La modificación m6A suprime la inmunidad antitumoral innata en el cáncer colorrectal al limitar la acumulación de ARN de doble cadena derivado de Alu.

Las modificaciones epigenéticas regulan la expresión génica, y estas modificaciones reversibles son cruciales para mediar los procesos biológicos en condiciones fisiológicas normales. Sin embargo, estas modificaciones pueden alterarse durante la tumorigénesis. Si bien la focalización de los reguladores epigenéticos en las neoplasias hematológicas muestra resultados prometedores, actualmente es ineficaz en el tratamiento de tumores sólidos^[1]. Tradicionalmente, los estudios sobre los mecanismos de las terapias epigenéticas en las células cancerosas se han basado en la identificación de genes con expresión transcripcional alterada, como los supresores tumorales y los oncogenes^[2]–^[5]. Sin embargo, el reciente descubrimiento del fenómeno de mimetismo viral como una nueva vulnerabilidad terapéutica ha cambiado el paradigma de las terapias contra el cáncer^[6],^[7].

Las terapias epigenéticas, como los inhibidores de las DNMT (DNMTi) y los enfoques dirigidos a las histona metiltransferasas, incluida la inhibición de SETDB1, han demostrado reactivar no solo los genes epigenéticamente silenciados, sino también los elementos repetitivos (RE) dentro del genoma humano^[6]–^[8]. Más allá de la regulación epigenética, la activación de los RE también está controlada por factores no epigenéticos, como el empalme (splicing)^[9]. La activación de los RE genera ARN derivados de los RE que forman estructuras de doble cadena (ds), imitando el ARN viral. Estos ARN de doble cadena endógenos son inmunostimulantes, activan la señalización inmune innata y promueven las respuestas inmunes antitumorales. En consecuencia, las células cancerosas pierden su capacidad de supervivencia, y este estado celular se conoce como mimetismo viral^[6],^[7],^[10],^[11].

Los elementos transponibles son secuencias de ADN repetitivas que desempeñan un papel importante en la evolución y la regulación del genoma humano. La mayoría de los elementos transponibles (TE) son RE, como los elementos nucleares dispersos cortos (SINE), los elementos nucleares dispersos largos (LINE) y las repeticiones terminales largas (LTR), que se mueven dentro del genoma utilizando un mecanismo de copia y pegado que implica un intermediario de ARN, similar a los retrovirus. En condiciones fisiológicas normales, varios mecanismos, como las modificaciones epigenéticas, suelen mantener los RE silenciados debido a sus posibles riesgos genéticos^[12]. Nosotros y otros hemos demostrado que existe una capa adicional de regulación para la actividad de los RE a nivel del ARN, mediada por la enzima de edición de ARN, ADAR1^[13],^[14]. Si los RE evaden los mecanismos de silenciamiento de histonas y ADN y se transcriben, los ARN derivados de los RE resultantes, en particular los de la familia SINE, que son inmunostimulantes, son editados y desestabilizados por ADAR1. Nuestros hallazgos indican que la focalización de ADAR1 podría representar una estrategia prometedora para mejorar la terapia contra el cáncer^[13]–^[16]. Sin embargo, a pesar de su potencial como un nuevo objetivo terapéutico, actualmente no existen inhibidores de ADAR1 disponibles comercialmente^[17].

Otro modificador del ARN, que muestra resultados prometedores como objetivo para el tratamiento de las neoplasias hematológicas, es la metiltransferasa del ARN 3 (METTL3)^[18],^[19], el componente catalítico clave del complejo de modificación del ARN N6-metiladenosina (m6A). La m6A es la modificación del ARNm más abundante, que normalmente se enriquece cerca de los codones de parada y desempeña un papel crucial en la regulación de la estabilidad, el empalme y la traducción del ARNm^[20]–^[23]. Estudios recientes han demostrado que la metiltransferasa del ARN m6A, METTL3, desempeña un papel fundamental en la modulación de la homeostasis inmune. La hipometilación del ARN m6A se ha asociado con la activación de las respuestas de los interferones (IFN) a través de la estabilización del ARNm de IFNβ, los cambios conformacionales en el sensor de ARN RIG-I y la reactivación de los elementos retrovirales endógenos IAP^[24]–^[26]. Además, las pruebas sugieren que, durante la hematopoyesis, las modificaciones del ARN m6A en los transcritos endógenos largos regulan las respuestas inmunes^[27]. Recientemente, Guirguis y sus colegas demostraron que un inhibidor de METTL3, STM3006, activa una respuesta de interferón intrínseca a las células y que la inhibición de METTL3 se sinergiza con la terapia anti-PDL1 en las células de cáncer de mama triple negativo en ratones^[28]. Además, los inhibidores de METTL3 se están evaluando actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos, lo que destaca el potencial terapéutico de la focalización de la metilación del ARN^[29]. Sin embargo, si bien estudios previos han informado que las células de CRC responden a la focalización de METTL3^[30],^[31], el grado en que la dependencia de METTL3 varía entre los CRC y los mecanismos que impulsan esta vulnerabilidad diferencial siguen sin estar claros.

El CRC es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en todo el mundo y la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer^[32]. A pesar de los avances terapéuticos, las tasas de recurrencia siguen siendo altas, y las terapias epigenéticas han mostrado beneficios limitados en el CRC y otros tumores sólidos. Además, el aumento de la incidencia de CRC en adultos más jóvenes destaca la urgente necesidad de identificar nuevas vulnerabilidades terapéuticas^[33]. Por lo tanto, nuestro estudio se centra en el CRC para determinar si la inhibición de METTL3 podría representar una estrategia terapéutica viable en esta enfermedad clínicamente significativa y terapéuticamente desafiante.

En este estudio, demostramos que METTL3 suprime las respuestas de mimetismo viral y descubrimos los mecanismos moleculares subyacentes a la susceptibilidad del CRC a la focalización de METTL3. Nuestros hallazgos muestran que la expresión de los elementos transponibles no necesariamente se correlaciona con la activación de los genes estimulados por los interferones (ISG). En cambio, la inhibición de METTL3 aumenta la acumulación de ARN de doble cadena (ds) inmunostimulante derivado de los RE, lo que indica que METTL3 regula el mimetismo viral a nivel del ARN. A través de ensayos funcionales sistemáticos, demostramos que la focalización de METTL3 activa las respuestas inmunes innatas intrínsecas en un subconjunto de CRC. Además, encontramos que la inhibición de METTL3 se sinergiza con los inhibidores de las DNMT para mejorar el mimetismo viral, eliminando eficazmente las células cancerosas que son resistentes a la focalización de METTL3 por sí sola.

Resultados

Las células de cáncer colorrectal muestran diferentes sensibilidades a la focalización de METTL3

Para evaluar el perfil de expresión del gen METTL3, primero analizamos los datos de secuenciación del transcriptoma del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA) de tejidos normales y cancerosos de varios tipos de cáncer (Fig. 1a). Este análisis reveló que la expresión de METTL3 es más alta en los tejidos cancerosos en comparación con los tejidos normales correspondientes en la mayoría de los cánceres, incluido el adenocarcinoma colorrectal (COAD), lo que es consistente con informes anteriores^[30],^[34],^[35]. A continuación, para evaluar ampliamente la dependencia de los CRC de METTL3, analizamos conjuntos de datos de cribado a gran escala de pérdida de función disponibles públicamente (DepMap)^[36]. Este análisis identificó METTL3 como un gen esencial en un subconjunto de CRC (Fig. 1b).

Para investigar más a fondo el papel de METTL3 en las células de CRC, establecimos líneas celulares HT29 y HCT116 con depleción de METTL3 (KD) utilizando cuatro ARNs de interferencia (ARNi) distintos (Fig. 1a suplementaria) y seleccionamos KD1 y KD4 para los análisis posteriores. También generamos líneas celulares de CRC COLO201 y NCI-H716 con depleción de METTL3, así como dos modelos de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) de CRC, POP92 y CSC73 (Fig. 1c y Fig. 1b suplementaria). Los ensayos de viabilidad demostraron que la depleción de METTL3 redujo significativamente la viabilidad de las células HT29, COLO201 y POP92, e inhibió la capacidad de formación de colonias de las células HT29. En cambio, la depleción de METTL3 no tuvo un efecto significativo en la viabilidad de las células HCT116, NCI-H716 o CSC73, ni en la capacidad de formación de colonias de las células HCT116 (Fig. 1d y Fig. 1c, d suplementarias). Aunque se ha demostrado que las células de CRC responden a la focalización de METTL3^[30],^[31], nuestros hallazgos revelan una capa adicional de complejidad: los modelos de CRC varían sustancialmente en su vulnerabilidad a la inhibición de METTL3.

La depleción de METTL3 induce el mimetismo viral impulsado por el ARN de doble cadena en un subconjunto de modelos de CRC

Para investigar los efectos de la focalización de METTL3 en el CRC, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) en células de control (CTRL) y con depleción de METTL3 (KD) de HT29, COLO201, HCT116, NCI-H716 y CSC73. La depleción de METTL3 resultó en la expresión diferencial de un número sustancial de genes en las células HT29, COLO201, NCI-H716 y CSC73 (Fig. 1e y Fig. 1e suplementaria). En cambio, el efecto transcriptómico en las células HCT116 fue mínimo, con solo 45 genes regulados a la baja y 34 regulados al alza (Fig. 1e suplementaria).

A continuación, seleccionamos los 200 genes regulados diferencialmente más altos en las células HT29 con depleción de METTL3 en relación con las células CTRL como un modelo de CRC sensible a METTL3 y realizamos análisis de vías y redes de enriquecimiento. En particular, la respuesta del interferón de tipo I y la defensa contra los virus surgieron como los términos de la ontología génica (GO) y los módulos de red más enriquecidos en las células HT29 (Fig. 1f y Fig. 2a suplementarias). De manera similar, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) reveló un fuerte enriquecimiento del conjunto de genes de referencia del interferón alfa (IFN) en las células HT29 con depleción de METTL3 en comparación con las células CTRL (Fig. 1f y Fig. 2b suplementarias).

Un análisis adicional demostró que la depleción de METTL3 en las células HT29, COLO201 y POP92 sensibles a la depleción de METTL3 indujo una expresión robusta de los genes estimulados por los interferones (ISG), que normalmente son impulsados por los interferones de tipo I/III, mientras que los niveles de ISG permanecieron en gran medida sin cambios en las células HCT116, NCI-H716 y CSC73 insensibles a METTL3 (Fig. 2c, d suplementarias). Para evaluar si la expresión basal de ISG podría predecir la sensibilidad del CRC a la pérdida de METTL3, cuantificamos la expresión promedio escalada de 38 ISG (Datos suplementarios 1)^[37] y comparamos estos valores con las probabilidades de dependencia de METTL3 del conjunto de datos de DepMap^[36]. No encontramos una correlación significativa entre las puntuaciones basales de ISG y la dependencia de METTL3 en las líneas celulares de CRC (Fig. 2e suplementaria). Coherente con estas observaciones, el análisis de RNA-seq mostró que las células HT29, a pesar de ser sensibles a la focalización de METTL3, muestran una expresión basal de ISG más baja que las células insensibles HCT116 y CSC73. En cambio, las células POP92 y COLO201, que también son sensibles a METTL3, exhiben niveles basales de ISG más altos (Fig. 2f suplementaria). Al extender este análisis a otros tipos de cáncer, se reveló que las puntuaciones de ISG se correlacionaron positivamente con la dependencia de METTL3 en las células madre de cáncer de ovario (OCSC) y el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), pero negativamente en el adenocarcinoma de pulmón (LUAD) (Fig. 2g suplementaria), lo que indica una relación dependiente del contexto. En conjunto, estos análisis sugieren que la expresión basal de ISG no es un biomarcador confiable para predecir la dependencia del CRC de METTL3.

Para determinar si la inducción de ISG en las células sensibles a la depleción de METTL3 está mediada por la acumulación de ARN endógeno de doble cadena, realizamos análisis de frotis de ARN y tinción de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo monoclonal J2 contra el ARN de doble cadena. Estos análisis indicaron un aumento significativo de los niveles de ARN de doble cadena en las células HT29, COLO201 y POP92 con depleción de METTL3 en comparación con las células CTRL, mientras que las células HCT116, NCI-H716 y CSC73 con depleción de METTL3 no mostraron cambios sustanciales en los niveles de ARN de doble cadena (Fig. 1g y Fig. 3a–e suplementarias). En conjunto, estos resultados demuestran que la focalización de METTL3 reduce la viabilidad de un subconjunto de células de CRC al promover la acumulación de niveles de ARN endógeno de doble cadena y la activación de los ISG.

Para evaluar si el dsARN endógeno inducido tras la inhibición de METTL3 (METTL3KD) podría, en efecto, activar una respuesta inmune innata, realizamos un ensayo de reportero de luciferasa del promotor de IFNβ. Primero, aislamos ARN de las células HT29 y HCT116 con inhibición de METTL3 (METTL3KD) y células de control (CTRL). A continuación, transfectamos células HEK que expresaban de forma estable un reportero de IFNβ con los ARN aislados (Fig. 2a). Observamos que la actividad del promotor de IFNβ aumentaba tras la transfección de las células reporteras con ARN aislado de las células HT29 deficientes en METTL3 (Fig. 2b), pero no con ARN de las células HCT116 (Fig. 2c), lo que sugiere que los dsARN que se acumulan al dirigirse a METTL3 inducen IFNβ y la señalización inmune innata en las células sensibles a METTL3 (HT29), pero no en las células insensibles. Este fenotipo se revirtió en las células reporteras con la eliminación del gen de la proteína de señalización antiviral mitocondrial (MAVS KO) (Fig. 2b, c). Para investigar más a fondo los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) implicados en la inducción de ISG y la muerte celular en los CRC de HT29 tras la inhibición de METTL3 (Fig. 2d), generamos células HT29 con la eliminación de PRR clave. Específicamente, generamos células HT29 con la eliminación de MAVS, que media las respuestas antivirales iniciadas por el gen inducible por ácido retinoico (RIG-I) y el gen asociado a la diferenciación del melanoma 5 (MDA5), así como la eliminación de la proteína quinasa R (PKR, EIF2AK2) y la endonucleasa RNase L, ya sea como eliminaciones individuales (Fig. 2e) o en combinación con la eliminación de METTL3 (Fig. 2f). Nuestros resultados mostraron que la eliminación de PKR revirtió significativamente la pérdida de viabilidad celular causada por la depleción de METTL3 en las células HT29 (Fig. 2g), mientras que la eliminación de MAVS revirtió la inducción de ISG tras la eliminación de METTL3 (Fig. 2h). Estos datos demuestran que la detección mediada por PRR del dsARN activa la inducción de ISG dependiente de MAVS y que PKR es necesaria para la muerte celular inducida por la inhibición de METTL3 en las células HT29 sensibles a METTL3.

La capacidad de formar dsARN determina la dependencia de METTL3 en los CRC

Para investigar la base de la variabilidad en la sensibilidad al tratamiento con METTL3 en el CRC, evaluamos los niveles de proteína METTL3 en los modelos de CRC y en las células del colon normal. Coherente con la elevada transcripción de METTL3 observada en los tejidos cancerosos en comparación con los tejidos normales de los pacientes con CRC en el conjunto de datos TCGA (Fig. 1a), detectamos niveles más altos de proteína METTL3 en las células de CRC en comparación con las células del colon normal (Fig. 3a). Sin embargo, la cuantificación de los niveles de proteína METTL3 en relación con el control de carga no reveló una correlación significativa con la sensibilidad de las células de CRC al tratamiento con METTL3 (Fig. 3a).

Las muestras de CRC se pueden clasificar en distintos subgrupos basándose en el fenotipo de metilación de las islas CpG (CIMP), una firma epigenética caracterizada por la hipermetilación de las islas CpG en las regiones promotoras de genes específicos, lo que las categoriza como CIMP-positivas o CIMP-negativas^[38]. Los CRC también se clasifican comúnmente basándose en el estado de los microsatélites como subtipos de microsatélites estables (MSS) y de inestabilidad de microsatélites (MSI). Los CRC MSS exhiben secuencias de microsatélites estables, mientras que los CRC MSI albergan mutaciones en el sistema de reparación de errores de emparejamiento de ADN^[39],^[40]. No encontramos una correlación significativa entre la dependencia de METTL3 y el estado de CIMP o el estado de los microsatélites (MSS/MSI) (Fig. 3b).

A continuación, analizamos la dependencia de METTL3 en los cuatro subtipos moleculares de consenso (CMS) de CRC^[41] (Fig. S4 y Datos suplementarios 2) y evaluamos su relación con los perfiles de mutación de los CRC^[36] (Fig. 3c). Aunque las líneas celulares sensibles a METTL3 tendían a presentar una mayor carga de mutación general, no se observó una asociación significativa entre la sensibilidad a METTL3 y la clasificación CMS o el estado de mutación. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la sensibilidad del CRC al tratamiento con METTL3 es independiente de estas características moleculares establecidas.

Para explorar los posibles determinantes de la sensibilidad diferencial a METTL3, examinamos la expresión basal de TE mediante RNA-seq en los modelos de CRC sensibles a METTL3 (HT29, COLO201, POP92) e insensibles a METTL3 (HCT116, NCI-H716, CSC73). La expresión basal de TE varió sustancialmente entre los modelos: HT29 y COLO201 mostraron una mayor expresión de TE que HCT116, mientras que NCI-H716 mostró niveles de TE aún más altos que HT29 y COLO201 (Fig. 3d-g). De manera similar, CSC73 mostró una mayor expresión de TE que los CRC PDX de POP92 (Fig. S4b). Los SINE representaron la clase principal de retroelementos con una expresión elevada en los modelos sensibles a METTL3 en comparación con los insensibles. Otros TE expresados diferencialmente incluyeron LINE, LTR, ARN pequeños y otras familias de elementos transponibles (Fig. S5a, b). En particular, los TE expresados más abundantemente en las células sensibles a METTL3 se enriquecieron particularmente dentro de las regiones intrónicas y 3′UTR (Fig. S5c, d). Además, el análisis de las subfamilias de Alu^[42] reveló que las células sensibles a METTL3 se enriquecieron con las subfamilias AluS y AluJ y se empobrecieron con la subfamilia AluY evolutivamente más joven (Fig. S5e, f).

Tras la inhibición de METTL3, las células HT29, COLO201 y HCT116 mostraron aproximadamente el mismo número de TE regulados al alza y a la baja, mientras que NCI-H716 mostró un patrón distinto con una mayor proporción de TE regulados al alza (Fig. S5g-j). Estos hallazgos indican que el impacto de la regulación postranscripcional dependiente de m⁶A sobre la expresión global de TE varía entre los modelos de CRC y es independiente de su dependencia de METTL3.

En conjunto, nuestros hallazgos demuestran que la expresión basal de TE por sí sola no explica la sensibilidad del CRC a la pérdida de METTL3. Aunque dos modelos sensibles a METTL3 (HT29 y COLO201) expresan niveles elevados de TE, un modelo insensible a METTL3 (NCI-H716) muestra niveles de TE comparables, pero no forma dsARN tras la inhibición de METTL3. Esto indica que los factores más allá de la expresión de TE, específicamente los niveles de m⁶A y la capacidad de formar dsARN, determinan las respuestas del CRC a la inhibición de METTL3. Por lo tanto, aunque la expresión de TE varía entre los modelos de CRC, no es un determinante fiable de la dependencia de METTL3.

La pérdida de METTL3 induce la activación transcripcional de los ISG en las células de CRC con alto contenido de m⁶A

Para investigar más a fondo los mecanismos subyacentes a la variabilidad en la sensibilidad de las células de CRC al tratamiento con METTL3, evaluamos los niveles globales de modificación de m⁶A tras el tratamiento con METTL3 en todos los modelos de CRC utilizando un análisis de dot-blot sobre ARN total utilizando un anticuerpo anti-m6A. La inhibición de METTL3 redujo significativamente las modificaciones globales de m6A en todos los modelos de CRC evaluados (Fig. S5k), lo que excluye la posibilidad de que la actividad catalítica compensatoria de METTL3 sea la causa de la sensibilidad diferencial. Para cuantificar y mapear las modificaciones de m6A, realizamos una secuenciación de inmunoprecipitación de ARN de metilación (MeRIP-Seq) sobre ARN total de las células HCT116 y HT29 (Fig. S5l). En ambas líneas celulares, los picos de m⁶A se enriquecieron para el motivo canónico DRACH (Fig. S5m). En particular, las células HT29 exhibieron un número sustancialmente mayor de picos de m⁶A en comparación con las células HCT116, con 21 705 picos identificados en HT29 frente a 8074 en HCT116 (Fig. 4a, b). Coherente con la elevada expresión de TE intrónicos en HT29 en relación con HCT116 (Fig. S5c), una gran fracción de los picos de m⁶A de HT29 (43,23%, correspondiente a 9390 picos) se mapeó a las regiones intrónicas (Fig. 4a).

Para explorar el papel de la modificación de m6A en la regulación de la actividad inmunostimulante de los ARN derivados de TE, evaluamos los cambios en la metilación de m6A en los transcritos de TE tras el tratamiento con METTL3. Coherente con la reducción global de los niveles de m⁶A, identificamos 59 653 transcritos de TE hipometilados tras la inhibición de METTL3 (Fig. 4c). La mayoría de los TE hipometilados fueron LINE, SINE y LTR, ubicados predominantemente dentro de las regiones intrónicas (78,31%) (Fig. 4d y Fig. S6a).

Dado que la modificación de m6A se ha asociado con la promoción de la degradación del ARN^[22],^[43], investigamos si la mayor abundancia de transcritos de ISG en las células deficientes en METTL3 podría reflejar una alteración de la estabilidad del ARN tras la pérdida de m6A. Al integrar los conjuntos de datos de RNA-seq y MeRIP-seq, identificamos 432 genes en las células HT29 que estaban tanto regulados al alza como hipometilados tras la inhibición de METTL3 (Fig. 4e, f). El análisis GO y de red reveló que estos genes se enriquecieron para las respuestas antivirales y la señalización del tipo I de IFN (Fig. 4g, h). Estos hallazgos sugieren que la pérdida de m6A puede contribuir a la elevada expresión de los ISG en las células deficientes en METTL3 al mejorar la estabilidad del transcrito.

Para evaluar directamente si la expresión de ISG se inducía a nivel transcripcional, realizamos un análisis CUT&RUN (cleavage under targets and release using nuclease)^[44] a nivel del genoma para medir la marca del promotor activo, la trimetilación de la histona 3 lisina 4 (H3K4me3). El análisis CUT&RUN reveló cambios alterados en la ocupación de H3K4me3 para numerosos genes en la inhibición de METTL3 en relación con el control (CTRL), con 2779 genes que mostraron un aumento y 50 genes que mostraron una disminución de la deposición de H3K4me3 en sus sitios de inicio de la transcripción (TSS) (Fig. S6b, c). En particular, la mayoría de los 38 ISG regulados al alza en las células HT29 deficientes en METTL3 también mostraron un aumento de la ocupación de H3K4me3 en sus TSS (Fig. 5a y Fig. S6d), lo que es coherente con la activación transcripcional. Además, la eliminación de MAVS abolió por completo la inducción de ISG tras la eliminación de METTL3 (Fig. 2h), lo que demuestra que la pérdida de METTL3 activa la transcripción de ISG a través de la señalización inmune innata dependiente de MAVS en lugar de a través de cambios en la estabilidad del ARN. En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que la depleción de METTL3 induce programas transcripcionales antivirales, lo que destaca el papel central de la regulación transcripcional en la firma de expresión génica inmune antitumoral observada.

La pérdida de METTL3 induce dsARN inmunostimulantes IR-Alu

Para caracterizar directamente los dsARN endógenos inmunostimulantes inducidos por la inhibición de METTL3, realizamos un ensayo de protección con RNasa A/MDA5^[13],^[45], seguido de RNA-seq utilizando ARN citoplasmático de las células HT29 (Fig. 5b). Este ensayo identificó los dsARN inmunostimulantes protegidos por la proteína MDA5 recombinante. En las células HT29, el 92% y el 94% de las regiones protegidas por MDA5 en CTRL e inhibición de METTL3, respectivamente, se superpusieron con los elementos repetidos (Fig. S7a). Los SINE, en particular los elementos de Alu, constituyeron la mayoría de las regiones protegidas por MDA5, y la inhibición de METTL3 resultó en un aumento de 1,7 veces en el número total de elementos repetidos protegidos por MDA5 (73 134 frente a 42 418) (Fig. S7b).

Para explorar cómo los TE generan dsARN inmunostimulantes, buscamos pares repetidos dentro de 3 kb que pudieran formar estructuras complementarias. Este análisis identificó 20 304 pares repetidos capaces de formar dsARN en las células CTRL, la mayoría de los cuales (81%) se superpusieron con los 41 926 pares detectados en las células con inhibición de METTL3 (Fig. 5c). Clasificamos los 20 304 pares repetidos como ARN inmunostimulantes de referencia y los 25 462 pares repetidos detectados únicamente en las células con inhibición de METTL3 como ARN inmunostimulantes inducidos por la inhibición de METTL3 (Fig. 5c). Los ARN inmunostimulantes de referencia se distribuyeron en las regiones intrónicas e intergénicas, mientras que el 84% de los ARN inmunostimulantes inducidos por la inhibición de METTL3 se localizaron en las regiones intrónicas (Fig. 5d). Aunque la expresión de los ARN inmunostimulantes de referencia fue comparable entre las condiciones CTRL y la inhibición de METTL3, la inhibición de METTL3 mejoró significativamente la protección de MDA5 de los dsARN inmunostimulantes sin necesariamente aumentar su transcripción (Fig. 5e, f y Fig. S7c, d, 8a-d). En particular, casi todos los pares repetidos en ambas condiciones correspondieron a los IR-Alu (Fig. 5g), y tanto los IR-Alu de referencia como los IR-Alu inducidos por la inhibición de METTL3 se enriquecieron con las subfamilias AluS (Fig. S8e). Estos dsARN inmunostimulantes se transcribieron predominantemente de forma unidireccional en orientaciones de sentido (+/+) o antisentido (-/-) (Fig. 5h), una configuración coherente con la formación de estructuras de tallo-bucle intramoleculares. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la inhibición de METTL3 mejora la formación o la persistencia de las estructuras de dsARN derivadas de IR-Alu en las células de CRC.

Cabe destacar que una mayor expresión basal de TE en las células de CRC no siempre se correlaciona con un aumento en la expresión de ISG, como se observa en las células HT29 y NCI-H716 (Figura suplementaria 2f). Esto sugiere que los RE expresados no necesariamente forman estructuras de ARN de doble cadena (dsRNA) inmunostimulantes. Nuestros resultados sugieren que este fenómeno depende, al menos en parte, de la actividad de METTL3, por la cual las modificaciones de m⁶A mediadas por METTL3 suprimen la formación de dsRNA a partir de los RE transcripcionalmente activos. Para probar esta hipótesis, medimos los niveles relativos de metilación de m⁶A dentro del dsRNA mediante análisis de "dot blot" del ARN total (entrada) y del ARN inmunoprecipitado con el anticuerpo anti-dsRNA J2 (J2-IP) (Figura 6a). Tanto en las células HT29 como en HCT116, observamos una reducción de los niveles de m⁶A en las muestras de J2-IP en comparación con el ARN total, lo que indica que los dsRNA en el conjunto de ARN total están relativamente hipometilados. Esta observación se corroboró aún más mediante el análisis de la abundancia de dsRNA en el ARN total en comparación con el ARN inmunoprecipitado con un anticuerpo anti-m⁶A (m⁶A-IP). En las células HT29, la supresión de METTL3 ( METTL3KD) aumentó notablemente la abundancia de dsRNA en el ARN total, mientras que esta inducción se atenuó sustancialmente en la fracción de m⁶A-metilada (Figura 6b). Estas observaciones sugieren que los transcritos que contienen modificaciones de m⁶A tienen menos probabilidades de formar o mantener estructuras de dsRNA, y que la pérdida de m⁶A aumenta la disponibilidad de ARN que pueden plegarse en dsRNA.

De manera consistente, el mapeo de la densidad de m⁶A en las regiones protegidas por MDA5 reveló que los dsRNA derivados de repeticiones inducidos por METTL3KD se originan en loci genómicos que normalmente están enriquecidos con m⁶A (Figura 6c), lo que demuestra un aumento de la abundancia y/o accesibilidad de las especies de dsRNA largas. Estos efectos se producen sin cambios detectables en la vida media del ARN para los transcritos de repetición seleccionados, según lo medido mediante el ensayo de persecución con actinomicina D seguido de RT-qPCR (Figura suplementaria 9a), lo que indica que estos cambios probablemente no se deban a alteraciones en la estabilidad del ARN.

Aunque RNAfold no predijo diferencias globales en la energía libre mínima entre las secuencias metiladas y no metiladas para las secuencias seleccionadas (Figura suplementaria 9b-d), esto es consistente con la evidencia previa de que m⁶A influye principalmente en el plegamiento local y cinético del ARN en lugar de en la termodinámica global. Los estudios de RMN y bioquímicos han demostrado que m⁶A debilita el apilamiento de bases y desestabiliza las estructuras de dúplex locales^[46]-^[48], lo que apoya la idea de que la pérdida de m⁶A favorece la formación o persistencia de conformaciones de dsRNA. Las estructuras de bucle-tallo inferidas del ensayo de protección con RNasa A/MDA5 son consistentes con el emparejamiento intramolecular de los elementos IR-Alu orientados de forma convergente.

El análisis de "dot blot" también mostró niveles basales más altos de dsRNA y m⁶A en los modelos de CRC sensibles a METTL3 en comparación con los modelos de CRC insensibles a METTL3 (Figura 6d). En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que los CRC sensibles a METTL3, caracterizados por una mayor deposición de m⁶A y la capacidad de generar dsRNA derivados de RE, acumulan niveles más altos de dsRNA después de la supresión de METTL3 (METTL3KD), lo que desencadena la mímica viral y la muerte de las células cancerosas. En contraste, los CRC insensibles a METTL3, a pesar de que a veces exhiben una alta expresión basal de TE, muestran bajos niveles de m⁶A y no generan dsRNA o generan dsRNA insuficiente tras la supresión de METTL3 (METTL3KD) para superar el umbral requerido para la activación antiviral, y por lo tanto no sufren citotoxicidad mediada por la mímica viral (Figura 6e).

La inhibición de DNMT combinada con la depleción de METTL3 supera la resistencia y reduce la carga tumoral de CRC in vivo

Dado que un subconjunto de CRC son insensibles al direccionamiento de METTL3 debido a la reducción de la modificación de m⁶A y contienen niveles basales más bajos de dsRNA, lo que impide que acumulen dsRNA inmunostimulantes suficientes para superar el umbral de estrés del dsRNA (Figura 6e), tratamos las células HCT116 insensibles a METTL3 con decitabina (DAC), un inhibidor de DNMT (DNMTi) conocido por inducir dsRNA y respuestas de mímica viral en CRC^[6],^[13]. La justificación de esta combinación se basa en múltiples estudios que demuestran que el tratamiento con DNMTi induce la transcripción endógena de dsRNA y desencadena la mímica viral en diversos tipos de cáncer^[6],^[7],^[49]. Además, los primeros estudios clínicos han demostrado que la combinación de la inhibición de DNMT con el bloqueo de puntos de control inmunitario, a través de la mímica viral, puede mejorar las respuestas terapéuticas en pacientes con cánceres refractarios, incluidos informes de altas tasas de respuesta completa en el linfoma de células NK/T resistente a la inmunoterapia^[50].

La combinación de la depleción de METTL3 con el tratamiento con DAC aumentó significativamente la expresión de 178 genes en las células HCT116, y los procesos biológicos de GO más enriquecidos fueron los relacionados con las vías antivirales y la señalización del interferón de tipo I (Figura 7a y Figura suplementaria 10a). RNA-seq reveló además que esta combinación mejoró la inducción de la firma ISG38 tanto en las células HCT116 insensibles a METTL3 como en las células HT29 sensibles a METTL3 (Figura 7b), un hallazgo que se validó aún más mediante el análisis de qPCR de ISG representativos, incluidos IRF7, ISG15 y MX1 (Figura suplementaria 10b, c).

Coherente con estos cambios transcriptómicos, los ensayos de CellTiter-Glo y de formación de colonias demostraron que el tratamiento con DAC mejoró los efectos antitumorales de la inhibición de METTL3 tanto en los modelos de CRC sensibles a METTL3 como en los insensibles a METTL3 (Figura suplementaria 10d-h), lo que sugiere que la inhibición de DNMT puede superar la resistencia al direccionamiento de METTL3.

A continuación, investigamos si esta combinación afecta la frecuencia de las células cancerosas iniciadoras (CIC). En las células HT29, el direccionamiento de METTL3 redujo la frecuencia de CIC y la combinación con DAC mejoró aún más este efecto. En contraste, la frecuencia de CIC en las células HCT116 no se vio afectada por la supresión de METTL3 (METTL3KD) por sí sola, pero se redujo significativamente cuando la inhibición de METTL3 se combinó con DAC (Figura 7c, d). La supresión de METTL3 (METTL3KD) también disminuyó la concentración efectiva media (EC50) de DAC en 4 veces en las células HT29 y en 2,3 veces en las células HCT116 (Figura 7e, f).

Para evaluar aún más el potencial terapéutico del direccionamiento de METTL3 solo o en combinación con DAC in vivo, inyectamos células NT, CTRL y METTL3KD de HT29 y HCT116 en los flancos de ratones NSG inmunodeficientes. Una vez que los tumores en los grupos CTRL alcanzaron aproximadamente los 100 mm³, los ratones fueron tratados con DAC (0,5 mg/kg) en dos ciclos de 4 días, con un intervalo de 3 días entre los ciclos (Figura 8a, d). El tratamiento con DAC a baja dosis por sí solo no tuvo un efecto significativo en el crecimiento tumoral en ninguno de los modelos, lo que es consistente con los resultados de los ensayos clínicos de DAC en tumores sólidos^[51],^[52]. En las células HT29 sensibles a METTL3, la supresión de METTL3 (METTL3KD) por sí sola demostró efectos antitumorales significativos (Figura 8b, c y Figura suplementaria 11a). En contraste, las células METTL3KD HCT116 crecieron de manera similar a las células CTRL en los ratones tratados con vehículo (Figura 8e, f y Figura suplementaria 11b). Lo más importante es que el tratamiento con DAC en combinación con la supresión de METTL3 (METTL3KD) en las células HCT116 exhibió una actividad antitumoral significativa. En conjunto, estos hallazgos sugieren que las terapias contra el cáncer, como DAC, que aumentan la acumulación de dsRNA endógenos, pueden sensibilizar los CRC al direccionamiento de METTL3, lo que destaca un posible enfoque combinatorio para un tratamiento más eficaz del CRC.

En resumen, nuestros hallazgos indican que el direccionamiento de METTL3 induce la muerte de células tumorales impulsada por la mímica viral en un subconjunto de CRC caracterizados por una alta deposición de m⁶A y la capacidad de generar dsRNA, mientras que los CRC con una capacidad limitada para formar dsRNA son resistentes. Sin embargo, el aumento de los niveles de dsRNA endógenos mediante la inhibición de DNMT puede sensibilizar estos modelos resistentes al direccionamiento de METTL3, lo que destaca una prometedora estrategia combinatoria para la terapia del CRC.

Las células de cáncer colorrectal muestran diferentes sensibilidades al direccionamiento de METTL3

Para evaluar el perfil de expresión del gen METTL3, primero analizamos los datos de secuenciación de transcriptomas de The Cancer Genome Atlas (TCGA) para tejidos normales y cancerosos en varios tipos de cáncer (Figura 1a). Este análisis reveló que la expresión de METTL3 está elevada en los tejidos cancerosos en comparación con los tejidos normales correspondientes en la mayoría de los cánceres, incluido el adenocarcinoma colorrectal (COAD), lo que es consistente con informes anteriores^[30],^[34],^[35]. A continuación, para evaluar ampliamente la dependencia de los CRC de METTL3, analizamos conjuntos de datos de cribado a gran escala de pérdida de función disponibles públicamente (DepMap)^[36]. Este análisis identificó a METTL3 como un gen esencial en un subconjunto de CRC (Figura 1b).

Para investigar aún más el papel de METTL3 en las células de CRC, establecimos líneas celulares HT29 y HCT116 con supresión de METTL3 (METTL3KD) utilizando cuatro shRNA distintos (Figura suplementaria 1a) y seleccionamos KD1 y KD4 para los análisis posteriores. También generamos líneas celulares de CRC COLO201 y NCI-H716 con supresión de METTL3 (METTL3KD), así como dos modelos de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) de CRC, POP92 y CSC73 (Figura 1c y Figura suplementaria 1b). Los ensayos de viabilidad demostraron que la supresión de METTL3 (METTL3KD) redujo significativamente la viabilidad de las células HT29, COLO201 y POP92, e inhibió la capacidad de formación de colonias de las células HT29. En contraste, la supresión de METTL3 (METTL3KD) no tuvo un efecto significativo en la viabilidad de las células HCT116, NCI-H716 o CSC73, ni en la capacidad de formación de colonias de las células HCT116 (Figura 1d y Figura suplementaria 1c, d). Aunque se ha demostrado que las células de CRC responden al direccionamiento de METTL3^[30],^[31], nuestros hallazgos revelan una capa adicional de complejidad: los modelos de CRC varían sustancialmente en su vulnerabilidad a la inhibición de METTL3.

La supresión de METTL3 induce la mímica viral impulsada por dsRNA en un subconjunto de modelos de CRC

Para investigar los efectos del direccionamiento de METTL3 en CRC, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) en células HT29, COLO201, HCT116, NCI-H716 y CSC73 de control (CTRL) y con supresión de METTL3 (METTL3KD). La supresión de METTL3 (METTL3KD) resultó en la expresión diferencial de un número sustancial de genes en las células HT29, COLO201, NCI-H716 y CSC73 (Figura 1e y Figura suplementaria 1e). En contraste, el efecto transcriptómico en las células HCT116 fue mínimo, con solo 45 genes regulados a la baja y 34 regulados al alza (Figura suplementaria 1e).

A continuación, seleccionamos los 200 genes regulados al alza más importantes en las células HT29 con supresión de METTL3 (METTL3KD) en relación con CTRL como un modelo de CRC sensible a METTL3 y realizamos análisis de vías y redes de enriquecimiento. En particular, la respuesta del interferón de tipo I y la respuesta de defensa contra virus surgieron como los términos de Gene Ontology (GO) y los módulos de red más enriquecidos en las células HT29 (Figuras suplementarias 1f, 2a). De manera similar, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) reveló un fuerte enriquecimiento del conjunto de genes de la firma del interferón alfa (IFN) en las células HT29 con supresión de METTL3 (METTL3KD) en comparación con CTRL (Figura 1f y Figura suplementaria 2b).

Un análisis adicional demostró que la supresión de METTL3 (METTL3KD) en las células HT29, COLO201 y POP92 sensibles a la supresión de METTL3 (METTL3KD) indujo una expresión robusta de los genes estimulados por el interferón (ISG), que normalmente son impulsados por los interferones de tipo I/III, mientras que los niveles de ISG permanecieron en gran medida sin cambios en las células HCT116, NCI-H716 y CSC73 insensibles a METTL3 (Figura suplementaria 2c, d). Para evaluar si la expresión basal de ISG podría predecir la sensibilidad de CRC a la pérdida de METTL3, cuantificamos la expresión promedio escalada de 38 ISG (Datos suplementarios 1)^[37] y comparamos estos valores con las probabilidades de dependencia de METTL3 del conjunto de datos de DepMap^[36]. No encontramos una correlación significativa entre las puntuaciones basales de ISG y la dependencia de METTL3 en las líneas celulares de CRC (Figura suplementaria 2e). Coherente con estas observaciones, el análisis de RNA-seq mostró que las células HT29, a pesar de ser sensibles al direccionamiento de METTL3, exhiben una expresión basal de ISG más baja que las células HCT116 y CSC73 insensibles (Figura suplementaria 2f). En contraste, las células POP92 y COLO201, que también son sensibles a METTL3, exhiben niveles basales de ISG más altos (Figura suplementaria 2f). La extensión de este análisis a otros tipos de cáncer reveló que las puntuaciones de ISG se correlacionaron positivamente con la dependencia de METTL3 en las células madre de cáncer de ovario (OCSC) y en el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), pero negativamente en el adenocarcinoma de pulmón (LUAD) (Figura suplementaria 2g), lo que indica una relación dependiente del contexto. En conjunto, estos análisis sugieren que la expresión basal de ISG no es un biomarcador confiable para predecir la dependencia de CRC de METTL3.

Para determinar si la inducción de ISG en células METTL3KD sensibles está mediada por la acumulación de dsRNA endógenos, realizamos un análisis de "dot blot" de ARN y un análisis de tinción por inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo monoclonal J2 contra dsRNA. Estos análisis indicaron un aumento significativo de los niveles de dsRNA en las células HT29, COLO201 y POP92 METTL3KD en comparación con las células CTRL, mientras que las células HCT116, NCI-H716 y CSC73 METTL3KD no mostraron cambios sustanciales en los niveles de dsRNA (Fig. 1g y Fig. S3a-e). En conjunto, estos resultados demuestran que la inhibición de METTL3 reduce la viabilidad de un subconjunto de células de CRC al promover la acumulación de niveles de dsRNA endógenos y la activación de ISG.

Para evaluar si el dsRNA endógeno inducido tras la inhibición de METTL3 puede activar realmente una respuesta inmune innata, realizamos un ensayo de reportero de luciferasa del promotor de IFNβ. Primero, aislamos ARN de las células HT29 y HCT116 METTL3KD y CTRL. Luego, las células HEK, transducidas de forma estable con un reportero de IFNβ, se transfectaron con los ARN aislados (Fig. 2a). Observamos que la actividad del promotor de IFNβ aumentó tras la transfección de las células reporteras con ARN aislado de las células HT29 deficientes en METTL3 (Fig. 2b), pero no con ARN de las células HCT116 (Fig. 2c), lo que sugiere que los dsRNA que se acumulan tras la inhibición de METTL3 inducen IFNβ y la señalización inmune innata en las células METTL3-sensibles (HT29) pero no en las células insensibles. Este fenotipo se revirtió en las células reporteras con la eliminación del gen de la proteína de señalización antiviral mitocondrial (MAVS KO) (Fig. 2b, c). Para investigar más a fondo los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) implicados en la inducción de ISG y la muerte celular en las células de CRC HT29 tras la inhibición de METTL3 (Fig. 2d), generamos células HT29 con la eliminación del gen de PRR clave. Específicamente, generamos células HT29 con la eliminación del gen MAVS, que media las respuestas antivirales iniciadas por el gen inducible por ácido retinoico (RIG-I) y el gen asociado a la diferenciación del melanoma 5 (MDA5), así como la eliminación del gen de la proteína quinasa R (PKR, EIF2AK2) y la endonucleasa RNase L, ya sea como eliminaciones individuales (Fig. 2e) o en combinación con la eliminación del gen METTL3 (Fig. 2f). Nuestros resultados mostraron que la eliminación del gen PKR revirtió significativamente la pérdida de viabilidad celular causada por la depleción de METTL3 en las células HT29 (Fig. 2g), mientras que la eliminación del gen MAVS revirtió la inducción de ISG tras la eliminación del gen METTL3 (Fig. 2h). Estos datos demuestran que la detección mediada por PRR de dsRNA activa la inducción de ISG dependiente de MAVS y que PKR es necesario para la muerte celular inducida por la inhibición de METTL3 en las células HT29 METTL3-sensibles.

La capacidad de formación de dsRNA determina la dependencia de METTL3 en las células de CRC

Para investigar la base de la variabilidad en la sensibilidad a la inhibición de METTL3 en las células de CRC, evaluamos los niveles de proteína METTL3 en los modelos de CRC y en las células normales del colon. Coherente con la elevada transcripción de METTL3 observada en los tejidos cancerosos en comparación con los tejidos normales de pacientes con CRC en el conjunto de datos TCGA (Fig. 1a), detectamos niveles más altos de proteína METTL3 en las células de CRC en comparación con las células normales del colon (Fig. 3a). Sin embargo, la cuantificación de los niveles de proteína METTL3 en relación con el control de carga no reveló una correlación significativa con la sensibilidad de las células de CRC a la inhibición de METTL3 (Fig. 3a).

Las muestras de CRC se pueden clasificar en distintos subgrupos en función del fenotipo de metilación de las islas CpG (CIMP), una firma epigenética caracterizada por la hipermetilación de las islas CpG en las regiones promotoras de genes específicos, que las categoriza como CIMP-positivas o CIMP-negativas^[38]. Las células de CRC también se clasifican comúnmente en función del estado de los microsatélites como subtipos de microsatélites estables (MSS) y de inestabilidad de microsatélites (MSI). Las células de CRC MSS exhiben secuencias de microsatélites estables, mientras que las células de CRC MSI albergan mutaciones en el sistema de reparación de errores de emparejamiento de ADN^[39],^[40]. No encontramos una correlación significativa entre la dependencia de METTL3 y el estado de CIMP o el estado de los microsatélites (MSS/MSI) (Fig. 3b).

A continuación, analizamos la dependencia de METTL3 en los cuatro subtipos moleculares de consenso (CMS) de CRC^[41] (Fig. S4a y Datos suplementarios 2) y evaluamos su relación con los perfiles de mutación de las células de CRC^[36] (Fig. 3c). Aunque las líneas celulares METTL3-sensibles tendían a exhibir una mayor carga de mutación general, no se observó una asociación significativa entre la sensibilidad a METTL3 y la clasificación CMS o el estado de mutación. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la sensibilidad de las células de CRC a la inhibición de METTL3 es independiente de estas características moleculares establecidas.

Para explorar los posibles determinantes de la sensibilidad diferencial a METTL3, examinamos la expresión basal de TE mediante RNA-seq en los modelos de CRC METTL3-sensibles (HT29, COLO201, POP92) e METTL3-insensibles (HCT116, NCI-H716, CSC73). La expresión basal de TE varió sustancialmente entre los modelos: HT29 y COLO201 mostraron una mayor expresión de TE que HCT116, mientras que NCI-H716 mostró niveles de TE aún más altos que HT29 y COLO201 (Fig. 3d-g). De manera similar, CSC73 mostró una mayor expresión de TE que las células de CRC PDX POP92 (Fig. S4b). Los SINE representaron la clase principal de retroelementos con una expresión elevada en los modelos METTL3-sensibles en comparación con los insensibles. Los retroelementos adicionales expresados diferencialmente incluyeron LINE, LTR, ARN pequeño y otras familias de elementos transponibles (Fig. S5a, b). En particular, los retroelementos expresados de forma más elevada en las células METTL3-sensibles se enriquecieron particularmente dentro de las regiones intrónicas y 3′UTR (Fig. S5c, d). Además, el análisis de las subfamilias de Alu^[42] reveló que las células METTL3-sensibles se enriquecieron con las subfamilias AluS y AluJ y se empobrecieron con la subfamilia AluY evolutivamente más joven (Fig. S5e, f).

Tras la inhibición de METTL3, las células HT29, COLO201 y HCT116 mostraron aproximadamente el mismo número de TE regulados al alza y a la baja, mientras que NCI-H716 mostró un patrón distinto con una mayor proporción de retroelementos regulados al alza (Fig. S5g-j). Estos hallazgos indican que el impacto de la regulación postranscripcional dependiente de m⁶A sobre la expresión global de TE varía entre los modelos de CRC y es independiente de su dependencia de METTL3.

En conjunto, nuestros hallazgos demuestran que la expresión basal de TE por sí sola no explica la sensibilidad de las células de CRC a la pérdida de METTL3. Aunque dos modelos METTL3-sensibles (HT29 y COLO201) expresan niveles elevados de TE, un modelo METTL3-insensible (NCI-H716) muestra una expresión de TE comparablemente alta, pero no forma dsRNA tras la inhibición de METTL3. Esto indica que los factores más allá de la expresión de TE, específicamente los niveles de m⁶A y la capacidad de formación de dsRNA, determinan las respuestas de las células de CRC a la inhibición de METTL3. Por lo tanto, si bien la expresión de TE varía entre los modelos de CRC, no es un determinante fiable de la dependencia de METTL3.

La pérdida de METTL3 induce la activación transcripcional de los ISG en las células de CRC con alto contenido de m⁶A

Para investigar más a fondo los mecanismos subyacentes a la variabilidad en la sensibilidad de las células de CRC a la inhibición de METTL3, evaluamos los niveles globales de modificación de m⁶A tras la inhibición de METTL3 en todos los modelos de CRC utilizando un análisis de "dot blot" en ARN total utilizando un anticuerpo anti-m6A. La inhibición de METTL3 redujo significativamente las modificaciones globales de m6A en todos los modelos de CRC evaluados (Fig. S5k), lo que excluye la posibilidad de que la actividad catalítica compensatoria de METTL3 sea la causa de la sensibilidad diferencial. Para cuantificar y mapear las modificaciones de m6A, realizamos una secuenciación de inmunoprecipitación de ARN de metilación (MeRIP-Seq) en ARN total de las células HCT116 y HT29 (Fig. S5l). En ambas líneas celulares, los picos de m⁶A se enriquecieron para el motivo canónico DRACH (Fig. S5m). En particular, las células HT29 exhibieron un número sustancialmente mayor de picos de m⁶A en comparación con las células HCT116, con 21 705 picos identificados en HT29 frente a 8074 en HCT116 (Fig. 4a, b). Coherente con la elevada expresión de los retroelementos intrónicos en HT29 en relación con HCT116 (Fig. S5c), una gran fracción de los picos de m⁶A de HT29 (43,23%, correspondiente a 9390 picos) se mapeó a las regiones intrónicas (Fig. 4a).

Para explorar el papel de la modificación de m6A en la regulación de la actividad inmunostimulante de los ARN derivados de TE, evaluamos los cambios en la metilación de m6A en los transcritos de TE tras la inhibición de METTL3. Coherente con la reducción global de los niveles de m⁶A, identificamos 59 653 transcritos de TE hipometilados tras la inhibición de METTL3 (Fig. 4c). La mayoría de los TE hipometilados fueron LINE, SINE y LTR, ubicados predominantemente dentro de las regiones intrónicas (78,31%) (Fig. 4d y Fig. S6a).

Dado que la modificación de m6A se ha asociado con la promoción de la degradación del ARN^[22],^[43], investigamos si la mayor abundancia de los transcritos de ISG en las células deficientes en METTL3 podría reflejar una alteración de la estabilidad del ARN tras la pérdida de m6A. Al integrar los conjuntos de datos de RNA-seq y MeRIP-seq, identificamos 432 genes en las células HT29 que estaban tanto regulados al alza como hipometilados tras la inhibición de METTL3 (Fig. 4e, f). El análisis GO y de red reveló que estos genes se enriquecieron para las respuestas antivirales y la señalización del tipo I de IFN (Fig. 4g, h). Estos hallazgos sugieren que la pérdida de m6A puede contribuir a la elevada expresión de los ISG en las células deficientes en METTL3 al mejorar la estabilidad del transcrito.

Para evaluar directamente si la expresión de ISG se inducía a nivel transcripcional, realizamos un análisis CUT&RUN (cleavage under targets and release using nuclease)^[44] a nivel del genoma para medir la marca de promotor activo, la trimetilación de la histona 3 lisina 4 (H3K4me3). El análisis CUT&RUN reveló cambios alterados en la ocupación de H3K4me3 para numerosos genes en las células METTL3KD en relación con las células CTRL, con 2779 genes que mostraron un aumento y 50 genes que mostraron una disminución de la deposición de H3K4me3 en sus sitios de inicio de la transcripción (TSS) (Fig. S6b, c). En particular, la mayoría de los 38 ISG regulados al alza en las células HT29 METTL3KD también mostraron un aumento de la ocupación de H3K4me3 en sus TSS (Fig. 5a y Fig. S6d), lo que es coherente con la activación transcripcional. Además, la eliminación del gen MAVS abolió por completo la inducción de ISG tras la eliminación del gen METTL3 (Fig. 2h), lo que demuestra que la pérdida de METTL3 activa la transcripción de ISG a través de la señalización inmune innata dependiente de MAVS en lugar de a través de cambios en la estabilidad del ARN. En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que la inhibición de METTL3 induce programas transcripcionales antivirales, lo que destaca el papel central de la regulación transcripcional en la firma de expresión génica inmune antitumoral observada.

La pérdida de METTL3 induce dsRNA inmunostimulantes IR-Alu

Para caracterizar directamente los dsRNA endógenos inmunostimulantes inducidos por la inhibición de METTL3, realizamos un ensayo de protección con RNasa A/MDA5^[13],^[45], seguido de RNA-seq utilizando ARN citoplasmático de las células HT29 (Fig. 5b). Este ensayo identificó los dsRNA inmunostimulantes protegidos por la proteína MDA5 recombinante. En las células HT29, el 92% y el 94% de las regiones protegidas por MDA5 en CTRL y METTL3KD, respectivamente, se superpusieron con los elementos repetidos (Fig. S7a). Los SINE, en particular los elementos Alu, constituyeron la mayoría de las regiones protegidas por MDA5, y la inhibición de METTL3 resultó en un aumento de 1,7 veces en el número total de elementos repetidos protegidos por MDA5 (73 134 frente a 42 418) (Fig. S7b).

Para explorar cómo los RE generan ARNds inmunostimulante, buscamos pares de repeticiones dentro de 3 kb que pudieran formar estructuras complementarias. Este análisis identificó 20.304 pares de repeticiones capaces de formar ARNds en células CTRL, la mayoría de los cuales (81%) se superponían con los 41.926 pares detectados en células METTL3KD. Clasificamos los 20.304 pares de repeticiones como ARN inmunostimulantes basales y los 25.462 pares de repeticiones detectados únicamente en METTL3KD como ARN inmunostimulantes inducidos por METTL3KD (Fig. 5c). Los ARN inmunostimulantes basales se distribuyeron en regiones intrónicas e intergénicas, mientras que el 84% de los ARN inmunostimulantes inducidos por METTL3KD se localizaron en regiones intrónicas (Fig. 5d). Aunque la expresión de los ARN inmunostimulantes basales fue comparable entre las condiciones CTRL y METTL3KD, METTL3KD mejoró significativamente la protección de MDA5 de los ARNds inmunostimulantes sin necesariamente aumentar su transcripción (Fig. 5e, f y Figuras suplementarias 7c, d, 8a–d). Es importante destacar que casi todos los pares de repeticiones en ambas condiciones correspondieron a IR-Alus (Fig. 5g), y tanto los IR-Alus basales como los IR-Alus inducidos por METTL3KD se enriquecieron con las subfamilias AluS (Figura suplementaria 8e). Estos ARNds inmunostimulantes se transcribieron predominantemente de forma unidireccional, ya sea en orientaciones de sentido (+/+) o antisentido (-/-) (Fig. 5h), una configuración consistente con la formación de estructuras de horquilla en tallo intramoleculares. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la inhibición de METTL3 mejora la formación o persistencia de estructuras de ARNds derivadas de IR-Alu en células de CRC.

Cabe destacar que una mayor expresión basal de TE en las células de CRC no siempre se correlaciona con una mayor expresión de ISG, como se observa en las células HT29 y NCI-H716 (Figura suplementaria 2f). Esto sugiere que los RE expresados no necesariamente forman estructuras de ARNds inmunostimulantes. Nuestros resultados sugieren que este fenómeno depende, al menos en parte, de la actividad de METTL3, por la cual las modificaciones de m⁶A mediadas por METTL3 suprimen la formación de ARNds a partir de RE transcripcionalmente activos. Para probar esta hipótesis, medimos los niveles relativos de metilación de m⁶A dentro del ARNds mediante análisis de blot de puntos de ARN total (entrada) y ARN inmunoprecipitado con el anticuerpo anti-ARNds J2 (J2-IP) (Fig. 6a). Tanto en las células HT29 como en las HCT116, observamos niveles reducidos de m⁶A en las muestras de J2-IP en comparación con el ARN total, lo que indica que los ARNds en el conjunto de ARN total están relativamente hipometilados. Esta observación se corroboró aún más mediante el análisis de la abundancia de ARNds en el ARN total en comparación con el ARN inmunoprecipitado con un anticuerpo anti-m⁶A (m⁶A-IP). En las células HT29, METTL3KD aumentó notablemente la abundancia de ARNds en el ARN total, mientras que esta inducción se atenuó sustancialmente en la fracción metilada con m⁶A (Fig. 6b). Estas observaciones sugieren que los transcritos que contienen modificaciones de m⁶A tienen menos probabilidades de formar o mantener estructuras de ARNds, y que la pérdida de m⁶A aumenta la disponibilidad de ARN que pueden plegarse en ARNds.

De manera consistente, el mapeo de la densidad de m⁶A en las regiones protegidas por MDA5 reveló que los ARNds derivados de repeticiones inducidos por METTL3KD se originan en loci genómicos que normalmente están enriquecidos con m⁶A (Fig. 6c), lo que demuestra un aumento de la abundancia y/o accesibilidad de especies de ARNds largas. Estos efectos se producen sin cambios detectables en la vida media del ARN para los transcritos derivados de repeticiones seleccionados, según lo medido por el seguimiento con actinomicina D seguido de RT-qPCR (Figura suplementaria 9a), lo que indica que estos cambios es poco probable que resulten de una alteración de la estabilidad del ARN.

Aunque RNAfold no predijo diferencias globales en la energía libre mínima entre secuencias metiladas y no metiladas para las secuencias seleccionadas (Figura suplementaria 9b–d), esto es consistente con la evidencia previa de que m⁶A influye principalmente en el plegamiento local y cinético del ARN en lugar de en la termodinámica global. Los estudios de RMN y bioquímicos han demostrado que m⁶A debilita el apilamiento de bases y desestabiliza las estructuras de dúplex locales^[46]–^[48], lo que apoya la idea de que la pérdida de m⁶A favorece la formación o persistencia de conformaciones de ARNds. Las estructuras de horquilla en tallo inferidas a partir del ensayo de protección con RNasa A/MDA5 son consistentes con el emparejamiento intramolecular de elementos IR-Alu orientados de forma convergente.

El análisis de blot de puntos mostró además niveles basales más altos de ARNds y m⁶A en los modelos de CRC METTL3-sensibles en comparación con los modelos METTL3-insensibles (Fig. 6d). En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que los CRC METTL3-sensibles, caracterizados por una mayor deposición de m⁶A y la capacidad de generar ARNds derivados de RE, acumulan niveles más altos de ARNds después de METTL3KD, lo que desencadena la mimetización viral y la muerte de las células cancerosas. Por el contrario, los CRC METTL3-insensibles, a pesar de que a veces exhiben una alta expresión basal de TE, muestran bajos niveles de m⁶A y no generan ARNds suficientes o suficientes tras METTL3KD para superar el umbral requerido para la activación antiviral, y por lo tanto no sufren citotoxicidad mediada por la mimetización viral (Fig. 6e).

La inhibición de DNMT combinada con la depleción de METTL3 supera la resistencia y reduce la carga tumoral de CRC in vivo

Dado que un subconjunto de CRC son insensibles al direccionamiento de METTL3 debido a la reducción de la modificación de m⁶A y contienen niveles basales más bajos de ARNds, lo que impide que acumulen ARNds inmunostimulantes suficientes para superar el umbral de estrés del ARNds (Fig. 6e), tratamos las células HCT116 METTL3-insensibles con decitabina (DAC), un DNMTi conocido por inducir ARNds y respuestas de mimetización viral en CRC^[6],^[13]. La justificación de esta combinación se basa en múltiples estudios que demuestran que el tratamiento con DNMTi induce la transcripción endógena de ARNds y desencadena la mimetización viral en diversos tipos de cáncer^[6],^[7],^[49]. Además, los primeros estudios clínicos han demostrado que la combinación de la inhibición de DNMT con el bloqueo de puntos de control inmunitario, a través de la mimetización viral, puede mejorar las respuestas terapéuticas en pacientes con cánceres refractarios, incluidos los informes de altas tasas de respuesta completa en el linfoma de células NK/T resistente a la inmunoterapia^[50].

La combinación de la depleción de METTL3 con el tratamiento con DAC aumentó significativamente la expresión de 178 genes en las células HCT116, con los principales procesos biológicos enriquecidos relacionados con las vías antivirales y la señalización del interferón de tipo I (Fig. 7a y Figura suplementaria 10a). RNA-seq reveló además que esta combinación mejoró la inducción de la firma ISG38 tanto en las células HCT116 METTL3-insensibles como en las células HT29 METTL3-sensibles (Fig. 7b), un hallazgo que se validó aún más mediante el análisis de qPCR de ISG representativos, incluidos IRF7, ISG15 y MX1 (Figura suplementaria 10b, c).

Coherente con estos cambios transcripcionales, los ensayos de CellTiter-Glo y de formación de colonias demostraron que el tratamiento con DAC mejoró los efectos antitumorales de la inhibición de METTL3 tanto en los modelos de CRC METTL3-sensibles como en los METTL3-insensibles (Figura suplementaria 10d–h), lo que sugiere que la inhibición de DNMT puede superar la resistencia al direccionamiento de METTL3.

A continuación, investigamos si esta combinación afecta la frecuencia de las células cancerosas iniciadoras (CIC). En las células HT29, el direccionamiento de METTL3 solo redujo la frecuencia de CIC, y la combinación con DAC mejoró aún más este efecto. Por el contrario, la frecuencia de CIC en las células HCT116 no se vio afectada por METTL3KD solo, pero se redujo significativamente cuando la inhibición de METTL3 se combinó con DAC (Fig. 7c, d). METTL3KD también disminuyó la concentración efectiva media (CE50) de DAC en 4 veces en las células HT29 y en 2,3 veces en las células HCT116 (Fig. 7e, f).

Para evaluar aún más el potencial terapéutico del direccionamiento de METTL3 solo o en combinación con DAC in vivo, inyectamos células no transducidas (NT), control (CTRL) y METTL3KD, HT29 y HCT116 en los flancos de ratones NSG inmunodeficientes. Una vez que los tumores en los grupos CTRL alcanzaron aproximadamente los 100 mm³, los ratones fueron tratados con DAC (0,5 mg/kg) en dos ciclos de 4 días, con un descanso de 3 días entre los ciclos (Fig. 8a, d). El tratamiento con DAC a baja dosis solo no tuvo un efecto significativo en el crecimiento tumoral en ninguno de los modelos, lo que es consistente con los resultados de los ensayos clínicos de DAC en tumores sólidos^[51],^[52]. En las células HT29 METTL3-sensibles, METTL3KD solo demostró efectos antitumorales significativos (Fig. 8b, c y Figura suplementaria 11a). Por el contrario, las células HCT116 METTL3KD crecieron de manera similar a las células CTRL en los ratones tratados con vehículo (Fig. 8e, f y Figura suplementaria 11b). Es importante destacar que el tratamiento con DAC en combinación con METTL3KD en las células HCT116 exhibió una actividad antitumoral significativa. En conjunto, estos hallazgos sugieren que las terapias contra el cáncer, como DAC, que aumentan la acumulación de ARNds endógenos, pueden sensibilizar los CRC al direccionamiento de METTL3, lo que destaca una posible estrategia combinatoria para un tratamiento más eficaz del CRC.

En resumen, nuestros hallazgos indican que el direccionamiento de METTL3 induce la muerte de células tumorales impulsada por la mimetización viral en un subconjunto de CRC caracterizados por una alta deposición de m⁶A y la capacidad de generar ARNds, mientras que los CRC con una capacidad limitada de formación de ARNds son resistentes. Sin embargo, el aumento de los niveles endógenos de ARNds mediante la inhibición de DNMT puede sensibilizar estos modelos resistentes al direccionamiento de METTL3, lo que destaca una prometedora estrategia combinatoria para la terapia del CRC.

Discusión

Si bien se ha examinado el papel de METTL3 en CRC^[30],^[31],^[53],^[54], su contribución a la regulación inmunitaria innata y la mimetización viral ha permanecido poco clara. Aquí, identificamos un posible mecanismo por el cual las células de CRC evaden la inmunidad antiviral y demostramos que la dependencia de METTL3 varía ampliamente entre los modelos de CRC. En los CRC METTL3-sensibles, la inhibición de METTL3 desencadena una señalización antiviral robusta y supresión tumoral in vivo. Por el contrario, los CRC METTL3-insensibles montan solo respuestas de tipo I IFN mínimas o subletales, lo que requiere una elevación adicional de los ARNds endógenos, como a través de la inhibición de DNMT, para restaurar la activación de la mimetización viral y la muerte celular.

Un determinante clave de esta sensibilidad diferencial es la capacidad dependiente de m⁶A de los transcritos derivados de retroelementos para formar ARNds. Los CRC METTL3-sensibles se caracterizan por una alta deposición global de m⁶A y una competencia preservada para la formación de ARNds, lo que permite que la pérdida de METTL3 promueva la acumulación de ARNds derivados en gran medida de los elementos IR-Alu intrónicos. Estos elementos normalmente se mantienen en un estado no inmunogénico a través de una extensa metilación de m⁶A; la depleción de METTL3 permite que estos transcritos se plieguen o persistan como ARNds, activando MAVS, induciendo ISG y desencadenando la muerte celular dependiente de PKR. Por el contrario, los CRC METTL3-insensibles, incluidos aquellos con una alta expresión basal de TE, exhiben una baja deposición de m⁶A y una capacidad limitada para la formación de ARNds, lo que destaca que la producción transcripcional por sí sola no dicta la sensibilidad a METTL3.

Mecanísticamente, nuestros hallazgos sugieren cómo m⁶A influye en el destino estructural de los transcritos que contienen IR-Alu. Los estudios bioquímicos y estructurales han demostrado que m⁶A desestabiliza los dúplex de ARN al interrumpir el apilamiento de bases y alterar la cinética de anillamiento^[46],^[55],^[56], lo que proporciona una justificación biofísica de cómo la pérdida de m⁶A puede promover la formación o persistencia de ARNds derivados de IR-Alu. Si bien los enfoques de mapeo de la estructura del ARN global, como DMS-seq o SHAPE-seq, podrían refinar aún más este modelo^[57],^[58], estos métodos no pueden distinguir fácilmente los ARNds inmunostimulantes de IR-Alu de otros ARN estructurados. En este contexto, nuestro ensayo de protección con RNasa A/MDA5 es particularmente informativo, ya que enriquece selectivamente los ARNds capaces de interactuar con los sensores inmunitarios innatos.

Observamos que nuestros datos resuelven la abundancia de ARNds endógenos en estado estacionario y las salidas de señalización asociadas, pero no dividen las contribuciones cinéticas ascendentes de la producción de transcritos versus la degradación. Dados los mecanismos mediados por los lectores de m⁶A establecidos, incluidos los mecanismos dependientes de YTHDF e IGF2BP que regulan la estabilidad y la rotación del ARN, la alteración de la cinética de degradación puede contribuir plausiblemente a los cambios de ARNds observados^[22],^[43],^[59]; sin embargo, nuestro enfoque está en el punto final biológicamente decisivo, es decir, si los ARNds derivados de repeticiones superan una abundancia y un umbral estructural suficientes para interactuar con la detección inmunitaria innata y los efectores posteriores en CRC.

SPANISH TRANSLATION:

Nuestros datos indican además que la inducción de ISG tras la pérdida de METTL3 se debe principalmente a la detección del dsRNA acumulado, en lugar de a una alteración en la estabilidad de los transcritos inmunitarios. El aumento de la ocupación de H3K4me3 en los promotores de ISG, la actividad inmunostimulante del ARN de las células con METTL3 deficiente y la pérdida de la inducción de ISG en las células deficientes en MAVS demuestran colectivamente que la señalización antiviral mediada por dsRNA es la vía dominante. Aunque METTL3 participa en procesos metabólicos adicionales del ARN que también pueden contribuir al fenotipo observado, el rescate sustancial de la citotoxicidad en las células con doble deleción de PKR/METTL3 destaca la mimetización viral como el principal impulsor de la muerte celular.

Gao y colaboradores demostraron previamente que la pérdida de METTL3 durante la hematopoyesis fetal murina conduce a la acumulación de dsRNA derivados predominantemente de transcritos codificantes de proteínas^[27]. Si bien estos hallazgos resaltan un papel conservado de METTL3 en la limitación de la formación de dsRNA, nuestros resultados identifican una fuente mecanísticamente distinta de dsRNA inmunogénico en el CRC humano. A través de la integración del perfilado de m⁶A con ensayos de protección de RNasa A/MDA5, mostramos que los elementos IR-Alu constituyen los principales dsRNA que activan MDA5 tras la pérdida de METTL3, un resultado probablemente influenciado tanto por los diferentes contextos biológicos como por la expansión específica de primates de los repetidos Alu. Además, demostramos una heterogeneidad sustancial entre los modelos de CRC en su capacidad para generar dsRNA y mostramos que la inhibición de DNMT, un conocido activador del dsRNA de retroelementos, se sinergiza con la focalización de METTL3 para superar la resistencia.

En consonancia con nuestros hallazgos, un estudio reciente de Li y colaboradores informó que la deficiencia de METTL3 en las células epiteliales mamarias conduce al enriquecimiento de transcritos derivados de retroelementos, incluidos Alu, LINE y ARN de ERV, y provoca una respuesta de interferón de tipo I^[60]. Esta observación en un modelo epitelial ortogonal apoya un papel conservado de METTL3 en la restricción del ARN inmunostimulante derivado de repetidos en los tejidos. Nuestro trabajo extiende estos hallazgos al identificar los elementos IR-Alu como la fuente predominante de dsRNA que activa MDA5 en el CRC humano y al demostrar que la dependencia de METTL3 no se rige simplemente por la expresión de retroelementos, sino por la competencia estructural dependiente de m⁶A de los transcritos derivados de repetidos para formar dsRNA. En conjunto, estos estudios destacan el ARN derivado de repetidos como un sustrato recurrente de la evasión inmune mediada por METTL3, al tiempo que subrayan las diferencias específicas del contexto en la naturaleza y el potencial inmunogénico de estos transcritos.

Estas perspectivas mecanísticas tienen implicaciones terapéuticas directas. Los inhibidores de METTL3, como el compuesto en fase clínica STC-15 (NCT05584111), se están evaluando actualmente para el tratamiento de tumores sólidos^[29]. Nuestros resultados sugieren que su eficacia en el CRC dependerá del paisaje basal de m⁶A y del potencial de formación de dsRNA de los transcritos IR-Alu. Para superar este desafío y ampliar el potencial terapéutico de los inhibidores de METTL3 para el tratamiento de tumores sólidos, nuestros hallazgos proporcionan una base para combinar la focalización de METTL3 con los inhibidores de DNMT y, posiblemente, con otros enfoques que eleven los niveles de dsRNA inmunostimulante, incluida la inhibición farmacológica de CDK4/6, LSD1 o G9a, así como la alteración genética de los factores de silenciamiento de retroelementos, como SETDB1 o la exonucleasa XRN1^[10],^[11],^[49],^[61]–^[64]. Sin embargo, el potencial terapéutico de estas combinaciones adicionales debe explorarse y validarse experimentalmente.

Finalmente, nuestros hallazgos proporcionan un modelo unificador en el que la susceptibilidad del CRC a la focalización de METTL3 no está determinada únicamente por la expresión de retroelementos, sino por la competencia estructural dependiente de m⁶A de los transcritos derivados de RE para formar dsRNA inmunostimulante. Los CRC con un alto m⁶A global albergan un gran conjunto de transcritos IR-Alu preparados para la formación de dsRNA tras la pérdida de METTL3, mientras que los CRC con bajo m⁶A carecen de esta capacidad y permanecen resistentes. Aunque estas conclusiones están respaldadas por modelos de líneas celulares y PDX, una evaluación adicional en especímenes primarios de CRC será esencial para establecer la relevancia clínica y desarrollar biomarcadores que predigan la respuesta a las terapias dirigidas a METTL3, solas o en combinación con la inhibición de DNMT.

Métodos

Líneas celulares y condiciones de cultivo

Las células HT29 (HTB-38™) fueron amablemente proporcionadas por el grupo del Prof. Colin Goding en el Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Oxford. HCT116 (CCL-247™), COLO201 (CCL-224™), NCI-H716 (CCL-251™) y las células normales de colon CCD 841 CoN (CRL-1790™) se adquirieron de ATCC. Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano HT29 y HCT116 se cultivaron en medio McCoy’s 5 A suplementado con penicilina-estreptomicina (1%) y suero fetal bovino (10%). Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano COLO201 y NCI-H716 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con penicilina-estreptomicina (1%) y suero fetal bovino (10%). Las células normales de colon CCD 841 CoN se cultivaron en ATCC-EMEM, suplementado con penicilina-estreptomicina (1%) y suero fetal bovino (10%).

Las células HT29 se autenticaron mediante Eurofins Genomics utilizando tecnología de un solo locus basada en PCR. Se analizaron dieciséis loci STR independientes (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, AMEL, D5S818, FGA, D19S433, vWA, TPOX y D18S51). Las células resultaron negativas para la contaminación por micoplasma. Además, ATCC realiza un perfilado STR para la autenticación de líneas celulares y realiza pruebas de micoplasma antes de la distribución.

Se proporciona una lista completa de los reactivos y kits utilizados en este estudio, incluida la información del proveedor y los números de catálogo, en los Datos Suplementarios 3.### Células de cáncer colorrectal derivadas de pacientes

Las muestras de tumores colorrectales humanos se recogieron en el momento de la resección quirúrgica tras el consentimiento informado del paciente, según los protocolos aprobados por la Junta de Ética de la Investigación del University Health Network (Toronto, Canadá). Los modelos de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) de cáncer colorrectal fueron amablemente proporcionados por el laboratorio de la Dra. Catherine O’Brien. Estos xenoinjertos se generaron mediante la implantación subcutánea de células tumorales en los flancos de ratones NOD-SCID de 6 a 8 semanas de edad^[65]. Las células derivadas del tumor se mantuvieron como esferoides en medio DMEM/F-12 suplementado con penicilina-estreptomicina (1%) (Thermo Fisher), 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, suplemento N2, suplemento neuronal NeuroCult SM1, heparina (4 µg ml−1), 0,2% de mezcla lipídica, factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 ng ml−1) y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF; 10 ng ml−1). Las células se autenticaron utilizando el perfilado de repeticiones cortas en tándem y se comprobó que eran negativas para el micoplasma.### Tratamiento farmacológico

El inhibidor de la ADN metiltransferasa, Decitabina (DAC; 5-Aza-2’-desoxicitidina), se reconstituyó en PBS en concentraciones de 10 mM y se almacenó a − 80 °C. Para los experimentos in vitro, las células se sembraron 24 horas antes del tratamiento a 50.000 células/mL y luego se trataron con Decitabina (300 nM) o se dejaron sin tratar (control). Las células se mantuvieron en cultivo durante 5 días. Luego, las células se recogieron y se utilizaron para el análisis posterior.### Generación de células con METTL3 silenciado

Los vectores lentivirales que contienen shRNA (KD1/KD2/KD3/KD4) dirigidos a METTL3 humano con proteína fluorescente verde turbo (TurboGFP) como CTRL se generaron a partir de plásmidos pLKO1 adquiridos de Sigma-Aldrich. Las secuencias de shRNA se muestran en los Datos Suplementarios 4. Las partículas virales se produjeron mediante transfección de fosfato de calcio^[66] y se concentraron utilizando polietilenglicol (PEG). En resumen, las células CRC METTL3KD y de tipo salvaje (CTRL) se generaron mediante la transducción de partículas lentivirales basadas en shRNA. Las células CRC se sembraron en placas de 12 pocillos (100.000 células por mL) y se transducieron con 30 µL de virus concentrados 200x. 72 horas después de la transducción, las células GFP+ se clasificaron utilizando un clasificador Sony MA900 o se seleccionaron con puromicina a 2 µg ml−1, y el silenciamiento de METTL3 se confirmó a nivel de ARNm y proteína mediante qPCR y Western blot, respectivamente.### Extracción de ARN y qPCR

Las células de cáncer colorrectal CTRL (TGFP) y/o METTL3KD1/2/3/4 se trataron con Decitabina (300 nM) o se dejaron sin tratar (MT). 5 días después del tratamiento, las células se recogieron, se lavaron en PBS y se utilizaron para la extracción de ARN. El ARN total se extrajo con el kit RNeasy Mini siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, después de añadir tampón RLT y 70% de etanol a los gránulos celulares, se realizó la digestión de la DNasa en columna utilizando el kit QIAGEN RNase-Free DNase Set (catálogo 79256). Se cuantificó el ARN total utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 2000 y las muestras con relaciones A260/A280 ≥ 1,8 se consideraron adecuadas para las aplicaciones posteriores. Para el secuenciamiento de ARN, se utilizaron 500 ng de ARN total para la preparación de la biblioteca. Para la síntesis de ADNc, se utilizaron de 500 ng a 1 µg de ARN y se transcribieron a ADNc utilizando el kit SuperScript IV VILO cDNA Synthesis Kit según las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó por triplicado utilizando de 10 a 20 ng de ADNc por reacción de 20 µL, que consistía en 5 µL de plantilla de ADNc, 10 µL de SYBR Select Master Mix y 0,2 µM de cada uno de los cebadores directo e inverso. La amplificación se realizó en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems). Los niveles de expresión de ARNm relativos se normalizaron a GAPDH y se expresaron en relación con el grupo de control. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en los Datos Suplementarios 5.### Preparación de la biblioteca para el secuenciamiento del ARN total

Las bibliotecas de secuenciamiento de ARN total se prepararon en el Oxford Genomics Centre (OGC) o por GENEWIZ® (Azenta Life Sciences). Para las muestras procesadas en OGC, la concentración de ARN se midió utilizando el ensayo RiboGreen (Invitrogen) en un lector de placas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech) y la integridad del ARN se evaluó utilizando el Agilent 2200 o 4200 TapeStation con RNA ScreenTape. Los números de integridad del ARN (RIN) oscilaron entre 5,5 y 10. Se utilizaron 100 nanogramos de ARN total como entrada para la preparación de la biblioteca. El ARN ribosómico se eliminó utilizando el kit NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat; New England Biolabs) y se generaron bibliotecas específicas de cadena utilizando el kit NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina. Las bibliotecas se amplificaron (14 ciclos), se cuantificaron, se normalizaron, se agruparon y se prepararon para el secuenciamiento según los protocolos estándar. El secuenciamiento de lectura emparejada se realizó en una plataforma Illumina NovaSeq 6000 (Illumina; kit de reactivos NovaSeq 6000 S4, 300 ciclos). Las muestras procesadas por GENEWIZ® (Azenta Life Sciences) se prepararon utilizando un flujo de trabajo de depleción de ribosomas específico de cadena con el kit NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) y se secuenciaron en una plataforma Illumina NovaSeq X según los protocolos estándar del proveedor.### Análisis del secuenciamiento de ARN

Todos los archivos FASTQ de secuenciamiento se recortaron utilizando el programa TrimGalore (v0.6.2), un envoltorio alrededor de Cutadapt, con los parámetros predeterminados^[67]. Los archivos FASTQ recortados se alinearon luego al genoma humano (hg38) utilizando el programa de alineación STAR (v2.7.9a)^[68] a menos que se especifique lo contrario. Los duplicados se marcaron y eliminaron utilizando el programa Picard (v3.0.0)^[69]. Se descargó un archivo de formato de transferencia de genes (GTF) que contenía anotaciones para los genes de referencia humanos del Navegador del Genoma UCSC como gencode.v21.annotationGRCh38.gtf.### Análisis de la expresión génica diferencial

Este archivo GTF para la anotación de genes se utilizó con el comando featureCounts de las herramientas subread (v1.6.4)^[70] para cuantificar el número de lecturas asignadas a cada gen. Los genes con un recuento de lecturas inferior a 10 en todas las muestras se eliminan del análisis posterior. edgeR (v3.40.2)^[71] se utilizó para identificar los genes expresados diferencialmente (DEG) en las comparaciones por pares, los DEG se denominan genes con un cambio absoluto mayor que 2 y un FDR inferior a 0,05.

Los 200 genes más significativamente sobreexpresados se enviaron al sitio web STRING (https://string-db.org/; v11.5) para obtener términos enriquecidos de Gene Ontology y Reactome Pathways. Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) dentro del software GSEA (v4.3.2) para obtener firmas de conjuntos de genes significativamente enriquecidos. Los 10 términos GO más enriquecidos y sus genes asociados se visualizaron como redes generadas utilizando Cytoscape (v3.10.0)^[72].

Se realizaron análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes en muestras individuales (ssGSEA) utilizando el paquete GSVA Bioconductor (v1.46.0)^[73] para obtener la puntuación de enriquecimiento de los 38 genes centrales estimulados por el interferón definidos por Liu y sus colegas^[37].

Análisis de la expresión diferencial de elementos repetidos

Los recuentos de lecturas de los elementos repetidos (RE) se cuantificaron aplicando la canalización SQulRE^[74]. A continuación, la matriz de recuentos de lecturas se analizó con el paquete edgeR para buscar RE con expresión diferencial. Para cada muestra, se determinó su tamaño de biblioteca como el número total de lecturas mapeadas al genoma humano. Los RE con recuentos de lecturas inferiores a 10 en todas las muestras se eliminaron del análisis posterior. Los RE con expresión significativamente diferente se identificaron como aquellos con un cambio absoluto en la expresión mayor que 2 y un FDR inferior a 0,05. La distribución genómica de los RE con expresión diferencial se analizó con el paquete Bioconductor GenomicDistributions (v3.17)^[75].

Western blot

Las células se lisaron en un tampón que contenía 0,1% de SDS, 400 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl, 1% de Triton X-100 y un cóctel de inhibidores de proteasas Halt (Thermo Fisher Scientific). Los lisados celulares totales se clarificaron y se cuantificaron las concentraciones de proteína utilizando un ensayo BCA (Promega). Se utilizaron cantidades iguales de proteína (40-50 µg), se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 minutos y se cargaron y resolvieron en geles Mini-PROTEAN TGX de 4-20%. A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Trans-Blot Turbo Midi (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon en 5% de BSA y se incubaron con anticuerpos primarios contra METTL3 (D2I6O, #96391S, Cell Signalling Technology; dilución 1:1000), PKR (EPR19374, ab184257, Abcam; dilución 1:2000), RNase L (E-9, sc-74405, Santa Cruz; dilución 1:1000), MAVS (ab89825, Abcam; dilución 1:1000), α-tubulina (T9026, Sigma-Aldrich; dilución 1:3000) o vinculina (#700062, Invitrogen; dilución 1:3000). Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP: anti-rabbit IgG (#7074S, Cell Signalling Technology; dilución 1:5000) o anti-mouse IgG (#7076S, Cell Signalling Technology; dilución 1:5000). Los inmunoblots se revelaron utilizando el sustrato Clarity o ClarityMax Western ECL (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de protección MDA5

Para identificar el ligando primario de MDA5 en las células de cáncer colorrectal que eran de tipo salvaje (transducidas con el plásmido de control pLKO1) o con METTL3 desactivado (KD), realizamos un ensayo de protección de RNase A/MDA5 seguido de secuenciación de ARN, como se describió previamente^[13],^[45]. Brevemente, el ARN citosólico se aisló de las líneas celulares de cáncer colorrectal HT29 utilizando el kit QIAGEN RNeasy Mini. El ARN citosólico purificado se preincubó con proteína recombinante MDA5-Δ2CARD (150 nM; amablemente proporcionada por el Dr. Kazuki Kato) a temperatura ambiente durante 10 minutos en un tampón que contenía 20 mM de HEPES (pH 7,5), 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl₂ y 2 mM de DTT. A continuación, se añadió RNase A hasta una concentración final de 2 ng/µL y las muestras se incubaron durante 5 minutos adicionales a temperatura ambiente. La digestión se detuvo mediante la adición de reactivo TRIzol y el ARN se purificó utilizando el kit Zymo Direct-zol RNA Miniprep según las instrucciones del fabricante. Para eliminar los pequeños fragmentos de ARN (< 100 pb) generados durante el tratamiento con RNase A, las muestras se purificaron aún más utilizando el kit QIAGEN RNeasy Mini. El ARN resultante se utilizó posteriormente para la preparación de la biblioteca.

Preparación de la biblioteca y secuenciación del ARN protegido por MDA5

Las bibliotecas de cDNA se generaron en la Unidad de Genómica de Células Únicas del Weatherall Institute of Molecular Medicine (WIMM) utilizando 100 ng de ARN de entrada y el kit de preparación de bibliotecas KAPA RNA HyperPrep con RiboErase (Roche), siguiendo las pautas del fabricante con modificaciones menores. Para la fragmentación del ARN, las muestras totales de ARN citosólico se incubaron a 94 °C durante 8 minutos, mientras que las muestras de ARN protegido por MDA5 se fragmentaron a 65 °C durante 1 minuto. La ligación del adaptador se realizó utilizando 1,5 µM de adaptadores KAPA Unique Dual-Indexed. La amplificación de la biblioteca se llevó a cabo en un termociclador C1000 Touch (Bio-Rad). La desnaturalización inicial se realizó a 98 °C durante 45 segundos, seguida de 11 ciclos de PCR para las bibliotecas de ARN citosólico total o 16 ciclos para las bibliotecas de ARN digerido por RNaseA y protegido por MDA5 (98 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos). Se realizó un paso de extensión final a 72 °C durante 1 minuto. Las bibliotecas amplificadas se purificaron utilizando una limpieza con 1 × KAPA Pure Bead y se eluyeron en 20 µL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0). La calidad de la biblioteca y la distribución del tamaño de los fragmentos se evaluaron utilizando el ensayo Agilent D5000 ScreenTape en el sistema 2200 TapeStation. Las bibliotecas derivadas del ARN citosólico total y del ARN protegido por MDA5 se agruparon y se secuenciaron a 6 pM utilizando lecturas pareadas de 150 pb en una plataforma Illumina NovaSeq X Plus (Novogene).

Análisis del ensayo de protección MDA5

Se descargó un archivo GTF que contiene loci de elementos repetidos de todo el genoma, anotados por RepeatMasker, de la tabla del Navegador del Genoma UCSC. Este archivo GTF se utilizó con el comando featureCounts para cuantificar el recuento de lecturas para cada locus de elemento repetido de los archivos BAM. Las lecturas que no se asignaron a los loci repetidos se consideraron lecturas no repetidas. A continuación, se agregaron los recuentos de lecturas para cada clase de repetición y se calculó el porcentaje de lecturas para cada clase como la relación entre los recuentos de la clase de repetición y el número total de lecturas en el archivo BAM.

Identificación de regiones protegidas por MDA5

Las regiones protegidas por MDA5 se identificaron como picos de señal de secuenciación de las muestras tratadas con RNaseA en comparación con las muestras de ARN citosólico total. Para cada muestra, los archivos BAM totales se dividieron en archivos BAM alineados en la cadena directa y archivos BAM alineados en la cadena inversa, y luego se llamaron picos de los archivos BAM específicos de la cadena utilizando MACS2 (v2.2.6)^[76] con los siguientes parámetros: -q 0.01 –keep-dup all –nomodel. Los picos identificados de las cadenas directa e inversa se combinaron para el análisis posterior. Se generaron mapas de calor que visualizan las señales en las regiones de los picos utilizando deepTools (v3.5.3)^[77]. Al comparar los picos identificados de dos grupos, aquellos que comparten al menos el 20% de sus regiones se clasificaron como picos comunes, mientras que el resto se designaron como picos específicos del grupo.

Identificación de repeticiones invertidas protegidas por MDA5

Primero, localizamos todos los loci de elementos repetidos que se superponen con al menos el 30% de las regiones protegidas por MDA5 identificadas previamente. A continuación, para identificar pares de elementos repetidos cercanos que puedan complementarse para formar estructuras de doble cadena, nos centramos en los pares separados por menos de 3 kb. Específicamente, la distancia entre el extremo del elemento repetido aguas arriba y el inicio del elemento repetido aguas abajo debía estar dentro de este límite. Dentro del umbral de distancia definido, cada elemento repetido podía formar múltiples pares potenciales. Para evaluar si estos pares podían formar estructuras de doble cadena complementarias inversas, realizamos un alineamiento local en orientación complementaria inversa utilizando el algoritmo de Smith-Waterman implementado en la herramienta exonerate (v2.2.0)^[78] con los parámetros predeterminados. Se aplicaron dos puntuaciones de penalización: una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 4, que son los valores predeterminados del programa. Los pares con una puntuación de alineamiento inferior a 500 se descartaron. Finalmente, los pares de repetición separados por menos de 3 kb y con una puntuación complementaria inversa superior a 500 se clasificaron como repeticiones invertidas (IR). Se contó el número de IR identificados en cada grupo y se compararon sus intersecciones. La distribución genómica de las regiones protegidas por MDA5 y las repeticiones invertidas se analizó con el paquete Bioconductor GenomicDistributions^[75].

Ensayo de formación de colonias y cristal violeta

El número de células se contó utilizando un contador de células automatizado TC20 (Bio-Rad). Para los ensayos de cristal violeta, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a densidades de 1.000 a 1.500 células por pocillo para los ensayos de formación de colonias y de 1,0 × 10⁵ a 1,5 × 10⁵ células por pocillo para los ensayos de proliferación. Las células se cultivaron hasta que los pocillos de control se acercaron a la confluencia. Al final del ensayo, los pocillos se lavaron dos veces con PBS frío, se fijaron en metanol frío durante 10 minutos sobre hielo y, a continuación, se tiñeron con cristal violeta al 0,5% preparado en 25% de metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente. El exceso de tinte se eliminó lavando las placas a fondo (al menos seis veces) con agua destilada. Las placas se secaron al aire y se capturaron imágenes utilizando una cámara digital.

Generación de líneas celulares de doble desactivación (DKO)

Las células HT29 de desactivación única (KO) de METTL3 se generaron utilizando un sgRNA diseñado a medida (Invitrogen, #A35534) dirigido a METTL3 humano (secuencia: CUUAGAUCUACGGAAUCCAG). Las células se sembraron a 5 × 10⁵ células por pocillo en placas de 6 pocillos y se transfectaron al día siguiente con proteína Cas9 (Invitrogen, #A36498) y sgRNA utilizando el reactivo Cas9 PLUS y Lipofectamine CRISPRMAX (Invitrogen, CMAX00003) en Opti-MEM, según las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, las células individuales se sembraron en placas de 96 pocillos para obtener clones monoclonales. La eficiencia de la desactivación se validó mediante inmunoblotting.

Para la generación de células HT29 de doble desactivación (DKO), se editó aún más un clon KO de METTL3 validado utilizando sgRNA prediseñados de IDT (secuencias proporcionadas en los Datos Suplementarios 6). Los complejos de ribonucleoproteínas (RNP) se ensamblaron combinando crRNA Alt-R™ CRISPR–Cas9 con tracrRNA Alt-R™ CRISPR–Cas9 (IDT, #1072533) y nucleasa Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 V3 (#1081061), según las instrucciones del fabricante. Los complejos RNP se administraron mediante electroporación utilizando el código de pulsos EH115 con el kit Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X (Lonza, #V4XP-3032). Después de 48 horas, las células individuales se clasificaron en placas de 96 pocillos para obtener clones DKO monoclonales. La interrupción exitosa del gen se confirmó mediante inmunoblotting.

Las células HT29 de desactivación de PKR (EIF2AK2), MAVS y RNaseL se generaron utilizando sgRNA prediseñados de IDT y la misma estrategia de electroporación RNP descrita anteriormente.

Ensayo de dilución limitante in vitro (LDA)

Para los ensayos de dilución limitante in vitro (LDA), las células HT29 y HCT116 de control (CTRL) o con METTL3 desactivado (METTL3KD) se trataron con decitabina (300 nM) o control vehículo (PBS) el día 0 y se mantuvieron en cultivo durante 5 días. El día 5, las células se recogieron, se lavaron para eliminar el fármaco residual, se disociaron en suspensiones de células individuales y se sembraron en placas de 96 pocillos a diluciones seriadas (1, 10, 100 o 1000 células por pocillo). Para cada densidad celular, se sembraron un mínimo de 18 pocillos y, para un menor número de células, se sembraron al menos 72 pocillos. Después de 4 semanas de cultivo, se puntuaron los pocillos para la formación de colonias en función de la presencia o ausencia de colonias. La frecuencia de células iniciadoras de cáncer (CIC) se calculó utilizando el software de análisis de dilución limitante extrema (ELDA) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html) proporcionado por el Walter and Eliza Hall Institute^[79].

Experimento in vivo

Todos los procedimientos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley del Reino Unido sobre Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y con la aprobación del Comité de Revisión Ética y de Bienestar Animal de la Universidad de Oxford, bajo el número de licencia de proyecto (PPL) PP7109477. Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en el Centro de Genética Humana, en un ambiente con una temperatura de 19 a 23 °C, con una humedad relativa del 45 al 65 % y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se inyectaron por vía subcutánea a ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) (Charles River Laboratories, cepa 614), de entre seis y ocho semanas de edad, con 5 × 10⁵ células HT29 o 2,5 × 10⁵ células de cáncer colorrectal HCT116. La decitabina (Sigma-Aldrich) se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se administró una vez que los tumores del grupo de control alcanzaron aproximadamente los 100 mm³. Los ratones recibieron decitabina a 0,5 mg/kg por inyección intraperitoneal una vez al día durante cuatro días consecutivos, seguida de un descanso de 3 días y otros cuatro días consecutivos de tratamiento. Los animales de control recibieron inyecciones intraperitoneales de PBS según el mismo protocolo. Se monitorizó el crecimiento tumoral hasta que los tumores del grupo tratado con el vehículo alcanzaron el tamaño máximo permitido, sin que ningún tumor superara los 1500 mm³.

Ensayo de reportero del promotor de IFNβ

Las células HEK293 con reportero del promotor de IFNβ (p125-HEK), incluidas las células de tipo salvaje (WT) y las células con deleción de MAVS (MAVSKO), fueron amablemente proporcionadas por el laboratorio del Prof. Jan Rehwinkel y se establecieron originalmente como se describió anteriormente ^[80]. Para los ensayos de luciferasa, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Corning) a una densidad de 1 × 10⁴ a 2 × 10⁴ células por pocillo. Al día siguiente, las células se transfectaron con 100 ng de ARN total aislado de las células HT29 o HCT116 utilizando 0,2 μL de Lipofectamine 2000 por pocillo. La actividad del promotor de IFNβ se midió 48 horas después de la transfección utilizando el sistema de ensayo de luciferasa One-Glo (Promega).

MeRIP-seq (Inmunoprecipitación de ARN de metilación-secuenciación)

MeRIP se realizó según las instrucciones del fabricante (Magna MeRIP Kit, Merck, Cat# 17-10499). En resumen, se extrajeron 300 μg de ARN total utilizando el RNeasy Mini Kit y se fragmentaron a aproximadamente 100 nucleótidos calentando a 94 °C durante 4 minutos. La inmunoprecipitación se realizó utilizando cuentas magnéticas de proteína A/G Magna ChIP (Cat# CS203152) y un anticuerpo anti-m6A (Cat# MABE1006). La mezcla de ARN, anticuerpo y cuentas se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para facilitar la unión. Después de la inmunoprecipitación, el ARN se eluyó utilizando el tampón de elución proporcionado y se purificó con el RNeasy Mini Kit. Para la preparación de la biblioteca, se utilizaron 100 ng de ARN de entrada e inmunoprecipitado (IP). Las bibliotecas se generaron utilizando el NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina® (Cat. #E7760L) en combinación con NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (Index Primer Set 1; Cat. #E7335S/L). Las bibliotecas de cDNA resultantes se secuenciaron utilizando una configuración de lectura emparejada de 100 pares de bases en la plataforma NextSeq 2000.

Análisis de MeRIP

En el resumen del proceso de recorte de los archivos FASTQ de las muestras de MeRIP, observamos que en varias muestras, la primera lectura de nuestro secuenciamiento emparejado presentaba una calidad de secuenciación inferior. Para minimizar el sesgo, solo se utilizaron las segundas lecturas de secuenciación para el análisis posterior. Primero, los archivos FASTQ de la segunda lectura se alinearon a la secuencia de ARN ribosómico humano utilizando el programa de alineación HISAT2 (v2.2.1) ^[81]; las lecturas que no se alinearon al ARN ribosómico se realinearon al genoma humano hg38. Se marcaron y, posteriormente, se eliminaron los duplicados utilizando el programa Picard. Los picos de m6A se identificaron a partir de los archivos BAM de las muestras IP en comparación con las muestras de entrada utilizando MACS2 con los parámetros: -p 0.000001 –nomodel –keep-dup all. Los motivos enriquecidos en m6A se identificaron a partir de los 2000 picos de m6A más significativos utilizando el script find Motifs.pl del software HOMER (v4.9.1) ^[82].

Se cuantificaron las señales IP y de entrada para cada gen utilizando featureCounts y se normalizaron a sus respectivas profundidades de la biblioteca de secuenciación; el nivel de m6A de cada gen se calculó como la relación de la señal IP a la señal de entrada para ese gen. Se utilizó edgeR para identificar los genes metilados en m6A diferencialmente (DMG) considerando tanto las señales IP como las señales de entrada. Los DMG se identificaron como genes con un cambio absoluto en los niveles de metilación de m6A mayor que 2 y una tasa de descubrimiento falso (FDR) inferior a 0,05. Se cuantificaron las señales IP y de entrada para cada locus de elemento repetitivo utilizando la canalización SQulRE y se normalizaron a sus respectivas profundidades de la biblioteca de secuenciación. Se aplicó un método similar al utilizado para identificar los DMG para detectar los loci de elementos repetitivos metilados en m6A diferencialmente. Los niveles promedio de metilación de m6A de los IR inducidos o protegidos por MDA5 de referencia y sus regiones flanqueantes de 50 kb se calcularon utilizando la función computeMatrix de deepTools.

Detección de dsRNA mediante J2 Dot Blot

Se extrajo el ARN total de las líneas celulares HT29, HCT116, COLO201, NCI-H716, POP92 y CSC73 utilizando el RNeasy Mini Kit. Se colocaron volúmenes y cantidades iguales de ARN (3 μL; 500 ng a 1 μg) en una membrana Hybond N+ (GE Healthcare, Cat# RPN119B), se dejó secar al aire y se reticuló dos veces con UV utilizando un Stratalinker (Stratagene). La membrana se bloqueó con un 5 % de leche en PBS-T (0,1 % de Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente y, posteriormente, se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo monoclonal anti-dsRNA J2 (IgG2a de ratón, cadena κ; Jena Bioscience, Cat# RNT-SCI-10010500-JEN) a una dilución de 1:500. Al día siguiente, las membranas se lavaron tres veces con PBS-T y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-IgG de ratón (Cell Signalling Technology, Cat# 7076S; dilución de 1:5000 en 5 % de leche) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales con PBS-T, las señales se detectaron utilizando un reactivo de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y se visualizaron en un sistema Bio-Rad ChemiDoc. A continuación, las membranas se tiñeron con azul de metileno para verificar la carga equitativa de ARN y se visualizaron utilizando la configuración de detección colorimétrica del sistema ChemiDoc.

Detección de m6A mediante RNA Dot Blot

El análisis de dot blot de los niveles de m6A se realizó como se describió anteriormente ^[83]. Se extrajo el ARN total de las líneas celulares HT29, HCT116, COLO201 y NCI-H716, así como de las muestras PDX de POP92 y CSC73, utilizando el RNeasy Mini Kit. Las muestras de ARN se desnaturalizaron a 95 °C durante 3 minutos en un bloque térmico para interrumpir las estructuras secundarias y se enfriaron inmediatamente en hielo para evitar la reanillación. Se colocaron volúmenes y cantidades iguales de ARN (3 μL; 500 ng a 1 μg) en una membrana Hybond N+ (GE Healthcare, Cat# RPN119B), se dejó secar al aire y se reticuló dos veces con UV utilizando un Stratalinker (Stratagene). La membrana se bloqueó con un 5 % de leche en PBS-T (0,1 % de Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-m6A (Synaptic Systems [SYSY], Cat# 202 003; dilución de 1:250). Al día siguiente, las membranas se lavaron tres veces con PBS-T y se incubaron con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Cell Signalling Technology, Cat# 7074S; dilución de 1:5000 en 5 % de leche) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales con PBS-T, las señales se detectaron utilizando el sustrato Clarity Max Western ECL (Bio-Rad, Cat# 1705062) o el sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad, Cat# 1705061) y se visualizaron en un sistema Bio-Rad ChemiDoc. A continuación, las membranas se tiñeron con azul de metileno para verificar la carga equitativa de ARN y se visualizaron utilizando el modo de detección colorimétrica del sistema ChemiDoc.

Ensayos de inmunoprecipitación de m⁶A y dsRNA

La inmunoprecipitación de ARN de m⁶A (MeRIP) se realizó utilizando el kit Magna MeRIP (Merck), según las instrucciones del fabricante, seguida de un análisis de dot blot. En resumen, se aisló el ARN total de cinco placas de 15 cm de células HT29 y/o HCT116 (CTRL o METTL3KD) utilizando el Qiagen RNeasy Midi Kit y se fragmentó antes de la inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación se realizó utilizando un anticuerpo anti-m⁶A unido a cuentas magnéticas de proteína A/G. El ARN recuperado de las fracciones de entrada e inmunoprecipitado (IP) se colocó en una membrana Hybond N+ (GE Healthcare, Cat# RPN119B) y se reticuló con UV utilizando un Stratalinker. Las membranas se bloquearon y se sondearon con el anticuerpo anti-dsRNA J2 para detectar el dsRNA en las muestras de entrada e IP de m⁶A. Para la inmunoprecipitación de dsRNA (dsRNA-IP), la IP se realizó utilizando el anticuerpo anti-dsRNA J2, y el ARN recuperado se analizó mediante dot blot utilizando un anticuerpo anti-m6A. El bloqueo, la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados, los pasos de lavado y la detección de la señal utilizando el sustrato ECL (Clarity o Clarity Max, Bio-Rad) se realizaron como se describió anteriormente para el análisis de dot blot.

Análisis de viabilidad celular mediante CellTiter-Glo

Las células de cáncer colorrectal (CRC) HT29 y HCT116 se sembraron en placas de 96 pocillos opacas a una densidad de 2500 a 5000 células por pocillo en 50 μL de medio de cultivo. Después de 24 horas, las células se trataron con concentraciones crecientes de decitabina (0,029, 0,05, 0,11, 0,23, 0,46, 0,93, 1,87, 3,75, 7,5, 15 y 30 μM). Se incluyeron células no tratadas y pocillos con solo medio como controles. Después de 5 días de tratamiento, las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la adición del reactivo del ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, Cat# G7572) en un volumen igual (100 μL por pocillo). Las placas se agitaron en un agitador orbital durante 2 minutos y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales para estabilizar la señal luminiscente. La luminiscencia se midió utilizando un lector de placas FLUOSTAR. Las señales se normalizaron a los pocillos de control y se generaron curvas de respuesta a dosis para calcular los valores de CE50 utilizando un análisis de regresión no lineal.

Tinción de inmunofluorescencia y microscopía

Se colocaron lamelas de vidrio en una placa de 24 pocillos, se trataron brevemente con etanol al 100 % (1 mL por pocillo) durante 5 minutos a temperatura ambiente y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, se sembraron células de CRC en las lamelas a una concentración de 1 × 10⁵ células/mL y se cultivaron durante la noche a 37 °C para permitir la adhesión. Al día siguiente, las células se lavaron suavemente con PBS y se fijaron en metanol preenfriado a -20 °C durante 15 minutos. Las células fijadas se lavaron tres veces con PBS y se incubaron en solución de bloqueo (1 % de albúmina sérica bovina en PBS) durante 1 hora a 37 °C para reducir la unión inespecífica. Para la detección de dsRNA, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario J2 diluido 1:500 en solución de bloqueo. Después de la incubación con el anticuerpo primario, las lamelas se lavaron tres veces en PBS (10 minutos cada una) y luego se expusieron a anticuerpo secundario anti-IgG de ratón (H + L) F(ab')₂ conjugado con Alexa Fluor 647 (Cell Signalling Technology, Cat# 4410S) a una dilución de 1:1000 en 1 % de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se protegieron de la luz durante y después de la incubación con el anticuerpo secundario. El exceso de anticuerpo se eliminó mediante tres lavados adicionales de 10 minutos en PBS. Para la tinción nuclear, las células se incubaron con Hoechst 33342 (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Cat# H1399; dilución de 1:2000 en PBS) durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de lavados con PBS. Las lamelas se montaron en portaobjetos utilizando ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, Cat# P36930), con la superficie de la célula orientada hacia el medio de montaje. Se adquirieron imágenes de confocal utilizando un microscopio Zeiss LSM980 equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40×. La intensidad de la fluorescencia se cuantificó utilizando el software ImageJ. La fluorescencia total celular corregida (CTCF) se calculó como:

CTCF = Densidad integrada - (Área de la célula seleccionada × Fluorescencia de fondo media). El anticuerpo J2 reconoce específicamente las especies de ARN de doble cadena de al menos 40 pares de bases de longitud.

CUT&RUN para el perfilado de H3K4me3

Se llevaron a cabo experimentos CUT&RUN en células de cáncer colorrectal (CCR) CTRL y METTL3KD utilizando el kit de ensayo CUT&RUN (Cell Signalling Technology, Cat# 86652) según el protocolo del fabricante. Para cada condición, se inmovilizaron 1 × 10⁶ células en microesferas magnéticas recubiertas con concanavalina A y se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-H3K4me3 (Cell Signalling Technology, Cat# 9751; dilución 1:50). Tras la unión del anticuerpo, las células unidas a las microesferas se lavaron en un tampón que contenía digitonina antes de la adición de la micrococcal nucleasa A-proteína (pA-MNase), que se incubó durante 1 h a 4 °C. La digestión de la cromatina se inició añadiendo 3 µL de 100 mM de CaCl₂ e incubando las muestras en hielo durante 30 min. La reacción se detuvo añadiendo un tampón de parada que contenía EDTA y EGTA. Los fragmentos de cromatina liberados se recogieron en el sobrenadante tras la centrifugación y el ADN se purificó utilizando el kit de purificación QIAGEN MinElute. El ADN purificado se utilizó posteriormente para la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II según las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas se secuenciaron en una plataforma Illumina NextSeq 2000 para generar lecturas de doble extremo.### Análisis CUT&RUN

Los archivos fastq recortados se alinearon al genoma humano hg38 utilizando el programa de alineación Bowtie2 (v.2.3.4.2)^[84] con los parámetros establecidos como: -I 10 -X 700 –local –very-sensitive- local –no-mixed –no-discordant –no-unal. Los duplicados se marcaron y luego se eliminaron utilizando el programa picard. Para realizar la normalización de "spike-in", los mismos archivos fastq se alinearon al genoma de levadura sacCer3 utilizando Bowtie2 con los parámetros establecidos como: -I 10 -X 700 –local –very-sensitive-local –no-mixed –no-discordant –no-unal –no-overlap –no-dovetail. El factor de normalización de "spike-in" se calculó como la relación entre 20.000 y el número total de lecturas alineadas al genoma de la levadura. La cobertura del genoma de cada muestra se generó a partir de los archivos de alineación utilizando el comando genomecov en el conjunto de herramientas bedtools (v.2.28.0)^[85] con el parámetro de escala establecido como el factor de normalización de "spike-in" para normalizar la biblioteca. Los picos se identificaron a partir de los archivos BAM alineados al genoma humano utilizando MACS2 con los siguientes parámetros: -q 0.01 -B –SPMR –keep-dup all. Las muestras de IgG se utilizaron como controles. Los mapas de calor que visualizan las señales en las regiones de los picos se generaron utilizando deeptools.

La ocupación de H3K4me3 dentro de 3000 nucleótidos aguas arriba y aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción (TSS) se cuantificó utilizando featureCounts con un archivo BED generado a medida. Se utilizó edgeR para identificar los genes diferencialmente ocupados (DOG) para H3K4me3 en comparaciones por pares. Los DOG se definieron como genes con un cambio absoluto mayor que 2 y una tasa de descubrimiento falso (FDR) inferior a 0,05. La ocupación promedio de H3K4me3 en las regiones IR protegidas por MDA5 inducidas o basales y sus regiones adyacentes de 50 kb se calculó por separado utilizando la función computeMatrix de deepTools.### Ensayo de estabilidad del ARN

Las células HT29 CTRL y METTL3KD se sembraron a una densidad de 5 × 10⁴ células/mL en placas de cultivo de 100 mm. Después de 24 h, se recogió una placa de cada condición para servir como punto de tiempo de 0 horas. Las placas restantes se trataron con DMSO (control vehículo) o actinomicina D (5 µg/mL; Sigma-Aldrich, Cat# A9415-2MG) para inhibir la transcripción, y las células se recogieron cada 2 h después del tratamiento. Se extrajo el ARN total utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen) con digestión de DNasa I en la columna según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó cDNA a partir del ARN purificado y se cuantificaron los niveles de transcripción mediante qPCR. Para determinar la vida media de los transcritos de ARN, primero se normalizaron los niveles de expresión de los ARN examinados a la expresión correspondiente de GAPDH en cada punto de tiempo. A continuación, se calculó la cantidad relativa de ARN restante dividiendo el nivel de ARN normalizado en cada punto de tiempo por el nivel en el punto de tiempo de 0 h. Las curvas de degradación para cada ARN se generaron ajustando la ecuación a los valores relativos de ARN restante en los puntos de tiempo medidos. Posteriormente, se calculó la vida media utilizando la fórmula .### Predicción de la estructura secundaria del ARN

Para predecir las estructuras secundarias de los transcritos IR-Alu, las secuencias de ARN sin procesar, incluidos los elementos Alu aguas arriba y aguas abajo, así como las regiones de conexión, se enviaron al RNAfold WebServer (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)^[86] utilizando la configuración predeterminada, excepto que se habilitaron las correcciones de energía para las bases modificadas. Las estructuras secundarias de energía libre mínima (MFE) predichas se descargaron y se extrajeron los valores de MFE correspondientes.

Para examinar el efecto de la modificación m⁶A en la estructura secundaria del ARN, se sustituyeron todos los adenosinas dentro del motivo de consenso m⁶A (DRACH) en las secuencias de ARN IR-Alu sin procesar por 6 y se enviaron al RNAfold WebServer utilizando la misma configuración. Las estructuras de MFE predichas se descargaron y se extrajeron los valores de MFE de manera similar.### Datos públicos

Los datos de expresión génica de las muestras del conjunto de datos TCGA se obtuvieron del UCSC Toil RNA-seq Recompute Compendium^[87]. El efecto del gen METTL3 en las líneas celulares cancerosas, cuantificado como probabilidad de dependencia, se obtuvo de DepMap (v24Q2) (https://depmap.org/portal)^[36]. El estado de inestabilidad de microsatélites de los cánceres colorrectales (CCR) también se obtuvo de DepMap, mientras que el estado del fenotipo de metilación de la isla CpG de los CCR se obtuvo de la ref. ^[88].

La subtipificación molecular de consenso (CMS) de los CCR se realizó utilizando el método SSP en el paquete R CMSclassifier (v1.0.0)^[41]. Los datos de expresión génica de entrada, descargados de DepMap, permitieron la clasificación de las muestras en CMS1, CMS2, CMS3, CMS4 o grupos no consenso. Cabe destacar que ninguna de las muestras de CCR se asignó al subtipo CMS4.

La asociación entre las mutaciones genéticas de CCR y los efectos del gen METTL3 se visualizó utilizando la función oncoplot del paquete R maftools (v2.18.0)^[89]. Los datos de entrada para este análisis, incluidos los perfiles de mutación somática y las puntuaciones del efecto del gen METTL3 para cada CCR, se obtuvieron de DepMap. Se proporciona un resumen de las líneas celulares de cáncer colorrectal analizadas en este estudio, incluida su probabilidad de dependencia de METTL3, estado CIMP, estado MSS/MSI y estado de mutación de KRAS, en los Datos Suplementarios 7.### Análisis estadístico e ilustración

El número de muestras utilizadas en cada experimento se indica en las leyendas de las figuras. Se utilizó GraphPad Prism (v11.0.0) para los análisis estadísticos y la visualización de datos, y se crearon ilustraciones esquemáticas con BioRender.com. Los análisis estadísticos de los datos de secuenciación y los datos disponibles públicamente se realizaron en R (v4.3.2). La significación se evaluó utilizando pruebas de rango Wilcoxon de dos colas, pruebas t de Student de dos colas u otros métodos según se especifica en las secciones correspondientes. Se aplicó el método de Benjamini-Hochberg para ajustar las pruebas de hipótesis múltiples cuando fue apropiado.### Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Líneas celulares y condiciones de cultivo

Las células HT29 (HTB-38™) fueron amablemente proporcionadas por el grupo del Prof. Colin Goding en el Ludwig Institute for Cancer Research, Oxford, HCT116 (CCL-247™), COLO201 (CCL-224™), NCI-H716 (CCL-251™) y las células normales de colon CCD 841 (CRL-1790™) se compraron a ATCC. Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano HT29 y HCT116 se cultivaron en medio McCoy’s 5 A suplementado con penicilina-estreptomicina (1%) y suero fetal bovino (10%). Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano COLO201 y NCI-H716 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con penicilina-estreptomicina (1%) y suero fetal bovino (10%). Las células normales de colon CCD 841 se cultivaron en ATCC-EMEM, suplementado con penicilina-estreptomicina (1%) y suero fetal bovino (10%).

Las células HT29 se autenticaron mediante Eurofins Genomics utilizando tecnología de un solo locus basada en PCR. Se analizaron dieciséis loci STR independientes (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, AMEL, D5S818, FGA, D19S433, vWA, TPOX y D18S51). Las células resultaron negativas para la contaminación por micoplasma. Además, ATCC realiza un perfilado STR para la autenticación de líneas celulares y realiza pruebas de micoplasma antes de la distribución.

Se proporciona una lista completa de los reactivos y kits utilizados en este estudio, incluida la información del proveedor y los números de catálogo, en los Datos Suplementarios 3.

Células de cáncer colorrectal derivadas de pacientes

Las muestras de tumores de colon humano se recogieron en el momento de la resección quirúrgica tras el consentimiento informado de los pacientes según los protocolos aprobados por la Junta de Ética de la Investigación del University Health Network (Toronto, Canadá). Los modelos de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) de cáncer colorrectal fueron amablemente proporcionados por el laboratorio de la Dra. Catherine O’Brien. Estos xenoinjertos se generaron mediante la implantación subcutánea de células tumorales en los flancos de ratones NOD-SCID de 6 a 8 semanas de edad^[65]. Las células derivadas del tumor se mantuvieron como esferoides en medio DMEM/F-12 suplementado con penicilina-estreptomicina (1%) (Thermo Fisher), 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, suplemento N2, suplemento neuronal NeuroCult SM1, heparina (4 µg/ml), 0,2% de mezcla lipídica, factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 ng/ml) y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF; 10 ng/ml). Las células se autenticaron utilizando el perfilado de repeticiones cortas en tándem y se comprobó que eran negativas para el micoplasma.

Tratamiento farmacológico

El inhibidor de la ADN metiltransferasa, Decitabina (DAC; 5-Aza-2'-desoxicitidina), se reconstituyó en PBS como concentraciones de 10 mM y se almacenó a -80 °C. Para los experimentos in vitro, las células se sembraron 24 horas antes del tratamiento a 50.000 células/ml y luego se trataron con Decitabina (300 nM) o se trataron con un control simulado. Las células se mantuvieron en cultivo durante 5 días. A continuación, se recogieron las células y se utilizaron para el análisis posterior.

Generación de células con reducción de METTL3

Los vectores lentivirales que contienen shRNA (KD1/KD2/KD3/KD4) dirigidos al METTL3 humano con proteína fluorescente verde turbo (TurboGFP) como CTRL se generaron a partir de plásmidos pLKO1 comprados a Sigma-Aldrich. Las secuencias de shRNA se muestran en los Datos Suplementarios 4. Las partículas virales se produjeron mediante transfección de fosfato de calcio^[66] y se concentraron utilizando polietilenglicol (PEG). En resumen, las células de CCR METTL3KD y de tipo salvaje (CTRL) se generaron mediante la transducción de partículas lentivirales basadas en shRNA. Las células de CCR se sembraron en placas de 12 pocillos (100.000 células por ml) y se transducieron con 30 µl de virus concentrados 200x. 72 h después de la transducción, las células GFP+ se clasificaron utilizando un clasificador Sony MA900 o se seleccionaron con puromicina a 2 µg/ml, y se confirmó la reducción de METTL3 a nivel de ARNm y proteína mediante qPCR y Western blot, respectivamente.

Extracción de ARN y qPCR

Las células de cáncer colorrectal CTRL (TGFP) y/o METTL3KD1/2/3/4 fueron tratadas con decitabina (300 nM) o se dejaron sin tratar (MT). Cinco días después del tratamiento, las células se recogieron, se lavaron en PBS y se utilizaron para la extracción de ARN. Se extrajo el ARN total con el kit RNeasy Mini siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, después de añadir el tampón RLT y el 70% de etanol a los sedimentos celulares, se realizó la digestión con DNasa I en columna utilizando el kit QIAGEN RNase-Free DNase (número de catálogo 79256). Se cuantificó el ARN total utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 2000, y las muestras con relaciones A260/A280 ≥ 1,8 se consideraron adecuadas para las aplicaciones posteriores. Para el secuenciamiento de ARN, se utilizaron 500 ng de ARN total para la preparación de la biblioteca. Para la síntesis de ADNc, se realizó la transcripción inversa de 500 ng a 1 µg de ARN utilizando el kit SuperScript IV VILO cDNA Synthesis Kit según las instrucciones del fabricante. Se realizó una PCR cuantitativa (qPCR) por triplicado utilizando de 10 a 20 ng de ADNc por 20 µL de reacción, que consistía en 5 µL de plantilla de ADNc, 10 µL de SYBR Select Master Mix y 0,2 µM de cada uno de los cebadores directo e inverso. La amplificación se realizó en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems). Los niveles relativos de expresión de ARNm se normalizaron con GAPDH y se expresaron en relación con el grupo de control. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en los Datos Suplementarios 5.

Preparación de la biblioteca para el secuenciamiento del ARN total

Las bibliotecas de secuenciamiento de ARN total se prepararon en el Oxford Genomics Centre (OGC) o por GENEWIZ® (Azenta Life Sciences). Para las muestras procesadas en el OGC, se midió la concentración de ARN utilizando el ensayo RiboGreen (Invitrogen) en un lector de placas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech), y se evaluó la integridad del ARN utilizando el Agilent 2200 o 4200 TapeStation con RNA ScreenTape. Los números de integridad del ARN (RIN) oscilaron entre 5,5 y 10. Se utilizaron 100 nanogramos de ARN total como entrada para la preparación de la biblioteca. El ARN ribosómico se eliminó utilizando el kit NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat; New England Biolabs), y se generaron bibliotecas de cadena específica utilizando el kit NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina. Las bibliotecas se amplificaron (14 ciclos), se cuantificaron, se normalizaron, se agruparon y se prepararon para el secuenciamiento según los protocolos estándar. Se realizó el secuenciamiento de doble extremo en una plataforma Illumina NovaSeq 6000 (Illumina; kit de reactivos NovaSeq 6000 S4, 300 ciclos). Las muestras procesadas por GENEWIZ® (Azenta Life Sciences) se prepararon utilizando un flujo de trabajo de ribodepleción de cadena específica con el kit NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) y se secuenciaron en una plataforma Illumina NovaSeq X según los protocolos estándar del proveedor.

Análisis del secuenciamiento de ARN

Todos los archivos FASTQ de secuenciamiento se recortaron utilizando el programa TrimGalore (v0.6.2), un envoltorio alrededor de Cutadapt, con los parámetros predeterminados^[67]. Los archivos FASTQ recortados se alinearon posteriormente al genoma humano (hg38) utilizando el programa de alineación STAR (v2.7.9a)^[68], a menos que se especifique lo contrario. Los duplicados se marcaron y se eliminaron utilizando el programa Picard (v3.0.0)^[69]. Se descargó un archivo de formato de transferencia de genes (GTF) que contenía anotaciones para los genes de referencia humanos del Navegador del Genoma UCSC como gencode.v21.annotationGRCh38.gtf.

Análisis de la expresión diferencial de genes

Este archivo GTF para la anotación de genes se utilizó con el comando featureCounts de las herramientas subread (v1.6.4)^[70] para cuantificar el número de lecturas asignadas a cada gen. Los genes con un número de lecturas inferior a 10 en todas las muestras se eliminan del análisis posterior. Se utilizó edgeR (v3.40.2)^[71] para identificar los genes expresados diferencialmente (DEG) en las comparaciones por pares; los DEG son genes con un cambio absoluto en la expresión mayor que 2 y un FDR inferior a 0,05.

Los 200 genes más significativamente sobreexpresados se enviaron al sitio web en línea STRING (https://string-db.org/; v11.5) para obtener términos enriquecidos de Gene Ontology y Reactome Pathways. Además, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) dentro del software GSEA; v4.3.2) para obtener firmas de conjuntos de genes significativamente enriquecidos. Los 10 términos GO más enriquecidos y sus genes asociados se visualizaron como redes generadas utilizando Cytoscape (v3.10.0)^[72].

Se realizaron análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única (ssGSEA) utilizando el paquete Bioconductor GSVA (v1.46.0)^[73] para obtener la puntuación de enriquecimiento de los 38 genes centrales estimulados por el interferón definidos por Liu y sus colegas^[37].

Análisis de la expresión diferencial de elementos repetidos

Se cuantificaron los recuentos de lecturas de los elementos repetidos aplicando la canalización SQulRE^[74]. A continuación, la matriz de recuentos de lecturas se analizó con el paquete edgeR para buscar elementos repetidos expresados diferencialmente. Para cada muestra, se determinó su tamaño de biblioteca como el número total de lecturas mapeadas al genoma humano. Los elementos repetidos con un número de lecturas inferior a 10 en todas las muestras se eliminan del análisis posterior. Los elementos repetidos significativamente expresados diferencialmente se definen como un cambio absoluto en la expresión mayor que 2 y un FDR inferior a 0,05. La distribución genómica de los elementos repetidos expresados diferencialmente se analizó con el paquete Bioconductor GenomicDistributions (v3.17)^[75].

Western blot

Las células se lisaron en un tampón que contenía 0,1% de SDS, 400 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl, 1% de Triton X-100 y un cóctel de inhibidores de proteasas Halt (Thermo Fisher Scientific). Los lisados celulares totales se aclararon y se cuantificaron las concentraciones de proteína utilizando un ensayo BCA (Promega). Se utilizaron cantidades iguales de proteína (40-50 µg), se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 minutos y se cargaron y resolvieron en geles Mini-PROTEAN TGX de 4-20%. A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Trans-Blot Turbo Midi (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon en 5% de BSA y se incubaron con anticuerpos primarios contra METTL3 (D2I6O, #96391S, Cell Signalling Technology; dilución 1:1000), PKR (EPR19374, ab184257, Abcam; dilución 1:2000), RNase L (E-9, sc-74405, Santa Cruz; dilución 1:1000), MAVS (ab89825, Abcam; dilución 1:1000), α-tubulina (T9026, Sigma-Aldrich; dilución 1:3000) o vinculina (#700062, Invitrogen; dilución 1:3000). Tras la incubación con los anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP: anti-rabbit IgG (#7074S, Cell Signalling Technology; dilución 1:5000) o anti-mouse IgG (#7076S, Cell Signalling Technology; dilución 1:5000). Los resultados se revelaron utilizando el sustrato Clarity o ClarityMax Western ECL (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de protección MDA5

Para identificar el ligando primario de MDA5 en las células de cáncer colorrectal que eran de tipo salvaje (transducidas con el plásmido de control pLKO1) o con METTL3 silenciado (KD), realizamos un ensayo de protección de RNasa A/MDA5 seguido de secuenciación de ARN, como se describió anteriormente^[13],^[45]. Brevemente, se aisló el ARN citosólico de las líneas celulares de cáncer colorrectal HT29 utilizando el kit QIAGEN RNeasy Mini. El ARN citosólico purificado se preincubó con proteína recombinante MDA5-Δ2CARD (150 nM; amablemente proporcionada por el Dr. Kazuki Kato) a temperatura ambiente durante 10 minutos en un tampón que contenía 20 mM de HEPES (pH 7,5), 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl₂ y 2 mM de DTT. A continuación, se añadió RNasa A hasta una concentración final de 2 ng/µL y las muestras se incubaron durante 5 minutos más a temperatura ambiente. La digestión se detuvo mediante la adición de reactivo TRIzol y el ARN se purificó utilizando el kit Zymo Direct-zol RNA Miniprep según las instrucciones del fabricante. Para eliminar los pequeños fragmentos de ARN (< 100 pb) generados durante el tratamiento con RNasa A, las muestras se purificaron aún más utilizando el kit QIAGEN RNeasy Mini. El ARN resultante se utilizó posteriormente para la preparación de la biblioteca.

Preparación de la biblioteca y secuenciación del ARN protegido por MDA5

Las bibliotecas de ADNc se generaron en la Unidad de Genómica de Células Únicas del Instituto Weatherall de Medicina Molecular (WIMM) utilizando 100 ng de ARN de entrada y el kit de preparación de bibliotecas KAPA RNA HyperPrep con RiboErase (Roche), siguiendo las directrices del fabricante con ligeras modificaciones. Para la fragmentación del ARN, las muestras totales de ARN citosólico se incubaron a 94 °C durante 8 minutos, mientras que las muestras de ARN protegido por MDA5 se fragmentaron a 65 °C durante 1 minuto. La ligación del adaptador se realizó utilizando 1,5 µM de adaptadores duales indexados KAPA Unique. La amplificación de la biblioteca se llevó a cabo en un termociclador C1000 Touch (Bio-Rad). La desnaturalización inicial se realizó a 98 °C durante 45 segundos, seguida de 11 ciclos de PCR para las bibliotecas de ARN citosólico total o 16 ciclos para las bibliotecas de ARN digerido por RNasa A y protegido por MDA5 (98 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos). Se realizó un paso de extensión final a 72 °C durante 1 minuto. Las bibliotecas amplificadas se purificaron utilizando una limpieza con 1 × KAPA Pure Bead y se eluyeron en 20 µL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0). La calidad de la biblioteca y la distribución del tamaño de los fragmentos se evaluaron utilizando el ensayo Agilent D5000 ScreenTape en el sistema 2200 TapeStation. Las bibliotecas derivadas del ARN citosólico total y del ARN protegido por MDA5 se agruparon y se secuenciaron a 6 pM utilizando lecturas de doble extremo de 150 pb en una plataforma Illumina NovaSeq X Plus (Novogene).

Análisis del ensayo de protección MDA5

Se descargó un archivo de formato de transferencia de genes (GTF) que contenía loci de elementos repetidos de todo el genoma, anotados por RepeatMasker, del Navegador del Genoma UCSC. Este archivo GTF se utilizó con el comando featureCounts para cuantificar el recuento de lecturas para cada locus de elemento repetido de los archivos BAM. Las lecturas que no se asignaron a los loci repetidos se consideraron lecturas no repetidas. A continuación, se agregaron los recuentos de lecturas para cada clase repetida y se calculó el porcentaje de lecturas para cada clase como la relación entre los recuentos de la clase repetida y el número total de lecturas en el archivo BAM.

Identificación de las regiones protegidas por MDA5

Las regiones protegidas por MDA5 se identificaron como picos de señal de secuenciación de las muestras tratadas con RNasa A en comparación con las muestras de ARN citosólico total. Para cada muestra, los archivos BAM totales se dividieron en archivos BAM alineados en la cadena directa y archivos BAM alineados en la cadena inversa, y a continuación se llamaron picos de los archivos BAM específicos de la cadena utilizando MACS2 (v2.2.6)^[76] con los siguientes parámetros: -q 0,01 –keep-dup all –nomodel. Los picos identificados de las cadenas directa e inversa se combinaron para el análisis posterior. Se generaron mapas de calor que visualizan las señales en las regiones de los picos utilizando deepTools (v3.5.3)^[77]. Al comparar los picos identificados de dos grupos, aquellos que comparten al menos el 20% de sus regiones se clasificaron como picos comunes, mientras que el resto se designaron como picos específicos del grupo.

Identificación de repeticiones invertidas protegidas por MDA5

Primero, localizamos todos los loci de elementos repetidos que se superponen con al menos el 30% de las regiones protegidas por MDA5 identificadas anteriormente. A continuación, para identificar pares de elementos repetidos cercanos capaces de complementarse entre sí para formar estructuras de doble cadena, nos centramos en los pares separados por menos de 3 kb. Concretamente, la distancia entre el extremo del elemento repetido aguas arriba y el inicio del elemento repetido aguas abajo debía estar dentro de este umbral. Dentro del umbral de distancia definido, cada elemento repetido podía formar múltiples pares potenciales. Para evaluar si estos pares podían formar estructuras de doble cadena complementarias inversas, realizamos un alineamiento local en orientación complementaria inversa utilizando el algoritmo de Smith-Waterman implementado en la herramienta exonerate (v2.2.0)^[78] con los parámetros predeterminados. Se aplicaron dos puntuaciones de penalización: una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 4, que son los valores predeterminados del programa. Los pares con una puntuación de alineamiento inferior a 500 se descartaron. Por último, los pares repetidos separados por menos de 3 kb y con una puntuación complementaria inversa superior a 500 se clasificaron como repeticiones invertidas (IR). Se contó el número de IR identificados en cada grupo y se compararon sus intersecciones. La distribución genómica de las regiones protegidas por MDA5 y las repeticiones invertidas se analizó con el paquete Bioconductor GenomicDistributions^[75].

Ensayo de formación de colonias y cristal violeta

Se contaron las células utilizando un contador de células automatizado TC20 (Bio-Rad). Para los ensayos con cristal violeta, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a densidades de 1000 a 1500 células por pocillo para los ensayos de formación de colonias y de 1,0 × 10⁵ a 1,5 × 10⁵ células por pocillo para los ensayos de proliferación. Las células se cultivaron hasta que los pocillos de control se acercaron a la confluencia. Al final del ensayo, los pocillos se lavaron dos veces con PBS frío, se fijaron en metanol frío durante 10 minutos sobre hielo y, posteriormente, se tiñeron con cristal violeta al 0,5% preparado en metanol al 25% durante 10 minutos a temperatura ambiente. El exceso de tinte se eliminó lavando las placas a fondo (al menos seis veces) con agua destilada. Las placas se secaron al aire y se capturaron imágenes utilizando una cámara digital.

Generación de líneas celulares de doble knockout (DKO)

Las células HT29 de knockout simple (METTL3) se generaron utilizando una sgRNA diseñada a medida (Invitrogen, #A35534) dirigida a METTL3 humano (secuencia: CUUAGAUCUACGGAAUCCAG). Las células se sembraron a 5 × 10⁵ células por pocillo en placas de 6 pocillos y se transfectaron al día siguiente con proteína Cas9 (Invitrogen, #A36498) y sgRNA utilizando el reactivo Cas9 PLUS y Lipofectamine CRISPRMAX (Invitrogen, CMAX00003) en Opti-MEM, según las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, las células individuales se sembraron en placas de 96 pocillos para obtener clones monoclonales. La eficiencia del knockout se validó mediante inmunoblotting.

Para la generación de células HT29 de doble knockout (DKO), se editó aún más un clon de METTL3 KO validado utilizando sgRNA predefinidas de IDT (secuencias proporcionadas en los Datos Suplementarios 6). Los complejos de ribonucleoproteína (RNP) se ensamblaron combinando crRNA Alt-R™ CRISPR-Cas9 con tracrRNA Alt-R™ CRISPR-Cas9 (IDT, #1072533) y nucleasa Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 V3 (#1081061), según las instrucciones del fabricante. Los complejos RNP se administraron mediante electroporación utilizando el código de pulsos EH115 con el kit Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X S (Lonza, #V4XP-3032). Después de 48 horas, las células individuales se clasificaron en placas de 96 pocillos para obtener clones DKO monoclonales. La interrupción exitosa del gen se confirmó mediante inmunoblotting.

Las células HT29 de knockout de PKR (EIF2AK2), MAVS y RNaseL se generaron utilizando sgRNA predefinidas de IDT y la misma estrategia de electroporación de RNP descrita anteriormente.

Ensayo de dilución limitante in vitro (LDA)

Para los ensayos de dilución limitante in vitro (LDA), las células HT29 y HCT116 de control (CTRL) o con METTL3 silenciado (METTL3KD) se trataron con decitabina (300 nM) o control vehículo (PBS) el día 0 y se mantuvieron en cultivo durante 5 días. El día 5, las células se recogieron, se lavaron para eliminar el fármaco residual, se disociaron en suspensiones de células individuales y se sembraron en placas de 96 pocillos a diluciones seriadas (1, 10, 100 o 1000 células por pocillo). Para cada densidad celular, se sembraron un mínimo de 18 pocillos y, para un menor número de células, se sembraron al menos 72 pocillos. Después de 4 semanas de cultivo, se evaluaron los pocillos para determinar la formación de colonias en función de la presencia o ausencia de colonias. La frecuencia de células iniciadoras de cáncer (CIC) se calculó utilizando el software de análisis de dilución limitante extrema (ELDA) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html) proporcionado por el Walter and Eliza Hall Institute^[79].

Experimento in vivo

Todos los procedimientos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley del Reino Unido sobre Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y la aprobación del Comité de Revisión de Bienestar y Ética Animal de la Universidad de Oxford, bajo el número de licencia de proyecto (PPL) PP7109477. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos en el Centro de Genética Humana, en una temperatura ambiente de 19 a 23 °C, con una humedad relativa del 45 al 65 % y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se inyectaron por vía subcutánea ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) machos y hembras de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories, cepa 614) con 5 × 10⁵ células HT29 o 2,5 × 10⁵ células de cáncer de colon HCT116. La decitabina (Sigma-Aldrich) se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se administró una vez que los tumores del grupo de control alcanzaron aproximadamente los 100 mm³. Los ratones recibieron decitabina a 0,5 mg/kg mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante cuatro días consecutivos, seguida de un descanso de 3 días y otros cuatro días consecutivos de tratamiento. Los animales de control recibieron inyecciones intraperitoneales de PBS según el mismo programa. El crecimiento tumoral se controló hasta que los tumores del grupo tratado con vehículo alcanzaron el tamaño máximo permitido, sin que ningún tumor superara los 1500 mm³.

Ensayo de reportero del promotor de IFNβ

Las células HEK293 de reportero del promotor de IFNβ (p125-HEK), incluidas las células de tipo salvaje (WT) y las células de knockout de MAVS (MAVSKO), fueron amablemente proporcionadas por el laboratorio del profesor Jan Rehwinkel y se establecieron originalmente como se describió anteriormente^[80]. Para los ensayos de luciferasa, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Corning) a una densidad de 1 × 10⁴ a 2 × 10⁴ células por pocillo. Al día siguiente, las células se transfectaron con 100 ng de ARN total aislado de células HT29 o HCT116 utilizando 0,2 μL de Lipofectamine 2000 por pocillo. La actividad del promotor de IFNβ se midió 48 horas después de la transfección utilizando el sistema de ensayo de luciferasa One-Glo (Promega).

MeRIP-seq (Inmunoprecipitación de ARN de metilación-secuenciación)

MeRIP se realizó según las instrucciones del fabricante (Magna MeRIP Kit, Merck, Cat# 17-10499). Brevemente, se extrajeron 300 μg de ARN total utilizando el kit RNeasy Mini y se fragmentaron a aproximadamente 100 nucleótidos calentando a 94 °C durante 4 minutos. La inmunoprecipitación se realizó utilizando cuentas magnéticas de proteína A/G Magna ChIP (Cat# CS203152) y un anticuerpo anti-m6A (Cat# MABE1006). La mezcla de ARN, anticuerpo y cuentas se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para facilitar la unión. Después de la inmunoprecipitación, el ARN se eluyó utilizando el tampón de elución proporcionado y se purificó con el kit RNeasy Mini. Para la preparación de la biblioteca, se utilizaron 100 ng de ARN de entrada e inmunoprecipitado (IP). Las bibliotecas se generaron utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN direccionales NEBNext® Ultra™ II para Illumina® (Cat. #E7760L) en combinación con oligos múltiples NEBNext® para Illumina® (conjunto de cebadores de índice 1; Cat. #E7335S/L). Las bibliotecas de cDNA resultantes se secuenciaron utilizando una configuración de lectura emparejada de 100 pares en la plataforma NextSeq 2000.

Análisis de MeRIP

En el resumen del proceso de recorte de los archivos FASTQ de las muestras de MeRIP, observamos que en varias muestras, la primera lectura de nuestra secuenciación de lectura emparejada exhibió una menor calidad de secuenciación. Para minimizar el sesgo, solo se utilizaron las segundas lecturas de secuenciación para el análisis posterior. Los archivos FASTQ de la segunda lectura se alinearon primero a la secuencia de ARN ribosómico humano utilizando el programa de alineación HISAT2 (v2.2.1)^[81]; las lecturas que no se alinearon al ARN ribosómico se realinearon a continuación al genoma humano hg38. Los duplicados se marcaron y se eliminaron posteriormente utilizando el programa Picard. Los picos de m6A se identificaron a partir de los archivos BAM de las muestras IP en comparación con las muestras de entrada utilizando MACS2 con los parámetros: -p 0.000001 –nomodel –keep-dup all. Los motivos enriquecidos en m6A se identificaron a partir de los 2000 picos de m6A más significativos utilizando el script find Motifs.pl del software HOMER (v4.9.1)^[82].

Las señales de IP y entrada para cada gen se cuantificaron utilizando featureCounts y se normalizaron a sus respectivas profundidades de la biblioteca de secuenciación; el nivel de m6A de cada gen se calculó como la relación de la señal de IP a la señal de entrada para ese gen. Se utilizó edgeR para identificar los genes diferencialmente metilados con m6A (DMG) considerando tanto las señales de IP como las señales de entrada. Los DMG se identificaron como genes con un cambio absoluto en los niveles de metilación de m6A mayor que 2 y una tasa de descubrimiento falso (FDR) inferior a 0,05. Las señales de IP y entrada para cada locus de elemento repetido se cuantificaron utilizando la canalización SQulRE y se normalizaron a sus respectivas profundidades de la biblioteca de secuenciación. Se aplicó un método similar al utilizado para identificar los DMG para detectar los loci de elementos repetidos diferencialmente metilados con m6A. Los niveles promedio de metilación de m6A de los IR inducidos o protegidos por MDA5 y sus regiones flanqueantes de 50 kb se calcularon utilizando la función computeMatrix de deepTools.

Detección de dsRNA mediante J2 Dot Blot

Se extrajo el ARN total de las líneas celulares HT29, HCT116, COLO201, NCI-H716, POP92 y CSC73 utilizando el kit RNeasy Mini. Se colocaron volúmenes y cantidades iguales de ARN (3 μL; 500 ng a 1 μg) en una membrana Hybond N+ (GE Healthcare, Cat# RPN119B), se dejaron secar al aire y se reticularon con UV dos veces utilizando un Stratalinker (Stratagene). La membrana se bloqueó con leche al 5% en PBS-T (0,1% de Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente y, posteriormente, se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo monoclonal anti-dsRNA J2 (IgG2a de ratón, cadena κ; Jena Bioscience, Cat# RNT-SCI-10010500-JEN) a una dilución de 1:500. Al día siguiente, las membranas se lavaron tres veces con PBS-T y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-IgG de ratón (Cell Signalling Technology, Cat# 7076S; dilución de 1:5000 en leche al 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales con PBS-T, las señales se detectaron utilizando un reactivo de quimiluminiscencia mejorada (ECL) y se visualizaron en un sistema Bio-Rad ChemiDoc. A continuación, las membranas se tiñeron con azul de metileno para verificar la carga equitativa de ARN y se visualizaron utilizando la configuración de detección colorimétrica del sistema ChemiDoc.

Detección de m6A mediante RNA Dot Blot

El análisis de dot blot de los niveles de m6A se realizó como se describió anteriormente^[83]. Se extrajo el ARN total de las líneas celulares HT29, HCT116, COLO201 y NCI-H716, así como de las muestras de xenoinjerto de POP92 y CSC73, utilizando el kit RNeasy Mini. Las muestras de ARN se desnaturalizaron a 95 °C durante 3 minutos en un bloque térmico para interrumpir las estructuras secundarias y se enfriaron inmediatamente sobre hielo para evitar la reanillación. Se colocaron volúmenes y cantidades iguales de ARN (3 μL; 500 ng a 1 μg) en una membrana Hybond N+ (GE Healthcare, Cat# RPN119B), se dejaron secar al aire y se reticularon con UV dos veces utilizando un Stratalinker (Stratagene). La membrana se bloqueó con leche al 5% en PBS-T (0,1% de Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubó durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-m6A (Synaptic Systems [SYSY], Cat# 202 003; dilución de 1:250). Al día siguiente, las membranas se lavaron tres veces con PBS-T y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-IgG de conejo (Cell Signalling Technology, Cat# 7074S; dilución de 1:5000 en leche al 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales con PBS-T, las señales se detectaron utilizando el sustrato Clarity Max Western ECL (Bio-Rad, Cat# 1705062) o el sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad, Cat# 1705061) y se visualizaron en un sistema Bio-Rad ChemiDoc. A continuación, las membranas se tiñeron con azul de metileno para verificar la carga equitativa de ARN y se visualizaron utilizando el modo de detección colorimétrica del sistema ChemiDoc.

Ensayos de inmunoprecipitación de m⁶A y dsRNA

La inmunoprecipitación de ARN de m⁶A (MeRIP) se realizó utilizando el kit Magna MeRIP (Merck), según las instrucciones del fabricante, seguida de un análisis de dot blot. Brevemente, se aisló el ARN total de cinco placas de 15 cm de células HT29 y/o HCT116 (CTRL o METTL3KD) utilizando el kit Qiagen RNeasy Midi y se fragmentó antes de la inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación se realizó utilizando un anticuerpo anti-m⁶A unido a cuentas magnéticas de proteína A/G. El ARN recuperado de las fracciones de entrada e inmunoprecipitado (IP) se colocó en una membrana Hybond N+ (GE Healthcare, Cat# RPN119B) y se reticuló con UV utilizando un Stratalinker. Las membranas se bloquearon y se sondearon con el anticuerpo anti-dsRNA J2 para detectar el dsRNA en las muestras de entrada e IP de m⁶A. Para la inmunoprecipitación de dsRNA (dsRNA-IP), la IP se realizó utilizando el anticuerpo anti-dsRNA J2 y el ARN recuperado se analizó mediante dot blot utilizando un anticuerpo anti-m6A. El bloqueo, la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados, los pasos de lavado y la detección de la señal utilizando el sustrato ECL (Clarity o Clarity Max, Bio-Rad) se realizaron como se describió anteriormente para el análisis de dot blot.

Análisis de viabilidad celular mediante CellTiter-Glo

Las células de cáncer colorrectal HT29 y HCT116 se sembraron en placas de 96 pocillos opacas a una densidad de 2500–5000 células por pocillo en 50 μL de medio de cultivo. Después de 24 h, las células se trataron con concentraciones crecientes de decitabina (0,029, 0,05, 0,11, 0,23, 0,46, 0,93, 1,87, 3,75, 7,5, 15 y 30 μM). Se incluyeron células tratadas con un control y pocillos que contenían solo medio como controles. Después de 5 días de tratamiento, las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante 30 min antes de la adición del reactivo del ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, Cat# G7572) en un volumen igual (100 μL por pocillo). Las placas se agitaron en un agitador orbital durante 2 min y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min adicionales para estabilizar la señal luminiscente. La luminiscencia se midió utilizando un lector de placas FLUOSTAR. Las señales se normalizaron a los pocillos de control y se generaron curvas de respuesta dosis para calcular los valores de CE50 utilizando análisis de regresión no lineal.

Tinción por inmunofluorescencia y microscopía

Se colocaron cubreobjetos de vidrio en una placa de 24 pocillos, se trataron brevemente con etanol al 100% (1 mL por pocillo) durante 5 min a temperatura ambiente y se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, las células de cáncer colorrectal se sembraron en los cubreobjetos a una concentración de 1 × 10⁵ células/mL y se cultivaron durante la noche a 37 °C para permitir la adhesión. Al día siguiente, las células se lavaron suavemente con PBS y se fijaron en metanol preenfriado a −20 °C durante 15 min. Las células fijadas se lavaron tres veces con PBS y se incubaron en solución de bloqueo (1% de albúmina sérica bovina en PBS) durante 1 h a 37 °C para reducir la unión inespecífica. Para la detección de ARN de cadena doble, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario J2 diluido 1:500 en solución de bloqueo. Después de la incubación con el anticuerpo primario, los cubreobjetos se lavaron tres veces en PBS (10 minutos cada uno) y luego se expusieron a anticuerpo secundario anti-IgG (H + L) F(ab')₂ conjugado con Alexa Fluor 647 (Cell Signalling Technology, Cat# 4410S) a una dilución de 1:1000 en 1% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente. Las muestras se protegieron de la luz durante y después de la incubación con el anticuerpo secundario. El exceso de anticuerpo se eliminó mediante tres lavados adicionales de 10 minutos en PBS. Para la tinción nuclear, las células se incubaron con Hoechst 33342 (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Cat# H1399; dilución 1:2000 en PBS) durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de lavados con PBS. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, Cat# P36930), con la superficie de la célula en contacto con el medio de montaje. Se adquirieron imágenes de confocal utilizando un microscopio Zeiss LSM980 equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40×. La intensidad de la fluorescencia se cuantificó utilizando el software ImageJ. La fluorescencia total celular corregida (CTCF) se calculó como:

CTCF = Densidad integrada – (Área de la célula seleccionada × Fluorescencia de fondo media). El anticuerpo J2 reconoce específicamente las especies de ARN de cadena doble de al menos 40 pares de bases de longitud.

CUT&RUN para el perfilado de H3K4me3

Los experimentos de CUT&RUN se llevaron a cabo en células de cáncer colorrectal CTRL y METTL3KD utilizando el kit de ensayo CUT&RUN (Cell Signalling Technology, Cat# 86652) según el protocolo del fabricante. Para cada condición, se inmovilizaron 1 × 10⁶ células en cuentas magnéticas recubiertas con concanavalina A y se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-H3K4me3 (Cell Signalling Technology, Cat# 9751; dilución 1:50). Después de la unión del anticuerpo, las células unidas a las cuentas se lavaron en un tampón que contenía digitonina antes de la adición de la micrococcina A-nucleasa (pA-MNase), que se incubó durante 1 h a 4 °C. La digestión de la cromatina se inició añadiendo 3 μL de 100 mM de CaCl₂ e incubando las muestras en hielo durante 30 min. La reacción se detuvo mediante la adición de un tampón de parada que contenía EDTA y EGTA. Los fragmentos de cromatina liberados se recogieron en el sobrenadante después de la centrifugación y el ADN se purificó utilizando el kit de purificación QIAGEN MinElute. El ADN purificado se utilizó luego para la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación con el kit de preparación de la biblioteca de ADN NEBNext Ultra II según las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas se secuenciaron en una plataforma Illumina NextSeq 2000 para generar lecturas de doble extremo.

Análisis de CUT&RUN

Los archivos fastq recortados se alinearon al genoma humano hg38 utilizando el programa de alineación Bowtie2 (v.2.3.4.2)^[84] con los parámetros establecidos como: -I 10 -X 700 –local –very-sensitive-local –no-mixed –no-discordant –no-unal. Los duplicados se marcaron y luego se eliminaron utilizando el programa picard. Para realizar la normalización de "spike-in", los mismos archivos fastq se alinearon al genoma de levadura sacCer3 utilizando Bowtie2 con los parámetros establecidos como: -I 10 -X 700 –local –very-sensitive-local –no-mixed –no-discordant –no-unal –no-overlap –no-dovetail. El factor de normalización de "spike-in" se calculó como la relación entre 20 000 y el número total de lecturas alineadas al genoma de levadura. La cobertura del genoma de cada muestra se generó a partir de los archivos de alineación utilizando el comando genomecov en el conjunto de herramientas bedtools (v.2.28.0)^[85] con el parámetro de escala establecido como el factor de normalización de "spike-in" para normalizar la biblioteca. Los picos se identificaron a partir de los archivos BAM alineados al genoma humano utilizando MACS2 con los siguientes parámetros: -q 0.01 -B –SPMR –keep-dup all. Las muestras de IgG se utilizaron como controles. Los mapas de calor que visualizan las señales en las regiones de los picos se produjeron utilizando deeptools.

La ocupación de H3K4me3 dentro de 3000 nucleótidos aguas arriba y aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción (TSS) se cuantificó utilizando featureCounts con un archivo BED generado a medida. Se utilizó edgeR para identificar los genes con ocupación diferencial (DOG) para H3K4me3 en comparaciones por pares. Los DOG se definieron como genes con un cambio absoluto mayor que 2 y una tasa de descubrimiento falso (FDR) inferior a 0,05. La ocupación promedio de H3K4me3 en las regiones IR inducidas o protegidas por MDA5 y sus regiones adyacentes de 50 kb se calculó por separado utilizando la función computeMatrix de deepTools.

Ensayo de estabilidad del ARN

Las células HT29 CTRL y METTL3KD se sembraron a una densidad de 5 × 10⁴ células/mL en placas de cultivo de 100 mm. Después de 24 h, se recogió una placa de cada condición para servir como punto de tiempo de 0 horas. Las placas restantes se trataron con DMSO (control del vehículo) o actinomicina D (5 μg/mL; Sigma-Aldrich, Cat# A9415-2MG) para inhibir la transcripción, y las células se recogieron cada 2 h después del tratamiento. Se extrajo el ARN total utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen) con digestión de DNasa I en la columna según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó cDNA a partir del ARN purificado y se cuantificaron los niveles de transcripción mediante qPCR. Para determinar la vida media de los transcritos de ARN, primero se normalizaron los niveles de expresión de los ARNs examinados a la expresión correspondiente de GAPDH en cada punto de tiempo. Luego, se calculó la cantidad relativa de ARN restante dividiendo el nivel de ARN normalizado en cada punto de tiempo por el nivel en el punto de tiempo de 0 h. Las curvas de degradación para cada ARN se generaron ajustando la ecuación a los valores de ARN restante relativo en los puntos de tiempo medidos. Posteriormente, se calculó la vida media utilizando la fórmula .

Predicción de la estructura secundaria del ARN

Para predecir las estructuras secundarias de los transcritos IR-Alu, las secuencias de ARN sin procesar, incluidos los elementos Alu aguas arriba y aguas abajo, así como las regiones de conexión, se enviaron al RNAfold WebServer (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)^[86] utilizando la configuración predeterminada, excepto que se habilitaron las correcciones de energía para las bases modificadas. Las estructuras secundarias de energía libre mínima (MFE) predichas se descargaron y se extrajeron los valores de MFE correspondientes.

Para examinar el efecto de la modificación m⁶A en la estructura secundaria del ARN, todos los adenosinas dentro del motivo de consenso m⁶A (DRACH) en las secuencias de ARN IR-Alu sin procesar se sustituyeron por 6 y se enviaron al RNAfold WebServer utilizando la misma configuración. Las estructuras de MFE predichas se descargaron y se extrajeron los valores de MFE de manera similar.

Datos públicos

Los datos de expresión génica de las muestras del conjunto de datos TCGA se obtuvieron del UCSC Toil RNA-seq Recompute Compendium^[87]. El efecto del gen METTL3 en células cancerosas, cuantificado como probabilidad de dependencia, se obtuvo de DepMap (v24Q2) (https://depmap.org/portal)^[36]. El estado de inestabilidad de microsatélites de los cánceres colorrectales (CRC) también se obtuvo de DepMap, mientras que el estado del fenotipo de metilación de las islas CpG de los CRC se obtuvo de la ref. ^[88].

La subtipificación molecular de consenso (CMS) de los CRC se realizó utilizando el método SSP en el paquete R CMSclassifier (v1.0.0)^[41]. Los datos de expresión génica de entrada, descargados de DepMap, permitieron la clasificación de las muestras en CMS1, CMS2, CMS3, CMS4 o grupos no consenso. Cabe destacar que ninguna de las muestras de CRC se asignó al subtipo CMS4.

La asociación entre las mutaciones genéticas de CRC y los efectos del gen METTL3 se visualizó utilizando la función oncoplot del paquete R maftools (v2.18.0)^[89]. Los datos de entrada para este análisis, incluidos los perfiles de mutación somática y las puntuaciones del efecto del gen METTL3 para cada CRC, se obtuvieron de DepMap. Se proporciona un resumen de las líneas celulares de cáncer colorrectal analizadas en este estudio, incluida su probabilidad de dependencia de METTL3, estado CIMP, estado MSS/MSI y estado de mutación de KRAS, en los Datos suplementarios 7.

Análisis estadístico e ilustración

El número de muestras utilizadas en cada experimento se indica en las leyendas de las figuras. GraphPad Prism (v11.0.0) se utilizó para los análisis estadísticos y la visualización de datos, y las ilustraciones esquemáticas se crearon con BioRender.com. Los análisis estadísticos de los datos de secuenciación y los datos disponibles públicamente se realizaron en R (v4.3.2). La significación se evaluó utilizando pruebas de rango-suma de Wilcoxon de dos colas, pruebas t de Student de dos colas u otros métodos según se especifica en las secciones correspondientes. El método de Benjamini-Hochberg se aplicó para ajustar las pruebas de hipótesis múltiples cuando fue apropiado.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.