAA1199 por parte de los hepatocitos demostró ser esencial para inducir el fenotipo "funcionalmente reprogramado" (Fig. S13D, E). A través del perfilado de carga, identificamos la granulina (GRN) como un efector aguas abajo fundamental que se enriquece preferentemente en las VE inducidas por KIAA1199 (Fig. S13F–H). Sorprendentemente, estas VE cargadas de GRN fueron captadas de forma eficiente por los hepatocitos y fueron suficientes para recapitular la remodelación transcripcional y metabólica observada en los hepatocitos funcionalmente reprogramados (Fig. S13I–K).

En conjunto, nuestro estudio describe una cascada metastásica en la que KIAA1199 remodela el secretoma de las células de CRC, promoviendo la liberación de VE ricas en GRN. La captación de estas vesículas por los hepatocitos desencadena una reprogramación metabólica caracterizada por la supresión de PPARγ y la consiguiente regulación al alza de SAA2. Este eje de señalización fomenta en última instancia un microambiente pro-metastásico. Además, nuestros datos resaltan la prometedora perspectiva terapéutica del agonista de PPARγ, la rosiglitazona, que interrumpe eficazmente este eje KIAA1199-GRN-PPARγ-SAA2, normalizando así el metabolismo hepático y previniendo la formación del nicho pre-metastásico en CRLM.

Los neutrófilos Egr1⁺ derivados del hígado promueven la metástasis a través de una supervivencia prolongada y la secreción de VEGFA a través del circuito PI3K/AKT/EGR1

Para evaluar directamente la actividad pro-tumoral de los neutrófilos Egr1⁺, establecimos un modelo de metástasis funcional en el que coinyectamos neutrófilos Egr1⁺ con células de CRC mediante inyección intrasplénica (Fig. 5A). En comparación con los neutrófilos de control, los neutrófilos Egr1⁺ aceleraron significativamente la formación de CRLM y redujeron la supervivencia general (Fig. 5B–E; Fig. S14A). Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a esta actividad pro-metastásica mejorada, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), que reveló una activación significativa de las vías NF-κB, PI3K-AKT y MAPK en los neutrófilos Egr1⁺ (Fig. 5F). A través de un cribado sistemático de foscoproteómica de neutrófilos en el sistema de co-cultivo de KIAA1199, identificamos la señalización PI3K-AKT como la vía de respuesta primaria activada tras la interacción SAA2-FPR2 (Fig. 5G). En experimentos de seguimiento del tiempo, observamos que la proporción de neutrófilos Egr1⁺ aumentaba progresivamente en el cultivo, acompañado de una mayor expresión de Ki67 y una reducción de las firmas apoptóticas, lo que indica una supervivencia significativamente prolongada en comparación con los neutrófilos Egr1⁻ (Fig. 5H–J). Esta vida útil prolongada representa una ventaja funcional crítica, ya que los neutrófilos convencionales suelen sobrevivir solo entre 1 y 2 días. Además, los neutrófilos Egr1⁺ mostraron una expresión y secreción de VEGFA marcadamente aumentadas (Fig. 5K–N; Fig. S14B, C), y el bloqueo de VEGFA (mediante un anticuerpo neutralizante de VEGFA) perjudicó significativamente la actividad pro-angiogénica de los neutrófilos Egr1⁺ (Fig. S14D–F), lo que implica que VEGFA es un efector clave de su capacidad pro-angiogénica mejorada. Es importante destacar que la inhibición farmacológica de la señalización PI3K-AKT con wortmannin abolió tanto la ventaja de supervivencia como las funciones pro-angiogénicas de los neutrófilos Egr1⁺. Estos hallazgos confirman que los neutrófilos Egr1⁺ derivados del hígado, tras recibir señales SAA2-FPR2, prolongan su vida útil y promueven la angiogénesis a través del circuito PI3K/AKT/EGR1 (Fig. 5O–R).

En conjunto, estos hallazgos establecen un vínculo mecanicista por el cual los hepatocitos funcionalmente reprogramados orquestan la activación funcional de los neutrófilos Egr1⁺ a través del eje de señalización FPR2-PI3K/AKT/EGR1, impulsando así la CRLM a través de una supervivencia prolongada de los neutrófilos y una angiogénesis mejorada.

Los neutrófilos Egr1⁺ impulsan la angiogénesis para acelerar la CRLM mediada por KIAA1199

Nuestros estudios funcionales revelaron que los neutrófilos Egr1⁺ poseen una potente actividad pro-angiogénica que está relacionada mecánicamente con su función pro-metastásica (Fig. 6A, B). Para investigar esta relación in vivo, examinamos los patrones vasculares en modelos ortotópicos con sobreexpresión de KIAA1199. Estos análisis revelaron un aumento significativo de la neovascularización hepática que se localizaba espacialmente con la infiltración de neutrófilos Egr1⁺ (Fig. 6C). El mismo patrón, una angiogénesis mejorada con una mayor infiltración de neutrófilos Egr1⁺, se observó de forma consistente en ratones con CRLM impulsada por KIAA1199 y en especímenes humanos de CRLM. El análisis espacial cuantitativo demostró que ambas poblaciones celulares se localizaban predominantemente en la interfaz tumor-hígado en lugar de en las regiones intratumorales (Fig. 6D, E). Estas relaciones espaciales consistentes implican firmemente que los neutrófilos Egr1⁺ participan en la promoción de la CRLM dependiente de la angiogénesis.

Para evaluar directamente la importancia funcional de esta relación, recolectamos medios de cultivo condicionados de neutrófilos Egr1⁺ generados bajo múltiples condiciones experimentales (sistemas de cocultivo que contienen células CRC y hepatocitos AML12) y probamos sus efectos sobre la función de las células endoteliales. Estos medios de cultivo condicionados mejoraron significativamente la proliferación, migración y formación de túbulos de las células endoteliales en comparación con los medios de neutrófilos de control. De manera crucial, la intervención farmacológica en dos puntos clave de la vía que identificamos, ya sea activando PPARγ con rosiglitazona o bloqueando FPR2 con WRW4, abolió significativamente estos efectos proangiogénicos (Fig. 6F–N; Fig. S15A–D; Fig. S16A–J). A la luz de nuestros datos previos que demuestran que los neutrófilos Egr1⁺ regulan al alza y secretan VEGFA a través del circuito PI3K/AKT/EGR1 (Fig. 5), el bloqueo de VEGFA (utilizando un anticuerpo neutralizante de VEGFA) atenúa drásticamente la respuesta angiogénica resultante de los medios de cultivo condicionados de neutrófilos Egr1⁺ impulsados por KIAA1199 (Fig. S16K–M). Estos resultados respaldan un modelo integral en el que los hepatocitos funcionalmente reprogramados inducidos por KIAA1199 potencian el programa angiogénico de los neutrófilos Egr1⁺ a través del eje de señalización PPARγ/SAA2/FPR2, acelerando así la CRLM a través de una neovascularización mejorada en la interfaz tumor-hígado.

La firma KIAA1199-SAA2 permite una estratificación de riesgo precisa para la metástasis hepática del cáncer colorrectal

Para traducir nuestros conocimientos mecanicistas en biomarcadores clínicamente aplicables, recolectamos pares de tejidos tumorales primarios y muestras de suero correspondientes de pacientes con CRC en la Cohorte de Unión #1 (n = 94). Todas las muestras se obtuvieron durante la atención clínica de rutina. Se registraron las variables demográficas, incluido el edad y el sexo, en el momento de la recolección de la muestra, pero no se utilizaron como covariables en los análisis posteriores. El análisis de correlación demostró que los niveles séricos de KIAA1199 reflejan con precisión la expresión intertumoral (r de Pearson = 0,79, p < 0,001), lo que establece su validez como un biomarcador sustituto (Fig. S17A). Coherente con nuestra hipótesis, los niveles séricos de KIAA1199 se correlacionaron positivamente con las concentraciones séricas de SAA2 (Fig. 7A). Es importante destacar que ambos marcadores estaban significativamente elevados en pacientes con metástasis hepáticas en comparación con los casos no metastásicos (Fig. 7B). Además, los niveles altos de KIAA1199 en suero se asociaron con un mayor riesgo de CRLM (Fig. 7C), en línea con nuestra observación anterior de que la expresión intratumoral de KIAA1199 predice el potencial metastásico. De manera similar, los niveles elevados de SAA2 se asociaron de forma independiente con un mayor riesgo de metástasis (Fig. 7D). En particular, los pacientes con una expresión alta concurrente de KIAA1199 y SAA2 exhibieron un riesgo sustancialmente mayor de desarrollar metástasis hepáticas en comparación con los pacientes con una expresión alta de solo uno de los marcadores (Fig. 7E), lo que subraya el valor clínico de estos dos factores como predictores combinados de CRLM. Con base en estos hallazgos, desarrollamos un modelo predictivo combinado KIAA1199-SAA2 para la estratificación de riesgos. En el análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC), el modelo combinado superó consistentemente tanto a KIAA1199 solo como a SAA2 solo en la predicción de metástasis hepáticas (Fig. 7F; Fig. S17B). El análisis de la curva de decisión confirmó además que el modelo combinado proporcionó un mayor beneficio clínico neto en un amplio rango de probabilidades de umbral (Fig. 7G). Para facilitar la implementación clínica, desarrollamos un nomograma que incorpora ambos biomarcadores para estimar la probabilidad de CRLM a los 6, 12 y 24 meses (Fig. 7H). El modelo demostró una excelente calibración, con probabilidades predichas que coincidían estrechamente con los resultados observados. La validación prospectiva en la Cohorte de Unión #2 (n = 5), con un seguimiento de imagen longitudinal, confirmó el poder predictivo del modelo (Fig. 7I). La validación externa en una cohorte de Unión #3 independiente (n = 70) estableció aún más la solidez y la reproducibilidad del modelo en diversas poblaciones de pacientes (Fig. 7J).

En conjunto, estos resultados establecen un modelo predictivo KIAA1199-SAA2 estable y reproducible con un fuerte rendimiento para la estratificación del riesgo de CRLM en múltiples cohortes independientes. Al proporcionar un marco clínicamente práctico para identificar a los pacientes de alto riesgo que pueden beneficiarse de una vigilancia intensificada y una intervención temprana, este modelo representa una vía prometedora para la traducción clínica de nuestros hallazgos mecanicistas.

La sobreexpresión de KIAA1199 establece un nicho premetastásico hepático que impulsa la metástasis hepática del cáncer colorrectal

Nuestros estudios previos demostraron que la expresión elevada de KIAA1199 es una característica del cáncer colorrectal (CRC) y está fuertemente asociada con un mayor riesgo de metástasis y un mal pronóstico ^[19], ^[20], ^[24]. Validamos aún más estos hallazgos utilizando tanto los conjuntos de datos TCGA-CRC como nuestra cohorte clínica independiente (Fig. 1A-E, Fig. S1A-C). El análisis transcriptómico espacial proporcionó una confirmación adicional, revelando niveles significativamente más altos de KIAA1199 en los tejidos tumorales en comparación con los tejidos normales adyacentes, tanto en los tumores de colon primarios como en las metástasis hepáticas correspondientes (Fig. 1F). Estas validaciones multiplataforma refuerzan colectivamente la solidez de nuestras observaciones anteriores. Nuestras investigaciones funcionales previas establecieron que los tumores primarios de CRC con alta expresión de KIAA1199 exhiben una mayor capacidad invasiva y potencial organo-metastásico ^[19], ^[20]. En los últimos años, el nicho premetastásico (NPM) ha surgido como un contribuyente fundamental a la colonización metastásica ^[6]. Por lo tanto, más allá de conferir una capacidad invasiva intrínseca a las células tumorales, investigamos si KIAA1199 contribuye a la progresión metastásica modulando el microambiente premetastásico hepático en la metástasis hepática del cáncer colorrectal (CRLM).

Para examinar sistemáticamente esta posibilidad, desarrollamos un modelo de ratón de doble tumor. Primero, se establecieron tumores ortotópicos utilizando células de CRC diseñadas para expresar niveles altos o bajos de KIAA1199. Cuando se estableció el tumor primario, pero antes de que ocurriera cualquier metástasis espontánea, introdujimos un modelo estandarizado de metástasis hepática mediante la inyección esplénica de células de CRC (Fig. 1G). Este enfoque nos permitió evaluar cómo la expresión de KIAA1199 en el tumor primario influye en la posterior colonización metastásica. Sorprendentemente, los ratones con tumores ortotópicos con bajo contenido de KIAA1199 mostraron una carga metastásica limitada y una supervivencia prolongada, mientras que aquellos que portaban tumores con alto contenido de KIAA1199 exhibieron una colonización metastásica marcadamente mejorada y una supervivencia general reducida (Fig. 1H-M, Fig. S2A). Además, los experimentos de etiquetado fluorescente con células de CRC etiquetadas con mCherry/GFP demostraron que todas las lesiones hepáticas se originan a partir de las inyecciones intrasplénicas, no del tumor primario ortotópico (Fig. S2B). En conjunto, estos resultados demuestran que los tumores primarios de CRC con sobreexpresión de KIAA1199 promueven la formación de un nicho premetastásico funcional en el hígado, facilitando así la CRLM.

La formación del nicho premetastásico se caracteriza por la infiltración de un subconjunto de neutrófilos Egr1⁺

Para dilucidar los mecanismos por los cuales la alta expresión de KIAA1199 en los tumores primarios de CRC remodela el microambiente hepático, establecimos pares de modelos de ratón ortotópicos con alta y baja expresión de KIAA1199. El análisis a los catorce días posteriores a la implantación, cuando no se detectaron metástasis por resonancia magnética, reveló un aumento significativo de los neutrófilos que infiltran el hígado en los ratones con alto contenido de KIAA1199 en comparación con los controles, lo que es consistente con nuestros hallazgos anteriores (Fig. 2A, B; Fig. S3A-E) ^[22]. El análisis de secuenciación de ARN de una sola célula seguido de un análisis de agrupamiento no supervisado identificó un subconjunto de neutrófilos distinto, designado Neu-C2 (Fig. 2C; Fig. S4A-E). El análisis de la trayectoria de pseudotiempo posicionó a Neu-C2 en una etapa de diferenciación terminal, y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes reveló una regulación al alza significativa de los programas que gobiernan la adhesión celular, la angiogénesis y la regulación del ciclo celular (Fig. 2D, E), lo que indica colectivamente un fenotipo pro-metastásico especializado.

Para identificar los reguladores transcripcionales ascendentes de este subconjunto de neutrófilos, aplicamos pySCENIC (Inferencia y agrupamiento de redes regulatorias de una sola célula) para derivar los principales factores de transcripción (FT) vinculados a Neu-C2 e intersectarlos con los genes expresados diferencialmente (DEG) (Fig. S5A, B). Early Growth Response 1 (EGR1) surgió como un regulador clave, que se sobreexpresó específicamente en los neutrófilos que infiltran el hígado de los ratones con alto contenido de KIAA1199 (Fig. 2F; Fig. S5C, D). Para validar la importancia funcional de EGR1, realizamos experimentos de ganancia de función en células HL-60 diferenciadas (dHL60, una línea celular similar a los neutrófilos humanos) y en sistemas de cocultivo (que contienen células de CRC, hepatocitos AML12 y neutrófilos), simulando el microambiente hepático donde los neutrófilos residen in vivo. La sobreexpresión de EGR1 en las células dHL-60 y la expresión de EGR1 impulsada por KIAA1199 en los neutrófilos recapitularon la firma transcriptómica de Neu-C2, lo que respalda su identificación como neutrófilos Egr1⁺ (Fig. S5E, F).

En estudios de validación adicionales, la acumulación de neutrófilos Egr1⁺ en el hígado aumentó significativamente en los ratones que portaban tumores con alta expresión de KIAA1199 y en pacientes con CRLM (Fig. 2G-I; Fig. S5G; Fig. S6A-F). En particular, en las lesiones metastásicas, los neutrófilos Egr1⁺ se localizaron predominantemente en las regiones peritumorales en lugar de en los núcleos tumorales y se superpusieron espacialmente con las áreas de angiogénesis activa (Fig. 2J, K) ^[25]. Funcionalmente, el medio de cultivo condicionado de los neutrófilos Egr1⁺ promovió directamente la formación de túbulos endoteliales in vitro (Fig. 2L; Fig. S6G) ^[26]. En conjunto, estos datos demuestran que los tumores de CRC con alta expresión de KIAA1199 establecen un nicho pro-metastásico en el hígado al reclutar y programar neutrófilos impulsados por EGR1, que a su vez facilitan la CRLM a través de una angiogénesis mejorada (Fig. 2M).

Los hepatocitos funcionalmente reprogramados orquestan el posicionamiento de los neutrófilos Egr1⁺ en la interfaz tumor-hígado a través del eje SAA2-FPR2

Para rastrear el origen de los neutrófilos Egr1⁺, realizamos un perfilado temporal y espacial sistemático en múltiples tejidos. Observamos que los neutrófilos Egr1⁺ se acumularon progresivamente específicamente en el hígado de los ratones que portaban tumores con sobreexpresión de KIAA1199, mientras que su frecuencia se mantuvo constantemente baja en todos los sitios periféricos, incluido el hueso, el bazo y la sangre periférica (Fig. 3A, B; Fig. S7A-C). Dado su estado de diferenciación terminal (Fig. 2D), estos datos sugieren que los neutrófilos Egr1⁺ probablemente se reprograman localmente en el hígado en lugar de reclutarse desde la circulación.

El análisis de la comunicación célula-célula reveló interacciones hepatocito-neutrófilo significativamente mejoradas en el grupo con alta expresión de KIAA1199 en comparación con los controles, acompañado de cambios notables en la composición de los grupos de hepatocitos (Fig. 2B; Fig. S8A). Estos hallazgos sugieren que las señales derivadas de los hepatocitos influyen en la conformación del fenotipo de los neutrófilos y respaldan un modelo de reprogramación in situ de neutrófilos Egr1⁺ impulsada por el hígado. En consonancia con las características espaciales y funcionales de los neutrófilos Egr1⁺, identificamos una subpoblación de hepatocitos distinta, Hepa-C11, presente casi exclusivamente en ratones que portaban tumores de CRC ortotópicos con sobreexpresión de KIAA1199 (Fig. 3C; Fig. S8B–D). El análisis de la trayectoria de pseudotiempo posicionó este grupo en una etapa intermedia a lo largo de la trayectoria de desarrollo, mientras que el análisis de la variación del número de copias (CNV) reveló patrones de inestabilidad genómica característicos de un alto potencial maligno, lo que nos llevó a designar este grupo como "hepatocitos funcionalmente reprogramados" (Fig. S9A, B). Funcionalmente, los hepatocitos funcionalmente reprogramados exhibieron un perfil transcriptómico significativamente enriquecido en angiogénesis, adhesión celular y vías inmunorreguladoras, lo que refleja estrechamente las características pro-tumorales de los neutrófilos Egr1⁺ (Fig. 3D). El análisis de la interacción ligando-receptor identificó una fuerte señalización SAA2–FPR2 entre los hepatocitos funcionalmente reprogramados y los neutrófilos Egr1⁺ (Fig. S9C–G). Los análisis de transcriptómica espacial y de inmunofluorescencia multiplex de muestras de pacientes con CRLM revelaron que estas dos poblaciones celulares se localizaron de forma conjunta específicamente en la interfaz tumor-hígado, superponiéndose a las regiones que exhiben marcadores de transición epitelio-mesenquimal (EMT). Esta relación espacial se observó de forma consistente tanto en especímenes humanos de CRLM como en modelos de ratón (Fig. 3E–G, Fig. S9H, Fig. S10A–D).

Para validar la importancia funcional de esta interacción celular, co-cultivamos hepatocitos con células de CRC con sobreexpresión de KIAA1199, lo que condujo a una regulación al alza y secreción robustas de SAA2. Este fenómeno también se observó in vivo en modelos de CRC ortotópicos (Fig. S10E–I). Es importante destacar que el SAA2 recombinante fue suficiente para inducir la generación de neutrófilos Egr1⁺ en el hígado, tanto in vitro como in vivo, en lugar de en la sangre periférica, el bazo, los tumores primarios o los ganglios linfáticos. Mientras que el bloqueo farmacológico de FPR2 utilizando el antagonista selectivo de FPR2, WRW4, abolió este efecto, confirmando así la importancia funcional del eje SAA2–FPR2 en la promoción de la adquisición local del fenotipo de neutrófilos Egr1⁺ (Fig. 3H–J; Fig. S10J–M). En modelos de tumores duales, la inhibición de la señalización SAA2–FPR2 utilizando WRW4 redujo significativamente la metástasis hepática y prolongó la supervivencia, sin afectar el crecimiento del tumor primario ortotópico (Fig. 3K–O; Fig. S11A–D).

En conjunto, estos hallazgos demuestran que los hepatocitos funcionalmente reprogramados orquestan el posicionamiento y la activación fenotípica de los neutrófilos Egr1⁺ a través del eje de señalización SAA2–FPR2 en la interfaz tumor-hígado. Además, nuestros resultados identifican a FPR2 como un prometedor objetivo terapéutico para prevenir la metástasis del cáncer colorrectal en el hígado.

La granulina vesicular impulsada por KIAA1199 induce la reprogramación de los hepatocitos y la regulación al alza de SAA2 a través de la supresión de PPARγ

Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la regulación al alza de SAA2 en los hepatocitos funcionalmente reprogramados, realizamos un análisis transcriptómico exhaustivo con perfiles de expresión génica clasificados y revelamos una marcada supresión de la vía de señalización PPAR dentro de esta subpoblación específica de hepatocitos (Fig. 4A, B). Dado el papel central de los PPAR (PPARα, PPARβ, PPARγ) en la regulación metabólica hepática, realizamos un análisis metabolómico dirigido, que demostró un cambio significativo de la síntesis/almacenamiento de lípidos hacia una vía metabólica asociada a la malignidad, incluido el aumento de la glucólisis y la glutaminólisis. Esta reprogramación metabólica respalda el aumento de la producción de energía y la adaptación al estrés, un sello distintivo de la transformación maligna (Fig. 4C). Entre los miembros de PPAR, PPARγ fue el que se reguló a la baja de forma más significativa en los hepatocitos funcionalmente reprogramados (Fig. 4D). Para investigar la relación funcional entre PPARγ y SAA2, activamos PPARγ utilizando rosiglitazona (Rog), un agonista selectivo. Esta intervención redujo significativamente la expresión y la secreción de proteínas de SAA2, lo que sugiere una relación de regulación negativa (Fig. 4E; Fig. S12A–C). Esta relación inversa se respaldó aún más mediante su colocalización espacial en el tejido hepático de CRLM y mediante datos transcripcionales de hepatocitos funcionalmente reprogramados (Fig. 4F).

Para determinar si PPARγ regula directamente la transcripción de SAA2, realizamos un análisis bioinformático utilizando UCSC Genome Browser y JASPAR, identificando dos motivos de unión a PPARγ conservados evolutivamente dentro de la región promotora de SAA2 (de –2000 a +100 pb) (Fig. 4G). Para probar la importancia funcional de estos sitios de unión, realizamos ensayos de reportero de luciferasa dual, que confirmaron que PPARγ suprime la actividad del promotor de SAA2. Específicamente, la sobreexpresión de PPARγ redujo significativamente la actividad de la luciferasa impulsada por el promotor de tipo salvaje, mientras que el constructo SAA2-MT2 (mutación en el sitio de unión 2) abolió esta represión. Por el contrario, SAA2-MT1 (mutante del sitio de unión 1) conservó la capacidad de respuesta a PPARγ, lo que indica que el sitio 2 es esencial para la inhibición transcripcional mediada por PPARγ (Fig. 4H). El ChIP-qPCR demostró además la unión directa de PPARγ al promotor de SAA2 en los hepatocitos, lo que confirma la especificidad de este eje regulador (Fig. 4I). Funcionalmente, la activación de PPARγ por rosiglitazona no solo suprimió la producción de SAA2, sino que también redujo la generación de neutrófilos Egr1⁺ in vitro e in vivo (Fig. 4J–M; Fig. S12D, E). Para evaluar el potencial terapéutico de la focalización de esta vía, tratamos modelos de CRC ortotópicos con rosiglitazona (Rog). Esta intervención atenuó significativamente la metástasis hepática impulsada por KIAA1199 y prolongó la supervivencia general (Fig. 4N–S; Fig. S12F).

Para descifrar el eje de señalización intercelular que conecta las células de CRC con alta expresión de KIAA1199 y los hepatocitos, realizamos análisis proteómicos y transcriptómicos integrados. Este enfoque multi-ómico implicó a KIAA1199 como un potente impulsor de la biogénesis y secreción de vesículas extracelulares (VE) (Fig. S13A). En consonancia con esto, la caracterización cuantitativa de las VE purificadas confirmó que la sobreexpresión de KIAA1199 mejora significativamente la liberación de VE. El análisis de seguimiento de partículas (NTA) demostró un aumento marcado en la concentración de partículas en el grupo con alta expresión de KIAA1199 en comparación con el grupo con baja expresión (Fig. S13B), un hallazgo que se corroboró aún más mediante la abundancia elevada del marcador clave de la biogénesis de ESCRT, TSG101 (Fig. S13C). Morfológicamente, si bien las VE de ambos grupos mantuvieron un rango de tamaño exosómico estándar (30-150 nm), el grupo con alta expresión de KIAA1199 exhibió un ligero cambio hacia un diámetro medio más pequeño, lo que posiblemente refleja una subpoblación distinta de vesículas que se secretan preferentemente tras la inducción de KIAA1199. En última instancia, la internalización de estas VE derivadas de CRC con alta expresión de KIAA1199 por parte de los hepatocitos demostró ser esencial para inducir el fenotipo "funcionalmente reprogramado" (Fig. S13D, E). A través del perfilado de carga, identificamos la granulina (GRN) como un efector descendente fundamental que se enriquece preferentemente en las VE inducidas por KIAA1199 (Fig. S13F–H). Sorprendentemente, estas VE cargadas de GRN fueron captadas de forma eficiente por los hepatocitos y fueron suficientes para recapitular la remodelación transcripcional y metabólica observada en los hepatocitos funcionalmente reprogramados (Fig. S13I–K).

En conjunto, nuestro estudio describe una cascada metastásica en la que KIAA1199 remodela el secretoma de las células de CRC, promoviendo la liberación de VE ricas en GRN. La captación de estas vesículas por los hepatocitos desencadena una reprogramación metabólica caracterizada por la supresión de PPARγ y la consiguiente regulación al alza de SAA2. Este eje de señalización fomenta en última instancia un microambiente pro-metastásico. Además, nuestros datos resaltan la prometedora perspectiva terapéutica del agonista de PPARγ, la rosiglitazona, que interrumpe eficazmente este eje KIAA1199-GRN-PPARγ-SAA2, normalizando así el metabolismo hepático y previniendo la formación del nicho pre-metastásico en CRLM.

Los neutrófilos Egr1⁺ derivados del hígado promueven la metástasis a través de una supervivencia prolongada y la secreción de VEGFA a través del circuito PI3K/AKT/EGR1

Para evaluar directamente la actividad pro-tumoral de los neutrófilos Egr1⁺, establecimos un modelo de metástasis funcional en el que coinyectamos neutrófilos Egr1⁺ con células de CRC mediante inyección intrasplénica (Fig. 5A). En comparación con los neutrófilos de control, los neutrófilos Egr1⁺ aceleraron significativamente la formación de CRLM y redujeron la supervivencia general (Fig. 5B–E; Fig. S14A). Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a esta actividad pro-metastásica mejorada, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), que reveló una activación significativa de las vías NF-κB, PI3K–AKT y MAPK en los neutrófilos Egr1⁺ (Fig. 5F). A través de un cribado sistemático de fosfoproteómica de neutrófilos en el sistema de co-cultivo de KIAA1199, identificamos la señalización PI3K-AKT como la vía de respuesta primaria activada tras la interacción SAA2-FPR2 (Fig. 5G). En experimentos de seguimiento del tiempo, observamos que la proporción de neutrófilos Egr1⁺ aumentaba progresivamente en el cultivo, acompañado de una mayor expresión de Ki67 y una reducción de las firmas apoptóticas, lo que indica una supervivencia significativamente prolongada en comparación con los neutrófilos Egr1⁻ (Fig. 5H–J). Esta vida útil prolongada representa una ventaja funcional crítica, ya que los neutrófilos convencionales suelen sobrevivir solo entre 1 y 2 días. Además, los neutrófilos Egr1⁺ mostraron una expresión y secreción de VEGFA marcadamente aumentadas (Fig. 5K–N; Fig. S14B, C), y el bloqueo de VEGFA (mediante un anticuerpo neutralizante de VEGFA) perjudicó significativamente la actividad pro-angiogénica de los neutrófilos Egr1⁺ (Fig. S14D–F), lo que implica que VEGFA es un efector clave de su capacidad pro-angiogénica mejorada. Es importante destacar que la inhibición farmacológica de la señalización PI3K–AKT con wortmannin abolió tanto la ventaja de supervivencia como las funciones pro-angiogénicas de los neutrófilos Egr1⁺. Estos hallazgos confirman que los neutrófilos Egr1⁺ derivados del hígado, tras recibir señales SAA2–FPR2, prolongan su vida útil y promueven la angiogénesis a través del circuito PI3K/AKT/EGR1 (Fig. 5O–R).

En conjunto, estos hallazgos establecen un vínculo mecanicista por el cual los hepatocitos funcionalmente reprogramados orquestan la activación funcional de los neutrófilos Egr1⁺ a través del eje de señalización FPR2–PI3K/AKT/EGR1, impulsando así la CRLM a través de una supervivencia prolongada de los neutrófilos y una angiogénesis mejorada.

Los neutrófilos Egr1⁺ impulsan la angiogénesis para acelerar la CRLM mediada por KIAA1199

Nuestros estudios funcionales revelaron que los neutrófilos Egr1⁺ poseen una potente actividad pro-angiogénica que está relacionada mecánicamente con su función pro-metastásica (Fig. 6A, B). Para investigar esta relación in vivo, examinamos los patrones vasculares en modelos ortotópicos con sobreexpresión de KIAA1199. Estos análisis revelaron un aumento significativo de la neovascularización hepática que se localizaba espacialmente con la infiltración de neutrófilos Egr1⁺ (Fig. 6C). El mismo patrón (angiogénesis mejorada con una mayor infiltración de neutrófilos Egr1⁺) se observó de forma consistente en ratones con CRLM impulsada por KIAA1199 y en especímenes humanos de CRLM. El análisis espacial cuantitativo demostró que ambas poblaciones celulares se localizaban predominantemente en la interfaz tumor-hígado en lugar de en las regiones intratumorales (Fig. 6D, E). Estas relaciones espaciales consistentes implican firmemente que los neutrófilos Egr1⁺ participan en la promoción de la CRLM dependiente de la angiogénesis.

Para evaluar directamente la importancia funcional de esta relación, recolectamos medios de cultivo condicionados de neutrófilos Egr1⁺ generados en múltiples condiciones experimentales (sistemas de cocultivo que contienen células CRC y hepatocitos AML12) y probamos sus efectos sobre la función de las células endoteliales. Estos medios de cultivo condicionados mejoraron significativamente la proliferación, migración y formación de túbulos de las células endoteliales en comparación con los medios de neutrófilos de control. De manera crucial, la intervención farmacológica en dos puntos clave de la vía que identificamos —ya sea activando PPARγ con rosiglitazona o bloqueando FPR2 con WRW4— abolió significativamente estos efectos proangiogénicos (Fig. 6F–N; Fig. S15A–D; Fig. S16A–J). A la luz de nuestros datos previos que demuestran que los neutrófilos Egr1⁺ regulan al alza y secretan VEGFA a través de la vía PI3K/AKT/EGR1 (Fig. 5), el bloqueo de VEGFA (utilizando un anticuerpo neutralizante de VEGFA) atenúa drásticamente la respuesta angiogénica resultante de los medios de cultivo condicionados de neutrófilos Egr1⁺ impulsados por KIAA1199 (Fig. S16K–M). Estos resultados respaldan un modelo integral en el que los hepatocitos funcionalmente reprogramados inducidos por KIAA1199 potencian el programa angiogénico de los neutrófilos Egr1⁺ a través del eje de señalización PPARγ/SAA2/FPR2, acelerando así la CRLM a través de una neovascularización mejorada en la interfaz tumor-hígado.

La firma KIAA1199-SAA2 permite una estratificación de riesgo precisa para la metástasis hepática del cáncer colorrectal

Para traducir nuestros conocimientos mecanicistas en biomarcadores clínicamente aplicables, recolectamos pares de tejidos tumorales primarios y muestras de suero correspondientes de pacientes con CRC en la Cohorte de Unión #1 (n = 94). Todas las muestras se obtuvieron durante la atención clínica de rutina. Se registraron las variables demográficas, incluido el edad y el sexo, en el momento de la recolección de la muestra, pero no se utilizaron como covariables en los análisis posteriores. El análisis de correlación demostró que los niveles séricos de KIAA1199 reflejan con precisión la expresión intertumoral (r de Pearson = 0,79, p < 0,001), lo que establece su validez como un biomarcador sustituto (Fig. S17A). Coherente con nuestra hipótesis, los niveles séricos de KIAA1199 se correlacionaron positivamente con las concentraciones séricas de SAA2 (Fig. 7A). Es importante destacar que ambos marcadores estuvieron significativamente elevados en pacientes con metástasis hepática en comparación con los casos no metastásicos (Fig. 7B). Además, los niveles altos de KIAA1199 en suero se asociaron con un mayor riesgo de CRLM (Fig. 7C), en línea con nuestra observación anterior de que la expresión intratumoral de KIAA1199 predice el potencial metastásico. De manera similar, los niveles elevados de SAA2 se asociaron de forma independiente con un mayor riesgo de metástasis (Fig. 7D). En particular, los pacientes con una expresión alta concurrente de KIAA1199 y SAA2 exhibieron un riesgo sustancialmente mayor de desarrollar metástasis hepática en comparación con los pacientes con una expresión alta de solo uno de los marcadores (Fig. 7E), lo que subraya el valor clínico de estos dos factores como predictores combinados de CRLM. Con base en estos hallazgos, desarrollamos un modelo predictivo combinado KIAA1199-SAA2 para la estratificación de riesgos. En el análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC), el modelo combinado superó consistentemente tanto a KIAA1199 solo como a SAA2 solo en la predicción de metástasis hepática (Fig. 7F; Fig. S17B). El análisis de la curva de decisión confirmó además que el modelo combinado proporcionó un mayor beneficio clínico neto en un amplio rango de probabilidades de umbral (Fig. 7G). Para facilitar la implementación clínica, desarrollamos un nomograma que incorpora ambos biomarcadores para estimar la probabilidad de CRLM a los 6, 12 y 24 meses (Fig. 7H). El modelo demostró una excelente calibración, con probabilidades predichas que coincidían estrechamente con los resultados observados. La validación prospectiva en la Cohorte de Unión #2 (n = 5), con un seguimiento de imagen longitudinal, confirmó el poder predictivo del modelo (Fig. 7I). La validación externa en una Cohorte de Unión #3 independiente (n = 70) estableció aún más la solidez y reproducibilidad del modelo en diversas poblaciones de pacientes (Fig. 7J).

En conjunto, estos resultados establecen un modelo predictivo KIAA1199-SAA2 estable y reproducible con un fuerte rendimiento para la estratificación del riesgo de CRLM en múltiples cohortes independientes. Al proporcionar un marco clínicamente práctico para identificar a los pacientes de alto riesgo que pueden beneficiarse de una vigilancia intensificada y una intervención temprana, este modelo representa una vía prometedora para la traducción clínica de nuestros hallazgos mecanicistas.

Discusión

En este estudio, identificamos una población distinta de neutrófilos Egr1⁺ que emergen específicamente dentro del microambiente premetastásico del hígado, moldeado por tumores colorrectales con alta expresión de KIAA1199. A través de la integración de firmas genéticas diferenciales con el análisis de inferencia de factores de transcripción, identificamos EGR1 como el regulador dominante de este subconjunto, ya que su sobreexpresión en los neutrófilos fue suficiente para recapitular los programas transcripcionales y funcionales distintivos de estas células. Estos hallazgos establecen a EGR1 como un coordinador central del reprogramación transcripcional de los neutrófilos y, a su vez, definen a los neutrófilos Egr1⁺ como una entidad funcional discreta. EGR1, un gen prototípico de respuesta temprana inducido rápidamente por diversos estímulos, incluidos los factores de crecimiento y las citocinas, tiene funciones establecidas en la proliferación, diferenciación y biología vascular^[27]. En consecuencia, se expresa con frecuencia en los tejidos tumorales, particularmente en las células tumorales metastásicas o altamente proliferativas, como también se observó en nuestros análisis de inmunofluorescencia multicolor^[28],^[29].

Aunque tradicionalmente se ha considerado que los neutrófilos son efectores terminalmente diferenciados y de corta duración, los estudios recientes de células individuales han revelado su notable plasticidad transcripcional a lo largo de una trayectoria continua de "neutrófilos"^[30]. EGR1 es un factor de transcripción pleiotrópico que a menudo se regula al alza en las células cancerosas proliferantes. Dentro de este marco, la expresión observada de EGR1 en las células de CRC metastásicas puede reflejar el estado altamente proliferativo e invasivo dentro del nicho metastásico. Nuestros datos posicionan a EGR1 como un regulador maestro que impulsa a los neutrófilos hacia un estado proangiogénico y pro-metastásico especializado. Este hallazgo se alinea con trabajos previos que muestran que EGR1 funciona como un regulador transcripcional activo en los neutrófilos asociados al tumor en el cáncer de pulmón de células no pequeñas^[31]. Nuestros resultados amplían este concepto al demostrar que los neutrófilos Egr1⁺ en el nicho premetastásico del hígado exhiben una supervivencia prolongada y una mayor capacidad proangiogénica, lo que vincula directamente este fenotipo con la progresión metastásica. Proponemos que EGR1 funciona de manera análoga a FOXP3 en las células T reguladoras, un regulador maestro que reprograma fundamentalmente la identidad y la función celular^[32]. Esta perspectiva desafía el paradigma de larga data de los neutrófilos como efectores homogéneos y de corta duración y los redefine como especialistas impulsados por factores de transcripción con diversos estados funcionales.

Un avance conceptual clave de nuestro estudio es la elucidación del origen ascendente de los neutrófilos Egr1⁺. En contraste con el paradigma predominante de que los neutrófilos asociados al tumor se reclutan predominantemente de la circulación a través de los gradientes de quimioquinas^[33],^[34], demostramos que los neutrófilos Egr1⁺ surgen in situ dentro del parénquima hepático inflamado. Específicamente, identificamos un subconjunto de hepatocitos funcionalmente reprogramados impulsados por vesículas extracelulares derivadas de KIAA1199 que suprimen la señalización de PPARγ y regulan al alza SAA2, "educando" así a los neutrófilos locales en un estado transcripcional impulsado por EGR1. Este hallazgo representa un cambio conceptual significativo con respecto a los informes anteriores que enfatizan el reclutamiento sistémico de neutrófilos^[35],^[36], y en cambio destaca la interacción hepatocito-neutrófilo local como el impulsor decisivo de la especialización de los neutrófilos. Mecánicamente, PPARγ, caracterizado inicialmente como un regulador del metabolismo de los lípidos, funciona como un orquestador crítico de la homeostasis metabólica e inflamatoria en los hepatocitos^[37]. Al actuar como un factor de transcripción represor, PPARγ restringe los programas proinflamatorios y mantiene a los hepatocitos en un estado quiescente. Nuestros datos revelan que PPARγ reprime directamente la transcripción de SAA2, estableciendo un eje regulador que vincula la reprogramación metabólica de los hepatocitos con la reprogramación de los neutrófilos. Dentro de este contexto, SAA2 emerge como un puente molecular fundamental entre el metabolismo de los hepatocitos y el microambiente inflamatorio. Estudios previos demostraron que los agonistas de PPARγ suprimen la expresión de SAA, mientras que la inhibición de PPARγ mejora su liberación^[37]–^[39]. Nuestros resultados amplían este paradigma al establecer las consecuencias funcionales de esta regulación, específicamente, la generación de neutrófilos Egr1⁺ que impulsan la formación del nicho premetastásico.

Una característica clave de nuestro estudio es la caracterización espacial de los neutrófilos Egr1⁺ dentro del microambiente hepático premetastásico. Utilizando inmunofluorescencia multiplexa y transcriptómica espacialmente resuelta, observamos un enriquecimiento y colocalización sorprendentes de hepatocitos funcionalmente reprogramados y neutrófilos Egr1⁺ en la interfaz tumor-parénquima en metástasis hepáticas establecidas. Este hallazgo indica que estas células funcionan no solo en la iniciación de la metástasis, sino también como efectores pioneros en el borde invasivo una vez que se establece la metástasis. Esta organización espacial es funcionalmente significativa, ya que ambas poblaciones celulares expresan programas transcripcionales relacionados con la transición epitelial-mesenquimal, la angiogénesis y el remodelado de la matriz extracelular. Y los neutrófilos Egr1⁺ desempeñan un papel primario e independiente en el impulso del remodelado proangiogénico dentro del microambiente tumoral. Nuestros hallazgos son conceptualmente distintos de los informes anteriores que enfatizaron la proteína amiloide A derivada de los hepatocitos como un mediador sistémico de la formación del nicho premetastásico^[40] o que describieron una "zona invasiva" enriquecida en características de remodelado estromal e inmunitario^[35]. Sin embargo, esos estudios se centraron principalmente en la secreción sistémica de SAA dependiente de STAT3 sin resolver las interacciones celulares específicas en el frente invasivo. Por el contrario, nuestros datos revelan un mecanismo localizado en el que los hepatocitos funcionalmente reprogramados suprimen la señalización de PPARγ y regulan al alza la expresión de SAA2, reprogramando directamente a los neutrófilos adyacentes en un estado proangiogénico Egr1⁺. Este eje hepatocito-neutrófilo local integra la reprogramación metabólica y la inflamación, proporcionando una explicación mecanicista de cómo se establece el microambiente de la CRLM en el borde invasivo. Las implicaciones traslacionales de estos hallazgos son sustanciales. Nuestros resultados sugieren que los niveles circulatorios de SAA2 y KIAA1199 pueden servir como biomarcadores predictivos del riesgo de CRLM. Además, las intervenciones terapéuticas dirigidas a este eje, en particular la vía PPARγ-SAA2-neutrófilos Egr1⁺, podrían proporcionar estrategias para la prevención de la metástasis al interrumpir este nicho microambiental especializado. Es importante destacar que, si bien la rosiglitazona es un agonista de PPARγ bien establecido, su uso sistémico se ha asociado con problemas de seguridad cardiovascular, lo que ha llevado a restricciones en la prescripción en algunos países^[41],^[42]. En este estudio, la rosiglitazona se empleó únicamente como una herramienta mecanicista a corto plazo, administrada a una dosis baja (10 μg/kg/día) durante un período limitado. Los estudios futuros deberían explorar estrategias más seguras y dirigidas a los hepatocitos para modular la actividad de PPARγ, con el fin de mantener la relevancia terapéutica y garantizar un margen de seguridad adecuado.

La diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) y la hiperglucemia se reconocen como factores de riesgo tanto para la incidencia como para la progresión del CCRC^[43]. En nuestro estudio, el agonista del PPARγ, la rosiglitazona, bloqueó eficazmente la supresión mediada por KIAA1199 de la señalización del PPARγ y atenuó la metástasis hepática del CCRC (CRLM), lo que subraya el potencial terapéutico de dirigir esta vía. Este hallazgo tiene implicaciones intrigantes para comprender la relación entre la enfermedad metabólica y la progresión del cáncer. Los estudios epidemiológicos respaldan esta idea, mostrando que los pacientes con DMT2 tienen un mayor riesgo de CCRC, mientras que la evidencia mecanística indica que la hiperglucemia promueve la CRLM movilizando monocitos a través del eje CCL3-CCR1^[44]. Por el contrario, los regímenes basados en metformina se han asociado con mejores resultados en pacientes con CRLM^[45], lo que refuerza aún más el concepto de que la enfermedad metabólica interactúa con la reprogramación inmuno-metabólica hepática. Aunque nuestro conjunto de datos clínicos no reveló una asociación estadísticamente significativa entre la diabetes y la CRLM (probablemente debido al tamaño limitado de la muestra y a la compleja interacción de las comorbilidades metabólicas), los mecanismos biológicos y las señales clínicas preliminares justifican una mayor investigación. La modulación de la actividad del PPARγ en pacientes diabéticos puede proporcionar beneficios duales: restaurar la homeostasis glucémica sistémica al tiempo que se interrumpe el eje hepatocito-neutrófilo que favorece la CRLM. Esta perspectiva destaca un paradigma emergente en la oncología de precisión: el potencial de reutilizar fármacos metabólicos establecidos basándose en la comprensión mecanística de la intersección entre el metabolismo y la biología del cáncer. Al vincular los agonistas del PPARγ con la interrupción del nicho premetastásico, nuestros hallazgos sugieren enfoques para prevenir la metástasis en pacientes con CCRC de alto riesgo.

Nuestro estudio revela una población distinta de neutrófilos Egr1⁺ que emerge preferentemente dentro del microambiente hepático premetastásico orquestado por el CCRC con alta expresión de KIAA1199 y delimita un eje de señalización metastásica integral que conecta la biología del CCRC primario con el inmunometabolismo hepático (Fig. 7K). Mecanísticamente, identificamos que KIAA1199 no es simplemente un marcador de agresividad, sino un regulador maestro de la comunicación vesicular, impulsando la secreción de vesículas extracelulares ricas en Granulina (GRN). La captación de estas vesículas por los hepatocitos induce un estado funcionalmente reprogramado caracterizado por la supresión de la señalización del PPARγ, la remodelación metabólica y la robusta regulación al alza de la expresión y secreción de SAA2. Esta SAA2 derivada de los hepatocitos actúa como una señal paracrina crítica, activando la cascada FPR2-PI3K-AKT para educar una población única de neutrófilos Egr1⁺. Estos neutrófilos, dotados de una supervivencia prolongada y capacidades proangiogénicas, se co-localizan con hepatocitos funcionalmente reprogramados para iniciar el nicho premetastásico. Conceptualmente, este trabajo desafía la visión tradicional de los neutrófilos como una población homogénea de células efectoras de vida corta reclutadas pasivamente desde la circulación y, en cambio, los posiciona como especialistas impulsados por factores de transcripción, moldeados por las señales metabólicas locales. Al definir el eje “KIAA1199-GRN-PPARγ/SAA2-FPR2-EGR1”, proporcionamos una justificación mecanística para la reutilización de moduladores metabólicos, como las tiazolidinedionas (p. ej., rosiglitazona), para normalizar el microambiente hepático y prevenir la siembra metastásica. En última instancia, este trabajo integra la biología de las células tumorales, el metabolismo de los hepatocitos y la inmunidad innata en un marco unificado, ofreciendo tanto una firma de estratificación de riesgos como objetivos terapéuticos viables para interceptar la progresión letal de la metástasis hepática del cáncer colorrectal.

Métodos

Todos los estudios en humanos se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por el Comité de Ética Médica de la Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong (Número de Aprobación: UHCT20210271-01). Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Gestión y Uso de Animales de Laboratorio del Centro Provincial de Control de Enfermedades de Hubei (Número de Aprobación: 202410259).

Pacientes y preparación de muestras de tejido

Las muestras de tejido de cáncer colorrectal (CCRC) humano se recolectaron prospectivamente de pacientes con diagnósticos confirmados histopatológicamente que recibieron tratamiento en el Hospital Union, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, entre septiembre de 2020 y agosto de 2025. Se registraron el sexo y la edad del paciente en el momento de la inclusión y se basaron en la autoinformación. Se registró la información sobre el sexo y el género, pero no se incluyó como variables en el análisis, ya que el estudio se centró en los mecanismos moleculares y celulares en lugar de en las diferencias específicas de sexo o género. No se proporcionó ninguna compensación económica a los participantes del estudio. Todos los participantes proporcionaron un consentimiento informado por escrito después de recibir una explicación completa del protocolo del estudio. Las muestras residuales se almacenan en el Hospital Union, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, y están disponibles al autor correspondiente previa solicitud razonable, sujeto a la aprobación ética.

Para el procesamiento de tejido hepático de ratón, se recolectaron muestras de los grupos de control y experimentales en condiciones estériles, se picaron mecánicamente en fragmentos de aproximadamente 1 mm³ y se disociaron enzimáticamente en suspensiones de células individuales utilizando colagenasa IV (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) y DNasa I (0,1 mg/mL; Sigma-Aldrich) en DMEM sin suero a 37 °C durante 30 minutos con agitación suave. Las suspensiones celulares resultantes se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm, se sometieron a lisis de eritrocitos utilizando el tampón ACK y se lavaron dos veces en PBS suplementado con 0,04% de BSA. Se evaluó la viabilidad celular mediante la exclusión de azul de tripan, con un umbral de ≥90% de viabilidad requerido para las aplicaciones de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). De acuerdo con el protocolo de ética animal aprobado, la carga tumoral máxima permitida no superó el 10% del peso corporal y se monitorearon de cerca los ratones para detectar signos de angustia. En todos los experimentos, no se superó el tamaño/carga tumoral máxima y se sacrificaron los animales en puntos finales humanitarios predefinidos. Los criterios para la eutanasia incluyeron: (i) carga tumoral que supera el 10% del peso corporal; (ii) pérdida de peso >20% en comparación con el valor basal; (iii) incapacidad para acceder a alimentos o agua; (iv) signos de angustia grave (p. ej., encorvamiento, pelaje erizado, letargo, hipotermia); (v) dificultad para respirar; (vi) sangrado, ulceración o infección persistente en el sitio quirúrgico; (vii) dolor intenso que no se alivia con analgésicos; o (viii) cualquier otra condición evaluada por personal capacitado de acuerdo con el protocolo aprobado. Se consideró el sexo en el diseño del estudio; para evitar una variabilidad adicional asociada con poblaciones de sexos mixtos, solo se utilizaron ratonas en este estudio.

Construcción de bibliotecas y secuenciación

Las bibliotecas de secuenciación de ARN unicelular se generaron utilizando el “Sistema de análisis unicelular BD Rhapsody” siguiendo los protocolos del fabricante. Brevemente, las células individuales se cargaron en cartuchos BD Rhapsody para el emparejamiento de cuentas y células, el etiquetado y la síntesis de ADN complementario. Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de ADN complementario BD Rhapsody y el kit de amplificación de transcriptoma completo de ARNm (WTA). Las bibliotecas finales se secuenciaron en el Illumina NovaSeq 6000 (lectura emparejada, 150 pb).

Procesamiento y análisis de datos

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando el “canal de procesamiento BD Rhapsody (plataforma Seven Bridges Genomics)”. Las lecturas se alinearon con el genoma del ratón (mm10) y se generaron matrices de genes y células. El control de calidad, la agrupación, la visualización (UMAP; tSNE) y los análisis de expresión génica diferencial se realizaron utilizando Seurat (v4.4.0) en R. Se excluyeron las células con 6000 genes o >10% de contenido mitocondrial. Los genes expresados diferencialmente (DEG) se identificaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (P ajustada < 0,05, |log₂FC| ≥ 0,25) y se realizaron análisis de enriquecimiento funcional utilizando clusterProfiler (v4.12.6).

Validación utilizando datos de secuenciación de ARN unicelular y transcriptómica espacial disponibles públicamente

Se descargaron y procesaron conjuntos de datos de secuenciación de ARN unicelular ^[26] y conjuntos de datos de transcriptómica espacial ^[25] disponibles públicamente de metástasis hepáticas del cáncer colorrectal (CRLM) y tumores colorrectales primarios correspondientes. Los datos de secuenciación sin procesar se reanalizaron utilizando el canal estándar en Seurat. Los datos se sometieron a control de calidad, normalización (método LogNormalize), reducción de dimensionalidad (PCA) y agrupación (algoritmo de Louvain). La anotación de tipos de células se realizó en función de los genes marcadores canónicos, y se compararon y visualizaron las diferencias en la composición de los tipos de células o los perfiles de expresión génica entre las muestras metastásicas y primarias utilizando la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) o la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP). Se identificaron las regiones tumorales en función de la histopatología (imágenes de tinción de H&E) y los gráficos de características espaciales, y se visualizó la distribución espacial de la expresión del gen objetivo (p. ej., KIAA1199) utilizando mapas de calor espaciales.

Análisis de trayectoria de pseudotiempo

El análisis de trayectoria de pseudotiempo se realizó utilizando Monocle (v2.3.2) en R para inferir las trayectorias de diferenciación celular entre los subgrupos de neutrófilos y hepatocitos. Las células se ordenaron a lo largo de las trayectorias de pseudotiempo inferidas en función de los genes variables identificados. La progresión del pseudotiempo se visualizó utilizando gráficos de trayectoria anotados con subgrupos de células.

Análisis de la red reguladora de factores de transcripción

Las redes reguladoras de factores de transcripción (TF) unicelulares se infirieron utilizando pySCENIC (v0.11.2) en Python. Los datos de recuento sin procesar se utilizaron como entrada para la inferencia de la red reguladora de genes utilizando GENIE3, seguida del análisis de enriquecimiento de motivos cis-reguladores utilizando RcisTarget con la base de datos proporcionada (base de datos de motivos mm10). Las actividades del regulón TF se calcularon con AUCell. Se generó un mapa de calor de la actividad del regulón para visualizar la actividad del TF en los subgrupos de neutrófilos, destacando los posibles factores de transcripción reguladores maestros.

Análisis de comunicación entre células

El análisis de comunicación entre células se realizó utilizando CellChat (v1.6.1) en R. Se utilizaron datos de expresión unicelular normalizados de Seurat como entrada. Se aplicaron las bases de datos de interacción ligando-receptor predeterminadas de CellChat para el ratón (CellChatDB.mouse). Se calcularon las probabilidades de comunicación entre los tipos o subgrupos de células identificados en función de los niveles de expresión de los pares de ligandos y receptores conocidos. Las interacciones ligando-receptor significativas se visualizaron utilizando diagramas de red y mapas de calor. Se analizaron y se identificaron aún más las vías de señalización de comunicación diferencial entre los grupos de control y tratamiento en función de la significación estadística (p < 0,05).

Análisis de variación del número de copias unicelular (CNV)

Los perfiles de variación del número de copias unicelular (CNV) se infirieron utilizando el paquete R inferCNV (v1.20.0). Brevemente, se importaron los datos de expresión de ARN unicelular normalizados de Seurat, y se establecieron las células no tumorales (p. ej., células inmunitarias o del estroma) como células de referencia. Se realizaron estimaciones de CNV en las regiones cromosómicas utilizando los parámetros predeterminados. Los resultados se visualizan como gráficos de violín que muestran las señales de CNV relativas en las poblaciones de células, lo que facilita la identificación de células malignas y la evaluación de la heterogeneidad tumoral.

Cultivo celular y reactivos

Las líneas celulares de cáncer colorrectal murino MC38 (Cat# CL-0972) y CT26 (Cat# CL-0071), la línea celular de hepatocitos murinos AML12 (Cat# CL-0602), la línea celular de endotelio murino SVEC4-10 (Cat# CL-0221), las células de endotelio de cordón umbilical humano (HUVEC, Cat# CL-0675) y la línea celular mieloide humana HL-60 (Cat# CL-0110) se obtuvieron de Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, China). La autenticación de la línea celular se realizó mediante el perfilado de repeticiones en tándem cortas (STR) y todas las líneas se probaron de forma rutinaria para detectar la contaminación por micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza).

Las células se mantuvieron en medio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM, Cat# PM150210, Procell) o en medio RPMI-1640 (Cat# PM150110, Procell), suplementados con 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado térmicamente (Cat# 164210, Procell) y 1% de solución de penicilina-estreptomicina (Cat# PB180120, Procell) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO₂. Las células HL-60 se diferenciaron en células similares a neutrófilos mediante tratamiento con 1,3% de DMSO durante 5 días, y la diferenciación se confirmó mediante la expresión de CD11b y la evaluación morfológica.

Se utilizaron los siguientes reactivos: WRW4 (antagonista de FPR2, Cat# HY-P1119), rosiglitazona (agonista de PPARγ, Cat# HY-14600), wortmannina (inhibidor de PI3K, Cat# HY-10197) y alcohol tribromoetílico (anestésico, Cat# HY-B1372) de MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, EE. UU.); proteína recombinante de ratón SAA2 (rSAA2, Cat# RPB795Mu01) y proteína recombinante humana SAA2 (hrSAA2, Cat# RPB795Hu01) de Cloud-Clone Corp. (Wuhan, China). Se proporciona información detallada sobre los anticuerpos utilizados en este estudio en la Tabla Suplementaria 1.

Modelos de cáncer colorrectal ortotópico y metástasis hepática en ratones

Se anestesiaron ratones BALB/c o C57BL/6 de seis semanas de edad (Changsheng Biotechnology Co., Ltd., Liaoning, China) mediante inyección intraperitoneal de alcohol tribromoetílico. Para establecer el modelo de cáncer colorrectal ortotópico, se inyectaron aproximadamente 1 × 10⁶ células de cáncer colorrectal suspendidas en 50 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, Cat# PB180327, Procell, China) en la capa submucosa del ciego (el día 14, antes de la metástasis visible, los ratones se sometieron a una exploración por resonancia magnética. La imagen se realizó en un sistema Bruker BioSpec sin agentes de contraste. Se utilizaron secuencias ponderadas en T2 para una detección óptima de las lesiones. Todas las imágenes fueron evaluadas de forma independiente por tres radiólogos experimentados, cegados a los grupos experimentales, para garantizar un análisis objetivo). Siete días después, para simular la metástasis hepática, se inyectaron 5 × 10⁶ células de cáncer colorrectal suspendidas en 100 μL de PBS en el bazo (o se coinyectaron directamente con neutrófilos Egr1⁺ en una proporción de 1:1, con cada tipo de célula administrado a 2,5 × 10⁶ células). El bazo se extirpó quirúrgicamente 15 minutos después de la inyección y se suturó la pared abdominal. Se administró analgesia postoperatoria y cuidados de apoyo. Se controló regularmente el crecimiento tumoral y se sacrificaron los ratones en puntos temporales predeterminados para evaluar la carga tumoral primaria y la extensión de las metástasis hepáticas. Los ratones se mantuvieron en condiciones SPF con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas a 22 ± 2 °C y una humedad relativa del 50-60%, con acceso libre a alimentos y agua. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Gestión y Uso de Animales de Laboratorio del Centro Provincial de Control y Prevención de Enfermedades de Hubei (Número de aprobación: 202410259).

Aislamiento de neutrófilos hepáticos

Se anestesiaron los ratones y se perfundió a través de la vena porta con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar el hígado. El hígado se extirpó rápidamente, se picó y se disoció suavemente a través de un tamiz celular de 70 μm para obtener una suspensión de células individuales. Se lisaron los glóbulos rojos utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos (Cat# C3702, Beyotime, China). Las células restantes se lavaron dos veces con PBS y se centrifugaron a 1000 × g durante 10 minutos para recoger el sedimento celular.

Las células se resuspendieron en un tampón para clasificación celular mediante fluorescencia (FACS), compuesto por PBS suplementado con 0,5% de suero fetal bovino (SFB) y 2 mM de EDTA (Cat# PB180620, Procell, China). A continuación, se aislaron los neutrófilos hepáticos utilizando el kit de aislamiento de neutrófilos de ratón MojoSort™ (Cat# 480058, BioLegend, San Diego, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Los neutrófilos purificados se utilizaron para análisis posteriores.

Análisis por citometría de flujo

Aproximadamente 1 × 10⁶ células se lavaron una vez con tampón FACS. A continuación, las células se incubaron con una mezcla adecuada de anticuerpos conjugados con fluorocromos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se centrifugaron a 300 × g durante 5 minutos cada vez. Finalmente, las células se resuspendieron en 100 μL de tampón FACS. El análisis por citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo (Beckman Coulter). Para cada muestra, se adquirieron un mínimo de 2 × 10⁴ eventos. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (versión 10).

Inmunohistoquímica (IHQ)

El tejido fresco de hígado de ratón y el tejido tumoral colorrectal ortotópico se fijaron en un 4% de paraformaldehído (Cat# P0099, Beyotime, China) durante la noche, se deshidrataron a través de una serie de etanol graduado, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm de espesor. Las secciones de tejido se desparafinaron con xileno, se rehidrataron a través de una serie de etanol graduado y se sometieron a recuperación de antígenos mediante calentamiento en microondas en un tampón de citrato de sodio (pH 6,0). La actividad peroxidasa endógena se eliminó utilizando peróxido de hidrógeno al 3%, seguido de bloqueo de la unión inespecífica con albúmina sérica bovina (BSA) al 5%. A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La inmunorreactividad se visualizó utilizando el cromógeno DAB y los núcleos se contrateñeron con hematoxilina. Las láminas se montaron y se observaron bajo un microscopio óptico.

Co-inmunoprecipitación (Co-IP) y análisis de Western blot

Las células o las muestras de tejido se lisaron utilizando un tampón RIPA (Cat# P0013B, Beyotime, China) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Cat# ST505, Beyotime, China) para extraer la proteína total. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Cat# P0012S, Beyotime, China). Para la co-inmunoprecipitación, cantidades iguales de lisados de proteínas se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo específico del objetivo o con un control de IgG de isotipo coincidente bajo una suave agitación. Al día siguiente, se añadieron cuentas magnéticas de proteína A/G (Cat# HY-K0202, MedChemExpress, EE. UU.) y se incubaron durante 2-4 horas a 4 °C. Las cuentas se recogieron utilizando un soporte magnético y se lavaron tres veces con PBS (5 minutos por lavado). Las proteínas unidas se eluyeron hirviendo las cuentas en un tampón de carga SDS durante 5 minutos.

Para el Western blot, cantidades iguales de muestras de proteínas se sometieron a SDS-PAGE (Cat# PG112, Epizyme Biotech, Shanghái, China) y se transfirieron a membranas de PVDF (Cat# ISEQ00010, Millipore, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con leche seca descremada al 5% o albúmina sérica bovina (BSA) en un tampón TBST y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con el sistema de imagen ChemiDoc (Bio-Rad, EE. UU.) y las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

Ensayo de reportero de luciferasa y ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Se identificaron dos posibles sitios de unión a PPAR-γ dentro de la región promotora de Saa2 utilizando la base de datos en línea JASPAR (https://jaspar.genereg.net/). La secuencia promotora de interés se clonó en un plásmido de reportero de luciferasa (GENE CREATE, Wuhan, China) y se transfectó en las células objetivo. Después de 48 horas de transfección, las células se lisaron y la actividad de la luciferasa se midió utilizando el sistema de ensayo de reportero Dual-Luciferase® (Promega, EE. UU.), normalizando la actividad de la luciferasa de luciérnaga a la actividad de la luciferasa de Renilla.

Para los ensayos de ChIP, se procesaron aproximadamente 1 × 10⁷ células utilizando un kit comercial de ChIP (Cat# P2078, Beyotime, China) según las instrucciones del fabricante para evaluar la unión directa de los factores de transcripción a la región promotora. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron durante la noche con cuentas magnéticas de proteína A/G conjugadas con anticuerpos anti-PPAR-γ, utilizando IgG normal como control negativo. Los complejos de cromatina inmunoprecipitados se lavaron, se eluyeron y se sometieron a una retro-reticulación. Los fragmentos de ADN recuperados se analizaron mediante PCR cuantitativa (qPCR) para evaluar el enriquecimiento de la región promotora, normalizado con la cromatina de entrada.

Infección lentiviral y transfección con plásmidos

Las células se sembraron en placas de 6 pocillos e se infectaron con partículas lentivirales a una confluencia de aproximadamente el 50%. Después de 12 horas de incubación, el medio de cultivo se reemplazó con medio completo fresco y las células se mantuvieron durante 48 horas adicionales antes del procesamiento posterior. Se generaron líneas celulares de cáncer colorrectal (CRC) estables con sobreexpresión de KIAA1199, silenciamiento de KIAA1199 y los vectores de control correspondientes mediante transducción lentiviral seguida de selección con puromicina, con la concentración y la duración aplicadas según las instrucciones del fabricante^[18]. Las partículas lentivirales se produjeron utilizando un sistema de empaquetamiento estándar de Genecopoeia (Guangzhou, China). La eficiencia de la expresión o el silenciamiento estable se validaron mediante PCR cuantitativa e inmunoblotting. Las nuevas líneas celulares estables están disponibles para el autor correspondiente a cambio de una solicitud razonable.

Para la transfección con plásmidos, las células se sembraron para alcanzar una confluencia del 60-70%. La transfección se realizó utilizando el reactivo Lipofectamine™ 2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se recogieron para aplicaciones posteriores, como Western blot, qPCR o ensayos funcionales. Se proporciona información detallada sobre la secuencia en las tablas suplementarias 1 y 3. Se puede obtener información adicional del autor correspondiente a cambio de una solicitud razonable.

Ensayos CCK-8, de curación de heridas, de transmigración y de formación de túbulos

Se midió la proliferación celular utilizando el kit de recuento de células-8 (Cat# C0037, Beyotime, China). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se añadió el reactivo CCK-8 en los puntos temporales indicados. Después de la incubación durante 1-2 horas, se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Para los ensayos de curación de heridas, se rasgaron monocapas de células en contacto con la punta de un pipeta estéril. Después de lavar con PBS, las células se cultivaron en un medio libre de suero y se observó el cierre de la herida a las 0 y 24 horas.

Los ensayos de transmigración se realizaron utilizando insertos Transwell de tamaño de poro de 8,0 μm (Corning, EE. UU.). Las células suspendidas en un medio libre de suero se añadieron a la cámara superior, mientras que el medio que contenía un 10% de FBS se colocó en la cámara inferior. Después de 24 horas, las células transmigradas se fijaron, se tiñeron y se contaron.

Para los ensayos de formación de túbulos, se sembraron células HUVEC o SVEC4-10 en placas de 96 pocillos recubiertas con Matrigel y se incubaron durante 4-6 horas. Las estructuras similares a túbulos se observaron y se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

Aislamiento de vesículas extracelulares (VE)

Las VE enriquecidas con exosomas se aislaron del medio acondicionado utilizando el kit de aislamiento de exosomas mejorado BeyoExo™ para medios de cultivo celular (Beyotime Biotechnology, China; Cat. No. C3622), un método de precipitación basado en polímeros, adhiriéndose estrictamente al protocolo del fabricante. Brevemente, las células se cultivaron en un medio suplementado con suero agotado de exosomas o en un medio libre de suero para evitar la contaminación con vesículas exógenas. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se sometieron a una centrifugación gradual para eliminar las células intactas y los restos celulares. Los sobrenadantes aclarados se pasaron posteriormente a través de un filtro de 0,22 μm, se incubaron con el reactivo de precipitación durante la noche a 4 °C y se centrifugaron (10 000 × g, 4 °C, 30 min) para recuperar los gránulos de VE. Los gránulos resultantes se resuspendieron en PBS estéril para aplicaciones estructurales y funcionales posteriores.

Etiquetado con PKH26 para ensayos de captación de VE

Para el seguimiento por fluorescencia, las VE purificadas se etiquetaron utilizando el kit de etiquetado y seguimiento de exosomas BeyoExo™ (PKH26) (Beyotime Biotechnology, China; Cat. No. C3637). Brevemente, las VE se incubaron con la solución de trabajo de PKH26 durante 1-5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción de etiquetado se detuvo inmediatamente utilizando la solución de extinción proporcionada. Es fundamental que, para distinguir la captación de VE de los artefactos del tinte libre, las VE etiquetadas se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para eliminar el tinte no unido antes de la incubación con las células receptoras.

Perfilado proteómico y transcriptómico

Se realizó un análisis proteómico mediante espectrometría de masas con adquisición independiente de datos (DIA), con tres réplicas biológicas por grupo (n = 3). Las proteínas se extrajeron utilizando el tampón SDT, se digirieron con tripsina mediante el método FASP y los péptidos se desalaron, se enriquecieron con estándares iRT y se analizaron en un sistema nano-UHPLC Vanquish Neo acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Astral (Thermo Fisher Scientific). Los escaneos MS1 se adquirieron en el rango m/z 380–980 a una resolución de 240.000, y los espectros MS2 se recolectaron utilizando 299 ventanas DIA (2 m/z) con HCD a 25 eV. Los datos se buscaron en el proteoma de referencia UniProt utilizando tripsina con hasta un corte erróneo, cisteína carbamidometilada como modificación fija, oxidación (M) y acetilación N-terminal de proteínas como modificaciones variables, y FDR < 1% a nivel de péptidos y proteínas.

Análisis transcriptómico

Se realizó un perfilado transcriptómico mediante secuenciación masiva de ARN (bulk RNA sequencing) de los correspondientes gránulos celulares. Tras un riguroso control de calidad, las lecturas de secuenciación se alinearon con el genoma de referencia y la expresión a nivel de gen se cuantificó y normalizó utilizando flujos de trabajo bioinformáticos estándar. Se realizó un análisis de expresión génica diferencial para identificar transcritos significativamente alterados entre las condiciones.

Análisis estadístico de los datos ómicos

Para los conjuntos de datos proteómicos y transcriptómicos, las pruebas estadísticas para la abundancia o expresión diferencial incluyeron la corrección para comparaciones múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Para facilitar la interpretación biológica, se realizaron análisis de enriquecimiento funcional, incluidos el análisis de Gene Ontology (GO), el análisis de la vía KEGG y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), en las listas de proteínas y genes regulados diferencialmente identificados bajo el marco de significancia corregido.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R (versión 4.2.2) y GraphPad Prism (versión 9.0). Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó la prueba t de Student cuando los datos siguieron una distribución normal con varianza igual; de lo contrario, se aplicó la prueba de rango-suma de Wilcoxon. Para las comparaciones entre tres o más grupos, se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) de un factor si se cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de la varianza; de lo contrario, se empleó la prueba de Kruskal-Wallis. La prueba de chi-cuadrado se utilizó para comparar variables categóricas entre los grupos. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres réplicas biológicas independientes. Los datos continuos se presentan como media ± desviación estándar (DE), a menos que se especifique lo contrario. Los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos, con la siguiente notación: *P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Pacientes y preparación de muestras de tejido

Las muestras de tejido de cáncer colorrectal humano (CCR) se recolectaron prospectivamente de pacientes con diagnósticos histopatológicos confirmados que recibieron tratamiento en el Hospital Union, Facultad de Medicina Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong entre septiembre de 2020 y agosto de 2025. Se registraron el sexo y la edad de los pacientes al momento de su inclusión y se basaron en la autoinformación. Se registró la información sobre el sexo y el género, pero no se incluyó como variables en el análisis, ya que el estudio se centró en los mecanismos moleculares y celulares en lugar de en las diferencias específicas de sexo o género. No se proporcionó ninguna compensación económica a los participantes del estudio. Todos los participantes proporcionaron un consentimiento informado por escrito después de recibir una explicación completa del protocolo del estudio. Las muestras residuales se almacenan en el Hospital Union, Facultad de Medicina Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong y están disponibles al autor correspondiente previa solicitud razonable, sujeto a la aprobación ética.

Para el procesamiento del tejido hepático de ratón, las muestras de los grupos de control y experimentales se recolectaron en condiciones estériles, se picaron mecánicamente en fragmentos de aproximadamente 1 mm³ y se disociaron enzimáticamente en suspensiones de células individuales utilizando colagenasa IV (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) y DNasa I (0,1 mg/mL; Sigma-Aldrich) en DMEM sin suero a 37 °C durante 30 minutos con agitación suave. Las suspensiones celulares resultantes se filtraron a través de tamices celulares de 70 μm, se sometieron a lisis de eritrocitos utilizando el tampón ACK y se lavaron dos veces en PBS suplementado con 0,04% de BSA. Se evaluó la viabilidad celular mediante la exclusión de azul de tripan, con un umbral de ≥ 90% de viabilidad requerido para las aplicaciones posteriores de secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq). De acuerdo con el protocolo de ética animal aprobado, la carga tumoral máxima permitida no superó el 10% del peso corporal y se monitorearon de cerca los ratones para detectar signos de angustia. En todos los experimentos, no se superó el tamaño/carga tumoral máxima y los animales fueron sacrificados en puntos finales humanitarios predefinidos. Los criterios para el sacrificio incluyeron: (i) carga tumoral que supera el 10% del peso corporal; (ii) pérdida de peso > 20% en comparación con la línea de base; (iii) incapacidad para acceder a alimentos o agua; (iv) signos de angustia grave (por ejemplo, encorvamiento, pelaje erizado, letargo, hipotermia); (v) dificultad para respirar; (vi) sangrado, ulceración o infección persistente en el sitio quirúrgico; (vii) dolor intenso que no se alivia con analgésicos; o (viii) cualquier otra condición evaluada por personal capacitado de acuerdo con el protocolo aprobado. Se consideró el sexo en el diseño del estudio; para evitar una variabilidad adicional asociada con poblaciones de sexos mixtos, solo se utilizaron ratonas en este estudio.

Construcción de bibliotecas y secuenciación

Las bibliotecas de ARN de células individuales se generaron utilizando el "Sistema de análisis de células individuales BD Rhapsody" siguiendo los protocolos del fabricante. Brevemente, las células individuales se cargaron en los cartuchos BD Rhapsody para el emparejamiento de cuentas y células, el codificación y la síntesis de ADNc. Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de ADNc BD Rhapsody y el kit de amplificación de todo el transcriptoma de ARNm (WTA). Las bibliotecas finales se secuenciaron en el Illumina NovaSeq 6000 (emparejamiento de extremos, 150 pb).

Procesamiento y análisis de datos

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando el "flujo de trabajo BD Rhapsody (plataforma Seven Bridges Genomics)". Las lecturas se alinearon con el genoma del ratón (mm10) y se generaron matrices de expresión a nivel de gen. El control de calidad, la agrupación, la visualización (UMAP; tSNE) y los análisis de expresión génica diferencial se realizaron utilizando Seurat (v4.4.0) en R. Se excluyeron las células con < 500 o > 6000 genes o > 10% de contenido mitocondrial. Los genes expresados diferencialmente (DEG) se identificaron mediante la prueba de rango-suma de Wilcoxon (P ajustada < 0,05, |log₂FC| ≥ 0,25) y se realizaron análisis de enriquecimiento funcional utilizando clusterProfiler (v4.12.6).

Validación utilizando datos de secuenciación de ARN de células individuales y transcriptómica espacial disponibles públicamente

Se descargaron y procesaron conjuntos de datos de secuenciación de ARN de células individuales ^[26] y conjuntos de datos de transcriptómica espacial ^[25] disponibles públicamente de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (CCR) y tumores colorrectales primarios correspondientes. Los datos de secuenciación sin procesar se reanalizaron utilizando el flujo de trabajo estándar en Seurat. Los datos se sometieron a control de calidad, normalización (método LogNormalize), reducción de dimensionalidad (PCA) y agrupación (algoritmo de Louvain). La anotación de tipos de células se realizó en función de los genes marcadores canónicos, y se compararon y visualizaron las diferencias en la composición de los tipos de células o los perfiles de expresión génica entre las muestras metastásicas y primarias utilizando la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) o la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP). Las regiones tumorales se identificaron en función de la histopatología (imágenes de tinción de H&E) y los gráficos de características espaciales, y la distribución espacial de la expresión del gen objetivo (por ejemplo, KIAA1199) se visualizó utilizando mapas de calor espaciales.

Análisis de la trayectoria de pseudotiempo

Se realizó un análisis de la trayectoria de pseudotiempo utilizando Monocle (v2.3.2) en R para inferir las trayectorias de diferenciación celular entre los subgrupos de neutrófilos y hepatocitos. Las células se ordenaron a lo largo de las trayectorias de pseudotiempo inferidas en función de los genes altamente variables identificados. La progresión del pseudotiempo se visualizó utilizando gráficos de trayectoria anotados con subgrupos de células.

Análisis de la red reguladora de factores de transcripción

Las redes reguladoras de factores de transcripción (TF) de células individuales se infirieron utilizando pySCENIC (v0.11.2) en Python. Los datos de recuento sin procesar se utilizaron como entrada para la inferencia de la red reguladora de genes utilizando GENIE3, seguida de un análisis de enriquecimiento de motivos cis-reguladores utilizando RcisTarget con la base de datos proporcionada (base de datos de motivos mm10). Las actividades del regulón TF se calcularon con AUCell. Se generó un mapa de calor de la actividad del regulón para visualizar la actividad de TF en los subgrupos de neutrófilos, destacando los posibles factores de transcripción reguladores maestros.

Análisis de la comunicación entre células

Se realizó un análisis de la comunicación entre células utilizando CellChat (v1.6.1) en R. Se utilizaron datos de expresión de células individuales normalizados de Seurat como entrada. Se aplicaron las bases de datos de interacción ligando-receptor predeterminadas de CellChat para el ratón (CellChatDB.mouse). Se calcularon las probabilidades de comunicación entre los tipos de células o subgrupos identificados en función de los niveles de expresión de los pares de ligandos y receptores conocidos. Las interacciones ligando-receptor significativas se visualizaron utilizando diagramas de red y mapas de calor. Se analizaron y se identificaron además las vías de señalización de comunicación diferencial entre los grupos de control y tratamiento en función de la significancia estadística (p < 0,05).

Análisis de la variación del número de copias de células individuales (CNV)

Los perfiles de variación del número de copias de células individuales (CNV) se infirieron utilizando el paquete R inferCNV (v1.20.0). Brevemente, se importaron los datos de expresión de ARN de células individuales normalizados de Seurat, y las células no tumorales (por ejemplo, células inmunitarias o del estroma) se establecieron como células de referencia. Se realizaron estimaciones de CNV en las regiones cromosómicas utilizando los parámetros predeterminados. Los resultados se visualizan como gráficos de violín que muestran las señales de CNV relativas en las poblaciones de células, lo que facilita la identificación de células malignas y la evaluación de la heterogeneidad tumoral.

Cultivo celular y reactivos

Las líneas celulares de cáncer colorrectal murino MC38 (Cat# CL-0972) y CT26 (Cat# CL-0071), la línea celular de hepatocitos murinos AML12 (Cat# CL-0602), la línea celular de células endoteliales murinas SVEC4-10 (Cat# CL-0221), las células endoteliales del cordón umbilical humano (HUVEC, Cat# CL-0675) y la línea celular mieloide humana HL-60 (Cat# CL-0110) se obtuvieron de Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, China). Se realizó la autenticación de la línea celular utilizando el perfilado de repeticiones en tándem cortas (STR) y todas las líneas se probaron de forma rutinaria para detectar la contaminación por micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza).

Las células se mantuvieron en medio DMEM (Cat# PM150210, Procell) o medio RPMI-1640 (Cat# PM150110, Procell) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor (Cat# 164210, Procell) y una solución de 1% de penicilina-estreptomicina (Cat# PB180120, Procell) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO₂. Las células HL-60 se diferenciaron en células similares a neutrófilos mediante el tratamiento con 1,3% de DMSO durante 5 días, y la diferenciación se confirmó mediante la expresión de CD11b y la evaluación morfológica.

Se utilizaron los siguientes reactivos: WRW4 (antagonista de FPR2, Cat# HY-P1119), rosiglitazona (agonista de PPARγ, Cat# HY-14600), wortmannina (inhibidor de PI3K, Cat# HY-10197) y alcohol tribromoetílico (anestésico, Cat# HY-B1372) de MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, EE. UU.); proteína recombinante de ratón SAA2 (rSAA2, Cat# RPB795Mu01) y proteína recombinante humana SAA2 (hrSAA2, Cat# RPB795Hu01) de Cloud-Clone Corp. (Wuhan, China). Se proporciona información detallada sobre los anticuerpos utilizados en este estudio en la Tabla suplementaria 1.

Modelos de ratón de cáncer colorrectal ortotópico y metástasis hepática

SPANISH TRANSLATION:

Se utilizaron ratones BALB/c o C57BL/6 de seis semanas de edad (Changsheng Biotechnology Co., Ltd., Liaoning, China), a los que se les administró anestesia mediante inyección intraperitoneal de tribromoetil alcohol. Para establecer el modelo ortotópico de cáncer colorrectal, se inyectaron aproximadamente 1 × 10⁶ células de cáncer colorrectal suspendidas en 50 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, Cat# PB180327, Procell, China) en la capa submucosa del ciego. (El día 14, antes de la aparición de metástasis visibles, los ratones se sometieron a una exploración por resonancia magnética. La imagen se realizó en un sistema Bruker BioSpec sin agentes de contraste. Se utilizaron secuencias ponderadas en T2 para una detección óptima de las lesiones. Todas las imágenes fueron evaluadas de forma independiente por tres radiólogos experimentados, cegados a los grupos experimentales, para garantizar un análisis objetivo). Siete días después, para simular la metástasis hepática, se inyectaron 5 × 10⁶ células de cáncer colorrectal suspendidas en 100 μL de PBS en la bazo (o se coinyectaron directamente con neutrófilos Egr1⁺ en una proporción de 1:1, con cada tipo de célula administrado a 2,5 × 10⁶ células). El bazo se extirpó quirúrgicamente 15 minutos después de la inyección y se suturó la pared abdominal. Se administraron analgésicos postoperatorios y cuidados de apoyo. El crecimiento tumoral se controló periódicamente y los ratones se sacrificaron en puntos temporales predeterminados para evaluar la carga tumoral primaria y la extensión de las metástasis hepáticas. Los ratones se mantuvieron en condiciones SPF con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas a 22 ± 2 °C y una humedad relativa del 50-60%, con acceso libre a alimentos y agua. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Gestión y Uso de Animales de Laboratorio del Centro Provincial de Control y Prevención de Enfermedades de Hubei (Número de Aprobación: 202410259).

Aislamiento de neutrófilos hepáticos

Los ratones se anestesiaron y se perfundieron a través de la vena porta con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar el hígado. El hígado se extirpó rápidamente, se picó y se disoció suavemente a través de un tamiz celular de 70 μm para obtener una suspensión de células individuales. Los glóbulos rojos se lisaron utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos (Cat# C3702, Beyotime, China). Las células restantes se lavaron dos veces con PBS y se centrifugaron a 1000 × g durante 10 minutos para recoger el sedimento celular.

Las células se resuspendieron en un tampón para clasificación celular mediante citometría de flujo (FACS), compuesto por PBS suplementado con 0,5% de suero bovino fetal (FBS) y 2 mM de EDTA (Cat# PB180620, Procell, China). Los neutrófilos hepáticos se aislaron utilizando el kit de aislamiento de neutrófilos de ratón MojoSort™ (Cat# 480058, BioLegend, San Diego, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Los neutrófilos purificados se utilizaron para análisis posteriores.

Análisis por citometría de flujo

Aproximadamente 1 × 10⁶ células se lavaron una vez con tampón FACS. Las células se incubaron luego con una mezcla apropiada de anticuerpos conjugados con fluorocromos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se centrifugaron a 300 × g durante 5 minutos cada vez. Finalmente, las células se resuspendieron en 100 μL de tampón FACS. El análisis por citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo (Beckman Coulter). Para cada muestra, se adquirieron un mínimo de 2 × 10⁴ eventos. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (versión 10).

Inmunohistoquímica (IHQ)

El hígado de ratón y los tejidos tumorales colorrectales ortotópicos recién extraídos se fijaron en un 4% de paraformaldehído (Cat# P0099, Beyotime, China) durante la noche, se deshidrataron mediante una serie de etanol graduado, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm de espesor. Las secciones de tejido se desparafinaron con xileno, se rehidrataron mediante una serie de etanol graduado y se sometieron a la recuperación del antígeno mediante calentamiento en microondas en un tampón de citrato de sodio (pH 6.0). La actividad peroxidasa endógena se eliminó utilizando peróxido de hidrógeno al 3%, seguido de la inhibición de la unión inespecífica con albúmina sérica bovina (BSA) al 5%. Las secciones se incubaron luego con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La inmunorreactividad se visualizó utilizando el cromógeno DAB y los núcleos se contrateñeron con hematoxilina. Las láminas se montaron y se observaron bajo un microscopio óptico.

Co-inmunoprecipitación (Co-IP) y análisis de Western blot

Las células o muestras de tejido se lisaron utilizando un tampón RIPA (Cat# P0013B, Beyotime, China) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Cat# ST505, Beyotime, China) para extraer la proteína total. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Cat# P0012S, Beyotime, China). Para la co-inmunoprecipitación, cantidades iguales de lisados de proteínas se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo específico del objetivo o un control de IgG con isotipo coincidente bajo una suave agitación. Al día siguiente, se añadieron cuentas magnéticas de proteína A/G (Cat# HY-K0202, MedChemExpress, EE. UU.) y se incubaron durante 2-4 horas a 4 °C. Las cuentas se recogieron utilizando un soporte magnético y se lavaron tres veces con PBS (5 minutos por lavado). Las proteínas unidas se eluyeron hirviendo las cuentas en un tampón de carga SDS durante 5 minutos.

Para el Western blot, cantidades iguales de muestras de proteínas se sometieron a SDS-PAGE (Cat# PG112, Epizyme Biotech, Shanghái, China) y se transfirieron a membranas de PVDF (Cat# ISEQ00010, Millipore, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con leche seca descremada al 5% o albúmina sérica bovina (BSA) en un tampón TBST y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con el sistema de imagen ChemiDoc (Bio-Rad, EE. UU.) y las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

Ensayo de reportero de luciferasa y ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Se identificaron dos posibles sitios de unión a PPAR-γ dentro de la región promotora de Saa2 utilizando la base de datos en línea JASPAR (https://jaspar.genereg.net/). La secuencia promotora de interés se clonó en un plásmido de reportero de luciferasa (GENE CREATE, Wuhan, China) y se transfectó en las células objetivo. Después de 48 horas de transfección, las células se lisaron y la actividad de la luciferasa se midió utilizando el sistema de ensayo de reportero Dual-Luciferase® (Promega, EE. UU.), normalizando la actividad de la luciferasa de luciérnaga a la actividad de la luciferasa de Renilla.

Para los ensayos de ChIP, aproximadamente 1 × 10⁷ células se procesaron utilizando un kit de ChIP comercial (Cat# P2078, Beyotime, China) según las instrucciones del fabricante para evaluar la unión directa de los factores de transcripción a la región promotora. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron durante la noche con cuentas magnéticas de proteína A/G conjugadas con anticuerpos anti-PPAR-γ, utilizando IgG normal como control negativo. Los complejos de cromatina inmunoprecipitados se lavaron, se eluyeron y se sometieron a una reticulación inversa. Los fragmentos de ADN recuperados se analizaron mediante PCR cuantitativa (qPCR) para evaluar el enriquecimiento de la región promotora, normalizado con respecto a la cromatina de entrada.

Infección lentiviral y transfección con plásmidos

Las células se sembraron en placas de 6 pocillos e se infectaron con partículas lentivirales a una confluencia de aproximadamente el 50%. Después de 12 horas de incubación, el medio de cultivo se reemplazó con medio completo fresco y las células se mantuvieron durante 48 horas adicionales antes del procesamiento posterior. Se generaron líneas celulares de cáncer colorrectal (CRC) estables con sobreexpresión de KIAA1199, silenciamiento de KIAA1199 y los vectores de control correspondientes mediante transducción lentiviral seguida de selección con puromicina, con la concentración y la duración aplicadas según las instrucciones del fabricante^[18]. Las partículas lentivirales se produjeron utilizando un sistema de empaquetamiento estándar de Genecopoeia (Guangzhou, China). La eficiencia de la expresión o el silenciamiento estable se validaron mediante PCR cuantitativa e inmunoblotting. Las nuevas líneas celulares estables están disponibles para el autor correspondiente a cambio de una solicitud razonable.

Para la transfección con plásmidos, las células se sembraron para alcanzar una confluencia del 60-70%. La transfección se realizó utilizando el reactivo Lipofectamine™ 2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se recogieron para aplicaciones posteriores, como Western blot, qPCR o ensayos funcionales. Se proporciona información detallada sobre la secuencia en las tablas suplementarias 1 y 3. Se puede obtener información adicional del autor correspondiente a cambio de una solicitud razonable.

Ensayos CCK-8, de curación de heridas, de transmigración y de formación de túbulos

La proliferación celular se midió utilizando el kit de conteo celular-8 (Cat# C0037, Beyotime, China). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se añadió el reactivo CCK-8 en los puntos temporales indicados. Después de la incubación durante 1-2 horas, se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Para los ensayos de curación de heridas, se rasgaron monocapas de células con la punta de una pipeta estéril. Después de lavar con PBS, las células se cultivaron en un medio libre de suero y se observó el cierre de la herida a las 0 y 24 horas.

Los ensayos de transmigración se realizaron utilizando insertos Transwell de tamaño de poro de 8,0 μm (Corning, EE. UU.). Las células suspendidas en un medio libre de suero se añadieron a la cámara superior, mientras que el medio que contenía un 10% de FBS se colocó en la cámara inferior. Después de 24 horas, las células que migraron se fijaron, se tiñeron y se contaron.

Para los ensayos de formación de túbulos, las células HUVEC o SVEC4-10 se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con Matrigel y se incubaron durante 4-6 horas. Las estructuras similares a túbulos se observaron y se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

Aislamiento de vesículas extracelulares (VE)

Las VE enriquecidas con exosomas se aislaron del medio acondicionado utilizando el kit de aislamiento de exosomas mejorado BeyoExo™ para medios de cultivo celular (Beyotime Biotechnology, China; Cat. No. C3622), un método de precipitación basado en polímeros, siguiendo estrictamente el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se cultivaron en un medio suplementado con suero desprovisto de exosomas o en un medio libre de suero para evitar la contaminación con vesículas exógenas. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se sometieron a una centrifugación gradual para eliminar las células intactas y los restos celulares. Los sobrenadantes aclarados se pasaron posteriormente a través de un filtro de 0,22 μm, se incubaron con el reactivo de precipitación durante la noche a 4 °C y se centrifugaron (10 000 × g, 4 °C, 30 min) para recuperar los gránulos de VE. Los gránulos resultantes se resuspendieron en PBS estéril para aplicaciones estructurales y funcionales posteriores.

Etiquetado con PKH26 para ensayos de captación de VE

Para el seguimiento por fluorescencia, las VE purificadas se etiquetaron utilizando el kit de etiquetado y seguimiento de exosomas BeyoExo™ (PKH26) (Beyotime Biotechnology, China; Cat. No. C3637). Brevemente, las VE se incubaron con la solución de trabajo de PKH26 durante 1-5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción de etiquetado se detuvo inmediatamente utilizando la solución de extinción proporcionada. Es fundamental que, para distinguir la captación de VE de los artefactos del tinte libre, las VE etiquetadas se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para eliminar el tinte no unido antes de la incubación con las células receptoras.

Perfilado proteómico y transcriptómico

Análisis proteómico

El análisis proteómico se realizó mediante adquisición independiente de datos (DIA) mediante espectrometría de masas con tres réplicas biológicas por grupo (n = 3). Las proteínas se extrajeron utilizando un tampón SDT, se digirieron con tripsina mediante el método FASP y los péptidos se desalaron, se añadieron estándares iRT y se analizaron en un sistema nano-UHPLC Vanquish Neo acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Astral (Thermo Fisher Scientific). Los escaneos MS1 se adquirieron en el rango m/z de 380-980 a una resolución de 240 000 y los espectros MS2 se recogieron utilizando 299 ventanas DIA (2 m/z) con HCD a 25 eV. Los datos se buscaron en el proteoma de referencia UniProt utilizando tripsina con hasta un fallo de escisión, cisteína carbamidometilada como modificación fija, oxidación (M) y acetilación de la proteína N-terminal como modificaciones variables, y FDR < 1% a nivel de péptido y proteína.

Análisis transcriptómico

Se realizó un perfilado transcriptómico mediante secuenciación de ARN a granel de los correspondientes gránulos celulares. Tras un riguroso control de calidad, las lecturas de secuenciación se alinearon con el genoma de referencia y la expresión a nivel de gen se cuantificó y normalizó utilizando flujos de trabajo bioinformáticos estándar. Se realizó un análisis de expresión génica diferencial para identificar los transcritos que presentaban alteraciones significativas entre las condiciones.

Análisis estadístico de los datos ómicos

Tanto para los conjuntos de datos proteómicos como para los transcriptómicos, las pruebas estadísticas para la abundancia o expresión diferencial incluyeron la corrección para comparaciones múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Para facilitar la interpretación biológica, se realizaron análisis de enriquecimiento funcional, incluidos el análisis de Gene Ontology (GO), el análisis de la vía KEGG y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), en las listas de proteínas y genes regulados de forma diferencial identificados bajo el marco de significación corregido.

Análisis proteómico

El análisis proteómico se realizó mediante espectrometría de masas con adquisición independiente de datos (DIA) con tres réplicas biológicas por grupo (n = 3). Las proteínas se extrajeron utilizando el tampón SDT, se digirieron con tripsina mediante el método FASP y los péptidos se desalaron, se añadieron estándares iRT y se analizaron en un sistema nano-UHPLC Vanquish Neo acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Astral (Thermo Fisher Scientific). Los escaneos MS1 se adquirieron en el rango m/z 380-980 a una resolución de 240.000, y los espectros MS2 se recogieron utilizando 299 ventanas DIA (2 m/z) con HCD a 25 eV. Los datos se buscaron en el proteoma de referencia UniProt utilizando tripsina con hasta un fallo de escisión, cisteína carbamidometilada como modificación fija, oxidación (M) y acetilación N-terminal de proteínas como modificaciones variables, y FDR < 1% a nivel de péptido y proteína.

Análisis transcriptómico

Se realizó un perfilado transcriptómico mediante secuenciación de ARN a granel de los correspondientes gránulos celulares. Tras un riguroso control de calidad, las lecturas de secuenciación se alinearon con el genoma de referencia y la expresión a nivel de gen se cuantificó y normalizó utilizando flujos de trabajo bioinformáticos estándar. Se realizó un análisis de expresión génica diferencial para identificar los transcritos que presentaban alteraciones significativas entre las condiciones.

Análisis estadístico de los datos ómicos

Tanto para los conjuntos de datos proteómicos como para los transcriptómicos, las pruebas estadísticas para la abundancia o expresión diferencial incluyeron la corrección para comparaciones múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Para facilitar la interpretación biológica, se realizaron análisis de enriquecimiento funcional, incluidos el análisis de Gene Ontology (GO), el análisis de la vía KEGG y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), en las listas de proteínas y genes regulados de forma diferencial identificados bajo el marco de significación corregido.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R (versión 4.2.2) y GraphPad Prism (versión 9.0). Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó la prueba t de Student cuando los datos seguían una distribución normal con varianza igual; de lo contrario, se aplicó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Para las comparaciones entre tres o más grupos, se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) de un factor si se cumplían los supuestos de normalidad y homogeneidad de la varianza; de lo contrario, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado para comparar las variables categóricas entre los grupos. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres réplicas biológicas independientes. Los datos continuos se presentan como media ± desviación estándar (DE), a menos que se especifique lo contrario. Los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos, con la siguiente notación: *P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.