El análisis genómico de los receptores de las células T revela firmas inmunitarias específicas del síndrome de Lynch.

El síndrome de Lynch (SL) es una condición genética que se estima afecta a más de un millón de individuos en los Estados Unidos^[1],^[2]. Los portadores de SL heredan una variante patógena heterocigota en la línea germinal en uno de los cuatro genes de reparación de desajustes del ADN (MMR) (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2), lo que los predispone a desarrollar diferentes tipos de cáncer, comenzando a una edad temprana^[3]. El SL es la causa principal de cáncer colorrectal hereditario (CCR), lo que confiere un riesgo de por vida del 50-80%, así como un riesgo del 40-60% de cáncer de endometrio (CE), y aumenta el riesgo de desarrollar múltiples otros tipos de tumores^[4]. La deficiencia de MMR se produce cuando las células adquieren un segundo golpe somático en el alelo alternativo del gen que alberga la alteración patógena de la línea germinal. Este evento conduce a la acumulación de cientos de mutaciones somáticas, principalmente inserciones-deleciones (indels) en los loci de microsatélites (MS)^[5].

Por lo tanto, las células malignas deficientes en MMR (MMRd) producen altos niveles de neoantígenos tumores específicos (neoAg), derivados principalmente de los indels de MS, que desencadenan una respuesta inmune antitumoral a través del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH)^[6]. Sin embargo, la activación posterior de los reguladores de los puntos de control inmunitario permite que las células malignas evadan esta respuesta inmune y continúen proliferando de forma incontrolada^[7]. Muchos de estos neoAg son ampliamente compartidos entre los portadores de SL, ya que varios loci de MS codificantes tienen una alta propensión a la mutación, lo que resulta en mutaciones idénticas que ocurren en loci comunes en tumores de diferentes individuos con SL^[8]. De manera similar a los antígenos virales, estos neoAg son altamente inmunogénicos, lo que provoca la activación de las células T y la memoria inmunitaria que permite respuestas rápidas tras la reexposición^[9]. Tras la eliminación de los neoAg, las células T proliferadas sufren una contracción y continúan existiendo como una población más pequeña de células T de memoria^[10], que pueden entrar en el torrente sanguíneo y circular por todo el cuerpo^[11]. Como resultado, la diversidad y abundancia de los clonotipos de TCR en la sangre periférica reflejan el historial de exposición a antígenos del individuo.

Los TCR públicos, definidos como clonotipos compartidos entre individuos debido a la exposición recurrente a antígenos, ofrecen una ventana a la memoria inmunológica compartida^[12]. El mapeo de los TCR públicos tiene un potencial diagnóstico^[13],^[14]. La iniciativa ‘Mapa de TCR-Antígeno’ tuvo como objetivo catalogar los TCR que se unen a antígenos clínicamente relevantes en diferentes enfermedades. Como prueba de concepto, identificó los TCR específicos del citomegalovirus (CMV)^[15], un enfoque que finalmente condujo a la aprobación por la FDA de la prueba T-Detect COVID^[16]. Dada la situación única del SL como un modelo de cáncer MMRd de alto riesgo bien definido, el amplio intercambio de neoAg entre los individuos con SL en las diferentes etapas de la enfermedad y la caracterización limitada de los repertorios de TCR asociados al SL, sigue existiendo una brecha crítica en la comprensión de cómo se representan sistémicamente los clonotipos de TCR compartidos y con experiencia en antígenos.

Aquí, mostramos que el análisis de los paisajes de los receptores de células T a partir de 277 muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 102 supervivientes de cáncer MMRd con SL, 130 portadores de SL sin antecedentes de cáncer (previvientes de SL) y 45 controles sin SL ni antecedentes de cáncer. Además, realizamos secuenciación de TCR (TCRseq) en tejidos colorrectales de 3 cánceres y 11 precánceres que coinciden con sus PBMC. En conjunto, estos hallazgos revelan que los TCR asociados al cáncer circulantes pueden identificarse en la sangre periférica de los portadores de SL y proporcionan información sobre los mecanismos de la biología inmune que influyen en la susceptibilidad al cáncer en los individuos con SL.

Resultados

Características demográficas y clínicas de la cohorte de pacientes con SL

Analizamos 277 muestras de PBMC o sangre total de 102 supervivientes de SL, 130 previvientes de SL y 45 controles, recogidas en el MD Anderson Cancer Center (MDACC), la Universidad de Kansas y el Instituto Catalán de Oncología (ICO-IDIBELL, España, Tabla 1). Los supervivientes de SL tenían una edad media de 54 años (rango 26-82) y eran predominantemente mujeres (61%), mientras que los previvientes de SL tenían una edad media de 44 años (rango 18-85) con un 71% de mujeres; los controles tenían una edad media de 59 años (rango 28-76) con una distribución de género equilibrada (49% mujeres, 51% hombres). La mayoría de los supervivientes de SL portaban variantes patógenas en MSH2 (42%), seguidas de MLH1 (26%), MSH6 (21%) y PMS2 (11%). Los previvientes de SL mostraron un patrón similar: MSH2 (34%), MLH1 (23%), MSH6 (23%) y PMS2 (20%). Entre los supervivientes, 72 tenían cáncer colorrectal (CCR) y 24 tenían cáncer de endometrio (CE), con menos casos de cáncer de páncreas, urotelial, gástrico, intestino delgado, ovario y próstata. También analizamos 14 lesiones colorrectales coincidentes de portadores de SL en nuestra cohorte de PBMC/sangre total, incluyendo 11 adenomas tubulares y tres adenocarcinomas (Tabla S1). De las 14 lesiones, cuatro eran MMRd y tres eran MMR-proficientes (MMRp) mediante inmunohistoquímica (IHQ); dos lesiones presentaban una IHQ indeterminada debido a una tinción ambigua. Las cinco muestras restantes se habían agotado para la secuenciación de TCR, por lo que el estado de MMR no estaba disponible (Tabla S2).

Clonabilidad y diversidad de los TCR circulantes

Evaluamos la diversidad de las cadenas TCRβ circulantes utilizando los números de Hill, que estiman el número efectivo de clonotipos con abundancia igual; valores más altos indican una mayor diversidad. Nuestro análisis reveló que los supervivientes de SL exhibieron niveles significativamente más bajos de diversidad en comparación con los previvientes de SL (P = 0,0006, prueba de Mann-Whitney de dos colas) (mediana 97,38 vs. 191,4, respectivamente) y en comparación con los controles (P = 0,076, prueba de Mann-Whitney de dos colas, mediana de los controles: 160,2, Fig. 1A). Esta tendencia persistió cuando se utilizó el índice de clonabilidad de Simpson (SCI), que evalúa tanto el número de clonotipos como el grado de expansión clonal; un valor de SCI más cercano a 1 indica una menor diversidad, mientras que un valor más cercano a 0 indica una mayor diversidad. Los supervivientes de SL exhibieron una clonabilidad significativamente mayor en sus repertorios de TCR que los previvientes de SL (P = 0,0002, prueba de Mann-Whitney de dos colas) (mediana 0,03500 vs. 0,02200, respectivamente), y también se observó una diferencia marginalmente significativa entre los supervivientes de SL y los controles (P = 0,094, prueba de Mann-Whitney de dos colas) (mediana 0,02660, Fig. 1B). Estas diferencias probablemente reflejen una mayor frecuencia de clonotipos TCRβ grandes e hiperexpandidos en los supervivientes de SL, mientras que los previvientes de SL muestran una mayor abundancia de clonotipos raros y mínimamente expandidos (Fig. 1C).

Observamos correlaciones positivas débiles entre la edad de los individuos y el nivel de clonabilidad entre los supervivientes (correlación de Spearman, R = 0,31), los previvientes (R = 0,31) y los controles (R = 0,22, Figura S1A). Solo entre las mujeres, se observó una diferencia significativa en el SCI entre los supervivientes de SL y los previvientes de SL (mediana 0,03655 para los supervivientes de SL vs. 0,01900 para los previvientes de SL, P = 0,00022, prueba de Mann-Whitney de dos colas, Figura S1B). De manera similar, independientemente de la institución de origen de la muestra, los supervivientes de SL exhibieron repertorios más clonales que los previvientes de SL y los controles (Figura S1C). No se detectaron diferencias significativas en la diversidad de los repertorios de TCRβ entre los supervivientes de SL y los previvientes cuando se analizaron en función de los genes MMR mutados (Figura S1D). Los efectos del estado de la enfermedad y la edad se confirmaron aún más utilizando un análisis de modelo lineal generalizado (GLM), que consideró el estado de la enfermedad, la institución, el género, el gen MMR mutado y los HLA como covariables. En última instancia, solo la edad y el estado de la enfermedad se encontraron asociados estadísticamente con el SCI (Tablas S3 y S4).

Repertorios de TCRβ públicos y similitud dentro de los grupos de estado de cáncer

Primero, nos centramos en los TCRβ circulantes compartidos entre los individuos en nuestras muestras de PBMC/sangre, ya que estos eran de particular interés para nosotros. Consideramos que un TCRβ era "compartido" o "público" si estaba presente en al menos dos individuos con una coincidencia exacta de la secuencia de aminoácidos del CDR3β, los segmentos Vβ y Jβ. La mayoría de estos TCRβ públicos (un total de 1.232.112, índice de Jaccard de 0,617) fueron compartidos por los supervivientes y previvientes de SL (Fig. 2A y B). Para comprender mejor las diferencias en el intercambio de TCR entre los tres grupos, utilizamos entonces un análisis de distribución de frecuencia de rango-tamaño^[17],^[18]. Los datos mostraron que solo 3 TCR públicos (0,000539%) en la cohorte de controles fueron compartidos por el 50% de los controles. En contraste, 69 TCR públicos (0,00454%) en los previvientes de SL y 13 TCR públicos (0,00197%) en los supervivientes de SL fueron compartidos por el 50% de las muestras en cada grupo (Fig. 2C). Además, solo 4.058 TCR públicos (0,73%) fueron compartidos por la cohorte de controles, mientras que 25.731 TCR (1,69%) en los previvientes de SL y 12.231 TCR (1,85%) en los supervivientes de SL fueron compartidos por el 10% de las muestras en cada grupo, respectivamente. El valor del exponente de potencia α de la ecuación de la distribución de la ley de potencias fue de 0,307 para los controles, 0,368 para los previvientes y 0,405 para los supervivientes, lo que sugiere que los grupos de previvientes y supervivientes comparten más TCR públicos que los controles (P = 1x10−16 para ambos grupos de previvientes y supervivientes en comparación con los controles en la prueba F, Fig. 2C).

Superposición del repertorio de TCRβ entre las lesiones colorrectales y la sangre periférica

Nuestro objetivo principal fue identificar una firma de TCRβ circulante que refleje la exposición a neoAg en el tejido colorrectal, por lo que investigamos si las secuencias de TCRβ de los CCR y los precánceres eran detectables en la sangre coincidente. Realizamos una secuenciación de TCR a granel en 14 lesiones colorrectales de portadores de SL recogidas durante su colonoscopia de vigilancia de rutina (Tabla S1). El repertorio de TCRβ de cada muestra de tejido se utilizó para analizar la superposición entre los 100 clonotipos más expandidos en cada lesión y las muestras de sangre del paciente coincidente. Las figuras 3A y B muestran los 100 TCRβ más expandidos en el cáncer y los adenomas tubulares. Un total de 41 y 28 de los TCRβ más expandidos también se identificaron en la sangre coincidente, respectivamente, incluso cuando la sangre se recogió en momentos posteriores a la biopsia (Fig. 3C y Tabla S2). Algunos de estos TCRβ superpuestos mostraron una expansión media y grande en la sangre y, lo que es más importante, algunos se identificaron como TCRβ públicos compartidos por diferentes individuos con SL (Fig. 3A y B, fuente roja). En general, en promedio, el 18% de los 100 TCR más expandidos en los CCR y los precánceres estaban presentes en la sangre recogida al mismo tiempo que las lesiones. Esta superposición disminuye ligeramente a un promedio del 14% cuando las muestras de sangre se toman de 1 a 10 años después de la detección de las lesiones (Figura S1E). La figura S2 resume la superposición general de los TCRβ más expandidos derivados de la sangre entre las muestras de cáncer y adenoma tubular. Además, observamos que del 3% al 25% de los 100 TCRβ más expandidos que infiltran el tejido de cada lesión colorrectal también estaban presentes en el repertorio de TCRβ público circulante de nuestra cohorte de pacientes (Fig. 3C). Por lo tanto, nuestros hallazgos sugieren que estos TCR pueden estar dirigidos a neoAg derivados del tejido colorrectal y que las respuestas de las células T son detectables tanto en el microambiente de la lesión como en la circulación.

Anotación del repertorio de TCRβ público a los TCR específicos de la enfermedad

Para evaluar la especificidad de los TCRβ públicos circulantes, los anotamos en relación con repertorios de referencia con especificidades antigénicas conocidas (Fig. 4A). Para ello, utilizamos la base de datos McPAS-TCR, que recopila secuencias de TCR asociadas a diversas enfermedades y antígenos^[19]. De esta base de datos, extrajimos dos grupos: uno que comprende 24.884 TCR específicos de patógenos virales y otro con 2.113 TCR específicos de afecciones autoinmunes. También compilamos un grupo de 14.208 TCRβ específicos de CRC con MMRd mediante la integración de datos de secuenciación de nueve CRC con MMRd informados previamente en la literatura^[20]. Curiosamente, se anotaron más TCRβ al grupo de TCRβ residentes en los tejidos de CRC con MMRd en comparación con el grupo de patógenos virales en los supervivientes (15,5% vs. 5,3%, P = 1,56 × 10⁻¹³, prueba de chi-cuadrado), los pre-supervivientes (18,2% vs. 6,1%, P = 5,75 × 10⁻¹⁹, prueba de chi-cuadrado) y los controles (9,4% vs. 2,7%, P = 2,3 × 10⁻⁶, prueba de chi-cuadrado), a pesar de que el grupo de TCR específicos de patógenos virales contiene casi el doble de TCR en comparación con el grupo de TCR en CRC con MMRd (Fig. 4B). Además, cuando examinamos la expansión de los TCRβ asociados con CRC con MMRd en la sangre y la correlacionamos con su expansión en las muestras de tejido de CRC, los supervivientes y pre-supervivientes de LS exhiben niveles significativamente más altos de expansión en el tejido en comparación con las muestras de sangre (P < 0,0001, prueba de Mann-Whitney de dos colas, Fig. 4C). En general, estos resultados indican que los supervivientes de LS albergan TCRβ públicos específicos de CRC con MMRd con una expansión de tamaño mediano a grande en la sangre periférica, mientras que los pre-supervivientes y controles de LS muestran una expansión de tamaño mediano a pequeño.

TCRβ circulantes para distinguir a los portadores de LS de la población general

A continuación, evaluamos si una firma distinta de TCRβ públicos circulantes podría diferenciar a los portadores de LS de los controles. Se espera que la expansión promedio de esta firma de TCRβ en la sangre de una muestra determinada prediga si la muestra proviene de un portador de LS o de un control sano (estado LS vs. control).

Para identificar la firma de TCRβ asociada con LS, probamos varios métodos, incluidos los enfoques de agrupación como GLIPH, la distancia de Levenshtein y TCRdist, que tratan los TCR similares como iguales, y un método de coincidencia exacta (Datos suplementarios 1). Sin embargo, las metodologías más complejas no mostraron una mejora clara en el rendimiento en comparación con el enfoque de coincidencia exacta. Por lo tanto, para optimizar la interpretabilidad y la simplicidad de nuestro método, utilizamos el clasificador de coincidencia exacta. Para identificar el mejor conjunto de firmas de coincidencia exacta, consideramos los siguientes hiperparámetros: 1. Región de TCR: la región más óptima para usar entre CDR3aa solamente, CDR3aa más segmentos J (CDR3aa+J), CDR3aa más segmentos V (CDR3aa+V) o CDR3aa más ambos segmentos J y V (CDR3aa+J + V); 2. Umbral de la relación de presencia positiva: los clones de TCRβ deben estar presentes en un cierto porcentaje de individuos en el grupo positivo; 3. Umbral de la prueba de Fisher: un clon de TCRβ en particular debe estar significativamente enriquecido (ocurrencia) en individuos con LS en comparación con los controles, superando la prueba exacta de Fisher en un umbral determinado; 4. Umbral de la prueba de Wilcoxon: un clon de TCRβ en particular debe mostrar un aumento significativo (nivel general de expansión) en individuos con LS en comparación con los controles, según lo determinado por la prueba de Wilcoxon en un umbral determinado. Luego, asignamos aleatoriamente el 80% de las muestras a un conjunto de entrenamiento (Datos suplementarios 2) para seleccionar los mejores hiperparámetros y el 20% a un conjunto de validación. Para compensar el desequilibrio en el número de controles negativos, también incluimos 197 controles sanos de un conjunto de datos público^[21] (Datos suplementarios 3). Luego, utilizamos una estrategia de validación cruzada de eliminación de uno (LOOCV) para probar combinaciones de los cuatro hiperparámetros en el conjunto de entrenamiento: región de TCR (CDR3aa, CDR3aa+J, CDR3aa+V, CDR3aa+J + V), umbral de la relación de presencia positiva (10%, 50%, 75%), umbral de la prueba de Fisher (10⁻¹, 10⁻², 10⁻⁴, 10⁻¹⁰, 10⁻¹⁵) y umbral de la prueba de Wilcoxon (10⁻¹, 10⁻², 10⁻⁴, 10⁻¹⁰, 10⁻¹⁵, Fig. 5A). El AUROC (área bajo la curva ROC) se utilizó como métrica de rendimiento.

Descubrimos que el uso solo de la región CDR3aa para representar el TCR, requiriendo que los TCR aparezcan en al menos el 10% de los sujetos con LS y aplicando tanto el umbral de la prueba de Fisher como el de la prueba de Wilcoxon en 10⁻¹⁰ produjo el mejor rendimiento de LOOCV en el conjunto de entrenamiento (Datos suplementarios 1). Utilizando este conjunto de hiperparámetros, identificamos 13.340 TCRβ asociados con el fenotipo de LS en comparación con los controles (Datos suplementarios 4 y Figura S3). Estos TCRβ exhibieron una mayor expansión e incidencia entre los pre-supervivientes y supervivientes de LS en comparación con los controles (Fig. 5B, C). Para descartar el sobreajuste, aplicamos este conjunto de firmas de TCR al 20% restante del conjunto de validación y logramos un AUROC de 0,930, que fue ligeramente inferior, pero comparable al rendimiento en el conjunto de entrenamiento (AUROC = 0,942, Fig. 5D). En general, estos hallazgos destacan la capacidad de las firmas de TCRβ para distinguir eficazmente a los portadores de LS de la población general.

Clasificación de TCRβ circulantes para distinguir a los pre-supervivientes de LS de la población general

A continuación, investigamos si los TCRβ podrían identificar a los portadores de LS sin cáncer (pre-supervivientes). Utilizando el mismo enfoque de clasificación, probamos si el repertorio de TCRβ distinguía a los controles de los pre-supervivientes dentro de la cohorte de LS (Fig. 6A). Cuando aplicamos la misma estrategia para identificar las firmas en LS Pre-supervivientes vs. Control, la mejor precisión de clasificación de LOOCV medida por el AUROC se logró utilizando el mismo conjunto de hiperparámetros que el clasificador de portadores de LS vs. Control (región de TCR = CDR3aa, relación de presencia positiva = 10%, umbral de la prueba de Fisher = 10⁻¹⁰, umbral de la prueba de Wilcoxon = 10⁻¹⁰, Datos suplementarios 5). Bajo estos parámetros, identificamos 16.248 secuencias de TCRβ asociadas con el fenotipo de pre-superviviente de LS (Datos suplementarios 6 y Figura S4), lo que resultó en una mayor expansión e incidencia en los pre-supervivientes de LS en comparación con los controles (Fig. 6B, C). En el conjunto de datos de entrenamiento, el clasificador distinguió a los pre-supervivientes de LS de los controles con un alto rendimiento (AUROC = 0,953), lo que también se confirmó en el conjunto de datos de validación (AUROC = 0,925, Fig. 6D). También evaluamos el clasificador después de excluir el conjunto de datos público y obtuvimos un rendimiento de LOOCV razonable para los controles vs. portadores de LS (AUROC = 0,835, Figura S5A) y los controles vs. pre-supervivientes (AUROC = 0,836, Figura S5B). Estos resultados destacan la presencia de una firma de TCRβ capaz de distinguir eficazmente a los pre-supervivientes de LS de los controles.

Clasificación de TCRβ circulantes para distinguir a los supervivientes de LS de los pre-supervivientes de LS

Luego, investigamos si los supervivientes de LS podrían distinguirse de los pre-supervivientes de LS utilizando un clasificador construido a partir de los repertorios de TCRβ (Fig. 7A). Nos centramos en la región CDR3 aa al seleccionar la firma para la comparación de pre-supervivientes vs. supervivientes. La mayor precisión de clasificación medida por el AUROC se logró utilizando un clasificador que requería que los TCR estuvieran presentes en más del 10% de los supervivientes y un valor p no ajustado de 0,1 para la prueba exacta de Fisher y la prueba de Wilcoxon (Datos suplementarios 7). Con estos parámetros, identificamos un total de 581 clones de TCRβ expandidos asociados con el fenotipo observado en los supervivientes de LS (Datos suplementarios 8 y Figura S6). Estos TCR mostraron una mayor expansión clonal y una mayor incidencia en los supervivientes en comparación con los pre-supervivientes (Fig. 7C). En particular, la firma de pre-supervivientes vs. supervivientes está integrada por 581 TCR, que es un número sustancialmente menor en comparación con los otros dos grupos: controles vs. portadores de LS (13.340 clones de TCR) y controles vs. pre-supervivientes (16.248 clones de TCR), a pesar de que se definen con un umbral estadístico menos estricto (FDR = 0,1 vs. 10⁻¹⁰). El modelo predictivo derivado de esta firma logró solo un rendimiento discriminatorio moderado (AUROC = 0,732; Fig. 7D).

Las firmas de TCRβ que distinguen a los controles de los portadores de LS (pre-supervivientes y supervivientes combinados) mostraron una superposición sustancial con las firmas que distinguen a los controles de los pre-supervivientes de LS solos (12.697 de 16.248; índice de Jaccard = 0,76, Fig. 7E), mientras que solo 7 de 574 firmas (índice de Jaccard = 0,0005) que distinguen a los supervivientes de LS de los pre-supervivientes se encontraron en las firmas que distinguen a los controles de todos los portadores de LS (pre-supervivientes y supervivientes juntos). También observamos que el índice de Jaccard medio por pares fue significativamente mayor entre los pre-supervivientes y los supervivientes (0,0128 ± 0,00553) en comparación con las comparaciones de controles vs. pre-supervivientes (0,0101 ± 0,00410) y controles vs. supervivientes (0,00948 ± 0,00370) (prueba de Wilcoxon de dos colas, P < 1 × 10⁻²², Fig. S7A y S7B). Además, se observó que significativamente menos clones de TCR mostraron diferencias significativas en diferentes umbrales de valor p en la abundancia utilizando la prueba de Wilcoxon (Fig. S7C) o la incidencia utilizando la prueba de Fisher (Fig. S7D) entre los pre-supervivientes y los supervivientes. En conjunto, estas observaciones indican una mayor similitud general de los clones de TCR entre los pre-supervivientes y los supervivientes, lo que probablemente explica el rendimiento limitado del clasificador para distinguirlos. La similitud entre los repertorios de TCR sugiere que los pre-supervivientes de LS pueden haber estado expuestos a muchos de los mismos antígenos antes de que se desarrolle el tumor en los supervivientes de LS.

Validación in vitro del análisis de secuenciación de TCR

A continuación, validamos estos hallazgos utilizando ensayos inmunológicos in vitro. Aprovechamos los TCRβ públicos anotados que se clasificaron como específicos de patógenos virales en la base de datos McPAS-TCR (Fig. 4A, B) y seleccionamos para la validación un subconjunto informado previamente como específico de EBV para el epítopo BMLF1 (GLCTLVAML). Se utilizó un complejo tetrámero de péptidos de EBV para aislar las células T CD8+ específicas del antígeno mediante citometría de flujo para la secuenciación de TCR de una sola célula (Figura S8A). Las células T CD8+ específicas del tetrámero de EBV representaron el 3,56% del total de células (Figura S8B) y se compararon con los TCRβ anotados de EBV en McPAS-TCR. Un total de 47 TCRβ se superpusieron entre las células T CD8+ específicas del tetrámero de EBV y nuestra cohorte de TCRβ públicos circulantes (Datos suplementarios 9 y Figura S8C). De estos, cinco TCRβ se anotaron como específicos de EBV-BMLF1 en McPAS-TCR, lo que validó la precisión de nuestros hallazgos de anotación (destacados por flechas moradas, Figura S8D).

Validación de la especificidad neoantigénica de LS de la firma de TCR asociada a Lynch circulante

Después de refinar nuestro enfoque experimental utilizando un EBV-tetrámero, validamos nuestras firmas de fenotipo LS de TCRβ para dos péptidos neoantigénicos altamente recurrentes, RNF43 (TQLARFFPI) de dos portadores de LS (IDs SABDL106 y SABDL165) y MSH3 (FLLALWECSL) de otro portador de LS (ID SABDL166, Fig. 8A) utilizando tinción con dextrámero seguida de secuenciación emparejada de scRNA y scTCR. Previamente, demostramos que estos dos neoantígenos son inmunogénicos in vitro ^[22]. Después de la tinción, el 2,1% de las células se aislaron con éxito como células T CD3+ específicas para RNF43 activadas de un portador de LS (ID SABDL106, Fig. 8B y Figura S9A, parte superior). Esta población incluía tanto células T CD4+ como CD8+. Repetimos la tinción del neoantígeno RNF43 con la adición de la selección de CD8 en un segundo portador de LS (SABDL165, Figura S9A, parte inferior) y también incluimos un segundo neoantígeno, MSH3, de otro portador de LS (SABDL166, Figura S9B). Este enfoque refinado reveló que el 10,6% de las células T CD8⁺ eran específicas para RNF43 en un portador de LS (SABDL165, Fig. 8B y Figura S9A, parte inferior), mientras que el 6,38% de las células T CD8⁺ eran específicas para MSH3 en otro portador de LS (SABDL166, Fig. 8B y Figura S9B). La Figura S9C muestra las proyecciones UMAP correspondientes de las poblaciones de células T CD3⁺, CD4⁺ y CD8⁺ derivadas de estos conjuntos de datos de una sola célula, confirmando un agrupamiento y una anotación consistentes entre las muestras (la estrategia de selección se muestra en la Figura S10). En particular, al examinar la intersección entre la firma de TCRβ asociada a LS circulante, que se derivó del clasificador que distingue a todos los portadores de LS (supervivientes y pre-supervivientes) de los controles, y las células T CD3⁺ y CD8⁺ positivas para el dextrámero RNF43, identificamos un total de 80 secuencias de TCRβ que se superponían entre los dos conjuntos, provenientes de una célula T que exhibía un fenotipo CD3+ y CD8+ (Datos suplementarios 10 y Fig. 8C). Estos TCRβ compartidos representan aproximadamente el 6,4% del total de secuencias CDRβ únicas (n = 1249) obtenidas de las dos muestras específicas para RNF43. De la población de células T CD8⁺ específicas para MSH3, identificamos 20 TCR cuya secuencia CDR3β se superponía con la firma de TCRβ asociada a LS circulante, representando así aproximadamente el 5,2% del total de secuencias CDR3β únicas (n = 388) en esa muestra (Datos suplementarios 10 y Fig. 8D). Estos resultados proporcionan evidencia directa de que un subconjunto de las firmas de TCRβ asociadas a LS circulantes identificadas en este estudio son específicas para neoantígenos y detectables a nivel de una sola célula, validando así su relevancia para la vigilancia inmunitaria en los portadores de LS.

Validación de la especificidad para CRC de la firma de TCR asociada a LS circulante

Finalmente, examinamos la convergencia entre las firmas asociadas a LS derivadas de los portadores de LS (pre-supervivientes y supervivientes) frente a los controles (Fig. 5B, C) y el conjunto de TCR residentes en CRC con MMRd, que se compiló previamente para la anotación (Fig. 4A, B). Este conjunto de TCR residentes en CRC con MMRd se generó combinando los repertorios de TCRβ de nueve CRC con MMRd disponibles públicamente ^[20] y dos ADCAs adicionales con MMRd obtenidas de nuestra cohorte de tejidos en MD Anderson. Este análisis reveló 783 TCRβ superpuestos entre estos dos conjuntos de datos (Fig. 8E y Datos suplementarios 11). Cabe destacar que 8 de estos TCRβ superpuestos mostraron una expansión notable (frecuencia >0,5%) dentro del microambiente tumoral de las muestras de tejido de CRC con MMRd anotadas (Fig. 8F). La superposición observada entre las secuencias CDR3β asociadas a LS y las identificadas en la secuenciación de scRNA RNF43+ y los datos de CRC con MMRd apoya la noción de que la exposición frecuente a neoantígenos compartidos, como los neoepítopos derivados de RNF43, impulsa la convergencia del repertorio de TCRβ y es responsable de la vigilancia inmunitaria en los portadores de LS. En conjunto, estas observaciones sugieren que algunos TCRβ asociados con LS demuestran especificidad hacia CRC con MMRd y neoantígenos presentados por estas neoplasias.

Características demográficas y clínicas de la cohorte de pacientes con LS

Analizamos 277 muestras de PBMC o sangre total de 102 supervivientes de LS, 130 pre-supervivientes de LS y 45 controles recolectadas en el MD Anderson Cancer Center (MDACC), la Universidad de Kansas y el Instituto Catalán de Oncología (ICO-IDIBELL, España, Tabla 1). Los supervivientes de LS tenían una edad media de 54 años (rango 26-82) y eran predominantemente mujeres (61%), mientras que los pre-supervivientes de LS tenían una edad media de 44 años (rango 18-85) con un 71% de mujeres; los controles tenían una edad media de 59 años (rango 28-76) con una distribución de género equilibrada (49% mujeres, 51% hombres). La mayoría de los supervivientes de LS presentaban variantes patogénicas en MSH2 (42%), seguidas de MLH1 (26%), MSH6 (21%) y PMS2 (11%). Los pre-supervivientes de LS mostraron un patrón similar: MSH2 (34%), MLH1 (23%), MSH6 (23%) y PMS2 (20%). Entre los supervivientes, 72 tenían cáncer colorrectal (CRC) y 24 tenían cáncer de endometrio (EC), con menos casos de cáncer de páncreas, urotelial, gástrico, intestino delgado, ovario y próstata. También analizamos 14 lesiones colorrectales correspondientes de portadores de LS en nuestra cohorte de PBMC/sangre total, incluyendo 11 adenomas tubulares y tres adenocarcinomas (Tabla S1). De las 14 lesiones, cuatro eran MMRd y tres eran MMRp por inmunohistoquímica (IHQ); dos lesiones presentaban IHQ indeterminada debido a una tinción ambigua. Las cinco muestras restantes se habían agotado para la secuenciación de TCR, por lo que el estado de MMR no estaba disponible (Tabla S2).

Clonabilidad y diversidad de los TCR circulantes

Evaluamos la diversidad de las cadenas de TCRβ circulantes utilizando los números de Hill, que estiman el número efectivo de clonotipos con abundancia igual; valores más altos indican una mayor diversidad. Nuestro análisis reveló que los supervivientes de LS exhibieron niveles de diversidad significativamente menores en comparación con los pre-supervivientes de LS (P = 0,0006, prueba de Mann-Whitney de dos colas) (mediana 97,38 vs. 191,4, respectivamente) y en comparación con los controles (P = 0,076, prueba de Mann-Whitney de dos colas, mediana de los controles: 160,2, Fig. 1A). Esta tendencia persistió cuando se utilizó el índice de clonabilidad de Simpson (SCI), que evalúa tanto el número de clonotipos como su grado de expansión clonal; un valor de SCI más cercano a 1 indica una menor diversidad, mientras que un valor más cercano a 0 indica una mayor diversidad. Los supervivientes de LS exhibieron una clonabilidad significativamente mayor en sus repertorios de TCR en comparación con los pre-supervivientes de LS (P = 0,0002, prueba de Mann-Whitney de dos colas) (mediana 0,03500 vs. 0,02200, respectivamente), y también se observó una diferencia marginalmente significativa (P = 0,094, prueba de Mann-Whitney de dos colas) entre los supervivientes de LS y los controles (mediana 0,02660, Fig. 1B). Estas diferencias probablemente reflejan una mayor frecuencia de grandes clonotipos de TCRβ hiperexpansivos en los supervivientes de LS, mientras que los pre-supervivientes de LS muestran una mayor abundancia de clonotipos raros y mínimamente expandidos (Fig. 1C).

Observamos correlaciones positivas débiles entre la edad de los individuos y el nivel de clonabilidad entre los supervivientes (correlación de Spearman, R = 0,31), los pre-supervivientes (R = 0,31) y los controles (R = 0,22, Figura S1A). Solo entre las mujeres, se observó una diferencia significativa en el SCI entre los supervivientes de LS y los pre-supervivientes de LS (mediana 0,03655 para los supervivientes de LS vs. 0,01900 para los pre-supervivientes de LS, P = 0,00022, prueba de Mann-Whitney de dos colas, Figura S1B). De manera similar, independientemente de la institución de origen de la muestra, los supervivientes de LS exhibieron repertorios más clonales que los pre-supervivientes de LS y los controles (Figura S1C). No se detectaron diferencias significativas en la diversidad de los repertorios de TCRβ entre los supervivientes de LS y los pre-supervivientes cuando se analizaron en función de los genes MMR mutados (Figura S1D). Los efectos del estado de la enfermedad y la edad se confirmaron aún más utilizando un análisis de modelo lineal generalizado (GLM), que consideró el estado de la enfermedad, la institución, el género, el gen MMR mutado y los HLA como covariables. En última instancia, solo la edad y el estado de la enfermedad se encontraron asociados estadísticamente con el SCI (Tablas S3 y S4).

Repertorios de TCRβ públicos y similitud dentro de los grupos de estado de cáncer

Primero, nos centramos en los TCRβ circulantes compartidos entre los individuos en nuestras muestras de PBMC/sangre, ya que estos fueron de particular interés para nosotros. Consideramos que un TCRβ era "compartido" o "público" si estaba presente en al menos dos individuos con una coincidencia idéntica de la secuencia de aminoácidos del CDR3β, los segmentos Vβ y Jβ. La mayoría de estos TCRβ públicos (un total de 1.232.112, índice de Jaccard de 0,617) se compartieron entre los supervivientes y los pre-supervivientes de LS (Fig. 2A y B). Para comprender mejor las diferencias en el intercambio de TCR entre los tres grupos, utilizamos un análisis de distribución de frecuencia de rango-tamaño [17, 18]. Los datos mostraron que solo 3 TCR públicos (0,000539%) en la cohorte de controles se compartieron entre el 50% de los controles. En contraste, 69 TCR públicos (0,00454%) en los pre-supervivientes de LS y 13 TCR públicos (0,00197%) en los supervivientes de LS se compartieron entre el 50% de las muestras en cada grupo (Fig. 2C). Además, solo 4.058 TCR públicos (0,73%) se compartieron entre la cohorte de controles, mientras que 25.731 TCR (1,69%) en los pre-supervivientes de LS y 12.231 TCR (1,85%) en los supervivientes de LS se compartieron entre el 10% de las muestras en cada grupo, respectivamente. El valor del exponente de potencia α de la ecuación de la distribución de ley de potencias fue de 0,307 para los controles, 0,368 para los pre-supervivientes y 0,405 para los supervivientes, lo que sugiere que los grupos de pre-supervivientes y supervivientes comparten más TCR públicos que los controles (P = 1x10−16 para ambos grupos de pre-supervivientes y supervivientes en comparación con los controles en la prueba F, Fig. 2C).

Superposición del repertorio de TCRβ entre las lesiones colorrectales y la sangre periférica

Nuestro objetivo principal fue identificar una firma de TCRβ circulante que reflejara la exposición a neoantígenos en el tejido colorrectal, por lo que investigamos si las secuencias de TCRβ de CRC y pre-cánceres eran detectables en la sangre correspondiente. Realizamos una secuenciación de TCR a granel en 14 lesiones colorrectales de portadores de LS recolectadas durante su colonoscopia de vigilancia de rutina (Tabla S1). El repertorio de TCRβ de cada muestra de tejido se utilizó para analizar la superposición entre los 100 clonotipos más expandidos en cada lesión y las muestras de sangre del paciente correspondiente. Las Figuras 3A y B muestran los 100 TCRβ más expandidos en cáncer y adenomas tubulares. Un total de 41 y 28 de los TCRβ más expandidos también se identificaron en la sangre correspondiente, respectivamente, incluso cuando la sangre se recolectó en momentos posteriores después de la biopsia (Fig. 3C y Tabla S2). Algunos de estos TCRβ superpuestos mostraron una expansión media y grande en la sangre y, lo que es más importante, algunos se identificaron como TCRβ públicos compartidos por diferentes individuos con LS (Fig. 3A y B, fuente roja). En general, en promedio, el 18% de los 100 TCR más expandidos en los CRC y pre-cánceres estaban presentes en la sangre recolectada al mismo tiempo que las lesiones. Esta superposición disminuye ligeramente a un promedio del 14% cuando las muestras de sangre se toman de 1 a 10 años después de detectar las lesiones (Figura S1E). La Figura S2 resume la superposición general de los TCRβ más expandidos derivados de la sangre entre las muestras de cáncer y adenomas tubulares. Además, observamos que del 3% al 25% de los 100 TCRβ infiltrantes en el tejido más expandidos de cada lesión colorrectal también estaban presentes en el repertorio de TCRβ público circulante de nuestra cohorte de pacientes (Fig. 3C). Por lo tanto, nuestros hallazgos sugieren que estos TCR pueden estar dirigidos a neoantígenos derivados del tejido colorrectal y que las respuestas de las células T son detectables tanto en el microambiente de la lesión como en la circulación.

Anotación del repertorio de TCRβ público a TCR específicos de la enfermedad

SPANISH TRANSLATION:

Para evaluar la especificidad de los TCRβ públicos circulantes, los anotamos en relación con repertorios de referencia con especificidades antigénicas conocidas (Fig. 4A). Para ello, utilizamos la base de datos McPAS-TCR, que recopila secuencias de TCR asociadas a diversas enfermedades y antígenos^[19]. De esta base de datos, extrajimos dos grupos: uno que comprende 24.884 TCR específicos de patógenos virales y otro con 2.113 TCR específicos de enfermedades autoinmunes. También compilamos un grupo de 14.208 TCRβ específicos de CRC con MMRd mediante la integración de datos de secuenciación de nueve CRC con MMRd previamente informados en la literatura^[20]. Curiosamente, se anotaron más TCRβ al grupo de TCRβ residentes en los tejidos de CRC con MMRd en comparación con el grupo de patógenos virales en los supervivientes (15,5% vs. 5,3%, P = 1,56 × 10⁻¹³, prueba de Chi-cuadrado), los pre-supervivientes (18,2% vs. 6,1%, P = 5,75 × 10⁻¹⁹, prueba de Chi-cuadrado) y los controles (9,4% vs. 2,7%, P = 2,3 × 10⁻⁶, prueba de Chi-cuadrado), aunque el grupo de TCR específicos de patógenos virales contiene casi el doble de TCR en comparación con el grupo de TCR en CRC con MMRd (Fig. 4B). Además, cuando examinamos la expansión de los TCRβ asociados con CRC con MMRd en la sangre y la correlacionamos con su expansión en las muestras de tejido de CRC, los supervivientes y pre-supervivientes de LS mostraron niveles de expansión significativamente más altos en el tejido en comparación con las muestras de sangre (P 1 año después de la detección de la lesión. Esta superposición limitada es consistente con estudios previos que informan de una similitud del 19-25% entre los perfiles de TCR infiltrantes en tumores y circulantes ^[32]–^[34]. Nuestro estudio adopta un enfoque más completo, considerando la superposición de los segmentos Vβ y Jβ, e indica un porcentaje de superposición ligeramente menor. Además, nuestra evaluación es la primera en explorar la superposición entre los TCR infiltrantes de las pre-cánceres y los TCR circulantes de las muestras de sangre coincidentes.

Varios algoritmos analizan los repertorios de TCR para identificar asociaciones fenotípicas. Por ejemplo, ImmuneML clasifica los fenotipos en función del recuento de clones ^[35], mientras que la herramienta de análisis de células inmunitarias (iCAT) utiliza la presencia o ausencia de TCR, utilizando la prueba exacta de Fisher ^[36]. Nuestro algoritmo integra ambos enfoques, considerando el recuento de clones y la incidencia de clonotipos, e identifica con precisión las firmas que distinguen a los controles de todos los portadores de LS, pero el rendimiento es limitado para distinguir entre los pre-supervivientes y los supervivientes de LS. La vigilancia inmunitaria desempeña un papel importante en la edición de los clones premalignos antes de la iniciación del cáncer. En los portadores de LS, el MMRd conduce a la acumulación de inserciones y deleciones, lo que genera un espectro distinto pero relativamente estrecho de mutaciones. En nuestro trabajo anterior, identificamos eventos MSI frecuentes en las pre-cánceres de LS y neoantígenos compartidos entre las pre-cánceres y los cánceres. En consecuencia, las células T CD8+ ingenuas pueden encontrar estos neoantígenos al principio de la carcinogénesis, generando así repertorios de TCR que persisten durante la progresión tumoral. Esto da como resultado firmas de TCR muy similares entre los pre-supervivientes y los supervivientes de LS, lo que limita el poder discriminatorio de los clasificadores basados en TCR. En consonancia con esto, se han detectado respuestas de células T específicas para péptidos con cambio de marco en la sangre periférica de los portadores de LS libres de cáncer y aquellos con CRC asociado a LS ^[37]–^[39]. Sin embargo, la dinámica de la evolución de TCR durante la carcinogénesis y la transición de pre-superviviente a superviviente sigue sin estar clara ^[22]. Se espera que los repertorios de TCR impulsados por neoantígenos tempranos que surgen de la deficiencia de MMR estén presentes en ambos grupos, mientras que pueden producirse expansiones adicionales de TCR en los supervivientes en respuesta a los neoantígenos específicos del tumor. En nuestra cohorte, el número de supervivientes de LS (n = 102) y pre-supervivientes de LS (n = 130) es relativamente limitado. Por lo tanto, el clasificador que distingue a los supervivientes de LS de los pre-supervivientes logró un AUC de 0,991 en el conjunto de entrenamiento, pero disminuyó a 0,732 en el conjunto de validación. Esta discrepancia indica un sobreajuste, que surge con frecuencia cuando los modelos de aprendizaje automático intentan distinguir entre grupos que comparten una alta similitud biológica. En nuestro estudio anterior ^[22], encontramos que los portadores de LS pueden tener una alta carga de mutaciones somáticas, neoantígenos correspondientes de inserciones y deleciones presentes en las muestras de pre-cáncer y repertorios de TCR específicos para neoantígenos en los pre-supervivientes de LS. Estos clonotipos de TCR pueden continuar persistiendo en la circulación incluso después de que se desarrollen los tumores en los supervivientes de LS, y por lo tanto no ayudan claramente a distinguir entre los dos grupos. Si bien algunos de estos clones de TCR pueden expandirse en los tumores, la dinámica de la evolución del repertorio de TCR durante la transición de normal a pre-cáncer y luego a cáncer no se comprende bien. Una posibilidad es que surjan neoantígenos novedosos de las mutaciones impulsoras durante la transición de pre-cáncer a cáncer, lo que conduciría a TCRs tumorales específicos adicionales. Otra posibilidad es que el repertorio de TCR permanezca en gran medida sin cambios, ya sea porque las mutaciones impulsoras ya están presentes en la etapa de pre-cáncer o porque el cáncer progresa a través de la evasión inmunitaria en lugar de la generación de nuevos neoantígenos. En nuestro conjunto de datos, detectamos menos TCRs diferencialmente abundantes o incidentes entre los pre-supervivientes y los supervivientes (Fig. 7, S5C y S5D), lo que es consistente con la segunda posibilidad. Por lo tanto, nuestra capacidad limitada para clasificar estos grupos es poco probable que se deba únicamente a una limitación en el tamaño de nuestra muestra, sino más bien a la historia inmunogénica compartida que es intrínseca a los portadores de LS. Se justifica una mayor exploración utilizando cohortes más grandes y un muestreo longitudinal para aclarar la dinámica del repertorio de TCR durante las etapas tempranas de la pre-cáncer y la iniciación del cáncer.

La validación in vitro de las células T positivas para el dextrámero RNF43 y MSH3 en los portadores de LS reveló que las poblaciones de neoantígenos específicos circulantes son en gran medida CD8+ en fenotipo. Con la adición de la selección de CD8+, confirmamos las respuestas de las células T CD8+ a RNF43 y MSH3, lo que es consistente con la naturaleza recurrente e inmunogénica de estos neoantígenos en la neoplasia de LS ^[8], ^[22]. Utilizando este enfoque, identificamos 80 secuencias de TCRβ específicas para RNF43 y 20 secuencias de TCRβ específicas para MSH3 que se superponían con la firma de TCRβ asociada a LS circulante. Estos datos proporcionan evidencia directa de la presencia de células T específicas para neoantígenos circulantes en los portadores de LS y respaldan su vínculo con el repertorio de TCRβ asociado a LS. Si bien se requerirá una validación más amplia en neoantígenos adicionales e individuos con LS para definir la especificidad de este fenómeno, el aislamiento y la caracterización a gran escala de las células T específicas para neoantígenos siguen siendo técnicamente y logísticamente desafiantes en grandes cohortes de pacientes. Además, es importante aclarar que la superposición entre la firma de TCR asociada al superviviente de LS y las poblaciones positivas para RNF43 o MSH3 no se evaluó debido al número limitado de TCRβ en la firma de los supervivientes y al hecho de que tanto RNF43 como MSH3 están presentes tanto en los cánceres como en las pre-cánceres, lo que lleva a TCR que lo reconocen en ambos, pre-supervivientes y supervivientes de LS. Además, nuestra validación se centró en las lesiones colorrectales, lo que podría limitar la aplicabilidad a otros cánceres. Sin embargo, las similitudes inmunogénicas entre el cáncer colorrectal y el cáncer de endometrio ^[8] sugieren que los TCR identificados también podrían predecir la presencia de cáncer de endometrio. Se requiere una validación adicional en muestras de endometrio para confirmar esta hipótesis.

En el futuro, el análisis a gran escala del repertorio de TCR en portadores de LS, facilitado por esfuerzos colaborativos y secuenciación avanzada, es crucial. La identificación de firmas de TCR asociadas a tipos específicos de cáncer con MMRd podría mejorarse mediante la estratificación de pacientes por tipo de cáncer y la restricción del grupo "positivo" a aquellos con enfermedad activa en el momento del muestreo. Las fluctuaciones temporales en los repertorios de TCRβ resaltan la necesidad de un seguimiento longitudinal, ya que las respuestas inmunitarias varían con el tiempo. Por lo tanto, si bien el análisis del perfil de TCR promete ser útil en el diagnóstico, su interpretación requerirá la integración con datos inmunitarios específicos del momento y otros marcadores clínicos. La incorporación de TCRseq con SNPs germinales y multi-ómicas podría generar biomarcadores y objetivos terapéuticos sólidos. Estos repertorios de TCRβ tienen potencial como biomarcadores inmunitarios; sin embargo, es necesaria una mayor validación en cohortes independientes para evaluar su utilidad clínica y reactividad tumoral. La detección de firmas en individuos asintomáticos con LS podría proporcionar una herramienta no invasiva para la detección temprana, la evaluación del riesgo y la vigilancia personalizada.

En resumen, la búsqueda de TCR circulantes asociados al cáncer en portadores de LS representa un paso importante en el desarrollo de la prevención de precisión para esta población de pacientes y proporciona información valiosa sobre la inmunología del cáncer. Al desentrañar las complejidades de las respuestas de las células T en los neoplasmas asociados a LS, esta investigación tiene el potencial de revolucionar la detección temprana del cáncer, la predicción del pronóstico y las intervenciones terapéuticas en esta población de alto riesgo.

Método

Aprobación ética

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. El protocolo del estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas (IRB #Lab-94-032, IRB #PA12-0327 e IRB #PA13-0178), con la aprobación de las juntas de revisión institucional correspondientes en las instituciones participantes.

Participantes y muestras

Se realizó un análisis de TCRseq a granel a partir de sangre total o PBMC de 277 individuos (102 supervivientes de LS, 130 individuos con riesgo de LS y 45 controles sin antecedentes de cáncer o LS, Datos suplementarios 12) recolectados en el Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas (MDACC), el Centro Oncológico de la Universidad de Kansas (KUCC) y el Instituto Catalán de Oncología (ICO, Barcelona, España). Para la cohorte de MDACC, la duración mediana del seguimiento fue de 62 meses, calculada desde la fecha del consentimiento hasta el último contacto registrado; tres individuos fallecieron en el último seguimiento. Para la cohorte de KUCC, el seguimiento mediano fue de aproximadamente 72 meses, con un individuo fallecido. Para la cohorte de ICO, la duración mediana del seguimiento fue de 138 meses; sin embargo, el estado vital fue desconocido para seis individuos. En las tres cohortes, aparte de los cuatro fallecidos conocidos y los seis participantes con estado desconocido, todos los demás en las tres cohortes estaban vivos en su último seguimiento (Datos suplementarios 12). Los supervivientes de LS se definieron como portadores de LS con antecedentes de un tipo de cáncer asociado a LS. Los individuos con riesgo de LS fueron portadores de LS sin antecedentes de ningún tipo de cáncer y los controles fueron individuos sanos con riesgo promedio de CRC y sin antecedentes de ningún tipo de cáncer o antecedentes familiares de LS. Además, también analizamos 14 neoplasias colorrectales (11 precancerosas y 3 cánceres) del colon y el recto de portadores de LS de los que obtuvimos PBMC o sangre. Se obtuvieron tres portaobjetos sin tinción (4 μm de espesor) de cada muestra para realizar una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y una inmunohistoquímica (IHC) de las proteínas de reparación de errores de emparejamiento (MMR), según se describió previamente^[40]. El diagnóstico patológico de las muestras de tejido fue verificado por un experto patólogo gastrointestinal (M.W.T.). Las muestras de tejido se clasificaron como adenomas tubulares (AT) y adenocarcinomas (ADCA) según la evaluación patológica y luego se agruparon en tres categorías: cánceres; precánceres avanzados, que comprendían AT de más de 1 cm de tamaño o que contenían características vellosas, o la presencia de displasia de alto grado; y precánceres, que consistían en AT sin características avanzadas.

Secuenciación, diversidad y análisis del repertorio público de TCRβ

Se obtuvo ADN genómico de todos los PBMC, sangre total y muestras de tejido utilizando el kit QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit (Cat. No. 69504), siguiendo las instrucciones del fabricante. La preparación de la biblioteca de muestras de ADN genómico la realizó Adaptive Biotechnologies utilizando el ensayo TCRβ ImmunoSEQ. Las muestras de ADN de MDACC (N = 180) se secuenciaron con una resolución "Profunda" y todas las muestras de KUCC e ICO (N = 97) se secuenciaron con la nueva resolución "Única" de Adaptive, que es comparable a la resolución profunda. Los análisis posteriores, incluidos los índices de diversidad y clonalidad, así como el análisis de la homeostasis de TCRβ y los TCRβ públicos, se realizaron con el paquete Immunarch R^[41] y el analizador ImmunoSEQ de Adaptive Biotechnologies. Solo se consideraron los reordenamientos de TCRβ productivos para el análisis. Para evaluar la diversidad de TCR en cada muestra, utilizamos el número de Hill, que es una medida que se utiliza con frecuencia en ecología para cuantificar la biodiversidad de los ecosistemas. Permite medir el número efectivo de clonotipos distintos que son igualmente abundantes, lo que corresponde a la diversidad^[42]. El índice de clonalidad de Simpson se obtuvo calculando la raíz cuadrada de la suma de todos los reordenamientos observados de las fracciones cuadradas de la abundancia de cada reordenamiento. La clonalidad productiva se obtuvo calculando la raíz cuadrada del índice de diversidad de Simpson para todos los reordenamientos productivos en cada muestra. Se definió un TCRβ público como un TCRβ productivo compartido por al menos 2 individuos de nuestra cohorte mediante la coincidencia de los segmentos CDR3β, Vβ y Jβ a nivel de la secuencia de aminoácidos. Además, se utilizó un análisis de distribución de frecuencia de rango-tamaño para evaluar las diferencias en el intercambio de TCR entre los supervivientes de LS, los individuos con riesgo de LS y los controles, lo que en diferentes sujetos sigue una distribución de ley de potencias, representada por la ecuación (f(x) = kx−α)^[17],^[18]. Un exponente de potencia mayor (α) indica que la población comparte más TCR públicos. Además, se utilizó el índice de Morisita para evaluar los niveles de similitud entre las muestras considerando las frecuencias relativas de TCRβ junto con la presencia de TCRβ específicos en más de una muestra. Se evaluó la superposición entre las muestras de tejido y sangre mediante la coincidencia de los segmentos CDR3β, Vβ y Jβ a nivel de la secuencia de aminoácidos.

Anotación de TCRβ

Se realizó la evaluación de la especificidad para condiciones virales y autoinmunes de todos los TCRβ públicos mediante su anotación en las categorías de patógenos y autoinmunidad de la base de datos McPAS-TCR^[19], basándose en coincidencias exactas de los segmentos CDR3β, J y V a nivel de la secuencia de aminoácidos. Para la evaluación de los TCRβ públicos específicos de CRC con MMRd, se agrupó un conjunto de nueve adenocarcinomas colorrectales con MMRd, de los que se realizó la secuenciación de TCR utilizando el mismo ensayo TCRβ ImmunoSEQ de Adaptive Biotechnologies, en un conjunto de datos de TCRβ específicos de CRC con MMRd. Este conjunto de datos incluyó tres adenocarcinomas de nuestra cohorte de tejidos (Tabla S2), tres adenocarcinomas colorrectales con MMRd obtenidos en MDACC de individuos no incluidos en nuestra cohorte de PBMC/sangre y tres tumores primarios colorrectales con MMRd de un conjunto de datos de acceso público disponible a través de la plataforma immuneACCESS (10.21417/B7WW2C) y publicados previamente^[20]. Los TCRβ públicos de la cohorte de PBMC/sangre se anotaron en relación con el conjunto de TCRβ específicos de CRC con MMRd mediante la coincidencia exacta de los segmentos CDR3β, J y V a nivel de la secuencia de aminoácidos.

Análisis de asociación fenotípica

La secuencia de TCRβ y su abundancia en la sangre periférica se utilizaron como características de entrada en el clasificador para diferenciar entre los portadores de LS (individuos con riesgo de LS N = 130 y supervivientes N = 102, total N = 232) y los controles (N = 45), entre los individuos con riesgo de LS y los controles, y entre los supervivientes de LS y los individuos con riesgo de LS (Fig. 5A). Para equilibrar el número de muestras de control, incluimos 197 muestras de control sanas de un conjunto de datos público (Datos suplementarios 3, https://www.synapse.org/Synapse:syn61987835/). Luego, seleccionamos aleatoriamente el 20% de las muestras como el conjunto de validación utilizando la función R 'sample' (seed = 1234) y utilizamos el 80% restante como el conjunto de entrenamiento/prueba para optimizar los parámetros (Datos suplementarios 2). Consideramos los siguientes hiperparámetros: 1. Región de TCR: consideramos la región más óptima para usar solo CDR3aa, CDR3aa más segmentos J, CDR3aa más segmentos V o CDR3aa más ambos segmentos J y V; 2. Umbral de corte de la proporción de presencia positiva: el porcentaje mínimo de individuos de la cohorte positiva en el que debe estar presente un clon de TCRβ; 3. Umbral de corte de la prueba de Fisher: el umbral de significación para el enriquecimiento de un clon de TCRβ en el grupo positivo frente al grupo negativo en la prueba de Fisher; 4. Umbral de corte de la prueba de Wilcoxon: el umbral de significación para el aumento de la expansión de un clon de TCRβ en el grupo positivo frente al grupo negativo en la prueba de Wilcoxon. Realizamos una búsqueda en cuadrícula sobre combinaciones de estos cuatro parámetros, incluida la región de TCR (CDR3aa, CDR3aa+J, CDR3aa+V, CDR3aa+J+V), el umbral de corte de la proporción de presencia positiva (10%, 50%, 75%), el umbral de corte de la prueba de Fisher (10⁻¹, 10⁻², 10⁻⁴, 10⁻¹⁰, 10⁻¹⁵) y el umbral de corte de la prueba de Wilcoxon (10⁻¹, 10⁻², 10⁻⁴, 10⁻¹⁰, 10⁻¹⁵, Fig. 5A) en el conjunto de entrenamiento utilizando la validación cruzada de eliminación de uno (LOOCV). Después de identificar los TCR de firma, su expansión media dentro de una muestra se utilizó para predecir el fenotipo de la muestra utilizando clasificadores de Bayes ingenuo gaussiano. Asumimos que las proporciones transformadas de la raíz cuadrada del arcoseno de la media de estos TCR de firma en cada muestra siguen una distribución gaussiana con parámetros (media y desviación estándar) estimados tanto del grupo positivo como del grupo negativo. Basándonos en estas distribuciones, estimamos la probabilidad de que una muestra pertenezca al grupo positivo utilizando las funciones de densidad de probabilidad de ambos grupos. Analizamos la compensación entre la tasa de verdaderos positivos (TPR) y la tasa de falsos positivos (FPR) en varios umbrales de probabilidad e informamos los valores AUROC (área bajo la curva de características operativas del receptor) para los clasificadores. Los parámetros óptimos se seleccionaron en función de los valores AUROC de los resultados de LOOCV del conjunto de entrenamiento/prueba. En los casos en que los valores AUROC estuvieran empatados en el segundo decimal, priorizamos los modelos con regiones de TCR más cortas y conjuntos de firma más pequeños. Los TCR de firma identificados a partir del conjunto de entrenamiento/prueba utilizando los hiperparámetros óptimos se probaron en el 20% del conjunto de validación retenido para evaluar el posible sobreajuste.

Validación in vitro de la especificidad de los TCR para virus y neoantígenos

Como parte del proceso de anotación de TCRβ, identificamos un subconjunto de secuencias de TCRβ dentro de nuestro repertorio público de TCRβ circulantes, que se informaron previamente en la base de datos McPAS TCR como específicas para antígenos virales. Entre estos antígenos virales, nos centramos en un péptido antigénico del virus de Epstein-Barr (VEB) (BMLF1, secuencia de aminoácidos: GLCTLVAML), ya que detectamos que varias secuencias de TCRβ públicas de las muestras de sangre de supervivientes, individuos con riesgo de LS y controles mostraron especificidad hacia este péptido BMLF1. Para validar nuestros resultados de anotación in silico, utilizamos el péptido BMLF1 junto con un tetrámero para estimular los PBMC de un donante humano sano, obteniendo así células T CD8+ específicas de BMLF1 para la secuenciación de TCR de una sola célula. Luego, comparamos las secuencias de TCRβ obtenidas de estas células con nuestro repertorio público de TCRβ anotado para evaluar el grado de superposición y validar la especificidad de las secuencias de TCRβ identificadas.

En detalle, se cultivaron PBMCs de donantes sanos en placas de 12 pocillos (1,5 × 10⁶/pocillo) utilizando medio R10 (RPMI 1640 con L-glutamina (Cat #10040CV, Corning), 10% de FBS inactivado por calor (Cat# SH30070.03, HyClone), 10 mM de tampón Hepes (Cat# 25060-CI, Corning) y 1X de penicilina/estreptomicina (Cat#30002CI, Corning)) suplementado con IL-7 humana recombinante (R&D Systems Biotech, 330U/ml). Se estimularon las PBMCs con BMLF1 (GLCTLVAML a 6 µg/ml). En los días 3 y 7 del cultivo, se alimentaron las células con medio R10 en presencia de IL-2 (R&D Systems Biotech, 20 U/mL). En el día 10, se estimularon las células con medio R10 en presencia de una dosis alta de IL-2 (1000U/ml). En el día 12, se recolectaron las células y se aislaron las células T pan-CD3+ para el análisis posterior por citometría de flujo. Se aislaron células T no estimuladas (>96% de pureza) de PBMCs de donantes humanos sanos positivos para HLA-A*02:01 utilizando el kit de aislamiento de células T pan de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania). Brevemente, se eliminaron las células no T de las PBMCs utilizando anticuerpos biotinilados contra CD14, CD16, CD19, CD36, CD56 y CD123, seguido de microesferas magnéticas anti-biotina marcadas con glicoforina A y columnas LS. Para generar tetrámeros cargados con péptidos, utilizamos monómeros Flex-T™ HLA-A*02:01 UVX (Biolegend) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 20 µL del monómero HLA-A*02:01 UVX con 20 µL del péptido viral respectivo diluido a 400 µM en PBS. Luego, la mezcla se irradió con UV (366 nm) durante 30 minutos, seguido de una incubación adicional de 30 minutos a 37 °C en la oscuridad. La solución irradiada se mezcló con estreptavidina-APC y estreptavidina-PE (Biolegend) para generar los tetrámeros. Los monómeros Flex-T™ se ensamblaron con dos conjugados de estreptavidina diferentes (APC y PE) en reacciones separadas para garantizar la máxima especificidad. Finalmente, se añadió D-biotina a la solución de tetrámeros para bloquear cualquier estreptavidina-APC y estreptavidina-PE libre restante. Los tetrámeros siempre se prepararon el día anterior a la tinción y se dejaron a 4 °C en la oscuridad durante la noche. Para cada muestra, se añadió el inhibidor de la proteína quinasa Dasatinib (Cayman Chemicals) al medio de cultivo hasta una concentración final de 50 nM para mejorar la unión de los tetrámeros de péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugados con fluorocromo y las células, y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Luego, las células T pan expandidas se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca²/Mg²⁺, suplementada con 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) (tampón de lavado), y se tiñeron con pMHC-tetrámero marcado con R-ficoeritrina (PE) y aloficocianina (APC) y anticuerpo anti-CD8 murino Peridinin-Clorofila-Proteína (PerCP) (Cat no. 347314, BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.) para determinar el número de células T CD8+ específicas para el péptido viral. Las células se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C con las concentraciones recomendadas por el fabricante para la tinción con tetrámeros. Después de la tinción con tetrámeros, las células se lavaron dos veces con 2 ml de tampón de lavado, se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos a 4 °C y se resuspendieron en el volumen residual, y se incubaron con el anticuerpo anti-CD8 durante 30 minutos sobre hielo. Las células muertas se excluyeron mediante la tinción con Sytox Blue (1 mM, Molecular Probes, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las células T pan no teñidas se utilizaron para detectar la autofluorescencia o la tinción de fondo. Las células teñidas se analizaron y se clasificaron utilizando un citómetro de flujo CytoFLEX SRT (Beckman Coulter, EE. UU.) en condiciones estériles, y los resultados se analizaron con el software FlowJo versión 10.8.1 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EE. UU.).

Validación in vitro de la especificidad de los TCR de la firma utilizando RNF43 y MSH3 neoAg

Seleccionamos RNF43 (con la secuencia de aminoácidos: TQLARFFPI), uno de los péptidos más recurrentes en los cánceres colorrectales y precánceres con LS y con inmunogenicidad validada que se ha identificado en nuestro trabajo anterior^[1]. Utilizamos este péptido RNF43_3 en conjunto con un dextrámero personalizado (Immudex) para estimular las PBMCs de 2 pacientes con LS, obteniendo así células T específicas para RNF43. Posteriormente, realizamos una secuenciación de ARN de célula única y una secuenciación de TCR de célula única en estas células T CD3+ y CD8+ específicas para RNF43-dextrámero. En paralelo, se utilizó un segundo péptido neoAg recurrente derivado de una mutación de cambio de marco en MSH3 (FLLALWECSL), descrito previamente como un neoAg compartido e inmunogénico en portadores de LS^[8],^[22], para teñir las PBMCs de un portador adicional de LS utilizando un dextrámero HLA-A02:01 específico para MSH3. Luego, comparamos las secuencias TCRβ obtenidas de estas células con nuestros TCRβ de la firma asociada a LS y, por separado, con nuestros TCRβ de la firma asociada a supervivientes de LS para evaluar la superposición y validar la especificidad del neoAg de las secuencias de la firma TCRβ identificadas.

En detalle, las PBMCs de pacientes con LS que portan el alelo HLA-A*02:01 se descongelaron y se cultivaron en placas de 12 pocillos a una densidad de 1,5 × 10⁶ células/pocillo en medio R10 (RPMI 1640 suplementado con L-glutamina (Catálogo #10040CV, Corning, NY), 10% de FBS inactivado por calor (Catálogo #SH30070.03, HyClone, Cytiva, MA), 10 mM de tampón HEPES (Catálogo #25060-CI, Corning) y 1 × penicilina-estreptomicina (Catálogo #30002CI, Corning). Para algunos ensayos, este medio se enriqueció aún más con 1000 UI/ml de GM-CSF humano (Catálogo #215-GM-050/CF, R&D Systems, MN), IL-4 humana recombinante (Catálogo #202-IL-050/CF, R&D Systems, MN) y Flt-3L humana (Catálogo #308-FKN-025, R&D Systems, MN), y se incubó durante la noche (día 0). El día 1, las PBMCs se estimularon con péptidos RNF43 o MSH3 (1 µM) sin péptidos virales. Las culturas se suplementaron con citocinas humanas recombinantes: IL-2 (10 UI/ml; Catálogo #202-IL-050, R&D Systems, MN), IL-7 (10 ng/ml; Catálogo #207-IL-025, R&D Systems, MN) e IL-15 (10 ng/ml; Catálogo #200-15, PeproTech). Después de 24 h (día 2), las células se recolectaron y se lavaron con PBS (sin Ca²⁺/Mg²⁺) que contenía 0,5% de BSA. Para la tinción, las células se incubaron con dextrámero HLA-A*02:01 RNF43 (TQLARFFPI) y MSH3 (FLLALWECSL) marcado con PE (10 µl por 50 µl de PBS que contiene 50% de FBS; Immudex) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces, se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos a 4 °C y se resuspendieron en el tampón residual. Luego, las células se tiñeron con anti-CD3-FITC (Catálogo #561807, BD Biosciences, CA), anti-CD8-PerCP (Catálogo #340693, BD Biosciences, CA) y 4-1BB-APC-Cy7 (Catálogo #309830, BioLegend, CA) durante 20 minutos sobre hielo. Las células muertas se excluyeron utilizando Sytox Blue (1 mM, Molecular Probes, CA). Los controles incluyeron PBMCs no teñidas para la autofluorescencia y PBMCs de donantes sanos no coincidentes para HLA como controles negativos. Las células se analizaron y se clasificaron en un citómetro de flujo CytoFLEX SRT (Beckman Coulter, CA), y los datos se procesaron utilizando el software FlowJo v10.8.1 (Tree Star, OR).

Preparación de células para la elaboración de perfiles de célula única

Para maximizar la viabilidad y la recuperación celular, las muestras se procesaron según la Guía de preparación de células del protocolo demostrado de 10x Genomics (CG00053; 10x Genomics, Pleasanton, CA, EE. UU.). Brevemente, después de retirar el sobrenadante, las células T se lavaron suavemente dos veces en 1,5-3 ml de 0,04% de BSA en PBS. Además, las células se pasaron a través de un tamiz de 35 µm (Tubos de fondo redondo BD Falcon® de 5 ml con tapa de tamiz para células, Corning, NY, EE. UU.) para eliminar los grupos de células. A continuación, las células se tiñeron con 0,4% de azul de tripan y se cuantificaron y se evaluó su viabilidad utilizando el contador de células automatizado Countess 3 (Invitrogen, FL, EE. UU.).

Secuenciación de ARN de célula única 5′ y V(D)J de 10x Genomics

Los análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA) y secuenciación de TCR de célula única (scTCR) se realizaron utilizando la solución de elaboración de perfiles de células inmunitarias de célula única V1.0 de 10x Genomics según los protocolos del fabricante (10x Genomics V(D)J + 5′ Gene Expression). Las bibliotecas de scRNA se secuenciaron en un sistema Illumina HiSeq 3000 utilizando longitudes de lectura de 26 pb lectura 1, 8 pb índice i7, 98 pb lectura 2. Las bibliotecas de scTCR se secuenciaron en un sistema Illumina HiSeq 3000 utilizando longitudes de lectura de 150 pb lectura 1, 8 pb índice i7, 150 pb lectura 2. Los datos de secuenciación se procesaron por separado utilizando Cell Ranger 2.1.1, que incluyó la generación de archivos fastq, la alineación de las lecturas y el cálculo de las matrices de expresión de genes-células. Las lecturas de TCR se alinearon al genoma de referencia GRCh38, y la anotación de consenso de TCR se realizó utilizando el programa cellranger vdj. Los códigos de barras con un número mayor de recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) que los simulados en el fondo se identificaron como códigos de barras de células. Para cada código de barras, cellranger realizó un ensamblaje de novo e identificó los contigs productivos junto con sus regiones CDR3 correspondientes y los genes V, D, J, C.

Los resultados de la expresión génica de célula única se procesaron utilizando Cell Ranger v8 multi y se alinearon al genoma de referencia GRCh38. Los recuentos de secuencias se analizaron utilizando la canalización Seurat v5. Las células con más del 5% de contenido de genes mitocondriales se eliminaron. La normalización de datos se realizó utilizando el método de normalización logarítmica, y se identificaron las características variables. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA), y los primeros 30 componentes principales (PC) se utilizaron para los análisis posteriores, incluido el agrupamiento y la visualización con la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP). Se identificaron los genes marcadores principales para cada grupo y se clasificaron por el valor P ajustado de BH utilizando la prueba de Wilcoxon, y los tipos de células se anotaron manualmente.

Análisis estadísticos

PRISM8 se utilizó para realizar todos los análisis estadísticos. La prueba de Mann-Whitney se utilizó para evaluar la significación estadística de las diferencias entre los supervivientes de LS, los supervivientes de LS y los controles en el contexto de la clonalidad, la diversidad, el índice de Morisita, la ocupación del espacio del repertorio de TCRβ grandes, medianos y pequeños hiperexpandidos, el sexo de los individuos, la institución de la que se obtuvieron las muestras y el gen MMR con la variante patogénica en la línea germinal. Se utilizó una prueba de Chi-cuadrado para evaluar la significación estadística de las diferencias entre el porcentaje de TCRβ de cada grupo específico de la enfermedad que se anota en la cohorte de supervivientes y supervivientes de LS y los controles. Además, la distribución de la ley de potencias de los TCR presentes en los sujetos se estimó utilizando un modelo lineal. Esto se hizo después de transformar logarítmicamente el porcentaje de sujetos positivos y el rango percentil de los TCR (log10(y) = log10(k) + log(C) * α). Además, para evaluar los efectos del estado de la enfermedad de LS (superviviente, superviviente o control) en combinación con la edad, la institución de la que se obtuvieron las muestras, el sexo de los individuos, el gen MMR con la variante patogénica en la línea germinal y el material de entrada (sangre o PBMCs), en el índice de clonalidad de Simpson (variable dependiente), se aplicó un modelo lineal generalizado para datos distribuidos gamma utilizando el paquete Stats (versión 3.6.2) en R, dada la distribución gamma de la variable del índice de clonalidad de Simpson. En más detalle, el índice de clonalidad de Simpson se estableció como la variable de respuesta, y el estado de la enfermedad, la institución de la que se obtuvieron las muestras, el sexo, el gen MMR que porta la variante patogénica en la línea germinal, el material de entrada (PBMCs o sangre total), así como la edad de los individuos se utilizaron como variables predictoras. Para inferir la significación de la correlación entre la edad del individuo y el índice de clonalidad de Simpson, se utilizó el coeficiente de correlación de rango de Spearman no paramétrico. Para cada prueba, la significación se definió por un valor de P < 0,05.

Aprobación ética

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. El protocolo del estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas (IRB #Lab-94-032, IRB #PA12-0327 e IRB #PA13-0178), con la aprobación de las juntas de revisión institucional correspondientes en las instituciones participantes.

Participantes y muestras

Se realizó un análisis de secuenciación masiva de TCR (TCRseq) a partir de sangre total o PBMC de 277 individuos (102 supervivientes de LS, 130 individuos con LS sin antecedentes de cáncer y 45 controles sin antecedentes de cáncer o LS, Datos Suplementarios 12), recolectados en el Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas (MDACC), el Centro Oncológico de la Universidad de Kansas (KUCC) y el Instituto Catalán de Oncología (ICO, Barcelona, España). Para la cohorte de MDACC, la duración mediana del seguimiento fue de 62 meses, calculada desde la fecha del consentimiento hasta el último contacto registrado; tres individuos fallecieron en el último seguimiento. Para la cohorte de KUCC, el seguimiento mediano fue de aproximadamente 72 meses, con un individuo fallecido. Para la cohorte de ICO, la duración mediana del seguimiento fue de 138 meses; sin embargo, el estado vital fue desconocido para seis individuos. En las tres cohortes, además de los cuatro individuos fallecidos y los seis participantes con estado desconocido, todos los demás individuos de las tres cohortes estaban vivos en su último seguimiento (Datos Suplementarios 12). Los supervivientes de LS se definieron como portadores de LS con antecedentes de un tipo de cáncer asociado a LS. Los individuos con LS sin antecedentes de cáncer se definieron como portadores de LS sin antecedentes de ningún tipo de cáncer, y los controles fueron individuos sanos con riesgo promedio de CRC y sin antecedentes de ningún tipo de cáncer o antecedentes familiares de LS. Además, también analizamos 14 neoplasias colorrectales (11 precancerosas y 3 cánceres) del colon y el recto de portadores de LS, de los cuales obtuvimos PBMC o sangre. Se obtuvieron tres portaobjetos sin tinción (de 4 μm de espesor) de cada muestra para realizar una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y una inmunohistoquímica (IHC) de las proteínas de reparación de errores de emparejamiento (MMR), según se describió previamente^[40]. El diagnóstico patológico de las muestras de tejido fue verificado por un experto patólogo gastrointestinal (M.W.T.). Las muestras de tejido se clasificaron como adenomas tubulares (AT) y adenocarcinomas (ADCA) según la evaluación patológica y luego se agruparon en tres categorías: cánceres; precánceres avanzados, que comprendían AT de más de 1 cm de tamaño o que contenían características vellosas, o la presencia de displasia de alto grado; y precánceres, que consistían en AT sin características avanzadas.

Secuenciación, diversidad y análisis del repertorio público de TCRβ

Se obtuvo ADN genómico de todas las PBMC, sangre total y muestras de tejido utilizando el kit QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit (N.º de catálogo 69504), siguiendo las instrucciones del fabricante. La preparación de la biblioteca de muestras de ADN genómico la realizó Adaptive Biotechnologies utilizando el ensayo TCRβ ImmunoSEQ. Las muestras de ADN de MDACC (N = 180) se secuenciaron con una resolución "profunda" y todas las muestras de KUCC e ICO (N = 97) se secuenciaron con la nueva resolución "única" de Adaptive, que es comparable a la resolución profunda. Los análisis posteriores, incluidos los índices de diversidad y clonalidad, así como el análisis de la homeostasis de TCRβ y los TCRβ públicos, se realizaron con el paquete Immunarch R^[41] y el analizador ImmunoSEQ de Adaptive Biotechnologies. Solo se consideraron los reordenamientos productivos de TCRβ para el análisis. Para evaluar la diversidad de TCR en cada muestra, utilizamos el número de Hill, que es una medida que se utiliza con frecuencia en ecología para cuantificar la biodiversidad de los ecosistemas. Permite medir el número efectivo de clonotipos distintos que son igualmente abundantes, lo que corresponde a la diversidad^[42]. El índice de clonalidad de Simpson se obtuvo calculando la raíz cuadrada de la suma de todos los reordenamientos observados de las fracciones cuadradas de la abundancia de cada reordenamiento. La clonalidad productiva se obtuvo calculando la raíz cuadrada del índice de diversidad de Simpson para todos los reordenamientos productivos en cada muestra. Se definió un TCRβ público como un TCRβ productivo compartido por al menos 2 individuos de nuestra cohorte mediante la coincidencia de los segmentos CDR3β, Vβ y Jβ a nivel de la secuencia de aminoácidos. Además, se utilizó un análisis de distribución de frecuencia de rango-tamaño para evaluar las diferencias en el intercambio de TCR entre los supervivientes de LS, los individuos con LS sin antecedentes de cáncer y los controles, lo que en diferentes sujetos sigue una distribución de ley de potencias, representada por la ecuación (f(x) = kx−α)^[17],^[18]. Un exponente de potencia mayor (α) indica que la población comparte más TCR públicos. Además, se utilizó el índice de Morisita para evaluar los niveles de similitud entre las muestras, considerando las frecuencias relativas de TCRβ junto con la presencia de TCRβ específicos en más de una muestra. La superposición entre las muestras de tejido y sangre se evaluó haciendo coincidir los segmentos CDR3β, Vβ y Jβ a nivel de la secuencia de aminoácidos.

Anotación de TCRβ

Se realizó la evaluación de la especificidad para condiciones virales y autoinmunes de todos los TCRβ públicos mediante su anotación en las categorías de patógenos y autoinmunidad de la base de datos McPAS-TCR^[19], basándose en coincidencias exactas de los segmentos CDR3β, J y V a nivel de la secuencia de aminoácidos. Para la evaluación de los TCRβ públicos específicos de CRC con MMRd, se agruparon nueve adenocarcinomas colorrectales con MMRd, de los cuales se realizó la secuenciación de TCR utilizando el mismo ensayo TCRβ ImmunoSEQ de Adaptive Biotechnologies, en un único conjunto de datos de TCRβ específicos de CRC con MMRd. Este conjunto de datos incluyó tres adenocarcinomas de nuestra cohorte de tejidos (Tabla S2), tres adenocarcinomas colorrectales con MMRd obtenidos en MDACC de individuos no incluidos en nuestra cohorte de muestras de PBMC/sangre y tres tumores primarios colorrectales con MMRd de un conjunto de datos de acceso público disponible a través de la plataforma immuneACCESS (10.21417/B7WW2C) y publicados previamente^[20]. Los TCRβ públicos de la cohorte de muestras de PBMC/sangre se anotaron en relación con el conjunto de TCRβ específicos de CRC con MMRd mediante la coincidencia exacta de los segmentos CDR3β, J y V a nivel de la secuencia de aminoácidos.

Análisis de asociación fenotípica

La secuencia de TCRβ y su abundancia en la sangre periférica se utilizaron como características de entrada en el clasificador para diferenciar entre los portadores de LS (sin antecedentes de cáncer, N = 130, y supervivientes, N = 102, total N = 232) y los controles (N = 45), entre los individuos con LS sin antecedentes de cáncer y los controles, y entre los supervivientes de LS y los individuos con LS sin antecedentes de cáncer (Fig. 5A). Para equilibrar el número de muestras de control, incluimos 197 muestras de control sanas de un conjunto de datos público (Datos Suplementarios 3, https://www.synapse.org/Synapse:syn61987835/). Luego, seleccionamos aleatoriamente el 20% de las muestras como el conjunto de validación utilizando la función R 'sample' (seed = 1234) y utilizamos el 80% restante como el conjunto de entrenamiento/prueba para optimizar los parámetros (Datos Suplementarios 2). Consideramos los siguientes hiperparámetros: 1. Región de TCR: consideramos la región más óptima para utilizar solo CDR3aa, CDR3aa más segmentos J, CDR3aa más segmentos V o CDR3aa más ambos segmentos J y V; 2. Umbral de corte de la relación de presencia positiva: el porcentaje mínimo de individuos de la cohorte positiva en el que debe estar presente un clon de TCRβ; 3. Umbral de corte de la prueba de Fisher: el umbral de significación para el enriquecimiento de un clon de TCRβ en el grupo positivo frente al grupo negativo en la prueba de Fisher; 4. Umbral de corte de la prueba de Wilcoxon: el umbral de significación para el aumento de la expansión de un clon de TCRβ en el grupo positivo frente al grupo negativo en la prueba de Wilcoxon. Realizamos una búsqueda en cuadrícula sobre combinaciones de estos cuatro parámetros, incluidos la región de TCR (CDR3aa, CDR3aa+J, CDR3aa+V, CDR3aa+J+V), el umbral de corte de la relación de presencia positiva (10%, 50%, 75%), el umbral de corte de la prueba de Fisher (10⁻¹, 10⁻², 10⁻⁴, 10⁻¹⁰, 10⁻¹⁵) y el umbral de corte de la prueba de Wilcoxon (10⁻¹, 10⁻², 10⁻⁴, 10⁻¹⁰, 10⁻¹⁵, Fig. 5A) en el conjunto de entrenamiento utilizando la validación cruzada de eliminación única (LOOCV). Después de identificar los TCRs de firma, su expansión media dentro de una muestra se utilizó para predecir el fenotipo de la muestra utilizando clasificadores de Bayes ingenuo gaussiano. Asumimos que las proporciones transformadas de la raíz cuadrada del arcoseno de las proporciones medias de estos TCRs de firma en cada muestra siguieron una distribución gaussiana con parámetros (media y desviación estándar) estimados a partir de los grupos positivo y negativo. Basándonos en estas distribuciones, estimamos la probabilidad de que una muestra pertenezca al grupo positivo utilizando las funciones de densidad de probabilidad de ambos grupos, positivo y negativo. Analizamos la compensación entre la tasa de verdaderos positivos (TPR) y la tasa de falsos positivos (FPR) en varios umbrales de probabilidad e informamos los valores AUROC (área bajo la curva de características operativas del receptor) para los clasificadores. Los parámetros óptimos se seleccionaron en función de los valores AUROC de los resultados de LOOCV del conjunto de entrenamiento/prueba. En los casos en que los valores AUROC fueron iguales en el segundo decimal, priorizamos los modelos con regiones de TCR más cortas y conjuntos de firma más pequeños. Los TCRs de firma identificados a partir del conjunto de entrenamiento/prueba utilizando los hiperparámetros óptimos se probaron en el 20% del conjunto de validación retenido para evaluar el posible sobreajuste.

Validación in vitro de la especificidad de los TCR para virus y neoantígenos

Como parte del proceso de anotación de TCRβ, identificamos un subconjunto de secuencias de TCRβ dentro de nuestro repertorio público de TCRβ circulante, que se informaron previamente en la base de datos McPAS TCR como específicas para antígenos virales. Entre estos antígenos virales, nos centramos en un péptido antigénico del virus de Epstein-Barr (VEB) (BMLF1, secuencia de aminoácidos: GLCTLVAML), ya que detectamos que varias secuencias de TCRβ públicas de las muestras de sangre de supervivientes, individuos con LS sin antecedentes de cáncer y controles mostraron especificidad hacia este péptido BMLF1. Para validar nuestros resultados de anotación in silico, utilizamos el péptido BMLF1 junto con un tetrámero para estimular las PBMC de un donante humano sano, obteniendo así células T CD8+ específicas para BMLF1 para la secuenciación de TCR de una sola célula. Luego, comparamos las secuencias de TCRβ obtenidas de estas células con nuestro repertorio público de TCRβ anotado para evaluar el grado de superposición y validar la especificidad de las secuencias de TCRβ identificadas.

En detalle, se cultivaron PBMCs de donantes sanos en placas de 12 pocillos (1,5 × 10⁶/pocillo) utilizando medio R10 (RPMI 1640 con L-glutamina (Cat #10040CV, Corning), 10% de FBS inactivado por calor (Cat# SH30070.03, HyClone), 10 mM de tampón Hepes (Cat# 25060-CI, Corning) y 1X de penicilina/estreptomicina (Cat#30002CI, Corning)) suplementado con IL-7 humana recombinante (R&D Systems Biotech, 330 U/ml). Se estimularon las PBMCs con BMLF1 (GLCTLVAML a 6 µg/ml). En los días 3 y 7 del cultivo, se alimentaron las células con medio R10 en presencia de IL-2 (R&D Systems Biotech, 20 U/ml). En el día 10, se estimularon las células con medio R10 en presencia de una dosis alta de IL-2 (1000 U/ml). En el día 12, se recolectaron las células y se aislaron las células T pan-CD3+ para el análisis posterior por citometría de flujo. Se aislaron células T no estimuladas (>96% de pureza) de PBMCs de donantes humanos sanos positivos para HLA-A*02:01 utilizando el kit de aislamiento de células T pan de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania). Brevemente, se eliminaron las células no T de las PBMCs utilizando anticuerpos biotinilados contra CD14, CD16, CD19, CD36, CD56 y CD123, seguido de microesferas magnéticas anti-biotina glicoforina A y columnas LS. Para generar tetrámeros cargados con péptidos, utilizamos monómeros Flex-T™ HLA-A*02:01 UVX (Biolegend) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 20 µL del monómero HLA-A*02:01 UVX con 20 µL del péptido viral respectivo diluido a 400 µM en PBS. Luego, la mezcla se irradió con UV (366 nm) durante 30 minutos, seguido de una incubación adicional de 30 minutos a 37 °C en la oscuridad. La solución irradiada se mezcló con estreptavidina-APC y estreptavidina-PE (Biolegend) para generar los tetrámeros. Los monómeros Flex-T™ se ensamblaron con dos conjugados de estreptavidina diferentes (APC y PE) en reacciones separadas para garantizar la máxima especificidad. Finalmente, se añadió D-biotina a la solución de tetrámeros para bloquear cualquier estreptavidina-APC y estreptavidina-PE libre restante. Los tetrámeros siempre se prepararon el día anterior a la tinción y se dejaron a 4 °C en la oscuridad durante la noche. Para cada muestra, se añadió el inhibidor de la proteína quinasa Dasatinib (Cayman Chemicals) al medio de cultivo hasta una concentración final de 50 nM para mejorar la unión de los tetrámeros de péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) conjugados con fluorocromo y las células se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Luego, las células T pan expandidas se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca²/Mg²⁺, suplementada con 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) (tampón de lavado) y se tiñeron con pMHC-tetrámero marcado con R-ficoeritrina (PE) y aloficocianina (APC) y anticuerpo anti-CD8 murino Peridinin-Clorofila-Proteína (PerCP) (Cat. n.º 347314, BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) para determinar el número de células T CD8+ específicas para el péptido viral. Las células se incubaron durante la tinción con tetrámero durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C a las concentraciones recomendadas por el fabricante. Después de la tinción con tetrámero, las células se lavaron dos veces con 2 ml de tampón de lavado, se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos a 4 °C y se resuspendieron en el volumen residual, y se incubaron con el anticuerpo anti-CD8 durante 30 minutos sobre hielo. Las células muertas se excluyeron mediante la tinción con Sytox Blue (1 mM, Molecular Probes, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las células T pan no teñidas se utilizaron para detectar la autofluorescencia o la tinción de fondo. Las células teñidas se analizaron y se clasificaron utilizando un citómetro de flujo CytoFLEX SRT (Beckman Coulter, EE. UU.) en condiciones estériles, y los resultados se analizaron con el software FlowJo versión 10.8.1 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EE. UU.).

Validación in vitro de la especificidad de los TCR de la firma utilizando RNF43 y MSH3 neoAg

Seleccionamos RNF43 (con la secuencia de aminoácidos: TQLARFFPI), uno de los péptidos más recurrentes en los cánceres colorrectales y precánceres con LS y con inmunogenicidad validada que se ha identificado en nuestro trabajo anterior^[1]. Utilizamos este péptido RNF43_3 en conjunto con un dextrámero personalizado (Immudex) para estimular las PBMCs de 2 pacientes con LS, obteniendo así células T específicas para RNF43. Posteriormente, realizamos una secuenciación de ARN de célula única y una secuenciación de TCR de célula única en estas células T CD3+ y CD8+ específicas para RNF43-dextrámero. En paralelo, se utilizó un segundo péptido neoAg recurrente derivado de una mutación de cambio de marco en MSH3 (FLLALWECSL), descrito previamente como un neoAg compartido e inmunogénico en portadores de LS^[8],^[22], para teñir las PBMCs de un portador adicional de LS utilizando un dextrámero HLA-A02:01 específico para MSH3. Luego, comparamos las secuencias TCRβ obtenidas de estas células con nuestros TCRβ de la firma asociados a LS y, por separado, con nuestros TCRβ de la firma asociados a supervivientes de LS para evaluar la superposición y validar la especificidad del neoAg de las secuencias de la firma TCRβ identificadas.

En detalle, las PBMCs de pacientes con LS que portan el alelo HLA-A*02:01 se descongelaron y se cultivaron en placas de 12 pocillos a una densidad de 1,5 × 10⁶ células/pocillo en medio R10 (RPMI 1640 suplementado con L-glutamina (Catálogo n.º 10040CV, Corning, NY), 10% de FBS inactivado por calor (Catálogo n.º SH30070.03, HyClone, Cytiva, MA), 10 mM de tampón HEPES (Catálogo n.º 25060-CI, Corning) y 1 × penicilina-estreptomicina (Catálogo n.º 30002CI, Corning). Para algunos ensayos, este medio se enriqueció aún más con 1000 UI/ml de GM-CSF humano (Catálogo n.º 215-GM-050/CF, R&D Systems, MN), IL-4 humana recombinante (Catálogo n.º 202-IL-050/CF, R&D Systems, MN) y Flt-3L humana (Catálogo n.º 308-FKN-025, R&D Systems, MN) y se incubó durante la noche (día 0). El día 1, las PBMCs se estimularon con péptidos RNF43 o MSH3 (1 µM) sin péptidos virales. Las culturas se suplementaron con citocinas humanas recombinantes: IL-2 (10 UI/ml; Catálogo n.º 202-IL-050, R&D Systems, MN), IL-7 (10 ng/ml; Catálogo n.º 207-IL-025, R&D Systems, MN) e IL-15 (10 ng/ml; Catálogo n.º 200-15, PeproTech). Después de 24 h (día 2), las células se recolectaron y se lavaron con PBS (sin Ca²⁺/Mg²⁺) que contenía 0,5% de BSA. Para la tinción, las células se incubaron con dextrámero HLA-A*02:01 RNF43 (TQLARFFPI) y MSH3 (FLLALWECSL) marcado con PE (10 µl por 50 µl de PBS que contiene 50% de FBS; Immudex) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces, se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos a 4 °C y se resuspendieron en el tampón residual. Luego, las células se tiñeron con anti-CD3-FITC (Catálogo n.º 561807, BD Biosciences, CA), anti-CD8-PerCP (Catálogo n.º 340693, BD Biosciences, CA) y anticuerpos 4-1BB-APC-Cy7 (Catálogo n.º 309830, BioLegend, CA) durante 20 minutos sobre hielo. Las células muertas se excluyeron utilizando Sytox Blue (1 mM, Molecular Probes, CA). Los controles incluyeron PBMCs no teñidas para la autofluorescencia y PBMCs de donantes sanos no coincidentes con HLA como controles negativos. Las células se analizaron y se clasificaron en un citómetro de flujo CytoFLEX SRT (Beckman Coulter, CA), y los datos se procesaron utilizando el software FlowJo v10.8.1 (Tree Star, OR).

Preparación de células para el perfilado de célula única

Para maximizar la viabilidad y la recuperación celular, las muestras se procesaron según la Guía de preparación de células del protocolo demostrado de 10x Genomics (CG00053; 10x Genomics, Pleasanton, CA, EE. UU.). Brevemente, después de retirar el sobrenadante, las células T se lavaron suavemente dos veces en 1,5-3 ml de BSA al 0,04% en PBS. Además, las células se pasaron a través de un tamiz de 35 µm (Tubos de fondo redondo BD Falcon® de 5 ml con tapa de tamiz de células, Corning, NY, EE. UU.) para eliminar los grupos de células. A continuación, las células se tiñeron con 0,4% de azul de tripan y se cuantificaron y se evaluó su viabilidad utilizando el contador de células automatizado Countess 3 (Invitrogen, FL, EE. UU.).

Secuenciación de ARN de célula única 5′ y V(D)J de 10x Genomics

Los análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA) y secuenciación de TCR de célula única (scTCR) se realizaron utilizando la solución de perfilado inmunitario de célula única V1.0 de 10x Genomics según los protocolos del fabricante (10x Genomics V(D)J + 5′ Gene Expression). Las bibliotecas de scRNA se secuenciaron en un sistema Illumina HiSeq 3000 utilizando longitudes de lectura de 26 pb lectura 1, 8 pb índice i7, 98 pb lectura 2. Las bibliotecas de scTCR se secuenciaron en un sistema Illumina HiSeq 3000 utilizando longitudes de lectura de 150 pb lectura 1, 8 pb índice i7, 150 pb lectura 2. Los datos de secuenciación se procesaron por separado utilizando Cell Ranger 2.1.1, que incluyó la generación de archivos fastq, la alineación de las lecturas y el cálculo de las matrices de expresión de genes-células. Las lecturas de TCR se alinearon al genoma de referencia GRCh38 y la anotación de consenso de TCR se realizó utilizando el programa cellranger vdj. Los códigos de barras con un número mayor de recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) que los simulados en el fondo se identificaron como códigos de barras de células. Para cada código de barras, cellranger realizó un ensamblaje de novo e identificó los contigs productivos junto con sus regiones CDR3 correspondientes y los genes V, D, J, C.

Los resultados de la expresión génica de célula única se procesaron utilizando Cell Ranger v8 multi y se alinearon al genoma de referencia GRCh38. Los recuentos de secuencias se analizaron luego utilizando la canalización Seurat v5. Las células con más del 5% de contenido de genes mitocondriales se eliminaron. La normalización de datos se realizó utilizando el método de normalización logarítmica y se identificaron las características variables. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) y los primeros 30 componentes principales (PC) se utilizaron para los análisis posteriores, incluida la agrupación y la visualización con la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP). Se identificaron los genes marcadores principales para cada grupo y se clasificaron por el valor P ajustado de BH utilizando la prueba de Wilcoxon, y los tipos de células se anotaron manualmente.

Análisis estadísticos

Se utilizó PRISM8 para realizar todos los análisis estadísticos. La prueba de Mann-Whitney se utilizó para evaluar la significación estadística de las diferencias entre los supervivientes de LS, los supervivientes de LS y los controles en el contexto de la clonalidad, la diversidad, el índice de Morisita, la ocupación del espacio del repertorio de TCRβ grandes, medianos y pequeños, el sexo de los individuos, la institución de la que se obtuvieron las muestras y el gen MMR con la variante patogénica de la línea germinal. Se utilizó una prueba de Chi-cuadrado para evaluar la significación estadística de las diferencias entre el porcentaje de TCRβ de cada grupo específico de la enfermedad que se anota en la cohorte de supervivientes y supervivientes de LS y los controles. Además, la distribución de la ley de potencias de los TCR presentes en los sujetos se estimó utilizando un modelo lineal. Esto se hizo después de transformar logarítmicamente el porcentaje de sujetos positivos y el rango percentil de los TCR (log10(y) = log10(k) + log(C) * α). Además, para evaluar los efectos del estado de la enfermedad de LS (superviviente, superviviente o control) en combinación con la edad, la institución de la que se obtuvieron las muestras, el sexo de los individuos, el gen MMR con la variante patogénica de la línea germinal y el material de entrada (sangre o PBMCs), en el índice de clonalidad de Simpson (variable dependiente), se aplicó un modelo lineal generalizado para datos distribuidos gamma utilizando el paquete Stats (versión 3.6.2) en R, dada la distribución gamma de la variable del índice de clonalidad de Simpson. En más detalle, el índice de clonalidad de Simpson se estableció como la variable de respuesta, y el estado de la enfermedad, la institución de la que se obtuvieron las muestras, el sexo, el gen MMR que porta la variante patogénica de la línea germinal, el material de entrada (PBMCs o sangre total), así como la edad de los individuos se utilizaron como variables predictoras. Para inferir la significación de la correlación entre la edad del individuo y el índice de clonalidad de Simpson, se utilizó el coeficiente de correlación de rango de Spearman no paramétrico. Para cada prueba, la significación se definió por un valor de P < 0,05.

Referencias requeridas

Resumen del informe

Se puede encontrar información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Resumen del informe

Se puede encontrar información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.