El ácido palmítico induce la palmitoilación de B7H3, lo que favorece la evasión inmune.

El cáncer colorrectal es el tercer tipo de cáncer más común en el mundo^[1]. Tradicionalmente, la cirugía ha sido el tratamiento principal, pero los avances recientes sugieren que la inmunoterapia puede ofrecer resultados duraderos y potencialmente curativos^[2]. Los puntos de control inmunitarios, como el receptor de muerte programada-1 (PD-1), el ligando de muerte programada-1 (PD-L1) y el antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), desempeñan funciones cruciales en el mantenimiento de la autotolerancia y la regulación de la inmunidad antitumoral^[3]–^[5]. Estas vías de los puntos de control inmunitarios implican interacciones receptor-ligando que transmiten señales co-inhibitorias a las células T, suprimiendo así su activación y función efectora. Los inhibidores de los puntos de control inmunitarios (ICIs) dirigidos a PD-1/PD-L1 son eficaces principalmente en los cánceres colorrectales con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H), que constituyen solo alrededor del 15% de los casos^[6]–^[9]. En contraste, estos tratamientos muestran un éxito limitado en la mayoría de los cánceres colorrectales que son estables en microsatélites (MSS)^[10],^[11]. Por lo tanto, es imperativo llevar a cabo una búsqueda exhaustiva de puntos de control inmunitarios alternativos para aplicarlos en el tratamiento de tumores MSS.

La familia B7, que comprende un grupo de proteínas transmembrana estructuralmente relacionadas, incluyendo B7-1, B7-2, B7-H1 (también conocido como PD-L1), B7-H3 y otros, interactúa con los receptores de la familia CD28 para estimular o suprimir la respuesta inmunitaria^[12]–^[14]. B7H3 (CD276) ha surgido recientemente como un objetivo de inmunoterapia prometedor debido a su papel en la supresión de la actividad de las células T citotóxicas y las células asesinas naturales (NK)^[15]–^[18]. B7H3 se expresa en gran medida en diversas neoplasias, y su expresión elevada se asocia con un mal pronóstico y resultados clínicos adversos^[19]–^[22]. Aunque el ARNm de B7H3 es detectable en una amplia variedad de tejidos y tipos de células, la expresión de proteínas es relativamente limitada, lo que sugiere que los mecanismos postranscripcionales regulan estrictamente su abundancia^[23]. Las modificaciones postraduccionales (PTM) de B7H3 están poco estudiadas, pero es probable que desempeñen un papel importante en la modulación de su función en el cáncer. Si bien se han predicho los sitios de fosforilación y ubiquitinación, la N-glicosilación desempeña un papel fundamental en la estabilización de B7H3 y en garantizar su expresión estable en la membrana plasmática, facilitando así su función inmunosupresora^[24]–^[26]. Sin embargo, aún se desconoce en gran medida si otras modificaciones postraduccionales, además de la glicosilación, contribuyen a regular la expresión o la función de B7H3. El esclarecimiento de estas modificaciones poco exploradas y sus mecanismos reguladores será fundamental para el desarrollo de terapias más eficaces dirigidas a B7H3.

La S-acilación (a menudo denominada S-palmitoilación o simplemente palmitoilación) es una importante modificación postraduccional en la que se forma un enlace tioéster entre el grupo sulfhidrilo de un residuo de cisteína y, más comúnmente, un palmitato de 16 carbonos^[27]–^[30]. Esta PTM conduce a un aumento de la lipofilicidad de la proteína diana modificada, lo que puede afectar su estabilidad, función o tráfico subcelular^[31]–^[35]. La palmitoilación está catalizada principalmente por una familia relativamente conservada de proteínas aciltransferasas de tipo zinc-finger DHHC (Asp-His-His-Cys) (PATs)^[36],^[37]. La evidencia acumulada sugiere que las moléculas relacionadas con la inmunidad, como PD-L1^[38] y NOD1/2^[39], pueden ser palmitoiladas, lo que indica que la palmitoilación desempeña un papel importante en la respuesta inmunitaria.

La palmitoilación de proteínas está regulada no solo por las enzimas de la familia ZDHHC, sino también por la disponibilidad de su sustrato activo, la palmitoil-coenzima A. Se ha informado que la palmitoil-coenzima A, el metabolito activo del ácido palmítico (AP), inicia las modificaciones de palmitoilación en una variedad de proteínas^[40]–^[42]. El AP es un ácido graso saturado que se encuentra de forma natural y que se ha informado que desempeña un papel importante en la evasión inmunitaria, el metabolismo y la inflamación^[43]–^[45]. Sin embargo, aún no está claro si el AP contribuye al establecimiento de un microambiente inmunosupresor en el cáncer colorrectal MSS.

En este trabajo, identificamos que la palmitoilación de B7H3 desencadenada por el AP es un factor clave en la formación del microambiente inmunosupresor en el cáncer colorrectal. Mecánicamente, demostramos que ZDHHC24 cataliza la palmitoilación de B7H3 en la cisteína 496 (C496), impidiendo su interacción con el receptor de autofagia SQSTM1/p62 y bloqueando su degradación autofágica. Biológicamente, demostramos que la palmitoilación de B7H3 C496 remodela el microambiente inmunitario y promueve específicamente la evasión inmune tumoral al inhibir los efectos antitumorales de las células T CD8+. Basándonos en estos hallazgos, diseñamos un péptido (péptido E) que se une de forma competitiva a ZDHHC24. Tanto los experimentos in vivo como in vitro demuestran que el péptido E reduce la palmitoilación de B7H3, promueve su degradación autofágica y, en última instancia, mejora la actividad antitumoral de las células T CD8+. En particular, la combinación del péptido E con la terapia anti-PD-1 produce un efecto sinérgico, mejorando significativamente los resultados terapéuticos. Estos hallazgos proporcionan información importante sobre la inmunoterapia para el cáncer colorrectal e identifican la palmitoilación de B7H3 como un prometedor objetivo terapéutico.

Resultados

La palmitoilación de B7H3 desencadenada por el AP mejora la estabilidad de la proteína B7H3

Para identificar los principales puntos de control inmunitarios que regulan el microambiente tumoral en el cáncer colorrectal MSS, realizamos un análisis inmunohistoquímico de los miembros de la familia B7 utilizando muestras de tumores fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) de pacientes con cáncer colorrectal MSS y MSI-H (cohorte 1, Tabla S1). Los resultados indicaron que la proteína B7H3 estaba marcadamente sobreexpresada en los tumores MSS (Fig. 1A, B y S1A). Como molécula de punto de control inmunitario, B7H3 se expresa no solo en las células tumorales, sino también en varias poblaciones de células inmunitarias. La tinción de inmunofluorescencia mostró una fuerte colocalización de B7H3 con el marcador tumoral, la molécula de adhesión de las células epiteliales (EPCAM), en los tejidos tumorales (Fig. S1B), lo que indica una expresión prominente en las células tumorales. La citometría de flujo confirmó además que más del 95% de las células tumorales son B7H3-positivas, en comparación con aproximadamente el 30% de las células inmunitarias (Fig. S1C, D) (cohorte 2, Tabla S2). Cuando se normalizó a 100 000 células totales, las células tumorales B7H3+ representaron aproximadamente 90 000 (Fig. S1E), lo que destaca que las células tumorales son la fuente predominante de B7H3 en los tumores MSS. Curiosamente, el análisis de qPCR posterior reveló que no hubo alteraciones significativas en los niveles de ARNm de B7H3 en las muestras MSS en comparación con las muestras MSI-H (Fig. S1F) (cohorte 3, Tabla S3), lo que sugiere que las PTM desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión de B7H3 específicamente en los tumores MSS. Dado que se ha informado que la glicosilación de B7H3 catalizada por FUT8 puede estabilizar B7H3 y garantizar su expresión estable en la membrana plasmática^[25], evaluamos a continuación la expresión de FUT8 en las muestras de tumores de cáncer colorrectal MSS y MSI-H mediante inmunohistoquímica. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa en la expresión de FUT8 entre estos grupos (Fig. S1G, H). Para comprender mejor los mecanismos subyacentes, realizamos un secuenciamiento de ARN utilizando muestras frescas de tumores de colon (cohorte 4, Tabla S4). El análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) reveló que varios genes que regulan los metabolitos, como los ácidos carboxílicos, los ácidos grasos y las vitaminas, se expresaban de forma aberrante en los tumores MSS (Fig. 1C y Datos suplementarios 1). Por lo tanto, especulamos que existían anomalías metabólicas subyacentes en estos dos tipos de tumores. Luego, recolectamos muestras frescas de CRC para un análisis de metabolitos no dirigido (Fig. 1D y S1I) (cohorte 5, Tabla S5 y Datos suplementarios 2) y realizamos un análisis de enriquecimiento de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) de los datos de metabolómica (Fig. 1E). Para los metabolitos aumentados en el CRC MSS, observamos el enriquecimiento de las vías relacionadas con la degradación de los ácidos grasos (Fig. 1F). En particular, las vías relacionadas con el metabolismo de los ácidos grasos también se enriquecieron en los resultados de GSEA de los datos de secuenciación de ARN (Fig. S1J-L). Los hallazgos sugieren que las anomalías en el metabolismo de los ácidos grasos pueden ser características de los tumores MSS. Sobre la base de estos hallazgos, tratamos las células RKO con cinco metabolitos asociados con la degradación de los ácidos grasos: ácido glutarico, palmitoilcarnitina, hexadecanal, ácido palmítico (AP) y coenzima A, identificados en nuestro análisis de metabolómica. Entre estos, solo el AP aumentó significativamente la expresión de B7H3 (Fig. 1G, H). Para confirmar aún más esta observación, realizamos experimentos de dependencia de la dosis en las células RKO y descubrimos que el aumento de las concentraciones de AP condujo a un aumento de la concentración de los niveles de proteína B7H3 (Fig. S1M). Dado que se ha informado ampliamente que el AP desencadena la palmitoilación, empleamos un ensayo de intercambio de acilo-biotina (ABE)^[46] para determinar si B7H3 se somete a palmitoilación (Fig. S1N). Nuestros resultados demostraron que los niveles de palmitoilación de B7H3 aumentaron en respuesta a concentraciones más altas de AP (Fig. 1I). Además, el tratamiento con 2-bromopalmitato (2-BP), un inhibidor de la palmitoilación, redujo significativamente la palmitoilación de B7H3 (Fig. 1J y S1O). Al igual que otro miembro de la familia B7, B7H1 (PD-L1)^[38], el nivel de proteína de B7H3 estaba estrechamente relacionado con su estado de palmitoilación (Fig. S1P). En particular, los resultados de qPCR indicaron que ni el 2-BP ni la palmostatina B (un inhibidor de la despalmitoilación) afectaron los niveles de transcripción de B7H3 (Fig. S1Q). Cuando se aplicó 2-BP para inhibir la palmitoilación, observamos una disminución dependiente de la dosis y del tiempo en la expresión de B7H3, mientras que el tratamiento con palmostatina B condujo al efecto opuesto (Fig. 1K y S1R). Dado que la palmitoilación también puede afectar la asociación de la proteína con la membrana, realizamos ensayos de fraccionamiento citoplásmico y de membrana, que revelaron una reducción en la expresión de B7H3 dentro de las fracciones citoplásmica y de membrana después del tratamiento con 2-BP (Fig. S1S). El análisis de inmunofluorescencia confirmó esta disminución en la expresión de B7H3 (Fig. S1T). Además, utilizando un ensayo de persecución con cicloheximida (CHX), evaluamos el impacto de la palmitoilación de B7H3 en la estabilidad de la proteína. El tratamiento con 2-BP aceleró notablemente la degradación de B7H3 (Fig. 1L, M), mientras que la inhibición de la despalmitoilación con palmostatina B ralentizó la degradación de B7H3 (Fig. S1U, V). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la palmitoilación desencadenada por el AP contribuye a la estabilidad de B7H3.

La palmitoilación de B7H3 C496 inhibe la degradación autofágica mediada por SQSTM1/p62

SPANISH TRANSLATION:

B7H3, al ser una proteína de membrana, en principio puede ser degradada a través del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), la vía de autofagia-lisosoma o la endocitosis hacia los lisosomas^[47],^[48]. Planteamos la hipótesis de que la palmitoilación modula principalmente una de estas vías para estabilizar B7H3. Por lo tanto, aplicamos moduladores específicos de cada vía junto con 2-BP. Los agentes farmacológicos que interrumpen las distintas etapas de la vía de autofagia-lisosoma (3-MA, que inhibe la PI3K de clase III y bloquea la iniciación de la autofagia), bafilomicina A1 (Baf A1) y cloroquina (ambos bloquean la degradación lisosomal) bloquearon eficazmente la degradación de B7H3 inducida por 2-BP, mientras que el inhibidor del proteasoma MG132 no tuvo tal efecto (Fig. 2A, B). Además, la inducción de la autofagia mediante EBSS aceleró significativamente la degradación de B7H3, lo que se vio aún más potenciado por 2-BP (Fig. S2A, B). En conjunto, estas observaciones indican que la degradación de B7H3 en este sistema está mediada predominantemente por la vía de autofagia-lisosoma. Las proteínas esenciales de la autofagia ATG5 y BECN1 son necesarias para la formación de autofagosomas, y la degradación de B7H3 se redujo notablemente en las células con deleción (KO) de ATG5 o BECN1 (Fig. 2C, D y S2C, D). La alteración de la autofagia también contrarrestó la reducción de la expresión de B7H3 inducida por 2-BP (Fig. S2E, F). La autofagia selectiva depende de los receptores de carga que transportan sustratos específicos a los autofagosomas para su degradación^[49],^[50]. Entre los varios receptores de carga probados (SQSTM1, OPTN, NDP52, NBR1, TOLLIP y NIX), B7H3 exhibió una fuerte afinidad por SQSTM1, como se demostró mediante ensayos de inmunoprecipitación (Fig. 2E). Además, los ensayos de persecución con cicloheximida (CHX) revelaron que la degradación de B7H3 se detuvo casi por completo en las células RKO que carecían de SQSTM1 (Fig. 2F, G) y que la deleción de SQSTM1 previno la degradación de B7H3 inducida por 2-BP (Fig. 2H). Estos hallazgos demuestran colectivamente que la degradación de B7H3 se produce principalmente a través de la autofagia selectiva mediada por SQSTM1 en los modelos celulares examinados. Para identificar el sitio de palmitoilación específico en la proteína B7H3, examinamos los 13 residuos de cisteína, cinco de los cuales se predijo que serían palmitoilados utilizando GPS-palm^[51] y GPS-lipid^[52] (Fig. 2I). El análisis con la base de datos Swiss-Palm, basada en proteomas de palmitoilación conocidos, también reveló un sitio de palmitoilación (Fig. 2I). Para validar estas predicciones experimentalmente, generamos mutantes de cisteína a alanina específicos del sitio y evaluamos sus niveles de palmitoilación utilizando ensayos ABE. Entre los mutantes, la palmitoilación de C496A fue casi indetectable en comparación con la de B7H3 de tipo salvaje (Fig. 2J), lo que destaca el papel esencial de C496. C496 se encuentra en el dominio intracelular de B7H3 (Fig. S2G) y está altamente conservado entre especies según el análisis de alineamiento de secuencias múltiples realizado en Jalview^[53] (Fig. 2K). De manera consistente, la mutación C496A en el sitio de palmitoilación de B7H3 también mostró una mayor afinidad por el receptor de carga SQSTM1/p62 que B7H3 WT (Fig. 2L). Para explorar el papel funcional de la palmitoilación de C496, utilizamos CRISPR/Cas9 para generar células RKO con deleción de B7H3 (RKOKO) (Fig. S2H) y establecimos posteriormente líneas celulares estables que expresan el mutante C496A (RKOC496A) (Fig. S2I). Los ensayos ABE confirmaron que la palmitoilación de B7H3 era apenas detectable en las células RKOC496A en comparación con las células de tipo salvaje (RKOWT) (Fig. 2M). Un ensayo de CHX reveló que la degradación de la proteína B7H3 se aceleró en las células RKOC496A (Fig. 2N, O), de manera similar a los efectos de la inhibición de la palmitoilación por 2-BP. La tinción de inmunofluorescencia demostró además una marcada disminución de la intensidad de la fluorescencia en las células RKOC496A (Fig. S2J). Además, encontramos que el tratamiento con rapamicina, que inhibe la actividad de mTORC1 y, por lo tanto, induce la autofagia, condujo a una degradación acelerada de la proteína B7H3 en las células RKOWT (Fig. S2K). Por el contrario, el tratamiento con 3-MA, bafilomicina A1 o cloroquina previno eficazmente la degradación de B7H3 en las células RKOC496A (Fig. S2L). Además, la microscopía confocal reveló que las células RKOC496A mostraron una mayor colocalización de B7H3 con LC3 y formaron agregados B7H3-SQSTM1/p62 más distintos en comparación con las células RKOWT (Fig. 2P y S2M), lo que indica que la palmitoilación de C496 restringe la degradación autofágica de B7H3. En conclusión, estos hallazgos demuestran que la palmitoilación de B7H3 en la cisteína 496 reduce su interacción con el receptor de carga SQSTM1/p62, lo que a su vez dificulta su degradación autofágica selectiva.

La palmitoilación de B7H3 inhibe la actividad antitumoral de las células T CD8+

Para investigar la función de la palmitoilación de B7H3 in vivo, generamos líneas celulares CT26 (CT26KO) y MC38 (MC38KO) con deleción de B7h3 de cáncer de colon de ratón (Fig. S3A). Dado que B7H3 murino comprende solo un par de dominios IgC y IgV^[24], diseñamos mutantes C278A (CT26C278A y MC38C278A) que expresan de manera estable B7H3 deficiente en palmitoilación, correspondiente al sitio de modificación humana (Fig. S3B). La palmitoilación en estos mutantes fue apenas detectable, como se confirmó mediante ensayos ABE (Fig. S3C). Luego, trasplantamos estas células de cáncer de colon de ratón modificadas de forma subcutánea en ratones. En ratones BALB/c inmunocompetentes, la progresión tumoral se inhibió significativamente en el grupo con B7H3 deficiente en palmitoilación (CT26C278A) en comparación con el grupo CT26WT (Fig. 3A, B y S3D). Sin embargo, en ratones NCG (NOD ShiLtJ Gpt Prkdcem26Cd52 Il2rgem26Cd22/Gpt) altamente inmunodeficientes, no se observaron diferencias significativas en el crecimiento tumoral entre CT26WT y CT26C278A, como lo evidencian pesos y volúmenes tumorales comparables (Fig. 3C, D y S3E). Se obtuvieron resultados similares con el modelo MC38, donde no hubo diferencias significativas entre MC38WT y MC38C278A en ratones NCG (Fig. S3F-H). Estos hallazgos sugieren que la palmitoilación de B7H3 no afecta directamente la proliferación de las células tumorales; más bien, los efectos antitumorales de la deficiencia de palmitoilación de B7H3 dependen del sistema inmunitario del huésped. Para investigar el impacto de la palmitoilación de B7H3 en el microambiente tumoral (TME), realizamos un análisis exhaustivo de las células inmunitarias CD45+ que infiltran dos tipos de tumores CT26 en ratones BALB/c utilizando citometría de flujo espectral. En resumen, identificamos 14 subpoblaciones celulares únicas (Fig. 3E, F). Los resultados revelaron que algunas células inmunosupresoras, incluidas las células supresoras derivadas de la médula ósea monocíticas (M-MDSC) y las células supresoras derivadas de la médula ósea polimorfonucleares (PMN-MDSC), se redujeron en los tumores deficientes en palmitoilación (C278A) (Fig. 3G y S3I). Por el contrario, algunas poblaciones celulares con efectos antitumorales, incluidas las células T CD8+, las células T CD4+ y las células asesinas naturales (NK), aumentaron en los tumores C278A (Fig. 3G y S3I). Estos resultados indican que la mutación de la palmitoilación de B7H3 altera sustancialmente el panorama inmunitario dentro del TME, particularmente al promover la infiltración de células T CD8+ (Fig. 3G, H y S3I). Para probar si las células T CD8+ son mediadores esenciales de los efectos antitumorales causados por la deficiencia de palmitoilación de B7H3, agotamos las células T CD8+ in vivo utilizando un anticuerpo anti-CD8α (Fig. 3I). Sorprendentemente, el agotamiento de las células T CD8+ abolió por completo la diferencia en el crecimiento tumoral entre B7H3 de tipo salvaje y el mutante C278A deficiente en palmitoilación (Fig. 3J, K y S3J), lo que indica que el efecto antitumoral asociado con la pérdida de la palmitoilación de B7H3 depende principalmente de las células T CD8+. Para validar estos hallazgos, trasplantamos de forma subcutánea la línea celular B7h3 con deleción (MC38KO) y las líneas celulares MC38WT y MC38C278A estables en ratones C57BL/6J. Los resultados revelaron que la mutación del sitio de palmitoilación suprimió significativamente el crecimiento tumoral, un efecto que se amplificó aún más en el grupo con deleción de B7h3 (MC38KO) (Fig. 3L, M y S3K). Un análisis de la infiltración de células T CD8+ reveló que el grupo MC38C278A presentaba una proporción significativamente mayor de células T CD8+ que el grupo MC38WT, una tendencia que se amplificó aún más en los tumores MC38KO (Fig. 3N y S3L). La tinción de inmunofluorescencia de los tejidos tumorales corroboró estos hallazgos (Fig. 3O, P). Además, la expresión de las moléculas efectoras de las células T CD8+, como la granzima B (GZMB) y el interferón gamma (IFN-γ), fue mayor en los tumores MC38C278A en comparación con los tumores MC38WT (Fig. 3Q, R y S3M, N). Para confirmar estas observaciones, realizamos un ensayo de eliminación tumoral mediada por células T al cocultivar células T primarias humanas activadas con las líneas celulares RKOKO, RKOWT y RKOC496A. La mutación RKOC496A mejoró notablemente la citotoxicidad de las células T hacia las células tumorales (Fig. 3S y S3O). Coherente con los hallazgos de citometría de flujo, el ensayo de citotoxicidad de la lactato deshidrogenasa (LDH) arrojó resultados similares (Fig. 3T). Finalmente, utilizando matrices de tejidos de muestras de cáncer colorrectal, examinamos la correlación entre la expresión de B7H3 y la infiltración de células T CD8+. Los pacientes con alta expresión de B7H3 tenían una menor supervivencia general y significativamente menos células T CD8+ que los pacientes con baja expresión de B7H3 (Fig. S3P, Q). De manera consistente, el análisis de Kaplan-Meier Plotter confirmó además que la alta expresión de B7H3 se asocia con una peor supervivencia general (Fig. S3R), y el análisis de la base de datos TIMER mostró que la alta expresión de B7H3 (CD276) se correlaciona con una menor infiltración de células T CD8+ (Fig. S3S). Además, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) basado en datos de secuenciación de ARN de muestras de tumores de cáncer colorrectal (cohorte 4, Fig. 1C) reveló que el conjunto de genes de regulación negativa de la activación de las células T estaba significativamente enriquecido en los tumores MSS (Fig. S3T). Por el contrario, las vías relacionadas con la función de las células T, incluida la diferenciación de células T CD8+, alfa-beta y la vía de señalización del receptor de células T, se enriquecieron negativamente en los tumores MSS (Fig. S3U, V), lo que sugiere una funcionalidad alterada de las células T citotóxicas. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la palmitoilación de B7H3 mejora su función inmunosupresora al limitar la infiltración y la actividad de las células T CD8+, lo que contribuye a la evasión inmunitaria tumoral.

ZDHHC24 media la palmitoilación de B7H3 en C496 y se correlaciona con una mala supervivencia en pacientes con CRC

SPANISH TRANSLATION:

Para identificar qué ZDHHC(s) catalizan la palmitoilación de B7H3, coexpresamos cada una de las 23 enzimas ZDHHC marcadas con FLAG con HA-B7H3. ZDHHC24 aumentó significativamente el nivel de palmitoilación de B7H3, mientras que ZDHHC3, ZDHHC8 y ZDHHC13 solo aumentaron ligeramente el nivel de palmitoilación de B7H3 (Fig. S4A). La transfección posterior de células RKO con ZDHHC3, ZDHHC8, ZDHHC13 o ZDHHC24 indicó que solo ZDHHC24 aumentó sustancialmente la expresión de B7H3 (Fig. S4B–E). Estos hallazgos nos llevaron a hipotetizar que ZDHHC24 es la enzima principal responsable de la palmitoilación de B7H3. Para confirmar la interacción entre B7H3 y ZDHHC24, realizamos ensayos de co-inmunoprecipitación (co-IP), que revelaron una interacción física a nivel endógeno en las células RKO y SW480 (Fig. 4A). En consonancia con estos hallazgos, observamos la colocalización de B7H3 y ZDHHC24 mediante inmunofluorescencia (Fig. 4B). Para evaluar el papel funcional de ZDHHC24, utilizamos ARN de horquilla corta (shRNA) para silenciar de forma estable ZDHHC24 en las células humanas RKO y Zdhhc24 en las células murinas MC38 (Fig. S4F, G). Los ensayos ABE revelaron posteriormente una disminución significativa de los niveles de palmitoilación de B7H3 tras el silenciamiento de ZDHHC24 o Zdhhc24 (Figs. 4C y S4H). En línea con los resultados anteriores, el silenciamiento de ZDHHC24 o Zdhhc24 también provocó una reducción de la expresión de la proteína B7H3 endógena (Fig. 4D, E), un efecto que se validó aún más mediante microscopía confocal (Fig. 4F). Cabe destacar que los niveles de transcripción de B7H3 mostraron cambios mínimos tras el silenciamiento de ZDHHC24 (Fig. S4I). Para confirmar esto, realizamos un ensayo CHX y descubrimos que el silenciamiento de ZDHHC24 aceleró la degradación de la proteína B7H3 (Fig. 4G, H). Además, cuando se transfectó Flag-ZDHHC24 en las células RKOWT y RKOC496A, se observó un aumento de la expresión endógena de B7H3 exclusivamente en las células RKOWT, pero no en las células RKOC496A deficientes en palmitoilación (Fig. 4I). Además, evaluamos los niveles de palmitoilación de RKOWT y RKOC496A tras la transfección con ZDHHC24. Los resultados indicaron que ZDHHC24 aumentó la palmitoilación de RKOWT, pero no la de la variante RKOC496A deficiente en el sitio de palmitoilación (Fig. 4J). Curiosamente, los experimentos de co-IP también revelaron que, en el mutante deficiente en palmitoilación RKOC496A, B7H3 exhibió una interacción más fuerte con las proteínas SQSTM1/p62 en comparación con RKOWT, y que ZDHHC24 redujo esta interacción en las células RKOWT, pero no en las células RKOC496A (Fig. 4K). Además, el silenciamiento de ZDHHC24 promovió la acumulación punteada y la colocalización de B7H3 y p62, como se demostró mediante inmunofluorescencia (Fig. 4L). Esta interacción mejorada se confirmó aún más mediante el ensayo de ligación de proximidad (PLA) (Fig. 4M). Un análisis de la base de datos Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) reveló una sobreexpresión sustancial de ZDHHC24 en múltiples tipos de tumores, particularmente en el cáncer colorrectal (Fig. S4J). El análisis de microarreglos de tejidos de muestras de cáncer colorrectal reveló que los pacientes con alta expresión de ZDHHC24 tenían una menor supervivencia global (Fig. 4N), un hallazgo que contó con el apoyo adicional del análisis de la base de datos Kaplan–Meier Plotter, que vinculó la alta expresión de ZDHHC24 con una peor supervivencia libre de recurrencia en el cáncer de colon (Fig. S4K). Además, la expresión de ZDHHC24 fue notablemente mayor en los tejidos tumorales que en los tejidos normales adyacentes y se correlacionó positivamente con el estadio tumoral clínico (Fig. 4O, P). Cabe señalar que no se detectaron diferencias significativas en los niveles de proteína B7H3 o ZDHHC24 entre los subtipos MSS y MSI-H en las líneas celulares de cáncer colorrectal (Fig. S4L). Sin embargo, las muestras de tumores derivados de pacientes mostraron que la expresión de ZDHHC24 fue significativamente mayor en los tumores MSS que en los tumores MSI-H (Fig. S4M). Esto sugiere que el microambiente tumoral in vivo, que está ausente en los sistemas de cultivo celular estándar, puede modular la expresión de ZDHHC24. Es importante destacar que la expresión de ZDHHC24 se correlacionó positivamente con los niveles de B7H3 en las muestras de microarreglos de tejidos (Fig. 4Q). En conjunto, estos hallazgos resaltan el papel fundamental de la palmitoilación de B7H3 mediada por ZDHHC24 en el mantenimiento de la estabilidad de la proteína B7H3 y subrayan su asociación con malos resultados de supervivencia en pacientes con cáncer colorrectal.

ZDHHC24 promueve la inmunosupresión en el cáncer colorrectal

Para examinar la función biológica de ZDHHC24 in vivo, generamos ratones Zdhhc24 floxed (Zdhhc24fl/fl) (Fig. S5A) y los cruzamos con animales transgénicos Villin-Cre (Fig. S5B) para generar modelos Zdhhc24-deficientes específicos de las células epiteliales intestinales (Zdhhc24ΔIEC) (Fig. S5C). La eficacia de la recombinasa Cre se confirmó cruzando la línea Villin-Cre con ratones reporteros Rosa26-CAG-LSL-tdTomato (Fig. S5D). Como se esperaba, las células epiteliales intestinales presentaron una fluorescencia roja específica bajo el microscopio (Fig. S5E). Además, aislamos las células epiteliales intestinales para verificar la deleción específica de ZDHHC24 en los ratones Zdhhc24ΔIEC (Fig. S5F). Posteriormente, investigamos el papel de ZDHHC24 en la malignidad del CRC mediante el establecimiento de un modelo de carcinogénesis colorrectal asociada a colitis (CAC) (Fig. 5A). Durante la inducción de CAC, los ratones Zdhhc24ΔIEC presentaron una menor pérdida de peso que los ratones Zdhhc24fl/fl (Fig. 5B). Al final del período de observación, los ratones Zdhhc24fl/fl tenían colones ligeramente más cortos que sus hermanos Zdhhc24ΔIEC (Figs. 5C y S5G). Además, los ratones Zdhhc24ΔIEC desarrollaron menos tumores (Fig. 5D, E) y presentaron significativamente menos tumores grandes (> ~1 mm) (Fig. 5F, G). Recolectamos tejidos tumorales de Zdhhc24ΔIEC y Zdhhc24fl/fl y evaluamos la expresión de la proteína B7H3 y los niveles de palmitoilación. Tanto la expresión de la proteína B7H3 como la palmitoilación se redujeron en los ratones Zdhhc24ΔIEC (Fig. S5H, I). El examen histológico reveló que los ratones Zdhhc24ΔIEC presentaron una reducción del engrosamiento del colon, la inflamación, la hiperplasia y la lesión en las regiones afectadas (Fig. 5H). El análisis de inmunofluorescencia también reveló un aumento de la infiltración de células T CD8+ en los tumores de los ratones Zdhhc24ΔIEC (Fig. 5I). Estos hallazgos sugieren que ZDHHC24 modula la inmunidad antitumoral durante el desarrollo del tumor de colon. Para validar estos resultados, trasplantamos células de cáncer de colon de ratón con ZDHHC24 silenciado (MC38) por vía subcutánea en ratones C57BL/6J. El crecimiento tumoral se redujo notablemente en el grupo con ZDHHC24 silenciado en comparación con el grupo de control, como se muestra en las curvas de crecimiento tumoral y los pesos tumorales finales (Figs. 5J, K y S5J). La citometría de flujo de suspensiones de células únicas de estos tumores reveló un aumento sustancial de la infiltración de células T CD8+ en el grupo con ZDHHC24 silenciado (Figs. 5L y S5K), un efecto que se corroboró mediante el análisis de inmunofluorescencia (Fig. S5L, M). Además, los niveles de marcadores funcionales, incluidos GZMB e IFN-γ, fueron significativamente mayores en las células T CD8+ infiltrantes tumorales en el grupo con ZDHHC24 silenciado que en el grupo de control (Figs. 5M, N y S5N, O). Posteriormente, establecimos un ensayo de citotoxicidad de células T in vitro para la validación. En comparación con las células de control, las células con ZDHHC24 silenciado mediante shRNA mostraron una mayor susceptibilidad a la apoptosis cuando se expusieron a células T activadas derivadas de células mononucleares de sangre periférica humana (Fig. S5P, Q). Este hallazgo contó con el apoyo de niveles más altos de LDH en los sobrenadantes de cultivo de las poblaciones celulares respectivas (Fig. S5R). Además, el análisis de IHC de microarreglos de tejidos de CRC reveló que los pacientes con alta expresión de ZDHHC24 tenían menos recuentos de células T CD8+ en los tejidos tumorales (Fig. 5O). Un diagrama de dispersión tridimensional ilustró aún más la correlación entre ZDHHC24, B7H3 y las células T CD8+ (Fig. 5P). En conjunto, estos resultados sugieren que ZDHHC24 promueve la inmunosupresión en el cáncer colorrectal al inhibir las respuestas antitumorales mediadas por las células T CD8+.

La palmitoilación de B7H3 es necesaria para la supresión de la inmunidad tumoral mediada por ZDHHC24

Para investigar más a fondo la relación entre la palmitoilación de B7H3 y ZDHHC24 en la modulación del microambiente inmunitario tumoral, sobreexpresamos de forma estable Zdhhc24 en las células MC38WT y MC38C278A (Fig. S6A) y las implantamos por vía subcutánea en ratones C57BL/6J. ZDHHC24 promovió significativamente el crecimiento tumoral en el grupo MC38WT; sin embargo, este efecto fue casi inexistente en el grupo MC38C278A (Figs. 6A, B y S6B). Un análisis de la infiltración de células inmunitarias reveló una mayor proporción de células T CD8+ en los tumores MC38C278A, mientras que la sobreexpresión de ZDHHC24 redujo los niveles de células T CD8+ en los tumores MC38WT, pero no tuvo ningún efecto en los tumores MC38C278A (Figs. 6C y S6C). Estos resultados fueron consistentes con los hallazgos de inmunofluorescencia (Fig. 6D, E). Además, las células T CD8+ que expresaban GZMB e IFN-γ fueron más comunes en los tumores MC38C278A que en los tumores MC38WT (Fig. 6F, H). Si bien ZDHHC24 disminuyó los niveles de células T CD8+ que expresaban GZMB e IFN-γ en los tumores MC38WT, no tuvo ningún efecto en los tumores MC38C278A (Fig. 6F–I). In vitro, los ensayos de citotoxicidad de células T con células RKOWT y RKOC496A que sobreexpresaban ZDHHC24 (Fig. S6D) demostraron que ZDHHC24 no afectó la apoptosis en ausencia de células T (Figs. 6J y S6E). Sin embargo, en presencia de células T, ZDHHC24 redujo significativamente la apoptosis en las células RKOWT, pero no en las células RKOC496A (Figs. 6J, K y S6E). En conjunto, estos hallazgos confirman que la inmunosupresión tumoral mediada por ZDHHC24 depende de la palmitoilación de B7H3.

Inhibición de la palmitoilación de B7H3 con péptidos sintéticos

Dado el papel fundamental de la palmitoilación de B7H3 mediada por ZDHHC24 en el residuo C496, que promueve un microambiente inmunosupresor en el cáncer colorrectal, investigamos más a fondo el potencial terapéutico de dirigir la palmitoilación de B7H3. Para comprender mejor la interacción de unión entre ZDHHC24 y B7H3, analizamos los dominios estructurales de B7H3. Como proteína de punto de control inmunitario, el dominio Ig extracelular de B7H3 probablemente contribuye al reconocimiento de antígenos y a la inmunomodulación. Por lo tanto, hipotetizamos que los principales sitios de unión para ZDHHC24 se encuentran dentro de las regiones transmembrana e intracelular. Para probar esta hipótesis, generamos constructos de B7H3 con deleciones dirigidas en dominios estructurales específicos y realizamos inmunoprecipitación con ZDHHC24 (Fig. 7A). Nuestros resultados revelaron que los aminoácidos 488-497 en la secuencia de B7H3 son esenciales para su interacción con ZDHHC24 (Fig. 7B). Cabe destacar que esta región está altamente conservada en humanos y ratones y abarca el sitio de palmitoilación en B7H3, lo que subraya su relevancia funcional. Posteriormente, diseñamos un péptido (péptido E) correspondiente a la secuencia de aminoácidos 488-497 de B7H3 y un péptido de control (péptido C) en el que los mismos aminoácidos se reorganizaron aleatoriamente para alterar la estructura específica de la secuencia y abolir la posible unión, siguiendo una estrategia descrita previamente ^[54]. Ambos péptidos se fusionaron con una etiqueta activadora transcripcional N-terminal (TAT) para facilitar la captación celular (Fig. 7C). Evaluamos la citotoxicidad de los péptidos in vitro y determinamos que la citotoxicidad solo se observó a concentraciones superiores a 50 μM (Fig. S7A). Luego, unimos un motivo fluorescente al primer residuo de lisina tanto del péptido E como del péptido C (Fig. S7B) y confirmamos su entrada celular mediante microscopía de fluorescencia (Fig. S7C). Para evaluar la funcionalidad de los péptidos sintetizados, tratamos las células con el péptido E y el péptido C. En contraste con el péptido C, el péptido E inhibió significativamente la unión de ZDHHC24 a B7H3, lo que sugiere que el péptido E compite eficazmente con B7H3 por la unión a ZDHHC24 (Fig. 7D). En paralelo, empleamos el análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR) para confirmar la interacción directa entre el péptido E y ZDHHC24 (Fig. S7D, E). Evaluamos además los niveles de palmitoilación de B7H3 y encontramos una reducción significativa en la palmitoilación con el tratamiento con el péptido E, pero no con el tratamiento con el péptido C (Fig. 7E). Cabe destacar que la disminución de los niveles de proteína B7H3 fue dependiente de la dosis en las células RKOWT tratadas con el péptido E, mientras que ninguno de los péptidos afectó la expresión de B7H3 en las células RKOC496A (Fig. 7F). Además, el péptido E, pero no el péptido C, redujo notablemente la palmitoilación de B7H3 en las células RKO de control, con efectos limitados en las células con la expresión de ZDHHC24 reducida (Figs. 7G y S7F). De manera similar, el tratamiento con el péptido E también redujo los niveles de proteína B7H3 en las células RKO de control, pero la disminución no fue significativa en las células con la expresión de ZDHHC24 reducida (Fig. 7H, I). Además, el análisis de co-inmunoprecipitación mostró que el tratamiento con el péptido E mejoró la interacción entre B7H3 y p62 (Fig. 7J). Para determinar el impacto de los péptidos sintetizados en la función inmunitaria in vitro, las células RKO se trataron con el péptido E o el péptido C y, posteriormente, se incubaron con células T CD8+ humanas activadas. Tanto la citometría de flujo como los ensayos de toxicidad del lactato deshidrogenasa demostraron que el péptido E mejoró eficazmente la capacidad citotóxica de las células T CD8+ (Figs. 7K, L y S7G). En conclusión, estos datos sugieren que el péptido E inhibe la palmitoilación de B7H3 y promueve su degradación al interrumpir la interacción entre B7H3 y ZDHHC24, mejorando así eficazmente la citotoxicidad mediada por las células T CD8+ in vitro.

El péptido E mejora la inmunidad antitumoral in vivo

Para evaluar más a fondo la eficacia in vivo de los péptidos de moléculas pequeñas sintetizadas, realizamos una evaluación de toxicidad. Los ratones recibieron cinco concentraciones diferentes de péptidos mediante inyección intraperitoneal (Fig. S8A). Solo un ratón murió en cada una de las dosis de 25 y 50 mg/kg, mientras que todos los demás sobrevivieron durante el período de observación (Fig. S8B). Al final del experimento, se sacrificaron los ratones supervivientes y se recogieron sangre periférica y tejidos de órganos para su análisis. La tinción con hematoxilina-eosina (HE) reveló una esteatosis hepática leve a la dosis de 50 mg/kg, pero no se observaron alteraciones histológicas significativas en otros órganos (Fig. S8C). Además, no se observaron cambios notables en los niveles de creatinina (CRE), alanina aminotransferasa (ALT) o aspartato aminotransferasa (AST) en la sangre periférica (Fig. S8D-F), lo que indica una toxicidad sistémica mínima a concentraciones más bajas. Para evaluar la hemocompatibilidad, realizamos ensayos de hemólisis in vitro y medimos el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa). El péptido E no indujo hemólisis (Fig. S8G, H) ni prolongó el TP o el TTPa (Fig. S8I, J), lo que demuestra una buena compatibilidad sanguínea en las condiciones probadas. A continuación, trasplantamos células MC38 por vía subcutánea en ratones C57BL/6J y administramos los péptidos por vía intraperitoneal (10 mg/kg) después del trasplante, utilizando suero fisiológico como control (Fig. 8A). Para verificar la infiltración intratumoral de los péptidos, un grupo separado recibió péptidos conjugados con 5'-FITC mediante inyección intraperitoneal. La inmunofluorescencia de las secciones tumorales confirmó la infiltración eficaz de los péptidos en el tumor, estableciendo una base espacial para su actividad biológica (Fig. S8K). Luego, evaluamos el efecto del tratamiento con el péptido E sobre la expresión de B7H3 y su palmitoilación en los tejidos tumorales. La administración de péptido E redujo significativamente tanto la proteína B7H3 total como sus niveles de palmitoilación (Fig. S8L, M). Es importante destacar que, en comparación con el suero fisiológico y el péptido C, el péptido E ralentizó significativamente el crecimiento tumoral (Fig. 8B-D), y se observaron resultados similares en ratones BALB/c (Fig. 8E-G). El análisis de citometría de flujo de las células T CD8+ en ratones BALB/c reveló un aumento significativo de la infiltración de células T CD8+ dentro del microambiente tumoral después del tratamiento con el péptido E, mientras que no se observó tal aumento con el péptido C (Figs. 8H y S8N). Además, la proporción de células T CD8+ IFN-γ+ y células T CD8+ GZMB+, indicadores clave de la actividad antitumoral, aumentó significativamente después del tratamiento con el péptido E (Fig. 8I-L). Para evaluar más a fondo la eficacia terapéutica del péptido E en un contexto inmunitario humano, utilizamos ratones humanizados con sistema inmunitario reconstituido que presentaban tumores colorrectales humanos SW480 subcutáneos. Los ratones fueron tratados con el péptido C de control o el péptido E (Fig. 8M). El tratamiento con el péptido E suprimió significativamente el crecimiento tumoral (Fig. 8N-P), mejoró la infiltración de células T CD8+ (Fig. 8Q, R) y aumentó la expresión de moléculas efectoras citotóxicas GZMB e IFN-γ en el microambiente tumoral (Figs. 8S-V). En conjunto, estos resultados demuestran que el péptido E mejora eficazmente la inmunidad antitumoral mediada por las células T CD8+ in vivo.

La combinación de péptido E y terapia anti-PD-1 ejerce un efecto antitumoral significativo

Un único inhibidor del punto de control inmunitario puede ser insuficiente para abordar las complejidades del microambiente inmunitario tumoral. Cada vez hay más evidencia que sugiere que las terapias combinadas que involucran inhibidores del punto de control inmunitario producen mejores resultados clínicos que las monoterapia [55, 56]. Por lo tanto, hipotetizamos que el péptido E actúa de forma sinérgica con el bloqueo de PD-1, lo que conduce a una supresión tumoral más eficaz. Inicialmente, inyectamos por vía subcutánea células CT26 que expresan luciferasa en ratones BALB/c, seguido de la administración intraperitoneal de anti-PD-1, péptido E o una combinación de anti-PD-1 y péptido E, con el grupo IgG como control (Fig. S9A). Los resultados demostraron que las monoterapia con el péptido E o los anticuerpos anti-PD-1 tenían una actividad antitumoral moderada. Sin embargo, el tratamiento combinado mejoró significativamente la inhibición tumoral, reduciendo el tamaño del tumor a un nivel mínimo (Fig. 9A, B). Para validar estos hallazgos, ampliamos el tamaño de la muestra para cada grupo y realizamos una observación de 60 días. Los resultados confirmaron que, en comparación con el péptido E o la monoterapia con anti-PD-1, la terapia combinada inhibió significativamente el crecimiento tumoral e incluso condujo a una regresión tumoral completa en un ratón (Fig. 9C-G). Los datos de supervivencia (Fig. 9G) muestran una supervivencia media de 18,1 días en el control de IgG, frente a 24,4 días con anti-PD-1 (+34,8%) y 25,2 días con péptido E (+39,2%). La combinación de péptido E y anti-PD-1 extendió la supervivencia media a 40,5 días (~124% más que el IgG). Para evaluar la interacción bajo el supuesto de acción independiente, estimamos el efecto de combinación esperado de Bliss para el péptido E más anti-PD-1 a partir de sus efectos de agente único (definido como la mejora normalizada en la supervivencia media sobre el IgG). Esto produjo una mejora aditiva esperada del 60,4%, correspondiente a una supervivencia media prevista de 29,0 días. La supervivencia media observada (40,5 días) supera la expectativa de Bliss, lo que es consistente con una interacción sinérgica. Además, validamos los hallazgos en ratones C57BL/6J, lo que produjo resultados consistentes con los observados en el modelo BALB/c (Figs. 9H, I y S9B). Además, se realizó un análisis de citometría de flujo para evaluar el impacto de los diferentes tratamientos en las células T CD8+ infiltrantes tumorales. Los resultados demostraron que la combinación de péptido E y anticuerpos anti-PD-1 aumentó significativamente el número de células T CD8+ y mejoró su actividad funcional (Figs. 9J-L y S9C-E). En resumen, nuestros hallazgos enfatizan el papel fundamental de la palmitoilación de B7H3 mediada por ZDHHC24 en la promoción de la evasión inmunitaria en el cáncer colorrectal y demuestran que dirigir esta modificación podría mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales, lo que sugiere una estrategia prometedora para mejorar la eficacia de la inmunoterapia en pacientes con cáncer colorrectal.

La palmitoilación de B7H3 activada por PA mejora la estabilidad de la proteína B7H3

Para identificar los principales puntos de control inmunitario que regulan el microambiente tumoral en el cáncer colorrectal MSS, realizamos un análisis inmunohistoquímico de los miembros de la familia B7 utilizando muestras tumorales fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) de pacientes con cáncer colorrectal MSS y MSI-H (cohorte 1, Tabla S1). Los resultados indicaron que la proteína B7H3 estaba marcadamente sobreexpresada en los tumores MSS (Figs. 1A, B y S1A). Como molécula de punto de control inmunitario, B7H3 se expresa no solo en las células tumorales, sino también en varias poblaciones de células inmunitarias. La tinción por inmunofluorescencia mostró una fuerte colocalización de B7H3 con el marcador tumoral, la molécula de adhesión de células epiteliales (EPCAM), en los tejidos tumorales (Fig. S1B), lo que indica una expresión prominente en las células tumorales. La citometría de flujo confirmó además que más del 95% de las células tumorales son B7H3-positivas, en comparación con aproximadamente el 30% de las células inmunitarias (Fig. S1C, D) (cohorte 2, Tabla S2). Cuando se normalizó a 100.000 células totales, las células tumorales B7H3⁺ representaron aproximadamente 90.000 (Fig. S1E), lo que destaca que las células tumorales son la fuente predominante de B7H3 en los tumores MSS. Curiosamente, el análisis de qPCR posterior reveló que no había alteraciones significativas en los niveles de ARNm de B7H3 en las muestras MSS en comparación con las muestras MSI-H (Fig. S1F) (cohorte 3, Tabla S3), lo que sugiere que las modificaciones postraduccionales (PTM) probablemente desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión de B7H3 específicamente en los tumores MSS. Dado que se ha informado que la glicosilación de B7H3 catalizada por FUT8 puede estabilizar B7H3 y garantizar su expresión estable en la membrana plasmática^[25], a continuación, evaluamos la expresión de FUT8 en las muestras tumorales colorrectales MSS y MSI-H mediante inmunohistoquímica. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa en la expresión de FUT8 entre estos grupos (Fig. S1G, H). Para comprender mejor los mecanismos subyacentes, realizamos una secuenciación de ARN utilizando muestras frescas de tumores de colon (cohorte 4, Tabla S4). El análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) reveló que varios genes que regulan los metabolitos, como los ácidos carboxílicos, los ácidos grasos y las vitaminas, se expresaban de manera aberrante en los tumores MSS (Fig. 1C y Datos suplementarios 1). Por lo tanto, especulamos que existían alteraciones metabólicas subyacentes en estos dos tipos de tumores. Luego, recolectamos muestras frescas de CRC para un análisis de metabolitos no dirigido (Figs. 1D y S1I) (cohorte 5, Tabla S5 y Datos suplementarios 2) y realizamos un análisis de enriquecimiento de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) de los datos metabolómicos (Fig. 1E). Para los metabolitos aumentados en el CRC MSS, observamos el enriquecimiento de las vías relacionadas con la degradación de ácidos grasos (Fig. 1F). En particular, las vías asociadas con el metabolismo de los ácidos grasos también se enriquecieron en los resultados de GSEA de los datos de secuenciación de ARN (Fig. S1J-L). Los hallazgos sugieren que las anomalías en el metabolismo de los ácidos grasos pueden ser características de los tumores MSS. Sobre la base de estos hallazgos, tratamos las células RKO con cinco metabolitos asociados con la degradación de ácidos grasos: ácido glutarico, palmitoil carnitina, hexadecanal, ácido palmítico (PA) y coenzima A, identificados en nuestro análisis metabolómico. Entre estos, solo el PA aumentó significativamente la expresión de B7H3 (Fig. 1G, H). Para confirmar aún más esta observación, realizamos experimentos de dependencia de la dosis en las células RKO y descubrimos que el aumento de las concentraciones de PA condujo a un aumento de la concentración en los niveles de proteína B7H3 (Fig. S1M). Dado que se ha informado ampliamente que el PA desencadena la palmitoilación, empleamos un ensayo de intercambio de acilo-biotina (ABE)^[46] para determinar si B7H3 sufre palmitoilación (Fig. S1N). Nuestros resultados demostraron que los niveles de palmitoilación de B7H3 aumentaron en respuesta a concentraciones más altas de PA (Fig. 1I). Además, el tratamiento con 2-bromopalmitato (2-BP), un inhibidor de la palmitoilación, redujo significativamente la palmitoilación de B7H3 (Figs. 1J y S1O). Al igual que otro miembro de la familia B7, B7H1 (PD-L1)^[38], el nivel de proteína de B7H3 estaba estrechamente relacionado con su estado de palmitoilación (Fig. S1P). En particular, los resultados de qPCR indicaron que ni el 2-BP ni la palmostatina B (un inhibidor de la despalmitoilación) afectaron los niveles de transcripción de B7H3 (Fig. S1Q). Cuando se aplicó 2-BP para inhibir la palmitoilación, observamos una disminución dependiente de la dosis y del tiempo en la expresión de B7H3, mientras que el tratamiento con palmostatina B condujo al efecto opuesto (Figs. 1K y S1R). Dado que la palmitoilación también puede afectar la asociación de la proteína con la membrana, realizamos ensayos de fraccionamiento citoplásmico y de membrana, que revelaron una reducción en la expresión de B7H3 dentro de las fracciones citoplásmica y de membrana después del tratamiento con 2-BP (Fig. S1S). El análisis de inmunofluorescencia confirmó esta disminución en la expresión de B7H3 (Fig. S1T). Además, utilizando un ensayo de persecución con cicloheximida (CHX), evaluamos el impacto de la palmitoilación de B7H3 en la estabilidad de la proteína. El tratamiento con 2-BP aceleró notablemente la degradación de B7H3 (Fig. 1L, M), mientras que la inhibición de la despalmitoilación con palmostatina B ralentizó la degradación de B7H3 (Fig. S1U, V). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la palmitoilación desencadenada por PA contribuye a la estabilidad de B7H3.

La palmitoilación de B7H3 C496 inhibe la degradación autofágica mediada por SQSTM1

B7H3, como proteína de membrana, en principio puede ser degradada a través del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), la vía autofagia-lisosoma o la endocitosis a los lisosomas^[47],^[48]. Hipotetizamos que la palmitoilación modula principalmente una de estas vías para estabilizar B7H3. Por lo tanto, aplicamos moduladores específicos de la vía junto con 2-BP. Los agentes farmacológicos que interrumpen las distintas etapas de la vía autofagia-lisosoma, 3-MA (que inhibe la clase III PI3K y bloquea la iniciación de la autofagia), bafilomicina A1 (Baf A1) y cloroquina (ambos bloquean la degradación lisosomal), bloquearon eficazmente la degradación de B7H3 inducida por 2-BP, mientras que el inhibidor del proteasoma MG132 no tuvo tal efecto (Fig. 2A, B). Además, la inducción de la autofagia mediante EBSS aceleró significativamente la degradación de B7H3, lo que se mejoró aún más con 2-BP (Fig. S2A, B). En conjunto, estas observaciones indican que la degradación de B7H3 en este sistema está mediada predominantemente por la vía autofagia-lisosoma. Las proteínas esenciales de la autofagia ATG5 y BECN1 son necesarias para la formación de autofagosomas, y la degradación de B7H3 se redujo notablemente en las células ATG5 o BECN1 deficientes (Figs. 2C, D y S2C, D). La autofagia alterada también contrarrestó la reducción de la expresión de B7H3 inducida por 2-BP (Fig. S2E, F). La autofagia selectiva se basa en los receptores de carga que transportan sustratos específicos a los autofagosomas para su degradación^[49],^[50]. Entre los varios receptores de carga probados (SQSTM1, OPTN, NDP52, NBR1, TOLLIP y NIX), B7H3 exhibió una fuerte afinidad por SQSTM1, como lo demostraron los ensayos de inmunoprecipitación (Fig. 2E). Además, los ensayos de persecución con cicloheximida (CHX) revelaron que la degradación de B7H3 se detuvo casi por completo en las células RKO deficientes en SQSTM1 (Fig. 2F, G) y que la deficiencia de SQSTM1 previno la degradación de B7H3 inducida por 2-BP (Fig. 2H). Estos hallazgos demuestran colectivamente que la degradación de B7H3 se produce principalmente a través de la autofagia selectiva mediada por SQSTM1 en los modelos celulares examinados. Para identificar el sitio de palmitoilación específico en la proteína B7H3, examinamos los 13 residuos de cisteína, cinco de los cuales se predijo que serían palmitoilados utilizando GPS-palm^[51] y GPS-lipid^[52] (Fig. 2I). El análisis con la base de datos Swiss-Palm, basada en proteomas de palmitoilación conocidos, también reveló un sitio de palmitoilación (Fig. 2I). Para validar estas predicciones experimentalmente, generamos mutantes de cisteína a alanina específicos del sitio y evaluamos sus niveles de palmitoilación utilizando ensayos ABE. Entre los mutantes, la palmitoilación de C496A fue casi indetectable en comparación con la de B7H3 de tipo salvaje (Fig. 2J), lo que destaca el papel esencial de C496. C496 se encuentra en el dominio intracelular de B7H3 (Fig. S2G) y está altamente conservado entre las especies según el análisis de alineamiento de secuencias múltiples realizado en Jalview^[53] (Fig. 2K). De manera consistente, la mutación C496A en el sitio de palmitoilación de B7H3 también mostró una mayor afinidad por el receptor de carga SQSTM1/p62 que B7H3 de tipo salvaje (Fig. 2L). Para explorar el papel funcional de la palmitoilación de C496, utilizamos CRISPR/Cas9 para generar células RKO deficientes en B7H3 (RKOKO) (Fig. S2H) y luego establecimos líneas celulares estables que expresan el mutante C496A (RKOC496A) (Fig. S2I). Los ensayos ABE confirmaron que la palmitoilación de B7H3 era apenas detectable en las células RKOC496A en comparación con las células de tipo salvaje (RKOWT) (Fig. 2M). Un ensayo de cicloheximida reveló que la degradación de la proteína B7H3 se aceleró en las células RKOC496A (Fig. 2N, O), similar a los efectos de la inhibición de la palmitoilación por 2-BP. La tinción por inmunofluorescencia demostró además una disminución marcada en la intensidad de la fluorescencia en las células RKOC496A (Fig. S2J). Además, encontramos que el tratamiento con rapamicina, que inhibe la actividad de mTORC1 y, por lo tanto, induce la autofagia, condujo a una degradación acelerada de la proteína B7H3 en las células RKOWT (Fig. S2K). Por el contrario, el tratamiento con 3-MA, bafilomicina A1 o cloroquina previno eficazmente la degradación de B7H3 en las células RKOC496A (Fig. S2L). Además, la microscopía confocal reveló que las células RKOC496A mostraron una mayor colocalización de B7H3 con LC3 y formaron agregados B7H3-SQSTM1/p62 más distintos en comparación con las células RKOWT (Figs. 2P y S2M), lo que indica que la palmitoilación de C496 restringe la degradación autofágica de B7H3. En conclusión, estos hallazgos demuestran que la palmitoilación de B7H3 en la cisteína 496 reduce su interacción con el receptor de carga SQSTM1/p62, inhibiendo así su degradación autofágica selectiva.

La palmitoilación de B7H3 inhibe la actividad antitumoral de las células CD8+ T

SPANISH TRANSLATION:

Para investigar la función de la palmitoilación de B7H3 in vivo, generamos líneas celulares CT26 (CT26KO) y MC38 (MC38KO) con deleción de B7h3 de cáncer colorrectal murino (Fig. S3A). Dado que la B7H3 murina comprende solo un par de dominios tipo IgC y tipo IgV ^[24], diseñamos mutantes C278A (CT26C278A y MC38C278A) que expresan de forma estable B7H3 deficiente en palmitoilación, correspondiente al sitio de modificación humano (Fig. S3B). La palmitoilación en estos mutantes era apenas detectable, como se confirmó mediante ensayos ABE (Fig. S3C). Luego, trasplantamos estas células modificadas de cáncer colorrectal murino por vía subcutánea en ratones. En ratones BALB/c inmunocompetentes, la progresión tumoral se inhibió significativamente en el grupo con B7H3 deficiente en palmitoilación (CT26C278A) en comparación con el grupo CT26WT (Fig. 3A, B y S3D). Sin embargo, en ratones NCG (NOD ShiLtJ Gpt Prkdcem26Cd52 Il2rgem26Cd22/Gpt) altamente inmunodeficientes, no se observaron diferencias significativas en el crecimiento tumoral entre CT26WT y CT26C278A, como lo evidencian pesos y volúmenes tumorales comparables (Fig. 3C, D y S3E). Se obtuvieron resultados similares con el modelo MC38, donde no hubo diferencias significativas entre MC38WT y MC38C278A en ratones NCG (Fig. S3F-H). Estos hallazgos sugieren que la palmitoilación de B7H3 no afecta directamente la proliferación de las células tumorales; más bien, los efectos antitumorales de la deficiencia de palmitoilación de B7H3 dependen del sistema inmunitario del huésped. Para investigar el impacto de la palmitoilación de B7H3 en el microambiente tumoral (MET), realizamos un análisis exhaustivo de las células inmunitarias CD45+ que infiltran dos tipos de tumores CT26 en ratones BALB/c utilizando citometría de flujo espectral. En resumen, identificamos 14 subpoblaciones celulares únicas (Fig. 3E, F). Los resultados revelaron que algunas células inmunosupresoras, incluidas las células supresoras derivadas de la médula ósea monocíticas (M-MDSC) y las células supresoras derivadas de la médula ósea polimorfonucleares (PMN-MDSC), se redujeron en los tumores deficientes en palmitoilación (C278A) (Fig. 3G y S3I). En contraste, algunas poblaciones celulares con efectos antitumorales, incluidas las células T CD8+, las células T CD4+ y las células asesinas naturales (NK), aumentaron en los tumores C278A (Fig. 3G y S3I). Estos resultados indican que la mutación de la palmitoilación de B7H3 altera sustancialmente el panorama inmunitario dentro del MET, particularmente al promover la infiltración de células T CD8+ (Fig. 3G, H y S3I). Para probar si las células T CD8+ son mediadores esenciales de los efectos antitumorales causados por la deficiencia de palmitoilación de B7H3, agotamos las células T CD8+ in vivo utilizando un anticuerpo anti-CD8α (Fig. 3I). Sorprendentemente, el agotamiento de las células T CD8+ abolió por completo la diferencia en el crecimiento tumoral entre la B7H3 de tipo salvaje y el mutante C278A deficiente en palmitoilación (Fig. 3J, K y S3J), lo que indica que el efecto antitumoral asociado con la pérdida de la palmitoilación de B7H3 depende principalmente de las células T CD8+. Para validar estos hallazgos, trasplantamos por vía subcutánea la línea celular con deleción de B7h3 MC38 (MC38KO) y las líneas celulares MC38WT y MC38C278A estables en ratones C57BL/6J. Los resultados revelaron que la mutación del sitio de palmitoilación suprimió significativamente el crecimiento tumoral, un efecto que fue aún más pronunciado en el grupo con deleción de B7h3 (MC38KO) (Fig. 3L, M y S3K). Un análisis de la infiltración de células T CD8+ reveló que el grupo MC38C278A presentaba una proporción significativamente mayor de células T CD8+ que el grupo MC38WT, una tendencia que se amplificó aún más en los tumores MC38KO (Fig. 3N y S3L). La tinción de inmunofluorescencia de los tejidos tumorales corroboró estos hallazgos (Fig. 3O, P). Además, la expresión de las moléculas efectoras de las células T CD8+, como la granzima B (GZMB) y el interferón gamma (IFN-γ), fue mayor en los tumores MC38C278A en comparación con los tumores MC38WT (Fig. 3Q, R y S3M, N). Para confirmar estas observaciones, realizamos un ensayo de muerte celular tumoral mediada por células T al cocultivar células T primarias humanas activadas con las líneas celulares RKOKO, RKOWT y RKOC496A. La mutación RKOC496A mejoró notablemente la citotoxicidad de las células T hacia las células tumorales (Fig. 3S y S3O). Coherente con los hallazgos de citometría de flujo, el ensayo de citotoxicidad de la lactato deshidrogenasa (LDH) arrojó resultados similares (Fig. 3T). Finalmente, utilizando microarreglos de tejidos de muestras de cáncer colorrectal, examinamos la correlación entre la expresión de B7H3 y la infiltración de células T CD8+. Los pacientes con alta expresión de B7H3 tenían una menor supervivencia general y significativamente menos células T CD8+ que aquellos con baja expresión de B7H3 (Fig. S3P, Q). De manera consistente, el análisis de Kaplan-Meier Plotter confirmó además que la alta expresión de B7H3 se asocia con una peor supervivencia general (Fig. S3R), y el análisis de la base de datos TIMER mostró que la alta expresión de B7H3 (CD276) se correlaciona con una menor infiltración de células T CD8+ (Fig. S3S). Además, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) basado en datos de secuenciación de ARN de muestras de tumores colorrectales (cohorte 4, Fig. 1C) reveló que el conjunto de genes de regulación negativa de la activación de las células T se enriqueció significativamente en los tumores MSS (Fig. S3T). En contraste, las vías relacionadas con la función de las células T, incluidas la diferenciación de células T alfa-beta CD8+ y la vía de señalización del receptor de células T, se enriquecieron negativamente en los tumores MSS (Fig. S3U, V), lo que sugiere una funcionalidad reducida de las células T citotóxicas. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la palmitoilación de B7H3 mejora su función inmunosupresora al limitar la infiltración y la actividad de las células T CD8+, contribuyendo así a la evasión inmune tumoral.

ZDHHC24 media la palmitoilación de B7H3 en C496 y se correlaciona con una peor supervivencia en pacientes con CRC

Para identificar qué ZDHHC(s) catalizan la palmitoilación de B7H3, coexpresamos cada una de las 23 enzimas ZDHHC marcadas con FLAG con HA-B7H3. ZDHHC24 aumentó significativamente el nivel de palmitoilación de B7H3, mientras que ZDHHC3, ZDHHC8 y ZDHHC13 solo aumentaron ligeramente el nivel de palmitoilación de B7H3 (Fig. S4A). La transfección posterior de células RKO con ZDHHC3, ZDHHC8, ZDHHC13 o ZDHHC24 indicó que solo ZDHHC24 aumentó sustancialmente la expresión de B7H3 (Fig. S4B-E). Estos hallazgos nos llevaron a hipotetizar que ZDHHC24 es la enzima principal responsable de la palmitoilación de B7H3. Para confirmar la interacción entre B7H3 y ZDHHC24, realizamos ensayos de co-inmunoprecipitación (co-IP), que revelaron una interacción física a nivel endógeno en las células RKO y SW480 (Fig. 4A). Coherente con estos hallazgos, observamos la colocalización de B7H3 y ZDHHC24 mediante inmunofluorescencia (Fig. 4B). Para evaluar el papel funcional de ZDHHC24, utilizamos ARN de horquilla corta (shRNA) para eliminar de forma estable ZDHHC24 en las células humanas RKO y Zdhhc24 en las células murinas MC38 (Fig. S4F, G). Los ensayos ABE revelaron posteriormente una disminución significativa de los niveles de palmitoilación de B7H3 después de la eliminación de ZDHHC24 o Zdhhc24 (Fig. 4C y S4H). En línea con los resultados anteriores, la eliminación de ZDHHC24 o Zdhhc24 también condujo a una reducción de la expresión de la proteína B7H3 endógena (Fig. 4D, E), un efecto que se validó aún más mediante microscopía confocal (Fig. 4F). Cabe destacar que los niveles de transcripción de B7H3 mostraron cambios mínimos después de la eliminación de ZDHHC24 (Fig. S4I). Para confirmar esto, realizamos un ensayo CHX y descubrimos que la eliminación de ZDHHC24 aceleró la degradación de la proteína B7H3 (Fig. 4G, H). Además, cuando se transfectó Flag-ZDHHC24 en las células RKOWT y RKOC496A, se observó un aumento de la expresión endógena de B7H3 exclusivamente en las células RKOWT, pero no en las células RKOC496A deficientes en palmitoilación (Fig. 4I). Además, evaluamos los niveles de palmitoilación de RKOWT y RKOC496A después de la transfección con ZDHHC24. Los resultados indicaron que ZDHHC24 aumentó la palmitoilación de RKOWT, pero no de la variante RKOC496A deficiente en el sitio de palmitoilación (Fig. 4J). Interesantemente, los experimentos de co-IP también revelaron que en el mutante deficiente en palmitoilación RKOC496A, B7H3 exhibió una interacción más fuerte con las proteínas SQSTM1/p62 en comparación con RKOWT, y que ZDHHC24 redujo esta interacción en las células RKOWT, pero no en las células RKOC496A (Fig. 4K). Además, la eliminación de ZDHHC24 promovió la acumulación punteada y la colocalización de B7H3 y p62, como se demostró mediante inmunofluorescencia (Fig. 4L). Esta interacción mejorada se confirmó aún más mediante el ensayo de ligación de proximidad (PLA) (Fig. 4M). Un análisis de la base de datos de análisis interactivo de perfiles de expresión génica (GEPIA) reveló una sobreexpresión sustancial de ZDHHC24 en múltiples tipos de tumores, particularmente en el cáncer colorrectal (Fig. S4J). El análisis de microarreglos de tejidos de muestras de cáncer colorrectal reveló que los pacientes con alta expresión de ZDHHC24 tenían una menor supervivencia general (Fig. 4N), un hallazgo que también respaldó el análisis de la base de datos de Kaplan-Meier Plotter, que vinculó la alta expresión de ZDHHC24 con una peor supervivencia libre de recurrencia en el cáncer de colon (Fig. S4K). Además, la expresión de ZDHHC24 fue significativamente mayor en los tejidos tumorales que en los tejidos normales adyacentes y se correlacionó positivamente con la etapa clínica del tumor (Fig. 4O, P). Cabe destacar que no se detectaron diferencias significativas en los niveles de proteína B7H3 o ZDHHC24 entre los subtipos MSS y MSI-H en las líneas celulares de cáncer colorrectal (Fig. S4L). Sin embargo, las muestras de tumores derivadas de pacientes mostraron que la expresión de ZDHHC24 fue significativamente mayor en los tumores MSS que en los tumores MSI-H (Fig. S4M). Esto sugiere que el microambiente tumoral in vivo, que está ausente en los sistemas de cultivo celular estándar, puede modular la expresión de ZDHHC24. En resumen, estos hallazgos resaltan el papel crítico de la palmitoilación de B7H3 mediada por ZDHHC24 en C496 para mantener la estabilidad de la proteína B7H3 y subrayan su asociación con malos resultados de supervivencia en pacientes con cáncer colorrectal.

ZDHHC24 promueve la inmunosupresión en el cáncer colorrectal

Para examinar la función biológica de ZDHHC24 in vivo, generamos ratones Zdhhc24 con alelos "floxed" (Zdhhc24fl/fl) (Fig. S5A) y los cruzamos con animales transgénicos Villin-Cre (Fig. S5B) para generar modelos Zdhhc24-deficient (Zdhhc24ΔIEC) específicos para las células epiteliales intestinales (CEI) (Fig. S5C). La eficacia de la recombinasa Cre se confirmó cruzando la línea Villin-Cre con ratones reporter Rosa26-CAG-LSL-tdTomato (Fig. S5D). Como se esperaba, las células epiteliales intestinales presentaron fluorescencia roja específica bajo el microscopio (Fig. S5E). A continuación, aislamos las CEI para verificar la deleción específica de Zdhhc24 en los ratones Zdhhc24ΔIEC (Fig. S5F). Posteriormente, investigamos el papel de ZDHHC24 en la malignidad del CRC mediante el establecimiento de un modelo de ratón de carcinogénesis asociada a colitis (CAC) (Fig. 5A). Durante la inducción de CAC, los ratones Zdhhc24ΔIEC presentaron una menor pérdida de peso que los ratones Zdhhc24fl/fl (Fig. 5B). Al final del período de observación, los ratones Zdhhc24fl/fl tenían colones ligeramente más cortos que sus hermanos de camada Zdhhc24ΔIEC (Figs. 5C y S5G). Además, los ratones Zdhhc24ΔIEC desarrollaron menos tumores (Figs. 5D y E) y presentaron significativamente menos tumores grandes (> ~1 mm) (Figs. 5F y G). Recolectamos tejido tumoral de Zdhhc24ΔIEC y Zdhhc24fl/fl y evaluamos la expresión y los niveles de palmitoilación de la proteína B7H3. Tanto la expresión de la proteína B7H3 como la palmitoilación se redujeron en los ratones Zdhhc24ΔIEC (Figs. S5H e I). El examen histológico reveló que los ratones Zdhhc24ΔIEC presentaban un engrosamiento, inflamación, hiperplasia y lesión reducidos en el colon en las regiones afectadas (Fig. 5H). El análisis de inmunofluorescencia también reveló un aumento de la infiltración de células T CD8+ en los tumores de los ratones Zdhhc24ΔIEC (Fig. 5I). Estos hallazgos sugieren que ZDHHC24 modula la inmunidad antitumoral durante el desarrollo del tumor de colon. Para validar estos resultados, trasplantamos células de cáncer de colon de ratón con ZDHHC24 "knockdown" (MC38) por vía subcutánea en ratones C57BL/6J. El crecimiento tumoral se redujo notablemente en el grupo con ZDHHC24 "knockdown" en comparación con el grupo de control, como se muestra en las curvas de crecimiento tumoral y los pesos tumorales finales (Figs. 5J, K y S5J). La citometría de flujo de suspensiones de células individuales de estos tumores reveló un aumento sustancial de la infiltración de células T CD8+ en el grupo con ZDHHC24 "knockdown" (Figs. 5L y S5K), un efecto que fue corroborado por el análisis de inmunofluorescencia (Fig. S5L, M). Además, los niveles de marcadores funcionales, incluidos GZMB e IFN-γ, fueron significativamente mayores en las células T CD8+ infiltrantes tumorales en el grupo con ZDHHC24 "knockdown" que en el grupo de control (Figs. 5M, N y S5N, O). Posteriormente, establecimos un ensayo de citotoxicidad de células T in vitro para la validación. En comparación con las células de control, las células con ZDHHC24 "knockdown" mediado por shRNA mostraron una mayor susceptibilidad a la apoptosis cuando se expusieron a células T activadas derivadas de células mononucleares de sangre periférica humana (Fig. S5P, Q). Este hallazgo fue respaldado por niveles más altos de LDH en los sobrenadantes de la cultura de las poblaciones celulares respectivas (Fig. S5R). Además, el análisis de inmunohistoquímica de microarreglos de tejido de CRC reveló que los pacientes con alta expresión de ZDHHC24 tenían menos recuentos de células T CD8+ en los tejidos tumorales (Fig. 5O). Un diagrama de dispersión tridimensional ilustró aún más la correlación entre ZDHHC24, B7H3 y células T CD8+ (Fig. 5P). En conjunto, estos resultados sugieren que ZDHHC24 promueve la inmunosupresión en el cáncer colorrectal al inhibir las respuestas antitumorales mediadas por las células T CD8+.

La palmitoilación de B7H3 es necesaria para la supresión de la inmunidad tumoral mediada por ZDHHC24

Para investigar más a fondo la relación entre la palmitoilación de B7H3 y ZDHHC24 en la modulación del microambiente inmunitario tumoral, sobreexpresamos establemente Zdhhc24 en las células MC38WT y MC38C278A (Fig. S6A) y las implantamos por vía subcutánea en ratones C57BL/6J. ZDHHC24 promovió significativamente el crecimiento tumoral en el grupo MC38WT; sin embargo, este efecto fue casi ausente en el grupo MC38C278A (Figs. 6A, B y S6B). Un análisis de la infiltración de células inmunitarias reveló una mayor proporción de células T CD8+ en los tumores MC38C278A, mientras que la sobreexpresión de ZDHHC24 redujo los niveles de células T CD8+ en los tumores MC38WT, pero no tuvo efecto en los tumores MC38C278A (Figs. 6C y S6C). Estos resultados fueron consistentes con los hallazgos de inmunofluorescencia (Fig. 6D, E). Además, las células T CD8+ que expresaban GZMB e IFN-γ fueron más comunes en los tumores MC38C278A que en los tumores MC38WT (Fig. 6F, H). Si bien ZDHHC24 disminuyó los niveles de células T CD8+ que expresaban GZMB e IFN-γ en los tumores MC38WT, no tuvo efecto en los tumores MC38C278A (Fig. 6F–I). In vitro, los ensayos de células T citotóxicas con células RKOWT y RKOC496A que sobreexpresaban ZDHHC24 (Fig. S6D) demostraron que ZDHHC24 no afectó la apoptosis en ausencia de células T (Figs. 6J y S6E). Sin embargo, en presencia de células T, ZDHHC24 redujo significativamente la apoptosis en las células RKOWT, pero no en las células RKOC496A (Figs. 6J, K y S6E). En conjunto, estos hallazgos confirman que la supresión de la inmunidad tumoral mediada por ZDHHC24 depende de la palmitoilación de B7H3.

Inhibición de la palmitoilación de B7H3 con péptidos sintéticos

Dado el papel fundamental de la palmitoilación de B7H3 mediada por ZDHHC24 en C496 para promover un microambiente inmunosupresor en el cáncer colorrectal, investigamos más a fondo el potencial terapéutico de dirigir la palmitoilación de B7H3. Para comprender mejor la interacción de unión entre ZDHHC24 y B7H3, analizamos los dominios estructurales de B7H3. Como proteína de punto de control inmunitario, el dominio Ig extracelular de B7H3 probablemente contribuye al reconocimiento de antígenos y a la inmunomodulación. Por lo tanto, hipotetizamos que los sitios de unión primarios para ZDHHC24 se encuentran dentro de las regiones transmembrana e intracelular. Para probar esta hipótesis, generamos constructos de B7H3 con deleciones dirigidas en dominios estructurales específicos y realizamos inmunoprecipitación con ZDHHC24 (Fig. 7A). Nuestros resultados revelaron que los aminoácidos 488-497 en la secuencia de B7H3 son esenciales para su interacción con ZDHHC24 (Fig. 7B). En particular, esta región está altamente conservada en humanos y ratones y abarca el sitio de palmitoilación en B7H3, lo que subraya su relevancia funcional. Posteriormente, diseñamos un péptido (péptido E) correspondiente a la secuencia de aminoácidos 488-497 de B7H3 y un péptido de control (péptido C) en el que los mismos aminoácidos se barajaron aleatoriamente para interrumpir la estructura específica de la secuencia y abolir la posible unión, siguiendo una estrategia descrita previamente ^[54]. Ambos péptidos se fusionaron con una etiqueta activadora transcripcional (TAT) en el extremo N para facilitar la captación celular (Fig. 7C). Evaluamos la citotoxicidad de los péptidos in vitro y determinamos que la citotoxicidad solo se observó a concentraciones superiores a 50 μM (Fig. S7A). Luego, unimos un motivo fluorescente al primer lisina de ambos, el péptido E y el péptido C (Fig. S7B) y confirmamos su entrada celular mediante microscopía de fluorescencia (Fig. S7C). Para evaluar la funcionalidad de los péptidos sintetizados, tratamos las células con el péptido E y el péptido C. En contraste con el péptido C, el péptido E inhibió significativamente la unión de ZDHHC24 a B7H3, lo que sugiere que el péptido E compite eficazmente con B7H3 por la unión a ZDHHC24 (Fig. 7D). En paralelo, empleamos el análisis de resonancia plasmónica de superficie (SPR) para confirmar la interacción directa entre el péptido E y ZDHHC24 (Fig. S7D, E). Además, evaluamos los niveles de palmitoilación de B7H3 y encontramos una reducción significativa en la palmitoilación con el tratamiento con el péptido E, pero no con el tratamiento con el péptido C (Fig. 7E). En particular, la disminución de los niveles de proteína B7H3 fue dependiente de la dosis en las células RKOWT tratadas con el péptido E, mientras que ninguno de los péptidos afectó la expresión de B7H3 en las células RKOC496A (Fig. 7F). Además, el tratamiento con el péptido E, pero no con el péptido C, redujo notablemente la palmitoilación de B7H3 en las células RKO de control, con efectos limitados en las células con ZDHHC24 "knockdown" (Figs. 7G y S7F). De manera similar, el tratamiento con el péptido E también redujo los niveles de proteína B7H3 en las células RKO de control, pero la disminución no fue significativa en las células con ZDHHC24 "knockdown" (Figs. 7H, I). Además, el análisis de co-inmunoprecipitación mostró que el tratamiento con el péptido E mejoró la interacción entre B7H3 y p62 (Fig. 7J). Para determinar el impacto de los péptidos sintetizados en la función inmunitaria in vitro, las células RKO se trataron con el péptido E o el péptido C y luego se incubaron con células T humanas CD8+ activadas. Tanto la citometría de flujo como los ensayos de toxicidad de lactato deshidrogenasa demostraron que el péptido E mejoró eficazmente la citotoxicidad de las células T CD8+ (Figs. 7K, L y S7G). En conclusión, estos datos sugieren que el péptido E inhibe la palmitoilación de B7H3 y promueve su degradación al interrumpir la interacción entre B7H3 y ZDHHC24, mejorando así eficazmente la citotoxicidad mediada por las células T CD8+ in vitro.

El péptido E mejora la inmunidad antitumoral in vivo

Para evaluar más a fondo la eficacia in vivo de los péptidos de molécula pequeña sintetizados, realizamos una evaluación de toxicidad. Los ratones recibieron cinco concentraciones diferentes de péptidos mediante inyección intraperitoneal (Fig. S8A). Solo murió un ratón en cada una de las dosis de 25 y 50 mg/kg, mientras que todos los demás sobrevivieron durante todo el período de observación (Fig. S8B). Al final del experimento, se sacrificaron los ratones supervivientes y se recogieron sangre periférica y tejidos de órganos para su análisis. La tinción con hematoxilina-eosina (HE) reveló una leve esteatosis hepática en la dosis de 50 mg/kg, pero no se observaron alteraciones histológicas significativas en otros órganos (Fig. S8C). Además, no se observaron cambios notables en los niveles de creatinina (CRE), alanina aminotransferasa (ALT) o aspartato aminotransferasa (AST) en la sangre periférica (Fig. S8D-F), lo que indica una toxicidad sistémica mínima a concentraciones más bajas. Para evaluar la hemocompatibilidad, realizamos ensayos de hemólisis in vitro y medimos el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). El péptido E no indujo hemólisis (Fig. S8G, H) ni prolongó el TP o el APTT (Fig. S8I, J), lo que demuestra una buena compatibilidad sanguínea en las condiciones probadas. A continuación, trasplantamos células MC38 por vía subcutánea en ratones C57BL/6J y administramos los péptidos por vía intraperitoneal (10 mg/kg) después del trasplante, utilizando solución salina normal como control (Fig. 8A). Para verificar la infiltración intratumoral de los péptidos, un grupo aparte recibió péptidos conjugados con 5'-FITC mediante inyección intraperitoneal. La inmunofluorescencia de las secciones tumorales confirmó una infiltración eficaz de los péptidos en el tumor, estableciendo una base espacial para su actividad biológica (Fig. S8K). A continuación, evaluamos el efecto del tratamiento con el péptido E sobre la expresión de B7H3 y su palmitoilación en los tejidos tumorales. La administración del péptido E redujo significativamente tanto la proteína B7H3 total como sus niveles de palmitoilación (Fig. S8L, M). Es importante destacar que, en comparación con la solución salina normal (NS) y el péptido C, el péptido E ralentizó significativamente el crecimiento tumoral (Fig. 8B-D), y se observaron resultados similares en ratones BALB/c (Fig. 8E-G). El análisis de citometría de flujo de las células T CD8+ en ratones BALB/c reveló un aumento significativo de la infiltración de células T CD8+ dentro del microambiente tumoral tras el tratamiento con el péptido E, mientras que no se observó tal aumento con el péptido C (Fig. 8H y S8N). Además, la proporción de células T CD8+ IFN-γ+ y células T CD8+ GZMB+ (indicadores clave de la actividad antitumoral) aumentó significativamente después del tratamiento con el péptido E (Fig. 8I-L). Para evaluar más a fondo la eficacia terapéutica del péptido E en un contexto inmunitario humano, utilizamos ratones humanizados con sistema inmunitario reconstituido que presentaban tumores de carcinoma colorrectal humano SW480 subcutáneos. Los ratones fueron tratados con el péptido C de control o el péptido E (Fig. 8M). El tratamiento con el péptido E suprimió significativamente el crecimiento tumoral (Fig. 8N-P), mejoró la infiltración de células T CD8+ (Fig. 8Q, R) y aumentó la expresión de las moléculas efectoras citotóxicas GZMB e IFN-γ en el microambiente tumoral (Fig. 8S-V). En conjunto, estos resultados demuestran que el péptido E mejora eficazmente la inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+ in vivo.

La combinación de péptido E y terapia anti-PD-1 ejerce un efecto antitumoral significativo

Un único inhibidor del punto de control inmunitario puede ser insuficiente para abordar las complejidades del microambiente inmunitario tumoral. Cada vez hay más evidencia que sugiere que las terapias combinadas que involucran inhibidores del punto de control inmunitario producen mejores resultados clínicos que las monoterapias [55, 56]. Por lo tanto, hipotetizamos que el péptido E actúa de forma sinérgica con el bloqueo de PD-1, lo que conduce a una supresión tumoral más eficaz. Inicialmente, inyectamos células CT26 que expresan luciferasa por vía subcutánea en ratones BALB/c, seguido de la administración intraperitoneal de anti-PD-1, péptido E o una combinación de anti-PD-1 y péptido E, con el grupo IgG como control (Fig. S9A). Los resultados demostraron que las monoterapias con péptido E o anticuerpos anti-PD-1 tenían una actividad antitumoral moderada. Sin embargo, el tratamiento combinado mejoró significativamente la inhibición tumoral, reduciendo el tamaño del tumor a un nivel mínimo (Fig. 9A, B). Para validar estos hallazgos, ampliamos el tamaño de la muestra para cada grupo y realizamos una observación de 60 días. Los resultados confirmaron que, en comparación con el péptido E o la monoterapia con anti-PD-1, la terapia combinada inhibió significativamente el crecimiento tumoral e incluso condujo a una regresión tumoral completa en un ratón (Fig. 9C-G). Los datos de supervivencia (Fig. 9G) muestran una supervivencia media de 18,1 días en el control de IgG, frente a 24,4 días con anti-PD-1 (+34,8%) y 25,2 días con péptido E (+39,2%). La combinación de péptido E y anti-PD-1 extendió la supervivencia media a 40,5 días (~124% más que el IgG). Para evaluar la interacción bajo el supuesto de acción independiente, estimamos el efecto de combinación esperado de Bliss para el péptido E más anti-PD-1 a partir de sus efectos de agente único (definido como la mejora normalizada en la supervivencia media sobre el IgG). Esto produjo una mejora aditiva esperada del 60,4%, correspondiente a una supervivencia media prevista de 29,0 días. La supervivencia media observada (40,5 días) supera la expectativa de Bliss, lo que es consistente con una interacción sinérgica. Además, validamos los hallazgos en ratones C57BL/6J, lo que produjo resultados consistentes con los observados en el modelo BALB/c (Fig. 9H, I y S9B). Además, se realizó un análisis de citometría de flujo para evaluar el impacto de los diferentes tratamientos en las células T CD8+ infiltrantes del tumor. Los resultados demostraron que la combinación de péptido E y anticuerpos anti-PD-1 aumentó significativamente el número de células T CD8+ y mejoró su actividad funcional (Fig. 9J-L y S9C-E). En resumen, nuestros hallazgos enfatizan el papel fundamental de la palmitoilación de B7H3 mediada por ZDHHC24 en la promoción de la evasión inmunitaria en el cáncer colorrectal y demuestran que la focalización de esta modificación podría mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales, lo que sugiere una estrategia prometedora para mejorar la eficacia de la inmunoterapia en pacientes con cáncer colorrectal.

Discusión

Se considera que varios mecanismos de inmunosupresión y evasión de las células tumorales malignas son características distintivas de la malignidad ^[57]. Los inhibidores del punto de control inmunitario, incluidos los anticuerpos anti-PD-1, anti-PD-L1 y anti-CTLA-4, han demostrado una eficacia duradera en el tratamiento y la posible curación de muchos tipos de tumores, lo que marca el comienzo de una nueva era en el tratamiento del cáncer ^[58]. Sin embargo, la aprobación actual de los inhibidores del punto de control inmunitario para el tratamiento del cáncer colorrectal se limita a un subconjunto de tumores MSI-H, lo que sugiere la posible participación de otros puntos de control inmunitarios en la regulación de la evasión inmunitaria en el cáncer colorrectal MSS ^[7]. B7H3, un punto de control inmunitario emergente, se expresa en gran medida en varios tumores humanos, pero se expresa en bajos niveles en los tejidos normales, lo que lo convierte en un objetivo prometedor para el desarrollo de futuros inhibidores del punto de control inmunitario [24, 59]. En particular, a pesar de la baja expresión de proteínas en los tejidos normales, el ARNm de B7H3 es detectable en una amplia gama de tejidos y órganos normales, lo que sugiere la presencia de una regulación postranscripcional significativa ^[23].

Los metabolitos no solo proporcionan energía para las actividades vitales, sino que también regulan la PTM de las proteínas a través de la derivación en productos metabólicamente activos ^[60-62]. El PA, un ácido graso saturado de cadena larga, se ha informado ampliamente como un metabolito que facilita la interacción entre los procesos metabólicos y las modificaciones postraduccionales de las proteínas [41, 42, 63, 64]. Coherente con los resultados de la inmunohistoquímica de la familia B7, demostramos que el PA desencadenó la palmitoilación de B7H3, lo que desempeñó un papel crucial en la formación de un microambiente inmunosupresor en el cáncer colorrectal MSS. Aunque nuestro perfilado metabolómico no dirigido reveló niveles elevados de PA en los tumores MSS en comparación con los tumores MSI-H, los mecanismos precisos que subyacen a esta diferencia siguen sin estar claros. Sin embargo, varias explicaciones plausibles pueden explicar esta observación. En primer lugar, la proteína de unión a ácidos grasos (FABP1), un transportador clave de ácidos grasos de cadena larga, se pierde preferentemente en los tumores MSI-H debido a la señalización inmunitaria impulsada por el IFN-γ, pero se conserva en los tumores MSS, lo que podría facilitar la acumulación de lípidos ^[65]. Además, en comparación con los tumores MSS, los tumores MSI-H están enriquecidos con células inmunitarias metabólicamente activas, que pueden consumir ácidos grasos para apoyar sus funciones efectoras ^[66]. Además, la β-oxidación de ácidos grasos se suprime en los tumores MSS, lo que conduce a una reducción de la degradación de lípidos y a una posible acumulación intracelular de ácidos grasos saturados ^[67]. En particular, los análisis de los conjuntos de datos TCGA y GEO también revelaron que las vías metabólicas relacionadas con los ácidos grasos (incluidos los ácidos grasos, la localización de los lípidos y el transporte de lípidos) se reducen significativamente en los cánceres colorrectales MSI-H, lo que es consistente con nuestros hallazgos ^[66]. En nuestro estudio, encontramos que el PA estaba elevado en los tumores MSS y promovía la palmitoilación de B7H3 en el residuo C496. Esta modificación impidió la unión de B7H3 al receptor de autofagia SQSTM1/p62, lo que redujo su degradación autofágica y mejoró la estabilidad de la proteína B7H3. Además, empleamos un enfoque de cribado exhaustivo para identificar ZDHHC24, un miembro de la familia DHHC con un dominio Cys DHHC conservado ^[32], como la enzima que cataliza la palmitoilación de B7H3. Anteriormente, se ha demostrado que ZDHHC24 palmitoila AKT, lo que permite el anclaje de membrana independiente de PIP3 ^[41], y que palmitoila MAVS, lo que promueve su agregación y localización mitocondrial ^[42]. En nuestro estudio, encontramos que ZDHHC24 catalizó la palmitoilación de la proteína B7H3 y que su nivel de expresión estaba correlacionado positivamente con el de B7H3. Además, el nivel de expresión de ZDHHC24 está asociado positivamente con el grado avanzado de cáncer y sirve como biomarcador pronóstico de malos resultados clínicos en pacientes con cáncer colorrectal.

Múltiples tipos de cáncer se clasifican como tumores “fríos”, caracterizados por una baja carga mutacional tumoral, una infiltración mínima de células inmunitarias y una expresión limitada de PD-L1^[11],^[68], lo que se correlaciona con una respuesta deficiente a la monoterapia con PD-1/PD-L1^[69]. Además, los mecanismos compensatorios entre los puntos de control inmunitario también pueden limitar la eficacia de la monoterapia. En muchos tumores, la inhibición de una vía conduce a la regulación al alza de otra. Por ejemplo, Shi et al. encontraron que la inhibición de B7H3 conduce a una regulación al alza compensatoria de PD-L1 en las células mieloides y aumenta la infiltración de células Treg en los tumores^[70]. De manera similar, Altan et al. encontraron que el cáncer de mama PD-L1 negativo puede evadir la vigilancia inmune mediante la regulación al alza de B7H4, y el nivel de expresión de B7H4 a menudo se correlaciona negativamente con los niveles de PD-L1^[71]. Esta retroalimentación enfatiza que el bloqueo con un solo agente puede verse afectado por vías supresoras alternativas. En consecuencia, se han explorado inmunoterapias combinadas que se dirigen a múltiples vías inhibitorias. De hecho, el bloqueo combinado de puntos de control ya ha demostrado ser eficaz: el anticuerpo anti-LAG-3 Relatlimab más Nivolumab (anti-PD-1) fue aprobado por la FDA para el melanoma avanzado^[72]. Además, en pacientes con cáncer colorrectal, la adición de un inhibidor de CTLA-4 al bloqueo de PD-1 ayuda a mejorar la eficacia a largo plazo^[8]. En nuestro estudio, encontramos que la palmitoilación de B7H3 inhibió la actividad antitumoral de las células T CD8⁺. Sintetizamos un péptido E para bloquear la palmitoilación de B7H3 C496, lo que aumentó la infiltración intratumoral de células T CD8⁺ y mejoró su expresión de moléculas efectoras como GZMB e IFN-γ, ejerciendo así notables efectos antitumorales. La terapia anti-PD-1 funciona de manera similar en la fase efectora de la respuesta de las células T al bloquear el eje PD-1/PD-L1 y revitalizar las células T agotadas. Por lo tanto, es razonable desde el punto de vista mecanístico hipotetizar que la focalización dual de la palmitoilación de B7H3 y PD-1 podría resultar en una mejora aditiva, o potencialmente sinérgica, de la función de las células T CD8⁺. Nuestros datos experimentales respaldan esta idea, ya que observamos una eficacia antitumoral significativamente mejorada con la combinación de péptido E y anti-PD-1 en comparación con cualquiera de las dos terapias por separado. Más allá de PD-1, otros receptores inhibitorios, como CTLA-4, LAG-3, TIM-3 y TIGIT, también desempeñan funciones críticas en la modulación de las respuestas de las células T. Estudios previos han demostrado que la combinación de anti-B7H3 con anti-CTLA-4, que reduce principalmente la supresión mediada por Treg, puede ser más eficaz que las combinaciones que involucran el bloqueo de PD-1 en ciertos contextos tumorales^[70]. Mecanísticamente, esto puede explicarse por los distintos papeles reguladores inmunitarios de CTLA-4 y PD-1: si bien el anti-PD-1 alivia la inhibición de las células T efectoras ya activadas, el bloqueo de CTLA-4 reduce preferentemente la actividad supresora de las células Treg, que expresan constitutivamente altos niveles de CTLA-4 y desempeñan un papel central en el mantenimiento de un microambiente tumoral inmunosupresor. Además, los factores derivados del tumor, como el VEGF, pueden regular al alza múltiples moléculas de puntos de control inmunitario (incluidos PD-L1, CTLA-4, TIM-3 y LAG-3), lo que sugiere que los mecanismos compensatorios entre estas vías pueden limitar la eficacia de las monoterapias^[73],^[74]. Por lo tanto, combinar la inhibición de la palmitoilación de B7H3 con agentes que se dirijan a puntos de control adicionales, como LAG-3, TIM-3 o TIGIT, puede mejorar aún más la inmunidad antitumoral. Aunque aún no hemos probado directamente las combinaciones de péptido E con inhibidores de CTLA-4 u otros puntos de control, nuestros hallazgos sientan una base mecanística para tales exploraciones futuras. Los estudios actuales y futuros se centrarán en evaluar estas estrategias de múltiples puntos de control en modelos preclínicos para identificar combinaciones sinérgicas capaces de superar la resistencia inmunitaria.

En conclusión, nuestros hallazgos sugieren que la palmitoilación de B7H3 desencadenada por PA puede ser un contribuyente clave al microambiente inmunosupresor en el CRC MSS. Específicamente, la palmitoilación de B7H3 inducida por ZDHHC24 facilita la capacidad de las células malignas para evadir el ataque de las células T CD8⁺. También demostramos que la inhibición farmacológica de la palmitoilación de B7H3 mediante un péptido que atraviesa la membrana mejora eficazmente los efectos antitumorales de las células T CD8⁺ tanto in vitro como in vivo (Fig. 9M). Creemos que este estudio proporciona información valiosa sobre los mecanismos de escape inmunitario en el cáncer colorrectal. En conjunto, la palmitoilación de B7H3 representa un proceso regulador crítico que mejora su efecto inmunosupresor, y la focalización de esta modificación puede ofrecer una prometedora estrategia terapéutica para superar la resistencia inmunitaria en los cánceres.

Métodos

Líneas celulares y cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer de colon humano RKO y SW480, la línea celular de riñón embrionario humano HEK293T y las líneas celulares de cáncer de colon murino MC38 y CT26 se compraron en el American Type Culture Collection (ATCC). Las células RKO y HEK293T se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco, EE. UU.), mientras que las células SW480 se cultivaron en medio L-15 de Leibovitz (Gibco, EE. UU.). Las células MC38 y CT26 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco, EE. UU.). Todos los medios de cultivo se complementaron con un 10% de suero bovino fetal (Thermo Fisher, EE. UU.). Las células RKO, HEK293T, MC38 y CT26 se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2, mientras que las células SW480 se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera libre de CO2. Todas las líneas celulares se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma utilizando un kit de detección de PCR de micoplasma (BMC1040, Abbkine).

Anticuerpos y productos químicos

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios disponibles comercialmente: anti-B7H3 (ab134161, abcam, [WB: 1:200]; ab227679, abcam [IF: 1:100]; 66481-1-Ig, proteintech, [WB: 1:1000; IHC: 1:2500]); anti-ZDHHC24 (ARP55989_P050, aviva systems biology, [WB: 1:1000]; HPA016619, Atlas antibodies, [IHC: 1:50]; y ABIN6743942, antibodies online, [WB: 1:1000]); anti-Flag tag (14793S, cell signaling technology, [WB: 1:1000]); anti-HA tag (3724T, cell signaling technology, [WB: 1:1000]); anti-GAPDH (sc-47724, santa cruz biotechnology, [WB: 1:200] y A19056, ABclonal, [WB: 1:5000]); caveolina-1 (A19006; ABclonal, [WB: 1:5000]); anti-PD-L1 (29122, cell signaling technology, [WB: 1:1000]); estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (A21000, abbkine, [WB: 1:10000]); anti-SQSTM1/p62 (HA721171, HUABIO, [WB: 1:5000; IHC: 1:1000]); anti-CD326/EpCAM (A25344, ABclonal, [IF: 1:200]); anti-ATG5 (ET1611-38, HUABIO, [WB: 1:5000]); anti-Beclin 1 (R381896, zen-bioscience, [WB: 1:1000]). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios en los ensayos de Western blot: anticuerpo secundario anti-IgG de conejo (HRP) (SSA004; Sino Biological Inc), anticuerpo secundario anti-IgG de ratón (HRP) (SSA007; Sino Biological Inc), HRP-conjugado anti-IgG ligero de ratón (AS0-62; ABclonal) y HRP-conjugado anti-IgG ligero de ratón (AS061; ABclonal). Todos los anticuerpos secundarios de Western blot se utilizaron a una dilución de 1:5000. Los anticuerpos secundarios utilizados para los ensayos de inmunofluorescencia (IF) fueron los siguientes: Cy3, anti-IgG de conejo (A22220, Abbkine); Cy3, anti-IgG de ratón (A22210, Abbkine); D-light 488, anti-IgG de conejo (A23220, Abbkine) y DyLight 488, anti-IgG de ratón (A23210, Abbkine); anti-IgG humana H&L (FITC) (HY-P83649, MCE); anti-IgG humana H&L (AF594) (HY-P83648, MCE). Todos los anticuerpos secundarios de IF se utilizaron a una dilución de 1:200. Los anticuerpos para citometría de flujo se enumeran a continuación: Zombie NIR Fixable Viability Kit (423106, BioLegend), BD Pharmingen™ FITC mouse anti-human CD45 (560976, BD), BD OptiBuild™ BV421 mouse anti-human NCAM-1 (CD56) (744217, BD), BD OptiBuild™ BV510 mouse anti-human CD11b (742638, BD), BD OptiBuild™ BV650 mouse anti-human CD14 (740633, BD), PE anti-human CD68 antibody (333808, BioLegend), BD pharmingen™ PerCP-Cy™5.5 mouse anti-human CD3 (552852, BD), BD OptiBuild™ RB780 mouse anti-human CD276 (B7-H3) (755486, BD), BD OptiBuild™ R718 mouse anti-human HLA-DR (752501, BD), BD horizon™ BV605 mouse anti-human CD19 (569363, BD), BD OptiBuild™ BV786 mouse anti-human CD16 (741042, BD), BD pharmingen™ APC mouse anti-human CD326 (EpCAM) (566842, BD), BD OptiBuild™ BV650 Mouse Anti-Human CD8 (743067, BD), APC anti-human/mouse Granzyme B (372204, BioLegend), BD pharmingen™ PE mouse anti-human IFN-γ (554552, BD), brilliant violet (BV)785-conjugated anti-mouse CD45 antibody (103149, BioLegend), BV510-conjugated anti-mouse CD3 antibody (100234, BioLegend), BV785-conjugated anti-mouse CD3 antibody (100232, BioLegend), BV650-conjugated anti-mouse CD8 antibody (100742, BioLegend), PE/cyanine7-conjugated anti-human/mouse Granzyme B recombinant antibody (372214, BioLegend), PerCP/Cyanine5.5-conjugated anti-mouse IFN-γ antibody (505822, BioLegend), FITC-conjugated anti-active Caspase-3(559341, BD), PE hamster anti-mouse γδ T-cell receptor (553178, BD), Alexa Fluor™ 647 rat anti-mouse CD206 (568808, BD), PE-CF594 rat anti-mouse CD49b (562453, BD), BUV661 rat anti-mouse CD93 (741574, BD), BUV737 rat anti-CD11b (612800, BD), BV510 rat anti-mouse F4/80 (743280, BD), PE-Cy7 rat anti-mouse Ly-6G (560601, BD), R718 rat anti-mouse Ly-6C (566987, BD), BUV496 rat anti-mouse CD4 (741050, BD), BUV563 hamster anti-mouse CD3e (741235, BD), BUV805 rat anti-mouse CD45 (748370, BD), BV421 rat anti-mouse Foxp3 (562996, BD), V450 rat anti-mouse CD45R (560472, BD), BV711 rat anti-mouse CD86 (740688, BD), BV650 hamster anti-mouse CD11c (564079, BD), Zombie Yellow™ fixable viability kit (423104, BioLegend), FITC anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody (108406, BioLegend), PE/Fire™ 640 anti-mouse I-A/I-E antibody (107664, BioLegend), PE/cyanine7 anti-mouse CD8a antibody (100722, BioLegend). Para la tinción por citometría de flujo, los colorantes de viabilidad se utilizaron a 1:500 (por 2 × 106 células en 100 μL), y todos los demás anticuerpos conjugados con fluorocromo se utilizaron a 2,5 μL por 1 × 106 células en 100 μL. Los reactivos utilizados son los siguientes: fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (HY-B0496; MCE), cóctel de inhibidores de fosfatasas I (HY-K0021; MCE), cóctel de inhibidores de fosfatasas II (HY-K0022; MCE), cloroquina (HY-17589A; MCE), ácido 2-bromohexadecanoico (HY-111770; MCE), palmostatina B (HY-120911; MCE), N-etilmaleimida (04260; Millipore Sigma), solución de hidroxilamina (467804; Millipore Sigma), 3-MA (HY-19312; MCE), MG-132 (HY-13259; MCE), cicloheximida (HY-12320; MCE), EZ-Link TM BMCC-biotina (21900; Thermo Fisher Scientific), NH4Cl (HY-Y1269; MCE), reactivo anti-desvanecimiento (con DAPI) (HY-K1048; MCE), PMA (HY-18739; MCE), ionomicina (HY-13434A; MCE), monensina (HY-N0150; MCE), brefeldina A (HY-16592; MCE).

Plásmidos

Se obtuvieron 23 plásmidos codificantes de proteínas de la familia ZDHHC marcadas con Flag (n = 23) de MiaoLingBio, China (números de catálogo: P44768, P44768, P44770, P41465, P43454, P44771, P43506, P43467, P44775, P44767, P44779, P44777, P44768, P41465, P43454, P44771, P43506, P43467, P44775, P44767, P44779, P44777, P44768, P41465, P43454, P44771, P43506, P43467, P44775, P44767, P44779, P44777). Los plásmidos indicados y los reactivos de transfección (HighGene plus, RM09014P, abclonal) se mezclaron bien y se dejaron reposar durante 20 minutos antes de transferirse uniformemente al plato de cultivo. Después de 8 horas, se reemplazó el medio completo que contenía suero y se esperó durante 48 horas.

Secuenciación de ARN

Se aisló ARN total utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, CA, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Se evaluó la pureza y concentración del ARN mediante un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EE. UU.), mientras que la integridad del ARN se confirmó utilizando un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Para el secuenciamiento del transcriptoma, se prepararon las librerías utilizando el kit VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit según las indicaciones del fabricante. El secuenciamiento se realizó en una plataforma Illumina Novaseq 6000, generando lecturas de 150 pb de doble extremo. Las lecturas iniciales en formato FASTQ se sometieron a un filtrado de calidad con fast para obtener lecturas limpias. Las lecturas limpias se alinearon al genoma de referencia utilizando HISAT2, y los niveles de expresión génica se cuantificaron en fragmentos por kilobase millón (FPKM), obteniendo los recuentos de lecturas génicas mediante HTSeq-count. Se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando DESeq2, identificando genes diferencialmente expresados (DEG) con un umbral de p < 0,05 y un cambio de expresión ≥ 2; se excluyeron los genes con una abundancia < 10. Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional de los DEG utilizando una prueba hipergeométrica para identificar términos de la Ontología Génica (GO) significativamente enriquecidos.

Análisis metabolómico no dirigido

Se realizó un análisis metabolómico no dirigido basado en LC-MS en 18 muestras de tumores de colon (MSS, n = 8; MSI-H, n = 10), cada una representando un replicado biológico independiente. Además, se prepararon muestras de control de calidad (QC) combinando alícuotas iguales de todos los extractos y se inyectaron a intervalos regulares para controlar la estabilidad del instrumento mediante el análisis de componentes principales (PCA). Todas las muestras de tumores utilizadas para el análisis metabolómico no dirigido se recolectaron en condiciones estrictamente estandarizadas para garantizar la consistencia experimental. Los tejidos se extirparon rápidamente, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a –80 °C hasta el análisis. Para minimizar la variabilidad relacionada con los lotes, todas las muestras se procesaron simultáneamente y se analizaron en una sola corrida de LC-MS/MS. Se pesaron 30 mg de muestra en un tubo EP de 1,5 ml, seguido de la adición de dos pequeñas cuentas de acero y 400 μL de metanol-agua (4:1, v/v) que contenía un estándar interno (4 μg/mL). La muestra se preenfrió a –40 °C durante 2 minutos y luego se homogeneizó a 60 Hz durante 2 minutos. Después de la homogeneización, la muestra se sometió a una extracción ultrasónica en un baño de hielo-agua durante 10 minutos y luego se dejó reposar a –40 °C durante 2 horas. La mezcla se centrifugó durante 20 minutos a 15.000 × g y 4 °C. Posteriormente, se extrajeron 150 μL del sobrenadante con una jeringa y se transfirió a un vial de inyección de LC. El análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) se realizó utilizando un cromatógrafo líquido de ultra alto rendimiento (UHPLC) Waters ACQUITY UPLC I-Class plus/espectrómetro de masas de alta resolución en tándem (HRMS) Thermo QE HF en OE Biotech, Inc., Shanghái, China. El sistema estaba equipado con una fuente de ionización por electrospray (ESI) calentada (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para analizar los perfiles metabólicos tanto en los modos ESI positivo como negativo. Se utilizó una columna ACQUITY UPLC HSS T3 (1,8 μm, 2,1 × 100 mm) para ambos modos de ionización; la temperatura de la columna se mantuvo a 45 °C y la velocidad de flujo fue de 0,35 ml/min. Se realizó una elución en gradiente con el disolvente A (agua con 0,1% de ácido fórmico, v/v) y el disolvente B (acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico, v/v) utilizando el siguiente programa: 0-2 min, 95% A/5% B; 2-4 min, lineal a 70% A/30% B; 4-8 min, lineal a 50% A/50% B; 8-10 min, lineal a 20% A/80% B; 10-14 min, 0% A/100% B; 14-15 min, 0% A/100% B; 15,1-16 min, reequilibrio a 95% A/5% B. Las muestras se mantuvieron a 10 °C durante el análisis, con un volumen de inyección de 4 μL. La detección se realizó en un rango de masas de 70-1050 m/z, utilizando una resolución de escaneo primario de 60.000 y una resolución de escaneo secundario de 15.000. Se aplicaron energías de colisión de 10, 20 y 40 eV. Las condiciones de funcionamiento del espectrómetro de masas fueron las siguientes: voltaje de pulverización de 3800 V (modo positivo) y 3200 V (modo negativo); caudal de gas de envoltura de 35 unidades; caudal de gas auxiliar de 8 unidades; temperatura del capilar de 320 °C; temperatura del calentador de gas auxiliar de 350 °C; y nivel de RF de la lente S de 50. El preprocesamiento de los datos se realizó utilizando Progenesis QI v3.0 (Nonlinear Dynamics, Newcastle, Reino Unido) para la corrección de la línea de base, la identificación de picos, la integración, la alineación del tiempo de retención y la normalización de la intensidad entre las muestras. Tras la imputación de valores faltantes y el filtrado, los datos se normalizaron aún más mediante una transformación logarítmica para aproximar una distribución gaussiana y reducir la heterocedasticidad, lo que garantiza su idoneidad para el análisis estadístico posterior. La identificación de los compuestos se basó en las relaciones masa-carga (m/z) precisas, los fragmentos secundarios y las distribuciones isotópicas, utilizando bases de datos como la Base de datos del metaboloma humano (HMDB), Lipidmaps (V2.3), Metlin y bases de datos construidas internamente. Los picos con más del 50% de valores faltantes (intensidad iónica = 0) se excluyeron, y los valores cero se reemplazaron por la mitad del valor mínimo. Los datos de los modos de iones positivos y negativos se fusionaron en una única matriz de datos para un análisis posterior. Los metabolitos diferenciales entre los grupos MSS y MSI-H se seleccionaron utilizando la prueba t de Student con P < 0,05 y un cambio de expresión (FC) ≥ 1,2 o ≤ 1/1,2.

Construcción de líneas celulares estables

Los plásmidos lentivirales pLVX-ZDHHC24 o pLVX-Zdhhc24 se construyeron clonando los genes ZDHHC24 o Zdhhc24 en el vector pLVX. Utilizamos los sistemas de empaquetamiento de tres plásmidos pLVX, pMD2.G y psPAX2 para generar los virus altamente expresados. El ARN de cadena corta (shRNA) dirigido a los genes humanos ZDHHC24 o murinos Zdhhc24 se expresó en el vector pLKO.1 para obtener clones de silenciamiento (KD). Los sistemas de empaquetamiento triple pLKO.1-shRNAs, pMD2.G y psPAX2 se utilizaron para construir los virus de expresión de silenciamiento. Las secuencias se enumeran en la Tabla S7 (Información complementaria). De manera similar, los tres se mezclaron en 500 μL de medio libre de suero y 40 μl de Lipofectamina 2000 en una relación de masa de 2:1:2. La mezcla de plásmidos se transfectó luego en células HEK293T. El sobrenadante viral recolectado se filtró a través de un filtro de polietetersulfona PES esterilizado (SFPES025022SI, membrane solutions LLC) y se utilizó para infectar las células indicadas. Se estabilizaron las líneas celulares mediante el cribado con 1 μg/ml de puromicina durante 48 h o 0,8 mg/mL de G418 durante 20 días. El sistema CRISPR/Cas9 se utilizó para generar las células KO de B7H3, SQSTM1, ATG5 y BECN1. Los ARN guía únicos se diseñaron a partir de un sitio web público, CHOPCHOP, y luego se clonaron en el plásmido PX459 (62988, Addgene) o el plásmido PX462 (62987, Addgene). Las secuencias de sgRNA se enumeran en la Tabla S7 (Información complementaria).

Aislamiento de proteínas de la membrana celular y del citoplasma

La separación de proteínas citosólicas y citoplasmáticas de las células indicadas se realizó utilizando el kit de extracción de proteínas de membrana y citoplasma ExKine™ (KTP3005; Abbkine).

Ensayo de kit de recuento de células-8

Para evaluar la citotoxicidad de los péptidos in vitro, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (100 μL de medio completo) y se dejaron adherir durante la noche. Luego, las células se trataron con péptido E o péptido C en las concentraciones indicadas (2,5, 5, 10, 25, 50, 100 y 200 μM) durante 24 h. Posteriormente, se añadió 10 μL del reactivo del kit de recuento de células-8 (C6005, new cell and molecular biotech) a cada pocillo y se incubó a 37 °C durante 1-4 h, protegido de la luz. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Los pocillos que contenían medio más reactivo sin células sirvieron como blancos, y la viabilidad celular se normalizó al control tratado con vehículo (establecido en 100%).

Bioquímica del suero de ratón

Se recolectó sangre periférica de ratones y se dejó coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos. El suero se separó por centrifugación a 4 °C a 3000 × g durante 10 minutos y se analizó inmediatamente o se almacenó a –80 °C hasta su uso. La creatinina sérica (CRE) se midió utilizando el kit de ensayo de contenido de creatinina (CRE) (AKNM008M, Beijing Boxbio Science and Technology Co., Ltd). El lector de microplacas se precalentó durante ≥ 30 minutos y se ajustó a 546 nm. Las reacciones se llevaron a cabo a 37 °C según el protocolo del fabricante, se registró la absorbancia y se calculó la concentración de CRE en relación con el estándar/blanco del kit utilizando la fórmula proporcionada. Las actividades de la alanina aminotransferasa (ALT/GPT) y la aspartato aminotransferasa (AST/GOT) séricas se determinaron utilizando el kit de ensayo de actividad de GPT (AKAM006M, Beijing Boxbio Science and Technology Co., Ltd) y el kit de ensayo de actividad de GOT (AKAM019M, Beijing Boxbio Science and Technology Co., Ltd), respectivamente. El instrumento se precalentó durante ≥ 30 minutos y se ajustó a 505 nm. Se incluyó un control coincidente y una curva estándar según las instrucciones. Después de la incubación y el desarrollo del color a 37 °C, se midió la absorbancia y se calcularon e informaron las actividades enzimáticas como U/L según la fórmula proporcionada en el kit.

Inmunoprecipitación

Se seleccionaron diferentes cuentas magnéticas (HAK21042, HAK21011, HUABIO) según las necesidades experimentales. Si las cuentas magnéticas (HY-K0202, MCE) no tenían un anticuerpo acoplado, era necesario mezclar las cuentas con el anticuerpo primario correspondiente durante media hora a temperatura ambiente o durante 2 h a 4 °C antes de recolectar las células. Posteriormente, se comenzó a lisar las células para recolectar las proteínas. Las proteínas se extraen en un tampón de lisis celular NP40 que contiene el inhibidor de la coctelería de proteasas durante 30 minutos. A continuación, las cuentas magnéticas que se han acoplado al anticuerpo se transfieren al sobrenadante en el lisado celular y se agitan a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, se descartó el sobrenadante y las cuentas magnéticas se lavaron cinco veces con 500 μL de tampón de lisis celular NP40. Entre cada lavado, se realizó una separación magnética suave. Finalmente, se descartó el sobrenadante y se mezclaron 40 μl de tampón de carga SDS con las cuentas magnéticas y se hirvieron en un baño de agua durante 10 minutos antes de usarlas para la inmunotransferencia.

Extracción de proteínas e inmunotransferencia

Para las células cultivadas, se descartó el medio y se lavaron las células tres veces con PBS frío. Las células se lisaron durante 30 minutos utilizando un tampón NP-40 que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo (HY-B0496, MCE) y un inhibidor de la coctelería de proteasas (HY-K0010, MCE). Para las muestras de tejido, se extrajo la proteína total utilizando el kit de extracción de proteínas totales (EX1100, Solarbio) según las instrucciones del fabricante. Los lisados se centrifugaron a 15.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Se recolectaron los sobrenadantes y se cuantificaron las concentraciones de proteína mediante el kit BCA (23227; Thermo Fisher). Posteriormente, los sobrenadantes de proteínas obtenidos se mezclaron con un tampón concentrado 5× que contenía 250 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 5% de β-mercaptoetanol, 10% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 30% de glicerol y azul de bromofenol, seguido de calentamiento a 95-100 °C durante 10 minutos. Las muestras de proteína se separaron por electroforesis en un electroforesis en gel de dodecilsulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 8-10%. Después de la electroforesis, las bandas de proteína separadas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Posteriormente, la membrana se bloqueó sumergiéndola en leche descremada al 5% en TBST o en un tampón de bloqueo rápido (SW162-01, Seven, Beijing, China). A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios y luego se expusieron a anticuerpos secundarios unidos a HRP durante 2 h a temperatura ambiente. Finalmente, las bandas de la membrana se lavaron tres veces con TBST y luego se visualizaron utilizando un kit de quimioluminiscencia eficiente (34096; Thermo Fisher).

Ensayo de intercambio de acil-biotina (ABE)

El ensayo ABE se realizó según protocolos establecidos^[33],^[39],^[46], y los pasos experimentales clave se detallan a continuación. Se añadieron 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, 1% de NP-40, 10% de glicerol, inhibidor de proteasas e inhibidor de fosfatasas al NP-40 para configurar el tampón de lisis. Se preparó una solución fresca de N-etilmaleimida (NEM) y se añadió al tampón de lisis hasta una concentración final de 50 mM. Las células indicadas se lisaron en un tampón que contenía 50 mM de NEM durante 1 h sobre hielo. Se recogió la suspensión celular y se mezcló con microesferas magnéticas pre-recubiertas con el anticuerpo apropiado durante 3 h a 4 °C. Después de 5 lavados con el tampón de lisis (pH = 7,5), las microesferas se lavaron nuevamente 3 veces con el tampón de lisis (pH = 7,2). Se preparó una solución fresca de hidroxilamina (HAM) en el tampón de lisis a pH 7,2 hasta una concentración final de 1 M. A continuación, las microesferas se incubaron con el tampón de lisis que contenía 1 M de HAM durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavaron 3 veces con el tampón de lisis (pH = 6,2) para eliminar el HAM residual. Posteriormente, las microesferas se incubaron con el tampón de lisis (pH = 6,2) que contenía biotina-BMCC (5 μM) a 4 °C durante 1 h. Las microesferas se lavaron dos veces con el tampón (pH = 6,2) y luego tres veces con el tampón de lisis (pH = 7,5). Se eliminó el exceso de tampón y se añadió a 50 μL de tampón de muestra (5% de SDS, 5% de glicerol, 125 mM de Tris-HCl (pH = 6,8), 0,01% de azul de bromofenol) que contenía 5 mM de DL-ditiotretol (DTT). Las muestras se hirvieron a 80 °C durante 10 min y luego se enfriaron a temperatura ambiente durante 15 min.

Ensayos de inmunofluorescencia

Las células se sembraron en portaobjetos de placas de cultivo de 24 pocillos, se dejaron adherir a la pared y luego se sometieron a varios tratamientos. Los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS preenfriado, seguido de la fijación en 4% de paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente. Después de eliminar el paraformaldehído, los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS. Se añadió 0,3% de Triton-X-100 a los pocillos y se permeabilizaron durante 15 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se bloquearon con 3% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente después de lavarlos tres veces con PBS. Posteriormente, se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, se aplicaron anticuerpos secundarios marcados con fluorocromo en la oscuridad durante 2 h a temperatura ambiente, y luego las muestras se tiñeron con DAPI durante 10 min. Las muestras de tejido se trataron de manera similar como se describe anteriormente. Finalmente, se obtuvieron imágenes representativas utilizando un microscopio confocal de barrido Olympus FLUOVIEW FV1000 japonés o un microscopio de fluorescencia Nikon ECLIPSE Ti2 japonés.

Aislamiento de linfocitos infiltrantes tumorales y análisis por citometría de flujo

Para las células inmunitarias infiltrantes tumorales, se aislaron todos los ratones inmediatamente después del sacrificio en los momentos indicados, y los tumores se colocaron sobre hielo y se cortaron cuidadosamente en pequeños trozos de aproximadamente 1 mm. Estos fragmentos de tejido tumoral se digirieron luego en un medio 1640 sin suero que contenía colagenasa IV (1 mg/ml, 17104019; Invitrogen), desoxirribonucleasa I (100 μg/ml, HY-108882; MCE) e hialuronidasa (250 μg/ml, BS171; Biosharp) durante 90 min a 37 °C. La suspensión celular se filtró luego utilizando un filtro celular. Se utilizó una solución de separación celular de gradiente de Percoll (17089101, Cytiva) para aislar las células tumorales y las células inmunitarias que infiltran el tumor. Para el análisis de citocinas, las células inmunitarias obtenidas se incubaron con PMA, Brefeldin A, monensina e ionomicina durante 6 h y luego se tiñeron con los anticuerpos correspondientes. Se utilizó la solución de fijación y permeabilización Cytofix/Cytoperm™ (554722, BD) para la tinción intracelular. Se utilizó el conjunto de tampones de factores de transcripción (562574, BD) para la tinción nuclear. Los archivos FCS sin procesar se analizaron utilizando el software FlowJo (v10.8.1).

Ensayo de eliminación de células T

La metodología experimental se adaptó de protocolos publicados^[75],^[76], y los procedimientos principales se describen a continuación. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre total anticoagulada utilizando un medio de separación de linfocitos humanos (7111011, Dakewe). Brevemente, la sangre total se diluyó 1:1 con PBS y se colocó cuidadosamente sobre el medio de separación. Las muestras se centrifugaron a temperatura ambiente a 800 × g durante 30 min utilizando un rotor horizontal con ajustes bajos de aceleración y desaceleración. Después de la centrifugación, la capa opaca de células mononucleares en la interfaz plasma-medio se recogió cuidadosamente en un tubo nuevo. Las células se lavaron 2 veces con RPMI-1640 por centrifugación a 20 °C y 250 × g durante 10 min, y el sedimento celular se resuspendió en solución salina normal o en el medio de cultivo apropiado para el aislamiento posterior. Las células T CD8+ humanas y las células dendríticas humanas se aislaron de las PBMC utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+, humano (130-096-495, Miltenyi Biotec) y el kit de enriquecimiento de células dendríticas humanas Dynabeads® (11308D, Thermo Fisher Scientific), respectivamente. Las células dendríticas aisladas se co-incubaron primero con las células tumorales indicadas, y luego las células dendríticas pretratadas se utilizaron para activar las células T CD8+. Para evaluar el efecto de eliminación tumoral mediado por las células T, las células T CD8+ preacondicionadas se reactivaron con anticuerpo anti-CD3 (2 μg/ml), anticuerpo anti-CD28 (2 μg/ml) e IL-2 (100 UI/ml). Las células T CD8+ activadas se co-incubaron luego con las células tumorales indicadas a una proporción de 10:1 durante 24-48 h. Detección de la citotoxicidad mediada por las células T utilizando el ensayo de escisión de caspasa-3 y el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante de cada pocillo y se determinó la cantidad de LDH liberada en el medio de cultivo utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad LDH (HY-K1090, MCE). Los grupos de células obtenidos después de la centrifugación se lavaron tres veces con PBS y luego se tiñeron con anticuerpo activado contra caspasa-3 conjugado con FITC, seguido de análisis por citometría de flujo.

Inmunohistoquímica (IHC)

Los especímenes de tejido incluidos se cortaron en secciones de 4 μm de espesor. Después de los procesos secuenciales de desparafinación, rehidratación, recuperación de antígenos y bloqueo, las secciones se trataron con el anticuerpo primario especificado durante la noche y luego se incubaron con el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Los resultados inmunohistoquímicos se cuantificaron mediante la densidad y la intensidad de las células positivas. La densidad de la tinción positiva se clasificó en 4 grados según la intensidad de la tinción positiva de la siguiente manera: 1 (70%). La intensidad de la tinción positiva se clasificó en 4 grados, 0 (sin tinción), 1 (débil), 2 (moderada) y 3 (fuerte). Los puntajes de densidad e intensidad se multiplicaron luego para obtener el puntaje de IHC, que osciló entre 0 y 12. Para evaluar el puntaje de tinción de CD8, se eligieron tres campos de visión aleatorios de cada sección de tejido y se analizaron con un aumento de ×400. Se calculó el número medio de células teñidas positivamente observadas en estos campos para representar cada caso. La tinción de IHC fue evaluada de forma independiente por dos patólogos experimentados, y el puntaje final de IHC para cada caso se definió como el promedio de los dos puntajes.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (qRT-PCR)

Inicialmente, se extrajo ARN de las células utilizando el reactivo de extracción de ARN AG RNAex Pro (AG21101, Accurate Biotechnology (Hunan) Co., Ltd) siguiendo el protocolo del fabricante. El ARN extraído se transcribió luego a ADNc utilizando el kit de transcripción inversa (HiScript III RT SuperMix for qPCR, Vazyme). Finalmente, se realizó qPCR utilizando el reactivo SupRealQ Ultra Hunter SYBR qPCR Master Mix(U+) (Q713-02, Vazyme Biotech Co., Ltd) en el instrumento QuantStudio 3 (Thermo Fisher). Todas las secuencias de los cebadores se proporcionan en la tabla S8.

Estudio en animales

Los ratones utilizados en este estudio (Mus musculus) incluyeron C57BL/6J, BALB/c, NCG, Zdhhc24
fl/fl, Villin-cre y Rosa26-CAG-LSL-tdTomato, que se compraron a GemPharmatech (Nanjing, China). La línea de ratones Zdhhc24 fl/fl se generó utilizando CRISPR/Cas9 sobre un fondo genético C57BL/6J (las secuencias de gRNA se proporcionan en la tabla S9) y se mantuvo en nuestro laboratorio. Los ratones huHSC-C-NKG-ProF se generaron por Cyagen Biosciences (Suzhou, China). Todos los animales utilizados en este estudio fueron hembras. A menos que se indique lo contrario en las leyendas de las figuras, los ratones tenían 6 semanas de edad al inicio de cada experimento, y el número de animales utilizados para cada experimento (n) y la cepa/subcepa correspondiente se indican en las leyendas de las figuras. El sexo no se incluyó como una variable biológica porque todos los experimentos se realizaron utilizando ratones hembras para reducir la variabilidad y mantener la consistencia entre los grupos; por lo tanto, no se realizaron comparaciones basadas en el sexo, y esta elección se realizó únicamente por consideraciones de diseño experimental y reproducibilidad, y no refleja ningún sesgo o discriminación por sexo. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Tongji (TJH-202303006). Los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, una temperatura ambiente de 22-24 °C y una humedad relativa del 40-60%, con comida y agua disponibles ad libitum.

Para los ensayos de xenoinjerto tumoral, las células se digirieron, se lavaron tres veces con PBS y se mezclaron con Matrigel (abs9493, Absin) en una proporción de 1:1 hasta una densidad final de 2 × 106 células/mL. Se inyectaron 100 μL de la suspensión celular por vía subcutánea en ratones hembra de 6 semanas de edad. El volumen tumoral se midió en los momentos indicados y se calculó como V = L × D2/2 (L: eje largo, D: eje corto). En el protocolo aprobado, la carga tumoral máxima fue un volumen tumoral de 2000 mm3, y los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron este límite o cuando se cumplieron otros criterios de eutanasia humanitaria. Además de la carga tumoral máxima predefinida (volumen tumoral de 2000 mm3), los ratones fueron sacrificados si se cumplió alguno de los siguientes criterios de eutanasia humanitaria: (i) ulceración, necrosis o sangrado en el sitio del tumor; (ii) movilidad deteriorada, incapacidad para acceder a la comida o el agua, o postura/comportamiento anormal persistente; (iii) pérdida de peso rápida (≥20% del valor basal) o deshidratación grave; (iv) signos de angustia sistémica, como dificultad para respirar, hipotermia o letargo marcado; o (v) cualquier otra condición que el personal de cuidado de animales/veterinario considere que requiere eutanasia para evitar un sufrimiento indebido. Los ratones se controlaron al menos cada 1-2 días, y con mayor frecuencia cuando los tumores se acercaban al punto final. En general, el estudio no superó sustancialmente el límite permitido. En el experimento de supervivencia de CT26 (fig. 9C-G), un pequeño número de ratones mostraron volúmenes tumorales calculados ligeramente superiores a 2000 mm3 en los momentos de medición programados, lo que refleja la variabilidad de la medición con la pinza y la naturaleza estimada de la fórmula del volumen, junto con el rápido crecimiento tumoral entre dos momentos de control consecutivos; los ratones fueron sacrificados inmediatamente después de la detección de acuerdo con el protocolo aprobado. Para los agentes terapéuticos, el anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg), el péptido E y el péptido C (10 mg/kg) se inyectaron en los ratones por inyección intraperitoneal en los momentos indicados. Para los ratones Zdhhc24fl/fl, se utilizó la tecnología CRISPR/Cas9 para modificar el gen Zdhhc24 (las secuencias de gRNA se proporcionan en la tabla S9). Brevemente, el sistema CRISPR/Cas9 y el donante se microinyectaron en óvulos fertilizados de ratones C57BL/6 J. La transferencia de óvulos fertilizados produjo ratones F0 positivos, que se confirmaron por PCR y secuenciación. Los ratones de la generación F0 positivos se cruzaron con C57BL/6 J durante al menos dos generaciones para obtener un modelo de ratón Zdhhc24fl/fl estable. Villin-cre y Rosa26-CAG-LSL-tdTomato son ratones comerciales bien establecidos. La validación de los cebadores de PCR para los ratones Zdhhc24fl/fl y Villin-cre se proporciona en la tabla S10.

Ensayo de hemólisis

Aproximadamente 0,6 mL de sangre se recolectó de ratones anestesiados mediante punción cardíaca en un tubo de centrífuga pre-recubierto con citrato de sodio como anticoagulante. La muestra se centrifugó a 2500 × g durante 10 min para eliminar el plasma. Los glóbulos rojos (RBC) restantes se lavaron repetidamente con solución salina normal hasta que el sobrenadante se volviera incoloro. Después de descartar el sobrenadante, los glóbulos rojos se resuspendieron en 1 mL de solución salina normal para obtener una suspensión de glóbulos rojos. Luego, se agregaron 100 μL de la suspensión de glóbulos rojos a 1 mL de solución de E-péptido (disuelto en solución salina) a varias concentraciones. Se utilizó solución salina sola como control negativo y agua destilada como control positivo. Las mezclas se incubaron a 37 °C durante 2 h, seguido de centrifugación a 2500 × g durante 10 min. Se midió la densidad óptica (OD) del sobrenadante a 541 nm. La tasa de hemólisis se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Ensayos de coagulación: tiempo de protrombina (PT) y tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT)

El PT y el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) se midieron utilizando kits de ensayo comerciales (Bioswamp Life Science Lab, Wuhan, China) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se centrifugó sangre total a 2500 × g durante 10 min para obtener plasma pobre en plaquetas. Se mezclaron 200 μL de plasma con 10 μL de solución de E-péptido (disuelta en solución salina normal) para obtener concentraciones finales de péptido de 5, 10, 25 y 50 μM. Se agregó un volumen igual de solución salina normal al plasma como control. Para la prueba de PT, se pre-incubaron 70 μL de plasma tratado con péptido o control y 140 μL de reactivo de PT por separado en un baño de agua a 37 °C durante 3 min. Luego, se mezclaron rápidamente los dos componentes y se registró el tiempo de coagulación al cesar el flujo durante una ligera inclinación del tubo de reacción. Para la prueba de APTT, se mezclaron 100 μL de plasma tratado con péptido o control con 100 μL de reactivo de APTT (que contiene ácido elágico) y se incubó a 37 °C durante 5 min. Posteriormente, se agregaron 100 μL de solución de CaCl2 al 25 mM (pre-calentada a 37 °C) para iniciar la coagulación. El tubo se agitó suavemente en un baño de agua a 37 °C y se registró el tiempo hasta la formación visible de fibrina como el valor de APTT.

Síntesis de péptidos

El C-péptido (YGRKKRRQRRRRKWEISQCKC) y el E-péptido (YGRKKRRQ-RRRCWRKIKQSCE) se sintetizaron por QYAOBlO (ChinaPeptides Co., Ltd.) utilizando protocolos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) basados en Fmoc sobre resina de cloruro de 2-clorotritilo. La síntesis siguió un procedimiento paso a paso que involucró la hinchazón de la resina en DMF, el acoplamiento secuencial de aminoácidos protegidos con Fmoc utilizando HBTU y DIEA, y la desprotección de Fmoc con 20% de piperidina en DMF. La eficiencia del acoplamiento se monitoreó mediante pruebas de Kaiser. Una vez completado el ensamblaje de la cadena, el péptido se escindió de la resina utilizando un cóctel de escisión basado en TFA (TFA/H₂O/EDT/TIS, 95:2:2:1, v/v) y se precipitó en éter frío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (RP-HPLC) preparativa en una columna C18. Se confirmó la identidad y pureza final del péptido mediante espectrometría de masas (MS) y HPLC analítica. El péptido purificado se liofilizó y se almacenó a −20 °C hasta su uso.

Ensayo de ligadura de proximidad (PLA)

El ensayo de ligadura de proximidad se detectó utilizando el kit iniciador rojo in situ Duolink® para ratón/conejo (Sigma-Aldrich) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras fijadas y permeabilizadas sobre portaobjetos de vidrio se bloquearon con la solución de bloqueo Duolink® a 37 °C durante 60 min, y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios: anti-CD276 (Abcam, ab134161) y anti-SQSTM1/p62 (CST, 88588). Después del lavado en tampón de lavado 1×, se aplicaron sondas PLUS y MINUS (dilución 1:5) durante 1 h a 37 °C, seguido de ligadura (ligasa 1:40, 30 min a 37 °C) y amplificación (polimerasa 1:80, 100 min a 37 °C, en la oscuridad). Los portaobjetos se lavaron, se montaron con medio de montaje in situ Duolink® que contiene DAPI y se visualizaron utilizando un microscopio confocal (LSM900 Airyscan).

Resonancia plasmónica de superficie (SPR)

Las mediciones de unión entre ZDHHC24 y E-péptido se realizaron mediante resonancia plasmónica de superficie (SPR) en un instrumento Biacore 8 K (GE Healthcare/Cytiva) utilizando chips CM5, basándose en protocolos establecidos ^[77], ^[78] con todos los parámetros experimentales clave proporcionados a continuación. En resumen, los experimentos se realizaron a 25 °C con una celda de referencia activada/desactivada en blanco. ZDHHC24 se inmovilizó en CM5 mediante acoplamiento de aminas utilizando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida/N-hidroxisuccinimida (EDC/NHS), y los ésteres residuales se bloquearon con etanolamina. El tampón de ejecución/inmovilización fue tampón fosfato salino 1× con surfactante P20 (PBS-P+, pH 7,4). Los análisis de interacción se llevaron a cabo en PBS-P+ (pH 7,4) suplementado con 5% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO); se utilizó una curva de corrección del índice de refracción del disolvente de ocho puntos que abarca el 5,0% de DMSO (preparada mezclando soluciones de DMSO del 4,5% y 5,8%) para la corrección del índice de refracción masivo. Los E-péptidos se inyectaron como analitos de baja a alta concentración (0,3125–10 µM) a una velocidad de flujo de 30 µL min−1 con una fase de asociación de 150 s, seguida de regeneración de la superficie con 10 mM de glicina-HCl (pH 2,0) durante 5 min entre inyecciones. Los parámetros de unión se obtuvieron mediante un ajuste global de los sensorgramas corregidos por disolvente y de doble referencia a un modelo de Langmuir 1:1 en Biacore Insight (Cytiva), lo que arrojó la constante de disociación de equilibrio (Kd).

Estadística y reproducibilidad

Todos los ensayos se realizaron en al menos tres experimentos independientes. El tamaño de la muestra se determinó en función de la experiencia previa o la literatura publicada. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyeron datos de los análisis. Los especímenes humanos diagnosticados con cáncer colorrectal se seleccionaron aleatoriamente de los pacientes hospitalizados elegibles. Los animales se asignaron aleatoriamente a los grupos de control y experimentales utilizando un método de aleatorización simple. Los investigadores desconocían la asignación del grupo durante la recopilación y el análisis de datos, incluida la evaluación de los resultados. Los datos se presentan como media ± DE. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 9.5) y Origin (versión 2021). Antes del análisis estadístico, se realizaron pruebas de normalidad y homogeneidad de la varianza. Se utilizaron pruebas t de Student no pareadas o pareadas de dos colas para las comparaciones entre dos grupos. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se utilizaron ANOVA de una vía con pruebas de comparación múltiple de Tukey o Dunnett, o ANOVA de dos vías con pruebas de comparación múltiple de Tukey. Las variables categóricas se analizaron utilizando pruebas de chi-cuadrado. Las correlaciones se evaluaron utilizando la correlación de Pearson (de dos colas). Los análisis de supervivencia se realizaron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de rango logarítmico. La significación estadística se estableció en p