VRAC coordina el equilibrio entre la absorción de nutrientes y la defensa antimicrobiana en los enterocitos frente a la inflamación.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que incluye la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), es un trastorno crónico y recurrente del tracto gastrointestinal y representa factores de riesgo clave para el cáncer colorrectal asociado a la inflamación (CAC)^[1],^[2]. Aunque la patogénesis precisa de la EII aún no está clara, se han implicado múltiples factores, incluyendo respuestas inmunitarias desreguladas, alteraciones en la microbiota intestinal, predisposición genética y factores ambientales desencadenantes. Las células epiteliales intestinales (CEI), que comprenden células madre, enterocitos, células caliciformes, células enteroendocrinas, células de Paneth y células en forma de huso, forman una barrera física y funcional que no solo separa el contenido luminal de la mucosa subyacente, sino que también regula la absorción de nutrientes y la integridad de la barrera^[3]. Una creciente cantidad de evidencia destaca el papel crítico de la disfunción del epitelio intestinal en la iniciación y progresión de la EII, sirviendo como una interfaz clave que conecta las agresiones luminales con la activación inmunitaria aberrante y la inflamación crónica^[4]–^[6]. La disfunción en la diferenciación de las CEI, las interacciones CEI-microbio o el intercambio de señales CEI-inmunitario juega un papel crítico en la patogénesis de la EII o el cáncer colorrectal^[7],^[8].

Entre los diferentes tipos de CEI, los enterocitos, que constituyen aproximadamente el 90% de las CEI, son el tipo más prominente y son responsables de la absorción de nutrientes y agua, y de la defensa antimicrobiana^[9],^[10]. Es importante destacar que los enterocitos tanto en el intestino delgado como en el colon exhiben un patrón de zonificación transcripcional y funcional espacialmente organizado a lo largo del eje cripta-superficie^[11]–^[14]. En la base de la cripta, los enterocitos expresan predominantemente genes involucrados en la defensa del huésped, como los péptidos antimicrobianos (PAM) y los transportadores de iones metálicos. A medida que las células migran hacia arriba, los enterocitos de la zona media se especializan en la absorción de aminoácidos, vitaminas y carbohidratos, mientras que los enterocitos ubicados en la superficie son principalmente responsables de la captación de lípidos^[11],^[12]. Aunque la malabsorción de nutrientes se ha relacionado estrechamente con el desarrollo y la progresión de la EII, los mecanismos moleculares que coordinan la función de los enterocitos en la absorción de nutrientes y la defensa antimicrobiana, especialmente bajo estrés inflamatorio, siguen siendo poco definidos.

Las células de mamíferos necesitan regular su volumen transportando iones y pequeños osmolitos orgánicos a través de canales iónicos y transportadores para contrarrestar la hinchazón o la contracción osmótica^[13],^[14]. El canal aniónico regulado por el volumen (VRAC) juega un papel fundamental en la restauración del volumen celular normal al mediar la salida de cloruro en respuesta a la hinchazón celular^[14]. VRAC es un canal heteromérico compuesto por subunidades de la familia de proteínas LRRC8 (LRRC8A-E), siendo LRRC8A (también denominado SWELL1) esencial y necesario para heteromerizarse con al menos otra subunidad (LRRC8B-E) para formar un canal funcional^[15],^[16]. Además de transportar Cl−, VRAC es capaz de transportar una amplia variedad de sustancias, incluyendo inositol, taurina, aminoácidos y metabolitos inmunitarios^[17]–^[21]. Es notable que la composición heteromérica específica de las subunidades de VRAC determina las distintas propiedades biofísicas y los roles fisiológicos del canal^[22],^[23]. Sirviendo como la superficie de barrera más grande del cuerpo, las CEI están constantemente expuestas a alteraciones significativas de la osmolaridad causadas por la ingesta dietética, la digestión y diversas condiciones patofisiológicas^[24],^[25]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de VRAC en la regulación de la función de las CEI y su participación en la inflamación intestinal. En este estudio, investigamos sistemáticamente la función de VRAC en las CEI utilizando una combinación de ratones con eliminación condicional específica de CEI de Lrrc8a y múltiples modelos de inflamación, incluyendo la colitis inducida por sulfato de dextrano (DSS) y ácido 2,4,6-trinitrobenzenesulfónico (TNBS), así como el modelo de cáncer asociado a la inflamación inducido por azoximetano (AOM)/DSS. Revelamos que el VRAC epitelial juega un papel crítico en la preservación de la homeostasis intestinal bajo condiciones inflamatorias. Además, la deleción de Lrrc8d, que codifica otra subunidad clave de VRAC, también agravó la colitis, lo que subraya la importancia funcional de los complejos VRAC que contienen LRRC8A/8D en las CEI. Mecánicamente, demostramos que VRAC es específicamente necesario para la maduración y zonificación de los enterocitos, como se muestra por los análisis de scRNA-seq y organoides. La deficiencia de VRAC da como resultado la reprogramación de los enterocitos hacia la defensa antimicrobiana a expensas de la absorción de nutrientes. El metabolismo del ácido retinoico fue la vía de absorción de nutrientes más afectada en las CEI deficientes en VRAC, y su suplementación alivió la inflamación. Por el contrario, la deficiencia de VRAC indujo disbiosis de la microbiota intestinal, reduciendo notablemente las especies Lactobacillus, mientras que la administración de Lactobacillus mitigó la inflamación causada por la pérdida de VRAC en las CEI. En conjunto, nuestros hallazgos identifican a VRAC como un regulador crítico que coordina la absorción de nutrientes y la defensa antimicrobiana en los enterocitos, manteniendo así la homeostasis intestinal durante la inflamación.

Resultados

La pérdida de VRAC intestinal exacerba la colitis y el cáncer colorrectal asociado a la inflamación

Para investigar el posible papel de VRAC en la homeostasis de las CEI y la inflamación intestinal, analizamos los niveles de expresión de las subunidades de VRAC en individuos sanos y pacientes con EII utilizando datos de secuenciación de ARN publicados de la base de datos GEO. Los datos demuestran que la expresión de LRRC8A, la subunidad esencial de VRAC, aumentó en el colon de los pacientes con EII en comparación con los donantes sanos (Fig. S1A, B). LRRC8D, otra subunidad clave de VRAC, también exhibió una alta expresión en relación con otros componentes de VRAC, lo que indica un posible vínculo entre VRAC y el desarrollo de la EII. Además, la inmunohistoquímica mostró una ligera mejora del tinte de LRRC8A epitelial en las biopsias de EC, y esto se acompañó de un modesto aumento de los niveles generales de proteína LRRC8A (Fig. S1C, D).

Para determinar los efectos de VRAC en las CEI y la EII, generamos ratones con eliminación específica de CEI de Lrrc8a mediante el cruce de ratones Lrrc8afl/fl con ratones transgénicos Villin1 (Vil1)-Cre^[26]. Estos ratones se denominaron en lo sucesivo ratones Lrrc8aΔIEC, mientras que los ratones Lrrc8afl/fl de la camada se utilizaron como controles WT (Fig. S2A). La pérdida de Lrrc8a en las CEI de los ratones Lrrc8aΔIEC se validó mediante qPCR y Western blot (Fig. S2B, C). El peso corporal, la ingesta de agua y el peso del bazo fueron similares entre los ratones WT y los ratones Lrrc8aΔIEC (Fig. S2D-F). Además, la deleción de LRRC8A en las CEI no tuvo un efecto significativo en el peso o el contenido de agua de las heces (Fig. S2G). La histología y los marcadores de las uniones estrechas del colon y el íleon distal tampoco mostraron alteraciones evidentes entre los ratones WT y los ratones Lrrc8aΔIEC (Fig. S2H-K). Esto sugiere que VRAC en las CEI es prescindible para la funcionalidad del epitelio intestinal en condiciones basales. Para dilucidar el posible papel de VRAC en las CEI bajo estrés inflamatorio, los ratones WT y los ratones Lrrc8aΔIEC se sometieron a colitis inducida por DSS^[27]. Es importante destacar que se observó una mayor pérdida de peso corporal y un mayor índice de actividad de la enfermedad (IAE) tras la administración de 1,5% o 2,5% de DSS en los ratones Lrrc8aΔIEC en comparación con los ratones WT (Fig. 1A, B). La longitud del colon de los ratones Lrrc8aΔIEC fue mucho más corta que la de los ratones WT tras la administración de DSS, lo que indica un mayor daño inflamatorio (Fig. 1C). Además, la letalidad en los ratones Lrrc8aΔIEC sometidos a 3% de DSS aumentó significativamente (Fig. 1D). Además, los ratones Lrrc8aΔIEC exhibieron una mayor erosión epitelial e inflamación, junto con una pronunciada reducción de las células caliciformes secretoras de moco después del tratamiento con DSS (Fig. 1E, F). Para validar aún más el papel de VRAC en la inflamación intestinal, establecimos un modelo de colitis inducida por TNBS, que imita de cerca la patología inmunitaria de la EC. Los ratones Lrrc8aΔIEC también exhibieron una longitud de colon reducida y una mayor inflamación, junto con una mayor pérdida de peso corporal (Fig. S3). En conjunto, estos hallazgos sugieren que VRAC intestinal juega un papel protector vital en el desarrollo y la progresión de la colitis.

Se ha demostrado que VRAC y la regulación del volumen celular transportan metabolitos inmunitarios específicos como cGAMP e itaconato, desempeñando así funciones clave tanto en la inmunidad innata como en la adaptativa^[28],^[29]. Por lo tanto, los ratones Lrrc8afl/fl también se cruzaron con ratones LysM-Cre o ratones CD4-Cre, para lograr la ablación condicional de Lrrc8a en las células mieloides (Lrrc8aΔLysM) o en las células T (Lrrc8aΔCD4), respectivamente (Fig. S2A). Sin embargo, los resultados demostraron que los ratones que carecían de Lrrc8a_ en las células mieloides o en las células T exhibieron una pérdida de peso, un IAE, un acortamiento del colon y características histopatológicas comparables a los de sus compañeros de camada de control tras la administración de DSS (Fig. 1G-L). Estos hallazgos enfatizan que es el VRAC epitelial intestinal, en lugar del VRAC intrínseco a las células inmunitarias, el que juega un papel crítico en la protección contra la inflamación intestinal.

La EII es un factor de riesgo bien establecido para el desarrollo del cáncer colorrectal asociado a la inflamación^[30]. Exploramos además el papel de VRAC intestinal en el desarrollo del cáncer colorrectal asociado a la inflamación utilizando AOM combinado con bajas concentraciones de DSS (1%), dado que los ratones Lrrc8aΔIEC tendían a sucumbir a la exposición al DSS. Los ratones Lrrc8aΔIEC exhibieron una pérdida de peso corporal significativamente mayor durante el tratamiento con DSS (Fig. 2A). En el día 80 posterior al tratamiento con AOM-DSS, los colones de los ratones Lrrc8aΔIEC desarrollaron una carga tumoral notablemente aumentada, incluyendo un mayor número de tumores y tamaños de tumores más grandes (Fig. 2B-D). El análisis histológico reveló una mayor extensión de la inflamación y la hiperplasia epitelial en los ratones Lrrc8aΔIEC (Fig. 2E-G). En conjunto, nuestros datos demuestran un papel crucial de VRAC intestinal en la protección del intestino contra los estímulos inflamatorios, incluyendo la colitis y el cáncer colorrectal asociado a la inflamación.

Los ratones Lrrc8aΔIEC exhibieron respuestas inflamatorias mejoradas y daño del epitelio intestinal

A continuación, realizamos un análisis de secuenciación de ARN a granel utilizando ARN de colon de ratones WT y ratones Lrrc8aΔIEC después de la administración de DSS. En los ratones Lrrc8aΔIEC, 110 genes se redujeron notablemente, mientras que 355 genes se sobreexpresaron significativamente (|log2FC| > 1; P ajustada < 0,05) (Fig. 3A). El análisis de enriquecimiento genético (GO) mediante Enrichr mostró una sobreexpresión significativa asociada con los genes de respuesta inflamatoria, la migración de neutrófilos y la respuesta antimicrobiana. Mientras que los genes involucrados en el transporte de lípidos y el transporte de iones exhibieron una reducción notable en los ratones Lrrc8aΔIEC (Fig. 3B). Los genes inflamatorios (por ejemplo, Cxcl10, Il6) aumentaron significativamente, como se confirmó mediante qPCR, en los ratones Lrrc8aΔIEC sometidos a tratamiento con DSS o AOM-DSS (Fig. 3C, E). Además, los niveles de expresión de los PAM, como las subunidades de calprotectina S100a8 y S100a9, aumentaron notablemente en los ratones Lrrc8aΔIEC (Fig. 3D). Además, se observó un aumento de la apoptosis y una reducción de la proliferación de las células epiteliales en los ratones Lrrc8aΔIEC mediante un aumento del tinte para TUNEL junto con una disminución del tinte para el marcador de proliferación Ki67, lo que demuestra una alteración de la curación intestinal (Fig. 3F). Por lo tanto, la pérdida de VRAC da como resultado respuestas inflamatorias y antimicrobianas mejoradas al tiempo que disminuye el transporte de iones y lípidos bajo estrés inflamatorio intestinal.

Dado el papel central de las disfunciones de la barrera intestinal en la inflamación intestinal, examinamos si la deficiencia de VRAC en las CEI comprometía la integridad de la barrera analizando la distribución o la expresión de la proteína de unión estrecha zonula occludens-1 (ZO-1), ocludina y claudina-2. De manera consistente, los colones de los ratones Lrrc8aΔIEC exhibieron uniones estrechas notablemente interrumpidas (Fig. 3G), lo que sugiere una barrera mucosa comprometida en los ratones Lrrc8aΔIEC. Esto se confirmó además mediante el aumento de la fluorescencia en el suero de los ratones Lrrc8aΔIEC alimentados con dextrano FITC (MW 4000), lo que indica una fuga colónica (Fig. 3H). Los datos revelan que VRAC en las CEI es crucial para mantener la barrera intestinal y proporciona una protección significativa contra la colitis y el CAC.

VRAC intestinal es específicamente necesario para la maduración y zonificación de los enterocitos

SPANISH TRANSLATION:

Para explorar el mecanismo subyacente por el cual el VRAC de las células epiteliales intestinales (IEC) protege contra la inflamación intestinal, analizamos diferentes subunidades del VRAC en las IEC utilizando datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de células epiteliales del colon humano, reportados por Smillie et al.^[31]. Los datos demuestran que LRRC8A se expresa predominantemente en enterocitos, así como en células caliciformes (Fig. 4A, B). En línea con nuestro análisis de datos GEO publicados, LRRC8A y LRRC8D fueron las subunidades primarias del VRAC en las IEC humanas (Fig. 4B). Además, la expresión de LRRC8A y LRRC8D en los enterocitos aumentó en pacientes con colitis en comparación con los donantes sanos (Fig. 4C). También inducimos colitis con DSS en ratones Lrrc8d−/− para evaluar el papel de LRRC8D en la inflamación intestinal. En comparación con los controles, los ratones Lrrc8d−/− mostraron síntomas de colitis significativamente más graves (Fig. S4A–D). Esto sugiere que, si bien LRRC8A sirve como la subunidad esencial del VRAC de las IEC, LRRC8D puede actuar como otra subunidad crítica para las funciones del VRAC de las IEC. Cabe destacar que, en comparación con los heterómeros que contienen LRRC8A combinado con LRRC8C o LRRC8E, los VRAC que contienen LRRC8A/8D exhiben una permeabilidad significativamente mayor a aniones orgánicos grandes o osmolitos no cargados^[32],^[33]. Esta propiedad biofísica única subraya la importancia de los heterómeros LRRC8A/8D en la mediación del transporte de osmolitos orgánicos y el mantenimiento de la homeostasis de las IEC, posicionándolos como reguladores críticos de la fisiología de las IEC. Sin embargo, los ratones Lrrc8d−/− mostraron un aumento en el consumo de agua que contiene DSS, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. S4E). Esta observación puede reflejar el papel esencial del VRAC en la función renal^[34]. Por lo tanto, nos centramos en el papel de LRRC8A en la regulación de la función de las IEC en el presente estudio. En ratones WT y Lrrc8aΔIEC después del desafío con DSS, la expresión de los marcadores de enterocitos maduros (Slc26a3, Alpi) disminuyó significativamente en los colones aislados de los ratones Lrrc8aΔIEC (Fig. 4D). En contraste, no hubo cambios notables en la expresión de los marcadores asociados con las células madre (Lgr5, Ephb3), las células caliciformes (Muc2, Tff3), las células de túbulos (Dclk1, Trpm5) o las células enteroendocrinas (Chga), lo que se confirmó mediante datos de qPCR y secuenciación de ARN a granel (Fig. S5A, B). Investigamos más a fondo el impacto del VRAC epitelial en la proliferación y el recambio intestinal midiendo la expresión de Ki67 en las criptas y rastreando el etiquetado con 5-Etinil-2-desoxiuridina (EdU) a las 12 y 24 horas en condiciones homeostáticas. El número de células Ki67+ en las criptas, así como la tasa de recambio epitelial, se compararon entre los ratones WT y Lrrc8aΔIEC (Fig. S5C–F), lo que sugiere que la deficiencia de LRRC8A epitelial no afecta la capacidad de las células madre intestinales ni la diferenciación general, sino que afecta específicamente la maduración y la función de los enterocitos.

También generamos células Caco-2 con deleción de LRRC8A (Caco-2ΔLRRC8A) y verificamos la pérdida de la función del VRAC mediante electrofisiología (Fig. S6A, B). Las corrientes activadas por hinchazón mostraron la inactivación dependiente del voltaje característica del VRAC en potenciales positivos, con corrientes de cola al volver a la repolarización a −80 mV, lo que refleja la recuperación de la inactivación. La pérdida de LRRC8A condujo a una marcada reducción en TEER (Fig. S6C). En paralelo, la tinción de ZO-1 reveló un aumento de la tortuosidad de las uniones y una reducción de la intensidad de la señal, lo que indica una interrupción de las uniones estrechas (Fig. S6D). Cabe destacar que la reexpresión de LRRC8A rescató parcialmente estos defectos de la barrera (Fig. S6E, F).

A lo largo del eje cripta-superficie del colon, los enterocitos (grupos C1–C5) exhiben un programa de zonificación espacialmente organizado caracterizado por la secreción de péptidos antimicrobianos (AMP) y el manejo de iones metálicos en la base de la cripta, seguido de la adquisición progresiva de funciones metabólicas y absortivas hacia la superficie luminal (Fig. 4E)^[11],^[35]. Dado que se produjo una pérdida del VRAC de las IEC, específicamente una disminución de los marcadores de enterocitos, nos vimos obligados a explorar el impacto del VRAC en la zonificación de los enterocitos después de la exposición a DSS, utilizando conjuntos de genes de zonificación de enterocitos derivados del conjunto de datos de Moor et al.^[11]. Nuestros resultados indicaron que la ausencia del VRAC de las IEC altera la zonificación de los enterocitos, lo que provoca un cambio desde los enterocitos de la zona media-superior hacia un programa asociado a la base, caracterizado por una mayor expresión de AMP y transportadores de iones metálicos (Fig. 4E, F). Para imitar la capacidad regenerativa del tejido intestinal y su capacidad para restaurar la homeostasis después de una lesión in vitro^[36], se derivaron organoides del intestino delgado de ratones WT y Lrrc8aΔIEC. Las mediciones del área de la superficie y los recuentos de la estructura de brotes no revelaron diferencias significativas entre las muestras de organoides WT y Lrrc8aΔIEC, lo que indica que la proliferación o la complejidad de los organoides no se alteraron tras la pérdida del VRAC en las IEC (Fig. S7A, B). El análisis de inmunofluorescencia de organoides para marcadores específicos de linaje reveló una reducción significativa del marcador de enterocitos Alpi en los organoides Lrrc8aΔIEC en comparación con los controles WT, mientras que la expresión del marcador de células madre Lgr5 y el marcador de células caliciformes Muc2 permanecieron comparables entre los genotipos (Fig. 4G). La sobreexpresión de LRRC8A en los organoides suprimió la expresión de Alpi, lo que es consistente con la reducción de las corrientes de VRAC causada por la sobreexpresión de LRRC8A en las células WT^[15]. Cabe destacar que la reexpresión de LRRC8A en los organoides Lrrc8aΔIEC restauró la expresión de Alpi, como se muestra por inmunofluorescencia y qPCR (Fig. 4H). Estos resultados indican que, si bien el VRAC de las IEC no es esencial para la capacidad de las células madre, la proliferación o la asignación de linaje en los organoides intestinales, desempeña un papel específico en la promoción de la diferenciación y la identidad funcional de los enterocitos.

Además, se realizó secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) utilizando células epiteliales del colon agrupadas de 2 pares de ratones WT y Lrrc8aΔIEC a las 8 semanas de edad. Se analizaron 2787 células Lrrc8afl/fl y 4461 células Lrrc8aΔIEC. Basándose en los perfiles de expresión génica, las células se agruparon en 10 grupos distintos (grupos 1–10), que se clasificaron en seis poblaciones celulares principales según los marcadores celulares específicos conocidos^[37],^[38]. Estas poblaciones incluyen células madre, células de amplificación transitiva (TA), células secretoras/caliciformes profundas de la cripta (DCS/G), progenitores de enterocitos (EC.pro), cuatro subtipos de enterocitos (EC) y células enteroendocrinas (EEC) (Fig. 4I y Fig. S8). Al combinar los cuatro grupos de enterocitos y realizar un análisis de deconvolución utilizando el conjunto de datos de Moor et al.^[11], se demostró que la deficiencia de LRRC8A indujo un cambio en la zonificación de los enterocitos, caracterizado por una mayor expresión en los enterocitos ubicados en la base y una menor expresión en los enterocitos de la zona media a superior (Fig. 4J), lo que es consistente con nuestros datos de secuenciación de ARN a granel. Cabe destacar que el análisis de scRNA-seq reveló un aumento significativo de los enterocitos Reg3g⁺ y una marcada reducción de los enterocitos Nt5e⁺ (Fig. 4K). De manera consistente, los ensayos de captación de lípidos y glucosa en los organoides intestinales mostraron una absorción alterada en los organoides Lrrc8aΔIEC (Fig. S7C, D). Además, realizamos secuenciación metabolómica de tejidos del colon, muestras fecales y plasma de ratones en condiciones de estado estacionario y bajo condiciones inducidas por DSS (Fig. S7E). La deficiencia de VRAC indujo una remodelación global del metabolismo intestinal, con alteraciones particularmente prominentes en la composición de lípidos y ácidos biliares (Fig. S7F–H). Estos cambios metabólicos son consistentes con la marcada reducción de los enterocitos asociados a la superficie y se alinean con el programa de zonificación de enterocitos alterado.

Los ligandos de BMP desempeñan un papel central en el establecimiento de la zonificación de los enterocitos, con una señalización de BMP que aumenta desde la base de la cripta hasta la superficie luminal, y Wnt muestra el gradiente recíproco^[39],^[40]. Por lo tanto, investigamos el posible papel del VRAC en la modulación de estas vías de patrón. El análisis de qPCR de los marcadores de señalización canónica de Wnt (Axin2 y Ascl2) en los tejidos del colon de ratones tratados con DSS y en cultivos de organoides in vitro no reveló diferencias significativas entre los grupos WT y Lrrc8aΔIEC (Fig. S7I y Fig. 4L). Mientras tanto, la tinción de β-catenina en los organoides demostró niveles comparables de β-catenina total y nuclear en ambos genotipos (Fig. S7J). En contraste, la señalización de BMP, incluidos BMP2 y BMP7, se redujo en los tejidos del colon Lrrc8aΔIEC y en los organoides (Fig. S7I y Fig. 4L). Además, la suplementación con BMP2 exógeno, un ligando de BMP importante en el intestino^[35], restauró sustancialmente la expresión de Alpi en los organoides Lrrc8aΔIEC (Fig. 4M).

En conjunto, nuestros datos revelan que el VRAC de las IEC gobierna la maduración espacial de los enterocitos a través de una vía dependiente de BMP. Al dar forma a los programas de zonificación que coordinan la defensa antimicrobiana con las funciones metabólicas y absortivas, el VRAC emerge como un regulador epitelial intrínseco crítico de la homeostasis intestinal y la resistencia a las lesiones.

El VRAC protege contra la inflamación intestinal mediante la modulación del metabolismo del ácido retinoico

Para investigar más a fondo el principal trastorno de absorción de nutrientes causado por la deficiencia de VRAC de las IEC, se realizó un análisis de vías de Ingenuity (IPA) entre los ratones WT y Lrrc8aΔIEC utilizando datos de secuenciación de ARN a granel después del desafío con DSS. Cabe destacar que el análisis central de IPA reveló que 4 de las 10 vías canónicas más reguladas a la baja estaban asociadas con la señalización del ácido retinoico (RA) (Fig. 5A). El RA se sintetiza a partir del derivado de la vitamina A, el retinol, a través de un proceso de oxidación de dos pasos que implica la retinol deshidrogenasa (ADH/RDH) y la retinaldehído deshidrogenasa (ALDH)^[41]. Se ha demostrado que el RA desempeña funciones multifacéticas tanto en la función de las IEC como en la inmunidad intestinal a través de la señalización a través de los receptores de ácido retinoico (RAR) y los receptores de retinoides X (RXR) (Fig. 5B)^[42]–^[45]. Por lo tanto, se examinó el panel de enzimas involucradas en la generación de RA en los ratones WT y Lrrc8aΔIEC. Cabe destacar que la expresión de Adh1, Aldh1a1 y Aldh1a2 se redujo significativamente en las IEC deficientes en LRRC8A, mientras que Rdh7 y Cyp26a1 fueron relativamente bajos tanto en los grupos WT como en Lrrc8aΔIEC (Fig. 5C). De manera consistente, el gen sensible al RA Nos2^[46] disminuyó en las IEC de los ratones Lrrc8aΔIEC (Fig. 5C).

Como se describió anteriormente, los enterocitos desempeñan un papel dual en la absorción de nutrientes y la expresión de AMP para defenderse contra los patógenos externos. Para examinar cómo se altera la zonificación de los enterocitos en diferentes condiciones de inflamación intestinal, analizamos múltiples conjuntos de datos publicados, incluidos los modelos experimentales de colitis, la infección por Salmonella typhimurium y los modelos de infección por Citrobacter rodentium^[47]–^[49]. Durante la inflamación intestinal, la zonificación de los enterocitos experimenta un cambio distinto, marcado por una expansión de los enterocitos que expresan AMP y una disminución progresiva de los enterocitos absortivos de nutrientes a lo largo del eje cripta-superficie (Fig. S9). Estos hallazgos sugieren que los enterocitos experimentan una reprogramación defensiva a expensas de la absorción de nutrientes durante la inflamación. Para determinar si este cambio de zonificación, en particular la supresión del metabolismo del RA y la regulación al alza de los AMP de la familia Reg3, impulsa la inflamación en los ratones Lrrc8aΔIEC, evaluamos la expresión de las enzimas que sintetizan RA y los marcadores de zonificación en los días 1 y 4 después del desafío con DSS. Aunque no se detectó daño inflamatorio en estos puntos temporales (Fig. S10A, B), la expresión de los genes del metabolismo del RA y la actividad de la enzima ALDH se redujeron notablemente, mientras que los genes de la familia AMP Reg3 se regularon al alza significativamente (Fig. S10C, D).

Por lo tanto, consideramos que VRAC es crucial para el metabolismo óptimo del ácido retinoico (RA) en las células epiteliales del intestino (IEC), desempeñando un papel protector significativo contra la inflamación intestinal. Para probar esta hipótesis, se administró ácido retinoico al-trans (atRA) antes del tratamiento con DSS (Figura 5D). Los resultados demuestran que el pretratamiento con atRA alivió el aumento de la inflamación intestinal causado por la deficiencia de VRAC en las IEC, como lo indican las mejoras en la longitud del colon y las puntuaciones histológicas, y la tinción AB-PAS (Figura 5D-G). Además, los niveles de expresión de las enzimas generadoras de RA (Adh1, Aldh1a1 y Aldh1a2) y la actividad de la enzima ALDH en las IEC se restauraron a niveles comparables tanto en los ratones WT como en los ratones Lrrc8aΔIEC después de la suplementación con atRA (Figura 5H, I). Además, la expresión reducida del marcador de enterocitos maduros Alpi en los organoides Lrrc8aΔIEC se restauró mediante la suplementación con atRA (Figura 5J). El retinol, el precursor metabólico del ácido retinoico, mejoró la expresión de Alpi y la actividad de ALDH en los organoides Lrrc8aΔIEC, aunque estos efectos se atenuaron significativamente en comparación con la administración directa de atRA (Figura S10E, F), lo que sugiere una alteración en la captación de retinol en ausencia de VRAC. En conjunto, estos hallazgos demuestran que VRAC regula la zonificación de los enterocitos de forma dependiente del RA.

La deficiencia de VRAC en el epitelio intestinal altera la producción de IL-17 e IL-22 por las células Th17 y las ILC3

La inmunidad del huésped desregulada en la interfaz de la mucosa desempeña un papel fundamental en la patogénesis de la EII. A continuación, investigamos cómo la deficiencia de VRAC en el epitelio afecta a las respuestas inmunitarias de la mucosa. La citometría de flujo de la lámina propia del colon reveló un aumento de la infiltración de leucocitos CD45⁺ en los ratones Lrrc8aΔIEC, acompañado de un aumento de los números de monocitos y neutrófilos (Figura S11B). Dado el papel central de IL-17A e IL-22 en el mantenimiento de la integridad de la barrera mucosa^[50],^[51], evaluamos estas poblaciones productoras de citocinas en los ratones Lrrc8aΔIEC. Se observó una marcada reducción en las células Th17 e ILC3 IL-17A⁺/IL-22⁺ (Figura 6A-D y Figura S11A), mientras que otros subconjuntos de células T CD4⁺ y ILC permanecieron sin cambios (Figura S11C, D).

Para investigar cómo la deficiencia de VRAC en el epitelio influye en las respuestas de las células inmunitarias, realizamos experimentos in vitro utilizando sobrenadantes recogidos de las células Caco-2WT y Caco-2ΔLRRC8A. Si bien los neutrófilos respondieron de manera similar a los sobrenadantes de ambos tipos de células, los sobrenadantes derivados de los cultivos Caco-2ΔLRRC8A redujeron significativamente las frecuencias de células Th17 e ILC3 IL-17⁺ e IL-22⁺ (Figura S11E y Figura 6E, F), lo que sugiere que la pérdida de VRAC en el epitelio altera las señales derivadas del epitelio que son necesarias para mantener la inmunidad de la mucosa mediada por IL-17A/IL-22. Dado que se ha informado que el RA desempeña múltiples funciones en la modulación de las respuestas inmunitarias intestinales^[45],^[52], a continuación, probamos si la suplementación con atRA podría restaurar la producción alterada de IL-17A e IL-22 en los ratones Lrrc8aΔIEC. La citometría de flujo mostró que el tratamiento con atRA restauró significativamente la proporción de células Th17 e ILC3 IL-17A/IL-22+ en la lámina propia del colon de los ratones Lrrc8aΔIEC, lo que sugiere que la suplementación con atRA puede revertir eficazmente el deterioro de la respuesta inmunitaria inducido por la deficiencia de VRAC en el epitelio (Figura 6A-D). En conjunto, estos hallazgos demuestran que el VRAC epitelial es esencial para mantener la inmunidad de la mucosa mediada por IL-17A/IL-22, y su pérdida conduce a una ruptura en la coordinación epitelio-inmunitaria que exacerba la inflamación intestinal.

La deficiencia de VRAC impulsa la inflamación intestinal dependiente de la microbiota intestinal

Dado que la deficiencia de VRAC en las IEC da como resultado la pérdida de la capacidad de absorción de nutrientes en los enterocitos, junto con la expansión de los enterocitos que expresan AMP en la región de la base de las criptas, hipotetizamos que estos enterocitos productores de AMP podrían interactuar con las comunidades microbianas para sustentar la mayor susceptibilidad a la colitis observada en los ratones Lrrc8aΔIEC. Para abordar esto, los ratones WT y Lrrc8aΔIEC se alojaron juntos durante cuatro semanas antes del tratamiento con DSS. El alojamiento conjunto (CH) eliminó las diferencias en la gravedad de la colitis inducida por DSS entre los ratones WT y Lrrc8aΔIEC (Figura 7A-D), lo que sugiere que la transferencia de microbios de los ratones WT mitiga parcialmente el fenotipo de la colitis en los ratones Lrrc8aΔIEC. Para investigar más a fondo el papel de la microbiota intestinal en la exacerbación de la deficiencia de VRAC intestinal en la colitis, se administró un cóctel de antibióticos (ABX) durante una semana para agotar la microbiota intestinal, seguido de tratamiento con DSS. El tratamiento con ABX abolió la diferencia en la gravedad de la colitis entre los ratones WT y Lrrc8aΔIEC (Figura S12A-D). La transferencia de microbiota fecal de los ratones Lrrc8aΔIEC a ratones receptores pretratados con antibióticos desarrolló una colitis notablemente más grave después del tratamiento con DSS (Figura 7E-H). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la mayor susceptibilidad a la colitis en los ratones Lrrc8aΔIEC es dependiente de la microbiota. A continuación, realizamos el secuenciamiento del rRNA 16S en muestras fecales de contrapartes de ratones WT y Lrrc8aΔIEC después de la administración de DSS en presencia o ausencia de atRA. En particular, se observó una disminución significativa tanto en la diversidad microbiana (índice de Shannon) como en la riqueza de especies (índice de Chao1) en los ratones Lrrc8aΔIEC (Figura 7I, J). Además, la diversidad β entre los grupos reveló una agrupación distinta de los ratones de control y Lrrc8aΔIEC en un análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en la disimilitud de Bray-Curtis (Figura 7K). Además, la suplementación con RA en los ratones WT y Lrrc8aΔIEC mejoró significativamente la diversidad microbiana a niveles comparables en ambos genotipos (Figura 7I-K). Para identificar los posibles microbios beneficiosos responsables de la exacerbación de la inflamación intestinal en los ratones Lrrc8aΔIEC, se calculó el porcentaje de taxones bacterianos y se realizó un análisis discriminante lineal de tamaño del efecto (LEfSe) para identificar las características distintivas de la microbiota intestinal. Significativamente, los ratones Lrrc8aΔIEC mostraron una notable reducción de Lactobacillus tanto a nivel de género como de especie (Figura 7L, M), que se sabe que desempeña un papel beneficioso en la inflamación intestinal^[53]. En particular, la suplementación con RA aumentó notablemente la abundancia de Lactobacillus al tiempo que redujo la expresión de AMP, incluidos Reg3b y Reg3g (Figura 7N, O). En general, nuestros datos respaldan un modelo en el que el VRAC epitelial mantiene el metabolismo del RA para mantener la identidad de los enterocitos y la homeostasis microbio-huésped, protegiendo así contra la inflamación intestinal.

La administración de Lactobacillus alivia la exacerbación de la inflamación intestinal en los ratones Lrrc8aΔIEC

Basándonos en la observación de que Lactobacillus fue la bacteria beneficiosa más abundante que faltaba en los ratones Lrrc8aΔIEC (Figura 7L, M), hipotetizamos que la suplementación con Lactobacillus podría ayudar a proteger contra la inflamación intestinal agravada causada por la deficiencia de VRAC en las IEC. Se seleccionaron dos cepas de Lactobacillus, específicamente Lactobacillus murinus (L. murinus) y Lactobacillus reuteri (L. reuteri), para este propósito (Figura S12E). En particular, la administración de cualquiera de las dos cepas alivió significativamente la inflamación intestinal inducida por la deficiencia de VRAC en las IEC, como lo demuestran las mejoras en el cambio de peso corporal, el índice de actividad de la enfermedad (DAI), la longitud del colon y las puntuaciones histológicas (Figura 8A-E y Figura S12F-I).

Para determinar si estos efectos beneficiosos implican la restauración del metabolismo del RA, examinamos la expresión de las enzimas sintetizadoras de RA. En los ratones Lrrc8aΔIEC, la suplementación con L. murinus aumentó significativamente la expresión de Adh1 y Aldh1a2 en las IEC, restaurándola a los niveles de WT (Figura 8F). Mientras tanto, la suplementación con ambas especies de Lactobacillus restauró la actividad de ALDH epitelial, normalizó la expresión de AMP tisular y recuperó las poblaciones de linfocitos IL-17A+ e IL-22+ en la lámina propia de los ratones Lrrc8aΔIEC (Figura 8F-H y Figura S12J-L). Estos resultados respaldan un modelo mecanístico coherente en el que la suplementación con Lactobacillus mejora el metabolismo del RA y restaura la zonificación de los enterocitos, mejorando así la disfunción epitelio-inmunitaria en los ratones con deficiencia de VRAC en las IEC.

En conjunto, nuestros hallazgos revelan que la pérdida de VRAC altera la maduración de los enterocitos y sesga el equilibrio hacia la defensa antimicrobiana a expensas de la absorción de nutrientes, lo que conduce a una alteración del metabolismo del RA, una disbiosis microbiana y una mayor susceptibilidad a la inflamación intestinal. En particular, estos cambios patológicos son reversibles mediante la suplementación con ácido retinoico o la intervención probiótica dirigida, lo que destaca el potencial terapéutico de restaurar las interacciones epitelio-microbiota-metabolito en la EII.

La pérdida de VRAC intestinal exacerba la colitis y el cáncer colorrectal asociado a la inflamación

Para investigar el posible papel de VRAC en la homeostasis de las IEC y la inflamación intestinal, analizamos los niveles de expresión de las subunidades de VRAC en individuos sanos y pacientes con EII utilizando datos de secuenciación de ARN publicados de la base de datos GEO. Los datos demuestran que la expresión de LRRC8A, la subunidad esencial de VRAC, aumentó en el colon de los pacientes con EII en comparación con los donantes sanos (Figura S1A, B). LRRC8D, otra subunidad clave de VRAC, también exhibió una alta expresión en relación con otros componentes de VRAC, lo que indica una posible relación entre VRAC y el desarrollo de la EII. Además, la inmunohistoquímica mostró una ligera mejora de la tinción de LRRC8A epitelial en las biopsias de CD, y esto se acompañó de un modesto aumento de los niveles generales de proteína LRRC8A (Figura S1C, D).

Para determinar los efectos de VRAC en las IEC y la EII, generamos ratones con deleción específica de Lrrc8a en las IEC cruzando ratones Lrrc8afl/fl con ratones transgénicos Villin1 (Vil1)-Cre^[26]. Estos ratones se denominaron Lrrc8aΔIEC, mientras que los ratones hermanos Lrrc8afl/fl se utilizaron como controles WT (Figura S2A). La pérdida de Lrrc8a en las IEC de los ratones Lrrc8aΔIEC se validó mediante qPCR y Western blot (Figura S2B, C). El peso corporal, la ingesta de agua y el peso del bazo fueron similares entre los ratones WT y Lrrc8aΔIEC (Figura S2D-F). Además, la deleción de LRRC8A en las IEC no tuvo un efecto significativo en el peso o el contenido de agua de las heces (Figura S2G). La histología y los marcadores de las uniones estrechas del colon y el íleon distal tampoco mostraron anomalías evidentes entre los ratones WT y Lrrc8aΔIEC (Figura S2H-K). Esto sugiere que VRAC en las IEC es prescindible para la funcionalidad del epitelio intestinal en condiciones basales. Para dilucidar el posible papel de VRAC en las IEC durante el estrés inflamatorio, los ratones WT y Lrrc8aΔIEC se sometieron a colitis inducida por DSS^[27]. En particular, se observó una mayor pérdida de peso corporal y un mayor índice de actividad de la enfermedad (DAI) tras el tratamiento con 1,5% o 2,5% de DSS en los ratones Lrrc8aΔIEC en comparación con los ratones WT (Figura 1A, B). La longitud del colon de los ratones Lrrc8aΔIEC fue mucho más corta que la de los ratones WT tras el tratamiento con DSS, lo que indica un mayor daño inflamatorio (Figura 1C). Además, la letalidad en los ratones Lrrc8aΔIEC sometidos a un 3% de DSS aumentó significativamente (Figura 1D). Además, los ratones Lrrc8aΔIEC exhibieron una mayor erosión epitelial e inflamación, junto con una pronunciada reducción de las células caliciformes secretoras de moco después del tratamiento con DSS (Figura 1E, F). Para validar aún más el papel de VRAC en la inflamación intestinal, establecimos un modelo de colitis inducida por TNBS, que imita estrechamente la patología inmunitaria de la CD. Los ratones Lrrc8aΔIEC también exhibieron una longitud de colon reducida y una mayor inflamación, junto con una mayor pérdida de peso corporal (Figura S3). En conjunto, estos hallazgos sugieren que el VRAC intestinal desempeña un papel protector vital en el desarrollo y la progresión de la colitis.

Se ha demostrado que el VRAC y la regulación del volumen celular transportan metabolitos inmunitarios específicos, como el cGAMP y el itaconato, desempeñando así funciones clave tanto en la inmunidad innata como en la adaptativa^[28],^[29]. Por lo tanto, los ratones Lrrc8afl/fl también se cruzaron con ratones LysM-Cre o ratones CD4-Cre, para lograr la ablación condicional de Lrrc8a en las células mieloides (Lrrc8aΔLysM) o en las células T (Lrrc8aΔCD4), respectivamente (Fig. S2A). Sin embargo, los resultados demuestran que los ratones que carecen de Lrrc8a en las células mieloides o en las células T exhibieron una pérdida de peso, un índice de enfermedad (DAI), un acortamiento del colon y características histopatológicas comparables a las de sus hermanos de camada de control tras la exposición a DSS (Fig. 1G–L). Estos hallazgos enfatizan que es el VRAC del epitelio intestinal, y no el VRAC intrínseco de las células inmunitarias, el que desempeña un papel fundamental en la protección contra la inflamación intestinal.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un factor de riesgo bien establecido para el desarrollo de cáncer colorrectal asociado a la inflamación^[30]. Investigamos más a fondo el papel del VRAC intestinal en el desarrollo del cáncer colorrectal asociado a la inflamación mediante el uso de AOM combinado con bajas concentraciones de DSS (1%), dado que los ratones Lrrc8aΔIEC tendían a sucumbir a la exposición a DSS. Los ratones Lrrc8aΔIEC mostraron una pérdida de peso significativamente mayor durante el tratamiento con DSS (Fig. 2A). Al día 80 después del tratamiento con AOM-DSS, los colones de los ratones Lrrc8aΔIEC desarrollaron una carga tumoral notablemente aumentada, incluyendo un mayor número de tumores y tumores de mayor tamaño (Fig. 2B–D). El análisis histológico reveló una mayor extensión de la inflamación y la hiperplasia epitelial en los ratones Lrrc8aΔIEC (Fig. 2E–G). En conjunto, nuestros datos demuestran un papel crucial del VRAC intestinal en la protección del intestino contra los estímulos inflamatorios, incluyendo la colitis y el cáncer colorrectal asociado a la inflamación.

Los ratones Lrrc8aΔIEC mostraron una respuesta inflamatoria y un daño epitelial intestinal mejorados

A continuación, realizamos un análisis de secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq) utilizando ARN de colon de ratones WT y Lrrc8aΔIEC después de la exposición a DSS. En los ratones Lrrc8aΔIEC, 110 genes se regularon a la baja de forma notable, mientras que 355 genes se regularon significativamente al alza (|log2FC| > 1; P ajustada  1; P ajustada  1; P ajustada  1; P ajustada  1; P ajustada  1; P ajustada  1; P ajustada  1; P ajustada 20) y luego se desruidieron con el método DADA2. La taxonomía se asignó mediante un clasificador de características que hizo coincidir las secuencias de alta calidad con la base de datos de referencia Greengenes, y el umbral de corte de identidad de la secuencia se estableció en 99%.

Cultivo bacteriano y colonización

Lactobacillus murinus (BNCC194688) y Lactobacillus reuteri (BNCC192190) se cultivaron en medio MRS (pH 5,7 ± 0,2) a 37 °C en una cámara anaeróbica. Las bacterias utilizadas en los experimentos con ratones se cultivaron durante la noche de forma anaeróbica a 37 °C en un medio rico y se administraron a ratones individuales mediante gavage intragástrico. Ambas cepas se conservaron a -70 °C y se inocularon en MRS a partir de cultivos almacenados en glicerol. Los ratones recibieron por gavage oral 1 × 10⁷ UFC de suspensiones de L. murinus o L. reuteri en 100 μL de PBS anaeróbico estéril diariamente durante dos semanas. En cada día de gavage, los cultivos bacterianos se lavaron y se concentraron en PBS anaeróbico hasta una concentración final de 1 × 10⁸ UFC/mL en condiciones estrictamente anaeróbicas. El éxito de la colonización se confirmó mediante análisis de PCR de Lactobacillus utilizando cebadores enumerados en la Tabla S1 complementaria.

Aislamiento de ARN y PCR en tiempo real

Se extrajo el ARN total utilizando TRIzol (Thermo Fisher). El ADNc se sintetizó utilizando el One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TransGen Biotech) según las instrucciones del fabricante, y se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech). Los datos se normalizan a β-actina y se expresan en relación con el valor medio del grupo WT, a menos que se especifique lo contrario en la leyenda de la figura. Los cebadores se enumeran en la Tabla S2 complementaria.

Perfil metabólico

Se realizaron análisis metabólicos integrales, que incluyen: (i) perfilado dirigido de tejidos cólicos (estado estacionario y postinflamación) y plasma (postinflamación); (ii) análisis no dirigido de muestras fecales postinflamatorias, realizados por Biotree Biotech. Brevemente, se homogeneizaron 25 mg de muestra sólida (tejido cólico y muestra fecal) o 100 μL de muestras líquidas, se agitaron en vórtice y se sometieron a sonicación en un baño de hielo durante 15 minutos, y luego se incubaron a -40 °C durante 1 hora. Luego, todas las muestras se centrifugaron a 13 000 × g y 4 °C durante 15 minutos, y el sobrenadante de cada muestra se transfirió a un vial de vidrio para el análisis LC-MS/MS. Los archivos de datos brutos generados por LC-MS/MS se procesaron con el software SCIEX Analyst Work Station (1.7.3), y la cuantificación de metabolitos se analizó con el software de análisis automatizado Biotree BioBud (v2.0.4). Los metabolitos detectados mediante el perfil metabólico se enumeran en los datos complementarios 1.

Análisis de inmunoblot

Las células se lisaron en tampón RIPA que contiene inhibidores de proteasas (Roche) y se determinaron las concentraciones de proteína mediante el ensayo BCA (Thermo Fisher). Se separaron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se bloquearon con 5% de BSA. Las membranas se sondearon durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-LRRC8A (como se describió anteriormente)^[29] y anti-GAPDH (CST) para la normalización, seguido de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Las señales se detectaron utilizando un kit de quimioluminiscencia (Biological Industries) y se visualizaron en un sistema Tanon 5200 Multi.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism v.10.6.0. Se compararon los datos utilizando una prueba t bilateral no pareada entre los grupos. Los campos AP-PAS positivos, la superficie del organoide, la intensidad de la fluorescencia y otras cuantificaciones de imágenes se midieron utilizando el software ImageJ. La significación entre múltiples grupos se evaluó utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Se utilizó ANOVA de dos vías con correcciones múltiples de Sidak para evaluar la significación de la curva de peso corporal y el índice de enfermedad (DAI). Para el análisis de supervivencia, se aplicaron las pruebas de Log-rank (Mantel-Cox) y Gehan-Breslow-Wilcoxon. Los datos se presentan como media ± SEM.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Recogida de muestras y declaración ética

Las muestras de colon humano se recogieron de controles sanos y pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII) en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Sun Yat-sen, con la aprobación ética del Comité de Ética de la Investigación del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Sun Yat-sen (Número de aprobación: G2023-488) y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes humanos. El diagnóstico y la clasificación de Montreal de la EII siguieron las directrices de la Organización Europea de Crohn y Colitis (ECCO) y se confirmaron después de una evaluación multidisciplinar. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica del Sur (Número de aprobación: SMUL2022-038; No. SMU2023-120-28).

Ratones

Los ratones Lrrc8afl/fl y Lrrc8d +/- se generaron en el Centro de Organismos Modelo de Shanghái, como se describió anteriormente^[29]. Los ratones Villin-Cre (No. 021504), los ratones LyzM-Cre (No. 018956) y los ratones Cd4-Cre (No. 022071) se compraron en el Laboratorio Jackson. Todos los ratones experimentales se mantuvieron en una dieta autoclavada (Catálogo No. ZYSL005; ZYSL001) a disposición. Todos los ratones se alojaron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a temperatura ambiente (20-24 °C) con una humedad del 40-60% en condiciones libres de patógenos específicos. La eutanasia se realizó por asfixia con dióxido de carbono. Se utilizaron compañeros de camada de edad y sexo similares de entre 8 y 12 semanas para los experimentos.

Cultivo celular y tratamiento

La línea celular HEK293T (CRL-3216) y la línea celular epitelial intestinal humana Caco-2 (HTB-37) se adquirieron de ATCC. La autenticación de las líneas celulares se realizó por los proveedores originales mediante el perfilado STR. Las líneas celulares se cultivaron en el medio correspondiente con un 10% de FBS (Nobimpex) y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina (Thermo Fisher). Se generaron líneas celulares Caco-2 con deleción estable de LRRC8A (Caco-2ΔLRRC8A) utilizando el sistema lenti-CRISPR v2. El sgRNA dirigido a LRRC8A se clonó en lenti-CRISPR v2 y se produjo lentivirus en células HEK293T. Las células Caco-2 se transfectaron y se seleccionaron con puromicina (2 μg/mL) durante 2 días para obtener líneas celulares Caco-2ΔLRRC8A estables. Las secuencias de sgRNA utilizadas son las siguientes: sentido: CACCGCCGGCACCAGTACAACTACG; reverso: AAACCGTAGTTGTACTGGTGCCGGC.

Electrofisiología

Los experimentos de registro de corriente con pinza de voltaje de célula entera se realizaron en la configuración estándar de célula entera a temperatura ambiente utilizando un amplificador de pinza de parche MultiClamp 700B/digitalizador Digidata 1550B y el software pClamp 10 (Molecular Devices), como se describió previamente^[23],^[59]. Para el registro de corrientes VRAC, la solución extracelular isotónica contenía 150 mM de NaCl, 6 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1,5 mM de CaCl2, 10 mM de glucosa y 10 mM de HEPES (el pH se ajustó a 7,4 con NaOH, 320 mOsm). Para elicitar las corrientes VRAC, las células se expusieron a una solución hipotónica que contenía 105 mM de NaCl, 6 mM de CsCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM de glucosa y 10 mM de HEPES (pH 7,4 con NaOH, 240 mOsm). Las micropipetas de parche para registrar las corrientes VRAC se llenaron con una solución que contenía 140 mM de CsCl, 1 mM de MgCl2, 5 mM de EGTA, 4 mM de Na2ATP y 10 mM de HEPES (pH 7,2 con NaOH, 290 mOsm). La inactivación dependiente del tiempo y del voltaje en potenciales de membrana superiores a +40 mV es una característica electrofisiológica característica de VRAC^[60]. La recuperación de la inactivación se facilita mediante potenciales de membrana negativos, y las corrientes de cola observadas a –80 mV reflejan la recuperación de la inactivación. Se han informado comportamientos similares de las corrientes de cola en múltiples estudios electrofisiológicos de VRAC^[61],^[62].

Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

La integridad de la barrera de monocapas de Caco-2 se evaluó mediante la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) utilizando un volt-ohmímetro (Millipore). Las células se sembraron en insertos Transwell de poliéster recubiertos con colágeno (formato de 12 pocillos; 1,13 cm²; poros de 0,4 μm; Corning) a 1 × 10⁵ células por inserto. La TEER se midió según las instrucciones del fabricante, y los valores finales (Ω·cm²) se obtuvieron restando la resistencia del inserto en blanco y multiplicando por el área de la superficie de la membrana. Cada inserto se midió por triplicado.

Colitis murina y modelo de cáncer colorrectal asociado a la inflamación (CAC) AOM-DSS

Los modelos de ratón de colitis y cáncer colorrectal asociado a la inflamación (CAC) inducidos por sulfato de dextrano (DSS) y azoximetano (AOM)-DSS, respectivamente, se establecieron utilizando el protocolo descrito previamente^[27]. En resumen, a los ratones se les administró un 1,5–2,5% de DSS en agua de bebida durante 5–7 días, seguido de agua de bebida normal hasta el final del experimento. Para el CAC, a los ratones se les administró una inyección intraperitoneal inicial de AOM (10 mg/kg), seguida de 3 ciclos de DSS. Para cada ciclo, se permitió a los ratones el acceso libre a agua de bebida suplementada con un 1% de DSS durante 5 días, seguido de 16 días de agua normal.

La colitis inducida por ácido 2,4,6-trinitrobenzenesulfónico (TNBS) se estableció sensibilizando a los ratones con 150 μL de 1% de TNBS aplicado a la piel dorsal afeitada. Siete días después, se administraron 100 μL de 2,5% de TNBS en 50% de etanol por vía rectal bajo anestesia. Después de la instilación, se mantuvo a los ratones en posición vertical durante 30 segundos para asegurar la retención.

La progresión de la enfermedad se controló diariamente mediante el peso corporal, la consistencia de las heces, el sangrado rectal y la supervivencia. El índice de actividad de la enfermedad (DAI) se calculó como la suma de las puntuaciones de consistencia de las heces y sangrado: (1) consistencia de las heces: 0 (normal), 1–2 (blanda), 3–4 (diarrea) y 5 (muerte). (2) sangre en las heces: 0 (ausencia), 1–2 (oculta), 3–4 (sangrado visible) y 5 (muerte).

Análisis histológico

Los tejidos se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche, se deshidrataron y se incluyeron en parafina. Las secciones del intestino delgado o del colon se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Para la colitis inducida por DSS, la evaluación histológica se puntuó de forma ciega (puntuación máxima de 10) en función de la hiperplasia epitelial, la infiltración de leucocitos y la formación de abscesos en las criptas.

Para el CAC inducido por AOM-DSS, las puntuaciones histológicas se evaluaron de forma similar a la colitis inducida por DSS, lo que se combinó con la inflamación, la integridad de las criptas, la ulceración y la hiperplasia. En particular, la displasia del colon se midió como se describió previamente^[63]. En resumen, la displasia se evaluó a través del grosor de las criptas y la mucosa, la presencia de células caliciformes y el índice mitótico.

Además, los tejidos incluidos en parafina se tiñeron con azul de Alcian-ácido periódico-Schiff (AB-PAS) para visualizar las células caliciformes y la mucina. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio Zeiss Axio Observer A1.

Análisis de la permeabilidad intestinal in vivo

Para evaluar la permeabilidad de la barrera epitelial, se ayunó a los ratones durante 6 horas (alimentos y agua) el día 6 después del tratamiento con DSS (2,5%). Luego, se les administró por sonda gástrica dextrano FITC (FD4000, Sigma-Aldrich) a una dosis de 60 mg/100 g de peso corporal. Tres horas después, se recogieron muestras de sangre y se midieron las concentraciones de FITC utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia (492/525 nm). Las concentraciones de FITC-dextrano se determinaron utilizando una curva estándar generada mediante diluciones seriadas.

Cultivo de organoides

Los organoides intestinales se aislaron de ratones siguiendo los procedimientos descritos previamente^[64]. En resumen, se aislaron los intestinos, se lavaron y se raspó las vellosidades. El tejido se cortó en fragmentos de 2 mm² y se lavó de 6 a 8 veces con PBS frío que contenía 1 mM de glutamina hasta que el sobrenadante estuviera claro. A continuación, las muestras intestinales se incubaron con PBS frío que contenía 5 mM de EDTA a 4 °C durante 40 minutos. Después de la incubación, la solución de EDTA se reemplazó por PBS y las muestras se agitaron vigorosamente durante 45 segundos, y la suspensión se filtró a través de un filtro de 70 μm. Las criptas enriquecidas se lavaron una vez con PBS frío y se resuspendieron en medio DMEM/F12 (Gibco). Las criptas se contaron, se sembraron con Matrigel (Corning) y medio de crecimiento de organoides IntestiCult con suplementos 1 y 2 (Stemcell). El medio se reemplazó cada 2 días. Se capturaron las imágenes de los organoides y se contó el número de yemas en los días 1, 3 y 5.

Ensayo de captación de lípidos y glucosa

Los organoides intestinales se privaron de suero durante 2 horas y luego se incubaron con 1 μg/mL de colesterol BODIPY (Cayman) o 100 μM de 2-NBDG (MCE) durante 30 minutos a 37 °C. Después de tres lavados con PBS, se adquirieron inmediatamente imágenes de campo claro y de fluorescencia utilizando microscopía confocal (505 nm/511 nm para BODIPY; 488 nm/540 nm para 2-NBDG).

Transfección lentiviral de organoides

Se utilizaron lentivirus que codifican el gen humano LRRC8A y los controles de vector vacío correspondientes para la transfección. Los organoides intestinales de ratón se disociaron en criptas individuales y se incubaron con Lenti-LRRC8A o Lenti-EV en medio de crecimiento de organoides IntestiCult (Stemcell) durante 30 minutos. Después de la centrifugación a 300 × g durante 5 minutos, el precipitado se resuspendió en Matrigel y se cultivó para establecer organoides transfectados como se describió anteriormente. Se realizaron inmunotinción y RT-qPCR 3 días después de la transfección.

Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica

Los tejidos intestinales se fijaron en 4% de PFA durante la noche a 4 °C, se crioprotegieron en sacarosa y se incluyeron en compuesto O.C.T. (Sakura). Se obtuvieron secciones criónicas (20 μm), se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 20 minutos y se bloquearon en suero de cabra al 10% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Ki67 (CST, 1:400), ZO-1 (Thermo Fisher, 1:400), ocludina (Proteintech, 1:400) o claudina-2 (Proteintech, 1:400). Se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo durante 1 hora a 37 °C en la oscuridad. La apoptosis se detectó utilizando un kit de ensayo TUNEL (CST) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secciones de tejidos colónicos humanos incluidos en parafina se cortaron a 5 μm, se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a recuperación de antígenos. Las secciones se incubaron con anti-LRRC8A (1:200), seguido de anticuerpo secundario de cabra conjugado con HRP y desarrollo de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Los anticuerpos policlonales de conejo contra LRRC8A se generaron en nuestro laboratorio, y su especificidad se confirmó mediante inmunoblot utilizando líneas celulares con deleción de LRRC8A como controles, como se describió^[15],^[22],^[32]. La intensidad de la tinción se puntuó de forma semicuantitativa como baja (+), media (++) o alta (+++), que corresponden a puntuaciones de 1, 2 y 3. La puntuación final de la inmunohistoquímica se calculó como: (+)% × 1 + (++)% × 2 + (+++)% × 3.

Las criptas intestinales aisladas se incluyeron en Matrigel en portaobjetos de cámara y se fijaron en 4% de PFA durante 15 minutos. Los organoides se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 20 minutos y se bloquearon en suero de cabra durante 1 hora. Los anticuerpos primarios contra Lgr5 (Thermo Fisher, 1:400), Alpi (Santa Cruz, 1:400), Muc2 (GeneTex, 1:400) y β-catenina (Proteintech, 1:400) se aplicaron durante la noche a 4 °C, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo durante 1 hora a 37 °C. Las muestras se montaron con medio que contenía DAPI y se visualizaron utilizando un microscopio confocal FV3000 (Olympus).

Las células Caco-2 se fijaron en 4% de PFA durante 15 minutos, se bloquearon en suero de cabra durante 1 hora y se incubaron durante la noche a 4 °C con anti-ZO-1 (Thermo Fisher, 1:400). Se aplicó anticuerpo secundario de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 durante 1 hora a 37 °C en la oscuridad.

Secuenciación masiva de ARN

Se extrajo el ARN total del tejido del colon recién aislado utilizando TRIzol (Thermo Fisher). Las bibliotecas de cDNA se secuenciaron luego utilizando el Illumina Novaseq X Plus con lecturas emparejadas de 300 pb y al menos 25 millones de lecturas por muestra por Genedenovo Biotechnology. Los genes expresados diferencialmente se determinaron con el software edgeR (versión 3.30.3).

Secuenciación de ARN de célula única

La suspensión de células epiteliales del colon se contó y se tiñó con tinte de viabilidad fijable (Thermo Fisher, 1:1000), CD45 (Thermo Fisher, 1:500) y EpCAM (Thermo Fisher, 1:500) para la clasificación de células epiteliales vivas (EpCAM+CD45−) utilizando FACSAria (BD). Las bibliotecas de secuenciación de ARN de célula única se prepararon por Genedenovo Biotechnology. Las células epiteliales del colon clasificadas se resuspendieron en 0,4% de BSA en PBS a una concentración de 2000 células/μL y se cargaron en un chip Chromium Next GEM Chip G (10x Genomics) para la encapsulación basada en gotas. La construcción de bibliotecas y la síntesis de cDNA se realizaron utilizando el kit Chromium Next GEM Single-Cell 3’ Kit v3.1 según las instrucciones del fabricante. La secuenciación se llevó a cabo en una plataforma Illumina NovaSeq con una profundidad promedio de 30 000 lecturas por célula para las bibliotecas de ARNm y 5000 lecturas por célula para las bibliotecas de HTO. Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando Cell Ranger v3.1 con el genoma de referencia mm10. El análisis posterior se realizó utilizando Seurat v3. Las células con menos de 200 o más de 6000 genes detectados, o con >12% de contenido de genes mitocondriales, se excluyeron. Los grupos de células se anotaron en función de las firmas génicas establecidas de subtipos de células epiteliales del colon, como se describe en Haber et al.^[37] y Zhang et al.^[38]. Los genes marcadores utilizados para la anotación de tipos de células se detallan en la Fig. S8.

Ensayo de EdU

Para evaluar la tasa de renovación de las células epiteliales del colon, se inyectaron por vía intraperitoneal a los ratones 5 mg/kg de peso corporal de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU, Sigma-Aldrich) 12 o 24 horas antes del análisis. Para la tinción de EdU, se recogieron secciones criónicas del íleon distal y del colon, y las células positivas para EdU se detectaron mediante el kit EdU Apollo 567 (RiboBio Technologies).

Ensayo de aldehído fluoruro

Se aislaron células epiteliales colónicas (células EpCAM+CD45− viables) y se detectó la actividad de la aldehído deshidrogenasa (ALDH) con un kit Aldefluor (Stemcell) según las instrucciones del fabricante, a una concentración de 1 × 106 células/mL con un tiempo de incubación de 30 min. El inhibidor de ALDH, dietilaminobenzaldehído (DEAB), se utilizó como control negativo para confirmar la especificidad de la actividad enzimática de ALDH. Las células se tiñeron con tinte de viabilidad fijable (Thermo Fisher, 1:1000), anti-CD45 (Thermo Fisher, 1:500) y anti-EpCAM (Thermo Fisher, 1:500) antes del análisis.

Para el análisis de la actividad de ALDH en organoides, los organoides se trataron con 30 μM de retinol a partir del día 1 después de la siembra y se mantuvieron hasta que los organoides alcanzaron la madurez. Se añadió tampón de ensayo de ALDH (300 μM) al medio completo durante 30 min a 37 °C antes de la imagen mediante microscopía confocal (488 nm/540 nm).

Aislamiento de células epiteliales intestinales y células de la lámina propia

Para aislar las células epiteliales colónicas y las células de la lámina propia, se extrajo el colon y se limpió eliminando el mesenterio, los residuos de grasa y las heces. El tejido se abrió longitudinalmente y se cortó en fragmentos de 2 a 5 mm, se incubó en PBS suplementado con 1 mM de DL-ditiotretol (DTT, Sigma-Aldrich) y 5 mM de EDTA (Corning) a 37 °C con agitación vigorosa durante 30 min, y el sobrenadante se centrifugó para obtener un sedimento de células epiteliales colónicas. El tejido restante (fracción no epitelial) se utilizó para el aislamiento de células de la lámina propia. El tejido se lavó dos veces en PBS, se picó con tijeras, se transfirió a un medio de digestión que consistía en 1 mg/mL de colagenasa (Sigma-Aldrich), 5 U/mL de DNasa I (Sigma-Aldrich), 2% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher), y se incubó a 37 °C durante 30 min. El tejido digerido se disoció mecánicamente presionándolo a través de un émbolo de una jeringa de 5 mL, se filtró a través de un tamiz celular de 70 μm y se centrifugó. El sedimento se recogió como células de la lámina propia.

Citometría de flujo de leucocitos de la lámina propia

Las células de la lámina propia aisladas de la lámina propia del colon se incubaron con anticuerpo anti-CD16/32 bloqueante (Thermo Fisher, 1:1000) y tinte de viabilidad fijable (Thermo Fisher, 1:1000) durante 30 min a 4 °C. Los leucocitos se detectaron con CD45 (30-F11), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), CD11b (M1/70), Ly6G (RB6-8C5), F4/80 (BM8), CD90.2 (53-2.1) y CD127 (A7R34) de Thermo Fisher o BD Biosciences a una concentración de 1:500 en PBS que contiene 0,1% de albúmina bovina (BSA). Para etiquetar las células linfoides innatas (ILC), se utilizaron anticuerpos de linaje conjugados con biotina de la siguiente manera: CD3e (145-2C11), CD11c (N418), TER-119 (TER-119), Ly6G (1A8), B220 (RA3-6B2) y CD11b (M1/70) de BioLegend. Para la detección intracelular de citocinas, las células se estimularon con cóctel de activación celular (BioLegend, 1:500) en medio RPMI 1640 completo a 37 °C durante 6 h. Después de la tinción superficial, las células se fijaron y permeabilizaron durante 40 min a temperatura ambiente con el conjunto de tampón de factores de transcripción (BD Biosciences). Las células fijadas se tiñeron con T-bet (O4-46), GATA3 (L50-823), RORγt (Q31-378), FoxP3 (FJK-16s), IFN gamma (XMG1.2), IL-17A (TC11-18H10) e IL-22 (Poly5164) de Thermo Fisher o BD Biosciences a una concentración de 1:100. Las células se analizaron en un citómetro de flujo BD LSRFortessa X-20 y se analizaron utilizando el software FlowJo v 10 (Treestar).

Ensayo de quimiotaxis in vitro

Los neutrófilos se aislaron de sangre periférica anticoagulada con EDTA obtenida mediante sangrado retro-orbital de ratones C57BL/6 anestesiados, se separaron utilizando un gradiente discontinuo de Percoll (72%/60%/52%) mediante centrifugación (1000 × g, 20 min) y se recogieron de la interfase del 72-60%. Los neutrófilos purificados se colocaron en el compartimento superior de la Transwell (tamaño de poro de 8 μm, Corning), y se añadió IL-8 (100 ng/mL) o sobrenadante de células Caco-2 en los pocillos inferiores debajo de la membrana de policarbonato. Después de la incubación durante 4 h, las células transmigradas en la membrana se fijaron con 4% de PFA y luego se tiñeron con una solución de cristal violeta al 0,1% (Sigma-Aldrich), se fotografiaron y se cuantificaron.

Cultivo in vitro de células T e ILC

Las células T CD4+ ingenuas se aislaron del bazo de ratones C57BL/6 (de 8 a 10 semanas de edad) mediante clasificación con cuentas magnéticas utilizando el kit de aislamiento de células T CD4+ de ratón (Vazyme), según lo descrito por los fabricantes. En resumen, los bazo se disociaron a través de un tamiz de 70 μm en tampón de FACS frío. Después de la centrifugación a 500 × g durante 5 min, se incubaron 1 × 107 células con cóctel de aislamiento CD4+ y cuentas de estreptavidina. La separación magnética produjo células T CD4+ ingenuas en la fracción no unida. Se sembraron 1 × 106 células T CD4+ ingenuas clasificadas en placas de fondo plano de 12 pocillos pretratadas con IgG de hámster y se estimularon con RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1 mM de glutamina, 55 μM de 2-mercaptoetanol y 1% de penicilina/estreptomicina. Se añadió sobrenadante de células Caco-2 en una proporción de 1:1 de RPMI 1640 al inicio del cultivo celular.

Para la inducción de células Th17, las células T ingenuas se cultivaron en presencia de TGF-β (2 ng/mL), IL-1β (50 ng/mL), IL6 (30 ng/mL), IL-23 (20 ng/mL), anti-IFN-γ (5 μg/mL), anti-CD28 (1 μg/mL) y anticuerpo anti-CD3 unido a la placa (5 μg/mL) durante 3 días. Para la inducción de ILC3, las células del bazo con depleción de células CD4+ se cultivaron con IL-23 (20 ng/mL) durante 16 h.

Experimentos de convivencia y tratamiento con antibióticos

Para los experimentos de convivencia, se colocaron dos ratones WT macho y dos ratones Lrrc8aΔIEC macho (de 4 semanas de edad) en una sola jaula durante 4 semanas. Se utilizaron un mínimo de tres jaulas para cada condición de convivencia. Después del período de convivencia, los ratones se sometieron a colitis inducida por DSS.

Para agotar la microbiota intestinal, los ratones recibieron un cóctel de antibióticos (ABX) en el agua de beber durante una semana antes del tratamiento con DSS. El ABX contenía ampicilina (1 g/L; Sigma-Aldrich), neomicina (1 g/L; Sigma-Aldrich), metronidazol (1 g/L; Sigma-Aldrich) y vancomicina (0,5 g/L; MCE). La esterilidad de las muestras fecales se confirmó mediante análisis de qPCR.

Trasplante de microbiota fecal (FMT)

Se homogeneizaron muestras fecales frescas de ratones WT y Lrrc8aΔIEC tratados con DSS en PBS estéril (200 mg/mL) en condiciones anaeróbicas. Después de la centrifugación (300 × g, 10 min, 4 °C), el sobrenadante se filtró a través de tamices celulares de 70 μm y se almacenó a -80 °C en 20% de glicerol. Los ratones receptores recibieron un tratamiento con ABX durante una semana antes del FMT. Se administró diariamente por gavage oral (200 μL/ratón) de suspensión fecal o control vehículo (PBS) 3 días antes del desafío con 2% de DSS y durante un total de 10 días consecutivos. El injerto microbiano se confirmó mediante RT-qPCR.

Secuenciación del gen del ARNr 16S y análisis de datos

Se recogieron muestras fecales de ratones vivos, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C. El ADN se extrajo utilizando el kit PowerFecal Pro DNA Kit (Qiagen) y se amplificó utilizando cebadores de la región V4 con código de barras que se dirigen al gen del ARNr 16S bacteriano y se secuenciaron utilizando un secuenciador Mi-Seq Illumina por Genedenovo Biotechnology. El análisis de la comunidad microbiana se realizó con el software QIIME2. Las lecturas emparejadas desmultiplexadas se filtraron (puntuación de calidad >20) y luego se desruidieron con el método DADA2. La taxonomía se asignó mediante un clasificador de características que hizo coincidir las secuencias de alta calidad con la base de datos de referencia Greengenes, y el umbral de corte de identidad de la secuencia se estableció en 99%.

Cultivo bacteriano y colonización

Lactobacillus murinus (BNCC194688) y Lactobacillus reuteri (BNCC192190) se cultivaron en medio MRS (pH 5,7 ± 0,2) a 37 °C en una cámara anaeróbica. Las bacterias utilizadas en los experimentos con ratones se cultivaron durante la noche de forma anaeróbica a 37 °C en un medio rico y se administraron a ratones individuales mediante gavage intragástrico. Ambas cepas se mantuvieron a -70 °C y se inocularon en MRS a partir de cultivos almacenados en glicerol. Los ratones recibieron por gavage oral 1 × 107 UFC de suspensiones de L. murinus o L. reuteri en 100 μL de PBS anaeróbico estéril diariamente durante dos semanas. En cada día de gavage, los cultivos bacterianos se lavaron y se concentraron en PBS anaeróbico hasta una concentración final de 1 × 108 UFC/mL en condiciones estrictamente anaeróbicas. El éxito de la colonización se confirmó mediante análisis de PCR de Lactobacillus utilizando cebadores enumerados en la Tabla Suplementaria S1.

Aislamiento de ARN y PCR en tiempo real

Se extrajo el ARN total utilizando TRIzol (Thermo Fisher). El ADNc se sintetizó utilizando el One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TransGen Biotech) según las instrucciones del fabricante, y se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech). Los datos se normalizan a β-actina y se expresan en relación con el valor medio del grupo WT, a menos que se especifique lo contrario en la leyenda de la figura. Los cebadores se enumeran en la Tabla Suplementaria S2.

Perfil metabólico

Se realizaron análisis metabólicos integrales, que incluyen: (i) perfilado dirigido de tejidos colónicos (estado estacionario y postinflamación) y plasma (postinflamación); (ii) análisis no dirigido de muestras fecales postinflamatorias, realizado por Biotree Biotech. Brevemente, se homogeneizaron 25 mg de muestra sólida (tejido colónico y muestra fecal) o 100 μL de muestras líquidas, se agitaron en vórtice y se sometieron a sonicación en un baño de hielo durante 15 min, y luego se incubaron a -40 °C durante 1 h. Luego, todas las muestras se centrifugaron a 13 000 × g y 4 °C durante 15 min, y el sobrenadante de cada muestra se transfirió a un vial de vidrio para el análisis de LC-MS/MS. Los archivos de datos brutos generados por LC-MS/MS se procesaron con el software SCIEX Analyst Work Station (1.7.3), y la cuantificación de metabolitos se analizó con el software de análisis automatizado Biotree BioBud (v2.0.4). Los metabolitos detectados mediante el perfil metabólico se enumeran en los Datos Suplementarios 1.

Análisis de inmunoblot

Las células se lisaron en tampón RIPA que contiene inhibidores de proteasas (Roche) y se determinaron las concentraciones de proteína mediante el ensayo BCA (Thermo Fisher). Se separaron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se bloquearon con 5% de BSA. Las membranas se sondearon durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-LRRC8A (como se describió anteriormente) ^[29] y anti-GAPDH (CST) para la normalización, seguido de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Las señales se detectaron utilizando un kit de quimioluminiscencia (Biological Industries) y se visualizaron en un sistema Tanon 5200 Multi.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism v.10.6.0. Los datos se compararon utilizando una prueba t bilateral no pareada entre grupos. Los campos AP-PAS positivos, la superficie del organoide, la intensidad de la fluorescencia y otras cuantificaciones de imágenes se midieron utilizando el software ImageJ. La significación entre múltiples grupos se evaluó utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Se utilizó ANOVA de dos vías con correcciones múltiples de Sidak para evaluar la significación de la curva de peso corporal y el índice de enfermedad (DAI). Para el análisis de supervivencia, se aplicaron las pruebas de Log-rank (Mantel-Cox) y Gehan-Breslow-Wilcoxon. Los datos se presentan como media ± SEM.

Resumen de la presentación de informes

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de presentación de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.