Aprovechamiento de la inmunidad innata inducida por el glucano para la reprogramación epigenética y metabólica de los macrófagos, con el fin de mejorar la respuesta de la vacuna contra el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) ha atraído una atención negativa significativa debido a que es la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer^[1]. Además, el cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo, con una estimación de 1,9 millones de nuevos casos y casi 1 millón de muertes en 2020^[2]. A pesar de que su incidencia se ha estabilizado o disminuido entre los adultos mayores debido al uso generalizado de la detección, varios estudios han informado un aumento en los diagnósticos de CCR entre los adultos más jóvenes a nivel mundial (menores de 50 años)^[3]. En comparación con el CCR de inicio tardío, los pacientes más jóvenes tienen una mayor proporción de enfermedad en estadio avanzado y, a pesar de tener tasas de supervivencia significativamente mejores, la supervivencia general (SG) en el CCR metastásico de inicio temprano es de 18 meses, lo que destaca la urgente necesidad de estrategias de detección mejoradas y nuevos enfoques terapéuticos^[4].

Los enfoques de tratamiento tradicionales se basan en la quimioterapia, la radioterapia y la resección quirúrgica radical, que, aunque son eficaces en un subconjunto de pacientes, están asociados con varios efectos secundarios y una alta tasa de recurrencia de alrededor del 70-75%, especialmente en casos de CCR más avanzados^[4]. Se produjo un cambio en el paradigma del tratamiento cuando se introdujeron las inmunoterapias contra el cáncer en la clínica. Se observaron avances significativos con los inhibidores de los puntos de control inmunitario (IPI) en el tratamiento del CCR, especialmente en el CCR con deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento o con alta inestabilidad de microsatélites debido a una mayor carga mutacional^[5]–^[8]. Sin embargo, se demostró que los IPI eran en gran medida ineficaces en el CCR con reparación de errores de emparejamiento competente o con baja inestabilidad de microsatélites, lo que representa el 85% de todos los casos^[9],^[10]. Para superar esta necesidad médica insatisfecha, se han diseñado varias vacunas contra el cáncer para mejorar una respuesta activa de las células T antitumorales, y se han realizado varios ensayos clínicos que han demostrado un aumento de las respuestas generales^[11]–^[14]. Sin embargo, el microambiente tumoral (MET) se consideró un factor común que limitaba la erradicación del tumor. A pesar de la formación de una respuesta/infiltración adecuada de células T CD8+, la eficacia de la eliminación del tumor se ha visto disminuida por la presencia de células T reguladoras (Tregs)^[15]–^[17], células supresoras derivadas de la médula ósea (CSMO)^[18]–^[20], macrófagos asociados al tumor (MAT)^[21]–^[24] y citocinas inmunosupresoras^[25]–^[27]. Por lo tanto, la modulación del MET podría ser una estrategia eficaz para mejorar las vacunas contra el cáncer en el CCR.

La inmunidad entrenada fue descrita por Netea y sus colegas como una respuesta de memoria inespecífica del sistema inmunitario innato^[28]. Implica una reprogramación epigenética y metabolómica de las células inmunitarias innatas, cuando se exponen a estímulos específicos, lo que resulta en una respuesta mejorada cuando se reexponen a un estímulo heterólogo. Muchos estudios han demostrado una protección contra un desafío heterólogo de patógenos, incluidos bacterias^[29]–^[31], virus^[32]–^[36] o hongos. En relación con el cáncer, solo recientemente se han realizado estudios que implican a las células tumorales como estímulos para la inmunidad entrenada. Estos efectos se han observado en el cáncer de mama^[37],^[38], páncreas^[39],^[40] y pulmón, donde se observó una inflamación antitumoral general en todos los estudios. Específicamente, se ha observado una reducción de las CSMO y una reprogramación de los MAT y los monocitos hacia una respuesta antitumoral, lo que ha llevado a un aumento de la respuesta a la terapia con IPI^[39],^[40]. Por lo tanto, se cree que la inmunidad entrenada podría mejorar la vacunación contra el cáncer mediante la modulación del MET, específicamente las poblaciones inmunitarias innatas. Además, también se cree que la inmunidad entrenada podría potenciar aún más la fuerza de las respuestas inmunitarias adaptativas elicitadas al fortalecer la respuesta inmunitaria innata. Este es un concepto que se ha hipotetizado, pero nunca se ha estudiado.

En este trabajo, utilizamos el beta-glucano como inductor de la inmunidad entrenada y probamos si podría mejorar el efecto de PeptiCrad (PC)^[41],^[42], una plataforma de vacuna contra el cáncer en la que los péptidos específicos del tumor se recubren electrostáticamente en la superficie de los adenovirus, combinando así una entrega viral eficiente con la activación de las células T específicas del antígeno. Actualmente, PC se está evaluando en ensayos clínicos (NCT05492682). Cuando se induce la inmunidad entrenada en ratones con CCR, se demuestra que la vacunación se mejora. Los estudios metabolómicos revelan una reprogramación de los MAT, lo que provoca un aumento del efecto de Warburg y cambios epigenéticos. La secuenciación de ARN de una sola célula revela que estos MAT aumentan la expresión de CXCL9 y CXCL10, lo que lleva a un aumento de la infiltración de células NK. Este aumento de las células NK da como resultado la excreción de CCL5, lo que induce a las poblaciones de células dendríticas convencionales 1 (cDC1), lo que mejora aún más las respuestas de las células T. En estudios en humanos, también demostramos que las PBMC inducidas por la inmunidad entrenada tienen respuestas más altas de células T CD8+ cuando se tratan con una vacuna contra el cáncer, lo que lleva a una mayor eliminación del tumor en organoides derivados de pacientes con CCR.

Resultados

La inmunidad entrenada inducida por el glucano mejora la respuesta de la vacuna

Para explorar los efectos inmunológicos de la inmunidad entrenada inducida por el glucano, reanalizamos los datos de secuenciación de ARN de una sola célula de un estudio publicado anteriormente^[40]. En ese estudio, se trató a ratones C57BL/6 con PBS o partículas de glucano completas derivadas de las paredes celulares de la levadura (WPG), y se recolectó tejido pancreático a los días 3 y 7 posteriores al tratamiento. Se observaron cambios distintos en las poblaciones de células inmunitarias entre los ratones tratados con PBS y los ratones tratados con WPG (Fig. 1A, Fig. S1A). En particular, los grupos 7, 11 y 12 aumentaron progresivamente en los ratones tratados con WPG (Fig. 1B) y se identificaron como macrófagos y monocitos Chil3+ Ly6C, lo que sugiere su participación en la inmunidad entrenada.

El análisis de la expresión génica promedio reveló un aumento de los genes de procesamiento y presentación de antígenos en los ratones WPG en ambos puntos temporales (Fig. S1B–C). Hif1α, un sello distintivo de la inmunidad entrenada, también se reguló al alza (Fig. S1D). El análisis DEG de los grupos 7, 11 y 12 confirmó la regulación al alza de los genes de presentación de antígenos (Fig. 1C). En el grupo 11, b2m, h2-k1, ctss y h2-q7 se elevaron en el día 7 (Fig. 1D–E), mientras que el grupo 7 mostró un aumento de ctsc, h2-dma, h2-ab1 y h2-aa, y el grupo 12 reguló al alza b2m. Estos cambios se alinean con las vías mejoradas de MHC-I y MHC-II, lo que respalda la activación de la inmunidad adaptativa. Además, cxcl9 y cxcl10 se regularon al alza (Fig. S1E), lo que sugiere un aumento del reclutamiento de células NK y células T. En resumen, este análisis enfocado de los grupos 7, 11 y 12, que enfatiza la presentación de antígenos y la atracción de células NK/T, no se exploró en el conjunto de datos original de Geller.

Dado que este análisis se limitó al páncreas y las poblaciones de células inmunitarias pueden diferir, investigamos más a fondo si la inmunidad entrenada inducida por WPG podría mejorar una respuesta de la vacuna a nivel sistémico. Se pretrataron ratones C57BL/6 con PBS o WPG y se vacunaron con PC basado en adenovirus que contenía SIINFEKL (Fig. 1F) como prueba de concepto. La citometría de flujo reveló que la estimulación con SIINFEKL indujo cambios significativos en los subconjuntos de memoria de las células T (Fig. S2A y Fig. S3A). Los ratones entrenados mostraron una reducción de la memoria central (MC) (CD44+ CD62L+) y un aumento de la memoria efectora (ME) (CD44+ CD62L-) de las células T CD8+ (Fig. 1G), un fenotipo relacionado con respuestas robustas. Además, las células T CD8+ de los ratones entrenados expresaron niveles más altos de IFN-γ y TNF-α (Fig. 1H–I), con una mayor producción de citocinas por célula (Fig. S3B). IL-2 no se elevó (Fig. S3C). Además, la estimulación con SIINFEKL indujo IL-2, TNF-α e IFN-γ en las células T CD4+ (Fig. S3D), lo que probablemente refleja los efectos indirectos de las células T CD8+^[43],^[44]. En conjunto, estos resultados demuestran que la inmunidad entrenada inducida por WPG mejora la presentación de antígenos en las células mieloides y promueve las respuestas de las células T CD8+ de memoria efectora, lo que fortalece la inmunidad inducida por la vacuna.

La inmunidad entrenada mejora la respuesta de la vacuna tanto en entornos profilácticos como terapéuticos en ratones portadores de CT26

Después de observar los efectos de nuestro modelo in vivo de vacuna inicial, procedimos a probar nuestro enfoque en un entorno de cáncer de colon utilizando el modelo CT26. Para imitar un entorno profiláctico, primero se trataron ratones Balb/c con PBS o WPG (Fig. 2A) antes de la implantación del tumor. Posteriormente, utilizamos la misma vacuna basada en adenovirus (PC), esta vez recubierta con un péptido CT26 derivado/específico inmunogénico validado (péptido Syl)^[44]. Como se muestra, los ratones tratados con la combinación de WPG y PeptiCRAd (Entrenado+PC) exhibieron el mayor control tumoral, PC solo mostró una supresión moderada y WPG solo no tuvo efecto en comparación con el grupo de control (Fig. 2B, Fig. S4A). Por lo tanto, la inmunidad entrenada por sí sola fue insuficiente, pero preparó el sistema inmunitario para mejorar la eficacia de la vacuna.

Después de sacrificar los ratones, analizamos los subconjuntos de células dendríticas en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. 2C, Fig. S5A). Si bien las cDC2 (CD103- MHCII+ CD11c+) dominaron en todos los grupos, el tratamiento con WPG y Entrenado+PC aumentó la frecuencia de cDC1 (CD103+ MHCII+ CD11c+), y Entrenado+PC mostró el efecto más fuerte.

A continuación, evaluamos la respuesta inmunitaria sistémica aislando esplenocitos de ratones tratados y estimulándolos ex vivo con PBS, adenovirus o el péptido Syl. Con la estimulación con PBS, los ratones Entrenado+PC mostraron una mayor cantidad de células T ME en los compartimentos CD8+ (CD44+ CD62L-) (Fig. 2D) y CD4+ (Fig. 2E), lo que indica una activación sistémica. Tras la reestimulación con el péptido Syl, los esplenocitos Entrenado+PC exhibieron nuevamente más células T ME y menos células T MC (CD44- CD62L-) en los compartimentos CD8+ (Fig. 2F) y CD4+ (Fig. 2G), lo que confirmó las respuestas específicas del péptido. En contraste, WPG solo no indujo respuestas específicas de Syl, aunque los esplenocitos respondieron vigorosamente al adenovirus, lo que es consistente con la inmunidad entrenada que potencia las vías antivirales.

Para evaluar el potencial terapéutico, probamos tumores de CT26 establecidos. Se administró WPG después de la implantación, seguido de la vacunación (Fig. 2K). Una vez más, los ratones Entrenado+PC exhibieron la carga tumoral más baja (Fig. 2L–M), mientras que Mock, PC o WPG solo tuvieron poco efecto. El análisis del MET mostró un aumento de la infiltración de monocitos (Fig. 2N) y MAT (Fig. 2O) en los grupos Entrenado y Entrenado+PC, mientras que los neutrófilos permanecieron sin cambios (Fig. S6A). Los MAT expresaron niveles más altos de CD80 (Fig. S6B) y los monocitos niveles más altos de CD86 (Fig. S6C), lo que indica la activación.

En conjunto, estos resultados demuestran que la inmunidad entrenada inducida por WPG mejora la vacunación contra el CCR tanto en entornos profilácticos como terapéuticos. Esta sinergia implica la expansión de cDC1, la activación sistémica de las células T ME, el aumento de la producción de citocinas y la remodelación del MET para favorecer la activación de monocitos/MAT.

El perfilado metabolómico de las células CD11b+ revela una reprogramación metabólica

Se ha demostrado que la inmunidad entrenada altera la función metabólica de las células mieloides. Para investigar más a fondo el estado metabólico de las células CD11b+ infiltrantes del tumor, realizamos un análisis metabolómico completo después del tratamiento. Dado que las células CD11b+ son la principal población inmunitaria afectada por nuestra estrategia, buscamos determinar cómo cambia su panorama metabólico al exponerse a PC en comparación con WPG combinado con PC (Entrenado+PC). Se cosecharon los tumores, se clasificaron las células CD11b+ mediante FACS y se sometieron a un perfilado metabolómico (Fig. 3A, Fig. S7A).

El análisis de componentes principales (ACP) reveló una clara diferenciación entre los dos grupos, con PC1 y PC2 que representaron el 62,2% y el 24,5% de la varianza, respectivamente (Fig. 3B), lo que destaca una clara divergencia en la composición de los metabolitos después del tratamiento con Trained+PC. El análisis comparativo reveló aumentos pronunciados en múltiples aminoácidos (alanina, serina, ácido glutámico, valina, asparagina, ácido málico, arginina), ácidos grasos y los principales intermediarios de la vía de la creatina (creatina, fosfocreatina, creatinina) (Fig. 3C y Fig. S7B–C). El análisis diferencial de metabolitos confirmó la regulación al alza de varios aminoácidos y la creatinina (Fig. 3D y Fig. S7D). El análisis del impacto de las vías identificó además la regulación al alza de la biosíntesis de aminoácidos (notablemente arginina, serina, ácido glutámico), la síntesis de ácidos grasos y las vías relacionadas con la glucólisis aeróbica y el efecto de Warburg, lo que se corroboró con el aumento del lactato (Fig. 3E). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos reforzó estos hallazgos, mostrando el enriquecimiento de las vías glucolíticas, de aminoácidos y de lípidos (Fig. 3F). En conjunto, estos datos sugieren que el tratamiento con Trained+PC promueve un cambio coordinado hacia programas biosintéticos y generadores de energía. Dados estos hallazgos, buscamos explorar cómo estaban interconectadas las diferentes vías metabólicas (Fig. S7D). El análisis de correlación reveló fuertes asociaciones entre la biosíntesis de nucleótidos, el metabolismo de los aminoácidos, la síntesis de ácidos grasos y el efecto de Warburg. Para visualizar las relaciones entre estas vías metabólicas, construimos un mapa de interacción de metabolitos basado en redes (Fig. S7E). Este análisis reveló una clara interconexión entre el metabolismo de los aminoácidos, la biosíntesis de ácidos grasos y la síntesis de nucleótidos, lo que apoya aún más nuestra hipótesis de que el tratamiento con Trained+PC induce un cambio metabólico coordinado hacia vías biosintéticas y generadoras de energía.

Para validar funcionalmente estas observaciones, realizamos ensayos de flujo extracelular de Seahorse en macrófagos murinos aislados, debido a su alta abundancia en el tumor (Fig. 2J). Después de 18 horas de estimulación ex vivo con PBS o WPG, los macrófagos entrenados mostraron tasas de consumo de oxígeno (TCO) significativamente más altas en dos densidades de siembra (40.000 y 80.000 células) (Fig. 3H), con aumentos en la respiración basal y máxima (Fig. S8A–C). Cabe destacar que una gran parte de la TCO basal se debió al consumo de oxígeno no mitocondrial (Fig. S8D). En paralelo, los macrófagos entrenados mostraron tasas de acidificación extracelular (TCAE) elevadas, con niveles más altos tanto en condiciones basales como después de la inhibición de la síntesis de ATP mitocondrial, lo que es consistente con una actividad glucolítica aumentada (Fig. 3I) y los niveles basales de glucólisis (Fig. S8D).

Para investigar la cinética de esta remodelación metabólica, repetimos el ensayo después de solo 2 horas de estimulación. En estas condiciones, la TCO se mantuvo comparable entre los grupos (Fig. 3K; y Fig. S8F–H). Nuevamente, la mayor parte de la TCO reflejó el consumo de oxígeno no mitocondrial (Fig. S8I). Sin embargo, la TCAE ya estaba significativamente aumentada en los macrófagos entrenados (Fig. 3L), acompañada de un aumento de la glucólisis basal (Fig. S8J). Estos resultados demuestran que el WPG reprograma rápidamente los macrófagos hacia la glucólisis, lo que es consistente con un fenotipo similar al de Warburg que se establece en pocas horas y se refuerza con el tiempo.

En conjunto, el perfilaje metabolómico y bioenergético convergen para mostrar que los macrófagos entrenados experimentan una amplia remodelación metabólica caracterizada por una mayor biosíntesis de aminoácidos y lípidos, el metabolismo de la creatina y un cambio pronunciado hacia la glucólisis aeróbica. Esta reprogramación proporciona la energía y la capacidad biosintética necesarias para mantener las funciones proinflamatorias y antitumorales en el contexto de la vacunación.

Secuenciación de ARN de una sola célula revela un paisaje inmunitario innato distinto después del tratamiento con Trained+PC

Para evaluar cómo el tratamiento con Trained+PC altera el paisaje inmunitario innato en los tumores, realizamos la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células CD11b+ clasificadas de ratones portadores de tumores tratados con PC o Trained+PC. Esto nos permitió capturar los cambios inducidos por el tratamiento en todo el compartimento mieloide. La agrupación reveló diversas poblaciones innatas, con macrófagos, monocitos y células NK como los principales subconjuntos (Fig. 4A y Fig. S9A). Los grupos 0, 3, 2, 7, 10 y 1 (macrófagos, monocitos, células NK) se expandieron significativamente en el tratamiento con Trained+PC, lo que demuestra la remodelación del microambiente tumoral (MET) (Fig. 4B, C). En consonancia con esto, el tratamiento con Trained+PC reguló a la alza las citocinas como cxcl9 y cxcl2 (Fig. S9B), lo que sugiere una mayor captación de células T y NK. El análisis reveló una clara expresión de itgam (CD11b) en la mayoría de los grupos (Fig. S9C), con una contaminación mínima, lo que demuestra un enriquecimiento exitoso.

A continuación, buscamos identificar los programas funcionales dentro de estos grupos. La estratificación reveló dos patrones inflamatorios principales (Fig. 4D). Primero, los grupos 2 (chil3+ ly6Chi macrófagos, Fig. S9D), 14 (células NK), 13 (células dendríticas convencionales, cDC1), 7 (monocitos) y 9 (células ILC) regularon a la alza fcgr1, ccl9, cxcl9/10, cd86 e irf5, lo que es consistente con un fenotipo proinflamatorio. La expresión de lyz2 y tnfaip2 en estos grupos (Fig. S9E) apoyó aún más la inflamación impulsada por el mieloide, y el grupo 2 mostró la respuesta más fuerte. En segundo lugar, los grupos 1 (células NK), 8 (monocitos) y 11 (células NKT) mostraron una firma de IFN de tipo I (Ifngr1). También examinamos la detección de β-glucano y encontramos que clec7a (dectin-1), un receptor clave involucrado en el reconocimiento de β-glucano [41, 42], se expresó ampliamente en los grupos inflamatorios (Fig. S9F), excepto en las células NK/NKT, lo que sugiere una activación indirecta de las células NK a través de las citocinas y la interacción de quimiocinas dentro del microambiente tumoral. Para probar si el tratamiento con Trained+PC desplazaba las células hacia la supresión, analizamos los genes antiinflamatorios. Se detectaron pocos (Fig. 4E): los macrófagos del grupo 2 mostraron una expresión limitada de nos2/arg1, pero esto se limitó a una minoría. Por lo tanto, el tratamiento con Trained+PC promovió una activación inflamatoria duradera en lugar de una supresión compensatoria.

Para analizar aún más un mecanismo de acción, realizamos un análisis de enriquecimiento de vías conjuntas, integrando los datos de scRNA-seq con el cribado metabolómico obtenido previamente (Fig. 4F). En particular, las vías asociadas con la activación de las células T, incluida la señalización del TCR y la diferenciación Th1/Th2, se enriquecieron significativamente, lo que sugiere que el tratamiento con Trained+PC mejoró la activación de la inmunidad adaptativa. Además, la señalización de quimiocinas y las vías JAK-STAT surgieron como redes reguladoras clave, lo que indica que la modulación inmunitaria impulsada por las citocinas fue una característica central de los cambios inducidos por el tratamiento. Curiosamente, la citotoxicidad mediada por las células NK fue una de las vías más reguladas a la alza, a pesar de que las propias células NK no expresaban dectina-1. Esto sugiere fuertemente que su expansión y activación fueron secundarias a las señales inflamatorias de otras poblaciones mieloides en lugar de a la señalización directa de WPG.

Para analizar los mecanismos que impulsan la expansión de las células NK, analizamos los grupos de monocitos y macrófagos, ya que estas células son los principales productores de citocinas conocidas por reclutar y activar las células NK (Fig. 4G). Los macrófagos del grupo 2 mostraron un perfil inflamatorio marcadamente mayor en comparación con los monocitos del grupo 7, lo que sugiere un papel dominante en la orquestación de la respuesta inmunitaria. El análisis de expresión confirmó que los macrófagos del grupo 2 regularon a la alza cxcl9, cxcl10 e il15, que son factores clave conocidos por impulsar el reclutamiento, la proliferación y la citotoxicidad de las células NK (Fig. 4H). Estos hallazgos implican que los macrófagos con inmunidad entrenada (macrófagos Chil3+ Ly6Chi) actúan como reguladores centrales de la expansión y la función de las células NK dentro del microambiente tumoral.

Dado el importante infiltrado de células NK observado en los tumores tratados con Trained+PC, caracterizamos aún más los grupos de células NK del grupo 1 para definir su fenotipo funcional (Fig. 4I), basándonos en métodos de clasificación previos ^[45]. Al clasificar estas células en subpoblaciones en reposo, sensibles a citocinas, activadas y sensibles al IFN de tipo I, observamos un enriquecimiento predominante de las células NK sensibles a citocinas (Fig. 4I). Esto se acompañó de una regulación robusta de las quimiocinas como ccl5, ccl4 y xcl1 (Fig. 4J), que se sabe que facilitan el reclutamiento de las células dendríticas convencionales (cDC) (Fig. 4J). Además, entre los principales genes del análisis de componentes principales se encontraba ccl5 (Fig. S9G), lo que demuestra aún más su importancia. Por lo tanto, el fenotipo de las células NK productoras de quimiocinas sugiere un papel crítico de las células NK en la configuración de la activación posterior de las células presentadoras de antígenos (APC). Además, se observó que las células NK del grupo 1 de los ratones tratados con Trained+PC tenían niveles similares de pdcd1, tigit, havcr2, lo que indica que no hay efectos de agotamiento (Fig. S10A). Esto se confirmó aún más al analizar las células NK del microambiente tumoral de los ratones que recibieron el tratamiento después de la implantación del tumor (Fig. S10B).

Para examinar el impacto posterior en la función de las APC, analizamos los grupos 12 y 13, que representan las células dendríticas plasmocitoides (pDC) y las células dendríticas convencionales (cDC1), respectivamente (Fig. 4K). Las cDC1 (grupo 13) mostraron una regulación marcada de los genes de presentación de antígenos cd80, cd83 y h2-Aa (Fig. 4K, L), lo que es consistente con un fenotipo activado. Por lo tanto, el tratamiento con Trained+PC no solo expandió las cDC1, sino que también mejoró su capacidad funcional.

En conjunto, estos experimentos revelan una posible cascada de activación secuencial: los macrófagos entrenados (grupo 2) secretan Cxcl9/10 e Il15, reclutando células NK; las células NK secretan Ccl5/Xcl1, mejorando la infiltración y activación de las cDC1; las cDC1 luego activan las células T. Este eje macrófago-célula NK-cDC1 podría proporcionar una explicación mecanicista de la eficacia superior del tratamiento con Trained+PC en comparación con el tratamiento con PC solo.

Regulación de la creatina en la inmunidad entrenada que mejora la liberación de citocinas proinflamatorias y la infiltración de células NK

Para analizar los requisitos metabólicos de la inmunidad entrenada, enriquecimos las células CD11b⁺ del bazo, las expusimos a PBS o WPG y las restimulamos con adenovirus en presencia o ausencia de inhibidores metabólicos dirigidos a la glucólisis/mTOR (rapamicina), la estabilización de HIF-1α (ascorbato) o la captación de creatina (β-GPA) (Fig. 5A). Las células tratadas con PBS no produjeron TNF-α, mientras que las células entrenadas con WPG mostraron una inducción robusta de TNF-α e IL-6, ambas de las cuales se redujeron significativamente con los inhibidores (Fig. 5A, B). Dado que nuestros datos de scRNA-seq destacaron CXCL9 y CXCL10 como las principales quimiocinas que se regularon a la alza en los macrófagos entrenados, evaluamos a continuación su secreción. Coherente con nuestros hallazgos de células individuales, las células CD11b⁺ entrenadas secretaron niveles significativamente más altos de CXCL9 y CXCL10 en comparación con los controles de PBS. Sin embargo, la secreción se abolió cuando se añadieron rapamicina, ascorbato o β-GPA, lo que demuestra que tanto el metabolismo glucolítico como el dependiente de la creatina apoyan la reprogramación proinflamatoria de los macrófagos entrenados.

Dado que los experimentos iniciales solo evaluaron los efectos de los inhibidores durante la estimulación secundaria, repetimos los ensayos añadiendo los inhibidores durante la fase de preparación del entrenamiento WPG. Como se esperaba, las células entrenadas produjeron niveles elevados de IL-6, TNF-α, CXCL9 y CXCL10 tras la estimulación con adenovirus, pero esta producción se redujo drásticamente con todos los inhibidores cuando se administraron durante la fase de preparación (Figura suplementaria 11A–E). Además, cuando lavamos la β-GPA y añadimos creatina, se restablecieron las expresiones de CXCL9 y CXCL10 (Figura suplementaria 11D y E). Para evaluar directamente si el metabolismo de la creatina afecta la programación epigenética o solo la función efectora, nos centramos en los macrófagos, ya que en nuestro análisis de células individuales, estos emergieron como la población entrenada clave que impulsa el eje NK–cDC1. Por lo tanto, se enriquecieron los macrófagos CD11b⁺F4/80⁺ y se tiñeron para detectar H3K4me3, una marca de histonas asociada con la inmunidad entrenada. En comparación con los controles de PBS, los macrófagos entrenados con WPG mostraron un aumento marcado en H3K4me3 después de la estimulación con adenovirus (Figura suplementaria 11F). Este enriquecimiento se mantuvo incluso en presencia de β-GPA (Figura suplementaria 11G), lo que indica que la creatina no influye en la adquisición de marcas epigenéticas entrenadas, sino que más bien mantiene la función efectora durante el desafío secundario. A continuación, evaluamos si la remodelación epigenética inducida por WPG regula la expresión del transportador de creatina Slc6a8. El ChIP-qPCR para H3K4me3 no mostró enriquecimiento en el locus Slc6a8 (Figura suplementaria 11H). Sin embargo, el RT-qPCR reveló un aumento significativo en los niveles de transcripción de Slc6a8 en los macrófagos entrenados en comparación con los controles tratados con PBS (Figura suplementaria 11I), lo que sugiere que la regulación al alza del transporte de creatina se produce independientemente de la inducción epigenética mediada por H3K4me3.

Para evaluar el papel de la creatina en la inmunidad adaptativa inducida por PC, probamos si el tratamiento con β-GPA afectaba el control tumoral. Los ratones portadores de CT26 fueron tratados con PBS o WPG (entrenados) y vacunados con PC, y a un subgrupo se le administró diariamente β-GPA para bloquear la captación de creatina (Figura 5C). Como se esperaba, Trained+PC proporcionó el mejor control tumoral (Figura 5D y Figura suplementaria 12A). En cambio, el tratamiento con β-GPA alteró parcialmente este efecto, con tumores que crecieron más que en Trained+PC, pero que siguieron siendo más pequeños que en los controles simulados (Figura 5C, D y Figura suplementaria 12A). La β-GPA por sí sola no afectó el crecimiento tumoral, lo que confirma que no tiene actividad antitumoral o pro-tumoral intrínseca.

Para analizar las alteraciones inmunitarias, analizamos la infiltración tumoral de macrófagos y células NK (Figura suplementaria 11B). Los números de macrófagos no cambiaron entre los grupos Trained+PC y Trained+PC+β-GPA (Figura 5E y F), mientras que la infiltración de células NK se redujo notablemente en los tumores tratados con β-GPA (Figuras G y H). Esto coincide con nuestro hallazgo anterior de que la β-GPA suprime la secreción de CXCL9/CXCL10 de las células CD11b⁺ entrenadas, unas quimiocinas críticas para el reclutamiento de células NK.

Para evaluar la remodelación epigenética in vivo, teñimos los macrófagos derivados del tumor CD11b⁺F4/80⁺. Trained+PC aumentó H3K4me3 en comparación con los controles de PBS (Figura 5I, J). Es importante destacar que este enriquecimiento persistió a pesar de la β-GPA, lo que refuerza que la creatina no impulsa la programación epigenética, sino que apoya las respuestas efectoras. En conjunto, estos resultados demuestran que el metabolismo de la creatina es un impulsor central de la fase efectora de la inmunidad entrenada en el CCRC, manteniendo la producción de citocinas y quimiocinas (incluidas CXCL9 y CXCL10) y permitiendo el reclutamiento de células NK, sin alterar la remodelación epigenética subyacente.

La interacción macrófago-célula NK promueve la infiltración de células dendríticas y la memoria de células T CD8⁺ en la inmunidad entrenada

Para aclarar los papeles funcionales de los macrófagos y las células NK en el control tumoral mediado por la inmunidad entrenada, eliminamos selectivamente estos subconjuntos en ratones portadores de CT26 antes del entrenamiento con WPG y la vacunación con PC (Figura 6A). La citometría de flujo confirmó la eliminación eficiente (Figura suplementaria 13A). El crecimiento tumoral mostró que la pérdida de cualquiera de los subconjuntos alteró el control, mientras que la eliminación dual abolió la eficacia (Figura 6B, Figura suplementaria 13B), lo que demuestra papeles complementarios no redundantes.

A continuación, preguntamos cómo estas células influyen en la inmunidad sistémica. Los esplenocitos de los ratones Trained+PC contenían abundantes células T CD8⁺ EM y células T CD8⁺ CM después de la reestimulación con péptido Syl (Figura 6C), mientras que la eliminación de macrófagos o células NK redujo ambas poblaciones (Figura 6D). Esto se correlacionó con una alteración del reclutamiento de células dendríticas, en particular cDC1, como se muestra por la citometría de flujo (Figura suplementaria 14A, B). Funcionalmente, la producción de citocinas de células T CD8⁺ (IFN-γ, TNF-α) se redujo significativamente en los grupos eliminados (Figura suplementaria 14C, D). En conjunto, estos resultados indicaron que los macrófagos y las células NK juntos forman un eje ascendente crítico necesario para establecer una inmunidad adaptativa eficaz. Para definir aún más el papel de las células T, repetimos los experimentos en ratones portadores de CT26 tratados con Trained+PC pero eliminados de células T CD8⁺ (Figura suplementaria 15A). La eliminación exitosa se confirmó mediante el análisis de sangre (Figura suplementaria 15B), y observamos que estos ratones perdieron por completo el control tumoral (Figura suplementaria 15C). Por lo tanto, los macrófagos entrenados o las células NK por sí solas no son suficientes para mediar el control tumoral en ausencia de células T CD8⁺.

Para analizar esta relación más a fondo, realizamos experimentos de transferencia adoptiva con macrófagos y células NK tratados con PBS o WPG en ratones portadores de CT26 que fueron posteriormente vacunados con PC (Figura 6E, Figura suplementaria 16A y B). Sorprendentemente, solo los ratones que recibieron macrófagos entrenados en combinación con PC mostraron una reducción significativa del crecimiento tumoral (Figura 6F). La transferencia de células NK entrenadas por sí sola no afectó la carga tumoral, lo que estableció a los macrófagos como la población iniciadora primaria en este circuito. De manera consistente, la transferencia de macrófagos entrenados condujo a frecuencias más altas de células T CD8⁺ EM esplénicas (Figura 6G) y respuestas mejoradas de citocinas tras la reestimulación con antígeno, con niveles significativamente elevados de producción de IFN-γ y TNF-α en las células T CD8⁺ (Figura 6H, I).

El análisis del microambiente tumoral apoyó aún más esta jerarquía. Los ratones que recibieron macrófagos entrenados más PC mostraron un aumento de los macrófagos intratumorales (Figura suplementaria 17A) y las células NK (Figura suplementaria 17B). Es importante destacar que estas células NK estaban funcionalmente activadas, como lo demuestra el aumento de la expresión de perforina (Figura suplementaria 17C). Si bien no se detectaron cambios en las células dendríticas plasmocitoides (pDC; Figura suplementaria 17D) o las poblaciones de cDC2 (Figura suplementaria 17E–F), la infiltración de cDC1 en el tumor aumentó notablemente en el grupo de macrófagos entrenados + PC (Figura suplementaria 17G). Este aumento coincidió con la expansión de las células T CD8⁺ EM en el microambiente tumoral (Figura suplementaria 17H), lo que refuerza el vínculo entre el reclutamiento de macrófagos-células NK, la posterior activación de cDC1 y la activación eficaz de las células T.

Para evaluar directamente la interacción entre macrófagos y células NK, empleamos un ensayo de migración en transwell en el que las células NK marcadas con CFSE se colocaron en la cámara superior y los macrófagos aislados de los tumores Trained+PC o simulados se colocaron debajo. Las células NK mostraron una mayor migración hacia los macrófagos derivados de Trained+PC en comparación con los controles (Figura 6J, K). La microscopía confirmó este aumento del reclutamiento. Es importante destacar que el pretratamiento de las células NK con un anticuerpo bloqueador de CXCR3 redujo significativamente la migración, lo que demuestra que los macrófagos reclutan las células NK a través del eje CXCL9/CXCL10–CXCR3.

A continuación, preguntamos si las células NK podían, a su vez, reclutar células dendríticas (células dendríticas). Utilizando el mismo sistema de transwell, las células NK aisladas del microambiente tumoral de los ratones tratados con Trained+PC, pero no de los tumores simulados, promovieron la migración de células dendríticas (Figura 6L, M). Este efecto se abolió con el bloqueo de CCL5, lo que implica que la CCL5 derivada de las células NK participa en el reclutamiento de células dendríticas (Figura 6L). El bloqueo de FLT3L no afectó el reclutamiento de células dendríticas, lo que destaca aún más la necesidad de CCL5 (Figura suplementaria 18A). Es importante destacar que las células NK simuladas tratadas con WPG in vitro no aumentaron la migración de células dendríticas, lo que sugiere que la activación funcional de las células NK requiere señales presentes dentro del microambiente tumoral entrenado en lugar de la exposición directa al β-glucano. Para investigar la base transcripcional de estas observaciones, realizamos ChIP-qPCR en macrófagos aislados de ratones tratados con PBS o WPG. Los macrófagos entrenados mostraron un enriquecimiento elevado de H3K4me3 en los loci cxcl9 y cxcl10 (Figura suplementaria 18B), lo que es consistente con la remodelación epigenética que impulsa la producción sostenida de quimiocinas. En cambio, las células NK de los ratones tratados con PBS o WPG no mostraron enriquecimiento de H3K4me3 en los loci ccl5, ccl4 o flt3 (Figura suplementaria 18C). De manera similar, las células NK aisladas del microambiente tumoral de los ratones Trained+PC carecían de marcas epigenéticas detectables en estos genes. Sin embargo, el RT-qPCR de lisados celulares reveló que las células NK de los tumores Trained+PC expresaban niveles elevados de ARNm de ccl5 (Figura suplementaria 18D). Estos resultados sugieren que las células NK no se remodelan epigenéticamente por la inmunidad entrenada, sino que se activan secundariamente dentro del microambiente tumoral, probablemente a través de señales derivadas de los macrófagos.

Dado que el metabolismo de la creatina mantuvo la producción de CXCL9/10 de los macrófagos, preguntamos si también mantenía el eje macrófago-célula NK-cDC1. La transferencia adoptiva de macrófagos entrenados más la vacunación con PC se combinó con el tratamiento con β-GPA (Figura suplementaria 19A). La β-GPA alteró el control tumoral (Figura suplementaria 19B) y redujo la infiltración de células NK (Figura suplementaria 19D) sin afectar el número de macrófagos (Figura suplementaria 19C).

Para determinar si el metabolismo de la creatina en sí estaba grabado epigenéticamente, realizamos ChIP-qPCR para H3K4me3 en el gen del transportador de creatina slc6a8. No se detectó enriquecimiento en los macrófagos entrenados (Figura suplementaria 19E), pero el RT-qPCR de los lisados celulares reveló un aumento de la expresión de slc6a8 (Figura suplementaria 19F). Por lo tanto, los macrófagos entrenados adquieren una mayor dependencia de la creatina, pero esta adaptación metabólica es transcripcional en lugar de epigenética.

En conjunto, estos experimentos establecen que los macrófagos entrenados son la población iniciadora, remodelada epigenéticamente para secretar CXCL9/10, lo que recluta las células NK a través de CXCR3. Las células NK amplifican entonces la inmunidad produciendo CCL5, lo que impulsa la infiltración de cDC1 y la activación de las células T. El metabolismo de la creatina mantiene este eje al mantener la producción de quimiocinas de los macrófagos, lo que destaca un circuito macrófago-célula NK-cDC1-célula T jerárquico y metabólicamente respaldado que es crítico para la eficacia antitumoral.

La inmunidad entrenada mejora la eficacia de la vacuna en el modelo tumoral MC38 y colon-26

Para determinar si los efectos de la inmunidad entrenada se extendían más allá del modelo CT26, probamos a continuación el modelo de cáncer colorrectal MC38. Los ratones fueron eliminados de macrófagos y/o células NK antes del entrenamiento con PBS o WPG y la vacunación con péptidos (Figura 7A). El tratamiento con Trained+PC produjo un control tumoral superior, con muchos ratones que lograron una eliminación completa (Figura 7B y Figura suplementaria 20A). La eliminación de cualquiera de los subconjuntos alteró parcialmente la protección, mientras que la eliminación combinada la abolió, lo que refleja los resultados de CT26.

A continuación, evaluamos la inmunidad adaptativa. El perfilaje esplénico mostró una expansión marcada de las células T CD8⁺ EM y las células T CD8⁺ CM en los ratones Trained+PC (Figura 7C, D y Figura suplementaria 20B), junto con un aumento de IFN-γ y TNF-α después de la estimulación con péptidos (Figura 7E, F y Figura suplementaria 20C, D). Estas respuestas se perdieron con la eliminación de macrófagos o células NK. En los ganglios linfáticos de drenaje, los ratones Trained+PC mostraron un aumento de las frecuencias de cDC1, lo que es consistente con una mejora de la presentación cruzada, mientras que la eliminación cambió el equilibrio hacia el dominio de cDC2 (Figura 7G y Figura suplementaria 20E).

Dado que el metabolismo de la creatina sostenía la producción de quimiocinas en experimentos anteriores, investigamos si también regulaba la eficacia de Trained+PC in vivo. Los ratones recibieron β-GPA para bloquear la captación de creatina (Fig. 7H). Si bien Trained+PC proporcionó nuevamente un control robusto, el tratamiento con β-GPA revirtió parcialmente la protección (Fig. 7I y Fig. S20F), reduciendo las células T CD8⁺ EM/CM (Fig. 7J), la producción de IFN-γ y TNF-α (Fig. 7K, L) y la acumulación de cDC1 en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. 7N). Estos resultados confirman que el metabolismo de la creatina es necesario para la amplificación de la inmunidad entrenada dependiente de las células NK y DC.

Finalmente, para validar los hallazgos en un contexto más inmunosupresor, utilizamos el modelo Colon-26, que es APC-mutante, resistente a la terapia con PD-1/PD-L1 y se considera más relevante clínicamente para el CRC humano (Fig. S21A). La vacunación por sí sola no logró controlar los tumores, mientras que Trained+PC suprimió significativamente el crecimiento (Fig. S21B, C). Los tumores de Trained+PC mostraron un aumento de la infiltración de macrófagos (Fig. S21D), una mayor acumulación de células NK (Fig. S21E) y una mayor captación de cDC1 en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. S21F). Los esplenocitos de los ratones Trained+PC produjeron más IFN-γ e IL-2 tras la reestimulación con el péptido A1H5 (Fig. S21H–I) y mostraron un aumento de las células T CD8⁺ EM (Fig. S21J).

En conjunto, estos resultados demuestran que el eje macrófago–célula NK–cDC1 impulsa la eficacia de la vacuna no solo en CT26, sino también en MC38 y en el modelo altamente inmunosupresor Colon-26. La inmunidad entrenada promovió constantemente la captación de cDC1, respuestas robustas de células T CD8⁺ efectoras y de memoria, y la dependencia del metabolismo de la creatina, lo que respalda su potencial como un potenciador de la vacunación contra el CRC de aplicación generalizada.

La inmunidad entrenada mejora las respuestas de la vacuna y la eliminación de tumores en organoides derivados de pacientes con CRC

Para extender nuestros hallazgos preclínicos a entornos humanos, primero examinamos la importancia clínica de los subconjuntos de macrófagos utilizando conjuntos de datos disponibles públicamente. En una cohorte de 163 pacientes con CRC (cBioPortal), la estratificación por expresión de CD206 (un marcador que se asocia típicamente con macrófagos similares a M2) reveló que los pacientes con alta expresión de CD206 tenían una supervivencia libre de enfermedad significativamente más larga en comparación con aquellos con baja expresión (Fig. 8A). Una mayor estratificación de la cohorte de alta expresión de CD206 (n = 123) en función de la expresión de CXCL9 demostró que los individuos con niveles elevados de CXCL9 mostraron mejores resultados (Fig. 8B). Estos resultados sugieren que los macrófagos que adquieren un fenotipo CXCL9⁺ pueden promover una mejor inmunidad antitumoral, lo que es consistente con el eje macrófago–célula NK–cDC1 que identificamos en nuestros modelos murinos.

A continuación, buscamos determinar si la inmunidad entrenada inducida por WPG podría replicarse en las células inmunitarias humanas y si podría aumentar las respuestas de la vacuna. Las PBMCs y los monocitos de donantes sanos se entrenaron con WPG durante 24 h, se lavaron y luego se estimularon con adenovirus, el adyuvante utilizado en la vacuna PC. Si bien los monocitos no entrenados produjeron respuestas modestas de IL-6 y TNF-α, los monocitos entrenados exhibieron frecuencias y concentraciones de citocinas marcadamente más altas después de la estimulación con adenovirus (Fig. S22A). La diferenciación de monocitos entrenados en macrófagos o células dendríticas mantuvo estos efectos: los macrófagos entrenados produjeron niveles significativamente más altos de IL-6 y TNF-α, mientras que las DCs entrenadas mostraron una mayor secreción de IFN-γ y una mayor expresión de CD83, una molécula costimuladora crítica para la activación de las células T (Fig. S22B–C). Estos hallazgos indican que la inmunidad entrenada mejora la capacidad de respuesta del compartimento mieloide a la estimulación con adenovirus, lo que podría amplificar los efectos posteriores de la vacuna.

Luego, evaluamos si las PBMCs entrenadas podrían mejorar las respuestas de las células T específicas del antígeno a una vacuna de péptido CEA restringida por HLA-A2 clínicamente probada. Las PBMCs de donantes HLA-A2⁺ se trataron con PBS o WPG, se estimularon con el péptido y se reestimularon el día 6 (Fig. 8C). En tres donantes independientes, las PBMCs entrenadas mostraron respuestas de IFN-γ mejoradas en comparación con los controles de PBS (Fig. 8D–E), lo que confirmó que la inmunidad entrenada aumenta la activación de las células T inducida por la vacuna en un contexto humano.

Para evaluar la relevancia funcional contra los tumores, probamos las PBMCs entrenadas en cocultivo con organoides derivados de pacientes con CRC (PDO). Las PBMCs de donantes HLA-A2⁺ se entrenaron con WPG y se expandieron con el péptido CEA, seguido de un enriquecimiento de células T CD8⁺ y cocultivo con los PDO (Fig. 8F). Después de 24 h, la microscopía y la imagen de pila Z revelaron un aumento de la tinción con PI de las células tumorales en PDO#2 y PDO#3 cuando se cultivaron con PBMCs entrenadas en comparación con los controles no entrenados (Fig. 8G, H y Fig. S23A). Los ensayos de citotoxicidad de LDH confirmaron una mayor eliminación de las células tumorales en múltiples PDO (Fig. 8I). Es importante destacar que los macrófagos entrenados con WPG no mostraron ninguna actividad tumoricida directa cuando se cocultivaron con los PDO (Fig. S23B), lo que sugiere que su papel es indirecto, mediado a través de la orquestación de las respuestas de las células NK y T.

Para probar directamente si los macrófagos son esenciales para la inmunidad entrenada en entornos humanos, primero examinamos sus cambios metabólicos y epigenéticos. En comparación con los controles de PBS, los macrófagos entrenados con WPG mostraron una mayor captación de glucosa (Fig. S23C), lo que indica la activación metabólica. El ChIP-qPCR reveló además un aumento del enriquecimiento de H3K4me3 en los loci Cxcl9 y Cxcl10 (Fig. S23D), lo que demuestra que los macrófagos entrenados sufren un remodelamiento epigenético para aumentar la expresión de quimiocinas. Funcionalmente, los macrófagos entrenados promovieron la migración de las células NK en un ensayo de transwell dependiente del eje CXCR3, lo que es consistente con su papel en el inicio del eje NK–cDC1 (Fig. S23E).

Luego, probamos si los macrófagos son necesarios para aumentar las respuestas inducidas por la vacuna. Las PBMCs de donantes HLA-A2⁺ se dejaron intactas o se les eliminaron los monocitos/macrófagos antes del entrenamiento con WPG. Ambos grupos se estimularon luego con una vacuna de péptido CEA clínicamente probada y se probaron en un ensayo de eliminación contra las células HCT116 de CRC. Las PBMCs intactas entrenadas con WPG mostraron una eliminación tumoral significativamente mejorada en comparación con los controles no entrenados (Fig. S23F). En contraste, las PBMCs que carecían de monocitos/macrófagos no mostraron ningún aumento en la eliminación tumoral después del entrenamiento con WPG, incluso cuando se proporcionó el péptido de la vacuna (Fig. S23F). Esto demuestra que los macrófagos son indispensables para la inmunidad entrenada en humanos: proporcionan la señal de reprogramación inicial que permite el reclutamiento de las células NK, la activación de las DCs y, en última instancia, una mayor eliminación tumoral mediada por las células T CD8⁺.

La inmunidad entrenada inducida por el glucano mejora la respuesta de la vacuna

Para explorar los efectos inmunológicos de la inmunidad entrenada inducida por el glucano, reanalizamos los datos de secuenciación de ARN de una sola célula de un estudio publicado anteriormente^[40]. En ese estudio, los ratones C57BL/6 fueron tratados con PBS o partículas de glucano completas derivadas de las paredes celulares de la levadura (WPG), y el tejido pancreático se recogió a los días 3 y 7 posteriores al tratamiento. Se observaron cambios distintos en las poblaciones de células inmunitarias entre los ratones tratados con PBS y los tratados con WPG (Fig. 1A, Fig. S1A). En particular, los cúmulos 7, 11 y 12 aumentaron progresivamente en los ratones tratados con WPG (Fig. 1B) y se identificaron como macrófagos y monocitos Chil3 + Ly6C, lo que sugiere su participación en la inmunidad entrenada.

El análisis de la expresión génica promedio reveló un aumento de los genes de procesamiento y presentación de antígenos en los ratones WPG en ambos puntos temporales (Fig. S1B–C). Hif1α, un sello distintivo de la inmunidad entrenada, también se reguló al alza (Fig. S1D). El análisis DEG de los cúmulos 7, 11 y 12 confirmó la regulación al alza de los genes de presentación de antígenos (Fig. 1C). En el cúmulo 11, b2m, h2-k1, ctss y h2-q7 se elevaron en el día 7 (Fig. 1D–E), mientras que el cúmulo 7 mostró un aumento de ctsc, h2-dma, h2-ab1 y h2-aa, y el cúmulo 12 reguló al alza b2m. Estos cambios se alinean con las vías mejoradas de MHC-I y MHC-II, lo que respalda la activación de la inmunidad adaptativa. Además, cxcl9 y cxcl10 se regularon al alza (Fig. S1E), lo que sugiere un aumento del reclutamiento de células NK y T. Es importante destacar que este análisis enfocado de los cúmulos 7, 11 y 12, que enfatiza la presentación de antígenos y la atracción de células NK/T, no se exploró en el conjunto de datos original de Geller.

Dado que este análisis se limitó al páncreas y las poblaciones de células inmunitarias pueden diferir, investigamos más a fondo si la inmunidad entrenada inducida por WPG podría mejorar una respuesta de la vacuna a nivel sistémico. Los ratones C57BL/6 se pretrataron con PBS o WPG y se vacunaron con una vacuna basada en adenovirus que contenía SIINFEKL (Fig. 1F) como prueba de concepto. La citometría de flujo reveló que la estimulación con SIINFEKL indujo cambios significativos en los subconjuntos de memoria de las células T (Fig. S2A y Fig. S3A). Los ratones entrenados mostraron una reducción de la memoria central (CM) (CD44 + CD62L +) y un aumento de la memoria efectora (EM) (CD44 + CD62L–) de las células T CD8⁺ (Fig. 1G), un fenotipo relacionado con respuestas robustas. Además, las células T CD8⁺ de los ratones entrenados expresaron niveles más altos de IFN-γ y TNF-α (Fig. 1H–I), con una mayor producción de citocinas por célula (Fig. S3B). IL-2 no se elevó (Fig. S3C). Además, la estimulación con SIINFEKL indujo IL-2, TNF-α e IFN-γ en las células T CD4⁺ (Fig. S3D), lo que probablemente refleja los efectos indirectos de las células T CD8⁺^[43],^[44]. En conjunto, estos resultados demuestran que la inmunidad entrenada inducida por WPG mejora la presentación de antígenos en las células mieloides y promueve las respuestas de las células T CD8⁺ de memoria efectora, lo que fortalece la inmunidad inducida por la vacuna.

La inmunidad entrenada mejora la respuesta de la vacuna tanto en entornos profilácticos como terapéuticos en ratones que portan CT26

Después de observar los efectos de nuestro modelo in vivo de vacuna inicial, procedimos a probar nuestro enfoque en un entorno de cáncer de colon utilizando el modelo CT26. Para imitar un entorno profiláctico, los ratones Balb/c primero se trataron con PBS o WPG (Fig. 2A) antes de la implantación del tumor. Posteriormente, utilizamos la misma vacuna basada en adenovirus (PC), esta vez recubierta con un péptido CT26 derivado/específico inmunogénico validado (péptido Syl)^[44]. Como se muestra, los ratones tratados con la combinación de WPG y PeptiCRAd (Trained+PC) exhibieron el mayor control tumoral, PC solo mostró una supresión moderada y WPG solo no tuvo ningún efecto en comparación con el control (Fig. 2B, Fig. S4A). Por lo tanto, la inmunidad entrenada por sí sola fue insuficiente, pero preparó el sistema inmunitario para mejorar la eficacia de la vacuna.

Después de sacrificar los ratones, analizamos los subconjuntos de células dendríticas en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. 2C, Fig. S5A). Si bien las cDC2 (CD103- MHCII+ CD11c +) dominaron en todos los grupos, el tratamiento con WPG y Trained+PC aumentó la frecuencia de cDC1 (CD103 + MHCII+ CD11c +), y Trained+PC mostró el efecto más fuerte.

A continuación, evaluamos la respuesta inmunitaria sistémica aislando los esplenocitos de los ratones tratados y estimulándolos ex vivo con PBS, adenovirus o el péptido Syl. Con la estimulación con PBS, los ratones Trained+PC mostraron un aumento de las células T EM en los compartimentos CD8⁺ (CD44 + CD62L-) (Fig. 2D) y CD4⁺ (Fig. 2E), lo que indica una preparación sistémica. Tras la reestimulación con el péptido Syl, los esplenocitos de Trained+PC mostraron nuevamente más células T EM y menos células T CM (CD44- CD62L-) en los compartimentos CD8⁺ (Fig. 2F) y CD4⁺ (Fig. 2G), lo que confirmó las respuestas específicas del péptido. En contraste, WPG solo no indujo respuestas específicas de Syl, aunque los esplenocitos respondieron vigorosamente al adenovirus, lo que es consistente con la inmunidad entrenada que aumenta las vías antivirales.

Para evaluar el potencial terapéutico, probamos tumores CT26 establecidos. Se administró WPG después de la implantación, seguido de la vacunación (Fig. 2K). Nuevamente, los ratones Trained+PC mostraron la menor carga tumoral (Fig. 2L-M), mientras que Mock, PC o WPG solos tuvieron poco efecto. El análisis del microambiente tumoral (TME) mostró un aumento de monocitos (Fig. 2N) y la infiltración de células dendríticas asociadas a tumores (TAM) (Fig. 2O) en los grupos Trained y Trained+PC, mientras que los neutrófilos permanecieron sin cambios (Fig. S6A). Las TAM expresaron niveles más altos de CD80 (Fig. S6B) y los monocitos niveles más altos de CD86 (Fig. S6C), lo que indica activación.

En conjunto, estos resultados demuestran que la inmunidad entrenada inducida por WPG mejora la vacunación contra el CCRC tanto en contextos profilácticos como terapéuticos. Esta sinergia implica la expansión de cDC1, la activación de células T de memoria efectoras sistémicas, un aumento de la producción de citocinas y la remodelación del TME para favorecer la activación de monocitos/TAM.

El perfil metabólico de las células CD11b+ revela una reprogramación metabólica

Se ha demostrado previamente que la inmunidad entrenada altera la función metabólica de las células mieloides. Para investigar más a fondo el estado metabólico de las células CD11b⁺ infiltrantes tumorales, realizamos un análisis metabólico exhaustivo después del tratamiento. Dado que las células CD11b⁺ son la principal población inmune afectada por nuestra estrategia, buscamos determinar cómo cambia su perfil metabólico al exponerse a PC versus WPG combinado con PC (Trained+PC). Se recolectaron los tumores, las células CD11b+ se clasificaron por citometría de flujo (FACS) y se sometieron a un perfil metabólico (Fig. 3A, Fig. S7A).

El análisis de componentes principales (PCA) reveló una agrupación distinta entre los dos grupos, con PC1 y PC2 que representaron el 62,2% y el 24,5% de la varianza, respectivamente (Fig. 3B), lo que destaca una clara divergencia en la composición de los metabolitos después del tratamiento Trained+PC. El análisis comparativo reveló aumentos pronunciados en múltiples aminoácidos (alanina, serina, ácido glutámico, valina, asparagina, ácido málico, arginina), ácidos grasos y los principales intermediarios de la vía de la creatina (creatina, fosfocreatina, creatinina) (Fig. 3C y Fig. S7B-C). El análisis diferencial de metabolitos confirmó la regulación al alza de varios aminoácidos y creatinina (Fig. 3D y Fig. S7D). El análisis del impacto de la vía identificó además la regulación al alza de la biosíntesis de aminoácidos (notablemente arginina, serina, ácido glutámico), la síntesis de ácidos grasos y las vías relacionadas con la glucólisis aeróbica y el efecto Warburg, lo que se corroboró con el aumento del lactato (Fig. 3E). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos reforzó estos hallazgos, mostrando el enriquecimiento de las vías glucolíticas, de aminoácidos y de lípidos (Fig. 3F). En conjunto, estos datos sugieren que Trained+PC promueve un cambio coordinado hacia programas biosintéticos y de generación de energía. Dados estos hallazgos, buscamos explorar cómo se interconectaban las diferentes vías metabólicas (Fig. S7D). El análisis de correlación reveló fuertes asociaciones entre la biosíntesis de nucleótidos, el metabolismo de los aminoácidos, la síntesis de ácidos grasos y el efecto Warburg. Para visualizar las relaciones entre estas vías metabólicas, construimos un mapa de interacción de metabolitos basado en redes (Fig. S7E). Este análisis reveló una clara interconexión entre el metabolismo de los aminoácidos, la biosíntesis de ácidos grasos y la síntesis de nucleótidos, lo que apoya aún más nuestra hipótesis de que el tratamiento Trained+PC induce un cambio metabólico coordinado hacia vías biosintéticas y de generación de energía.

Para validar funcionalmente estas observaciones, realizamos ensayos de flujo extracelular de Seahorse en macrófagos murinos aislados, debido a su alta abundancia en el tumor (Fig. 2J). Después de 18 horas de estimulación ex vivo con PBS o WPG, los macrófagos entrenados mostraron tasas de consumo de oxígeno (OCR) significativamente más altas en dos densidades de siembra (40 000 y 80 000 células) (Fig. 3H), con aumentos en la respiración basal y máxima (Fig. S8A-C). Cabe destacar que una gran parte de la OCR basal se debió al consumo de oxígeno no mitocondrial (Fig. S8D). En paralelo, los macrófagos entrenados mostraron tasas de acidificación extracelular (ECAR) elevadas, con niveles más altos tanto en condiciones basales como después de la inhibición de la síntesis de ATP mitocondrial, lo que es consistente con una actividad glucolítica aumentada (Fig. 3I) y los niveles de glucólisis basal (Fig. S8D).

Para sondear la cinética de esta reprogramación metabólica, repetimos el ensayo después de solo 2 horas de estimulación. En estas condiciones, la OCR permaneció comparable entre los grupos (Fig. 3K; y Fig. S8F-H). Nuevamente, la mayor parte de la OCR reflejó el consumo de oxígeno no mitocondrial (Fig. S8I). Sin embargo, la ECAR ya aumentó significativamente en los macrófagos entrenados (Fig. 3L), acompañado de un aumento de la glucólisis basal (Fig. S8J). Estos resultados demuestran que WPG reprograma rápidamente los macrófagos hacia la glucólisis, lo que es consistente con un fenotipo similar al de Warburg que se establece en pocas horas y se refuerza con el tiempo.

En conjunto, el perfil metabólico y la evaluación bioenergética convergen para mostrar que los macrófagos entrenados experimentan una reprogramación metabólica amplia caracterizada por una mayor biosíntesis de aminoácidos y lípidos, el metabolismo de la creatina y un cambio pronunciado hacia la glucólisis aeróbica. Esta reprogramación proporciona la energía y la capacidad biosintética necesarias para mantener las funciones proinflamatorias y antitumorales en el contexto de la vacunación.

El secuenciamiento de ARN de una sola célula revela un paisaje inmune innato distinto después de la terapia Trained+PC

Para evaluar cómo Trained+PC altera el paisaje inmune innato en los tumores, realizamos el secuenciamiento de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células CD11b+ clasificadas de ratones portadores de tumores tratados con PC o Trained+PC. Esto nos permitió capturar los cambios inducidos por el tratamiento en todo el compartimento mieloide. La agrupación reveló diversas poblaciones innatas, con macrófagos, monocitos y células NK como los principales subconjuntos (Fig. 4A y Fig. S9A). Los grupos 0, 3, 2, 7, 10 y 1 (macrófagos, monocitos, células NK) se expandieron significativamente en Trained+PC, lo que demuestra la remodelación del TME (Fig. 4B, C). En consonancia con esto, Trained+PC reguló al alza las citocinas como cxcl9 y cxcl2 (Fig. S9B), lo que sugiere una mayor captación de células T y NK. El análisis reveló una clara expresión de itgam (CD11b) en la mayoría de los grupos (Fig. S9C), con una contaminación mínima, lo que demuestra un enriquecimiento exitoso.

A continuación, buscamos identificar los programas funcionales dentro de estos grupos. La estratificación reveló dos patrones inflamatorios principales (Fig. 4D). Primero, los grupos 2 (chil3+ ly6Chi macrófagos, Fig. S9D), 14 (NK), 13 (cDC1), 7 (monocitos) y 9 (ILC) regularon al alza fcgr1, ccl9, cxcl9/10, cd86 e irf5, lo que es consistente con un fenotipo proinflamatorio. La expresión de lyz2 y tnfaip2 en estos grupos (Fig. S9E) respaldó aún más la inflamación impulsada por el mieloide, y el grupo 2 mostró la respuesta más fuerte. En segundo lugar, los grupos 1 (NK), 8 (monocitos) y 11 (NKT) mostraron una firma de IFN de tipo I (Ifngr1). También examinamos la detección de β-glucano y encontramos que clec7a (dectina-1), un receptor clave involucrado en el reconocimiento de β-glucano^[41],^[42], se expresó ampliamente en los grupos inflamatorios (Fig. S9F), excepto en las células NK/NKT, lo que sugiere una activación indirecta de las células NK a través de las citocinas y la interacción de quimiocinas dentro del microambiente tumoral. Para probar si Trained+PC desplazó las células hacia la supresión, analizamos los genes antiinflamatorios. Se detectaron pocos (Fig. 4E): los macrófagos del grupo 2 mostraron una expresión limitada de nos2/arg1, pero esto se limitó a una minoría. Por lo tanto, Trained+PC promovió una activación inflamatoria duradera en lugar de una supresión compensatoria.

Para diseccionar aún más un mecanismo de acción, realizamos un análisis de enriquecimiento de vías conjuntas, integrando los datos de scRNA-seq con el cribado metabólico obtenido previamente (Fig. 4F). En particular, las vías asociadas con la activación de las células T, incluida la señalización del TCR y la diferenciación de las células T Th1/Th2, se enriquecieron significativamente, lo que sugiere que la terapia Trained+PC mejoró la activación de la inmunidad adaptativa. Además, la señalización de quimiocinas y las vías JAK-STAT surgieron como redes reguladoras clave, lo que indica que la modulación inmunitaria impulsada por las citocinas fue una característica central de los cambios inducidos por el tratamiento. Curiosamente, la citotoxicidad mediada por las células NK fue una de las vías más reguladas al alza, a pesar de que las propias células NK no expresaban dectina-1. Esto sugiere fuertemente que su expansión y activación fueron secundarias a las señales inflamatorias de otras poblaciones mieloides en lugar de a la señalización directa de WPG.

Para diseccionar los mecanismos que impulsan la expansión de las células NK, analizamos los grupos de monocitos y macrófagos, ya que estas células son los principales productores de citocinas conocidas por reclutar y activar las células NK (Fig. 4G). Los macrófagos del grupo 2 mostraron un perfil inflamatorio marcadamente mayor en comparación con los monocitos del grupo 7, lo que sugiere un papel dominante en la orquestación de la respuesta inmunitaria. El análisis de expresión confirmó que los macrófagos del grupo 2 regularon fuertemente al alza cxcl9, cxcl10 e il15, que son factores clave conocidos por impulsar el reclutamiento, la proliferación y la citotoxicidad de las células NK (Fig. 4H). Estos hallazgos implican que los macrófagos con inmunidad entrenada (macrófagos Chil3+ Ly6Chi) actúan como reguladores centrales de la expansión y la función de las células NK dentro del microambiente tumoral.

Dada la importante infiltración de células NK observada en los tumores tratados con Trained+PC, caracterizamos aún más los grupos de células NK del grupo 1 para definir su fenotipo funcional (Fig. 4I), basándonos en métodos de clasificación anteriores^[45]. Al clasificar estas células en subpoblaciones en reposo, sensibles a citocinas, activadas y sensibles al IFN de tipo I, observamos un enriquecimiento predominante de las células NK sensibles a citocinas (Fig. 4I). Esto se acompañó de una regulación al alza de las quimiocinas, como ccl5, ccl4 y xcl1 (Fig. 4J), que se sabe que facilitan el reclutamiento de las células dendríticas convencionales (cDC). Además, entre los principales genes con el análisis de componentes principales estaba ccl5 (Fig. S9G), lo que demuestra aún más su importancia. Por lo tanto, el fenotipo de las células NK productoras de quimiocinas sugiere un papel crítico de las células NK en la configuración de la activación posterior de las células presentadoras de antígenos (APC). Además, se observó que las células NK del grupo 1 de los ratones tratados con Trained+PC tenían niveles similares de pdcd1, tigit, havcr2, lo que indica que no hay efectos de agotamiento (Fig. S10A). Esto se confirmó aún más al analizar las células NK del microambiente tumoral de los ratones que recibieron el entrenamiento después de la implantación del tumor (Fig. S10B).

Para examinar el impacto posterior en la función de las APC, analizamos los grupos 12 y 13, que representan las células dendríticas plasmocitoides (pDC) y las células dendríticas convencionales (cDC1), respectivamente (Fig. 4K). Las cDC1 (grupo 13) mostraron una regulación al alza marcada de los genes de presentación de antígenos cd80, cd83 y h2-Aa (Fig. 4K, L), lo que es consistente con un fenotipo activado. Por lo tanto, Trained+PC no solo expandió las cDC1, sino que también mejoró su capacidad funcional.

En conjunto, estos experimentos revelan una posible cascada de activación secuencial: los macrófagos entrenados (grupo 2) secretan Cxcl9/10 e Il15, reclutando células NK; las células NK secretan Ccl5/Xcl1, mejorando la infiltración y activación de las cDC1; las cDC1 luego activan las células T. Este eje macrófago-NK-cDC1 podría proporcionar una explicación mecanicista de la eficacia superior de Trained+PC en comparación con PC solo.

La regulación de la creatina en la inmunidad entrenada mejora la liberación de citocinas proinflamatorias y la infiltración de células NK

SPANISH TRANSLATION:

Para dilucidar los requisitos metabólicos de la inmunidad entrenada, enriquecimos las células CD11b⁺ del bazo, las expusimos a PBS o WPG y las reestimulamos con adenovirus en presencia o ausencia de inhibidores metabólicos dirigidos a la glucólisis/mTOR (rapamicina), la estabilización de HIF-1α (ascorbato) o la captación de creatina (β-GPA) (Fig. 5A). Las células tratadas con PBS no produjeron TNF-α, mientras que las células entrenadas con WPG mostraron una robusta inducción de TNF-α e IL-6, ambas significativamente reducidas por los inhibidores (Fig. 5A, B). Dado que nuestros datos de secuenciación de ARN de célula única destacaron CXCL9 y CXCL10 como quimiocinas clave fuertemente reguladas al alza en los macrófagos entrenados, a continuación evaluamos su secreción. Coherente con nuestros hallazgos en células individuales, las células CD11b⁺ entrenadas secretaron niveles significativamente más altos de CXCL9 y CXCL10 en comparación con los controles de PBS. Sin embargo, la secreción se abolió cuando se añadieron rapamicina, ascorbato o β-GPA, lo que demuestra que tanto el metabolismo glucolítico como el dependiente de la creatina sustentan la reprogramación proinflamatoria de los macrófagos entrenados.

Dado que los experimentos iniciales probaron los efectos de los inhibidores solo durante la estimulación secundaria, repetimos los ensayos añadiendo los inhibidores durante la fase de preparación del entrenamiento con WPG. Como se esperaba, las células entrenadas produjeron niveles elevados de IL-6, TNF-α, CXCL9 y CXCL10 tras la estimulación con adenovirus, pero esto se atenuó significativamente con todos los inhibidores cuando se administraron durante la preparación (Fig. S11A-E). Además, cuando lavamos la β-GPA y añadimos creatina, se restablecieron las expresiones de CXCL9 y CXCL10 (Fig. S11D y E). Para probar directamente si el metabolismo de la creatina afecta la programación epigenética o solo la función efectora, nos centramos en los macrófagos, ya que surgieron en nuestro análisis de células individuales como la población entrenada clave que impulsa el eje NK-cDC1. Por lo tanto, se enriquecieron los macrófagos CD11b⁺F4/80⁺ y se tiñeron para detectar H3K4me3, una marca de histonas asociada con la inmunidad entrenada. En comparación con los controles de PBS, los macrófagos entrenados con WPG mostraron un aumento marcado en H3K4me3 después de la estimulación con adenovirus (Fig. S11F). Este enriquecimiento se mantuvo incluso en presencia de β-GPA (Fig. S11G), lo que indica que la creatina no influye en la adquisición de marcas epigenéticas entrenadas, sino que más bien sustenta la función efectora durante el desafío secundario. A continuación, evaluamos si la remodelación epigenética inducida por WPG regula la expresión del transportador de creatina Slc6a8. La ChIP-qPCR para H3K4me3 no mostró enriquecimiento en el locus Slc6a8 (Fig. S11H). Sin embargo, la RT-qPCR reveló un aumento significativo en los niveles de transcripción de Slc6a8 en los macrófagos entrenados en comparación con los controles tratados con PBS (Fig. S11I), lo que sugiere que la regulación al alza del transporte de creatina se produce independientemente de la inducción epigenética mediada por H3K4me3.

Para evaluar el papel de la creatina en la inmunidad adaptativa inducida por el cáncer de colon, probamos si el tratamiento con β-GPA afectaba el control tumoral. Los ratones portadores de CT26 fueron tratados con PBS o WPG (entrenados) y vacunados con cáncer de colon, con un subgrupo que recibió β-GPA diariamente para bloquear la captación de creatina (Fig. 5C). Como se esperaba, el tratamiento con entrenamiento + cáncer de colon proporcionó el mayor control tumoral (Fig. 5D y Fig. S12A). En contraste, el tratamiento con β-GPA perjudicó parcialmente este efecto, con tumores que crecieron más que en el grupo de entrenamiento + cáncer de colon, pero que siguieron siendo más pequeños que en los controles simulados (Fig. 5C, D y Fig. S12A). La β-GPA por sí sola no afectó el crecimiento tumoral, lo que confirma que no tiene actividad antitumoral o pro-tumoral intrínseca.

Para dilucidar las alteraciones inmunitarias, analizamos la infiltración tumoral de macrófagos y células NK (Fig. S11B). El número de macrófagos no cambió entre los grupos de entrenamiento + cáncer de colon y entrenamiento + cáncer de colon + β-GPA (Fig. 5E y F), mientras que la infiltración de células NK se redujo notablemente en los tumores tratados con β-GPA (Fig. G y H). Esto se alinea con nuestro hallazgo anterior de que la β-GPA suprime la secreción de CXCL9/CXCL10 de las células CD11b⁺ entrenadas, quimiocinas críticas para el reclutamiento de células NK.

Para evaluar la remodelación epigenética in vivo, teñimos los macrófagos CD11b⁺F4/80⁺ derivados del tumor. El tratamiento con entrenamiento + cáncer de colon aumentó H3K4me3 en comparación con los controles de PBS (Fig. 5I, J). Es importante destacar que este enriquecimiento persistió a pesar del tratamiento con β-GPA, lo que refuerza que la creatina no impulsa la programación epigenética, sino que más bien sustenta las respuestas efectoras. En conjunto, estos resultados demuestran que el metabolismo de la creatina es un impulsor central de la fase efectora de la inmunidad entrenada en el cáncer colorrectal, sustentando la producción de citocinas y quimiocinas (incluidas CXCL9 y CXCL10) y permitiendo el reclutamiento de células NK, sin alterar la reprogramación epigenética subyacente.

La interacción macrófago-célula NK promueve la infiltración de células dendríticas y la memoria de células T CD8+ en la inmunidad entrenada

Para aclarar los papeles funcionales de los macrófagos y las células NK en el control tumoral mediado por la inmunidad entrenada, eliminamos selectivamente estos subconjuntos en ratones portadores de CT26 antes del entrenamiento con WPG y la vacunación con cáncer de colon (Fig. 6A). La citometría de flujo confirmó la eliminación eficiente (Fig. S13A). El crecimiento tumoral mostró que la pérdida de cualquiera de los subconjuntos perjudicó el control, mientras que la eliminación dual abolió la eficacia (Fig. 6B, Fig. S13B), lo que demuestra papeles complementarios no redundantes.

A continuación, preguntamos cómo estas células influyen en la inmunidad sistémica. Los esplenocitos de los ratones tratados con entrenamiento + cáncer de colon contenían abundantes células T CD8+ EM y células T CD8+ CM después de la reestimulación con péptido Syl (Fig. 6C), mientras que la eliminación de macrófagos o células NK redujo ambas poblaciones (Fig. 6D). Esto se correlacionó con una alteración de la captación de células dendríticas, en particular cDC1, como se muestra por la citometría de flujo (Fig. S14A, B). Funcionalmente, la producción de citocinas de las células T CD8+ (IFN-γ, TNF-α) se redujo significativamente en los grupos eliminados (Fig. S14C, D). En conjunto, estos resultados indicaron que los macrófagos y las células NK juntos forman un eje ascendente crítico necesario para establecer una inmunidad adaptativa eficaz. Para definir aún más el papel de las células T, repetimos los experimentos en ratones portadores de CT26 tratados con entrenamiento + cáncer de colon, pero eliminados de células T CD8+ (Fig. S15A). La eliminación exitosa se confirmó mediante el análisis de sangre (Fig. S15B), y observamos que estos ratones perdieron por completo el control tumoral (Fig. S15C). Por lo tanto, los macrófagos entrenados o las células NK por sí solos son insuficientes para mediar el control tumoral en ausencia de células T CD8+.

Para dilucidar aún más esta relación, realizamos experimentos de transferencia adoptiva con macrófagos y células NK tratados con PBS o WPG en ratones portadores de CT26 que fueron posteriormente vacunados con cáncer de colon (Fig. 6E, Fig. S16A y B). Sorprendentemente, solo los ratones que recibieron macrófagos entrenados en combinación con cáncer de colon mostraron una reducción significativa del crecimiento tumoral (Fig. 6F). La transferencia de células NK entrenadas por sí sola no afectó la carga tumoral, lo que estableció a los macrófagos como la población iniciadora primaria en este circuito. De manera consistente, la transferencia de macrófagos entrenados condujo a frecuencias más altas de células T CD8+ EM esplénicas (Fig. 6G) y respuestas de citocinas mejoradas tras la reestimulación con antígeno, con niveles significativamente elevados de producción de IFN-γ y TNF-α en las células T CD8+ (Fig. 6H, I).

El análisis del microambiente tumoral apoyó aún más esta jerarquía. Los ratones que recibieron macrófagos entrenados más cáncer de colon mostraron un aumento de los macrófagos intratumorales (Fig. S17A) y las células NK (Fig. S17B). Es importante destacar que estas células NK estaban funcionalmente activadas, como lo demuestra el aumento de la expresión de perforina (Fig. S17C). Si bien no se detectaron cambios en las células dendríticas plasmocitoides (pDC; Fig. S17D) o las poblaciones de cDC2 (Fig. S17E-F), la infiltración de cDC1 en el tumor aumentó notablemente en el grupo de macrófagos entrenados + cáncer de colon (Fig. S17G). Este aumento coincidió con la expansión de las células T CD8+ EM en el microambiente tumoral (Fig. S17H), lo que refuerza el vínculo entre el reclutamiento de macrófagos impulsado por las células NK, la posterior activación de cDC1 y la activación eficaz de las células T.

Para evaluar directamente la interacción entre macrófagos y células NK, utilizamos un ensayo de migración en transwell en el que las células NK marcadas con CFSE se colocaron en la cámara superior y los macrófagos aislados de los tumores tratados con entrenamiento + cáncer de colon o simulados se colocaron debajo. Las células NK mostraron una mayor migración hacia los macrófagos derivados del tratamiento con entrenamiento + cáncer de colon en comparación con los controles (Fig. 6J, K). La microscopía confirmó este aumento del reclutamiento. Es importante destacar que el pretratamiento de las células NK con un anticuerpo bloqueador de CXCR3 redujo significativamente la migración, lo que demuestra que los macrófagos reclutan las células NK a través del eje CXCL9/CXCL10-CXCR3.

A continuación, preguntamos si las células NK podían, a su vez, reclutar células dendríticas (cDC). Utilizando el mismo sistema de transwell, las células NK aisladas del microambiente tumoral de los ratones tratados con entrenamiento + cáncer de colon, pero no de los tumores simulados, promovieron la migración de cDC (Fig. 6L, M). Este efecto se abolió con el bloqueo de CCL5, lo que implica que la CCL5 derivada de las células NK participa en el reclutamiento de cDC (Fig. 6L). El bloqueo de FLT3L no afectó el reclutamiento de cDC, lo que destaca aún más la necesidad de CCL5 (Fig. S18A). Es importante destacar que las células NK simuladas tratadas con WPG in vitro no aumentaron la migración de cDC, lo que sugiere que la activación funcional de las células NK requiere señales presentes dentro del microambiente tumoral entrenado en lugar de la exposición directa al β-glucano. Para investigar la base transcripcional de estas observaciones, realizamos ChIP-qPCR en macrófagos aislados de ratones tratados con PBS o WPG. Los macrófagos entrenados mostraron un enriquecimiento elevado de H3K4me3 en los loci cxcl9 y cxcl10 (Fig. S18B), lo que es consistente con la remodelación epigenética que impulsa la producción sostenida de quimiocinas. En contraste, las células NK de los ratones tratados con PBS o WPG no mostraron enriquecimiento de H3K4me3 en los loci ccl5, ccl4 o flt3 (Fig. S18C). De manera similar, las células NK aisladas del microambiente tumoral de los ratones tratados con entrenamiento + cáncer de colon carecían de marcas epigenéticas detectables en estos genes. Sin embargo, la RT-qPCR de lisados celulares completos reveló que las células NK de los tumores tratados con entrenamiento + cáncer de colon expresaban niveles elevados de ARNm de ccl5 (Fig. S18D). Estos resultados sugieren que las células NK no se remodelan epigenéticamente por la inmunidad entrenada, sino que se activan secundariamente dentro del microambiente tumoral, probablemente a través de señales derivadas de los macrófagos.

Dado que el metabolismo de la creatina sustentó la producción de CXCL9/10 de los macrófagos, preguntamos si también mantenía el eje macrófago-célula NK-cDC1. La transferencia adoptiva de macrófagos entrenados más vacunación con cáncer de colon se combinó con el tratamiento con β-GPA (Fig. S19A). La β-GPA perjudicó el control tumoral (Fig. S19B) y redujo la infiltración de células NK (Fig. S19D) sin afectar el número de macrófagos (Fig. S19C).

Para determinar si el metabolismo de la creatina en sí estaba epigenéticamente marcado, realizamos ChIP-qPCR para H3K4me3 en el gen del transportador de creatina slc6a8. No se detectó enriquecimiento en los macrófagos entrenados (Fig. S19E), pero la RT-qPCR de los lisados celulares reveló un aumento de la expresión de slc6a8 (Fig. S19F). Por lo tanto, los macrófagos entrenados adquieren una mayor dependencia de la creatina, pero esta adaptación metabólica es transcripcional en lugar de epigenética.

En conjunto, estos experimentos establecen que los macrófagos entrenados son la población iniciadora, remodelada epigenéticamente para secretar CXCL9/10, lo que recluta las células NK a través de CXCR3. Las células NK amplifican entonces la inmunidad produciendo CCL5, lo que impulsa la infiltración de cDC1 y la activación de las células T. El metabolismo de la creatina sustenta este eje al mantener la producción de quimiocinas de los macrófagos, lo que destaca un circuito macrófago-célula NK-cDC1-célula T jerárquico y metabólicamente sustentado que es crítico para la eficacia antitumoral.

La inmunidad entrenada mejora la eficacia de la vacuna en el modelo tumoral MC38 y cáncer de colon-26

Para determinar si los efectos de la inmunidad entrenada se extendían más allá del modelo CT26, probamos a continuación el modelo de cáncer colorrectal MC38. Los ratones fueron eliminados de macrófagos y/o células NK antes del entrenamiento con PBS o WPG y la vacunación con péptidos (Fig. 7A). El tratamiento con entrenamiento + cáncer de colon produjo un control tumoral superior, con muchos ratones que lograron una eliminación completa (Fig. 7B y Fig. S20A). La eliminación de cualquiera de los subconjuntos perjudicó parcialmente la protección, mientras que la eliminación combinada abolió la eficacia, lo que refleja los resultados de CT26.

A continuación, evaluamos la inmunidad adaptativa. El análisis del bazo mostró una marcada expansión de las células CD8⁺ T EM y CM en los ratones Trained+PC (Fig. 7C, D y Fig. S20B), junto con un aumento de las concentraciones de IFN-γ y TNF-α tras la estimulación con péptidos (Fig. 7E, F y Fig. S20C, D). Estas respuestas se perdieron con la depleción de macrófagos o células NK. En los ganglios linfáticos de drenaje, los ratones Trained+PC mostraron un aumento de las frecuencias de cDC1, lo que es consistente con una mejora en la presentación cruzada, mientras que la depleción desplazó el equilibrio hacia el predominio de cDC2 (Fig. 7G y Fig. S20E).

Dado que el metabolismo de la creatina sostenía la producción de quimiocinas en experimentos anteriores, investigamos si también regulaba la eficacia de Trained+PC in vivo. Los ratones recibieron β-GPA para bloquear la captación de creatina (Fig. 7H). Si bien Trained+PC proporcionó nuevamente un control robusto, el tratamiento con β-GPA revirtió parcialmente la protección (Fig. 7I y Fig. S20F), reduciendo las células CD8⁺ T EM/CM (Fig. 7J), la producción de IFN-γ y TNF-α (Fig. 7K, L) y la acumulación de cDC1 en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. 7N). Estos resultados confirman que el metabolismo de la creatina es necesario para la amplificación dependiente de las células NK y las células dendríticas (DC) de la inmunidad entrenada.

Finalmente, para validar los hallazgos en un contexto más inmunosupresor, utilizamos el modelo Colon-26, que es APC-mutante, refractario a la terapia con PD-1/PD-L1 y se considera más relevante clínicamente para el CRC humano (Fig. S21A). La vacunación por sí sola no logró controlar los tumores, mientras que Trained+PC suprimió significativamente el crecimiento (Fig. S21B, C). Los tumores de Trained+PC mostraron un aumento de la infiltración de macrófagos (Fig. S21D), una mayor acumulación de células NK (Fig. S21E) y una mayor captación de cDC1 en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. S21F). Los esplenocitos de los ratones Trained+PC produjeron mayores cantidades de IFN-γ e IL-2 tras la reestimulación con el péptido A1H5 (Fig. S21H–I) y mostraron un aumento de las células CD8⁺ T EM (Fig. S21J).

En conjunto, estos resultados demuestran que el eje macrófago-NK-cDC1 impulsa la eficacia de la vacuna no solo en CT26, sino también en MC38 y en el modelo altamente inmunosupresor Colon-26. La inmunidad entrenada promovió constantemente la captación de cDC1, respuestas robustas de células CD8⁺ T efectoras y de memoria, y la dependencia del metabolismo de la creatina, lo que respalda su potencial como un potenciador de la vacunación contra el CRC de aplicación generalizada.

La inmunidad entrenada mejora las respuestas de la vacuna y la destrucción tumoral en organoides derivados de pacientes con CRC

Para extender nuestros hallazgos preclínicos a entornos humanos, primero examinamos la importancia clínica de los subconjuntos de macrófagos utilizando conjuntos de datos disponibles públicamente. En una cohorte de 163 pacientes con CRC (cBioPortal), la estratificación por expresión de CD206 (un marcador que se asocia típicamente con macrófagos similares a M2) reveló que los pacientes con alta expresión de CD206 tenían una supervivencia libre de enfermedad significativamente más larga en comparación con aquellos con baja expresión (Fig. 8A). Una mayor estratificación de la cohorte de alta expresión de CD206 (n = 123) en función de la expresión de CXCL9 demostró que los individuos con niveles elevados de CXCL9 mostraron mejores resultados (Fig. 8B). Estos resultados sugieren que los macrófagos que adquieren un fenotipo CXCL9⁺ pueden promover una mejor inmunidad antitumoral, lo que es consistente con el eje macrófago-NK-cDC1 que identificamos en nuestros modelos murinos.

A continuación, buscamos determinar si la inmunidad entrenada inducida por WPG podría replicarse en las células inmunitarias humanas y si podría aumentar las respuestas de la vacuna. Las PBMCs y los monocitos de donantes sanos se entrenaron con WPG durante 24 horas, se lavaron y luego se estimularon con adenovirus, el adyuvante utilizado en la vacuna PC. Si bien los monocitos no entrenados produjeron respuestas modestas de IL-6 y TNF-α, los monocitos entrenados exhibieron frecuencias y concentraciones de citocinas significativamente más altas después de la estimulación con adenovirus (Fig. S22A). La diferenciación de monocitos entrenados en macrófagos o células dendríticas (DC) mantuvo estos efectos: los macrófagos entrenados produjeron niveles significativamente más altos de IL-6 y TNF-α, mientras que las DC entrenadas mostraron un aumento de la secreción de IFN-γ y una mayor expresión de CD83, una molécula costimuladora crítica para la activación de las células T (Fig. S22B–C). Estos hallazgos indican que la inmunidad entrenada mejora la capacidad de respuesta del compartimento mieloide a la estimulación con adenovirus, lo que podría amplificar los efectos posteriores de la vacuna.

Luego, evaluamos si las PBMCs entrenadas podrían mejorar las respuestas de las células T específicas del antígeno a una vacuna de péptidos CEA restringida por HLA-A2 que se ha probado clínicamente. Las PBMCs de donantes HLA-A2⁺ se trataron con PBS o WPG, se estimularon con péptido y se reestimularon el día 6 (Fig. 8C). En tres donantes independientes, las PBMCs entrenadas mostraron respuestas de IFN-γ mejoradas en comparación con los controles de PBS (Fig. 8D–E), lo que confirmó que la inmunidad entrenada aumenta la activación de las células T inducida por la vacuna en un contexto humano.

Para evaluar la relevancia funcional contra los tumores, probamos las PBMCs entrenadas en cocultivo con organoides derivados de pacientes con CRC (PDO). Las PBMCs de donantes HLA-A2⁺ se entrenaron con WPG y se expandieron con péptido CEA, seguido de un enriquecimiento de células CD8⁺ y cocultivo con PDO (Fig. 8F). Después de 24 horas, la microscopía y la imagen de pila Z revelaron un aumento de la tinción con PI de las células tumorales en PDO#2 y PDO#3 cuando se cultivaron con PBMCs entrenadas en comparación con los controles no entrenados (Fig. 8G, H y Fig. S23A). Los ensayos de citotoxicidad de LDH confirmaron una mayor destrucción de las células tumorales en múltiples PDO (Fig. 8I). Es importante destacar que los macrófagos entrenados con WPG no mostraron ninguna actividad tumoricida directa cuando se cocultivaron con PDO (Fig. S23B), lo que sugiere que su papel es indirecto, mediado a través de la orquestación de las respuestas de las células NK y las células T.

Para probar directamente si los macrófagos son esenciales para la inmunidad entrenada en entornos humanos, primero examinamos sus cambios metabólicos y epigenéticos. En comparación con los controles de PBS, los macrófagos entrenados con WPG mostraron una mayor captación de glucosa (Fig. S23C), lo que indica una activación metabólica. Además, la ChIP-qPCR reveló un aumento del enriquecimiento de H3K4me3 en los loci Cxcl9 y Cxcl10 (Fig. S23D), lo que demuestra que los macrófagos entrenados sufren un remodelamiento epigenético para aumentar la expresión de quimiocinas. Funcionalmente, los macrófagos entrenados promovieron la migración de las células NK en un ensayo de transwell dependiente del eje CXCR3, lo que es consistente con su papel en el inicio del eje NK-cDC1 (Fig. S23E).

A continuación, probamos si los macrófagos son necesarios para aumentar las respuestas inducidas por la vacuna. Las PBMCs de donantes HLA-A2⁺ se dejaron intactas o se les eliminaron los monocitos/macrófagos antes del entrenamiento con WPG. Ambos grupos se estimularon luego con una vacuna de péptidos CEA que se ha probado clínicamente y se probaron en un ensayo de destrucción contra las células HCT116 de CRC. Las PBMCs intactas entrenadas con WPG mostraron una destrucción tumoral significativamente mayor en comparación con los controles no entrenados (Fig. S23F). En contraste, las PBMCs que carecían de monocitos/macrófagos no mostraron ningún aumento en la destrucción tumoral después del entrenamiento con WPG, incluso cuando se proporcionó el péptido de la vacuna (Fig. S23F). Esto demuestra que los macrófagos son indispensables para la inmunidad entrenada en humanos: proporcionan la señal de reprogramación inicial que permite el reclutamiento de las células NK, la activación de las DC y, en última instancia, una mayor destrucción tumoral mediada por las células CD8⁺ T.

Discusión

El avance de las vacunas contra el cáncer en el cáncer colorrectal (CRC), particularmente para los tumores con una menor carga mutacional, exige una comprensión más profunda de la interacción entre los diversos componentes del microambiente tumoral (TME) en respuesta a la vacunación. En este estudio, integramos datos disponibles públicamente de un modelo de cáncer de páncreas^[40], datos de secuenciación de ARN de células individuales (scRNAseq), citometría de flujo y datos de metabolómica de nuestro modelo in vivo de CRC, seguido de la validación en un modelo in vivo diferente y PDO para diseccionar el papel de la inmunidad entrenada en la mejora de la eficacia de la vacunación con PC. Un hallazgo clave fue que la exposición a WPG desempeña un papel fundamental en la adaptación metabólica y epigenética de las células inmunitarias, particularmente los macrófagos, lo que permite una mayor secreción de citocinas proinflamatorias. Esta adaptación facilita el reclutamiento y la activación de otras células inmunitarias, como las células NK y las cDC1, estableciendo una respuesta antitumoral robusta de las células T. Estudios anteriores han proporcionado evidencia convincente que respalda el uso de la inmunidad entrenada en el cáncer^[37]–^[40]. Por ejemplo, Kalafati y sus colegas demostraron que el entrenamiento inducido por β-glucano mejora la activación de las células mieloides y la infiltración tumoral, lo que conduce a una supresión tumoral significativa^[38]. Además, se ha demostrado que la inmunidad entrenada inducida por BCG reprograma las células inmunitarias innatas para superar las barreras inmunosupresoras. Más recientemente, Wattenberg y sus colegas informaron que la coactivación de los receptores mieloides como CD40 y Dectin-1 aumenta sinérgicamente la inmunidad entrenada, lo que resulta en un mejor control tumoral mediado por las células T^[39]. En conjunto, estos hallazgos subrayan el potencial terapéutico de aprovechar la inmunidad entrenada para provocar respuestas antitumorales duraderas y proporcionan una sólida justificación para integrar esta estrategia en la inmunoterapia del CRC.

Nuestro reanálisis de los datos disponibles públicamente de Geller y sus colegas^[40] respalda la noción de que el tratamiento con WPG induce una reprogramación mieloide sostenida, lo que refuerza los mecanismos de inmunidad entrenada en su modelo de cáncer de páncreas. La acumulación progresiva de macrófagos y monocitos Chil3 + Ly6C+ con el tiempo sugiere una huella duradera en el compartimento inmunitario innato, respaldada por una mayor expresión de la maquinaria de presentación de antígenos, así como la activación de la inmunidad adaptativa. En consonancia con esto, en su modelo de vacuna contra el cáncer, los ratones pretratados con WPG mostraron alteraciones significativas en los subconjuntos de memoria de las células T, con un cambio de las células CD8 + T de memoria central a las células CD8 + T efectoras. Además, estos ratones entrenados exhibieron una mayor producción de IFN-γ y TNF-α tras la estimulación antigénica, lo que subraya una respuesta funcional mejorada. Estos hallazgos sugieren que la inmunidad entrenada mediada por WPG no solo remodela el paisaje mieloide, sino que también impulsa una respuesta de las células T más robusta y duradera, lo que se alinea con las implicaciones más amplias de la interacción innata-adaptativa en la inmunidad antitumoral.

Se observó un aumento de cDC1, monocitos y macrófagos en ratones tratados únicamente con WPG, pero esto no tuvo un efecto antitumoral sustancial con nuestros modelos de cáncer de colon. Wattenberg y sus colegas también mostraron una tendencia similar, donde los ratones entrenados con la vacuna BCG mostraron un control tumoral similar a los ratones simulados con cáncer de páncreas implantado subcutáneamente^[39]. Solo cuando los ratones entrenados con BCG y tratados con anticuerpos anti-CD40 mostraron un control tumoral superior. Esto puede indicar que los tumores injertados subcutáneamente pueden requerir una mayor activación inmunitaria para obtener una respuesta antitumoral eficaz de la inmunidad entrenada.

El eje NK-macrófago-cDC1 ha surgido como un componente clave de la inmunidad antitumoral eficaz en múltiples modelos de tumores^[46],^[47]. Se ha demostrado que los macrófagos son clave en la orquestación de respuestas antitumorales eficaces. Un estudio reciente mostró que la interrupción de los macrófagos CD206+ condujo a una disminución de la infiltración de células NK, lo que a su vez redujo la infiltración de cDC1^[48]. De manera similar a nuestros resultados, demostraron que CXCL9 es una quimiocina clave expresada por los macrófagos CD206+ en el reclutamiento de las células NK. Se ha demostrado que los pacientes humanos con un eje macrófago-NK-cDC1 intacto tienen una mejor supervivencia en comparación con los pacientes cuyo eje se interrumpe. En el CRC, estos macrófagos a menudo se inclinan hacia fenotipos inmunosupresores^[49]–^[56], lo que dificulta una activación inmunitaria eficaz y posiblemente el reclutamiento del eje NK-cDC1. Al reprogramar los macrófagos a través de la inmunidad entrenada, podemos restaurar potencialmente este eje, lo que permite una mejor presentación del antígeno tumoral, la secreción de citocinas y la posterior activación de las células T (Fig. S24).

Nuestro análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) reveló que los macrófagos Chil3+Ly6Chigh eran la principal población celular que impulsaba el eje NK-cDC1. Esto es sorprendente, dado que estos macrófagos se clasifican típicamente como células reguladoras o pro-tumorales, a menudo asociadas con la cicatrización de heridas y la supresión inmune en el microambiente tumoral (TME)^[57]–^[59]. Sin embargo, en condiciones de inmunidad entrenada, estos macrófagos mostraron un fenotipo más alineado con funciones proinflamatorias y antitumorales, lo que sugiere que su papel en la respuesta inmune puede ser más plástico de lo que se pensaba. Una posible explicación para este cambio es que la inmunidad entrenada reprograma estos macrófagos para que adopten un fenotipo híbrido, conservando algunas funciones reguladoras al tiempo que adquieren la capacidad de producir citocinas proinflamatorias. Otra posibilidad es que el aumento de la presencia de IFN-γ en el entorno entrenado alteró el estado de polarización de los macrófagos, empujando a los macrófagos Chil3+Ly6Chigh hacia un fenotipo similar a M1 capaz de apoyar la actividad antitumoral.

Un sello distintivo clave de la inmunidad entrenada es la remodelación metabólica que sustenta los cambios funcionales a largo plazo en las células inmunes innatas. Nuestro análisis metabolómico reveló cambios significativos en las vías metabólicas centrales, particularmente en el metabolismo de los aminoácidos y la producción de energía. Estos cambios se alinean con estudios previos que muestran que los macrófagos entrenados experimentan un cambio hacia la glucólisis, la activación de la vía del fosfato de pentosa y la biosíntesis de colesterol, todo lo cual apoya el aumento de la producción de citocinas y la actividad inflamatoria^[60]. Curiosamente, nuestros datos revelaron un aumento significativo en el metabolismo de la creatina, un hallazgo que no se ha explorado ampliamente en el contexto de la inmunidad entrenada. Tradicionalmente, la creatina se asocia con el metabolismo energético muscular, pero la evidencia reciente sugiere que desempeña un papel importante en la activación de las células inmunes al amortiguar los niveles de ATP. Esto se ha demostrado con macrófagos y células T, donde la suplementación con creatina mejoró la actividad antitumoral^[61]. Dado que los macrófagos entrenados requieren un gran suministro de ATP para mantener la síntesis de citocinas y quimiocinas, hipotetizamos que el metabolismo de la creatina es esencial para alimentar las altas demandas metabólicas de la inmunidad entrenada. Específicamente, los macrófagos pueden depender de la creatina para apoyar la expresión de quimiocinas inflamatorias clave como CXCL9 y CXCL10, que son cruciales para el reclutamiento de células T y células NK. Este hallazgo sugiere que el metabolismo de la creatina puede ser un componente pasado por alto pero esencial de la activación de las células mieloides y podría representar un objetivo potencial para mejorar las terapias basadas en la inmunidad entrenada.

Nuestros hallazgos muestran que la inmunidad entrenada puede mejorar la eficacia de la vacuna en el cáncer colorrectal (CRC) reprogramando las células mieloides para mantener la activación inmune a largo plazo. La relevancia clínica de este enfoque se apoya en el uso de PDO (organoides derivados de pacientes), que proporcionan un modelo altamente predictivo para las respuestas específicas del paciente a la inmunoterapia. Además, el uso de una vacuna de péptidos de CEA (antígeno carcinoembrionario) clínicamente probada destaca el potencial de traslación de nuestra estrategia, ya que el CEA es un antígeno tumoral bien establecido con ensayos en curso en múltiples tipos de cáncer^[62]. Desde una perspectiva más amplia, estos hallazgos tienen implicaciones para el desarrollo de vacunas contra el cáncer de nueva generación. Al integrar la inmunidad entrenada con los enfoques de inmunoterapia establecidos, podemos ser capaces de superar las limitaciones de las vacunas y los inhibidores de los puntos de control actuales, particularmente en tumores resistentes a los enfoques tradicionales mediados por las células T. En última instancia, nuestro estudio proporciona una base sólida para una mayor exploración de la inmunidad entrenada en la inmunoterapia contra el cáncer, específicamente en la terapia de vacunas contra el cáncer. Dada su capacidad para reprogramar el sistema inmune innato para una actividad antitumoral sostenida, los enfoques basados en la inmunidad entrenada podrían representar un cambio de paradigma en el tratamiento del cáncer, ofreciendo esperanza para los pacientes con cáncer con malignidades resistentes a las vacunas.

Si bien nuestro estudio proporciona evidencia del papel de la inmunidad entrenada en la mejora de la vacunación contra el cáncer colorrectal, se deben reconocer varias limitaciones. Primero, nuestros modelos in vivo, aunque robustos, pueden no recapitular completamente la complejidad y la heterogeneidad del CRC humano, y se requiere una mayor validación en diversas cohortes de pacientes, incluidos modelos derivados de pacientes, para fortalecer la relevancia traslacional. En segundo lugar, si bien delineamos los mecanismos metabólicos y epigenéticos que sustentan el entrenamiento inducido por β-glucano, no evaluamos cuánto tiempo persisten estos cambios funcionales. Nuestros ensayos funcionales demuestran la eficacia varias semanas después del entrenamiento, sin embargo, los experimentos longitudinales dedicados (como la inoculación tumoral tardía, el re-desafío inmune y el perfilado serial de los macrófagos entrenados) serán fundamentales para definir la persistencia y las características similares a la memoria en los contextos del cáncer. Finalmente, como ocurre con todos los estudios preclínicos, la traslación a la clínica requerirá no solo la validación mecanicista en los subconjuntos inmunes humanos, sino también la evaluación de la seguridad, la dosis y los regímenes combinados con las terapias existentes.

Métodos

Permisos éticos

El estudio del biobanco del Proyecto Emblemático iCAN se basa en un consentimiento del biobanco y fue revisado por el Comité de Ética de HUS y se ejecuta según un permiso de investigación de HUS (4.5.2023 §38 (HUS/223/2023), un permiso de datos de Findata (THL/1338/14.02.00/2022) y acuerdos de transferencia de materiales (MTA) con el Biobanco de Helsinki (HBP20210170) y el Biobanco de Hematología y Registro de Finlandia (FHRB) (12.5.2022).

Todos los estudios con animales fueron evaluados y autorizados por el Comité de Animales de Experimentación de la Universidad de Helsinki y el Gobierno Provincial de Finlandia del Sur (permisos ESAVI/11895/2019 y ESAVI/12722/2022). Nuestra autorización ética limita el tamaño del tumor a un diámetro máximo de 18 mm, y este límite no se superó en ningún experimento realizado para este estudio.

Líneas celulares murinas

El adenocarcinoma de colon murino CT26 (ATCC Cat# CRL-2638) se compró al American Type Culture Collection (ATCC) después de 2013. El adenocarcinoma de colon murino MC38 (amablemente proporcionado por Cristian Smerdou, Cima Universidad de Navarra). El adenocarcinoma de colon murino Colon-2 se compró a Cytion (número de producto: 400156). Las líneas celulares se descongelaron en el paso 5 y se mantuvieron en cultivo hasta alcanzar el paso 15. Todas las líneas celulares fueron autenticadas por la ATCC, cultivadas en condiciones adecuadas y controladas periódicamente para detectar contaminación por micoplasma.

Preparación de adenovirus de replicación condicional

Todos los adenovirus se generaron como adenovirus de replicación condicional utilizando protocolos estándar descritos previamente^[40],^[63]. En resumen, los virus adenovirus son del serotipo quimérico 5/3 con una deleción de 24 nucleótidos y la deleción de la región gp19k en la región E1A, lo que resulta en una replicación selectiva en las células con la vía Rb deficiente.

Formación del complejo PC

El complejo PeptiCab se generó combinando el vector adenovirus con un péptido que incluye una cola poli-K. Veinte microgramos de epítopos extendidos con poli-K se incubaron con los 1 × 109 partículas virales durante 15 minutos a temperatura ambiente antes del tratamiento con los complejos resultantes. Se ha informado previamente información detallada sobre la estabilidad y la formación del complejo^[41],^[42]. Las cantidades específicas de péptido y virus utilizadas en cada experimento se proporcionan en las leyendas de las figuras correspondientes.

Recolección de PBMCs, PMNs y monocitos

Las células polimorfonucleares (PMNs) y las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron de concentrados de glóbulos rojos como se describió previamente^[65]. Las capas de PBMCs y PMNs se eliminaron posteriormente entre el suero y el Ficoll (Cytivia, Cat# 1714400) o en la capa de Histopaque (Sigma-Aldrich, Cat# 11191), respectivamente, y se cultivaron en 1xRPMI (Roswell Park Memorial Institute, Gibco, Cat# 21875034).

Las PBMCs se procesaron para el enriquecimiento de monocitos utilizando la centrifugación de gradiente de densidad con soluciones de Percoll (Sigma-Aldrich, Cat# P1644). La suspensión de PBMCs (que contiene aproximadamente 150–200 × 106 células) se colocó cuidadosamente sobre un Percoll hiperosmótico. Los tubos se centrifugaron a 580 g durante 15 minutos y las células en la interfaz se recogieron y luego se centrifugaron a 350 g durante 7 minutos. El pellet celular se resuspendió en medio RPMI para producir una suspensión enriquecida con monocitos. Para purificar aún más la población de monocitos eliminando las plaquetas y las células muertas, se superpuso 10 ml de solución de Percoll isoosmótica con 3 ml de la suspensión enriquecida con monocitos (hasta 200 × 106 células) seguida de la centrifugación a 350 g durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y los pellets celulares se resuspendieron en medio RPMI. Se tomaron muestras de concentrados de glóbulos rojos del Servicio de Sangre de la Cruz Roja Finlandesa (permiso ético 26/2025).

Implantación de tumores y entrenamiento inmune innato para experimentos con animales

Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Animales de Experimentación de la Universidad de Helsinki y el Gobierno Provincial de Finlandia del Sur (número de licencia ESAVI/11895/2019). Se inyectaron aproximadamente 4-6 semanas de edad, ratones hembra BALB/c inmunocompetentes, comprados de Envigo (Venray, Países Bajos), en el flanco derecho con 500 000 células CT26. En cuanto a los tumores MC38, se inyectaron ratones C57BL/6 comprados de Envigo (Venray, Países Bajos) en el flanco derecho con 500 000 células. Todos los ratones se mantuvieron en una dieta estándar para roedores ad libitum. Los animales recibieron alimento en pellets seco (Envigo; Catálogo No. 2018S) a menos que se especifique lo contrario. El alimento y el agua estuvieron siempre disponibles durante los experimentos. El volumen del tumor se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Se realizó una aleatorización completa el día del tratamiento. Los detalles del programa de tratamiento se pueden encontrar en las leyendas de las figuras. La dosis viral utilizada fue de 1 × 109 vp/tumor complejada con 20 µg de un solo péptido. Se midieron los tumores con un calibrador y se sacrificaron los ratones cuando se cumplió el punto final ético humano.

Para los ajustes profilácticos, se entrenaron los ratones inyectando dos administraciones IP de 1 mg de WPG (Invivogen, Cat# tlrl-wgp) 7 y 4 días antes de la implantación del tumor. Para los ajustes terapéuticos, primero se implantaron los tumores en los ratones y luego, 4 y 7 días después de la implantación del tumor, se inyectaron dos administraciones de 1 mg de WPG (Invivogen, Cat# tlrl-wgp) IP.

Para los experimentos de transferencia adoptiva, se aislaron macrófagos y células NK de los esplenocitos de los ratones donantes. Primero, las células CD11b+ se enriquecieron utilizando cuentas magnéticas CD11b (BioLegend, 480109, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas) y luego se purificaron en macrófagos F4/80+ utilizando cuentas magnéticas F4/80 (BioLegend, 480169, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas). Las células NK se enriquecieron utilizando cuentas de aislamiento de NK (BioLegend, 480049, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas). Los macrófagos o las células NK purificadas se estimularon con 1 µg/ml de WPG durante 24 horas, se lavaron exhaustivamente y luego se transfirieron a los ratones receptores (1 × 106 células por ratón, IP).

Depleción in vivo de tipos específicos de células inmunes

Para la depleción de macrófagos, se administraron a los ratones 200 µl de liposomas de clodronato (Liposoma, Cat# C-005) IP 1 día después de la implantación del tumor y luego cada cuatro días hasta el final del experimento. En cuanto a la depleción de células NK, se trató a los ratones con 50 µl de anticuerpos anti-Asialo-GM1 (anticuerpo anti-Asialo-GM1 purificado, BioLegend, Cat# 146002) un día después de la implantación del tumor y se administraron cada cuatro días hasta el final del experimento. Para la depleción de ambas poblaciones inmunes, se trató a los ratones con ambos tratamientos 1 día después de la implantación del tumor y se administraron cada cuatro días hasta el final del experimento. Para la depleción de las células T CD8+, se administró a los ratones un tratamiento único de 500 µg de anticuerpo anti-CD8 (BioXcell, Cat# #BE0061) IP 1 día antes del primer tratamiento con PC y se mantuvo inyectando 100 µg de anticuerpo anti-CD8 IP cada 3 días.

Ensayo metabólico de Seahorse

Se utilizó un analizador Seahorse XFe96 (Agilent) para determinar la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en macrófagos. Los macrófagos se enriquecieron utilizando microesferas F4/80 (BioLegend, Cat#480169). Los macrófagos purificados se transfirieron a un medio base Seahorse XF (Agilent) suplementado con glucosa (10 mM), piruvato de sodio (5 mM) y L-glutamina (5 mM) (Gibco), pH 7,4, a 37 °C. Las células se sembraron a una concentración de 0,5 × 10⁵ o 0,8 × 10⁵ células por pocillo en placas de cultivo celular Seahorse XF96 y se dejaron adherir. A continuación, los macrófagos se estimularon con 1 µg/ml de partículas de β-glucano total (WPG; InvivoGen, Cat#tlrl-bgp) o con PBS como control, durante 2 h (estimulación a corto plazo) o durante la noche (16 h; estimulación a largo plazo).

La OCR y la ECAR se midieron utilizando un ensayo estándar de estrés mitocondrial. Los siguientes inhibidores se inyectaron secuencialmente durante el ensayo: oligomicina (1 µM), carbonil cianuro 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP; 1 µM) y una mezcla de antimicina A y rotenona (1 µM cada una). Los parámetros del ensayo fueron: 3 minutos de mezcla, sin tiempo de espera y 3 minutos de medición, repetidos 3 veces en la línea de base y después de cada inyección. Tras las mediciones, se realizó la determinación de proteínas y los resultados se normalizaron en función del contenido total de proteínas.

Inhibición de la creatina

Los ratones recibieron una inyección I.P. de β-GPA (500 mg/kg en 100 µl de PBS) (Sigma-Adlrich, Cat#G6878) 1 día después de la implantación del tumor y se les administró diariamente hasta el final del experimento.

Estimulación y tinción intracelular

La estimulación y tinción intracelular se realizaron en 2 × 10⁶ esplenocitos murinos incubados en una placa de fondo plano de 96 pocillos con brefeldina A (Biolegend, Cat# 420601) (1:1.000) y monensina A (Biolegend, Cat# 420701) (1:1.000) a 37 °C durante 5 h. Los estimulantes se añadieron a concentraciones de 2 µg para los péptidos y 40 MOI para el adenovirus. Tras la estimulación, las muestras se almacenaron durante la noche a 4 °C. A continuación, las células se centrifugaron y los sedimentos se resuspendieron en Fc-block murino (BioLegend, Cat# 156613) a 4 °C durante 15 minutos. Las proteínas extracelulares se tiñeron utilizando los siguientes anticuerpos: BV711 CD3 (BD Biosciences, #563123, 0,5 µl/1 millón de células), BV510 CD8 (BD Biosciences, #563068, 1 µl/1 millón de células), PE-CF594 CD4 (BD Biosciences, #562285, 0,5 µl/1 millón de células), APC CD62L (eBioscience, #17-0621-81, 0,5 µl/1 millón de células), AF700 CD44 (BioLegend, #103026, 1 µl/1 millón de células) y v450 CCR7 (BD Biosciences, #560805, 1 µl/1 millón de células). Tras la tinción extracelular, las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando un kit de fijación/permeabilización (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se tiñeron las proteínas intracelulares con BV650 TNF-α (BioLegend, #506333, 1 µl/1 millón de células), PE-Cy7 IL-2 (BioLegend, #503832, 1 µl/1 millón de células), PE IFN-γ (BioLegend, #505808, 1 µl/1 millón de células) y FITC IL-6 (BioLegend, #503806, 1 µl/1 millón de células). Por último, las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Fortessa (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (versión 10.8.2).

Citometría de flujo de muestras tumorales

Los tumores de los ratones se pasaron a través de un tamiz celular de 70 µm (Falcon) para obtener una suspensión celular. A continuación, se sembraron 1 millón de células en una placa de fondo plano de 96 pocillos (Sarstedt) y se tiñeron con los siguientes anticuerpos: BV711 CD3 (clon: 145-2C11, cat: 563123, BD Biosciences, 0,5 µl/1 millón de células), BV510 CD8 (clon: 53-6.7, cat: 563068, BD Biosciences, 1 µl/1 millón de células), PE-CF594 CD4 (clon: RM4-5, cat: 562285, BD Biosciences, 0,5 µl/1 millón de células), APC CD62L (clon: MEL-14, cat: 17-0621-81, eBioscience, 0,5 µl/1 millón de células), AF700 CD44 (clon: IM7, cat: 103026, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), v450 CCR7 (clon: 4B12, cat: 560805, BD Biosciences, 1 µl/1 millón de células), BV650 TNF-α (clon: MP6-XT22, cat: 506333, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), PE-Cy7 IL-2 (clon: JES6-5H4, cat: 503832, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), PE IFN-γ (clon: XMG1.2, cat: 505808, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), BV711 CD11b (clon: M1/70, cat: 101241, BioLegend, 0,5 µl/1 millón de células), FITC CD11c (clon: N418, cat: 25-0114-82, eBioscience, 0,5 µl/1 millón de células), PerCP/cy5.5H2-Kd (clon: AF6-88S, cat: 116516, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), PE CD103 (clon: 2E7, cat: 121406, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), APC PDCA (clon: 927, cat: 127015, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), APC anti-ratón CD3 (clon: 17A2, cat: 100236, BioLegend, 0,5 µg/1 millón de células), FITC anti-ratón CD8a (clon: 53-6.7, cat: 100706, BioLegend, 1 µg/1 millón de células) y PerCP/cy5.5 anti-ratón CD107a (LAMP-1) (clon: 1D4B, cat: 121625, BioLegend, 5 µl/1 millón de células). Todas las mezclas de anticuerpos se incubaron en un volumen final de 100 µl y se utilizaron generalmente según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de entrenamiento y estimulación de células inmunitarias humanas in vitro

Se resuspendieron 100.000 monocitos purificados en un volumen de 100 µl y se dispensaron en placas de fondo plano de 96 pocillos (Corning, NY, EE. UU.) y se dejaron adherir a la superficie de poliestireno durante 1 h a 37 °C. A continuación, se lavaron las células con medio precalentado. A continuación, los monocitos se incubaron con medio de cultivo RPMI como control negativo o con 1 µg/ml de β-glucano a 37 °C durante 24 h. Después, las células se trataron con brefeldina A (1:1.000) y monensina A (1:1.000) a 37 °C y se estimularon con 40 MOI de adenovirus o LPS (Invivogen, Cat#, tlrl-3pelps) (10 ng/ml) durante 5 h. En cuanto a los macrófagos, los monocitos se diferenciaron en macrófagos M0 suplementando el medio RPMI con 10% de suero humano inactivado por calor durante cinco días. Para las células dendríticas (DC), los monocitos se estimularon con GM-CSF (1000 U/ml) e IL-4 (800 U/ml) durante 4 días. A continuación, las DC y los macrófagos se incubaron con medio de cultivo RPMI como control negativo o con 1 µg/ml de β-glucano a 37 °C durante 24 h. Después, las células se trataron con brefeldina A (1:1.000) y monensina A (1:1.000) a 37 °C y se estimularon con 40 MOI de adenovirus o LPS (Invivogen, Cat#, tlrl-3pelps) (10 ng/ml) durante 5 h.

Inhibición metabolómica ex vivo

Primero, se entrenaron ratones Balb/c con PBS o WPG y, a continuación, se sacrificaron. Se aislaron los bazo y se pasaron a través de un tamiz celular de 70 µm (Falcon) para obtener una suspensión celular. Las células CD11b+ se aislaron utilizando microesferas magnéticas CD11b (BioLegend, 480109, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanobeads) y se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos y se dejaron adherir. A continuación, las células CD11b+ se trataron con 10 nM de rapamicina (Sigma), 500 nM de ácido ascórbico (Merck, Cat# APO456787373) y 10 mM de β-GPA durante 5 días y, a continuación, se lavaron con PBS. A continuación, las células CD11b+ se estimularon con PBS o 40 MOI de adenovirus durante 5 h. Para la medición de TNF-α (BioLegend, 502909, 1 µl/1 millón de células) e IL-6, las células CD11b+ se trataron con brefeldina A (1:1000) y monensina A (1:1000) para medir los niveles mediante citometría de flujo intracelular. En cuanto a CXCL9 y CXCL10, las concentraciones de cada citocina se determinaron en el sobrenadante del cultivo celular mediante ELISA utilizando MIG/CXCL9 (ThermoFisher, Cat#250-18-20UG) y el kit ELISA murino CXCL10/IP-10 (R&D, Cat# DY466-05).

Inmunofluorescencia en macrófagos F4/80

Los tumores de los ratones se pasaron a través de un tamiz celular de 70 µm (Falcon) para obtener una suspensión celular. Las células CD11b+ se aislaron utilizando microesferas magnéticas CD11b (BioLegend, 480109, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanobeads) y, a continuación, se enriquecieron aún más para los macrófagos F4/80 utilizando microesferas F4/80 (Biologend, 480169, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanobeads). Las células de macrófagos F4/80 se sembraron en placas Nunc de 8 pocillos; Lab-Tek; II Chamber Slides y se cultivaron durante 4 días. Las células se fijaron en 4% de paraformaldehído frío y se tiñeron con el anticuerpo H3K4me3 (1:200, Diagnode, C15410003) y DAPI (1 µg/ml, Invitrogen™, P36941). Se tomaron imágenes de microscopía utilizando un sistema de imagen celular EVOS FL (Thermo Fisher Scientific).

Ensayo de transwell

Los tumores de los ratones se pasaron a través de un tamiz celular de 70 µm (Falcon) para obtener una suspensión celular única. Las células CD11b+ se aislaron utilizando microesferas magnéticas CD11b (BioLegend, 480109) y se enriquecieron aún más para los macrófagos F4/80 utilizando microesferas F4/80 (BioLegend, 480169), las células NK utilizando el kit de aislamiento de células NK murinas (BioLegend, 480049, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanobeads) o las células dendríticas (DC) utilizando el kit de aislamiento de células dendríticas panmurinas (BioLegend, 480097, 10 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanobeads).

Para los ensayos de migración de macrófagos NK murinos, los macrófagos F4/80+ se sembraron en la cámara inferior y se estimularon con 40 MOI de adenovirus. Las células NK se etiquetaron fluorescentemente con 5 µM de tinte CellTracker™ Green CMFDA (Thermo Fisher Scientific, Cat#C2925) y se sembraron en la cámara superior de insertos de membrana de policarbonato Transwell® de 6,5 mm con un tamaño de poro de 5,0 µm (Corning). Cuando se indica, las células NK se preincubaron con 10 µg/ml de anticuerpo anti-CXCR3 murino (BioXcell, Cat#BE0249) antes de la migración. Después de 24 h, las células NK migradas se cuantificaron utilizando un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences) con cuentas de recuento de precisión (BioLegend, Cat#424902, 5 µl por muestra).

Para los ensayos de migración de células NK-DC murinas, las células NK se aislaron del microentorno tumoral (TME) utilizando el kit de aislamiento de células NK (BioLegend, 480049, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanobeads), mientras que las células dendríticas se aislaron utilizando el kit de aislamiento de células dendríticas panmurinas MojoSort™ (BioLegend, 480097, 10 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanobeads). Las células NK se preincubaron con 10 µg/ml de anticuerpo anti-CXCR3 murino (BioXcell, Cat#BE0249) antes de la migración. Las células NK se etiquetaron fluorescentemente con 5 µM de tinte CellTracker™ Green CMFDA (Thermo Fisher Scientific, Cat#C2925) y se sembraron en la cámara superior de insertos de membrana de policarbonato Transwell® de 6,5 mm con un tamaño de poro de 5,0 µm (Corning). Las células dendríticas se etiquetaron fluorescentemente con 5 µM de tinte CellTracker™ Red CMFDA (Thermo Fisher Scientific, Cat#C34754) y se sembraron en la cámara inferior. Después de 24 h, las células NK y las células dendríticas migradas se cuantificaron utilizando un citómetro de flujo BD LSRFortessa (BD Biosciences).

RT-qPCR

Se aislaron células NK de tumores de ratón utilizando el kit de aislamiento de células NK de ratón MojoSort™ (BioLegend, Cat#480049) según las instrucciones del fabricante. Se extrajo el ARN total utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Cat#74104) y se determinó la concentración y pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Para la síntesis de ADNc, la muestra de ARN se transcribió inversamente utilizando la transcriptasa inversa Maxima (200 U/μL; Thermo Fisher Scientific, Cat#EP0742) siguiendo el protocolo del fabricante.

Se realizó una PCR cuantitativa (qPCR) utilizando el Master Mix GoTaq® qPCR (Promega, Cat#A6002) en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems). Cada reacción se realizó en triplicado técnico con las siguientes condiciones de ciclado: 95 °C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. Los niveles de expresión se normalizaron a Gapdh, y el cambio relativo se calculó utilizando el método ΔΔCt en relación con los controles de células NK tratadas con PBS. Los primers se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1.

Generación a largo plazo de células CD8+ T específicas para péptidos

Las PBMCs aisladas se cultivaron con PBS o 1 μg/mL de WPG durante 24 h. Las PBMCs cultivadas se incubaron con GM-CSF (1000 U/mL) e IL-4 (800 U/mL) durante 4 días para diferenciarlas en células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs). Para estimular las células T específicas para péptidos, las PBMCs se incubaron con PC (10 μM de péptidos complejos con 109 partículas virales). Posteriormente, se aplicaron directamente TNFα (10 ng/mL, Peprotech) y LPS (10 ng/mL), que se incubaron durante 4 h para generar células dendríticas semi-maduras. Después, se añadió IL-21 (60 ng/mL, Peprotech) para mejorar la expansión de las células T. Después de 10 a 12 días, las células T se reestimularon con PC durante 10 días adicionales. Los cultivos se mantuvieron alimentándolos cada 2 a 3 días con IL-2 (50 U/mL, STEMCELL Technologies).

Generación a corto plazo de células CD8+ T específicas para péptidos

Se sembraron 106 PBMCs en una placa de 24 pocillos y se trataron con PBS o 1 μg/mL de WPG durante 24 h. Luego, las células se lavaron y se estimularon con PC (10 μM de péptidos complejos con 109 partículas virales). Después de tres días, se añadió IL-2 (50 U/mL, STEMCELL Technologies) para expandir aún más las células T. Luego, las PBMCs se reestimularon con PC y se trataron con brefeldina A (1:1,000) y monensina A (1:1,000) a 37 °C durante 5 h.

Microscopía y cuantificación

La visualización microscópica de la muerte de los PDO se realizó con el sistema de imagen EVOS M7000 (Thermo Fisher Scientific), donde se obtuvieron imágenes de las células CD8+ T marcadas con verde y la muerte celular (utilizando PI) en los canales de transmisión, proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente roja (RFP), respectivamente. Los ajustes, incluido el brillo, el enfoque y el número de recuentos por imagen, se establecieron manualmente, con los objetivos deseados por imagen. Después de la calibración manual, se realizó la adquisición automatizada de imágenes para obtener 50 imágenes por pocillo en varios canales y construir una pila Z. La adquisición automatizada de imágenes para este estudio incluyó la transmisión (para el producto de precipitado coloreado convencional), RFP y GFP.

Perfilado metabolómico

Las células CD11b+ clasificadas de tumores murinos se añadieron a 400 μl de disolvente de extracción frío, seguido inmediatamente de centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Luego, los sobrenadantes se cargaron en una placa de 96 pocillos Ostro (25 mg; Waters) y se procesaron utilizando un sistema de vacío robótico. Los filtrados resultantes se transfirieron a tubos de polipropileno y se secaron por completo en un evaporador de gas nitrógeno. Los residuos secos se reconstituieron en 40 μl de disolvente de extracción, se agitaron en un vórtice durante 2 minutos y luego se transfirieron a viales de vidrio para el autoinyector de HPLC. Se inyectaron dos microlitros de cada muestra en un sistema UHPLC Thermo Vanquish acoplado a un espectrómetro de masas cuádrupolo Orbitrap Q-Exactive equipado con una fuente de ionización por pulverización electrostática calentada (H-ESI) (Thermo Fisher Scientific). La separación cromatográfica se realizó utilizando una columna SeQuant ZIC-pHILIC (2,1 mm × 100 mm, tamaño de partícula de 5 μm; Merck) en condiciones de elución en gradiente a una velocidad de flujo de 0,100 ml/min. Se utilizó una fase móvil A, compuesta por 20 mM de carbonato de hidrógeno de amonio ajustado a un pH de 9,4 con una solución de amonio al 25%, y acetonitrilo como fase móvil B en el siguiente gradiente: comenzando con 20% A y 80% B, mantenido hasta los 2 minutos, luego aumentando gradualmente la fase móvil A hasta el 80% a los 17 minutos y, finalmente, reduciéndola de nuevo al 20% A a los 17,1 minutos, lo que se mantuvo hasta los 24 minutos. El horno de la columna y el autoinyector se mantuvieron a 40 °C ± 3 °C y 5 °C ± 3 °C, respectivamente. La espectrometría de masas se realizó con polaridad de conmutación en las siguientes condiciones: una resolución de 35.000; voltajes de pulverización de 4250 V (modo positivo) y 3250 V (modo negativo); gas de envoltura a 25 unidades arbitrarias; gas auxiliar a 15 unidades arbitrarias; flujo de gas de barrido de 0; temperatura del capilar a 275 °C; y un nivel de RF de lente S de 50,0. El instrumento se operó utilizando el software Xcalibur 4.1.31.9 (Thermo Fisher Scientific), y los metabolitos se anotaron para 462 metabolitos con el software TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific) utilizando las relaciones masa/carga y los tiempos de retención de los estándares (MSMLS-1EA, Merck). Durante la ejecución, la calidad de los datos se controló incluyendo una muestra de control de calidad (QC) de suero agrupado cada 10 inyecciones. Los datos finales se prefiltraron para los metabolitos que presentaban una cromatografía deficiente, una alta variación en las muestras de QC agrupadas > 20% de desviación estándar (RSD) o ruido de fondo > 20% en comparación con las muestras en blanco. Los datos se analizaron con MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/). Las variables faltantes se imputaron reemplazándolas con 1/5 de los valores mínimos positivos de cada característica. Los datos se normalizaron aún más con una transformación log10 y un escalado automático. En el análisis de agrupamiento multivariante, el mapa de calor se calculó utilizando la medida de distancia euclidiana para hasta las 25 características más significativas (prueba t). Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) para visualizar los datos. Para el análisis univariante, se realizó una prueba t y un análisis de diagrama de dispersión con un cambio de pliegue de 1,5 y un valor p bruto < 0,05. Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos cuantitativos (MSEA) en MetaboAnalyst 5.0 utilizando la base de datos KEGG del ratón.

Marcado de muestras para la secuenciación de ARN de una sola célula

Las células CD11b+ clasificadas se lavaron de 2 a 3 veces con 10 ml de PBS y luego se resuspendieron en 100 μl de tampón de tinción celular (BioLegend, Cat# 420201). A continuación, se añadió 10 μl de reactivo de bloqueo TruStain FcX (BioLegend, Cat# 420510) y las células se incubaron durante 10 minutos para bloquear la unión inespecífica. Luego, se añadió un anticuerpo de marcado TotalSeq-A único (BioLegend, Cat#1603-1608, 1 μl/1 millón de células) a cada muestra a una concentración de 1 a 2 μl (o 1 a 2 μg por muestra) y se incubó durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Después de esto, las células se lavaron de 3 a 5 veces con 3 ml de tampón de tinción, se combinaron en un volumen único de 1 ml de tampón de tinción, se centrifugaron y, finalmente, se resuspendieron en PBS que contenía 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA) antes de continuar con la secuenciación de ARN de una sola célula.

Secuenciación de ARN de una sola célula

La ejecución de Chromium Single Cell 3’RNAseq y las preparaciones de la biblioteca se realizaron utilizando la química Dual Index 3’ Gene Expression v3.1 de 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell, con modificaciones descritas por Stoeckius et al.22 (https://cite-seq.com/) y basadas en un protocolo actualizado disponible en www.biolegend.com/en-us/protocols/totalseq-a-antibodies-and-cell-hashing-with-10x-single-cell-3-reagent-kit-v3-3-1-protocol. Se apuntó a aproximadamente 15.000 células por carril de 10x (pocillo GEM) que contenía muestras marcadas de 13 líneas celulares, que se cultivaron solas o en combinación con células NK, con pocillos GEM separados asignados para cada grupo de tratamiento. Esta configuración dio como resultado el objetivo de aproximadamente 1000 a 1200 células para la secuenciación de cada línea celular en monocultivo o cocultivo. Las bibliotecas de 3’ GEX y Cell Hashing (multiplexación) se secuenciaron en un sistema Illumina NovaSeq 6000, con longitudes de lectura establecidas en 28 pb para Read 1, 10 pb para el índice i7, 10 pb para el índice i5 y 90 pb para Read 2.

Análisis de la secuenciación de ARN de una sola célula

Los datos de la secuenciación de ARN de una sola célula se procesaron utilizando Seurat (v6.0) en R (v4.3.2). Para el control de calidad, se filtraron las células para excluir aquellas con < 200 o > 2500 genes detectados, > 30% de contenido de genes mitocondriales o genes expresados en menos de tres células. También se eliminaron las células con un contenido de ribosomas anormalmente alto (> 50%) o un bajo recuento de UMI (< 700).

Los valores de expresión génica se normalizaron con la función NormalizeData utilizando el método LogNormalize (factor de escala = 10.000). Se identificaron genes altamente variables (HVG; n = 2000) utilizando el método "vst" en FindVariableFeatures. Los datos se escalaron y se centraron utilizando la función ScaleData. Para controlar la heterogeneidad del ciclo celular, se calcularon las puntuaciones del ciclo celular con CellCycleScoring (marcadores G2/M y S proporcionados en Seurat) y se eliminaron durante el escalado.

La reducción de la dimensionalidad se realizó mediante el análisis de componentes principales (PCA) en los HVG. Se seleccionaron los 30 primeros componentes principales en función de la inspección del diagrama de codo y el remuestreo de JackStraw. Para mitigar los efectos de lote entre los experimentos, aplicamos Harmony (v1.0) con los parámetros predeterminados, utilizando la identidad de la muestra como covariable.

El agrupamiento se realizó utilizando las funciones FindNeighbors y FindClusters. Para el agrupamiento global en todas las células inmunitarias, utilizamos una resolución de 0,5; para el subagrupamiento centrado en las células linfoides, se aplicó una resolución de 0,5; y para los análisis de TAM/monocitos, utilizamos 0,4. La visualización bidimensional se realizó con UMAP (RunUMAP, 30 componentes principales, configuración predeterminada).

La anotación del clúster se guió por los marcadores expresados diferencialmente (DE), identificados con la función FindAllMarkers (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, cambio de pliegue log2 > 0,8 o < -0,8, valor p ajustado < 0,05, corrección de Bonferroni). La expresión diferencial entre los grupos experimentales se realizó con la función FindMarkers utilizando los mismos umbrales. Luego, se asignaron las identidades del tipo de célula mediante la revisión manual de los DEG específicos del clúster y se confirmaron utilizando la herramienta ImmGen MyGeneSet, en lugar de herramientas de clasificación automatizadas, para garantizar anotaciones biológicamente fundamentadas.

Recolección de tejido para el cultivo de PDO y permisos éticos

Las muestras de tejido fueron obtenidas por el cirujano ya sea mediante fórceps de biopsia endoscópica o mediante una biopsia del espécimen quirúrgico. Las muestras se transportaron al laboratorio en un medio de transferencia (DMEM suplementado con un 1% de solución de penicilina-estreptomicina) y se procesaron dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. El estudio del proyecto insignia iCAN se basa en un consentimiento de biobanco y fue revisado por el Comité de Ética de HUS y se ejecuta en base a un permiso de investigación de HUS (4.5.2023 §38 (HUS/223/2023), un permiso de datos de Findata (THL/1338/14.02.00/2022) y acuerdos de transferencia de materiales con Helsinki Biobank (HBP20210170) y Finnish Hematology and Registry Biobank FHRB (12.5.2022). Todas las muestras utilizadas en este estudio se destruyeron después del análisis.

Cultivo de PDO

Las muestras de tejido se disociaron mecánicamente con una pipeta P1000, seguido, si es necesario, de una digestión enzimática de diez minutos con un medio de digestión de organoides para aumentar el rendimiento de la biomasa. Las células disociadas se lavaron 1 o 3 veces (en caso de digestión enzimática) por centrifugación (5 min a 4 °C, 200 g) en un medio de lavado, se resuspendieron en Matrigel (Corning, Cat# 354230) y se sembraron como domos únicos (50 μl cada uno) en una placa de 24 pocillos (1 domo/pocillo). Después de que el Matrigel se solidificara (15 a 30 min a 37 °C), se añadieron 500 μl de medio de cultivo de organoides suplementado con 1 μl/ml de inhibidor de la quinasa de la cadena de enrollamiento asociada al Rho Y-27632 para cubrir los domos, y las placas se devolvieron a 37 °C (con 21% de O2 y 5% de CO2) y se cultivaron para su expansión. El medio de cultivo de organoides se cambió cada 7 días. Los organoides se pasaron cada 14 días (o 7 días si es necesario).

Ensayos de muerte celular mediada por células T con PDO

Los PDOs de CRC se cocultivaron con 100.000 células CD8+ expandidas. Las células CD8+ se inyectaron mediante una aguja de 27 G directamente en el matrigel. Se añadió yoduro de propidio (1:1000) al cultivo para visualizar la muerte celular. Después de 24 horas de incubación a 37 °C, se midió la muerte celular determinando la cantidad de LDH liberada mediante un ensayo colorimétrico (CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay, Cat# C20303). A continuación, se calculó la lisis específica utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de citotoxicidad = (“experimental”–“control espontáneo”)/(“máximo del control”–“control espontáneo”) × 100%, donde “experimental” corresponde a la señal medida en una muestra tratada, “control espontáneo” corresponde a la señal medida en los PDOs solos y “máximo del control” corresponde a la señal medida en presencia de células tumorales lisadas con detergente.

Resumen de la información presentada

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de información de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Permisos éticos

El estudio del biobanco del Proyecto iCAN Flagship se basa en un consentimiento para el biobanco y fue revisado por el Comité de Ética de HUS y se ejecuta según un permiso de investigación de HUS (4.5.2023 §38 (HUS/223/2023), un permiso de datos de Findata (THL/1338/14.02.00/2022) y acuerdos de transferencia de materiales (MTA) con Helsinki Biobank (HBP20210170) y Finnish Hematology and Registry Biobank FHRB (12.5.2022).

Todos los estudios con animales fueron evaluados y autorizados por el Comité de Animales de Experimentación de la Universidad de Helsinki y el Gobierno Provincial del Sur de Finlandia (permisos ESAVI/11895/2019 y ESAVI/12722/2022). Nuestra autorización ética limita el tamaño del tumor a un diámetro máximo de 18 mm, y este límite no se superó en ningún experimento realizado para este estudio.

Líneas celulares murinas

El adenocarcinoma de colon murino CT26 (ATCC Cat# CRL-2638) se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC) después de 2013. El adenocarcinoma de colon murino MC38 (amablemente proporcionado por Cristian Smerdou, Cima Universidad de Navarra). El adenocarcinoma de colon murino Colon-2 se adquirió de Cytion (número de producto: 400156). Las líneas celulares se descongelaron en el pasaje 5 y se mantuvieron en cultivo hasta alcanzar el pasaje 15. Todas las líneas celulares fueron autenticadas por la ATCC, cultivadas en condiciones adecuadas y controladas periódicamente para detectar contaminación por micoplasma.

Preparación del adenovirus de replicación condicional

Todos los adenovirus se generaron como adenovirus de replicación condicional utilizando protocolos estándar descritos previamente^[40],^[63]. En resumen, los virus adenovirus son de serotipo quimérico 5/3 con una deleción de 24 nucleótidos y deleción de la región gp19k en la región E1A, lo que resulta en una replicación selectiva en células con vía Rb deficiente.

Formación del complejo PC

El complejo PeptiCab se generó combinando el vector adenovirus con un péptido que incluye una cola poliK. Veinte microgramos de epítopos extendidos con poliK se incubaron con los 1 × 109 partículas virales durante 15 minutos a temperatura ambiente antes del tratamiento con los complejos resultantes. Se ha informado previamente información detallada sobre la estabilidad y la formación del complejo^[41],^[42]. Las cantidades específicas de péptido y virus utilizadas en cada experimento se proporcionan en las leyendas de las figuras correspondientes.

Recolección de PMNs, PMBC y monocitos

Las células polimorfonucleares (PMNs) y las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron a partir de concentrados de glóbulos rojos, como se describió previamente^[65]. Las capas de PMBC y PMN se eliminaron posteriormente entre el suero y el Ficoll (Cytivia, Cat# 1714400) o en la capa de Histopaque (Sigma-Aldrich, Cat# 11191), respectivamente, y se cultivaron en 1xRPMI (Roswell Park Memorial Institute, Gibco, Cat# 21875034).

Las PMBC se procesaron para el enriquecimiento de monocitos mediante centrifugación de gradiente de densidad con soluciones de Percoll (Sigma-Aldrich, Cat# P1644). La suspensión de PMBC (que contiene aproximadamente 150–200 × 106 células) se colocó cuidadosamente sobre un Percoll hiperosmótico. Los tubos se centrifugaron a 580 g durante 15 minutos y las células de la interfase se recogieron y luego se centrifugaron a 350 g durante 7 minutos. El pellet celular se resuspendió en medio RPMI para producir una suspensión enriquecida en monocitos. Para purificar aún más la población de monocitos eliminando plaquetas y células muertas, se superpusieron 10 ml de solución de Percoll isoosmótica con 3 ml de la suspensión enriquecida en monocitos (hasta 200 × 106 células) seguida de centrifugación a 350 g durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y los pellets celulares se resuspendieron en medio RPMI. Se tomaron muestras de concentrados de glóbulos rojos del servicio de sangre de la Cruz Roja Finlandesa (permiso ético 26/2025).

Implantación de tumores y entrenamiento de la inmunidad innata para experimentos con animales

Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Animales de Experimentación de la Universidad de Helsinki y el Gobierno Provincial del Sur de Finlandia (número de licencia ESAVI/11895/2019). Se inyectaron en el flanco derecho ratones BALB/c hembra inmunocompetentes de 4 a 6 semanas de edad, adquiridos de Envigo (Venray, Países Bajos), con 500.000 células CT26. En cuanto a los tumores MC38, se inyectaron en el flanco derecho ratones C57BL/6 adquiridos de Envigo (Venray, Países Bajos) con 500.000 células. Todos los ratones se mantuvieron con una dieta estándar para roedores, disponible ad libitum. Los animales recibieron alimento en pellets seco (Envigo; Catálogo No. 2018S) a menos que se especifique lo contrario. El alimento y el agua estuvieron siempre disponibles durante los experimentos. El volumen tumoral se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Se realizó una aleatorización completa el día del tratamiento. Los detalles sobre el programa de tratamiento se pueden encontrar en las leyendas de las figuras. La dosis viral utilizada fue de 1 × 109 vp/tumor complejada con 20 µg de un solo péptido. Se midieron los tumores con un calibrador y se sacrificaron los ratones cuando se cumplió el punto final ético.

Para los ajustes profilácticos, se entrenaron los ratones inyectando dos administraciones I.P. de 1 mg de WPG (Invivogen, Cat# tlrl-wgp) 7 y 4 días antes de la implantación del tumor. Para los ajustes terapéuticos, primero se implantaron los tumores en los ratones y luego, 4 y 7 días después de la implantación del tumor, se inyectaron dos administraciones de 1 mg de WPG (Invivogen, Cat# tlrl-wgp) I.P.

Para los experimentos de transferencia adoptiva, se aislaron macrófagos y células NK de los esplenocitos de ratones donantes. Primero, se enriquecieron las células CD11b+ utilizando cuentas magnéticas CD11b (BioLegend, 480109, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas) y luego se purificaron en macrófagos F4/80+ utilizando cuentas magnéticas F4/80 (BioLegend, 480169, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas). Las células NK se enriquecieron utilizando cuentas de aislamiento de NK (BioLegend, 480049, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas). Los macrófagos o las células NK purificadas se estimularon con 1 µg/ml de WPG durante 24 horas, se lavaron exhaustivamente y luego se transfirieron a los ratones receptores (1 × 106 células por ratón, I.P.).

Depleción in vivo de tipos específicos de células inmunitarias

Para la depleción de macrófagos, se administró a los ratones i.p. 200 µl de liposomas de clodronato (Liposoma, Cat# C-005) 1 día después de la implantación del tumor y luego cada cuatro días hasta el final del experimento. En cuanto a la depleción de células NK, se trató a los ratones con 50 µl de anticuerpos anti-Asialo-GM1 (anticuerpo anti-Asialo-GM1 purificado, BioLegend, Cat# 146002) un día después de la implantación del tumor y se administró cada cuatro días hasta el final del experimento. Para la depleción de ambas poblaciones inmunitarias, se trató a los ratones con ambos tratamientos 1 día después de la implantación del tumor y se administró cada cuatro días hasta el final del experimento. Para la depleción de células T CD8+, se administró a los ratones una dosis de bolo de 500 µg de anticuerpo anti-CD8 (BioXcell, Cat# BE0061) I.P. 1 día antes del primer tratamiento con PC y se mantuvo inyectando 100 µg de anticuerpo anti-CD8 I.P. cada 3 días.

Ensayo metabólico de Seahorse

Se utilizó un analizador Seahorse XFe96 (Agilent) para determinar la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en macrófagos. Los macrófagos se enriquecieron utilizando microcuentas F4/80 (BioLegend, Cat#480169). Los macrófagos purificados se transfirieron al medio base de Seahorse XF (Agilent) suplementado con glucosa (10 mM), piruvato de sodio (5 mM) y L-glutamina (5 mM) (Gibco), pH 7,4, a 37 °C. Las células se colocaron en placas de cultivo Seahorse XF96 a 0,5 × 105 o 0,8 × 105 células por pocillo y se dejaron adherir. Luego, los macrófagos se estimularon con 1 µg/ml de partículas de β-glucano total (WPG; InvivoGen, Cat#tlrl-bgp) o control PBS durante 2 horas (estimulación a corto plazo) o durante la noche (16 horas; estimulación a largo plazo).

La OCR y la ECAR se midieron utilizando un ensayo estándar de estrés mitocondrial. Los siguientes inhibidores se inyectaron secuencialmente durante el ensayo: oligomicina (1 µM), carbonilcianuro 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP; 1 µM) y una mezcla de antimicina A y rotenona (1 µM cada una). Los parámetros del ensayo fueron 3 minutos de mezcla, sin tiempo de espera y 3 minutos de medición, repetidos 3 veces en la línea de base y después de cada inyección. Después de las mediciones, se realizó la determinación de proteínas y los resultados se normalizaron con respecto al contenido total de proteínas.

Inhibición de la creatina

Los ratones recibieron una inyección I.P. de β-GPA (500 mg/kg en 100 µl de PBS) (Sigma-Adlrich, Cat#G6878) 1 día después de la implantación del tumor y se administró diariamente hasta el final del experimento.

Estimulación y tinción intracelular

La estimulación y tinción intracelular se realizaron en 2 × 106 esplenocitos murinos incubados en una placa de fondo plano de 96 pocillos con brefeldina A (Biolegend, Cat# 420601) (1:1000) y monensina A (Biolegend, Cat# 420701) (1:1000) a 37 °C durante 5 horas. Los estimulantes se añadieron a concentraciones de 2 µg para péptidos y 40 MOI para adenovirus. Después de la estimulación, las muestras se almacenaron durante la noche a 4 °C. Luego, las células se centrifugaron y los pellets se resuspendieron en bloqueador Fc murino (BioLegend, Cat# 156613) a 4 °C durante 15 minutos. Las proteínas extracelulares se tiñeron utilizando los siguientes anticuerpos: BV711 CD3 (BD Biosciences, #563123, 0,5 µl/1 millón de células), BV510 CD8 (BD Biosciences, #563068, 1 µl/1 millón de células), PE-CF594 CD4 (BD Biosciences, #562285 0,5 µl/1 millón de células), APC CD62L (eBioscience, #17-0621-81 0,5 µl/1 millón de células), AF700 CD44 (BioLegend, #103026, 1 µl/1 millón de células) y v450 CCR7 (BD Biosciences, #560805, 1 µl/1 millón de células). Después de la tinción extracelular, las células se fijaron y permeabilizaron utilizando un kit de fijación/permeabilización (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante. Luego, se tiñeron las proteínas intracelulares con BV650 TNF-α (BioLegend, #506333, 1 µl/1 millón de células), PE-Cy7 IL-2 (BioLegend, #503832, 1 µl/1 millón de células), PE IFN-γ (BioLegend, #505808, 1 µl/1 millón de células) y FITC IL-6 (BioLegend, #503806, 1 µl/1 millón de células). Finalmente, las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo Fortessa (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (versión 10.8.2).

Citometría de flujo de muestras de tumor

Se procesaron tumores de ratones a través de un tamiz celular de 70 µm (Falcon) para obtener una suspensión celular. Luego, se sembraron un millón de células en una placa de 96 pocillos de fondo en V (Sarstedt) y se tiñeron con los siguientes anticuerpos: BV711 CD3 (clon: 145-2C11, cat: 563123, BD Biosciences, 0,5 µl/1 millón de células), BV510 CD8 (clon: 53-6.7, cat: 563068, BD Biosciences, 1 µl/1 millón de células), PE-CF594 CD4 (clon: RM4-5, cat: 562285, BD Biosciences, 0,5 µl/1 millón de células), APC CD62L (clon: MEL-14, cat: 17-0621-81, eBioscience, 0,5 µl/1 millón de células), AF700 CD44 (clon: IM7, cat: 103026, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), v450 CCR7 (clon: 4B12, cat: 560805, BD Biosciences, 1 µl/1 millón de células), BV650 TNF-α (clon: MP6-XT22, cat: 506333, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), PE-Cy7 IL-2 (clon: JES6-5H4, cat: 503832, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), PE IFN-γ (clon: XMG1.2, cat: 505808, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), BV711 CD11b (clon: M1/70, cat: 101241, BioLegend, 0,5 µl/1 millón de células), FITC CD11c (clon: N418, cat: 25-0114-82, eBioscience, 0,5 µl/1 millón de células), PerCP/cy5.5H2-Kd (clon: AF6-88S, cat: 116516, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), PE CD103 (clon: 2E7, cat: 121406, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), APC PDCA (clon: 927, cat: 127015, BioLegend, 1 µl/1 millón de células), APC anti-ratón CD3 (clon: 17A2, cat: 100236, BioLegend, 0,5 µg/1 millón de células), FITC anti-ratón CD8a (clon: 53-6.7, cat: 100706, BioLegend, 1 µg/1 millón de células) y PerCP/cy5.5 anti-ratón CD107a (LAMP-1) (clon: 1D4B, cat: 121625, BioLegend, 5 µl/1 millón de células). Todas las mezclas de anticuerpos se incubaron en un volumen final de 100 µl y se utilizaron generalmente según las instrucciones del fabricante.

Entrenamiento y estimulación in vitro de células inmunitarias humanas

Se resuspendieron 100 000 monocitos purificados en un volumen de 100 µl y se dispensaron en placas de 96 pocillos de fondo plano (Corning, Nueva York, EE. UU.) y se dejaron adherir a la superficie de poliestireno durante 1 h a 37 °C. Posteriormente, se lavaron las células con solución precalentada. Luego, se incubaron los monocitos con medio de cultivo RPMI como control negativo o con 1 µg/ml de β-glucano a 37 °C durante 24 h. Después, se trataron las células con brefeldina A (1:1000) y monensina A (1:1000) a 37 °C y se estimularon con 40 unidades de adenovirus o LPS (Invivogen, Cat#, tlrl-3pelps) (10 ng/ml) durante 5 h. En cuanto a los macrófagos, se diferenciaron los monocitos en macrófagos M0 complementando el medio RPMI con 10 % de suero humano inactivado por calor durante cinco días. Para las células dendríticas (DCs), se estimularon los monocitos con GM-CSF (1000 U/ml) e IL-4 (800 U/ml) durante 4 días. Luego, se incubaron las DCs y los macrófagos con medio de cultivo RPMI como control negativo o con 1 µg/ml de β-glucano a 37 °C durante 24 h. Después, se trataron las células con brefeldina A (1:1000) y monensina A (1:1000) a 37 °C y se estimularon con 40 unidades de adenovirus o LPS (Invivogen, Cat#, tlrl-3pelps) (10 ng/ml) durante 5 h.

Inhibición metabolómica ex vivo

Primero, se entrenaron ratones Balb/c con PBS o WPG y luego se sacrificaron. Se aislaron los bazo y se procesaron a través de un tamiz celular de 70 µm (Falcon) para obtener una suspensión celular. Se aislaron las células CD11b+ utilizando cuentas magnéticas anti-CD11b (BioLegend, 480109, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas) y se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano y se dejaron adherir. Luego, se trataron las células CD11b+ con 10 nM de rapamicina (Sigma), 500 nM de ácido ascórbico (Merck, Cat# APO456787373) y 10 mM de β-GPA durante 5 días y luego se lavaron con PBS. A continuación, se estimularon las células CD11b+ con PBS o 40 unidades de adenovirus durante 5 h. Para la medición de TNF-α (BioLegend, 502909, 1 µl/1 millón de células) e IL-6 (BioLegend, 501112, 1 µl/1 millón de células), se trataron las células CD11b+ con brefeldina A (1:1000) y monensina A (1:1000) para medir los niveles mediante citometría de flujo intracelular. En cuanto a CXCL9 y CXCL10, se determinaron las concentraciones de cada citocina en el sobrenadante del cultivo celular mediante ELISA utilizando MIG/CXCL9 (ThermoFisher, Cat# 250-18-20UG) y el kit ELISA para CXCL10/IP-10 de ratón (R&D, Cat# DY466-05).

Inmunofluorescencia en macrófagos F4/80

Se procesaron tumores de ratones a través de un tamiz celular de 70 µm (Falcon) para obtener una suspensión celular. Se aislaron las células CD11b+ utilizando cuentas magnéticas anti-CD11b (BioLegend, 480109, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas) y luego se enriquecieron aún más para los macrófagos F4/80 utilizando cuentas F4/80 (Biologend, 480169, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas). Se sembraron las células de macrófagos F4/80 en placas Nunc de 8 pocillos; Lab-Tek; II Chamber Slides y se cultivaron durante 4 días. Se fijaron las células en 4 % de paraformaldehído frío y se tiñeron con el anticuerpo H3K4me3 (1:200, Diagnode, C15410003) y DAPI (1 µg/ml, Invitrogen™, P36941). Se tomaron imágenes de microscopía utilizando un sistema de imagen celular EVOS FL (Thermo Fisher Scientific).

Ensayo de transwell

Se procesaron tumores de ratones a través de un tamiz celular de 70 µm (Falcon) para obtener una suspensión de una sola célula. Se aislaron las células CD11b+ utilizando cuentas magnéticas anti-CD11b (BioLegend, 480109) y se enriquecieron aún más para los macrófagos F4/80+ utilizando cuentas F4/80 (BioLegend, 480169), las células NK utilizando el kit de aislamiento de células NK de ratón (BioLegend, 480049, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas) o las DCs utilizando el kit de aislamiento de células dendríticas de ratón (BioLegend, 480097, 10 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas).

Para los ensayos de migración de macrófagos NK de ratón, se sembraron los macrófagos F4/80+ en la cámara inferior y se estimularon con 40 unidades de adenovirus. Las células NK se etiquetaron fluorescentemente con 5 µM de tinte CellTracker™ Green CMFDA (Thermo Fisher Scientific, Cat# C2925) y se sembraron en la cámara superior de insertos de membrana de policarbonato Transwell® de 6,5 mm con un tamaño de poro de 5,0 µm (Corning). Cuando se indica, se preincubaron las células NK con 10 µg/ml de anticuerpo anti-CXCR3 de ratón (BioXcell, Cat# BE0249) antes de la migración. Después de 24 h, se cuantificaron las células NK migradas utilizando un BD LSRFortessa (BD Biosciences) con cuentas de recuento de precisión (BioLegend, Cat# 424902, 5 µl por muestra).

Para los ensayos de migración de DCs-NK de ratón, se aislaron las células NK del microambiente tumoral (TME) utilizando el kit de aislamiento de células NK (BioLegend, 480049, 5 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas), mientras que las DCs se aislaron utilizando el kit de aislamiento de células dendríticas de ratón MojoSort™ (BioLegend, 480097, 10 µl/1 millón de células de biotina, 10 µl/1 millón de células de nanocuentas). Cuando se indica, se estimularon las células NK con 1 µg/ml de WPG durante la noche y luego se lavaron con PBS. Las DCs se etiquetaron con 5 µM de tinte CellTracker™ Green CMFDA y se colocaron en la cámara superior de los insertos Transwell® (5,0 µm). Se sembraron las células NK en la cámara inferior y se estimularon con 40 unidades de adenovirus. En condiciones seleccionadas, se trataron las células NK con 10 µg/ml de anticuerpo anti-CCL5 (BioXcell, Cat# BE0449) antes de la migración. Después de 24 horas, se cuantificaron las DCs migradas mediante citometría de flujo en un BD LSRFortessa utilizando cuentas de recuento de precisión™.

ChIP-qPCR en muestras de ratón

Se realizó la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para evaluar el enriquecimiento de H3K4me3 en loci diana. Brevemente, se cruzaron 1 × 10⁷ células en cultivo con 0,75 % de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de la desactivación con 125 mM de glicina durante 5 min. Se lavaron las células dos veces en PBS frío, se recogieron por raspado, se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de lisis FA (750 µl por 1 × 10⁷ células). Se rompieron los núcleos mediante sonicación durante 15 ciclos (1 min ON y 1 min OFF) para muestras de ratón, mientras que para muestras humanas, 25 ciclos (1 min ON y 1 min OFF) para generar fragmentos de cromatina de 500-1000 pb, lo que se confirmó en un gel de agarosa al 1,5 %. Se guardaron las muestras de entrada antes de la inmunoprecipitación.

Para ChIP, se diluyeron 25 µg de proteína por reacción 1:10 en tampón RIPA y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-H3K4me3 o con anticuerpo IgG de control (1 µg de anticuerpo por 25 µg de proteína) y cuentas de proteína A/G (prebloqueadas con ADN de esperma de bacalao y BSA). Las muestras de cuentas solamente sirvieron como controles negativos. Se lavaron las cuentas secuencialmente tres veces con tampón de lavado y una vez con tampón de lavado final antes de la elución en 120 µl de tampón de elución. Se invirtieron los enlaces cruzados a 65 °C durante 4-5 h con tratamiento con RNasa A y proteinasa K. Se purificó el ADN utilizando un kit de purificación de PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

Se analizó el ADN purificado mediante PCR cuantitativa utilizando cebadores específicos para los promotores diana (por ejemplo, CXCL9, CXCL10, Slc6a8). Primero, se corrigieron los valores de Ct de las muestras inmunoprecipitadas restando el fondo de IgG. Luego, se normalizaron los datos con el ADN de entrada para tener en cuenta las diferencias en la cantidad de cromatina. El enriquecimiento se expresó como enriquecimiento en relación con las muestras de control (no entrenadas). Los cebadores se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1.

RT-qPCR

Se aislaron las células NK de los tumores de ratón utilizando el kit de aislamiento de células NK de ratón MojoSort™ (BioLegend, Cat# 480049) según las instrucciones del fabricante. Se extrajo el ARN total utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Cat# 74104) y se determinó la concentración y pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Para la síntesis de ADNc, se transcribió inversamente la muestra de ARN utilizando la transcriptasa inversa Maxima (200 U/µL; Thermo Fisher Scientific, Cat# EP0742) siguiendo el protocolo del fabricante.

Se realizó la PCR cuantitativa (qPCR) utilizando el Master Mix GoTaq® qPCR (Promega, Cat# A6002) en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems). Cada reacción se realizó en triplicado técnico con las siguientes condiciones de ciclado: 95 °C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. Se normalizaron los niveles de expresión con Gapdh y se calculó el cambio basal utilizando el método ΔΔCt en relación con los controles de células NK tratadas con PBS. Los cebadores se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1.

Generación a largo plazo de células CD8+ específicas de péptidos

Se entrenaron las PBMCs aisladas utilizando PBS o 1 µg/ml de WPG durante 24 h. Las PBMCs entrenadas se cultivaron con GM-CSF (1000 U/ml) e IL-4 (800 U/ml) durante 4 días para diferenciarlas en células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs). Para estimular las células T específicas de péptidos, se pulsaron las PBMCs con PC (10 µM de péptidos complejos con 109 partículas virales). Posteriormente, se aplicaron TNFα (10 ng/ml, Peprotech) y LPS (10 ng/ml) directamente, que se incubaron durante 4 h para generar células dendríticas semi-maduras. Después, se añadió IL-21 (60 ng/ml, Peprotech) para mejorar la expansión de las células T. Después de 10-12 días, se reestimularon las células T con PC durante 10 días adicionales. Se mantuvo la cultura alimentándola cada 2-3 días con IL-2 (50 U/ml).

Generación a corto plazo de células CD8+ específicas de péptidos

Se entrenaron las PBMCs aisladas utilizando PBS o 1 µg/ml de WPG durante 24 h. Las PBMCs entrenadas se cultivaron con GM-CSF (1000 U/ml) e IL-4 (800 U/ml) durante 4 días para diferenciarlas en células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs). Para estimular las células T específicas de péptidos, se pulsaron las PBMCs con PC (10 µM de péptidos complejos con 109 partículas virales). Posteriormente, se aplicaron TNFα (10 ng/ml, Peprotech) y LPS (10 ng/ml) directamente, que se incubaron durante 4 h para generar células dendríticas semi-maduras. Después, se añadió IL-21 (60 ng/ml, Peprotech) para mejorar la expansión de las células T. Después de 10-12 días, se reestimularon las células T con PC durante 10 días adicionales. Se mantuvo la cultura alimentándola cada 2-3 días con IL-2 (50 U/ml).

Microscopía y cuantificación

Se realizó la visualización microscópica de la muerte de los PDO con el sistema de imagen EVOS M7000 (Thermo Fisher Scientific), donde se obtuvieron imágenes de las células CD8+ marcadas con verde y la muerte celular (utilizando PI) en los canales de transmisión, proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente roja (RFP), respectivamente. Los ajustes, incluidos el brillo, el enfoque y el recuento por imagen, se establecieron manualmente, con los objetivos deseados por imagen. Después de la calibración manual, se realizó la adquisición automática de imágenes para obtener 50 imágenes por pocillo en varios canales y construir una pila Z. La adquisición automática de imágenes para este estudio incluyó la transmisión (para el producto de precipitado coloreado convencional), RFP y GFP.

Perfilado metabolómico

Las células CD11b+ obtenidas de tumores murinos se añadieron a 400 μl de disolvente de extracción frío, seguido inmediatamente de una centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se cargaron en una placa Ostro de 96 pocillos (25 mg; Waters) y se procesaron utilizando un sistema de vacío robótico. Los filtrados resultantes se transfirieron a tubos de polipropileno y se secaron por completo en un evaporador de gas nitrógeno. Los residuos secos se resuspendieron en 40 μl de disolvente de extracción, se agitaron en un vórtice durante 2 minutos y luego se transfirieron a viales de vidrio para autoinyector de HPLC. Se inyectaron dos microlitros de cada muestra en un sistema UHPLC Thermo Vanquish acoplado a un espectrómetro de masas cuádrupolo Orbitrap Q-Exactive equipado con una fuente de ionización por electrospray calentada (H-ESI) (Thermo Fisher Scientific). La separación cromatográfica se realizó utilizando una columna SeQuant ZIC-pHILIC (2,1 mm × 100 mm, tamaño de partícula de 5 μm; Merck) bajo elución en gradiente a una velocidad de flujo de 0,100 ml/min. Se utilizó una fase móvil A, compuesta por 20 mM de carbonato de hidrógeno de amonio ajustado a un pH de 9,4 con una solución de amonio al 25%, y acetonitrilo como fase móvil B en el siguiente gradiente: comenzando con 20% A y 80% B, mantenido hasta los 2 minutos, luego aumentando gradualmente la fase móvil A hasta el 80% en 17 minutos, y finalmente reduciéndola de nuevo a 20% A a los 17,1 minutos, lo que se mantuvo hasta los 24 minutos. El horno de la columna y el autoinyector se mantuvieron a 40 ° ± 3 °C y 5 ° ± 3 °C, respectivamente. La espectrometría de masas se realizó con cambio de polaridad bajo las siguientes condiciones: una resolución de 35.000; voltajes de pulverización de 4250 V (modo positivo) y 3250 V (modo negativo); gas de envoltura a 25 unidades arbitrarias; gas auxiliar a 15 unidades arbitrarias; flujo de gas de barrido de 0; temperatura del capilar a 275 °C; y un nivel de RF de la lente S de 50,0. El instrumento se operó utilizando el software Xcalibur 4.1.31.9 (Thermo Fisher Scientific), y los metabolitos se anotaron para 462 metabolitos con el software TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific) utilizando las relaciones masa/carga y los tiempos de retención de los estándares (MSMLS-1EA, Merck). Durante todo el análisis, la calidad de los datos se controló incluyendo una muestra de control de calidad (QC) de suero agrupado cada 10 inyecciones. Los datos finales se prefiltraron para los metabolitos que presentaban cromatografía deficiente, alta variación en las muestras de QC agrupadas > 20% de desviación estándar (RSD) o ruido de fondo > 20% en comparación con las muestras en blanco. Los datos se analizaron con MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/). Las variables faltantes se imputaron reemplazándolas con 1/5 de los valores mínimos positivos de cada característica. Los datos se normalizaron aún más con una transformación logarítmica de base 10 y un autoescalado. En el análisis de agrupamiento multivariante, el mapa de calor se calculó utilizando la medida de distancia euclidiana para hasta las 25 características más significativas (prueba t). Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) para visualizar los datos. Para el análisis univariante, se realizó una prueba t y un análisis de diagrama de dispersión con un cambio de 1,5 y un valor p bruto < 0,05. Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos cuantitativo (MSEA) en MetaboAnalyst 5.0 utilizando la base de datos KEGG del ratón.

Marcado de muestras para la secuenciación de ARN de una sola célula

Las células CD11b+ clasificadas se lavaron 2-3 veces con 10 ml de PBS y luego se resuspendieron en 100 μl de tampón de tinción celular (BioLegend, Cat# 420201). A continuación, se añadió 10 μl de reactivo de bloqueo TruStain FcX (BioLegend, Cat# 420510) y las células se incubaron durante 10 minutos para bloquear la unión inespecífica. A cada muestra se añadió un anticuerpo de marcaje TotalSeq-A único (BioLegend, Cat# 1603-1608, 1 μl/1 millón de células) a una concentración de 1-2 μl (o 1-2 μg por muestra) y se incubó durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. Después de esto, las células se lavaron 3-5 veces con 3 ml de tampón de tinción, se combinaron en un volumen único de 1 ml de tampón de tinción, se centrifugaron y, finalmente, se resuspendieron en PBS que contenía 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA) antes de continuar con la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq).

Secuenciación de ARN de una sola célula

La ejecución de la secuenciación de ARN de una sola célula con Chromium y la preparación de las bibliotecas se realizaron utilizando la química Dual Index de expresión génica 3' de una sola célula 10x Genomics Chromium Next GEM, con las modificaciones descritas por Stoeckius et al.22 (https://cite-seq.com/) y basadas en un protocolo actualizado disponible en www.biolegend.com/en-us/protocols/totalseq-a-antibodies-and-cell-hashing-with-10x-single-cell-3-reagent-kit-v3-3-1-protocol. Se apuntó a aproximadamente 15.000 células por carril 10x (pocillo GEM) que contenía muestras marcadas de 13 líneas celulares, que se cultivaron solas o en combinación con células NK, con pocillos GEM separados asignados para cada grupo de tratamiento. Esta configuración dio como resultado el objetivo de aproximadamente 1000-1200 células para la secuenciación de cada línea celular en monocultivo o cocultivo. Las bibliotecas de expresión génica 3' y de marcaje celular (multiplexación) se secuenciaron en un sistema Illumina NovaSeq 6000, con longitudes de lectura establecidas en 28 pb para la lectura 1, 10 pb para el índice i7, 10 pb para el índice i5 y 90 pb para la lectura 2.

Análisis de la secuenciación de ARN de una sola célula

Los datos de scRNA-seq se procesaron utilizando Seurat (v6.0) en R (v4.3.2). Para el control de calidad, las células se filtraron para excluir aquellas con < 200 o > 2500 genes detectados, > 30% de contenido de genes mitocondriales o genes expresados en menos de tres células. También se eliminaron las células con un contenido ribosómico anormalmente alto (> 50%) o un bajo recuento de UMI (< 700).

Los valores de expresión génica se normalizaron con la función NormalizeData utilizando el método LogNormalize (factor de escala = 10.000). Los genes altamente variables (HVG; n = 2000) se identificaron utilizando el método "vst" en FindVariableFeatures. Los datos se escalaron y se centraron utilizando la función ScaleData. Para controlar la heterogeneidad del ciclo celular, se calcularon las puntuaciones del ciclo celular con CellCycleScoring (marcadores G2/M y S proporcionados en Seurat) y se eliminaron durante el escalado.

La reducción de la dimensionalidad se realizó mediante el análisis de componentes principales (PCA) en los HVG. Se seleccionaron los 30 primeros componentes principales basándose en la inspección del diagrama de codo y el remuestreo de JackStraw. Para mitigar los efectos de lote entre los experimentos, aplicamos Harmony (v1.0) con los parámetros predeterminados, utilizando la identidad de la muestra como covariable.

El agrupamiento se realizó utilizando las funciones FindNeighbors y FindClusters. Para el agrupamiento global en todas las células inmunitarias, utilizamos una resolución de 0,5; para el subagrupamiento centrado en las células linfoides, se aplicó una resolución de 0,5; y para los análisis de TAM/monocitos, utilizamos 0,4. La visualización bidimensional se realizó con UMAP (RunUMAP, 30 componentes principales, configuración predeterminada).

La anotación del clúster se guió por los marcadores expresados diferencialmente (DE), identificados con la función FindAllMarkers (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, cambio de log2 > 0,8 o < -0,8, valor p ajustado < 0,05, corrección de Bonferroni). La expresión diferencial entre los grupos experimentales se realizó con la función FindMarkers utilizando los mismos umbrales. Las identidades del tipo celular se asignaron mediante una revisión manual de los DEG específicos del clúster y se confirmaron utilizando la herramienta ImmGen MyGeneSet, en lugar de herramientas de clasificación automatizadas, para garantizar anotaciones biológicamente fundamentadas.

Recolección de tejido para el cultivo de PDO y permisos éticos

Las muestras de tejido fueron obtenidas por el cirujano ya sea mediante fórceps de biopsia endoscópica o mediante una biopsia del espécimen quirúrgico. Las muestras se transportaron al laboratorio en un medio de transferencia (DMEM suplementado con un 1% de solución de penicilina-estreptomicina) y se procesaron dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. El estudio del biobanco del Proyecto Emblemático iCAN se basa en un consentimiento del biobanco y fue revisado por el Comité de Ética de HUS y se ejecuta basándose en un permiso de investigación de HUS (4.5.2023 §38 (HUS/223/2023), un permiso de datos de Findata (THL/1338/14.02.00/2022) y acuerdos de transferencia de materiales con el Biobanco de Helsinki (HBP20210170) y el Biobanco de Hematología y Registro de Finlandia (FHRB) (12.5.2022). Todas las muestras utilizadas en este estudio fueron destruidas después del análisis.

Cultivo de PDO

Las muestras de tejido se disociaron mecánicamente con una pipeta P1000, seguido, si es necesario, de una digestión enzimática de diez minutos con un medio de digestión de organoides para aumentar el rendimiento de la biomasa. Las células disociadas se lavaron 1 o 3 veces (en caso de digestión enzimática) por centrifugación (5 minutos a 4 °C, 200 g) en un medio de lavado, se resuspendieron en Matrigel (Corning, Cat# 354230) y se colocaron como domos únicos (50 μl cada uno) en una placa de 24 pocillos (1 domo/pocillo). Después de que el Matrigel se solidificara (15-30 minutos a 37 °C), se añadieron 500 μl de medio de cultivo de organoides suplementado con 1 μl/ml de inhibidor de la quinasa de la cadena de enrollamiento asociada al Rho, Y-27632, para cubrir los domos, y las placas se devolvieron a 37 °C (con 21% de O2 y 5% de CO2) y se cultivaron para su expansión. El medio de cultivo de organoides se cambió cada 7 días. Los organoides se pasaron cada 14 días (o cada 7 días si fue necesario).

Ensayos de eliminación de células T con PDO

Los PDO de CRC se cocultivaron con 100.000 células CD8+ expandidas. Las células CD8+ se inyectaron utilizando una aguja de 27 G directamente en el matrigel. Se añadió yoduro de propidio (1:1000) al cultivo para visualizar la muerte. Después de 24 horas de incubación a 37 °C, la eliminación de células se midió determinando la cantidad de LDH liberada utilizando un ensayo colorimétrico (ensayo de citotoxicidad LDH CyQUANT, Cat# C20303). La lisis específica se calculó utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de citotoxicidad = ("experimental" - "espontáneo del objetivo") / ("máximo del objetivo" - "espontáneo del objetivo") × 100%, donde "experimental" corresponde a la señal medida en una muestra tratada, "espontáneo del objetivo" corresponde a la señal medida en los PDO solos y "máximo del objetivo" corresponde a la señal medida en presencia de células tumorales lisadas con detergente.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.