Nanovesículas exosómicas diseñadas para la administración de anticuerpos en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que incluye la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), es un trastorno gastrointestinal crónico y recurrente que se caracteriza por síntomas debilitantes como diarrea, dolor abdominal y sangrado rectal, que a menudo progresan a complicaciones que ponen en peligro la vida^[1]. Un factor clave en la patogénesis de la EII es la inflamación intestinal sostenida, junto con una alteración de la tolerancia inmunitaria, lo que conduce a un círculo vicioso de desregulación inmunitaria^[2],^[3]. Si bien los tratamientos actuales, que incluyen probióticos, medicamentos de molécula pequeña, inmunosupresores y biológicos, pueden reducir los síntomas de la enfermedad, su eficacia para revertir la desregulación inmunitaria sigue siendo limitada^[4]–^[6]. Es fundamental destacar que el desequilibrio inmunológico no resuelto aumenta el riesgo de recurrencia de la enfermedad y contribuye a complicaciones progresivas, como la fibrosis intestinal y el cáncer colorrectal asociado a la colitis (CAC). La fibrosis intestinal se caracteriza por el engrosamiento de las paredes intestinales y la reducción del peristaltismo, lo que finalmente conduce a la estenosis intestinal y a una obstrucción que pone en peligro la vida. La incidencia acumulada de fibrosis intestinal se informa como >50% en la EC y del 2 al 11% en la CU^[7],^[8]. En paralelo, la desregulación inmunitaria crónica promueve mutaciones somáticas en las células epiteliales intestinales, incluidos genes supresores de tumores clave como TP53, lo que impulsa la progresión hacia el CAC. Los pacientes con EII tienen un riesgo ~2-3 veces mayor de desarrollar CAC en comparación con la población general^[9]–^[11]. A pesar de esto, actualmente no existen tratamientos aprobados por la FDA para la fibrosis intestinal^[8], y el CAC sigue asociado con malos resultados clínicos^[11]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de estrategias terapéuticas que no solo supriman la inflamación, sino que también restauren la tolerancia inmunitaria para corregir la desregulación inmunitaria, con el objetivo de reducir la gravedad de la enfermedad y las complicaciones a largo plazo.

La citocina proinflamatoria interleucina-23 (IL-23) desempeña un papel central en la patogénesis de la EII al promover la diferenciación, la expansión y la función efectora de las células T colaboradoras 17 (Th17)^[12]. Las células Th17 exacerban la EII al secretar citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-17A), lo que provoca una disfunción de la barrera epitelial y un daño tisular crónico, perpetuando así la cascada inflamatoria^[13],^[14]. Los anticuerpos terapéuticos dirigidos a la IL-23 neutralizan específicamente estas citocinas, interrumpiendo eficazmente la cascada inflamatoria y reduciendo los síntomas de la enfermedad. Los estudios clínicos han demostrado que los anticuerpos anti-IL-23 logran tasas de remisión de ~40%, superando sustancialmente a las terapias convencionales, que generalmente producen tasas de remisión inferiores al 20%^[15],^[16]. Sin embargo, la administración sistémica de anticuerpos anti-IL-23 puede provocar inmunosupresión no dirigida, lo que aumenta el riesgo de infecciones oportunistas^[17]. En consecuencia, el desarrollo de sistemas de administración dirigidos es esencial para mejorar la seguridad terapéutica y mejorar la eficacia del tratamiento.

Las células T reguladoras (Treg) son cruciales para mantener la tolerancia inmunitaria^[18],^[19], lo que convierte a las terapias basadas en Treg en candidatos prometedores para el tratamiento de la EII, como lo demuestran los estudios clínicos y preclínicos en curso^[20]–^[22]. Sin embargo, la aplicación directa de Treg se ve dificultada por protocolos complejos de aislamiento y expansión, así como por su estabilidad reducida dentro del microambiente inflamatorio^[14],^[23]. Como alternativa, los exosomas derivados de Treg han surgido como potentes nanovesículas inmunomoduladoras. Estas nanovesículas llevan consigo diversas biomoléculas funcionales, incluidos citocinas, microARN y proteínas, que facilitan la regulación inmunitaria al dirigirse y reprogramar las células inmunitarias receptoras^[24],^[25]. Es importante destacar que la terapia con rEXO evita los problemas de estabilidad asociados con la terapia celular basada en Treg, lo que la convierte en una estrategia atractiva para modular la tolerancia inmunitaria en la EII.

Las características patológicas de la EII incluyen un entorno inflamatorio y un daño en la vasculatura intestinal^[26],^[27]. Las integrinas de alta afinidad que se unen a las moléculas de adhesión endotelial reguladas al alza por la inflamación se expresan en la superficie de las células Treg, lo que permite dirigir las lesiones inflamadas^[28],^[29]. Las plaquetas, que poseen moléculas de superficie únicas (por ejemplo, GPIbα), pueden localizarse preferentemente en la vasculatura dañada a través de una adhesión robusta al colágeno expuesto en el endotelio vascular lesionado^[30],^[31]. La estrategia de ingeniería híbrida de plaquetas y Treg ofrece un enfoque para permitir la administración de fármacos específica de la lesión a través de un mecanismo de direccionamiento dual para la terapia de la EII.

Inspirados en estos hallazgos, diseñamos un sistema nanovesicular híbrido de plaquetas y Treg (PrEXO-a23) para la administración específica de la lesión de agentes antiinflamatorios y de tolerancia inmunitaria para abordar la desregulación inmunitaria en el tratamiento de la EII. Se fusionó rEXO con vesículas de membrana de plaquetas (PMV) para generar nanovesículas híbridas (PrEXO), seguido de la conjugación de anticuerpos anti-IL-23 (a23) a través de un enlazador peptídico clivable por metaloproteinasas (MMP). Las MMP se expresan en exceso y son liberadas por las células estromales activadas y las células inmunitarias que se infiltran en la mucosa intestinal inflamada en la EII^[32]. La introducción de un enlazador clivable por MMP9 puede aprovechar el microambiente patológico para controlar la liberación del fármaco, maximizando así la eficacia terapéutica local y minimizando la exposición sistémica y la inmunosupresión no dirigida^[24],^[33]. Por lo tanto, después de la administración intravenosa de PrEXO-a23, este se acumuló selectivamente en los sitios de las lesiones colónicas dañadas e inflamadas debido a la adhesión mediada por plaquetas y a la orientación de la inflamación derivada de Treg. El escisión por MMP promovió la liberación de a23 y PrEXO dentro de las lesiones de la EII enriquecidas con MMP. La liberación de a23 neutralizó la citocina IL-23, lo que suprimió la inflamación, mientras que PrEXO, enriquecido con moléculas inmunomoduladoras de Treg, reprogramó las células inmunitarias locales en fenotipos reguladores, como las células dendríticas tolerogénicas (tDC) y las Treg, promoviendo la tolerancia inmunitaria. Como resultado, en los modelos murinos de EII, el tratamiento con PrEXO-a23 moduló eficazmente la desregulación inmunitaria colónica, lo que condujo a una remisión integral de la EII, incluido el alivio de los síntomas, la reparación de la barrera intestinal y la normalización de la microbiota. Además, PrEXO-a23 disminuyó significativamente el riesgo de complicaciones, como la fibrosis intestinal y el CAC. Es importante destacar que la acción de PrEXO-a23 para prevenir la progresión del CAC depende parcialmente de p53 (Fig. 1).

Resultados

Ingeniería de una nanovesícula exosomal biomimética (PrEXO-a23) para la administración dirigida del anticuerpo inmunomodulador IL-23

Las células CD4+ naïves aisladas de los bazo de ratón se diferenciaron con éxito en Treg, como lo confirmó el análisis de citometría de flujo que mostró la expresión de CD25 y FOXP3 en el día 7 (Fig. 1 suplementaria). Posteriormente, los exosomas derivados de Treg (rEXO) se aislaron del sobrenadante celular mediante ultracentrifugación y se verificó mediante Western blot que conservaban las proteínas inmunosupresoras de Treg, como IL-10 y CTLA-4 (Fig. 2 suplementaria). Las vesículas de membrana de plaquetas (PMV) se prepararon a partir de sangre entera utilizando ciclos repetidos de congelación-descongelación seguidos de extrusión en serie. Luego, rEXO y PMV se fusionaron mediante una coextrusión adicional para generar vesículas híbridas (PrEXO). El análisis de citometría de flujo de nanoflujo reveló que una relación de masa de 1:1 de PMV a rEXO logró la mayor eficiencia de fusión (Fig. 3 suplementaria), y esta relación se utilizó para todos los experimentos posteriores. Para equipar estas vesículas híbridas para la administración controlada de anticuerpos, utilizamos un enlazador peptídico clivable por MMP (Arg-Val-Gly-Leu-Pro) que lleva terminales N-hidroxisuccinimida (NHS) y maleimida (Mal). El extremo NHS reaccionó con las aminas primarias del anticuerpo para producir el enlazador-a23 (Fig. 4 suplementaria). Cuando la relación molar de a23 al enlazador fue de 1:50, la eficiencia de conjugación del enlazador a a23 fue la más alta (Fig. 5a suplementaria). Posteriormente, los tioles de la superficie de PrEXO se activaron mediante una reducción suave y se hicieron reaccionar con el enlazador-a23 para formar enlaces tioéter estables a través del grupo maleimida y generar PrEXO-a23. El ensayo inmunoenzimático (ELISA) determinó la eficiencia de conjugación de a23 a PrEXO, lo que reveló que una relación de masa de PrEXO a a23 de 1:0,5 logró la eficiencia de conjugación óptima (Fig. 5b suplementaria). Por lo tanto, a lo largo de este estudio, se utilizó una relación molar de a23 al enlazador de 1:50 y una relación de masa de PrEXO a a23 de 1:0,5 para preparar las formulaciones de PrEXO-a23.

El análisis de microscopía electrónica de transmisión (MET) demostró que PrEXO-a23 mantuvo la típica morfología en forma de copa de los exosomas (~100 nm), y el etiquetado con oro inmunitario confirmó la conjugación superficial de a23 (Fig. 2a). En comparación con PrEXO, PrEXO-a23 exhibió un ligero aumento en el tamaño de las partículas y una reducción en el potencial zeta (Fig. 2b, c y Fig. 6 suplementaria). Los resultados de la microscopía confocal láser de barrido (CLSM) revelaron una alta colocalización de las señales de rEXO marcadas con DiI, PMV marcadas con DiD y a23 marcadas con Alexa Fluor 488 en PrEXO-a23 (Fig. 2d), lo que confirmó la construcción exitosa de PrEXO-a23. El análisis de Western blot verificó la presencia de proteínas exosómicas (ALIX, TSG101), receptor de quimiocinas (CCR6), marcadores de plaquetas (GPIbα y CD62P) y a23 en PrEXO-a23 (Fig. 2e y Fig. 7 suplementaria), lo que indica la retención de componentes funcionales. La expresión de MMP9 se incrementó notablemente en los tejidos colónicos inflamados de ratones con EII en comparación con los controles sanos (Fig. 8a, b suplementaria) y fue significativamente mayor que en el suero de los mismos ratones (Fig. 8c suplementaria). Esta enzima facilitó la liberación responsiva de a23 de PrEXO-a23, lo que se suprimió mediante el inhibidor de MMP9 GM6001 (Fig. 2f). El a23 liberado conservó su actividad de neutralización de IL-23 (Fig. 2g). Es importante destacar que PrEXO-a23 se mantuvo estable durante 7 días en PBS a 4 °C (Fig. 2h) y en plasma a 37 °C (Fig. 9 suplementaria), sin cambios detectables en el tamaño o el potencial zeta, lo que respalda su potencial para la aplicación in vivo.

Efectos antiinflamatorios y protectores de las células epiteliales de PrEXO-a23

Para investigar los efectos reguladores de PrEXO-a23 sobre la diferenciación de las células Th17 y su potencial para proteger las células epiteliales intestinales, establecimos un modelo de cocultivo. Las células CD4+ naïves se sembraron en la cámara superior y se trataron con IL-6 e IL-23 para inducir la polarización de Th17. Luego, las células se trataron con PBS (grupo Th17), rEXO (grupo rEXO), PMV (grupo PMV), PrEXO (grupo PrEXO), a23 (grupo a23) o PrEXO-a23 (grupo PrEXO-a23). Las células no tratadas sirvieron como control negativo (grupo Control). Después de 72 horas de tratamiento, las células epiteliales colónicas NCM460 se sembraron en la cámara inferior y se cocultivaron con las células pretratadas durante 24 horas adicionales para evaluar la respuesta epitelial (Fig. 3a).

El análisis de citometría de flujo reveló que IL-6 e IL-23 indujeron con éxito la diferenciación de las células T naïves en células Th17 en el grupo Th17, como lo evidenció un aumento en la proporción de células CD4+IL-17A+ en comparación con el control (Fig. 3b y Fig. 10 suplementaria). En comparación con el grupo Th17, el tratamiento con PMV no mostró efectos inhibitorios sobre la diferenciación de las células Th17. El tratamiento con el anticuerpo neutralizante de IL-23 a23 redujo significativamente la diferenciación de Th17 (P = 0,0001), lo que confirmó su actividad de bloqueo funcional. Los tratamientos con rEXO y PrEXO mostraron efectos inhibitorios eficaces, mientras que PrEXO-a23 exhibió la supresión más pronunciada, reduciendo la diferenciación de las células Th17 a niveles comparables a los de los controles no tratados. Mientras tanto, el análisis de ELISA de los sobrenadantes reveló niveles elevados de citocinas proinflamatorias IL-17A y TNF-α en el grupo Th17, lo que es consistente con la activación de Th17. No hubo una diferencia significativa en la secreción de estas citocinas inflamatorias en el grupo PMV (Fig. 3c, d). En contraste, los tratamientos con rEXO y PrEXO redujeron los niveles de estas citocinas, con PrEXO-a23 mostrando una reducción más pronunciada y llevándolos a niveles comparables al control.

A continuación, examinamos los efectos de la polarización Th17 en la viabilidad de las células epiteliales. Los resultados mostraron que la apoptosis y la necrosis de las células NCM460 aumentaron significativamente cuando se cultivaron en monocultivo con células Th17 en el grupo Th17 (P < 0,0001), lo que indica daño en las células epiteliales. De manera similar, el PMV solo ejerció un efecto protector mínimo contra el daño epitelial inducido por Th17. Cabe destacar que el tratamiento con PrEXO-a23 alivió significativamente este daño, reduciendo tanto la apoptosis como la necrosis y demostrando un robusto efecto protector epitelial (P < 0,0001, Fig. 3e y Fig. S10b, c). Estos hallazgos indican claramente que PrEXO-a23 protege a las células epiteliales intestinales del daño al inhibir la diferenciación de las células Th17 y la secreción de citocinas inflamatorias, ejerciendo así efectos antiinflamatorios y protectores epiteliales.

PrEXO-a23 reprograma las células dendríticas hacia un fenotipo tolerogénico y promueve la expansión de las Tregs

Las células dendríticas (DCs) son reguladores clave de las respuestas inmunitarias, ya que modulan la diferenciación de las células T a través de sus distintos fenotipos^[34]. Las DCs maduras (mDCs) impulsan las funciones efectoras inmunitarias, caracterizadas por una mayor expresión de los marcadores costimuladores (CD80, CD86 y MHC II) y la secreción de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-6 y TNF-α). En contraste, las DCs tolerogénicas (tDCs) muestran niveles reducidos de estos marcadores y una mayor producción de citocinas inmunosupresoras, incluidas la IL-10 y el TGF-β, promoviendo la tolerancia inmunitaria al facilitar la inducción de Tregs y suprimir la diferenciación de las células Th17^[35]–^[37].

Dado el papel de los exosomas derivados de Tregs en el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria^[38], evaluamos si PrEXO-a23 podría reprogramar las mDCs hacia un fenotipo tolerogénico. Las DCs inmaduras (imDCs) se estimularon con lipopolisacárido (LPS) e IFN-γ para inducir mDCs maduras y, posteriormente, se trataron con varias formulaciones, que incluyeron PBS (grupo mDC), rEXO (grupo rEXO), PMV (grupo PMV), PrEXO (grupo PrEXO), a23 (grupo a23) o PrEXO-a23 (grupo PrEXO-a23) durante 24 h. Las DCs inmaduras no tratadas (grupo imDCs) sirvieron como control negativo (Fig. 3f). La expresión de los marcadores de superficie y los perfiles de citocinas se analizaron mediante citometría de flujo y ELISA, respectivamente. Como se esperaba, las mDCs mostraron una mayor expresión de CD80, CD86 y MHC II en comparación con las imDCs (Fig. 3g y Fig. S11a), así como una mayor producción de IL-6 y TNF-α (Fig. 3h). El tratamiento con PMV no afectó significativamente estos marcadores o citocinas en las mDCs. Si bien el tratamiento con a23 redujo marcadamente estos marcadores de maduración y disminuyó los niveles de citocinas proinflamatorias, lo que indica un efecto antiinflamatorio, los niveles de IL-10 y TGF-β fueron comparables a los de las mDCs, lo que sugiere que a23 solo no fue suficiente para reprogramar completamente las DCs en un estado tolerogénico. En contraste, tanto los tratamientos con rEXO como con PrEXO dieron como resultado la reducción de los marcadores de maduración y las citocinas proinflamatorias, al tiempo que promovieron la secreción de IL-10 y TGF-β, lo que indica un cambio hacia un fenotipo tolerogénico. Cabe destacar que PrEXO-a23 exhibió los efectos supresores más potentes sobre los marcadores inflamatorios y la mayor promoción de la producción de citocinas antiinflamatorias, lo que sugiere su importante papel en la inducción de la transformación de las DCs en tDCs. Esta mayor eficacia se debió probablemente a los efectos antiinflamatorios de a23, que crearon un microambiente favorable para que PrEXO reprogramara las mDCs en tDCs.

Para explorar aún más el potencial de las tDCs inducidas por PrEXO-a23 en la promoción de la diferenciación de Tregs, cultivamos en monocultivo las mDCs pretratadas con células T naïvas durante 72 h, y los fenotipos de las células T se determinaron mediante citometría de flujo (Fig. 3i). El análisis de citometría de flujo reveló que las mDCs tratadas con PBS del grupo mDC no indujeron significativamente la diferenciación de Tregs en comparación con las imDCs (P = 0,9998, Fig. 3j y Fig. S11b). De manera similar, las mDCs tratadas con PMV y a23 no promovieron la diferenciación de Tregs. Sin embargo, la proporción de Tregs (CD25+ FOXP3+) entre las células T naïvas aumentó significativamente tanto en los grupos de mDCs tratadas con rEXO como con PrEXO en comparación con el grupo mDCs. De manera notable, las tDCs inducidas por PrEXO-a23 condujeron al aumento más significativo en la diferenciación de Tregs (P < 0,0001). Además, estas tDCs redujeron eficazmente la proporción de células Th17 (CD4+ IL-17A+) en comparación con otros tratamientos, con rEXO, PrEXO y a23 mostrando efectos moderados, y PMV solo mostrando un efecto insignificante (Fig. 3k y Fig. S11c).

En conjunto, si bien la monoterapia con a23 inhibió eficazmente la diferenciación de Th17 y la secreción de citocinas proinflamatorias, mostró una capacidad limitada para promover la generación de tDCs y Tregs. PMV no indujo la tolerancia inmunitaria en estas condiciones. En contraste, tanto rEXO como PrEXO indujeron eficazmente la diferenciación de Tregs sobre las células Th17 al promover la polarización de las DCs hacia un fenotipo tolerogénico, apoyando así la tolerancia inmunitaria. Cabe destacar que PrEXO-a23 demostró una capacidad sustancialmente mayor para inducir tDCs y expandir Tregs. Esta mayor eficacia se deriva de la regulación ambiental de la diferenciación de DCs y células T, donde un microambiente inflamatorio dominado por citocinas como la IL-23 impulsa la polarización hacia estados proinflamatorios. La señalización sostenida de IL-23 suprime la expresión de FOXP3, un factor de transcripción crítico para la función de Tregs, lo que dificulta la diferenciación de Tregs y exacerba la pérdida de la tolerancia inmunitaria^[19],^[39],^[40]. Al neutralizar la IL-23, a23 mitigó este ambiente inhibitorio, lo que permitió que la carga tolerogénica intrínseca de PrEXO reprogramara completamente las DCs y las células T hacia un estado regulatorio.

PrEXO-a23 permite la administración dirigida precisa y la liberación dependiente de MMP de anticuerpos a lesiones colónicas inflamadas

Durante la EII, la lesión inflamatoria del endotelio intestinal expone el colágeno subendotelial, al que las plaquetas se adhieren rápidamente a través de las interacciones GPIbα-factor de von Willebrand (vWF) en la sangre^[41]. Para determinar si PrEXO-a23 conserva esta capacidad adhesiva crítica, realizamos un ensayo de circulación sanguínea in vitro utilizando canales de flujo recubiertos con colágeno que imitan los vasos dañados. Las formulaciones marcadas con DiO, que incluyen rEXO, PMV, PrEXO o PrEXO-a23, se introdujeron en el canal de flujo en condiciones de flujo arterial (1000 s−1), y se realizó una imagen de fluorescencia utilizando CLSM. Si bien rEXO mostró una fluorescencia débil en el canal de flujo, tanto PrEXO como PrEXO-a23 mostraron fuertes señales fluorescentes (Fig. S12a), lo que indica una fuerte adherencia a la matriz de colágeno. Estos resultados confirmaron que la hibridación de la membrana plaquetaria confirió una mayor adhesión en condiciones de alto cizallamiento, prolongando la retención en los sitios de la lesión, y que la conjugación con a23 no afectó esta capacidad.

A continuación, para determinar su orientación a las células inflamatorias, incubamos macrófagos y neutrófilos RAW264.7 activados con LPS con formulaciones marcadas con DiI. CLSM reveló que todas las formulaciones se unieron fuertemente a las células RAW264.7 tratadas con LPS después de 2 h, mientras que la unión a los controles no tratados fue mínima (Fig. S12b). El resultado de la citometría de flujo de los neutrófilos pretratados con LPS confirmó esta tendencia (Fig. S12c). Esta mayor capacidad de orientación se debe probablemente al aumento de las interacciones moleculares entre los receptores de adhesión expresados en exceso en las células inflamadas y los ligandos correspondientes en las membranas híbridas. Además, en presencia de células RAW264.7, PrEXO-a23 liberó eficazmente a23 tras la exposición a MMP9 (Fig. S12d).

Animados por estos hallazgos in vitro, investigamos el rendimiento de orientación in vivo de PrEXO-a23 en un modelo de EII murino inducido por sulfato de dextrano sódico (DSS). Las formulaciones marcadas con DiD, que incluyen rEXO, PMV, rEXO + PMV (mezcla física), PrEXO o PrEXO-a23, se administraron por vía intravenosa, y la biodistribución se monitoreó mediante un sistema de imagen in vivo. PrEXO y PrEXO-a23 mostraron una fuerte acumulación en los tejidos intestinales inflamados dentro de las 2 h posteriores a la inyección, alcanzaron un máximo a las 12 h y mantuvieron una fuerte retención hasta las 48 h. Las otras formulaciones mostraron una orientación intestinal más débil y menos duradera (Fig. 4a y Fig. S13a). El análisis farmacocinético mostró que la vida media de eliminación de PrEXO-a23 en la sangre fue de aproximadamente 1,44 h (Fig. S13b). La imagen ex vivo de los colones cosechados y las secciones de tejido congelado confirmó una orientación significativamente mayor a la lesión por parte de PrEXO y PrEXO-a23 en comparación con los controles (P < 0,0001, Fig. 4b–d). PrEXO-a23 exhibió las relaciones colon-hígado más altas de intensidad de fluorescencia, lo que indica aún más su mayor selectividad del sitio de la enfermedad (Fig. S13c–e). Además, la citometría de flujo de las células inmunitarias intestinales reveló una captación eficiente de PrEXO-a23 por las células dendríticas, los macrófagos, las células T, las células B y los neutrófilos (Fig. 4e y Fig. S13f). Es importante destacar que PrEXO-a23 superó a rEXO en la orientación a la lesión, lo que sugiere que la fusión de la membrana mejora sinérgicamente la adhesión a los vasos dañados (a través de PMV) y la orientación de las células inflamadas (a través de rEXO). Por lo tanto, PrEXO-a23 demuestra una capacidad de orientación dual, dirigiéndose eficazmente tanto a los vasos sanguíneos dañados como al tejido colónico inflamado, lo que ofrece una prometedora estrategia de administración dirigida para la terapia de la EII.

Para dilucidar aún más el mecanismo de la administración dirigida y la liberación dependiente de MMP del anticuerpo por parte de PrEXO-a23, realizamos un análisis de seguimiento in vivo de doble etiqueta para monitorear de forma independiente el anticuerpo (a23) y el portador (PrEXO). a23 se etiquetó con Alexa Fluor 647, y PrEXO se etiquetó con DiR. Se incluyeron tres grupos para la comparación: PrEXO + a23 (una mezcla física de PrEXO y a23), PrEXO-fL-a23 (PrEXO y a23 se conjugaron con un péptido no escindible, fL) y PrEXO-a23 (PrEXO y a23 se conjugaron con el péptido escindible por MMP). Tras la administración intravenosa, se realizaron imágenes in vivo y ex vivo en puntos de tiempo predeterminados para evaluar la distribución y la retención en ratones con EII inducida por DSS y en colones aislados. En el grupo PrEXO + a23, la señal de DiR-PrEXO se acumuló fuertemente en las lesiones del colon, alcanzó su punto máximo a las 12 h y persistió hasta las 48 h, lo que demuestra que PrEXO se dirige eficazmente a los tejidos del colon inflamados (Fig. 4f–h), lo que es consistente con la orientación observada en la Fig. 4a–c. Sin embargo, la señal de Alexa Fluor 647-a23 en este grupo fue débil y disminuyó rápidamente, volviéndose casi indetectable después de 12 h, lo que indica una mala orientación a la lesión y una rápida eliminación del anticuerpo libre. En contraste, tanto los grupos PrEXO-fL-a23 como PrEXO-a23 mostraron señales de PrEXO de intensidad y duración similares a la mezcla física, pero, lo que es importante, sus señales de a23 fueron significativamente más fuertes y más persistentes (más altas que en la mezcla física, Fig. 4h). Estos resultados demostraron que tanto PrEXO como a23 en PrEXO-a23 se administraron eficazmente a las lesiones del colon, lo que se atribuyó a la capacidad de orientación a la lesión de PrEXO, lo que permitió la coadministración de a23 mediante el enlace.

A continuación, realizamos un análisis CLSM en secciones de tejido de colon de ratones con EII para confirmar la liberación de PrEXO y a23 tras la escisión dependiente de MMP9 de PrEXO-a23 en las lesiones. Como se muestra en la Fig. 4i, el grupo PrEXO-fL-a23 no escindible mostró una fuerte colocalización espacial de a23 (verde) y PrEXO (rojo), lo que indica la administración simultánea del anticuerpo y el portador a las lesiones. En contraste, se detectó una clara separación espacial de las dos señales en el grupo PrEXO-a23, lo que confirmó la escisión in situ del enlazador escindible por MMP y la posterior liberación de a23 y PrEXO en las lesiones del colon.

En conjunto, estos hallazgos demuestran que PrEXO-a23 no solo logra la administración dirigida de ambos, el portador y el anticuerpo, al sitio de la inflamación, sino que también se somete a una escisión dependiente de MMP eficiente para liberar el anticuerpo terapéutico y PrEXO.

PrEXO-a23 corrige la desregulación inmunitaria mediante la modulación dual de la inflamación y la tolerancia en la EII

Evaluamos la eficacia terapéutica de PrEXO-a23 en un modelo de colitis inducida por DSS, centrándonos en su capacidad para modular la desregulación inmune mediante la supresión simultánea de la inflamación y la promoción de la tolerancia inmunitaria. Se administró a ratones C57BL/6 un 3% (p/v) de DSS en el agua de beber durante 7 días para inducir colitis, y se dividieron aleatoriamente en cinco grupos de tratamiento que recibieron inyecciones intravenosas cada dos días: PBS (grupo DSS), PrEXO (grupo PrEXO), anticuerpo IL-23 (grupo a23), rEXO-a23 (grupo rEXO-a23) o PrEXO-a23 (grupo PrEXO-a23). Los ratones sanos sin DSS sirvieron como controles (grupo Salud). Se recogieron tejidos cólicos el día 8 para los análisis posteriores.

La inflamación persistente en la EII se caracteriza por una infiltración excesiva de células inmunitarias innatas y una producción de citocinas desregulada^[3],^[42]. El análisis de inmunofluorescencia de los tejidos cólicos reveló que el tratamiento con PrEXO-a23 redujo significativamente la infiltración de células dendríticas CD86⁺ (P < 0,0001) y macrófagos CD68⁺ (P = 0,0010), con mayores reducciones que las observadas para las monoterapias PrEXO o a23 (Fig. 5a-c). La evaluación adicional de los perfiles de citocinas cólicas mediante inmunohistoquímica, ELISA y RT-qPCR demostró que el tratamiento con DSS aumentó notablemente las citocinas proinflamatorias IL-17A, IL-6, TNF-α, IL-23 e IFN-γ, mientras que la IL-10 antiinflamatoria se suprimió en comparación con los controles sanos (Fig. 5d-f y Fig. S14a, b). Estas citocinas son mediadores críticos de la patogénesis de la EII: IL-23 e IL-17 promueven la diferenciación patógena de Th17^[3], IFN-γ y TNF-α exacerban la inflamación crónica y el daño del tejido intestinal^[43],^[44], y la IL-6 se correlaciona con la actividad de la enfermedad^[45], mientras que la IL-10 promueve la tolerancia inmunitaria y la protección de la mucosa^[46]. Si bien el a23 libre demostró cierta actividad antiinflamatoria in vitro, su eficacia in vivo fue limitada, reduciendo moderadamente el IFN-γ, la IL-23 y la IL-17A, y mostrando un impacto insignificante en la IL-6, el TNF-α o la IL-10. Esto se atribuyó a una mala focalización de la lesión y a una insuficiente acumulación del fármaco. Además, la monoterapia con a23 tuvo una eficacia insuficiente en la regulación de la tolerancia inmunitaria. En contraste, PrEXO-a23 suprimió ampliamente todas las principales citocinas proinflamatorias a niveles cercanos a los de los sujetos sanos, al tiempo que aumentaba significativamente la IL-10 (P < 0,0001). Estos efectos terapéuticos probablemente se deben a la focalización de la lesión mediada por la membrana híbrida, que administra a23 para inhibir localmente el eje IL-23/Th17, combinado con el papel de PrEXO como modulador de la tolerancia inmunitaria para regular el microambiente inflamatorio.

Estudios previos han sugerido que la promoción de la diferenciación de Treg y la inhibición de las respuestas Th1/Th17 pueden aliviar significativamente la EII al restaurar la tolerancia inmunitaria^[22],^[47]. El tinte de inmunofluorescencia de los tejidos cólicos mostró que el tratamiento con PrEXO-a23 disminuyó sustancialmente la infiltración de células T CD4⁺ en comparación con los ratones con DSS (Fig. S14c). A continuación, se realizó un análisis de citometría de flujo para cuantificar las proporciones de Tregs (CD4⁺ FOXP3⁺), células Th1 (CD4⁺ IFN-γ⁺) y células Th17 (CD4⁺ IL-17A⁺) entre las células T CD4⁺. En comparación con los ratones sanos, los ratones con DSS mostraron frecuencias reducidas de Tregs y proporciones elevadas de Th1 y Th17, lo que confirmó la ruptura de la tolerancia inmunitaria (Fig. 5g, h). En comparación con el grupo DSS, el tratamiento con a23 disminuyó significativamente las poblaciones de Th1 (P = 0,0061) y células Th17 (P = 0,0090), pero tuvo efectos mínimos en la proporción de Tregs, lo que es consistente con su perfil antiinflamatorio in vitro y su capacidad limitada para promover la reprogramación tolerogénica. Aunque PrEXO mostró cierto potencial para inducir Tregs y suprimir las células Th17 in vitro, su efecto promotor de Tregs se atenuó in vivo, probablemente debido a señales inflamatorias antagónicas, como la inestabilidad de Tregs mediada por IL-23^[19],^[39],^[40]. En contraste, PrEXO-a23 provocó la respuesta inmunorreguladora más potente, con una inducción significativa de Tregs y una supresión concurrente de las células Th1 y Th17 (P < 0,0001), restaurando un perfil inmunitario comparable al de los ratones sanos. Este efecto mejorado probablemente se debe a la combinación sinérgica de a23, que establece un entorno antiinflamatorio propicio para la tolerancia, y PrEXO, que promueve la diferenciación de Tregs. En conjunto, estos datos demuestran que PrEXO-a23 proporciona una estrategia terapéutica dual en el complejo microambiente de la EII mediante: (1) la supresión del eje inflamatorio IL-23/Th17 a través de la administración dirigida de a23 y (2) la promoción de la tolerancia inmunitaria a través de la inducción de Tregs y la reprogramación tolerogénica.

Para dilucidar aún más la base molecular de los efectos inmunorreguladores de PrEXO-a23, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) en los tejidos cólicos, utilizando el grupo DSS como control. El tratamiento con PrEXO-a23 indujo 1134 genes expresados diferencialmente (DEG): 199 regulados al alza y 935 regulados a la baja (Fig. S15a). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) mostró una regulación a la baja significativa de las firmas de genes relacionados con la EII y la diferenciación de Th17 (P < 0,05; Fig. 5i y Fig. S15b). El análisis de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) de los DEG regulados a la baja destacó la supresión de la interacción citocina-receptor de citocinas, TNF, NF-κB, IL-17, JAK/STAT, la señalización del receptor tipo Toll y las vías de diferenciación de Th17 (Fig. 5j). El análisis de la Ontología Génica (GO) indicó además una regulación a la baja significativa de los procesos implicados en la infiltración de células inmunitarias, la respuesta inflamatoria, la producción de citocinas proinflamatorias y la quimiotaxis de neutrófilos (P < 0,05, Fig. S15c). Es importante destacar que PrEXO-a23 redujo notablemente los genes inflamatorios clave (por ejemplo, Ccr2, Ccr5, Il-17a y Tnf) y aumentó los genes antiinflamatorios o asociados a la tolerancia (por ejemplo, Fem1a) (Fig. 5k). En conjunto, estos resultados establecen PrEXO-a23 como una plataforma terapéutica de doble función capaz de extinguir simultáneamente la señalización patógena de IL-23 y regular la tolerancia inmunitaria, resolviendo así la desregulación inmunitaria subyacente a la patogénesis de la EII.

Eficacia terapéutica potente de PrEXO-a23 en el tratamiento de la EII

Para evaluar la eficacia terapéutica de PrEXO-a23, empleamos un modelo de ratón de EII inducida por DSS, caracterizado por características patológicas destacadas, como la pérdida de peso corporal, el aumento del índice de actividad de la enfermedad (DAI), el acortamiento del colon y la esplenomegalia. Los ratones recibieron un 3% (p/v) de DSS en el agua de beber durante 7 días. Mientras tanto, los ratones fueron tratados los días 2, 4 y 6 mediante la administración intravenosa, según lo indicado en la Fig. 6a. El DAI, incluido el cambio de peso, la consistencia de las heces y el sangrado fecal, se controló diariamente. Los tejidos del colon y el bazo se recogieron para su análisis el día 8. El tratamiento con PrEXO, a23 o rEXO-a23 alivió parcialmente la pérdida de peso inducida por DSS (Fig. 6b) y la elevación del DAI (Fig. 6c y Fig. S16a-c), siendo PrEXO-a23 el que demostró el beneficio terapéutico más significativo. La longitud del colon, que se redujo gravemente en el grupo DSS (~4,2 cm), se restauró parcialmente con rEXO-a23 (~5,4 cm) y se extendió aún más a niveles casi normales con PrEXO-a23 (~6,6 cm; Fig. 6d). El análisis del índice del bazo indicó una esplenomegalia significativa en los ratones tratados con DSS (P < 0,0001), que no se observó en el grupo PrEXO-a23 (Fig. S16d), lo que sugiere la atenuación de la inflamación sistémica^[48]. Estos hallazgos destacan la robusta eficacia de PrEXO-a23 en comparación con las monoterapias. El análisis mecanicista sugiere que, si bien PrEXO o a23 solos mostraron efectos terapéuticos limitados debido a una regulación inmunitaria insuficiente, PrEXO-a23 combina la administración dirigida a la lesión con la inmunomodulación sinérgica. rEXO facilita la administración precisa y contribuye a la tolerancia inmunitaria a través de su bioactividad intrínseca, mientras que la adhesión vascular mediada por la fusión PMV mejora la retención en los sitios inflamados, amplificando la acumulación del fármaco y los resultados terapéuticos más allá de los de rEXO-a23.

En la EII, el daño de las células epiteliales intestinales y la infiltración de células inflamatorias alteran la integridad de la barrera mucosa^[49]. El tinte de hematoxilina y eosina (H&E) y la puntuación histológica revelaron que el tratamiento con PrEXO-a23 preservó la integridad del epitelio cólico, manteniendo un epitelio intacto, una arquitectura de criptas regular y capas de la mucosa, junto con una reducción de la infiltración de células inflamatorias en comparación con el grupo DSS (Fig. 6e y Fig. S16e). El tinte de inmunofluorescencia demostró la restauración de la expresión de las proteínas de unión estrecha zonula occludens-1 (ZO-1) y ocludina, que estaban reguladas a la baja en los ratones tratados con DSS, lo que indica una mejora de la reparación de la barrera intestinal (Fig. 6f y Fig. S16f). Estos resultados confirman que PrEXO-a23 previene sustancialmente el daño fisiológico al tejido cólico y preserva la función de la barrera intestinal.

Más allá de la integridad de la barrera, la composición de la microbiota intestinal es un indicador crítico de la salud intestinal. El microambiente inmunitario desregulado en la EII favorece el crecimiento de bacterias patógenas al tiempo que suprime los probióticos beneficiosos, lo que provoca disbiosis^[50]. A continuación, investigamos la modulación de la microbiota por PrEXO-a23 en ratones con EII mediante la secuenciación del gen del ARN ribosómico 16S (ARNr) de las muestras fecales. Un diagrama circos de la comunidad ilustró que PrEXO-a23 alivió las alteraciones en la composición de la microbiota inducidas por DSS (Fig. 6g). En concreto, PrEXO-a23 mitigó la reducción de las bacterias beneficiosas, como Lachnospiraceae y Akkermansiaceae, familias conocidas por sus propiedades antiinflamatorias y probióticas^[51],^[52], al tiempo que suprimió el crecimiento excesivo de Erysipelotrichaceae (Fig. 6h), una familia asociada con la progresión de la EII^[53],^[54]. El análisis del tamaño del efecto discriminante lineal (LEfSe) identificó además los taxones microbianos dominantes que influyen en el entorno intestinal, desde el nivel de familia hasta el de especie. Coherente con los hallazgos anteriores, las abundancias de las bacterias patógenas asociadas a la EII, como Erysipelotrichaceae, Turicibacter y Bacteroides, aumentaron en los ratones tratados con DSS (Fig. 6i). El tratamiento con PrEXO-a23 redujo estas bacterias patógenas al tiempo que enriqueció los microbios beneficiosos, como Lachnospiraceae y Akkermansiaceae, lo que sugiere la restauración de la homeostasis de la microbiota intestinal. Este importante efecto de regulación de la microbiota de PrEXO-a23 probablemente se debe a sus acciones duales antiinflamatorias y promotoras de la tolerancia, que juntas restauran la homeostasis inmunitaria y reparan la barrera epitelial, creando así un microambiente favorable para la recuperación de la microbiota.

En la práctica clínica, la EII se asocia con diversas respuestas inflamatorias extraintestinales, como la inflamación de la piel. Para explorar si PrEXO-a23 puede tratar simultáneamente estas afecciones inflamatorias, establecimos un modelo de ratón de EII comórbida con psoriasis utilizando DSS e imiquimod (IMQ). A continuación, se administró PrEXO-a23 por vía intravenosa para evaluar su acumulación y sus efectos terapéuticos en el sitio de la inflamación. Los resultados mostraron que PrEXO-a23, a través de su estrategia sinérgica de "focalización de la inflamación + adhesión al daño", se enriqueció no solo en las lesiones cólicas, sino también en los sitios de la piel inflamada extraintestinal, sin acumularse en los tejidos sanos (Fig. S17). Además, el tratamiento con PrEXO-a23 alivió eficazmente los síntomas de la EII y la psoriasis, como se demostró mediante la supresión de la pérdida de peso corporal y el acortamiento del colon, y la reducción de las puntuaciones de la actividad de la enfermedad para ambas enfermedades (Fig. S18).

Por último, se evaluó la bioseguridad de PrEXO-a23 tanto in vitro como in vivo. Los ensayos de citotoxicidad in vitro no mostraron efectos adversos sobre la viabilidad de las células epiteliales cólicas en un rango de concentraciones de PrEXO-a23 (Fig. S19a, b). La evaluación de la seguridad in vivo tras la administración intravenosa de PrEXO-a23 en ratones sanos no reveló ninguna anomalía histopatológica en los órganos principales (Fig. S19c). La bioquímica sanguínea (Fig. S19d, e) y los análisis de citocinas confirmaron que los niveles de IFN-γ, IL-6 y TNF-α (Fig. S19f) se mantuvieron dentro de los rangos fisiológicos normales, lo que indica una biocompatibilidad favorable.

Analizamos más a fondo los datos de RNA-seq de tejidos cólicos de ratones con IBD inducida por DSS, comparando los perfiles de expresión génica entre los grupos sano, tratado con DSS y tratado con PrEXO-a23. Entre los genes expresados, 295 presentaron diferencias consistentes en los ratones tratados con DSS en comparación con los controles sanos y el grupo tratado con PrEXO-a23. Utilizando STRING y Cytoscape, construimos una red de interacción proteína-proteína y extrajimos una subred de 89 nodos y 1044 aristas. El análisis MCODE reveló dos módulos altamente interconectados (módulo 1, puntuación = 23,5; módulo 2, puntuación = 8,0), siendo el módulo 1 el que contenía 49 objetivos y 564 interacciones. La clasificación de centralidad de grado dentro de este módulo identificó a Trp53 como el centro pivote (Fig. 7a y Fig. S20). Como supresor tumoral que regula el ciclo celular, la reparación del ADN y la apoptosis, la disfunción de Trp53 es un evento temprano en la carcinogénesis colorrectal asociada a la colitis ulcerosa^[10],^[55]. Cabe destacar que la terapia con PrEXO-a23 reguló p53 en los colones tratados con DSS, lo que sugiere que PrEXO-a23 tiene el potencial de disminuir el riesgo de progresión de la IBD a CAC.

Para evaluar el potencial terapéutico a largo plazo de PrEXO-a23 en la prevención de complicaciones asociadas a la IBD, como la fibrosis intestinal y el CAC, empleamos un modelo de ratón con CAC inducida por azoximetano (AOM)/DSS. Se administró AOM a los ratones, seguido de ciclos repetidos de DSS para inducir colitis crónica y tumorigénesis, y se utilizaron ratones sanos no tratados como controles (grupo Sano). Durante la progresión de la enfermedad, los ratones recibieron inyecciones intravenosas de PBS (grupo AOM/DSS), PrEXO (grupo PrEXO), a23 (grupo a23), rEXO-a23 (grupo rEXO-a23) o PrEXO-a23 (grupo PrEXO-a23) (Fig. 7b). Como se esperaba, los ratones tratados con AOM/DSS mostraron una supervivencia significativamente reducida (P = 0,0208; Fig. 7c), una pérdida de peso sustancial (Fig. S21a) y puntuaciones DAI significativamente elevadas (Fig. 7d), así como una longitud del colon acortada y un aumento de la carga tumoral, tanto en términos de número como de tamaño (Fig. 7e-g y Fig. S21b). Entre todos los grupos de tratamiento, PrEXO-a23 demostró la eficacia terapéutica más robusta, mejorando notablemente la supervivencia, el peso corporal, el DAI y la morfología del colon, hasta niveles comparables con los controles sanos. Es importante destacar que, si bien los tratamientos con PrEXO, a23 y rEXO-a23 conferían una protección parcial, ninguna de estas monoterapias previno el desarrollo de tumores. En contraste, el tratamiento con PrEXO-a23 inhibió por completo la formación de tumores, lo que destaca su potente efecto anticanceroso y su capacidad para detener la progresión de la IBD a CAC.

Dado que el desarrollo del CAC implica una activación inmune mucosa sostenida, una alteración de la barrera epitelial y una hiperproliferación^[11], investigamos más a fondo el impacto de PrEXO-a23 en estos marcadores patológicos. En comparación con el grupo AOM/DSS, PrEXO-a23 disminuyó significativamente los niveles de citocinas proinflamatorias (TNF-α e IL-6) en los tejidos del colon (P = 0,0016 y P = 0,0112; Fig. 7h, i) y normalizó el índice esplénico (Fig. S21c), lo que sugiere una supresión eficaz tanto de la inflamación local como sistémica. El análisis histológico mediante tinción con H&E confirmó la preservación de la arquitectura epitelial y la reducción de la infiltración de células inflamatorias en el grupo PrEXO-a23 (Fig. 7j). Además, la tinción de inmunofluorescencia de Ki67 demostró una supresión de la hiperproliferación epitelial, con índices de proliferación comparables a los de los controles sanos (Fig. 7k y Fig. S21d). En conjunto, estos datos indican que PrEXO-a23 mejora la integridad y la función del colon, como lo demuestra su capacidad para modular la respuesta inmune, reparar la barrera del colon y controlar la proliferación epitelial.

Para evaluar si PrEXO-a23 también protege contra la fibrosis intestinal, una consecuencia común y grave de la IBD crónica, empleamos un modelo de colitis crónica inducida por DSS con tres ciclos de DSS. Los ratones del grupo AOM/DSS mostraron un marcado engrosamiento de la pared del colon, la muscularis mucosa y la muscularis propia, características típicas de la fibrosis (Fig. 7l-o). La tinción inmunohistoquímica para la α-actina de músculo liso (α-SMA), un marcador de la activación de los miofibroblastos, mostró una regulación al alza significativa en los colones fibroticos (P < 0,0001; Fig. 7p, q). Si bien las monoterapias con PrEXO, a23 y rEXO-a23 no inhibieron la progresión fibrotica, el tratamiento con PrEXO-a23 preservó el grosor normal del colon y suprimió la expresión de α-SMA a los niveles basales, lo que indica una prevención eficaz de los cambios fibroticos. PrEXO-a23 mitigó la progresión fibrotica a través de un mecanismo dual coordinado. Al neutralizar la IL-23, podría suprimir la inflamación impulsada por Th17, al tiempo que suministra exosomas derivados de Treg para promover la tolerancia inmune. Esta estrategia combinada antiinflamatoria y pro-tolerogénica no solo corrigió la desregulación inmune subyacente antes de que se produzca la fibrosis patológica, sino que también reprogramó el microambiente local para favorecer las funciones inmunosupresoras y tolerogénicas beneficiosas de los Treg, bloqueando así de forma preventiva la progresión patológica hacia la fibrosis.

Anteriormente demostramos que PrEXO-a23 afectó al cambio en la expresión de Trp53 en los colones tratados con DSS. Para evaluar la contribución de p53 al efecto terapéutico de PrEXO-a23, los ratones fueron cotratados con el inhibidor de p53, pifitrina-α (ip53). Esta intervención disminuyó notablemente la eficacia terapéutica de PrEXO-a23 y anuló sus efectos antitumorales (Fig. 8a-g), lo que sugiere que la actividad de la vía de p53 está asociada con la capacidad de la nanoterapia para prevenir el CAC. Por lo tanto, examinamos los principales mediadores de la señalización de p53 en los tejidos del colon utilizando análisis de RT-qPCR y Western blot. El análisis de RT-qPCR reveló que, durante la progresión del CAC en el grupo AOM/DSS, la expresión de Trp53, Cdkn1a y Bax se redujo significativamente en comparación con los controles sanos, lo que refleja la disfunción de la vía. El tratamiento con PrEXO-a23 restauró su expresión a niveles casi normales, un efecto que se bloqueó parcialmente mediante la inhibición de p53 (PrEXO-a23 + ip53) (Fig. 8h). El análisis de Western blot confirmó estos cambios a nivel de proteína para p53, p21 y Bax (Fig. 8i, j). En conjunto, estos datos demuestran que la capacidad de PrEXO-a23 para prevenir la progresión de la inflamación crónica a cáncer depende parcialmente de la señalización funcional de p53. En conjunto, PrEXO-a23 no solo atenúa la inflamación activa, sino que también proporciona una protección duradera contra la fibrosis y la tumorigénesis, lo que la convierte en una prometedora estrategia terapéutica para el manejo a largo plazo de la IBD y sus complicaciones.

Ingeniería de un nanovesículo exosomal biomimético (PrEXO-a23) para la administración dirigida del anticuerpo inmunomodulador IL-23

Las células T CD4+ ingenuas aisladas de los bazo de ratón se diferenciaron con éxito en Treg, como lo confirmó el análisis de citometría de flujo que mostró la expresión de CD25 y FOXP3 en el día 7 (Fig. S1). Posteriormente, los exosomas derivados de Treg (rEXO) se aislaron del sobrenadante celular mediante ultracentrifugación y se verificó mediante Western blot que conservaban las proteínas inmunosupresoras de Treg, como IL-10 y CTLA-4 (Fig. S2). Las vesículas de membrana plaquetaria (PMV) se prepararon a partir de sangre total utilizando ciclos repetidos de congelación-descongelación seguidos de extrusión en serie. Luego, rEXO y PMV se fusionaron mediante una coextrusión adicional para generar vesículas híbridas (PrEXO). El análisis de citometría de flujo de nanoflujo reveló que una relación de masa de 1:1 de PMV a rEXO logró la mayor eficiencia de fusión (Fig. S3), y esta relación se utilizó para todos los experimentos posteriores. Para equipar estas vesículas híbridas para la administración controlada de anticuerpos, empleamos un enlazador peptídico escindible por MMP (Arg-Val-Gly-Leu-Pro) que contiene terminales de N-hidroxisuccinimida (NHS) y maleimida (Mal). El extremo NHS reaccionó con las aminas primarias del anticuerpo para producir el enlazador-a23 (Fig. S4). Cuando la relación molar de a23 al enlazador fue de 1:50, la eficiencia de conjugación del enlazador a a23 fue la más alta (Fig. S5a). Posteriormente, los tioles de la superficie de PrEXO se activaron mediante una reducción suave y se hicieron reaccionar con el enlazador-a23 para formar enlaces tioéter estables a través del grupo maleimida y generar PrEXO-a23. El ensayo inmunoenzimático (ELISA) determinó la eficiencia de conjugación de a23 a PrEXO, revelando que una relación de masa de PrEXO a a23 de 1:0,5 logró la eficiencia de conjugación óptima (Fig. S5b). Por lo tanto, a lo largo de este estudio, se utilizó una relación molar de a23 a enlazador de 1:50 y una relación de masa de PrEXO a a23 de 1:0,5 para preparar las formulaciones de PrEXO-a23.

El análisis de microscopía electrónica de transmisión (MET) demostró que PrEXO-a23 mantuvo la morfología típica en forma de copa de los exosomas (~100 nm), y el etiquetado con oro inmune confirmó la conjugación superficial de a23 (Fig. 2a). En comparación con PrEXO, PrEXO-a23 exhibió un ligero aumento en el tamaño de las partículas y una reducción en el potencial zeta (Fig. 2b, c y Fig. S6). Los resultados de la microscopía confocal láser de barrido (CLSM) revelaron una alta colocalización de las señales de rEXO marcadas con DiI, PMV marcadas con DiD y a23 marcadas con Alexa Fluor 488 en PrEXO-a23 (Fig. 2d), lo que confirmó la construcción exitosa de PrEXO-a23. El análisis de Western blot verificó la presencia de proteínas exosómicas (ALIX, TSG101), receptor de quimiocinas (CCR6), marcadores plaquetarios (GPIbα y CD62P) y a23 en PrEXO-a23 (Fig. 2e y Fig. S7), lo que indica la retención de componentes funcionales. La expresión de MMP9 se reguló al alza significativamente en los tejidos cólicos inflamados de los ratones con IBD en comparación con los controles sanos (Fig. S8a, b) y fue significativamente mayor que en el suero de los mismos ratones (Fig. S8c). Esta enzima facilitó la liberación responsiva de a23 de PrEXO-a23, lo que se suprimió mediante el inhibidor de MMP9, GM6001 (Fig. 2f). El a23 liberado conservó su actividad de neutralización de IL-23 (Fig. 2g). En particular, PrEXO-a23 se mantuvo estable durante 7 días en PBS a 4 °C (Fig. 2h) y en plasma a 37 °C (Fig. S9), sin cambios detectables en el tamaño o el potencial zeta, lo que respalda su potencial para la aplicación in vivo.

Efectos antiinflamatorios y protectores de las células epiteliales de PrEXO-a23

Para investigar los efectos reguladores de PrEXO-a23 sobre la diferenciación de las células Th17 y su potencial para proteger las células epiteliales intestinales, establecimos un modelo de cocultivo. Las células T CD4+ ingenuas aisladas de los bazo de ratón se sembraron en la cámara superior y se trataron con IL-6 e IL-23 para inducir la polarización de Th17. Luego, las células se trataron con PBS (grupo Th17), rEXO (grupo rEXO), PMV (grupo PMV), PrEXO (grupo PrEXO), a23 (grupo a23) o PrEXO-a23 (grupo PrEXO-a23). Las células no tratadas sirvieron como control negativo (grupo Control). Después de 72 horas de tratamiento, las células epiteliales cólicas NCM460 se sembraron en la cámara inferior y se cocultivaron con las células T pretratadas durante 24 horas adicionales para evaluar la respuesta epitelial (Fig. 3a).

El análisis de citometría de flujo reveló que IL-6 e IL-23 indujeron con éxito la diferenciación de las células T ingenuas en células Th17 en el grupo Th17, como lo demostró un aumento en la proporción de células CD4+IL-17A+ en comparación con el control (Fig. 3b y Fig. S10a). En comparación con el grupo Th17, el tratamiento con PMV no mostró efectos inhibitorios sobre la diferenciación de las células Th17. El tratamiento con el anticuerpo neutralizante de IL-23, a23, redujo significativamente la diferenciación de Th17 (P = 0,0001), lo que confirmó su actividad de bloqueo funcional. Los tratamientos con rEXO y PrEXO mostraron efectos inhibitorios eficaces, mientras que PrEXO-a23 exhibió la supresión más pronunciada, reduciendo la diferenciación de las células Th17 a niveles comparables con los controles no tratados. Mientras tanto, el análisis de ELISA de los sobrenadantes reveló niveles elevados de citocinas proinflamatorias IL-17A y TNF-α en el grupo Th17, lo que es consistente con la activación de Th17. No hubo una diferencia significativa en la secreción de estas citocinas inflamatorias en el grupo PMV (Fig. 3c, d). En contraste, los tratamientos con rEXO y PrEXO redujeron los niveles de estas citocinas, con PrEXO-a23 mostrando una reducción más pronunciada y llevándolos a niveles comparables con el control.

A continuación, examinamos los efectos de la polarización Th17 en la viabilidad de las células epiteliales. Los resultados mostraron que la apoptosis y la necrosis de las células NCM460 aumentaron significativamente cuando se cultivaron en monocultivo con células Th17 en el grupo Th17 (P < 0,0001), lo que indica daño en las células epiteliales. De manera similar, el PMV solo ejerció un efecto protector mínimo contra el daño epitelial inducido por Th17. Cabe destacar que el tratamiento con PrEXO-a23 alivió significativamente este daño, reduciendo tanto la apoptosis como la necrosis y demostrando un robusto efecto protector epitelial (P < 0,0001, Fig. 3e y Fig. S10b, c). Estos hallazgos indican claramente que PrEXO-a23 protege a las células epiteliales intestinales del daño al inhibir la diferenciación de las células Th17 y la secreción de citocinas inflamatorias, ejerciendo así efectos antiinflamatorios y protectores epiteliales.

PrEXO-a23 reprograma las células dendríticas hacia un fenotipo tolerogénico y promueve la expansión de las Tregs

Las células dendríticas (DCs) son reguladores clave de las respuestas inmunitarias, ya que modulan la diferenciación de las células T a través de sus distintos fenotipos^[34]. Las DCs maduras (mDCs) impulsan las funciones efectoras inmunitarias, caracterizadas por una mayor expresión de los marcadores costimuladores (CD80, CD86 y MHC II) y la secreción de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-6 y TNF-α). En contraste, las DCs tolerogénicas (tDCs) muestran niveles reducidos de estos marcadores y una mayor producción de citocinas inmunosupresoras, incluidas la IL-10 y el TGF-β, promoviendo la tolerancia inmunitaria al facilitar la inducción de Tregs y suprimir la diferenciación de las células Th17^[35]–^[37].

Dado el papel de los exosomas derivados de Tregs en el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria^[38], evaluamos si PrEXO-a23 podría reprogramar las mDCs hacia un fenotipo tolerogénico. Las DCs inmaduras (imDCs) se estimularon con lipopolisacárido (LPS) e IFN-γ para inducir mDCs maduras y, posteriormente, se trataron con varias formulaciones, que incluyeron PBS (grupo mDC), rEXO (grupo rEXO), PMV (grupo PMV), PrEXO (grupo PrEXO), a23 (grupo a23) o PrEXO-a23 (grupo PrEXO-a23) durante 24 h. Las DCs inmaduras no tratadas (grupo imDCs) sirvieron como control negativo (Fig. 3f). La expresión de los marcadores de superficie y los perfiles de citocinas se analizaron mediante citometría de flujo y ELISA, respectivamente. Como se esperaba, las mDCs mostraron una mayor expresión de CD80, CD86 y MHC II en comparación con las imDCs (Fig. 3g y Fig. S11a), así como una mayor producción de IL-6 y TNF-α (Fig. 3h). El tratamiento con PMV no afectó significativamente estos marcadores o citocinas en las mDCs. Si bien el tratamiento con a23 redujo marcadamente estos marcadores de maduración y disminuyó los niveles de citocinas proinflamatorias, lo que indica un efecto antiinflamatorio, los niveles de IL-10 y TGF-β fueron comparables a los de las mDCs, lo que sugiere que a23 solo no fue suficiente para reprogramar completamente las DCs en un estado tolerogénico. En contraste, tanto los tratamientos con rEXO como con PrEXO dieron como resultado la reducción de los marcadores de maduración y las citocinas proinflamatorias, al tiempo que promovieron la secreción de IL-10 y TGF-β, lo que indica un cambio hacia un fenotipo tolerogénico. Cabe destacar que PrEXO-a23 exhibió los efectos supresores más potentes sobre los marcadores inflamatorios y la mayor promoción de la producción de citocinas antiinflamatorias, lo que sugiere su importante papel en la inducción de la transformación de las DCs en tDCs. Esta mayor eficacia se debió probablemente a los efectos antiinflamatorios de a23, que crearon un microambiente favorable para que PrEXO reprogramara las mDCs en tDCs.

Para explorar aún más el potencial de las tDCs inducidas por PrEXO-a23 en la promoción de la diferenciación de Tregs, cultivamos en monocultivo las mDCs pretratadas con células T naïvas durante 72 h, y los fenotipos de las células T se determinaron mediante citometría de flujo (Fig. 3i). El análisis de citometría de flujo reveló que las mDCs tratadas con PBS del grupo mDC no indujeron significativamente la diferenciación de Tregs en comparación con las imDCs (P = 0,9998, Fig. 3j y Fig. S11b). De manera similar, las mDCs tratadas con PMV y a23 no promovieron la diferenciación de Tregs. Sin embargo, la proporción de Tregs (CD25+ FOXP3+) entre las células T naïvas aumentó significativamente tanto en los grupos de mDCs tratadas con rEXO como con PrEXO en comparación con el grupo mDCs. De manera notable, las tDCs inducidas por PrEXO-a23 condujeron al aumento más significativo en la diferenciación de Tregs (P < 0,0001). Además, estas tDCs redujeron eficazmente la proporción de células Th17 (CD4+ IL-17A+) en comparación con otros tratamientos, con rEXO, PrEXO y a23 que mostraron efectos moderados, y PMV solo mostrando un efecto insignificante (Fig. 3k y Fig. S11c).

En conjunto, si bien la monoterapia con a23 inhibió eficazmente la diferenciación de Th17 y la secreción de citocinas proinflamatorias, mostró una capacidad limitada para promover la generación de tDCs y Tregs. PMV no indujo la tolerancia inmunitaria en estas condiciones. En contraste, tanto rEXO como PrEXO indujeron eficazmente la diferenciación de Tregs sobre las células Th17 al promover la polarización de las DCs hacia un fenotipo tolerogénico, apoyando así la tolerancia inmunitaria. Cabe destacar que PrEXO-a23 demostró una capacidad sustancialmente mayor para inducir tDCs y expandir Tregs. Esta mayor eficacia se deriva de la regulación ambiental de la diferenciación de DCs y células T, donde un microambiente inflamatorio dominado por citocinas como la IL-23 impulsa la polarización hacia estados proinflamatorios. La señalización sostenida de IL-23 suprime la expresión de FOXP3, un factor de transcripción crítico para la función de Tregs, lo que dificulta la diferenciación de Tregs y exacerba la pérdida de la tolerancia inmunitaria^[19],^[39],^[40]. Al neutralizar la IL-23, a23 mitigó este ambiente inhibitorio, lo que permitió que la carga tolerogénica intrínseca de PrEXO reprogramara completamente las DCs y las células T hacia un estado regulatorio.

PrEXO-a23 permite la administración dirigida precisa y la liberación dependiente de MMP del anticuerpo a las lesiones colónicas inflamadas

Durante la EII, la lesión inflamatoria del endotelio intestinal expone el colágeno subendotelial, al que las plaquetas se adhieren rápidamente a través de las interacciones GPIbα-factor de von Willebrand (vWF) en la sangre^[41]. Para determinar si PrEXO-a23 conserva esta capacidad adhesiva crítica, realizamos un ensayo de circulación sanguínea in vitro utilizando canales de flujo recubiertos con colágeno que imitan los vasos dañados. Las formulaciones marcadas con DiO, que incluyen rEXO, PMV, PrEXO o PrEXO-a23, se introdujeron en el canal de flujo en condiciones de flujo arterial (1000 s−1), y se realizó una imagen de fluorescencia utilizando CLSM. Si bien rEXO mostró una fluorescencia débil en el canal de flujo, tanto PrEXO como PrEXO-a23 mostraron fuertes señales fluorescentes (Fig. S12a), lo que indica una fuerte adherencia a la matriz de colágeno. Estos resultados confirmaron que la hibridación de la membrana plaquetaria confirió una mayor adhesión bajo alto cizallamiento, prolongando la retención en los sitios de la lesión, y que la conjugación con a23 no afectó esta capacidad.

A continuación, para determinar su orientación a las células inflamatorias, incubamos macrófagos y neutrófilos RAW264.7 activados con LPS con formulaciones marcadas con DiI. CLSM reveló que todas las formulaciones se unieron fuertemente a las células RAW264.7 tratadas con LPS después de 2 h, mientras que la unión a los controles no tratados fue mínima (Fig. S12b). El resultado de la citometría de flujo de los neutrófilos pretratados con LPS confirmó esta tendencia (Fig. S12c). Esta mayor capacidad de orientación se debe probablemente al aumento de las interacciones moleculares entre los receptores de adhesión expresados en exceso en las células inflamadas y los ligandos correspondientes en las membranas híbridas. Además, en presencia de células RAW264.7, PrEXO-a23 liberó eficazmente a23 tras la exposición a MMP9 (Fig. S12d).

Animados por estos hallazgos in vitro, investigamos el rendimiento de orientación in vivo de PrEXO-a23 en un modelo murino de EII inducida por sulfato de dextrano (DSS). Las formulaciones marcadas con DiD, que incluyen rEXO, PMV, rEXO + PMV (mezcla física), PrEXO o PrEXO-a23, se administraron por vía intravenosa, y la biodistribución se monitoreó mediante un sistema de imagen in vivo. PrEXO y PrEXO-a23 mostraron una fuerte acumulación en los tejidos intestinales inflamados dentro de las 2 h posteriores a la inyección, alcanzaron un máximo a las 12 h y mantuvieron una fuerte retención hasta las 48 h. Las otras formulaciones mostraron una orientación intestinal más débil y menos duradera (Fig. 4a y Fig. S13a). El análisis farmacocinético mostró que la vida media de eliminación de PrEXO-a23 en la sangre fue de aproximadamente 1,44 h (Fig. S13b). La imagen ex vivo de los colones cosechados y las secciones de tejido congelado confirmó una orientación significativamente mayor a la lesión por parte de PrEXO y PrEXO-a23 en comparación con los controles (P < 0,0001, Fig. 4b–d). PrEXO-a23 exhibió las relaciones colon-hígado más altas de intensidad de fluorescencia, lo que indica aún más su mayor selectividad del sitio de la enfermedad (Fig. S13c–e). Además, la citometría de flujo de las células inmunitarias intestinales reveló una captación eficiente de PrEXO-a23 por las células dendríticas, los macrófagos, las células T, las células B y los neutrófilos (Fig. 4e y Fig. S13f). Es importante destacar que PrEXO-a23 superó a rEXO en la orientación a la lesión, lo que sugiere que la fusión de la membrana mejora sinérgicamente la adhesión a los vasos dañados (a través de PMV) y la orientación de las células inflamadas (a través de rEXO). Por lo tanto, PrEXO-a23 demuestra una capacidad de orientación dual, dirigiéndose eficazmente tanto a los vasos sanguíneos dañados como al tejido colónico inflamado, lo que ofrece una prometedora estrategia de administración dirigida para la terapia de la EII.

Para dilucidar aún más el mecanismo de administración dirigida y la liberación dependiente de MMP del anticuerpo por parte de PrEXO-a23, realizamos un análisis de seguimiento in vivo de doble etiqueta para monitorear de forma independiente el anticuerpo (a23) y el portador (PrEXO). a23 se etiquetó con Alexa Fluor 647, y PrEXO se etiquetó con DiR. Se incluyeron tres grupos para la comparación: PrEXO + a23 (una mezcla física de PrEXO y a23), PrEXO-fL-a23 (PrEXO y a23 se conjugaron con un péptido no escindible, fL) y PrEXO-a23 (PrEXO y a23 se conjugaron con el péptido escindible por MMP). Tras la administración intravenosa, se realizaron imágenes in vivo y ex vivo en puntos de tiempo predeterminados para evaluar la distribución y la retención en ratones con EII inducida por DSS y en colones aislados. En el grupo PrEXO + a23, la señal de DiR-PrEXO se acumuló fuertemente en las lesiones del colon, alcanzó su punto máximo a las 12 h y persistió hasta las 48 h, lo que demuestra que PrEXO se dirige eficazmente a los tejidos del colon inflamados (Fig. 4f–h), lo que es consistente con la orientación observada en la Fig. 4a–c. Sin embargo, la señal de Alexa Fluor 647-a23 en este grupo fue débil y disminuyó rápidamente, volviéndose casi indetectable después de 12 h, lo que indica una mala orientación a la lesión y una rápida eliminación del anticuerpo libre. En contraste, tanto los grupos PrEXO-fL-a23 como PrEXO-a23 mostraron señales de PrEXO de intensidad y duración similares a la mezcla física, pero, lo que es importante, sus señales de a23 fueron significativamente más fuertes y más persistentes (más altas que en la mezcla física, Fig. 4h). Estos resultados demostraron que tanto PrEXO como a23 en PrEXO-a23 se administraron eficazmente a las lesiones del colon, lo que se atribuyó a la capacidad de orientación a la lesión de PrEXO, lo que permitió la coadministración de a23 mediante el enlace.

A continuación, realizamos un análisis de CLSM en secciones de tejido del colon de ratones con EII para confirmar la liberación de PrEXO y a23 tras la escisión dependiente de MMP9 de PrEXO-a23 en las lesiones. Como se muestra en la Fig. 4i, el grupo PrEXO-fL-a23 no escindible mostró una fuerte colocalización espacial de a23 (verde) y PrEXO (rojo), lo que indica la administración simultánea del anticuerpo y el portador a las lesiones. En contraste, se detectó una clara separación espacial de las dos señales en el grupo PrEXO-a23, lo que confirmó la escisión in situ del enlazador escindible por MMP y la posterior liberación de a23 y PrEXO en las lesiones del colon.

En conjunto, estos hallazgos demuestran que PrEXO-a23 no solo logra la administración dirigida conjunta del portador y el anticuerpo al sitio de la inflamación, sino que también se somete a una escisión dependiente de MMP eficiente para liberar el anticuerpo terapéutico y PrEXO.

PrEXO-a23 corrige la desregulación inmunitaria mediante la modulación dual de la inflamación y la tolerancia en la EII

Evaluamos la eficacia terapéutica de PrEXO-a23 en un modelo de colitis inducida por DSS, centrándonos en su capacidad para modular la desregulación inmune mediante la supresión simultánea de la inflamación y la promoción de la tolerancia inmunitaria. Se administró a ratones C57BL/6 un 3% (p/v) de DSS en el agua de beber durante 7 días para inducir colitis, y se dividieron aleatoriamente en cinco grupos de tratamiento que recibieron inyecciones intravenosas cada dos días: PBS (grupo DSS), PrEXO (grupo PrEXO), anticuerpo IL-23 (grupo a23), rEXO-a23 (grupo rEXO-a23) o PrEXO-a23 (grupo PrEXO-a23). Los ratones sanos sin DSS sirvieron como controles (grupo Salud). Se recolectaron tejidos cólicos el día 8 para análisis posteriores.

La inflamación persistente en la EII se caracteriza por una infiltración excesiva de células inmunitarias innatas y una producción de citocinas desregulada^[3],^[42]. El análisis de inmunofluorescencia de los tejidos cólicos reveló que el tratamiento con PrEXO-a23 redujo significativamente la infiltración de células dendríticas CD86⁺ (P < 0,0001) y macrófagos CD68⁺ (P = 0,0010), con mayores reducciones que las observadas para las monoterapias PrEXO o a23 (Fig. 5a–c). La evaluación adicional de los perfiles de citocinas cólicas mediante inmunohistoquímica, ELISA y RT-qPCR demostró que el tratamiento con DSS aumentó notablemente las citocinas proinflamatorias IL-17A, IL-6, TNF-α, IL-23 e IFN-γ, mientras que la IL-10 antiinflamatoria se suprimió en comparación con los controles sanos (Fig. 5d–f y Fig. S14a, b). Estas citocinas son mediadores críticos de la patogénesis de la EII: IL-23 e IL-17 promueven la diferenciación patógena de Th17^[3], IFN-γ y TNF-α exacerban la inflamación crónica y el daño del tejido intestinal^[43],^[44], y la IL-6 se correlaciona con la actividad de la enfermedad^[45], mientras que la IL-10 promueve la tolerancia inmunitaria y la protección de la mucosa^[46]. Si bien el a23 libre demostró cierta actividad antiinflamatoria in vitro, su eficacia in vivo fue limitada, reduciendo moderadamente el IFN-γ, la IL-23 y la IL-17A, y mostrando un impacto insignificante en la IL-6, el TNF-α o la IL-10. Esto se atribuyó a una mala focalización de la lesión y a una insuficiente acumulación del fármaco. Además, la monoterapia con a23 tuvo una eficacia insuficiente en la regulación de la tolerancia inmunitaria. En contraste, PrEXO-a23 suprimió ampliamente todas las principales citocinas proinflamatorias a niveles cercanos a los de los sujetos sanos, al tiempo que aumentaba significativamente la IL-10 (P < 0,0001). Estos efectos terapéuticos probablemente resultan de la focalización de la lesión mediada por la membrana híbrida, que administra a23 para inhibir localmente el eje IL-23/Th17, combinado con el papel de PrEXO como modulador de la tolerancia inmunitaria para regular el microambiente inflamatorio.

Estudios previos han sugerido que la promoción de la diferenciación de Treg y la inhibición de las respuestas Th1/Th17 pueden aliviar significativamente la EII al restaurar la tolerancia inmunitaria^[22],^[47]. El tinte de inmunofluorescencia de los tejidos cólicos mostró que el tratamiento con PrEXO-a23 disminuyó sustancialmente la infiltración de células T CD4⁺ en comparación con los ratones tratados con DSS (Fig. S14c). Luego, se realizó un análisis de citometría de flujo para cuantificar las proporciones de Treg (CD4⁺ FOXP3⁺), células Th1 (CD4⁺ IFN-γ⁺) y células Th17 (CD4⁺ IL-17A⁺) entre las células T CD4⁺. En comparación con los ratones sanos, los ratones tratados con DSS mostraron frecuencias reducidas de Treg y proporciones elevadas de Th1 y Th17, lo que confirmó la ruptura de la tolerancia inmunitaria (Fig. 5g, h). En comparación con el grupo DSS, el tratamiento con a23 disminuyó significativamente las poblaciones de Th1 (P = 0,0061) y células Th17 (P = 0,0090), pero tuvo efectos mínimos en la proporción de Treg, lo que es consistente con su perfil antiinflamatorio in vitro y su capacidad limitada para promover la reprogramación tolerogénica. Aunque PrEXO mostró cierto potencial para inducir Treg y suprimir las células Th17 in vitro, su efecto promotor de Treg se atenuó in vivo, probablemente debido a señales inflamatorias antagónicas, como la inestabilidad de Treg mediada por IL-23^[19],^[39],^[40]. En contraste, PrEXO-a23 provocó la respuesta inmunorreguladora más fuerte, con una inducción significativa de Treg y una supresión concurrente de las células Th1 y Th17 (P < 0,0001), restaurando un perfil inmunitario comparable al de los ratones sanos. Este efecto mejorado probablemente resulta de la combinación sinérgica de a23, que establece un ambiente antiinflamatorio propicio para la tolerancia, y PrEXO, que promueve la diferenciación de Treg. En conjunto, estos datos demuestran que PrEXO-a23 proporciona una estrategia terapéutica dual en el complejo microambiente de la EII mediante: (1) la supresión del eje inflamatorio IL-23/Th17 a través de la administración dirigida de a23 y (2) la promoción de la tolerancia inmunitaria a través de la inducción de Treg y la reprogramación tolerogénica.

Para dilucidar aún más la base molecular de los efectos inmunorreguladores de PrEXO-a23, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) en tejidos cólicos, utilizando el grupo DSS como control. El tratamiento con PrEXO-a23 indujo 1134 genes expresados diferencialmente (DEG): 199 regulados al alza y 935 regulados a la baja (Fig. S15a). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) mostró una disminución significativa de las firmas de genes relacionados con la EII y la diferenciación de Th17 (P < 0,05; Fig. 5i y Fig. S15b). El análisis de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) de los DEG regulados a la baja destacó la supresión de la interacción citocina-receptor de citocinas, TNF, NF-κB, IL-17, JAK/STAT, la señalización del receptor tipo Toll y las vías de diferenciación de Th17 (Fig. 5j). El análisis de la Ontología de Genes (GO) indicó además una disminución significativa de los procesos involucrados en la infiltración de células inmunitarias, la respuesta inflamatoria, la producción de citocinas proinflamatorias y la quimiotaxis de neutrófilos (P < 0,05, Fig. S15c). Es importante destacar que PrEXO-a23 redujo notablemente los genes inflamatorios clave (por ejemplo, Ccr2, Ccr5, Il-17a y Tnf) y aumentó los genes antiinflamatorios o asociados con la tolerancia (por ejemplo, Fem1a) (Fig. 5k). En conjunto, estos resultados establecen PrEXO-a23 como una plataforma terapéutica de doble función capaz de extinguir simultáneamente la señalización patógena de IL-23 y regular la tolerancia inmunitaria, resolviendo así la desregulación inmunitaria fundamental que subyace a la patogénesis de la EII.

Potente eficacia terapéutica de PrEXO-a23 en el tratamiento de la EII

Para evaluar la eficacia terapéutica de PrEXO-a23, empleamos un modelo de ratón de EII inducida por DSS, caracterizado por características patológicas notables, como la pérdida de peso corporal, el aumento del índice de actividad de la enfermedad (DAI), el acortamiento del colon y la esplenomegalia. Los ratones recibieron un 3% (p/v) de DSS en el agua de beber durante 7 días. Mientras tanto, los ratones fueron tratados los días 2, 4 y 6 mediante la administración intravenosa, según lo indicado en la Fig. 6a. El DAI, incluido el cambio de peso, la consistencia de las heces y el sangrado fecal, se controló diariamente. Los tejidos del colon y el bazo se recolectaron para su análisis el día 8. El tratamiento con PrEXO, a23 o rEXO-a23 alivió parcialmente la pérdida de peso inducida por DSS (Fig. 6b) y la elevación del DAI (Fig. 6c y Fig. S16a–c), y PrEXO-a23 demostró el beneficio terapéutico más significativo. La longitud del colon, que se redujo gravemente en el grupo DSS (~4,2 cm), se restauró parcialmente con rEXO-a23 (~5,4 cm) y se extendió aún más a niveles casi normales con PrEXO-a23 (~6,6 cm; Fig. 6d). El análisis del índice del bazo indicó una esplenomegalia significativa en los ratones tratados con DSS (P < 0,0001), que no se observó en el grupo PrEXO-a23 (Fig. S16d), lo que sugiere la atenuación de la inflamación sistémica^[48]. Estos hallazgos destacan la sólida eficacia de PrEXO-a23 en comparación con las monoterapias. El análisis mecanicista sugiere que, si bien PrEXO o a23 solos mostraron efectos terapéuticos limitados debido a una regulación inmunitaria insuficiente, PrEXO-a23 combina la administración dirigida a la lesión con la inmunomodulación sinérgica. rEXO facilita la administración precisa y contribuye a la tolerancia inmunitaria a través de su bioactividad intrínseca, mientras que la adhesión vascular mediada por la fusión PMV mejora la retención en los sitios inflamados, amplificando la acumulación del fármaco y los resultados terapéuticos más allá de los de rEXO-a23.

En la EII, el daño de las células epiteliales intestinales y la infiltración de células inflamatorias interrumpen la integridad de la barrera de la mucosa^[49]. El tinte de hematoxilina y eosina (H&E) y la puntuación histológica revelaron que el tratamiento con PrEXO-a23 preservó la integridad del epitelio cólico, manteniendo un epitelio intacto, una arquitectura de criptas regular y capas de la mucosa, junto con una reducción de la infiltración de células inflamatorias en comparación con el grupo DSS (Fig. 6e y Fig. S16e). El tinte de inmunofluorescencia demostró la restauración de la expresión de las proteínas de unión estrecha zonula occludens-1 (ZO-1) y ocludina, que se redujeron en los ratones tratados con DSS, lo que indica una mejora en la reparación de la barrera intestinal (Fig. 6f y Fig. S16f). Estos resultados confirman que PrEXO-a23 previene sustancialmente el daño fisiológico al tejido cólico y preserva la función de la barrera intestinal.

Más allá de la integridad de la barrera, la composición de la microbiota intestinal es un indicador crítico de la salud intestinal. El microambiente inmunitario desregulado en la EII favorece el crecimiento de bacterias patógenas al tiempo que suprime los probióticos beneficiosos, lo que provoca disbiosis^[50]. A continuación, investigamos la modulación de la microbiota por PrEXO-a23 en ratones con EII mediante la secuenciación del gen del ARN ribosomal 16S (ARNr) de muestras fecales. Un diagrama circos de la comunidad ilustró que PrEXO-a23 alivió las alteraciones en la composición de la microbiota inducidas por DSS (Fig. 6g). Específicamente, PrEXO-a23 mitigó la reducción de bacterias beneficiosas, como Lachnospiraceae y Akkermansiaceae, familias conocidas por sus propiedades antiinflamatorias y probióticas^[51],^[52], al tiempo que suprimió el crecimiento excesivo de Erysipelotrichaceae (Fig. 6h), una familia asociada con la progresión de la EII^[53],^[54]. El análisis del tamaño del efecto discriminante lineal (LEfSe) identificó además los taxones microbianos dominantes que influyen en el entorno intestinal a nivel de familia y especie. Coherente con los hallazgos anteriores, las abundancias de bacterias patógenas asociadas con la EII, incluidas Erysipelotrichaceae, Turicibacter y Bacteroides, aumentaron en los ratones tratados con DSS (Fig. 6i). El tratamiento con PrEXO-a23 redujo estas bacterias patógenas al tiempo que enriqueció los microbios beneficiosos, como Lachnospiraceae y Akkermansiaceae, lo que sugiere la restauración de la homeostasis de la microbiota intestinal. Este importante efecto de regulación de la microbiota de PrEXO-a23 probablemente se deba a sus acciones duales antiinflamatorias y promotoras de la tolerancia, que en conjunto restauran la homeostasis inmunitaria y reparan la barrera epitelial, creando así un microambiente favorable para la recuperación de la microbiota.

En la práctica clínica, la EII se asocia con diversas respuestas inflamatorias extraintestinales, como la inflamación de la piel. Para explorar si PrEXO-a23 puede tratar simultáneamente estas afecciones inflamatorias, establecimos un modelo de ratón de EII comórbida con psoriasis utilizando DSS e imiquimod (IMQ). Luego, se administró PrEXO-a23 por vía intravenosa para evaluar su acumulación y sus efectos terapéuticos en el sitio de la inflamación. Los resultados mostraron que PrEXO-a23, a través de su estrategia sinérgica de "focalización de la inflamación + adhesión al daño", se enriqueció no solo en las lesiones cólicas, sino también en los sitios de la piel inflamada extraintestinal, sin acumularse en los tejidos sanos (Fig. S17). Además, el tratamiento con PrEXO-a23 alivió eficazmente los síntomas de la EII y la psoriasis, como se demostró mediante la supresión de la pérdida de peso corporal y el acortamiento del colon, y la reducción de las puntuaciones de la actividad de la enfermedad para ambas enfermedades (Fig. S18).

Finalmente, se evaluó la bioseguridad de PrEXO-a23 tanto in vitro como in vivo. Los ensayos de citotoxicidad in vitro no mostraron efectos adversos sobre la viabilidad de las células epiteliales cólicas en un rango de concentraciones de PrEXO-a23 (Fig. S19a, b). La evaluación de la seguridad in vivo tras la administración intravenosa de PrEXO-a23 en ratones sanos no reveló ninguna anomalía histopatológica en los órganos principales (Fig. S19c). Los análisis bioquímicos de la sangre (Fig. S19d, e) y los análisis de citocinas confirmaron que los niveles de IFN-γ, IL-6 y TNF-α (Fig. S19f) se mantuvieron dentro de los rangos fisiológicos normales, lo que indica una biocompatibilidad favorable.

PrEXO-a23 reduce eficazmente el riesgo de CAC y fibrosis.

Analizamos más a fondo los datos de RNA-seq de tejidos cólicos de ratones con IBD inducida por DSS, comparando los perfiles de expresión génica entre grupos sanos, tratados con DSS y tratados con PrEXO-a23. Entre los genes expresados, 295 presentaron diferencias consistentes en los ratones tratados con DSS en comparación con los controles sanos y el grupo tratado con PrEXO-a23. Utilizando STRING y Cytoscape, construimos una red de interacción proteína-proteína y extrajimos una subred de 89 nodos y 1044 aristas. El análisis MCODE reveló dos módulos altamente interconectados (módulo 1, puntuación = 23,5; módulo 2, puntuación = 8,0), siendo el módulo 1 el que contenía 49 objetivos y 564 interacciones. La clasificación de centralidad de grado dentro de este módulo identificó a Trp53 como el centro pivote (Fig. 7a y Fig. S20). Como supresor tumoral que regula el ciclo celular, la reparación del ADN y la apoptosis, la disfunción de Trp53 es un evento temprano en la carcinogénesis colorrectal asociada a la colitis ulcerosa^[10],^[55]. Cabe destacar que la terapia con PrEXO-a23 reguló p53 en los colones tratados con DSS, lo que sugiere que PrEXO-a23 tiene el potencial de disminuir el riesgo de progresión de la IBD a la CAC.

Para evaluar el potencial terapéutico a largo plazo de PrEXO-a23 en la prevención de complicaciones asociadas a la IBD, como la fibrosis intestinal y la CAC, utilizamos un modelo de ratón con CAC inducida por azoximetano (AOM)/DSS. Se administró AOM a los ratones, seguido de ciclos repetidos de DSS para inducir colitis crónica y tumorigénesis, y los ratones sanos no tratados sirvieron como controles (grupo Salud). Durante la progresión de la enfermedad, los ratones recibieron inyecciones intravenosas de PBS (grupo AOM/DSS), PrEXO (grupo PrEXO), a23 (grupo a23), rEXO-a23 (grupo rEXO-a23) o PrEXO-a23 (grupo PrEXO-a23) (Fig. 7b). Como se esperaba, los ratones tratados con AOM/DSS mostraron una supervivencia significativamente reducida (P = 0,0208; Fig. 7c), una pérdida de peso sustancial (Fig. S21a) y puntuaciones DAI significativamente elevadas (Fig. 7d), así como una longitud del colon acortada y un aumento de la carga tumoral, tanto en términos de número como de tamaño (Fig. 7e-g y Fig. S21b). Entre todos los grupos de tratamiento, PrEXO-a23 demostró la mayor eficacia terapéutica, mejorando notablemente la supervivencia, el peso corporal, el DAI y la morfología del colon, hasta niveles comparables con los controles sanos. Es importante destacar que, si bien los tratamientos con PrEXO, a23 y rEXO-a23 conferían una protección parcial, ninguna de estas monoterapias previno el desarrollo de tumores. En contraste, el tratamiento con PrEXO-a23 inhibió por completo la formación de tumores, lo que destaca su potente efecto anticanceroso y su capacidad para detener la progresión de la IBD a la CAC.

Dado que el desarrollo de la CAC implica una activación inmune mucosa sostenida, una alteración de la barrera epitelial y una hiperproliferación^[11], investigamos más a fondo el impacto de PrEXO-a23 en estos marcadores patológicos. En comparación con el grupo AOM/DSS, PrEXO-a23 disminuyó significativamente los niveles de citocinas proinflamatorias (TNF-α e IL-6) en los tejidos del colon (P = 0,0016 y P = 0,0112; Fig. 7h, i) y normalizó el índice esplénico (Fig. S21c), lo que sugiere una supresión eficaz tanto de la inflamación local como sistémica. El análisis histológico mediante tinción con H&E confirmó la preservación de la arquitectura epitelial y la reducción de la infiltración de células inflamatorias en el grupo PrEXO-a23 (Fig. 7j). Además, la tinción por inmunofluorescencia de Ki67 demostró una supresión de la hiperproliferación epitelial, con índices de proliferación comparables a los de los controles sanos (Fig. 7k y Fig. S21d). En conjunto, estos datos indican que PrEXO-a23 mejora la integridad y la función del colon, como lo demuestra su capacidad para modular la respuesta inmune, reparar la barrera del colon y controlar la proliferación epitelial.

Para evaluar si PrEXO-a23 también protege contra la fibrosis intestinal, una consecuencia común y grave de la IBD crónica, utilizamos un modelo de colitis crónica inducida por DSS con tres ciclos de DSS. Los ratones del grupo AOM/DSS mostraron un marcado engrosamiento de la pared del colon, la muscularis mucosa y la muscularis propia, características típicas de la fibrosis (Fig. 7l-o). La tinción inmunohistoquímica para la α-actina de músculo liso (α-SMA), un marcador de la activación de los miofibroblastos, mostró una regulación al alza significativa en los colones fibroticos (P < 0,0001; Fig. 7p, q). Si bien las monoterapias con PrEXO, a23 y rEXO-a23 no inhibieron la progresión fibrotica, el tratamiento con PrEXO-a23 preservó el grosor normal del colon y suprimió la expresión de α-SMA a los niveles basales, lo que indica una prevención eficaz de los cambios fibroticos. PrEXO-a23 mitigó la progresión fibrotica a través de un mecanismo dual coordinado. Al neutralizar la IL-23, podría suprimir la inflamación impulsada por Th17, al tiempo que suministra exosomas derivados de Treg para promover la tolerancia inmune. Esta estrategia combinada antiinflamatoria y pro-tolerogénica no solo corrigió la disregulación inmune subyacente antes de que se produzca la fibrosis patológica, sino que también reprogramó el microambiente local para favorecer las funciones inmunosupresoras y tolerogénicas beneficiosas de los Treg, bloqueando así de forma preventiva la progresión patológica hacia la fibrosis.

Anteriormente demostramos que PrEXO-a23 afectó al cambio en la expresión de Trp53 en los colones tratados con DSS. Para evaluar la contribución de p53 al efecto terapéutico de PrEXO-a23, los ratones fueron tratados conjuntamente con el inhibidor de p53, pifitrín-α (ip53). Esta intervención disminuyó notablemente la eficacia terapéutica de PrEXO-a23 y anuló sus efectos antitumorales (Fig. 8a-g), lo que sugiere que la actividad de la vía de p53 está asociada con la capacidad de la nanoterapia para prevenir la CAC. Por lo tanto, examinamos los principales mediadores de la señalización de p53 en los tejidos del colon utilizando análisis de RT-qPCR y Western blot. El análisis de RT-qPCR reveló que, durante la progresión de la CAC en el grupo AOM/DSS, la expresión de Trp53, Cdkn1a y Bax se redujo significativamente en comparación con los controles sanos, lo que refleja una disfunción de la vía. El tratamiento con PrEXO-a23 restauró su expresión a niveles casi normales, un efecto que se bloqueó parcialmente mediante la inhibición de p53 (PrEXO-a23 + ip53) (Fig. 8h). El análisis de Western blot confirmó estos cambios a nivel de proteína para p53, p21 y Bax (Fig. 8i, j). En conjunto, estos datos demuestran que la capacidad de PrEXO-a23 para prevenir la progresión de la inflamación crónica a cáncer depende parcialmente de la señalización funcional de p53. En conjunto, PrEXO-a23 no solo atenúa la inflamación activa, sino que también proporciona una protección duradera contra la fibrosis y la tumorigénesis, lo que la convierte en una prometedora estrategia terapéutica para el manejo a largo plazo de la IBD y sus complicaciones.

Discusión

“¿Cómo se mantiene y regula la homeostasis inmune?” fue destacado como una de las 125 preguntas científicas más importantes por Science en 2021. La IBD, un trastorno prototípico de la disregulación inmune, sigue estando mal gestionada por las terapias convencionales, que ofrecen principalmente un alivio sintomático transitorio y, a menudo, no logran lograr una modulación inmune duradera^[4],^[5], dejando a los pacientes vulnerables a la recurrencia y la progresión de las complicaciones. La inducción de la tolerancia inmune antígeno-específica se considera ampliamente como una estrategia óptima para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias, ya que restaura selectivamente la tolerancia a los antígenos patógenos al tiempo que preserva la competencia inmune sistémica^[37],^[56]. Sin embargo, esta estrategia es actualmente inviable para la IBD, dado el conocimiento incompleto de los antígenos que impulsan la enfermedad. Los Treg, que desempeñan un papel central en el mantenimiento de la tolerancia inmune, han surgido así como una estrategia viable para el manejo de la IBD^[20]-^[22]. No obstante, la inducción y la expansión de los Treg de forma específica para la enfermedad siguen siendo técnicamente difíciles. Los anticuerpos anti-IL-23 han demostrado ser prometedores como terapias clínicas para la IBD^[15],^[16]. Nuestros hallazgos demuestran que los anticuerpos anti-IL-23 libres inhiben eficazmente la diferenciación de Th17 y la secreción de citocinas proinflamatorias in vitro. Sin embargo, exhiben una capacidad limitada para inducir tDCs o expandir los Treg, que son esenciales para restablecer la tolerancia inmune. Además, la administración in vivo precisa y las preocupaciones de seguridad asociadas con las terapias basadas en citocinas deben abordarse cuidadosamente para mejorar los resultados terapéuticos.

Los exosomas derivados de Treg (rEXO) están enriquecidos con una variedad de moléculas inmunomoduladoras, incluidas proteínas y microARN, que contribuyen a sus funciones inmunomoduladoras^[24],^[25]. En este estudio, encontramos que los exosomas derivados de Treg tienen potentes capacidades de inducción de la tolerancia in vitro, promoviendo eficazmente la generación de tDCs y Treg, al tiempo que suprimen la polarización de Th17. Basándonos en esta observación, desarrollamos un sistema nanoterapéutico dual, PrEXO-a23, que integra tanto la supresión de la inflamación como la inducción de la tolerancia inmune. Esta nanoplattaforma está diseñada mediante la fusión de exosomas derivados de Treg con vesículas de membrana plaquetaria, lo que le permite dirigirse a las lesiones del colon a través del homing inflamatorio y la unión al colágeno. Además, los anticuerpos anti-IL-23 (a23) se conjugan a las vesículas híbridas mediante enlaces peptídicos que pueden ser escindidos por las MMP, lo que libera a23 en respuesta al microambiente inflamatorio. La a23 liberada localmente neutraliza la IL-23 e inhibe la inflamación impulsada por Th17, mientras que la carga exosomal reprograma las células dendríticas a un fenotipo tolerogénico y promueve la expansión de los Treg, suprimiendo aún más la polarización de Th17. Este enfoque sinérgico “antiinflamatorio y pro-tolerogénico” ayuda a modular eficazmente la disregulación inmune en la IBD, lo que resulta en un alivio de los síntomas, la reparación de la barrera intestinal y la normalización de la microbiota intestinal. Cabe destacar que PrEXO-a23 demostró el potencial de mantener la remisión a largo plazo y reducir el riesgo de fibrosis intestinal y CAC. Además, la eficacia de PrEXO-a23 para prevenir la progresión de la IBD a la CAC depende parcialmente de p53.

Si bien nuestro enfoque demuestra un fuerte potencial terapéutico para la IBD, varias consideraciones importantes merecen una mayor investigación. En primer lugar, los modelos murinos existentes no replican completamente el complejo y heterogéneo panorama inmune de la IBD humana, lo que destaca la necesidad de una validación rigurosa de PrEXO-a23 en modelos preclínicos avanzados y, en última instancia, en entornos clínicos^[57],^[58]. En segundo lugar, dada la importante variabilidad interpacientes en la IBD, la eficacia terapéutica de PrEXO-a23 puede diferir entre los subtipos de la enfermedad, como la enfermedad de Crohn frente a la colitis ulcerosa, y entre las etapas de la enfermedad (activa frente a remisión)^[1],^[59]. Por lo tanto, los estudios futuros deben incorporar la estratificación de pacientes basada en biomarcadores, como la expresión del receptor de IL-23 (IL-23R) y las proporciones de Treg/Th17, para identificar poblaciones responsivas y respaldar el desarrollo de modelos de enfermedad específicos para el subtipo. Afortunadamente, la plataforma PrEXO está diseñada como un sistema de administración modular y adaptable, lo que permite la integración de agentes inmunomoduladores alternativos, como anticuerpos monoclonales o inhibidores de moléculas pequeñas, adaptados al perfil inmune de un individuo.

En resumen, la nanomedicina PrEXO-a23 ofrece una estrategia prometedora para superar las limitaciones de la regulación inmune de las terapias actuales para la IBD. A través de la focalización específica de la lesión mediante vesículas híbridas de exosomas de plaquetas y Treg, combinada con la supresión concurrente de la inflamación y la regulación de la tolerancia inmune, PrEXO-a23 mitiga eficazmente la progresión de la enfermedad y sus complicaciones asociadas. Este trabajo ejemplifica la inmunomodulación de precisión a través de la biomimética diseñada y representa un importante paso hacia las terapias personalizadas de próxima generación para la IBD.

Métodos

Reactivos y materiales

Se adquirió un kit de aislamiento de células T CD4+ vírgenes de Miltenyi Biotec. El péptido enlazador (Arg-Val-Gly-Leu-Pro, RVGLP) fue diseñado y sintetizado por ChinaPeptides. InVivoMAb IL-23 se obtuvo de BioXcell. Los anticuerpos primarios para la inmunotinción de MMP9, ALIX, TSG101, CCR6, CD68, CD4, ZO-1, ocludina, CD62P, CTLA-4, GAPDH y Ki67 fueron proporcionados por Abcam. Los anticuerpos anti-GPIbα, IFN-γ, IL-10 y α-SMA fueron suministrados por Affinity. Los anticuerpos anti-CD86, IL-17A y p53 fueron adquiridos de Proteintech. Los anticuerpos anti-p21 y Bax se obtuvieron de Cell Signaling Technology. BV421-anti-CD11c, PE-anti-CD86, APC-anti-CD80, FITC-anti-MHC II, BV421-anti-CD45, FITC-anti-CD3, APC/FireTM 750-anti-CD4, APC-anti-CD25, PE-anti-IL-17A, APC/FireTM 750-anti-CD45, PE-anti-CD19, BV421-anti-F4/80 y PE-Ly6G fueron adquiridos de BioLegend. PE-anti-FOXP3 y APC-anti-IFN-γ fueron proporcionados por eBioscience. 3,3′-dioctadecyloxacarbocianina perclorato (DiO), 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI), 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindodicarbocianina, 4-clorobencenosulfonato (DiD) y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) se obtuvieron de Invitrogen. IL-6, IL-23, IFN-γ e IL-1β fueron proporcionados por PeproTech. IL-2, TGF-β, MMP9, GM6001, enlazador NHS-PEG-MAL y pifitrín-α fueron adquiridos de MedChemExpress. Sal de sulfato de dextrano (DSS), kit de tinción con calcéin-AM/yoduro de propidio (PI) y kit de detección de apoptosis PI/anexina V, y colágeno tipo I de ratón fueron suministrados por Yeasen. Azoximetano (AOM) y lipopolisacárido (LPS) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. 2-(4-Amidinofenil)-6-indolocarbamidina dihidrocloruro (DAPI) y kits ELISA para IFN-γ, TNF-α, IL-17A, IL-23, IL-6 e IL-10 fueron adquiridos de Solarbio. Los kits ELISA para TGF-β1 y MMP9 se obtuvieron de Elabscience. El medio X-VIVO fue adquirido de Lonza. Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio RPMI 1640, suero fetal bovino (SFB) y penicilina-estreptomicina (P/S) fueron adquiridos de Gibco.

Animales y líneas celulares

Todos los ratones hembra C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad) se obtuvieron de SPF Biotechnology Co., Ltd (Pekín, China) y se alojaron en grupos de seis en jaulas con ventilación individual bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas a 20-22 °C con acceso libre a pienso estándar para roedores y agua. Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales con animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Academia China de Ciencias Médicas y el Instituto de Medicina de Radiación de la Universidad de Pekín (número de aprobación: IRM/2-IACUC-2311-002).

RAW264.7 (línea celular de macrófagos murinos) y células HT-29 (línea celular de carcinoma colorrectal humano) se obtuvieron de Procell. Las células NCM460 (línea celular de epitelio colónico normal humano) se adquirieron de SUNNCELL. Todas las líneas celulares se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de SFB y 1% de P/S. Los neutrófilos y las células dendríticas derivadas de médula ósea se aislaron de ratones C57BL/6 de 6 semanas de edad. Las células de la médula ósea se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía 10% de SFB, 1% de P/S, 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos recombinante murino (GM-CSF; Sino Biological) y 10 ng/mL de IL-4 (Sino Biological) para la diferenciación de células dendríticas. La mitad del medio de cultivo se reemplazó con medio fresco en el día 3 y las células se utilizaron en el día 6 como células dendríticas inmaduras. Para el aislamiento de neutrófilos, las células de la médula ósea se añadieron a un gradiente de Percoll (55, 65 y 78%; v/v), seguido de centrifugación a 500×g durante 30 minutos. Los neutrófilos se recogieron en la interfase entre las capas de Percoll del 65 y el 78%, se lavaron tres veces con PBS y se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía 10% de SFB y 1% de P/S para un análisis posterior. Todas las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Preparación de rEXO y PMV

Las células T CD4+ vírgenes se aislaron del bazo de ratones C57BL/6 sanos utilizando un kit de aislamiento de células T CD4+ y se polarizaron a células T reguladoras en medio X-VIVO suplementado con anti-CD3 (5 μg/mL), anti-CD28 (2 μg/mL), IL-2 (20 ng/mL) y TGF-β (5 ng/mL) durante 7 días. El sobrenadante del cultivo de Treg se centrifugó secuencialmente a 300×g durante 10 minutos, 2000×g durante 20 minutos y 10.000×g durante 30 minutos para eliminar los desechos, seguido de ultracentrifugación a 100.000×g durante 70 minutos para obtener rEXO.

Las plaquetas aisladas de la sangre total de ratones C57BL/6 sanos se sometieron a ciclos de congelación-descongelación y las membranas plaquetarias se extrajeron mediante centrifugación a 8000×g durante 20 minutos. Las membranas procesadas se extruyeron secuencialmente a través de filtros de membrana porosa de policarbonato con tamaños de poro decrecientes (0,8, 0,4, 0,2 y 0,1 μm) para obtener PMV. Las concentraciones de proteína de rEXO y PMV se cuantificaron utilizando un kit de ensayo BCA (Accurate Biotechnology).

Preparación y caracterización de PrEXO-a23

Coextrusión de PMV y rEXO. PrEXO se preparó mezclando PMV y rEXO en relaciones de masa proteica de 1:1, 1:2 o 1:3, seguido de sonicación (40 kHz, 5 minutos) y luego una extrusión repetida como se describe para la preparación de PMV. La eficiencia de fusión de PrEXO se evaluó mediante citómetro de flujo NanoFlow (CytoFLEX, Beckman).

Síntesis y conjugación de un enlazador escindible por MMP9 a a23. Se utilizó un enlazador peptídico escindible por MMP (Arg-Val-Gly-Leu-Pro, RVGLP) con un grupo NHS en el extremo arginina (Arg) y un grupo Mal en el extremo prolina (Pro) para conjugar el anticuerpo IL-23 (a23) a los vesículas híbridas (PrEXO). Para determinar la relación molar óptima para la conjugación del enlazador-a23, a23 se hizo reaccionar con un enlazador en relaciones molares (a23:enlazador) de 1:1, 1:10, 1:50, 1:75 o 1:100 en PBS a 4 °C durante 12-18 horas. El enlazador no reaccionado se eliminó mediante centrifugación a 8000×g durante 30 minutos utilizando un filtro centrífugo (100 kDa; Jet Biofil). El enlazador-a23 purificado se analizó utilizando espectrometría de masas de ionización láser asistida por matriz en tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS; AXIMA-Performance MA, Shimadzu).

Preparación de PrEXO-a23. PrEXO se preparó mediante coextrusión de vesículas de membrana de plaquetas y exosomas derivados de Treg en una relación de masa proteica de 1:1, seguida de la cuantificación de proteínas utilizando un ensayo BCA. PrEXO se trató con 1 mM de TCEP a 37 °C durante 30 minutos para exponer los grupos sulfhidrilo (SH) en su membrana. El PrEXO pretratado se añadió luego al enlazador-a23 purificado en una relación de masa (PrEXO:a23) de 1:0,1, 1:0,25, 1:0,5, 1:1 o 1:2, y se incubó a 25 °C durante 1 hora. El enlazador-a23 no reaccionado se eliminó mediante centrifugación a 8000×g durante 30 minutos utilizando un filtro centrífugo (300 kDa). Se utilizó ELISA para determinar la eficiencia de conjugación de a23 a PrEXO. Utilizando el mismo método, PrEXO se conjugó a a23 utilizando un enlazador no escindible por MMP (fL: NHS-PEG-MAL) para generar PrEXO-fL-a23.

Caracterización de PrEXO-a23. El análisis morfológico se realizó utilizando un instrumento TEM (JEM-1400 Flash, JEOL, Japón). El tamaño de las partículas y los potenciales zeta se midieron mediante un analizador Nano ZS Malvern (Malvern, Reino Unido). PrEXO-a23 se almacenó en PBS (pH 7,4) a 4 °C y en plasma a 37 °C, y el tamaño de las partículas y el potencial zeta se midieron diariamente durante 7 días.

Análisis de proteínas de PrEXO-a23

IL-10 (1:50), CTLA-4 (1:50), ALIX (1:50), TSG101 (1:50), CCR6 (1:50), CD62P (1:50), GPIbα (1:50) y a23 se detectaron utilizando un sistema automatizado de electroforesis capilar digital (CE)-Western (JS4167, ProteinSimple, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Específicamente, las muestras de proteína se prepararon utilizando tampón de carga sin agentes reductores (por ejemplo, DTT) para permitir el análisis en condiciones no reductoras. Las muestras de proteína, la dilución del anticuerpo primario, la dilución del anticuerpo secundario y el sustrato de quimioluminiscencia se añadieron secuencialmente a las placas de canal para la detección de proteínas. Todos los análisis se llevaron a cabo utilizando el software Compass for Simple Western (v 6.0.0, ProteinSimple).

Ensayo de colocalización de PrEXO-a23

rEXO, PMV y a23 se etiquetaron con DiI, DiD y Alexa Fluor 488, respectivamente. Todas las muestras se incubaron con 5 μg/mL de tinte a 37 °C durante 30 minutos. El PrEXO-a23 triplemente etiquetado se observó utilizando un microscopio confocal de escaneo láser (Eclipse Ti2, Nikon, Japón) con un objetivo de inmersión en aceite de 100×.

Evaluación in vitro de la liberación de a23 de PrEXO-a23

Para evaluar las propiedades responsivas a MMP9 del enlazador peptídico, PrEXO-a23 se incubó con MMP9 con o sin el inhibidor de MMP9 GM6001 en intervalos de tiempo predeterminados. El a23 liberado se cuantificó utilizando un kit ELISA.

Modelo de cocultivo de células T CD4+ y células epiteliales intestinales

Las células T CD4+ vírgenes se polarizaron a células Th17 cultivándolas en medio RPMI 1640 que contenía TGF-β (1 ng/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-23 (5 ng/mL), IL-1β (10 ng/mL), anti-IFN-γ (10 μg/mL) y anti-IL-4 (10 μg/mL) durante 72 horas. Las células se trataron con rEXO (25 μg/mL), PMV (25 μg/mL), PrEXO (25 μg/mL de rEXO y 25 μg/mL de PMV), a23 (7,5 μg/mL) o PrEXO-a23 (25 μg/mL de rEXO, 25 μg/mL de PMV y 7,5 μg/mL de a23), respectivamente. Después de 72 horas, las células T se recogieron y se tiñeron con el anticuerpo APC/FireTM 750-CD4 y el anticuerpo PE-IL-17A para detectar el porcentaje de células Th17 utilizando un citómetro de flujo (CytoFLEX, Beckman).

Para el cocultivo, las células T pretratadas (2 × 105 por pocillo) se sembraron en la cámara superior de insertos de 12 pocillos (NEST Biotechnology), mientras que las células NCM460 (5 × 105 células por pocillo) se sembraron en la cámara inferior. Después de 24 horas, las células NCM460 se recogieron y se tiñeron con PI/calcéin-AM o anexina V/PI durante 15 minutos según el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron luego utilizando microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.

Inducción de células dendríticas tolerogénicas (tDCs) y células T reguladoras (Tregs)

En el día 6, las células dendríticas inmaduras se estimularon con LPS (1 μg/mL) e IFN-γ (20 ng/mL) para generar células dendríticas maduras durante 24 horas. Para la inducción de tDCs, las células se cotrataron con rEXO, PMV, PrEXO, a23 o PrEXO-a23, respectivamente. Después de 24 horas, las células se incubaron con CD16/CD32 (BioLegend) durante 15 minutos para bloquear los receptores Fcγ, y luego se tiñeron con los anticuerpos BV421-CD11c, APC-CD80, PE-CD86 y FITC-MHC II, y se analizaron mediante citometría de flujo. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron para el análisis de citocinas (IL-10, TGF-β, IL-6 y TNF-α) utilizando kits ELISA.

Para activar los linfocitos, se cocultivaron 5 × 105 células T CD4+ con 1 × 105 células dendríticas pretratadas durante 72 horas. Después de la incubación, las células T CD4+ se tiñeron con anticuerpos, incluidos APC/FireTM 750-CD4, PE-IL-17A, APC-CD25 y PE-FOXP3, para evaluar la proporción de células Th17 y Tregs.

Ensayo de flujo in vitro

Un canal de flujo se recubrió con 100 μg/mL de colágeno tipo I incubando durante la noche a 37 °C. rEXO, PMV, PrEXO o PrEXO-a23 etiquetados con DiO se cargaron en una jeringa de 1 mL para la perfusión a través del canal de flujo recubierto con colágeno a una velocidad de cizallamiento de 500 s−1 utilizando una bomba de jeringa (Harvard, EE. UU.). Luego, el canal de flujo se perfundió con PBS a la misma velocidad de cizallamiento antes de la imagen mediante CLSM.

Ensayo de direccionamiento inflamatorio in vitro

Las células RAW264.7 o los neutrófilos se incubaron con rEXO, PMV, PrEXO o PrEXO-a23 etiquetados con DiI durante 2 horas, con o sin la preestimulación con LPS (1 μg/mL). Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y luego se midió el porcentaje de células positivas para DiI o la intensidad media de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo o CLSM. PrEXO-a23 se incubó con o sin RAW264.7 activadas con LPS en condiciones de MMP9. La liberación acumulativa de a23 se midió mediante ELISA en los puntos de tiempo indicados.

Biodistribución in vivo de PrEXO-a23 en el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal (EII)

Para generar el modelo de ratón con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), se alimentó a ratones C57BL/6 con un 3% (p/v) de DSS durante 7 días, tras haber sido sometidos a una dieta sin fluorescencia. Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con rEXO, PMV, rEXO + PMV, PrEXO o PrEXO-a23 marcados con DiD, respectivamente. A los 0, 2, 6, 12, 24, 36 y 48 h después de la inyección, se realizaron imágenes de los ratones utilizando un sistema de imagenología in vivo (ABL-X5, Tanon, China) para analizar la biodistribución de la fluorescencia de DiD. Se sacrificaron los ratones de cada grupo y se recolectaron sus principales órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y colon) para su posterior análisis. Para el análisis de localización, se tiñeron secciones de colon congeladas con DAPI y se capturaron imágenes utilizando microscopía confocal láser (CLSM). Para el análisis del direccionamiento celular, los tejidos del colon se procesaron para obtener suspensiones de células individuales para el análisis por citometría de flujo. Se analizó la fluorescencia relativa de DiD en las células dendríticas (APC/FireTM 750-CD45 y BV421-CD11c), macrófagos (APC/FireTM 750-CD45 y BV421-F4/80), células T (APC/FireTM 750-CD45 y FITC-CD3), células B (APC/FireTM 750-CD45 y PE-CD19) y neutrófilos (APC/FireTM 750-CD45 y PE-Ly6G) para determinar la captación por las células inmunitarias.

Estudio de farmacocinética in vivo

Se administró por vía intravenosa PrEXO-a23 marcado con DiD a ratones C57BL/6, y se recolectaron muestras de sangre en puntos temporales predeterminados (0,5, 1, 2, 4, 24, 48 y 72 h). Las muestras de sangre se colocaron en placas de 96 pocillos, y se midió la intensidad de la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 650 nm utilizando un sistema de imagenología in vivo.

Análisis de seguimiento con doble marcador in vivo

Se marcó a23 con Alexa Fluor 647, y PrEXO se marcó con DiR. A los ratones con EII inducida por DSS se les inyectó por vía intravenosa PrEXO + a23 (una mezcla física de PrEXO y a23), PrEXO-fL-a23 (PrEXO y a23 se conjugaron con un péptido no escindible, fL) o PrEXO-a23 (PrEXO y a23 se conjugaron con el péptido escindible por MMP), respectivamente. Se monitoreó la biodistribución de PrEXO y a23 utilizando un sistema de imagenología in vivo a los 0, 2, 6, 12, 24, 36 y 48 h después de la inyección. Se recolectaron tejidos del colon a las 12 h después de la inyección para el análisis de imagen ex vivo. Se procesaron las secciones criónicas para la imagenología CLSM con el fin de examinar la colocalización de las señales de PrEXO (marcado con DiI) y a23 (marcado con Alexa Fluor 647).

Evaluación de los signos clínicos en el modelo de EII inducida por DSS

Tras un período de aclimatación de 7 días, se administró un 3% (p/v) de DSS en agua de beber a ratonas C57BL/6 (de 8 semanas de edad) durante 7 días para establecer un modelo de EII. Los ratones sanos del grupo normal no recibieron tratamiento, mientras que los ratones con EII inducida por DSS en los grupos DSS, PrEXO, a23, rEXO-a23 y PrEXO-a23 recibieron inyecciones intravenosas de PBS, PrEXO, a23, rEXO-a23 y PrEXO-a23 en los días 2, 4 y 6 de la administración de DSS, respectivamente. La dosis se administró a 5 mg/kg para rEXO y 1,5 mg/kg para a23. Se observaron los ratones diariamente, y se evaluó el peso corporal y el índice de actividad de la enfermedad (IAE). Los puntajes del IAE se calcularon diariamente en función de la pérdida de peso (de 0 a 4), la consistencia de las heces (de 0 a 4) y el sangrado fecal (de 0 a 4). El día 8, se sacrificaron los ratones y se recolectaron sus colones para medir la longitud y realizar análisis posteriores. El índice del bazo se calculó de la siguiente manera: índice del bazo = (peso del bazo/peso corporal) × 100%.

Evaluación del efecto inhibitorio en el modelo de CAC inducido por AOM/DSS

Para inducir el modelo de ratón con cáncer colorrectal (CAC), se inyectó por vía intraperitoneal AOM (10 mg/kg) a ratonas C57BL/6 de seis semanas de edad. Después de 7 días, se sometió a los ratones a tres ciclos de tratamiento con DSS, cada uno de los cuales consistió en un 2,5% de DSS durante 7 días seguido de un período de recuperación de 14 días con agua normal. Durante cada período de tratamiento con DSS de 7 días, se administraron PBS, PrEXO, a23, rEXO-a23 y PrEXO-a23 por vía intravenosa cada 2 días, como se describió para el modelo de EII. Al final del experimento de 10 semanas, se sacrificaron los ratones y se extirparon los colones para la enumeración de tumores y la medición de la longitud.

Análisis histológico

Los tejidos del colon se fijaron en formaldehído al 10% durante 24 h, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm con un micrótomo (Thermo Fisher). Posteriormente, se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en las secciones de tejido. Se puntuó de forma ciega el daño histológico del colon para evaluar el daño epitelial (0–6) y la infiltración inflamatoria (mucosa: 0–3; submucosa: 0–2; músculo/serosa: 0–1) según los criterios establecidos ^[60].

Para la inmunofluorescencia, las láminas de colon fijadas se permeabilizaron con 0,3% de Triton X-100 durante 10 min, se bloquearon con suero de cabra al 5% y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra ZO-1 (1:100), ocludina (1:100), CD86 (1:400), CD68 (1:1000), CD4 (1:500) o Ki67 (1:1000). Se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 647 (1:500) durante 1 h, y los núcleos de las células se tiñeron con DAPI (1:1000).

Para la inmunohistoquímica, las secciones de colon preprocesadas se marcaron con anticuerpos primarios anti-MMP9 (1:500), anti-IL-17A (1:900), anti-IFN-γ (1:200) o anti-α-SMA (1:900) durante la noche, seguidos de anticuerpos secundarios y una reacción de coloración utilizando un kit DAB (Maxim). Se contratiñeron los núcleos de las células con hematoxilina. Todas las imágenes se adquirieron utilizando un escáner de portaobjetos digitales Pannoramic (3D HISTECH) y se analizaron con ImageJ.

Análisis de citometría de flujo de subgrupos de células del colon

Se aislaron linfocitos de la lámina propia del colon mediante la digestión del tejido con Liberase (31,25 μg/mL, Roche) y DNase I (50 μg/mL, Roche) a 37 °C durante 1 h con agitación. Se obtuvieron suspensiones de células individuales mediante un tamiz celular de 70 μm (Biosharp), y se separaron 1 × 106 células de cada grupo para la tinción. Después del bloqueo de los receptores Fc, las células se incubaron con anticuerpos fluorescentes de superficie que contenían BV421-CD45, FITC-CD3 y anticuerpos APC/FireTM 750-CD4. Para la tinción de factores de transcripción, las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando un kit comercial de tinción FOXP3 (eBioscience) según el protocolo del fabricante, seguido de la incubación con el anticuerpo PE-FOXP3. Para la tinción intracelular de citocinas, los linfocitos aislados se estimularon con un cóctel de activación celular (BioLegend) durante 6 h a 37 °C antes de la tinción de superficie. Posteriormente, se utilizaron el anticuerpo PE-anti-IL-17 y el anticuerpo APC-anti-IFN-γ. Se analizaron las proporciones de células Th1, Th17 y Treg en cada muestra utilizando un citómetro de flujo. Finalmente, todos los datos se procesaron utilizando FlowJo V10.8.1.

Ensayo ELISA

Se recolectaron suero y tejidos del colon de ratones con EII. Los segmentos del colon se homogeneizaron en PBS utilizando un homogeneizador a 4 °C. Los homogeneizados se centrifugaron a 10 000×g durante 10 min, y se analizaron los sobrenadantes para detectar citocinas y MMP9 utilizando kits ELISA siguiendo los protocolos del fabricante.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR)

Se extrajo el ARN total de los tejidos del colon congelados utilizando TRIzol, se cuantificó en un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, EE. UU.) y se transcribió a ARN complementario utilizando HiScript III RT SuperMix (Vazyme). A continuación, se realizó qPCR en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX Connect con SYBR Green Master Mix. Los pares de cebadores para los genes diana del ratón se muestran en la Tabla Suplementaria 1. Se calculó la expresión génica relativa utilizando el método 2−ΔΔCt, normalizada a GAPDH.

Análisis de secuenciación de ARN

El día 8, se sacrificaron los ratones y se extirparon los tejidos del colon (n = 5). Se extrajo el ARN total de los tejidos del colon utilizando TRIzol. Después de la extracción del ARN total, se enriqueció el ARNm eucariota utilizando cuentas de Oligo (dT). Tras el enriquecimiento del ARNm, se procesó el ARN para la síntesis de ADNc y la construcción de bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ARN MGIEasy. Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma de secuenciación MGISEQ-2000 (Beijing Genomic Institution, BGI). Las lecturas sin procesar se filtraron con SOAPnuke 1.5.6, y las lecturas limpias se alinearon al genoma del ratón (GRCm38.p6) utilizando HISAT2. Se obtuvieron los recuentos de expresión génica con feature counts, y se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando DESeq2 (v1.4.5) entre dos grupos diferentes. Los genes con el parámetro de |log2(cambio de pliegue)| ≥ 1 y P ajustada ≤ 0,05 se consideraron genes expresados diferencialmente (DEG). Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional, incluido el agrupamiento de mapas de calor, GSEA, GO y análisis KEGG en la plataforma BGI Dr. Tom (https://biosys.bgi.com). Se realizó GSEA utilizando el software GSEA v4.0.3 para determinar si los conjuntos de genes predefinidos de las vías KEGG estaban significativamente enriquecidos entre dos grupos.

Análisis de Western blot

Se cuantificó la expresión de proteínas utilizando un sistema automatizado de electroforesis capilar digital Western (JS4167, ProteinSimple, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se homogeneizaron los segmentos del colon de los ratones en tampón RIPA para extraer proteínas, y se determinó la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo BCA. Se añadieron las muestras de proteínas a cada pocillo, seguidas de los anticuerpos primarios correspondientes (p53 a 1:50, p21 a 1:50, Bax a 1:50 y GAPDH a 1:50) y el anticuerpo secundario conjugado con HRP. Se calcularon los niveles relativos de proteínas midiendo el área bajo la curva de un cromatograma de quimioluminiscencia y se normalizaron a GAPDH. Todos los análisis se realizaron utilizando el software Compass for Simple Western (v 6.0.0, ProteinSimple). Los escaneos sin recortar están disponibles en el archivo de datos fuente.

Ensayo de secuenciación de microbiota de ARNr 16S

El día 7, se recolectaron heces de ratón para el análisis de la microbiota intestinal mediante la secuenciación del gen de ARNr 16S en Genesky Biotechnologies Inc. (Shanghái, China). Se extrajo el ADN total de las heces utilizando un kit de extracción de ADN de heces. Las regiones hipervariables V3-V4 del gen de ARNr 16S de las bacterias se amplificaron por PCR, y los productos se purificaron con el kit Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, CA, EE. UU.). Se construyeron bibliotecas con adaptadores Illumina, se cuantificaron mediante un fluorómetro Qubit 3.0 y se validaron con un sistema Agilent Bioanalyzer 2100. La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina NovaSeq para generar lecturas emparejadas de 250 pb. El análisis de datos se realizó en la plataforma Genesky Cloud (http://cloud.geneskybiotech.com), y se analizó la composición microbiana a nivel de familia.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± DE (desviación estándar). Para las comparaciones entre dos grupos, se aplicó una prueba t de Student de dos colas. Para las comparaciones múltiples, se utilizó un ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las curvas de supervivencia se analizaron mediante la prueba de log-rank. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (v9.0). Se consideró significativo un valor de P < 0,05.

Resumen de la presentación de informes

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de presentación de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Reactivos y materiales

Se adquirió un kit de aislamiento de células T CD4+ vírgenes de Miltenyi Biotec. El péptido enlazador (Arg-Val-Gly-Leu-Pro, RVGLP) fue diseñado y sintetizado por ChinaPeptides. InVivoMAb IL-23 se obtuvo de BioXcell. Los anticuerpos primarios para la inmunotinción de MMP9, ALIX, TSG101, CCR6, CD68, CD4, ZO-1, ocludina, CD62P, CTLA-4, GAPDH y Ki67 fueron proporcionados por Abcam. Los anticuerpos anti-GPIbα, IFN-γ, IL-10 y α-SMA fueron suministrados por Affinity. Los anticuerpos anti-CD86, IL-17A y p53 fueron adquiridos de Proteintech. Los anticuerpos anti-p21 y Bax se obtuvieron de Cell Signaling Technology. BV421-anti-CD11c, PE-anti-CD86, APC-anti-CD80, FITC-anti-MHC II, BV421-anti-CD45, FITC-anti-CD3, APC/FireTM 750-anti-CD4, APC-anti-CD25, PE-anti-IL-17A, APC/FireTM 750-anti-CD45, PE-anti-CD19, BV421-anti-F4/80 y PE-Ly6G fueron adquiridos de BioLegend. PE-anti-FOXP3 y APC-anti-IFN-γ fueron proporcionados por eBioscience. 3,3′-dioctadecyloxacarbocianina perclorato (DiO), 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI), 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindodicarbocianina, 4-clorobencenosulfonato (DiD) y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) se obtuvieron de Invitrogen. IL-6, IL-23, IFN-γ e IL-1β fueron proporcionados por PeproTech. IL-2, TGF-β, MMP9, GM6001, enlazador NHS-PEG-MAL y pifitrín-α fueron adquiridos de MedChemExpress. Sal de dextrano sulfato de sodio (DSS), kit de tinción con calceína-AM/yoduro de propidio (PI) y kit de detección de apoptosis PI/Anexina V, y colágeno tipo I de ratón fueron suministrados por Yeasen. Azoximetano (AOM) y lipopolisacárido (LPS) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. 2-(4-Amidinofenil)-6-indolocarbamidina dihidrocloruro (DAPI) y kits ELISA para IFN-γ, TNF-α, IL-17A, IL-23, IL-6 e IL-10 fueron adquiridos de Solarbio. Los kits ELISA para TGF-β1 y MMP9 se obtuvieron de Elabscience. El medio X-VIVO se adquirió de Lonza. Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio RPMI 1640, suero fetal bovino (SFB) y penicilina-estreptomicina (P/S) se adquirieron de Gibco.

Animales y líneas celulares

Todos los ratones hembra C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad) se obtuvieron de SPF Biotechnology Co., Ltd (Pekín, China) y se alojaron en grupos de seis en jaulas con ventilación individual bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas a 20-22 °C con acceso libre a pienso estándar para roedores y agua. Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales con animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Academia China de Ciencias Médicas y el Instituto de Medicina de Radiación de la Universidad de Pekín (número de aprobación: IRM/2-IACUC-2311-002).

RAW264.7 (línea celular de macrófagos murinos) y células HT-29 (línea celular de carcinoma colorrectal humano) se obtuvieron de Procell. Las células NCM460 (línea celular de epitelio colónico normal humano) se adquirieron de SUNNCELL. Todas las líneas celulares se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de SFB y 1% de P/S. Los neutrófilos y las células dendríticas derivadas de médula ósea se aislaron de ratones C57BL/6 de 6 semanas de edad. Las células de la médula ósea se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía 10% de SFB, 1% de P/S, 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos recombinante murino (GM-CSF; Sino Biological) y 10 ng/mL de IL-4 (Sino Biological) para la diferenciación de células dendríticas. La mitad del medio de cultivo se reemplazó con medio fresco en el día 3 y las células se utilizaron en el día 6 como células dendríticas inmaduras. Para el aislamiento de neutrófilos, las células de la médula ósea se añadieron a un gradiente de Percoll (55, 65 y 78%; v/v), seguido de centrifugación a 500×g durante 30 minutos. Los neutrófilos se recogieron en la interfase entre las capas de Percoll del 65 y el 78%, se lavaron tres veces con PBS y se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía 10% de SFB y 1% de P/S para su posterior análisis. Todas las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Preparación de rEXO y PMV

Las células T CD4+ vírgenes se aislaron del bazo de ratones C57BL/6 sanos utilizando un kit de aislamiento de células T CD4+ y se polarizaron a células T reguladoras en medio X-VIVO suplementado con anti-CD3 (5 μg/mL), anti-CD28 (2 μg/mL), IL-2 (20 ng/mL) y TGF-β (5 ng/mL) durante 7 días. El sobrenadante del cultivo de Treg se centrifugó secuencialmente a 300×g durante 10 minutos, 2000×g durante 20 minutos y 10.000×g durante 30 minutos para eliminar los residuos, seguido de ultracentrifugación a 100.000×g durante 70 minutos para obtener rEXO.

Las plaquetas aisladas de la sangre total de ratones C57BL/6 sanos se sometieron a ciclos de congelación-descongelación y las membranas plaquetarias se extrajeron mediante centrifugación a 8000×g durante 20 minutos. Las membranas procesadas se extruyeron secuencialmente a través de filtros de membrana porosa de policarbonato con tamaños de poro decrecientes (0,8, 0,4, 0,2 y 0,1 μm) para obtener PMV. Las concentraciones de proteína de rEXO y PMV se cuantificaron utilizando un kit de ensayo BCA (Accurate Biotechnology).

Preparación y caracterización de PrEXO-a23

Coextrusión de PMV y rEXO. PrEXO se preparó mezclando PMV y rEXO en relaciones de masa proteica de 1:1, 1:2 o 1:3, seguido de sonicación (40 kHz, 5 minutos) y luego una extrusión repetida como se describió para la preparación de PMV. La eficiencia de fusión de PrEXO se evaluó mediante citómetro de flujo NanoFlow (CytoFLEX, Beckman).

Síntesis y conjugación de un enlazador escindible por MMP9 a a23. Se utilizó un enlazador peptídico escindible por MMP9 (Arg-Val-Gly-Leu-Pro, RVGLP) con un grupo NHS en el extremo arginina (Arg) y un grupo Mal en el extremo prolina (Pro) para conjugar el anticuerpo IL-23 (a23) a los vesículas híbridas (PrEXO). Para determinar la relación molar óptima para la conjugación del enlazador-a23, a23 se hizo reaccionar con un enlazador en relaciones molares (a23:enlazador) de 1:1, 1:10, 1:50, 1:75 o 1:100 en PBS a 4 °C durante 12-18 horas. El enlazador no reaccionado se eliminó mediante centrifugación a 8000×g durante 30 minutos utilizando un filtro centrífugo (100 kDa; Jet Biofil). El enlazador-a23 purificado se analizó utilizando espectrometría de masas de ionización láser asistida por matriz en tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS; AXIMA-Performance MA, Shimadzu).

Preparación de PrEXO-a23. PrEXO se preparó mediante coextrusión de vesículas de membrana de plaquetas y exosomas derivados de Treg en una relación de masa proteica de 1:1, seguida de la cuantificación de proteínas utilizando un ensayo BCA. PrEXO se trató con 1 mM de TCEP a 37 °C durante 30 minutos para exponer los grupos sulfhidrilo (SH) en su membrana. PrEXO pretratado se añadió luego al enlazador-a23 purificado en una relación de masa (PrEXO:a23) de 1:0,1, 1:0,25, 1:0,5, 1:1 o 1:2, y se incubó a 25 °C durante 1 hora. El enlazador-a23 no reaccionado se eliminó mediante centrifugación a 8000×g durante 30 minutos utilizando un filtro centrífugo (300 kDa). Se utilizó ELISA para determinar la eficiencia de conjugación de a23 a PrEXO. Utilizando el mismo método, PrEXO se conjugó a a23 utilizando un enlazador no escindible por MMP9 (fL: NHS-PEG-MAL) para generar PrEXO-fL-a23.

Caracterización de PrEXO-a23. El análisis morfológico se realizó utilizando un instrumento TEM (JEM-1400 Flash, JEOL, Japón). El tamaño de las partículas y los potenciales zeta se midieron mediante un analizador Nano ZS Malvern (Malvern, Reino Unido). PrEXO-a23 se almacenó en PBS (pH 7,4) a 4 °C y en plasma a 37 °C, y el tamaño de las partículas y el potencial zeta se midieron diariamente durante 7 días.

Análisis de proteínas de PrEXO-a23

IL-10 (1:50), CTLA-4 (1:50), ALIX (1:50), TSG101 (1:50), CCR6 (1:50), CD62P (1:50), GPIbα (1:50) y a23 se detectaron utilizando un sistema automatizado de electroforesis capilar digital (CE)-Western (JS4167, ProteinSimple, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Específicamente, las muestras de proteína se prepararon utilizando un tampón de carga sin agentes reductores (por ejemplo, DTT) para permitir el análisis en condiciones no reductoras. Las muestras de proteína, la dilución del anticuerpo primario, la dilución del anticuerpo secundario y el sustrato de quimioluminiscencia se añadieron secuencialmente a las placas de canal para la detección de proteínas. Todos los análisis se llevaron a cabo utilizando el software Compass for Simple Western (v 6.0.0, ProteinSimple).

Ensayo de colocalización de PrEXO-a23

rEXO, PMV y a23 se etiquetaron con DiI, DiD y Alexa Fluor 488, respectivamente. Todas las muestras se incubaron con 5 μg/mL de tinte a 37 °C durante 30 minutos. PrEXO-a23 triplemente etiquetado se observó utilizando microscopía confocal de barrido láser (Eclipse Ti2, Nikon, Japón) con un objetivo de inmersión en aceite de 100×.

Evaluación in vitro de la liberación de a23 de PrEXO-a23

Para evaluar las propiedades responsivas a MMP9 del enlazador peptídico, PrEXO-a23 se incubó con MMP9 con o sin el inhibidor de MMP9 GM6001 en intervalos de tiempo predeterminados. El a23 liberado se cuantificó utilizando un kit ELISA.

Modelo de cocultivo de células T CD4+ y células epiteliales intestinales

Las células T CD4+ vírgenes se polarizaron a células Th17 cultivándolas en medio RPMI 1640 que contenía TGF-β (1 ng/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-23 (5 ng/mL), IL-1β (10 ng/mL), anti-IFN-γ (10 μg/mL) y anti-IL-4 (10 μg/mL) durante 72 horas. Las células se trataron con rEXO (25 μg/mL), PMV (25 μg/mL), PrEXO (25 μg/mL de rEXO y 25 μg/mL de PMV), a23 (7,5 μg/mL) o PrEXO-a23 (25 μg/mL de rEXO, 25 μg/mL de PMV y 7,5 μg/mL de a23), respectivamente. Después de 72 horas, las células T se recogieron y se tiñeron con el anticuerpo APC/FireTM 750-CD4 y el anticuerpo PE-IL-17A para detectar el porcentaje de células Th17 utilizando un citómetro de flujo (CytoFLEX, Beckman).

Para el cocultivo, las células pretratadas (2 × 105 por pocillo) se sembraron en la cámara superior de insertos de 12 pocillos (NEST Biotechnology), mientras que las células NCM460 (5 × 105 células por pocillo) se colocaron en la cámara inferior. Después de 24 horas, las células NCM460 se recogieron y se tiñeron con PI/Calceína-AM o Anexina V/PI durante 15 minutos según el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron luego utilizando microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.

Inducción de células dendríticas tolerogénicas (tDCs) y células T reguladoras (Tregs)

En el día 6, las células dendríticas inmaduras se estimularon con LPS (1 μg/mL) e IFN-γ (20 ng/mL) para generar células dendríticas maduras durante 24 horas. Para la inducción de tDCs, las células se cotrataron con rEXO, PMV, PrEXO, a23 o PrEXO-a23, respectivamente. Después de 24 horas, las células se incubaron con CD16/CD32 (BioLegend) durante 15 minutos para bloquear los receptores Fcγ, y luego se tiñeron con los anticuerpos BV421-CD11c, APC-CD80, PE-CD86 y FITC-MHC II, y se analizaron mediante citometría de flujo. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron para el análisis de citocinas (IL-10, TGF-β, IL-6 y TNF-α) utilizando kits ELISA.

Para activar los linfocitos, se cocultivaron 5 × 105 células T CD4+ con 1 × 105 células dendríticas pretratadas durante 72 horas. Después de la incubación, las células T CD4+ se tiñeron con anticuerpos, incluidos APC/FireTM 750-CD4, PE-IL-17A, APC-CD25 y PE-FOXP3, para evaluar la proporción de células Th17 y Tregs.

Ensayo de flujo in vitro

Un canal de flujo se recubrió con 100 μg/mL de colágeno tipo I incubando durante la noche a 37 °C. rEXO, PMV, PrEXO o PrEXO-a23 etiquetados con DiO se cargaron en una jeringa de 1 mL para la perfusión a través del canal de flujo recubierto con colágeno a una velocidad de cizallamiento de 500 s−1 utilizando una bomba de jeringa (Harvard, EE. UU.). Luego, el canal de flujo se perfundió con PBS a la misma velocidad de cizallamiento antes de la imagen mediante CLSM.

Ensayo de direccionamiento inflamatorio in vitro

Las células RAW264.7 o los neutrófilos se incubaron con rEXO, PMV, PrEXO o PrEXO-a23 etiquetados con DiI durante 2 horas, con o sin la preestimulación con LPS (1 μg/mL). Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y luego se midió el porcentaje de células positivas para DiI o la intensidad media de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo o CLSM. PrEXO-a23 se incubó con o sin RAW264.7 activadas con LPS en condiciones de MMP9. La liberación acumulativa de a23 se midió mediante ELISA en los puntos de tiempo indicados.

Biodistribución in vivo de PrEXO-a23

[Este apartado está incompleto en el texto original y no se puede traducir sin información adicional.]

Para generar el modelo de ratón con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), se alimentó a ratones C57BL/6 con un 3% (p/v) de DSS durante 7 días, tras haberlos sometido previamente a una dieta sin fluorescencia. Los ratones recibieron por vía intravenosa rEXO, PMV, rEXO + PMV, PrEXO o PrEXO-a23 marcados con DiD, respectivamente. A los 0, 2, 6, 12, 24, 36 y 48 h después de la inyección, se obtuvieron imágenes de los ratones utilizando un sistema de imagenología in vivo (ABL-X5, Tanon, China) para analizar la biodistribución de la fluorescencia de DiD. Se sacrificaron los ratones de cada grupo y se recolectaron sus principales órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y colon) para su posterior análisis. Para el análisis de localización, se tiñeron secciones de colon congeladas con DAPI y se capturaron imágenes utilizando microscopía confocal láser (MCL). Para el análisis del direccionamiento celular, se procesaron los tejidos del colon en suspensiones de células individuales para el análisis por citometría de flujo. Se analizó la fluorescencia relativa de DiD en las células dendríticas (APC/FireTM 750-CD45 y BV421-CD11c), macrófagos (APC/FireTM 750-CD45 y BV421-F4/80), células T (APC/FireTM 750-CD45 y FITC-CD3), células B (APC/FireTM 750-CD45 y PE-CD19) y neutrófilos (APC/FireTM 750-CD45 y PE-Ly6G) para determinar la captación por las células inmunitarias.

Estudio de farmacocinética in vivo

Se administró por vía intravenosa PrEXO-a23 marcado con DiD a ratones C57BL/6, y se recolectaron muestras de sangre en puntos de tiempo predeterminados (0,5, 1, 2, 4, 24, 48 y 72 h). Las muestras de sangre se colocaron en placas de 96 pocillos y se midió la intensidad de la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 650 nm utilizando un sistema de imagenología in vivo.

Análisis de seguimiento con doble etiqueta in vivo

Se marcó a23 con Alexa Fluor 647 y PrEXO con DiR. A los ratones con EII inducida por DSS se les inyectó por vía intravenosa PrEXO + a23 (una mezcla física de PrEXO y a23), PrEXO-fL-a23 (PrEXO y a23 se conjugaron con un péptido no escindible, fL) o PrEXO-a23 (PrEXO y a23 se conjugaron con el péptido escindible por MMP), respectivamente. Se monitoreó la biodistribución de PrEXO y a23 utilizando un sistema de imagenología in vivo a los 0, 2, 6, 12, 24, 36 y 48 h después de la inyección. Se recolectaron tejidos del colon a las 12 h después de la inyección para el análisis de imagen ex vivo. Se procesaron las secciones criocongeladas para la imagenología con MCL con el fin de examinar la colocalización de las señales de PrEXO (marcado con DiI) y a23 (marcado con Alexa Fluor 647).

Evaluación de los signos clínicos en el modelo de EII inducida por DSS

Tras un período de aclimatación de 7 días, se administró a ratonas C57BL/6 (de 8 semanas de edad) un 3% (p/v) de DSS en agua de beber durante 7 días para establecer un modelo de EII. Los ratones sanos del grupo normal no recibieron tratamiento, mientras que los ratones con EII inducida por DSS en los grupos DSS, PrEXO, a23, rEXO-a23 y PrEXO-a23 recibieron inyecciones intravenosas de PBS, PrEXO, a23, rEXO-a23 y PrEXO-a23, respectivamente, en los días 2, 4 y 6 de la administración de DSS. La dosis se administró a 5 mg/kg para rEXO y 1,5 mg/kg para a23. Se observaron los ratones diariamente y se evaluó el peso corporal y el índice de actividad de la enfermedad (IAE). Los puntajes del IAE se calcularon diariamente en función de la pérdida de peso (de 0 a 4), la consistencia de las heces (de 0 a 4) y la presencia de sangre en las heces (de 0 a 4). El día 8, se sacrificaron los ratones y se recolectaron sus colones para medir la longitud y realizar análisis posteriores. El índice del bazo se calculó de la siguiente manera: índice del bazo = (peso del bazo/peso corporal) × 100%.

Evaluación del efecto inhibitorio en el modelo de CAC inducido por AOM/DSS

Para inducir el modelo de ratón con cáncer colorrectal (CAC), se inyectó por vía intraperitoneal AOM (10 mg/kg) a ratonas C57BL/6 de seis semanas de edad. Después de 7 días, los ratones se sometieron a tres ciclos de tratamiento con DSS, cada uno de los cuales consistió en un 2,5% de DSS durante 7 días seguido de un período de recuperación de 14 días con agua normal. Durante cada período de tratamiento con DSS de 7 días, se administraron PBS, PrEXO, a23, rEXO-a23 y PrEXO-a23 por vía intravenosa cada 2 días, como se describió para el modelo de EII. Al final del experimento de 10 semanas, se sacrificaron los ratones y se extirparon los colones para la enumeración de tumores y la medición de la longitud.

Análisis histológico

Los tejidos del colon se fijaron en formaldehído al 10% durante 24 h, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm con un micrótomo (Thermo Fisher). Posteriormente, se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en las secciones de tejido. Se puntuó de forma ciega el daño histológico del colon para evaluar el daño epitelial (de 0 a 6) y la infiltración inflamatoria (mucosa: de 0 a 3; submucosa: de 0 a 2; músculo/serosa: de 0 a 1) según los criterios establecidos ^[60].

Para la inmunofluorescencia, se permeabilizaron las láminas de colon fijadas con 0,3% de Triton X-100 durante 10 min, se bloquearon con suero de cabra al 5% y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra ZO-1 (1:100), ocludina (1:100), CD86 (1:400), CD68 (1:1000), CD4 (1:500) o Ki67 (1:1000). Se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 647 (1:500) durante 1 h y se tiñeron los núcleos de las células con DAPI (1:1000).

Para la inmunohistoquímica, se etiquetaron las secciones de colon preprocesadas con anticuerpos primarios anti-MMP9 (1:500), anti-IL-17A (1:900), anti-IFN-γ (1:200) o anti-α-SMA (1:900) durante la noche, seguidos de anticuerpos secundarios y una reacción de coloración utilizando un kit DAB (Maxim). Se contratiñeron los núcleos de las células con hematoxilina. Todas las imágenes se adquirieron utilizando un escáner de portaobjetos digitales Pannoramic (3D HISTECH) y se analizaron con ImageJ.

Análisis por citometría de flujo de los subgrupos de células del colon

Se aislaron los linfocitos de la lámina propia del colon mediante la digestión del tejido con Liberase (31,25 μg/mL, Roche) y DNase I (50 μg/mL, Roche) a 37 °C durante 1 h con agitación. Se obtuvieron suspensiones de células individuales mediante un tamiz celular de 70 μm (Biosharp) y se separaron 1 × 106 células de cada grupo para la tinción. Después del bloqueo de los receptores Fc, se incubaron las células con anticuerpos fluorescentes de superficie que contenían BV421-CD45, FITC-CD3 y anticuerpos APC/FireTM 750-CD4. Para la tinción de los factores de transcripción, se fijaron y permeabilizaron las células utilizando un kit comercial de tinción de FOXP3 (eBioscience) según el protocolo del fabricante, seguido de la incubación con el anticuerpo PE-FOXP3. Para la tinción de citocinas intracelulares, se estimularon los linfocitos aislados con un cóctel de activación celular (BioLegend) durante 6 h a 37 °C antes de la tinción de superficie. Posteriormente, se utilizaron el anticuerpo PE-anti-IL-17 y el anticuerpo APC-anti-IFN-γ. Se analizaron las proporciones de células Th1, Th17 y Treg en cada muestra utilizando un citómetro de flujo. Finalmente, se procesaron todos los datos utilizando FlowJo V10.8.1.

Ensayo ELISA

Se recolectaron suero y tejidos del colon de ratones con EII. Se homogeneizaron los segmentos del colon en PBS utilizando un homogeneizador a 4 °C. Se centrifugaron los homogeneizados a 10 000×g durante 10 min y se analizaron los sobrenadantes para detectar citocinas y MMP9 utilizando kits ELISA siguiendo los protocolos del fabricante.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR)

Se extrajo el ARN total de los tejidos del colon congelados utilizando TRIzol, se cuantificó en un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, EE. UU.) y se realizó la transcripción inversa utilizando HiScript III RT SuperMix (Vazyme). A continuación, se realizó qPCR en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX Connect con SYBR Green Master Mix. Los pares de cebadores para los genes diana del ratón se muestran en la Tabla Suplementaria 1. Se calculó la expresión génica relativa utilizando el método 2−ΔΔCt, normalizada a GAPDH.

Análisis de secuenciación de ARN

El día 8, se sacrificaron los ratones y se extirparon los tejidos del colon (n = 5). Se extrajo el ARN total de los tejidos del colon utilizando TRIzol. Después de la extracción del ARN total, se enriqueció el ARNm eucariota utilizando cuentas de Oligo (dT). Tras el enriquecimiento del ARNm, se procesó el ARN para la síntesis de ADNc y la construcción de bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ARN MGIEasy. Se secuenciaron las bibliotecas en la plataforma de secuenciación MGISEQ-2000 (Beijing Genomic Institution, BGI). Se filtraron las lecturas sin procesar con SOAPnuke 1.5.6 y se alinearon las lecturas limpias con el genoma del ratón (GRCm38.p6) utilizando HISAT2. Se obtuvieron los recuentos de expresión génica con feature counts y se realizó el análisis de expresión diferencial utilizando DESeq2 (v1.4.5) entre dos grupos diferentes. Los genes con el parámetro de |log2(cambio de pliegue)| ≥ 1 y P ajustada ≤ 0,05 se consideraron genes expresados diferencialmente (DEG). Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional, incluido el agrupamiento de mapas de calor, GSEA, GO y análisis KEGG en la plataforma BGI Dr. Tom (https://biosys.bgi.com). Se realizó GSEA utilizando el software GSEA v4.0.3 para determinar si los conjuntos de genes predefinidos de las vías KEGG estaban significativamente enriquecidos entre dos grupos.

Análisis de Western blot

Se cuantificó la expresión de proteínas utilizando un sistema automatizado de electroforesis capilar digital Western (JS4167, ProteinSimple, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se homogeneizaron los segmentos del colon de los ratones en tampón RIPA para extraer proteínas y se determinó la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo de BCA. Se añadieron las muestras de proteínas a cada pocillo, seguidas de los anticuerpos primarios correspondientes (p53 a 1:50, p21 a 1:50, Bax a 1:50 y GAPDH a 1:50) y el anticuerpo secundario conjugado con HRP. Se calcularon los niveles relativos de proteínas midiendo el área bajo la curva de un cromatograma de quimioluminiscencia y se normalizaron con GAPDH. Todos los análisis se realizaron utilizando el software Compass for Simple Western (v 6.0.0, ProteinSimple). Los escaneos sin recortar están disponibles en el archivo de datos fuente.

Ensayo de secuenciación de microbiota de ARNr 16S

El día 7, se recolectaron las heces de los ratones para el análisis de la microbiota intestinal mediante la secuenciación del gen de ARNr 16S en Genesky Biotechnologies Inc. (Shanghái, China). Se extrajo el ADN total de las heces utilizando un kit de extracción de ADN de heces. Las regiones hipervariables V3-V4 del gen de ARNr 16S de las bacterias se amplificaron por PCR y los productos se purificaron con el kit Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, CA, EE. UU.). Se construyeron bibliotecas con adaptadores Illumina, se cuantificaron con un fluorómetro Qubit 3.0 y se validaron con un sistema Agilent Bioanalyzer 2100. La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina NovaSeq para generar lecturas emparejadas de 250 pb. El análisis de datos se realizó en la plataforma Genesky Cloud (http://cloud.geneskybiotech.com), y se analizó la composición microbiana a nivel de familia.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± DE (desviación estándar). Para las comparaciones entre dos grupos, se aplicó una prueba t de Student de dos colas. Para las comparaciones múltiples, se utilizó ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las curvas de supervivencia se analizaron mediante la prueba de log-rank. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (v9.0). Se consideró que P < 0,05 era significativo.

Resumen de la información

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de información de Nature Portfolio vinculado a este artículo.