La adaptación metabólica tumoral inducida por la L-asparaginasa revela una vulnerabilidad a los inhibidores de PARP1/2 en los linfomas de células B.

Las células cancerosas exhiben un metabolismo mejorado para satisfacer las crecientes demandas energéticas y biosintéticas, una vulnerabilidad que ha llevado a varios laboratorios a desarrollar inhibidores metabólicos para su uso clínico en oncología^[1]–^[3]. A pesar de las evaluaciones exitosas en modelos preclínicos de cáncer, solo unos pocos de estos inhibidores han obtenido la aprobación de la FDA, debido en parte a toxicidades significativas y al desarrollo de mecanismos de resistencia^[1],^[4]. Los mecanismos intrínsecos por los cuales las células tumorales se adaptan al tratamiento metabólico in vivo siguen siendo poco conocidos, lo que limita el desarrollo de estrategias terapéuticas adicionales para los pacientes que presentan resistencia a los agentes antimetabólicos de uso habitual en la clínica.

La L-asparaginasa (ASNasa) es el único fármaco aprobado clínicamente que se dirige a la adicción de las células cancerosas a un aminoácido en particular, y se ha integrado con éxito en regímenes de quimioterapia multiagente para tratar tanto las leucemias linfoblásticas agudas de células T y B de la infancia como las del adulto (LLA-T, LLA-B) y los linfomas de células NK/T (LCNT). Al catalizar la hidrólisis del aminoácido no esencial asparagina en el torrente sanguíneo, la ASNasa desencadena la inanición y la apoptosis selectiva de las células cancerosas que dependen de la asparagina. Hasta la fecha, el uso clínico de la ASNasa se limita a la LLA y al LCNT, ya que estas neoplasias hematológicas suelen albergar un silenciamiento epigenético del gen que codifica la asparagina sintetasa, que cataliza la conversión dependiente de ATP del L-aspartato (Asp) y la L-glutamina (Gln) en L-asparagina (Asn) y L-glutamato (Glu)^[5]–^[7]. En consecuencia, la mayoría de las LLA y los LCNT son auxotróficos para la asparagina, lo que los hace muy vulnerables al tratamiento con ASNasa. Por lo tanto, la asparagina sintetasa se ha considerado durante mucho tiempo como un determinante primario de la sensibilidad de las células cancerosas al tratamiento con ASNasa^[6]. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que el tratamiento con ASNasa también exhibe eficacia antitumoral en una variedad de otras neoplasias que presentan una expresión basal heterogénea de la asparagina sintetasa^[8]–^[12]. Además, nuestro trabajo reciente demostró que la asparagina extracelular previene su biosíntesis de novo en los linfomas de células B, independientemente de los niveles de expresión de la asparagina sintetasa^[9]. Estos hallazgos desafían la visión convencional de que la expresión de la asparagina sintetasa por sí sola es un factor fiable para predecir la sensibilidad tumoral al tratamiento con ASNasa en las neoplasias que expresan asparagina sintetasa^[9].

Se han descrito varios mecanismos implicados en la reaparición del tumor durante el tratamiento con ASNasa. Debido a su naturaleza bacteriana, puede producirse inmunización contra la ASNasa durante la terapia, lo que conduce a la neutralización de la actividad enzimática. Este problema se está abordando mediante el desarrollo de una segunda generación de formulaciones de ASNasa con menor inmunogenicidad^[13]–^[15]. Los mecanismos adicionales implican principalmente la regulación al alza y/o la activación de la asparagina sintetasa en las células malignas, impulsada por la activación de múltiples vías de señalización distintas que convergen en un programa transcripcional dependiente de ATF4 (factor de transcripción activador 4) que promueve el crecimiento celular^[10]–^[12]. La liberación de nutrientes por las células del estroma, que alimenta los brotes leucémicos^[16],^[17], junto con adaptaciones metabólicas tumorales específicas, también explica los mecanismos adicionales de resistencia al tratamiento con ASNasa que se han notificado^[18]–^[20]. Sin embargo, ninguno de ellos ha dado lugar a tratamientos alternativos clínicamente viables para los pacientes que no responden a la terapia con ASNasa.

Recientemente, demostramos la eficacia antitumoral de una estrategia antimetabólica basada en ASNasa en pacientes con linfoma difuso de células B grandes refractario/recurrente (LDBCG)^[8]. A pesar de lograr respuestas completas, todos los pacientes finalmente recayeron durante o después de completar la terapia, lo que sugiere que un subconjunto de células malignas sobrevivió y se adaptó para superar el tratamiento.

Nuestro estudio tuvo como objetivo descubrir alteraciones metabólicas intrínsecas adicionales de las células cancerosas que contribuyen a la recaída tumoral durante el tratamiento con ASNasa, con el objetivo de revelar vulnerabilidades desconocidas que puedan ser objeto de tratamiento. Utilizando un modelo de ratón preclínico de linfomas de células B (LCB), modelamos la resistencia secundaria tras una respuesta antineoplásica inicial al tratamiento con ASNasa, tanto in vitro como in vivo. A través de un perfil metabólico exhaustivo del LCB, complementado con un análisis en profundidad de las vías metabólicas alteradas, utilizando el rastreo de isótopos estables tanto in vitro como in vivo, demostramos que el tratamiento con ASNasa induce una reprogramación metabólica dinámica caracterizada por un aumento de la biosíntesis de novo de serina en las células malignas. Mediante la inhibición farmacológica, el silenciamiento mediado por shRNA y la sobreexpresión de PHGDH, la enzima limitante de la biosíntesis de novo de serina, demostramos que PHGDH desempeña un papel fundamental en la mediación de la respuesta adaptativa del tumor a la ASNasa. Mecánicamente, la actividad de PHGDH mitiga el estrés oxidativo inducido por la ASNasa y el daño relacionado del ADN, lo que permite que las células malignas reanuden la proliferación durante el tratamiento. Es importante destacar que el daño del ADN inducido por la ASNasa aumenta la dependencia de las células B malignas de la actividad de la poli(ADP-ribosa) polimerasa 1/2 (PARP), lo que revela una vulnerabilidad terapéutica al inhibidor de PARP aprobado clínicamente, olaparib, que altera los mecanismos de reparación del ADN.

Resultados

Los linfomas de células B sensibles a la ASNasa sufren una reprogramación metabólica durante la terapia con ASNasa, tanto in vitro como in vivo

Anteriormente, demostramos que los linfomas de células B (LCB) que dependen del metabolismo de la fosforilación oxidativa (OxPhos) para la producción de energía son sensibles a la terapia con L-asparaginasa de E. coli (ASNasa), mientras que los LCB dependientes de la glucólisis presentan resistencia^[8]. En el presente estudio, injertamos ratones C57BL/6 de tipo salvaje con células Eµ-Myc dependientes de OxPhos (células B malignas) aisladas de dos ratones transgénicos Eµ-MycTg/+ individuales (#506 o #688). Siete días después, los ratones recibieron ya sea vehículo o ASNasa cada 48 horas hasta que el linfoma alcanzó el punto final ético (Fig. 1a, b). El tratamiento con ASNasa mostró una eficacia antitumoral significativa, lo que resultó en un retraso en el desarrollo del LCB (Fig. 1a, b y S1a, b). Esto representa la respuesta antineoplásica inicial al tratamiento. Sin embargo, a pesar del tratamiento continuo, todos los ratones finalmente desarrollaron LCB, un resultado que se observó de forma consistente en dos clones independientes de Eµ-Myc (#506 o #688) que mostraron una sensibilidad inicial equivalente al tratamiento con ASNasa in vivo. Esta respuesta secundaria refleja una fase de fracaso terapéutico, que imita la recaída tumoral tras una respuesta favorable inicial, como se observa en los pacientes con LDBCG refractario/recurrente tratados con una innovadora terapia antimetabólica basada en ASNasa^[8].

Un mecanismo de reaparición del tumor durante el tratamiento con ASNasa en entornos clínicos es la producción de anticuerpos anti-ASNasa, que neutralizan la actividad de la enzima y a menudo se asocian con episodios alérgicos en los pacientes. Para descartar que la disminución de la actividad de la ASNasa sea la causa de la recaída tumoral, los ratones recibieron una dosis final de vehículo o ASNasa al final del estudio. Cuatro horas después de la administración, los ratones con LCB tratados con ASNasa mostraron concentraciones de asparagina plasmática indetectables y concentraciones de aspartato plasmático elevadas en comparación con los controles tratados con vehículo, lo que indica una actividad sostenida de la ASNasa a pesar de la recaída de la enfermedad (Fig. S1c).

Independientemente de la entidad tumoral o la dependencia energética, las células cancerosas resistentes a la terapia a menudo mejoran las funciones energéticas mitocondriales para promover la supervivencia^[21]–^[24]. De manera consistente, observamos un aumento significativo de la contribución de OxPhos a la producción de ATP en los LCB que progresaron durante el tratamiento con ASNasa in vivo, lo que sugiere una reprogramación metabólica para satisfacer las elevadas demandas de ATP (Fig. S1d).

A continuación, realizamos un análisis metabolómico dirigido en los LCB que se sometieron a tratamiento con vehículo o ASNasa in vivo. El análisis de componentes principales (PCA) y los diagramas de Venn mostraron que el perfil metabólico de los LCB tratados con ASNasa in vivo era distinto del de los LCB tratados con vehículo, independientemente del clon de Eµ-Myc utilizado (Fig. 1c–e y S1e). Diecinueve (14%) metabolitos se desregularon significativamente y fueron comunes a ambos conjuntos de datos (LCB derivados de células Eµ-Myc #506 o Eµ-Myc #688) y mostraron una regulación direccional similar en respuesta al tratamiento con ASNasa, con 14 metabolitos aumentados y 5 metabolitos disminuidos (Fig. 1f y Datos suplementarios S1). Estos metabolitos compartidos probablemente reflejan las respuestas metabólicas centrales al tratamiento con ASNasa que son independientes del origen del clon Eµ-Myc, lo que sugiere vulnerabilidades metabólicas conservadas en nuestro modelo in vivo.

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos (MSEA) utilizando la herramienta computacional de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG), reveló la desregulación del metabolismo de nucleótidos y aminoácidos (AA) en los LCB tratados con ASNasa (Fig. 1g). Entre los AA proteicos, la serina, la glicina, la tirosina y la asparagina fueron los únicos AA que se desregularon de manera significativa y consistente en los LCB tratados con ASNasa, cumpliendo el umbral de cambio de pliegue (ASNasa/Vehículo) > 1,25 y el valor p bruto < 0,05, en ambos conjuntos de datos (Fig. 1e y S1e, Tablas S1 y S2). De hecho, los LCB tratados con ASNasa in vivo exhiben un aumento de dos a tres veces en los niveles de serina y glicina en estado estacionario en comparación con los LCB tratados con vehículo (Fig. 1h, i).

Para confirmar que el tratamiento con ASNasa desencadenó una remodelación del metabolismo de la serina en las células malignas, las células Eµ-Myc se cultivaron en medio DMEM sin asparagina, pero que contenía concentraciones suprfisiológicas de serina y glicina, con (+) o sin (-) suplementación de asparagina y ASNasa. Se utilizó una concentración de 0,003 UI/ml de ASNasa para evitar la hidrólisis de la glutamina en L-glutamato (Fig. S1f). El tratamiento con ASNasa aumentó significativamente la muerte de las células Eµ-Myc en 24 horas (Fig. 1j y S1g, h). Sin embargo, las células Eµ-Myc que sobrevivieron a este estrés nutricional reanudaron la proliferación con el tiempo (Fig. 1k y S1i), un proceso que se acompañó de un aumento significativo de los niveles intracelulares de serina y glicina tras 24 horas de tratamiento con ASNasa (Fig. 1l, m y S1j, k). Para evaluar específicamente las adaptaciones metabólicas a la privación de asparagina, ya que la liberación de aspartato y amoníaco mediada por la ASNasa puede influir en la respuesta metabólica del tumor, cultivamos células Eµ-Myc en un medio sin asparagina. Esta configuración experimental garantizó que los cambios metabólicos observados fueran directamente atribuibles a la privación de asparagina, lo que reforzó la solidez de nuestras conclusiones. Nuestros hallazgos indican que el tratamiento con ASNasa induce una respuesta metabólica en los LCB, tanto in vitro como in vivo, caracterizada por niveles elevados de serina y glicina en las células B malignas.

Aumento de la biosíntesis de novo de serina en los linfomas de células B tratados con ASNasa, in vitro e in vivo

El aumento de los niveles totales de serina en las células malignas puede deberse a una mayor importación de serina mediante transporte activo o a un aumento de la biosíntesis de novo de serina a partir del intermediario glucolítico 3-fosfoglicerato y el glutamato derivado de la glutamina, a través de un proceso enzimático de 3 pasos catalizado por la fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH), la fosfoserina aminotransferasa-1 (PSAT1) y la fosfoserina fosfatasa (PSPH). La proliferación de las células Eµ-Myc no se vio afectada por la eliminación de L-serina/glicina del medio extracelular, independientemente de la disponibilidad de asparagina (Fig. S2a). En consonancia con un informe previo que describe la asparagina como un factor de intercambio de aminoácidos que facilita la importación de serina^[25], las células Eµ-Myc con restricción de asparagina mostraron una reducción significativa de la captación de serina extracelular y un aumento de los niveles totales de serina intracelular (Figs. 2a, 1l y S1j). Además, la incubación de células Eµ-Myc en un medio libre de serina/glicina siguió dando lugar a un aumento marcado y significativo de la abundancia de serina y glicina intracelular en las células tratadas con ASNasa en comparación con las células de control, lo que sugiere la activación de la vía de biosíntesis de novo de serina y glicina tras el tratamiento (Fig. 2b, c). En apoyo de esta hipótesis, las células Eµ-Myc con privación de asparagina aumentaron la expresión de ARNm y proteína de PHGDH, PSAT1 y PSPH, junto con la inducción esperada de la asparagina sintetasa (Figs. 2d, e y S2b). La glutamina sintetasa (GLUL), que se ha asociado con la resistencia de las células de sarcoma a la ASNasa^[18],^[19], se sobreexpresó solo en las células Eµ-Myc con privación de glutamina, pero no en las células Eµ-Myc con privación de asparagina, lo que sugiere una contribución débil de la GLUL a la resistencia secundaria al tratamiento con ASNasa en las células B malignas. El nivel de expresión de la glutamato oxaloacetato transaminasa 1 (GOT1), que no cambió tras el estrés nutricional, indica una regulación selectiva de enzimas metabólicas específicas, lo que es coherente con la sobreexpresión del factor de transcripción ATF4 (Figs. 2d, e y S2c), como ya se ha descrito^[26]–^[29].

Dado que el nivel de expresión de una enzima metabólica no refleja necesariamente su actividad^[9], evaluamos la actividad de la PHGDH, la enzima limitante de la biosíntesis de novo de serina, así como el nivel de serina y glicina sintetizadas de novo mediante el seguimiento de la [U-13C]-glucosa en las células Eµ-Myc in vitro. Observamos un aumento significativo de la actividad de la PHGDH (Fig. S2d), junto con niveles elevados de serina 13C marcada de novo (M + 3) y glicina 13C marcada (M + 2) derivadas de la [U-13C]-glucosa, en las células Eµ-Myc con privación de asparagina, incluso en un medio que contenía concentraciones suprafisiológicas de ambos aminoácidos (Figs. 2f, g y S2e). Estas células también mostraron niveles elevados de asparagina 13C marcada (M + 2 y M + 3), lo que es coherente con la activación de la asparagina sintetasa en condiciones de retirada de asparagina extracelular (Fig. S2f). De forma similar, utilizando α−15N-L-glutamina, detectamos niveles elevados de serina 15N marcada (M + 1) y asparagina 15N marcada (M + 1) (Figs. S2e, g, h), lo que apoya aún más el aumento de la biosíntesis de novo de serina en las células B malignas expuestas a un entorno sin asparagina.

In vivo, las células BCL obtenidas de ratones tratados con ASNasa también mostraron una sobreexpresión de PSAT1, PSPH, ASNS y ATF4, aunque la expresión de PHGDH no cambió (Figs. 2h y S2i). No obstante, la actividad de la PHGDH aumentó significativamente en las células BCL de los ratones tratados con ASNasa (Fig. 2i). Tras varias semanas de tratamiento con vehículo o ASNasa, los ratones portadores de células BCL recibieron dos dosis consecutivas de [U-13C]-glucosa con un intervalo de 20 min para cuantificar la serina, la glicina y la asparagina sintetizadas de novo en los tumores (Fig. 2j). Se detectó un enriquecimiento equivalente de glucosa totalmente marcada con carbono (M + 6) en el plasma de los ratones tratados con vehículo y ASNasa que portaban células BCL (Fig. S3a). Coherente con los datos in vitro, los niveles de serina 13C marcada (M + 3), glicina (M + 2) y asparagina (M + 2) aumentaron significativamente en las células BCL tratadas con ASNasa, junto con niveles totales elevados de serina, glicina y una disminución de los niveles totales de asparagina, lo que sugiere un aumento de la biosíntesis de novo de serina/glicina y asparagina en las células BCL expuestas al tratamiento con ASNasa in vivo (Figs. 2k y S3b-e). Como se informó anteriormente en ratones WT y en múltiples modelos de cáncer murino^[30], también confirmamos la elevación de la concentración de serina en el plasma en los ratones C57BL/6 portadores de células BCL tratados con ASNasa (Fig. S3f).

En conjunto, nuestros resultados demuestran que las células B malignas expuestas a un entorno con restricción de asparagina favorecen la biosíntesis de novo de serina, a pesar de la disponibilidad de serina y glicina en el entorno.### La PHGDH favorece la proliferación de las células B malignas sensibles a la ASNasa durante la terapia

A continuación, investigamos si las células B malignas sensibles a la ASNasa aumentan la biosíntesis de novo de serina para facilitar su crecimiento en un entorno con privación de asparagina. En primer lugar, probamos varios inhibidores de la PHGDH disponibles comercialmente, incluidos tres compuestos alostéricos (NCT-503, CBR-5884 y PKUMDL-WQ2101) y un inhibidor competitivo (BI-4916)^[31]–^[34] en las células Eµ-Myc para evaluar sus efectos sobre la actividad enzimática de la PHGDH y la viabilidad celular. Si bien todos los compuestos mostraron citotoxicidad dependiente de la concentración in vitro (Fig. S4a–d), solo el BI-4916, un inhibidor NAD⁺/NADH competitivo y selectivo de la PHGDH que penetra en las células^[34], inhibió eficazmente la actividad de la PHGDH en las células Eµ-Myc (Fig. S4e). Basándose en estos resultados, se seleccionó el BI-4916 para investigaciones posteriores. Cabe destacar que nuestros hallazgos son coherentes con estudios previos que demuestran la eficacia superior del BI-4916 en la inhibición de la biosíntesis de novo de serina en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468, en comparación con los inhibidores alostéricos^[35]. El tratamiento con 10 µM de BI-4916 inhibió la actividad de la PHGDH en un 80% (Fig. 3a), redujo significativamente los niveles totales de serina intracelular (Fig. S4f) e indujo un aumento medio significativo del 30% de la muerte de las células Eµ-Myc en 24 horas (Figs. 3b y S4d). Cuando se combinó con la ASNasa, el BI-4916 mejoró aún más la muerte celular de forma dependiente de las caspasas en 24 h, en comparación con cualquiera de los tratamientos por separado (Figs. 3b y S4g). Además, el cotratamiento con ASNasa/BI-4916 retrasó significativamente el crecimiento de las células Eµ-Myc, lo que subraya la contribución de la actividad de la PHGDH a la adaptación de las células B malignas durante el tratamiento con ASNasa (Fig. 3c). Se obtuvieron efectos similares con otras células Eµ-Myc sensibles a la ASNasa (Fig. S4h, i) y con el inhibidor competitivo de la PHGDH BI-4924, que se modificó químicamente para generar la forma de profármaco esterificado, BI-4916^[34] (Fig. S4j, k).

Debido a la inestabilidad intrínseca del BI-4924 y el BI-4916, lo que impide su uso en estudios in vivo^[34], buscamos confirmar que los efectos observados se debían a la inhibición de la PHGDH mediante la expresión estable de ARNs de interferencia (ARNi) dirigidos al ARNm de Phgdh murino en las células Eµ-Myc. Dos constructos de ARNi (#1 y #2) redujeron eficazmente los niveles de proteína PHGDH sin alterar los niveles de expresión de PSAT1 o PSPH (Fig. 3d, e). Coherente con la inhibición farmacológica, el silenciamiento de Phgdh sensibilizó las células Eµ-Myc a la muerte celular inducida por la ASNasa y previno la expansión de las células supervivientes in vitro (Fig. 3f, g). In vivo, los ratones tratados con ASNasa y portadores de células Eµ-Myc-shPhgdh #1 mostraron un retraso significativo en la progresión del linfoma en comparación con los que portaban células Eµ-Myc-shSCR de control (Fig. 3h), lo que confirmó que la PHGDH es un mediador clave de la recurrencia de las células BCL durante la terapia con ASNasa. Cabe destacar que, al final del estudio, confirmamos la disminución de los niveles de proteína PHGDH en las células BCL de los ratones portadores de células Eµ-Myc-shPhgdh #1, independientemente de los tratamientos (Fig. 3i, j). Por el contrario, la sobreexpresión de PHGDH en las células Eµ-Myc aceleró el desarrollo de las células BCL tras el tratamiento con ASNasa (Fig. S4l–n), lo que validó aún más el papel de la PHGDH en los mecanismos de resistencia adaptativa.

En conjunto, nuestros resultados destacan el papel fundamental de la actividad de la PHGDH y la biosíntesis de novo de serina en la proliferación de las células B malignas expuestas a un entorno con privación de asparagina.### El tratamiento con ASNasa induce una respuesta metabólica tumoral reversible in vivo

El estrés nutricional prolongado, como el que se impone con semanas de tratamiento con la ASNasa utilizada clínicamente, plantea interrogantes sobre la persistencia de los mecanismos que impulsan la recurrencia del tumor. Para evaluar la reversibilidad de esta adaptación, las células Eµ-Myc que sobrevivieron a 4 días de tratamiento con ASNasa in vitro (1.er desafío) se liberaron de la terapia (células C1). Tras la reexposición a la ASNasa (2.º desafío), las células C1 mostraron una sensibilidad a la ASNasa comparable a la de las células Eµ-Myc parentales (WT) que no habían recibido tratamiento, lo que sugiere que la respuesta adaptativa es transitoria (Fig. 4a–c). Este resultado fue coherente con otras células Eµ-Myc sensibles a la ASNasa (Fig. S5a, b).

Los niveles de expresión de PHGDH, PSAT1, PSPH, ASNS y del factor de transcripción ATF4, que se sobreexpresaron inicialmente en las primeras 24 horas, se mantuvieron elevados durante los 4 días de tratamiento con ASNasa (Figs. 4d y S5c). Tras la retirada de la terapia, los niveles de proteína ASNS y PSPH volvieron a los niveles basales en 24 horas, mientras que los niveles de PSAT1 y PHGDH disminuyeron modestamente a las 72 horas y 96 horas (condición de control del 2.º desafío), respectivamente, lo que es coherente con una disminución dependiente del tiempo del nivel de expresión de ATF4. Tras la reexposición a la ASNasa (2.º desafío), estas enzimas se reindujeron en 24 horas (Figs. 4d y S5c), lo que confirma un proceso regulador dinámico y reversible.

In vivo, las células BCL obtenidas de ratones tratados con vehículo o ASNasa (1.er desafío in vivo) se reengraparon en ratones C57BL/6 WT y se sometieron a una segunda ronda de terapia con ASNasa (2.º desafío in vivo). Los ratones que recibieron células tratadas con ASNasa mostraron un beneficio de supervivencia significativo tras el retratamiento (Fig. 4e–g), lo que apoya un modelo de adaptación metabólica flexible y no permanente.

Para evaluar si la respuesta metabólica a la ASNasa era reversible in vivo, realizamos un perfil metabólico de las células BCL obtenidas tras el 1.er o 2.º tratamiento con ASNasa (desafío in vivo). Los tumores de los ratones tratados con vehículo (BCL-V y BCL-A) mostraron perfiles metabólicos distintos en comparación con los de los ratones tratados con ASNasa (BCL-N y BCL-AN), independientemente del origen del tumor (BCL-V o BCL-A). Es importante destacar que los tumores obtenidos de los ratones tratados con vehículo (BCL-V y BCL-A) mostraron una firma metabólica muy similar, aunque las células BCL-A procedían de células que ya se habían adaptado al tratamiento con ASNasa, lo que sugiere un fenotipo de resistencia transitorio (Fig. 4h). Entre las vías metabólicas más desreguladas en las células BCL-AN en comparación con las células BCL-A, el metabolismo de la serina/glicina fue prominente, lo que es coherente con los hallazgos previos (Fig. S5d). Las células BCL tratadas con ASNasa mostraron niveles elevados de serina y niveles reducidos de asparagina, mientras que se observó el patrón opuesto en las células BCL tratadas con vehículo, lo que pone de manifiesto una reprogramación metabólica dinámica (Fig. 4i). En consonancia con los resultados in vitro (Figs. 4d y S5c), la inducción de la expresión de PSAT1, PSPH y ASNS en las células BCL tras el 1.er desafío in vivo con ASNasa fue transitoria, ya que sus niveles de expresión disminuyeron en las células BCL-A de los ratones tratados con vehículo (o se mantuvieron en las células BCL-AN de los ratones tratados con ASNasa) tras el 2.º desafío in vivo (Figs. 4j y S5e). En conjunto, nuestros datos destacan la plasticidad metabólica de las células B malignas expuestas a la terapia con ASNasa.### La actividad de la PHGDH limita el estrés oxidativo inducido por la ASNasa en las células B malignas.

Dado que la privación de aminoácidos o glucosa induce estrés oxidativo^[36],^[37], determinamos si el tratamiento con ASNasa induce estrés oxidativo en las células Eµ-Myc y cómo estas células Eµ-Myc sensibles a la ASNasa se adaptan. Las células Eµ-Myc privadas de asparagina mostraron niveles elevados de ROS y una mayor relación oxidada/reducida de glutatión (GSSG/GSH) (Figs. 5a, b y S6a, b). Este estrés oxidativo se acompañó de la estabilización de la proteína NRF2 (Factor Nuclear Eritroide 2-Relacionado 2), que a su vez activó la transcripción de los genes canónicos de respuesta antioxidante, incluyendo la subunidad catalítica de la glutamato-cisteína ligasa (Gclc), la subunidad modificadora de la glutamato-cisteína ligasa (Gclm) —las primeras enzimas limitantes de la biosíntesis de glutatión—, así como la NAD(P)H quinona deshidrogenasa 1 (Nqo1) (Fig. 5c–e).

Dado que la inducción de Gclc, Gclm y el gen diana de NRF2, slc6a9 (miembro 6 de la familia de transportadores de solutos)^[38], que codifica un transportador de glicina (Fig. S6c), verificamos si la síntesis de glutatión, que requiere cisteína, glutamato y, en última instancia, glicina, se potenciaba en las células Eµ-Myc privadas de asparagina. Detectamos niveles aumentados de GSH marcada con 13C (M+2) derivada de la 13C2-glicina (Fig. S6d, e), lo que indica una síntesis activa de glutatión en las células Eµ-Myc privadas de asparagina. Cabe destacar que la glicina parece ser catabolizada específicamente en la biosíntesis de glutatión, como lo demuestra una reducción significativa en la abundancia de los productos posteriores del metabolismo de la glicina y una disminución de los niveles de 13C-ATP (M+2) (Fig. S6f).

Dado que la biosíntesis de serina de novo también contribuye a la glicina para la defensa antioxidante, y dado el aumento observado en los niveles de 13C3-serina y 13C2-glicina derivados de la [U-13C]-glucosa en las células tratadas con ASNasa (Fig. 2f, g), hipotetizamos que esta vía apoya la homeostasis redox. La inhibición de PHGDH con BI-4916 aumentó significativamente los niveles de ROS, lo que indica que la biosíntesis de serina de novo desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis redox en las células Eµ-Myc en condiciones basales (Fig. 5f, g). Además, las células tratadas con BI-4916 en un medio libre de Asn o con la combinación BI4916/ASNasa en un medio que contiene Asn, exhiben niveles más altos de ROS en comparación con los observados con cada tratamiento individual, lo que apoya la contribución de la biosíntesis de serina de novo a la homeostasis redox en las células Eµ-Myc tratadas con ASNasa (Fig. 5f, g). En consecuencia, la eliminación de ROS con N-acetil-L-cisteína (NAC) previno la muerte celular inducida por BI-4916, ya sea solo o en combinación con ASNasa (Fig. 5h).

Para promover una respuesta antioxidante eficaz, las células cancerosas no solo deben satisfacer una alta demanda de glicina, sino también de cisteína, el precursor limitante de la biosíntesis de glutatión^[39]–^[41]. Debido al entorno tumoral oxidante, la cisteína extracelular es inestable y se convierte rápidamente en cistina. Por lo tanto, la mayoría de las células cancerosas dependen del transporte de cistina, que se importa y se reduce a cisteína en el citosol, o de la biosíntesis de novo de cisteína. Sorprendentemente, las células Eµ-Myc obtenidas de 12 ratones transgénicos individuales Eµ-Myc Tg/+ carecían de niveles detectables de ARNm de slc7a11, el miembro 7 de la familia de transportadores de solutos (también llamado xCT), que es el principal antiporter de la membrana plasmática que media en la captación de cistina extracelular a cambio de glutamato (Fig. 5i). El ARNm de slc7a11 permaneció indetectable mediante qPCR en las células Eµ-Myc tratadas con ASNasa durante 72 h in vitro o mediante RNAseq en BCL expuestas a varias semanas de tratamiento con ASNasa in vivo (Figs. 5j y S6g). Otros transportadores de cisteína, slc7a9 y slc3a1, también estaban ausentes, mientras que slc3a2 (también llamado cd98), que codifica la chaperona para los transportadores xCT y LAT, se expresaba de forma ubicua (Fig. 5i, j). El análisis de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) confirmó que el DLBCL humano exhibe una baja expresión de ARNm de slc7a11 (Fig. 5k), un hallazgo reforzado por los datos de RNA-seq de 775 muestras de DLBCL humano^[42], que mostraron que el 7,28% expresó poco o ningún nivel detectable de ARNm de slc7a11, a pesar de la expresión heterogénea de ARNm de slc3a2 (Fig. S6h, i). La sobreexpresión de SLC7A11 murino en las células Eµ-Myc deficientes en slc7a11 atenuó la muerte inducida por la inhibición de PHGDH sola o en combinación con ASNasa (Fig. 5l–n). En conjunto, nuestros resultados resaltan el papel de PHGDH en la mitigación del estrés oxidativo inducido por ASNasa en las células B malignas.

El estrés oxidativo inducido por ASNasa reveló una vulnerabilidad terapéutica al inhibidor de PARP1/2 clínicamente utilizado en las células B malignas sensibles a ASNasa in vitro

A continuación, nos propusimos ampliar nuestra investigación sobre las posibles consecuencias de la homeostasis redox alterada en las células B malignas tratadas con ASNasa. Dado que la acumulación de ROS puede inducir roturas de ADN de una o dos hebras, buscamos determinar si el estrés oxidativo inducido por ASNasa desencadena daño en el ADN.

Las células Eµ-Myc con restricción de asparagina exhibieron un aumento de la fosforilación de la histona H2AX en Ser139 (γH2AX), junto con la activación de la vía de respuesta al daño del ADN dependiente de ATR (DDR) (Fig. 6a–d). Esto se evidenció por la fosforilación de ATR en Ser428 y sus sustratos posteriores, Chk1 en Ser345 y RPA32 en Ser33, in vitro e in vivo (Figs. 6c, d y S7a, b), lo que indica la presencia de daño en el ADN. En contraste, la DDR dependiente de ATM no se activó, ya que KAP1, un sustrato posterior de ATM, no se fosforiló en Ser824 en las células Eµ-Myc con restricción de Asn in vitro (Fig. 6c, d).

La eliminación de ROS con NAC redujo los niveles de γH2AX, lo que confirma que el estrés oxidativo contribuye al daño del ADN inducido por ASNasa (Fig. 6e, f). Por el contrario, la inhibición de PHGDH aumentó modestamente γH2AX en las células tratadas con ASNasa (Fig. 6g, h). En consecuencia, la sobreexpresión de PHGDH en las células Eµ-Myc (Fig. S4l, m) atenuó significativamente los niveles de expresión de γH2AX y la activación de la DDR dependiente de ATR durante la terapia con ASNasa in vivo (Fig. 6i, j). Esto apoya un papel protector de la biosíntesis de novo de serina en la preservación de la estabilidad del genoma.

Tras una respuesta al daño del ADN dependiente de ATR, las enzimas asociadas a la cromatina, la poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) y PARP2, catalizan la síntesis y la transferencia de polímero de ADP-ribosa (PAR) desde la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) a sus residuos de serina, tirosina y glutamato (auto-PARilación), activándolas. A su vez, las PARP activadas permiten la PARilación de las proteínas diana, promoviendo su reclutamiento en las roturas del ADN para una reparación eficaz del ADN. Nos propusimos investigar si PARP se activaba en las células Eµ-Myc tratadas con ASNasa, ya que esto podría representar una vulnerabilidad tumoral explotable terapéuticamente utilizando inhibidores de PARP1/2 (PARP) aprobados clínicamente. Observamos un aumento en la expresión de proteínas que contienen motivos de poli(ADP-ribosa), lo que indica una mayor actividad de PARP en las células Eµ-Myc tratadas con asparagina restringida (Fig. 7a). Los inhibidores de PARP, como el olaparib, compiten con NAD+ por el sitio catalíticamente activo de PARP, impidiendo así el inicio de los mecanismos de reparación del ADN. Para interferir con la reparación del ADN en las células tratadas con ASNasa, buscamos probar los efectos del co-tratamiento con ASNasa/Olaparib en las células Eµ-Myc, en entornos in vitro e in vivo. Esta combinación terapéutica mejoró la muerte celular dependiente de la caspasa en dos líneas Eµ-Myc dependientes de OxPhos (#506 y #688), superando el efecto de cada agente por separado (Fig. 7b–d). Cuando se co-trataron con olaparib (0,3 µM), las células Eµ-Myc tratadas con ASNasa no reanudaron la proliferación in vitro (Fig. 7e, f). In vivo, el co-tratamiento con ASNasa (cada 48 h) y olaparib (diario) retrasó significativamente la pérdida de peso y la aparición de BCL en ratones C57BL/6, en comparación con las monoterapias (Fig. 7g–i). El efecto antineoplásico del co-tratamiento con ASNasa/Olaparib se confirmó en una línea de células de cáncer de colon humano cultivada en 3D (Fig. S8a, b).

En general, estos resultados demuestran que el estrés oxidativo inducido por ASNasa crea una vulnerabilidad al inhibidor de PARP, olaparib, en las células B malignas, y que la combinación de ASNasa con olaparib tiene el potencial de ser una estrategia anticancerígena eficaz.

Los linfomas de células B sensibles a ASNasa sufren una reprogramación metabólica durante la terapia con ASNasa tanto in vitro como in vivo

Anteriormente, demostramos que los linfomas de células B (BCL) que dependen del metabolismo de la fosforilación oxidativa (OxPhos) para la producción de energía son sensibles a la terapia con L-asparaginasa de E. coli (ASNasa), mientras que los BCL dependientes de la glucólisis presentan resistencia^[8]. En el presente estudio, injertamos ratones C57BL/6 de tipo salvaje con células Eµ-Myc dependientes de OxPhos (células B malignas) aisladas de dos ratones transgénicos individuales Eµ-MycTg/+ (#506 o #688). Siete días después, los ratones fueron tratados con vehículo o ASNasa cada 48 h hasta que el linfoma alcanzó el punto final ético (Fig. 1a, b). El tratamiento con ASNasa mostró una eficacia antitumoral significativa, lo que resultó en un retraso en el desarrollo de BCL (Figs. 1a, b y S1a, b). Esto representa la respuesta antineoplásica inicial al tratamiento. Sin embargo, a pesar del tratamiento continuo, todos los ratones finalmente desarrollaron BCL, un resultado que se observó de forma consistente en dos clones independientes de Eµ-Myc (#506 o #688) que mostraron una sensibilidad inicial equivalente al tratamiento con ASNasa in vivo. Esta respuesta secundaria refleja una fase de fracaso terapéutico, que imita la recurrencia del tumor tras una respuesta favorable inicial, como se observa en pacientes con DLBCL refractario/recurrente tratados con una terapia antimetabólica innovadora basada en ASNasa^[8].

Un mecanismo de resurgimiento tumoral durante el tratamiento con ASNasa en entornos clínicos es la producción de anticuerpos anti-ASNasa, que neutralizan la enzima y a menudo se asocian con episodios alérgicos en los pacientes. Para descartar la disminución de la actividad de ASNasa como la causa de la recurrencia del tumor, los ratones recibieron una dosis final de vehículo o ASNasa en el punto final. Cuatro horas después de la administración, los ratones con BCL tratados con ASNasa mostraron concentraciones de asparagina plasmática indetectables y concentraciones de aspartato plasmático elevadas en comparación con los controles tratados con vehículo, lo que indica una actividad de ASNasa sostenida a pesar de la recurrencia de la enfermedad (Fig. S1c).

Independientemente de la entidad tumoral o la dependencia energética, las células cancerosas resistentes a la terapia aumentan con frecuencia las funciones energéticas mitocondriales para promover la supervivencia^[21]–^[24]. En consecuencia, observamos un aumento significativo en la contribución de OxPhos a la producción de ATP en los BCL que progresaron durante el tratamiento con ASNasa in vivo, lo que sugiere una reprogramación metabólica para satisfacer las elevadas demandas de ATP (Fig. S1d).

A continuación, realizamos un análisis metabolómico dirigido en los BCL que se sometieron a tratamiento con vehículo o ASNasa in vivo. El análisis de componentes principales (PCA) y los diagramas de Venn mostraron que el perfil metabólico de los BCL tratados con ASNasa in vivo era distinto del de los BCL tratados con vehículo, independientemente del clon de Eµ-Myc utilizado (Figs. 1c–e y S1e). Diecinueve (14%) metabolitos significativamente desregulados fueron comunes a ambos conjuntos de datos (BCL derivados de células Eµ-Myc #506 o Eµ-Myc #688) y mostraron una regulación direccional similar en respuesta al tratamiento con ASNasa, con 14 metabolitos aumentados y 5 metabolitos disminuidos (Fig. 1f y Datos suplementarios S1). Estos metabolitos compartidos probablemente reflejen las respuestas metabólicas centrales al tratamiento con ASNasa que son independientes del origen del clon Eµ-Myc, lo que sugiere vulnerabilidades metabólicas conservadas en nuestro modelo in vivo.

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos (MSEA) utilizando la herramienta computacional de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG), reveló la desregulación del metabolismo de nucleótidos y aminoácidos (AA) en los BCL tratados con ASNasa (Fig. 1g). Entre los AA proteicos, la serina, la glicina, la tirosina y la asparagina fueron los únicos AA significativamente y consistentemente desregulados en los BCL tratados con ASNasa, cumpliendo el umbral de cambio de pliegue (ASNasa/Vehículo) > 1,25 y el valor p bruto < 0,05, en ambos conjuntos de datos (Figs. 1e y S1e, Tablas S1 y S2). De hecho, los BCL tratados con ASNasa in vivo exhiben un aumento de dos a tres veces en los niveles de serina y glicina en estado estacionario en comparación con los BCL tratados con vehículo (Fig. 1h, i).

Para confirmar que el tratamiento con ASNasa desencadenó una remodelación del metabolismo de la serina en las células malignas, las células Eµ-Myc se cultivaron en medio DMEM carente de asparagina, pero que contenía concentraciones suprfisiológicas de serina y glicina, con (+) o sin (−) suplementación de asparagina y ASNasa. Se utilizó una concentración de 0,003 UI/ml de ASNasa para evitar la hidrólisis de la glutamina en L-glutamato (Fig. S1f). El tratamiento con ASNasa aumentó significativamente la muerte de las células Eµ-Myc en 24 horas (Figs. 1j y S1g, h). Sin embargo, las células Eµ-Myc que sobrevivieron a este estrés nutricional reanudaron la proliferación con el tiempo (Figs. 1k y S1i), un proceso que se acompañó de un aumento significativo de los niveles intracelulares de serina y glicina después de 24 horas de tratamiento con ASNasa (Figs. 1l, m y S1j, k). Para evaluar específicamente las adaptaciones metabólicas a la privación de asparagina (ya que la liberación de aspartato y amonio mediada por la ASNasa puede influir en la respuesta metabólica del tumor), cultivamos células Eµ-Myc en un medio libre de asparagina. Esta configuración experimental aseguró que los cambios metabólicos observados fueran directamente atribuibles a la depleción de asparagina, reforzando así la solidez de nuestras conclusiones. Nuestros hallazgos indican que el tratamiento con ASNasa induce una respuesta metabólica en el BCL, tanto in vitro como in vivo, caracterizada por niveles elevados de serina y glicina en las células B malignas.

Aumento de la biosíntesis de novo de serina en linfomas de células B tratados con ASNasa, in vitro e in vivo

El aumento de los niveles totales de serina en las células malignas puede deberse a una mayor importación de serina a través del transporte activo o a un aumento de la biosíntesis de novo de serina a partir del intermediario glucolítico 3-fosfoglicerato y el glutamato derivado de la glutamina, a través de un proceso enzimático de 3 pasos catalizado por la fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH), la fosfoserina aminotransferasa-1 (PSAT1) y la fosfoserina fosfatasa (PSPH). La proliferación de las células Eµ-Myc no se vio afectada por la eliminación de L-serina/glicina extracelular, independientemente de la disponibilidad de asparagina (Fig. S2a). En línea con un informe previo que describe la asparagina como un factor de intercambio de aminoácidos que facilita la importación de serina ^[25], las células Eµ-Myc con restricción de asparagina mostraron una reducción significativa de la captación extracelular de serina y un aumento de los niveles totales de serina intracelular (Figs. 2a, 1l y S1j). Además, la incubación de células Eµ-Myc en un medio libre de serina/glicina aún produjo un aumento marcado y significativo de la abundancia intracelular de serina y glicina en las células tratadas con ASNasa en comparación con las células de control, lo que sugiere la activación de la vía de biosíntesis de novo de serina y glicina tras 24 horas de tratamiento con ASNasa (Figs. 2b, c). Apoyando esta hipótesis, las células Eµ-Myc privadas de asparagina aumentaron la expresión de ARNm y proteínas de PHGDH, PSAT1, PSPH, junto con la inducción esperada de la asparagina sintetasa (Figs. 2d, e y S2b). La glutamina sintetasa (GLUL), que se ha asociado con la resistencia de las células de sarcoma a la ASNasa [18, 19], se sobreexpresó solo en las células Eµ-Myc privadas de glutamina, pero no en las células Eµ-Myc privadas de asparagina, lo que sugiere una contribución débil de la GLUL a la resistencia secundaria al tratamiento con ASNasa en las células B malignas. El nivel de expresión de la glutamato oxaloacetato transaminasa 1 (GOT1), que no cambió durante el estrés nutricional, indica una regulación selectiva de enzimas metabólicas específicas, lo que es consistente con la sobreexpresión del factor de transcripción ATF4 (Figs. 2d, e y S2c), como ya se ha descrito ^[26]-^[29].

Dado que el nivel de expresión de una enzima metabólica no refleja necesariamente su actividad ^[9], evaluamos la actividad de la PHGDH, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de novo de serina, así como el nivel de serina y glicina sintetizadas de novo mediante el rastreo de [U-13C]-glucosa en las células Eµ-Myc in vitro. Observamos un aumento significativo de la actividad de la PHGDH (Fig. S2d), junto con niveles elevados de serina 13C marcada de novo (M + 3) y glicina 13C marcada (M + 2) derivadas de la [U-13C]-glucosa, en las células Eµ-Myc privadas de asparagina, incluso en un medio que contenía concentraciones suprfisiológicas de ambos aminoácidos (Figs. 2f, g y S2e). Estas células también mostraron niveles aumentados de asparagina 13C marcada (M + 2 y M + 3), lo que es consistente con la asparagina sintetasa activa en condiciones de retirada de asparagina extracelular (Fig. S2f). De manera similar, utilizando α-15N-L-glutamina, detectamos niveles aumentados de serina 15N marcada (M + 1) y asparagina 15N marcada (M + 1) (Figs. S2e, g, h), lo que apoya aún más el aumento de la biosíntesis de novo de serina en las células B malignas expuestas a un entorno libre de asparagina.

In vivo, el BCL obtenido de ratones tratados con ASNasa también muestra una sobreexpresión de PSAT1, PSPH, ASNS y ATF4, aunque la expresión de PHGDH no (Figs. 2h y S2i). No obstante, la actividad de la PHGDH aumentó significativamente en el BCL de los ratones tratados con ASNasa (Fig. 2i). Después de varias semanas de tratamiento con vehículo o ASNasa, los ratones portadores de BCL recibieron dos dosis consecutivas de [U-13C]-glucosa a un intervalo de 20 minutos para cuantificar la serina, la glicina y la asparagina sintetizadas de novo en los tumores (Fig. 2j). Se detectó un enriquecimiento equivalente de glucosa totalmente marcada con carbono (M + 6) en el plasma de los ratones con vehículo y los ratones con BCL tratados con ASNasa (Fig. S3a). Coherente con los datos in vitro, los niveles de serina 13C marcada (M + 3), glicina (M + 2) y asparagina (M + 2) aumentaron significativamente en el BCL tratado con ASNasa, junto con niveles totales elevados de serina, glicina y una disminución de los niveles totales de asparagina, lo que sugiere un aumento de la biosíntesis de novo de serina/glicina y asparagina en el BCL expuesto al tratamiento con ASNasa in vivo (Figs. 2k y S3b-e). Como se informó previamente en ratones WT y en múltiples modelos de cáncer murino ^[30], también confirmamos una concentración elevada de serina en plasma en los ratones con BCL tratados con ASNasa (Fig. S3f).

En conjunto, nuestros resultados demuestran que las células B malignas expuestas a un entorno con restricción de asparagina apoyan la biosíntesis de novo de serina, a pesar de la disponibilidad de serina y glicina en el entorno.

La PHGDH apoya la proliferación de células B malignas sensibles a la ASNasa durante la terapia

A continuación, investigamos si las células B malignas sensibles a la ASNasa aumentan la biosíntesis de novo de serina para facilitar su crecimiento en un entorno con asparagina restringida. Primero, probamos varios inhibidores de la PHGDH disponibles comercialmente, incluidos tres compuestos alostéricos (NCT-503, CBR-5884 y PKUMDL-WQ2101) y un inhibidor competitivo (BI-4916) ^[31]-^[34] en las células Eµ-Myc para evaluar sus efectos sobre la actividad enzimática de la PHGDH y la viabilidad celular. Si bien todos los compuestos exhibieron citotoxicidad dependiente de la concentración in vitro (Fig. S4a-d), solo BI-4916, un inhibidor NAD+/NADH competitivo de la PHGDH permeable a las células y selectivo ^[34], inhibió eficazmente la actividad de la PHGDH en las células Eµ-Myc (Fig. S4e). Con base en estos resultados, se seleccionó BI-4916 para investigaciones adicionales. Cabe destacar que nuestros hallazgos son consistentes con estudios previos que demuestran la eficacia superior de BI-4916 en la inhibición de la biosíntesis de novo de serina en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468, en comparación con los inhibidores alostéricos ^[35]. El tratamiento con 10 µM de BI-4916 inhibió la actividad de la PHGDH en un 80% (Fig. 3a), redujo significativamente los niveles totales de serina intracelular (Fig. S4f) e indujo un aumento promedio significativo del 30% en la muerte de las células Eµ-Myc en 24 horas (Figs. 3b y S4d). Cuando se combinó con ASNasa, BI-4916 mejoró aún más la muerte celular de manera dependiente de la caspasa en 24 horas, en comparación con cualquiera de los tratamientos solos (Figs. 3b y S4g). Además, el cotratamiento con ASNasa/BI-4916 retrasó significativamente el crecimiento de las células Eµ-Myc, lo que subraya la contribución de la actividad de la PHGDH a la adaptación de las células B malignas durante el tratamiento con ASNasa (Fig. 3c). Se obtuvieron efectos similares con otras células Eµ-Myc sensibles a la ASNasa (Fig. S4h, i) y con el inhibidor de la PHGDH competitivo de NAD+/NADH BI-4924, que se modificó químicamente para generar la forma de profármaco esterificado, BI-4916 ^[34] (Fig. S4j, k).

Debido a la inestabilidad intrínseca de BI-4924 y BI-4916, lo que impide su uso en estudios in vivo ^[34], buscamos confirmar que los efectos observados se debieron a la inhibición de la PHGDH dirigida, expresando establemente shRNA dirigido al ARNm de Phgdh murino en las células Eµ-Myc. Dos constructos de shRNA (#1 y #2) redujeron eficazmente los niveles de proteína PHGDH sin alterar los niveles de expresión de PSAT1 o PSPH (Figs. 3d, e). Coherente con la inhibición farmacológica, el silenciamiento de Phgdh sensibilizó las células Eµ-Myc a la muerte celular inducida por la ASNasa y previno la expansión de las células supervivientes in vitro (Figs. 3f, g). In vivo, los ratones tratados con ASNasa y trasplantados con células Eµ-Myc-shPhgdh #1 mostraron un retraso significativo en la progresión del linfoma en comparación con los que portaban células Eµ-Myc-shSCR de control (Fig. 3h), lo que confirma que la PHGDH es un mediador clave de la recurrencia del BCL durante la terapia con ASNasa. Cabe destacar que, al final del estudio, confirmamos niveles reducidos de proteína PHGDH en el BCL de los ratones que portaban células Eµ-Myc-shPhgdh #1, independientemente de los tratamientos (Figs. 3i, j). Por el contrario, la sobreexpresión de PHGDH en las células Eµ-Myc aceleró el desarrollo del BCL tras el tratamiento con ASNasa (Fig. S4l-n), lo que validó aún más el papel de la PHGDH en los mecanismos de resistencia adaptativa.

En conjunto, nuestros resultados destacan el papel fundamental de la actividad de la PHGDH y la biosíntesis de novo de serina en la proliferación de las células B malignas expuestas a un entorno con asparagina restringida.

El tratamiento con ASNasa induce una respuesta metabólica tumoral reversible in vivo

El estrés nutricional prolongado, como el impuesto por semanas de tratamiento con la ASNasa clínicamente utilizada, plantea interrogantes sobre la persistencia de los mecanismos que impulsan la recurrencia del tumor. Para evaluar la reversibilidad de esta adaptación, las células Eµ-Myc que sobrevivieron a 4 días de tratamiento con ASNasa in vitro (1.er desafío) se liberaron de la terapia (células C1). Tras la reexposición a la ASNasa (2.º desafío), las células C1 mostraron una sensibilidad a la ASNasa comparable a la de las células Eµ-Myc parentales (WT) sin quimioterapia, lo que sugiere que la respuesta adaptativa es transitoria (Figs. 4a-c). Este resultado fue consistente en otras células Eµ-Myc sensibles a la ASNasa (Fig. S5a, b).

Los niveles de expresión de PHGDH, PSAT1, PSPH, ASNS y del factor de transcripción ATF4, que inicialmente se sobreexpresaron en las primeras 24 horas, permanecieron elevados durante los 4 días de tratamiento con ASNasa (Figs. 4d y S5c). Tras la retirada de la terapia, los niveles de proteína ASNS y PSPH volvieron a los niveles basales en 24 horas, mientras que los niveles de PSAT1 y PHGDH disminuyeron modestamente a las 72 horas y 96 horas (condición de control del 2.º desafío), respectivamente, lo que es consistente con una disminución dependiente del tiempo del nivel de expresión de ATF4. Tras la reexposición a la ASNasa (2.º desafío), estas enzimas se reindujeron en 24 horas (Figs. 4d y S5c), lo que confirma un proceso regulatorio dinámico y reversible.

In vivo, las células Eµ-Myc aisladas del BCL tratadas con vehículo o ASNasa (1.er desafío in vivo) se retransplantaron en ratones C57BL/6 WT y se sometieron a una segunda ronda de terapia con ASNasa (2.º desafío in vivo). Los ratones trasplantados con células tratadas con ASNasa aún mostraron un beneficio de supervivencia significativo tras el retratamiento (Figs. 4e-g), lo que apoya un modelo de adaptación metabólica flexible y no permanente.

Para evaluar si la respuesta metabólica a la ASNasa era reversible in vivo, realizamos un perfil metabólico de los BCL recolectados después del primer o segundo tratamiento con ASNasa (estudio in vivo). Los tumores de ratones tratados con vehículo (Vehicle-VBCL y Vehicle-ABCL) mostraron perfiles metabólicos distintos en comparación con los tumores de ratones tratados con ASNasa (ASNase-VBCL y ASNase-ABCL), independientemente del origen del tumor (VBCL o ABCL). Es importante destacar que los tumores recolectados de ratones tratados con vehículo (Vehicle-VBCL y Vehicle-ABCL) mostraron una firma metabólica muy similar, a pesar de que Vehicle-ABCL se originó a partir de células ABCL, es decir, células B malignas que ya se habían adaptado al tratamiento con ASNasa, lo que sugiere un fenotipo de resistencia transitorio (Fig. 4h). Entre las vías metabólicas más significativamente desreguladas en ASNase-ABCL en comparación con Vehicle-ABCL, el metabolismo de la serina/glicina fue prominente, lo que coincide con hallazgos previos (Fig. S5d). Los BCL tratados con ASNasa mostraron niveles elevados de serina y niveles reducidos de asparagina, mientras que se observó el patrón opuesto en los BCL tratados con vehículo, lo que subraya una reprogramación metabólica dinámica (Fig. 4i). En línea con los resultados in vitro (Figs. 4d y S5c), la inducción de la expresión de PSAT1, PSPH y ASNS en los BCL después del primer estudio in vivo con ASNasa fue transitoria, ya que sus niveles de expresión disminuyeron en Vehicle-ABCL de ratones tratados con vehículo (o se mantuvieron en ASNase-ABCL de ratones tratados con ASNasa) después del segundo estudio in vivo (Figs. 4j y S5e). En conjunto, nuestros datos resaltan la plasticidad metabólica de las células B malignas expuestas a la terapia con ASNasa.

La actividad de PHGDH limita el estrés oxidativo inducido por la ASNasa en las células B malignas

Dado que la privación de aminoácidos o glucosa induce estrés oxidativo^[36],^[37], determinamos si el tratamiento con ASNasa induce estrés oxidativo en las células Eµ-Myc y cómo se adaptan estas células Eµ-Myc sensibles a la ASNasa. Las células Eµ-Myc privadas de asparagina mostraron niveles elevados de ROS y una mayor relación oxidada/reducida de glutatión (GSSG/GSH) (Figs. 5a, b y S6a, b). Este estrés oxidativo se acompañó de la estabilización de la proteína NRF2 (factor nuclear relacionado con el factor eritroide 2), que a su vez activó la transcripción de los genes de respuesta antioxidante canónica, incluido el Gclc (subunidad catalítica de la glutamato-cisteína ligasa), el Gclm (subunidad modificadora de la glutamato-cisteína ligasa), que son las primeras enzimas limitantes de la biosíntesis de glutatión, así como la NAD(P)H quinona deshidrogenasa 1 (Nqo1) (Fig. 5c-e).

Dado que se induce la expresión de Gclc, Gclm y el gen diana de NRF2, slc6a9 (miembro 9 de la familia de transportadores de solutos)^[38], que codifica un transportador de glicina, verificamos si la síntesis de glutatión, que requiere cisteína, glutamato y, en última instancia, glicina, se mejoraba en las células Eµ-Myc privadas de asparagina. Detectamos niveles aumentados de GSH marcada con 13C (M+2) derivados de la 13C2-glicina (Fig. S6d, e), lo que indica una síntesis activa de glutatión en las células Eµ-Myc privadas de asparagina. Cabe destacar que la glicina parece ser catabolizada específicamente en la biosíntesis de glutatión, como lo demuestra una reducción significativa en la abundancia de los productos posteriores del metabolismo de la glicina y una disminución de los niveles de 13C-ATP (M+2) (Fig. S6f).

Dado que la biosíntesis de novo de serina también contribuye a la glicina para la defensa antioxidante, y dado que se observaron niveles aumentados de 13C3-serina y 13C2-glicina derivados de [U-13C]-glucosa en las células tratadas con ASNasa (Fig. 2f, g), hipotetizamos que esta vía apoya la homeostasis redox. La inhibición de PHGDH con BI-4916 aumentó significativamente los niveles de ROS, lo que indica que la biosíntesis de novo de serina desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis redox en las células Eµ-Myc en condiciones basales (Fig. 5f, g). Además, las células tratadas con BI-4916 en un medio sin Asn o con la combinación BI4916/ASNasa en un medio que contiene Asn mostraron niveles más altos de ROS en comparación con los observados con cada tratamiento individual, lo que apoya la contribución de la biosíntesis de novo de serina a la homeostasis redox en las células Eµ-Myc tratadas con ASNasa (Fig. 5f, g). En consecuencia, la eliminación de ROS con N-acetil-L-cisteína (NAC) previno la muerte celular inducida por BI-4916, ya sea solo o en combinación con ASNasa (Fig. 5h).

Para promover una respuesta antioxidante eficaz, las células cancerosas no solo deben satisfacer una alta demanda de glicina, sino también de cisteína, el precursor limitante de la biosíntesis de glutatión^[39]–^[41]. Debido al entorno tumoral oxidante, la cisteína extracelular es inestable y se convierte rápidamente en cistina. Por lo tanto, la mayoría de las células cancerosas dependen del transporte de cistina, que se importa y se reduce a cisteína en el citosol, o de la biosíntesis de novo de cisteína. Sorprendentemente, las células Eµ-Myc recolectadas de 12 ratones transgénicos Eµ-Myc Tg/+ carecían de niveles detectables de ARNm de slc7a11, el miembro 7 de la familia de transportadores de solutos (también llamado xCT), que es el principal antiporter de la membrana plasmática que media en la captación de cistina extracelular a cambio de glutamato (Fig. 5i). El ARNm de slc7a11 permaneció indetectable mediante qPCR en las células Eµ-Myc tratadas con ASNasa durante 72 horas in vitro o mediante RNAseq en los BCL expuestos a varias semanas de tratamiento con ASNasa in vivo (Figs. 5j y S6g). Otros transportadores de cisteína, slc7a9 y slc3a1, también estaban ausentes, mientras que slc3a2 (también llamado cd98), que codifica la chaperona para los transportadores xCT y LAT, se expresaba de forma ubicua (Fig. 5i, j). El análisis de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) confirmó que el DLBCL humano exhibe una baja expresión de ARNm de slc7a11 (Fig. 5k), un hallazgo reforzado por los datos de RNA-seq de 775 muestras de DLBCL humano^[42], que mostraron que el 7,28% expresó poco o ningún nivel detectable de ARNm de slc7a11, a pesar de la expresión heterogénea de ARNm de slc3a2 (Fig. S6h, i). La sobreexpresión de SLC7A11 murino en las células Eµ-Myc deficientes en slc7a11 atenuó la muerte inducida por la inhibición de PHGDH sola o en combinación con ASNasa (Fig. 5l-n). En conjunto, nuestros resultados resaltan el papel de PHGDH en la mitigación del estrés oxidativo inducido por la ASNasa en las células B malignas.

El estrés oxidativo inducido por la ASNasa reveló una vulnerabilidad terapéutica al inhibidor de PARP1/2 clínicamente utilizado en las células B malignas sensibles a la ASNasa in vitro

A continuación, nuestro objetivo fue ampliar nuestra investigación sobre las posibles consecuencias de la alteración de la homeostasis redox en las células B malignas tratadas con ASNasa. Dado que la acumulación de ROS puede inducir roturas de ADN de una o dos hebras, buscamos determinar si el estrés oxidativo inducido por la ASNasa desencadena daño en el ADN.

Las células Eµ-Myc con restricción de asparagina mostraron un aumento de la fosforilación de la histona H2AX en Ser139 (γH2AX), junto con la activación de la vía de respuesta al daño del ADN dependiente de ATR (DDR) (Fig. 6a-d). Esto se evidenció por la fosforilación de ATR en Ser428 y sus sustratos aguas abajo Chk1 en Ser345 y RPA32 en Ser33, in vitro e in vivo (Figs. 6c, d y S7a, b), lo que indica la presencia de daño en el ADN. En contraste, la DDR dependiente de ATM no se activó, ya que KAP1, un sustrato aguas abajo de ATM, no se fosforiló en Ser824 en las células Eµ-Myc con restricción de Asn in vitro (Fig. 6c, d).

La eliminación de ROS con NAC redujo los niveles de γH2AX, lo que confirma que el estrés oxidativo contribuye al daño en el ADN inducido por la ASNasa (Fig. 6e, f). Por el contrario, la inhibición de PHGDH aumentó modestamente los niveles de γH2AX en las células tratadas con ASNasa (Fig. 6g, h). En consecuencia, la sobreexpresión de PHGDH en las células Eµ-Myc (Fig. S4l, m) atenuó significativamente los niveles de expresión de γH2AX y la activación de la DDR dependiente de ATR durante la terapia con ASNasa in vivo (Fig. 6i, j). Esto apoya un papel protector de la biosíntesis de novo de serina en la preservación de la estabilidad del genoma.

Tras una respuesta al daño del ADN dependiente de ATR, las enzimas asociadas a la cromatina, la poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) y PARP2, catalizan la síntesis y la transferencia de polímero de ADP-ribosa (PAR) desde el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) a sus residuos de serina, tirosina y glutamato (auto-PARilación), activándolas. A su vez, las PARP activadas permiten la PARilación de las proteínas diana, promoviendo su reclutamiento en las roturas del ADN para una reparación eficaz del ADN. Nuestro objetivo fue investigar si PARP se activaba en las células Eµ-Myc tratadas con ASNasa, ya que esto podría representar una vulnerabilidad tumoral explotable terapéuticamente utilizando inhibidores de PARP1/2 clínicamente aprobados. Observamos un aumento en la expresión de proteínas que contienen motivos de poli(ADP-ribosa), lo que indica una mayor actividad de PARP en las células Eµ-Myc con restricción de asparagina (Fig. 7a). Los inhibidores de PARP, como el olaparib, compiten con el NAD+ por el sitio catalíticamente activo de PARP, impidiendo así el inicio de los mecanismos de reparación del ADN. Para interferir con la reparación del ADN en las células tratadas con ASNasa, buscamos probar los efectos del co-tratamiento con ASNasa/olaparib en las células Eµ-Myc in vitro y en entornos in vivo. Esta combinación terapéutica mejoró la muerte celular dependiente de la caspasa en dos líneas de Eµ-Myc dependientes de la fosforilación oxidativa (OxPhos) (#506 y #688), superando el efecto de cada agente por separado (Fig. 7b-d). Cuando se co-trataron con olaparib (0,3 µM), las células Eµ-Myc tratadas con ASNasa no reanudaron la proliferación in vitro (Fig. 7e, f). In vivo, el co-tratamiento con ASNasa (cada 48 horas) y olaparib (diario) retrasó significativamente la pérdida de peso y la aparición de BCL en los ratones C57BL/6, en comparación con las monoterapia (Fig. 7g-i). El efecto antineoplásico del co-tratamiento con ASNasa/olaparib se confirmó en una línea de cáncer de colon humano cultivada en 3D (Fig. S8a, b).

En general, estos resultados demuestran que el estrés oxidativo inducido por la ASNasa crea una vulnerabilidad al inhibidor de PARP olaparib en las células B malignas, y que la combinación de ASNasa con olaparib tiene el potencial de ser una estrategia anticancerígena eficaz.

Discusión

Nuestro estudio revela que el tratamiento con ASNasa clínicamente utilizado induce estrés oxidativo y daño asociado al ADN en las células B malignas, desencadenando así una dependencia compensatoria de la biosíntesis de serina impulsada por PHGDH para restaurar el estrés redox y de la reparación del ADN mediada por PARP para resolver el daño. La inhibición farmacológica de PARP con olaparib sensibiliza significativamente las células B malignas a la ASNasa, lo que confirma la importancia funcional de esta respuesta adaptativa. Este cruce metabólico-daño en el ADN no solo apoya la supervivencia de las células tumorales bajo el estrés nutricional inducido por el tratamiento, sino que también expone una vulnerabilidad terapéutica. Nuestros hallazgos proporcionan, por lo tanto, una sólida base para estrategias combinadas dirigidas a PARP en las células B malignas tratadas con ASNasa utilizando inhibidores de PARP clínicamente aprobados, para mejorar la eficacia y la durabilidad de las terapias basadas en ASNasa.

La mayoría de los estudios que investigan los mecanismos de resistencia al tratamiento con ASNasa en líneas de células cancerosas sólidas y hematológicas se han centrado en la resistencia primaria, con el objetivo de identificar estrategias terapéuticas para eliminar las células cancerosas resistentes a la ASNasa^[10],^[11],^[18]–^[20],^[43]–^[46]. Varios estudios de selección CRISPR-Cas9 han identificado determinantes de la sensibilidad a la ASNasa en líneas de células resistentes expuestas a ASNasa a largo plazo (10-20 días in vitro)^[43],^[45],^[46] o in vivo en ratones inmunodeficientes^[20]. Uno de estos estudios destacó la sobreexpresión de PHGDH, PSAT1 y PSPH, las tres enzimas implicadas en la biosíntesis de novo de serina, en las células de melanoma resistentes a la ASNasa con la asparagina sintetasa eliminada^[45]. Sin embargo, no se estableció si la biosíntesis de novo de serina se mejora funcionalmente en las células resistentes y si sus enzimas impulsan la resistencia.

Utilizando linfomas de células B sensibles a la ASNasa, nuestro estudio identificó otros determinantes clave de la recurrencia tumoral durante la terapia con ASNasa, tras una respuesta antineoplásica inicial, que se asemeja a la resistencia secundaria observada en pacientes con linfoma difuso de células B en recaída o refractario (R/R)^[8]. Observamos niveles elevados de serina sintetizada de novo y un aumento del estrés oxidativo en las células B malignas tratadas con ASNasa. Identificamos a PHGDH como un mediador clave de esta respuesta adaptativa al mitigar la acumulación de ROS, lo que permite el crecimiento de las células B malignas sometidas a estrés terapéutico. Estos hallazgos son consistentes con un estudio reciente que muestra que los linfomas impulsados por Eµ-Myc dependen de la biosíntesis de serina de novo para la progresión de la enfermedad, lo que destaca la importancia funcional de PHGDH en los linfomas de células B humanos^[47]. Dado que la asparaginasa sintetasa es un determinante clave en la resistencia a la ASNasa, aún queda por determinar si la activación de la biosíntesis de serina de novo en las células tratadas con ASNasa depende de su capacidad para reponer niveles suficientes de asparagina mediante la regulación al alza y/o la activación de la asparaginasa sintetasa durante el tratamiento in vitro e in vivo.

Curiosamente, los ciclos de terapia con ASNasa y la interrupción del fármaco en células B malignas que no han recibido quimioterapia, demostraron que sus células hijas seguían siendo sensibles a la reexposición a la terapia, una adaptación tumoral transitoria observada in vitro e in vivo. Además, esta respuesta adaptativa intrínseca al tumor implicó un remodelamiento metabólico flexible, que involucra la biosíntesis de novo de serina, glicina, glutatión y asparagina, probablemente impulsada por un programa transcripcional dinámico dependiente de ATF4 y NRF2 que contrarresta el estrés oxidativo inducido por la ASNasa y facilita la reentrada en el ciclo celular. En consonancia con nuestros resultados, la restricción de asparagina induce estrés oxidativo y una respuesta al estrés dependiente de NRF2 en las células T CD8+, mejorando su proliferación y funciones efectoras^[48]–^[51].

También demostramos que la privación de asparagina induce estrés oxidativo y daño al ADN. Las células B malignas tratadas con ASNasa activaron la vía de respuesta al daño del ADN dependiente de ATR y exhibieron una actividad elevada de PARP, lo que sugiere estrés en la replicación. En consecuencia, las células BCL tratadas con ASNasa son muy sensibles al inhibidor de PARP Olaparib, tanto in vitro como in vivo, lo que implica que PARP es un determinante de la recurrencia de BCL durante el tratamiento con ASNasa. Nuestros hallazgos son consistentes con estudios previos que muestran que PARP desempeña un papel clave en los mecanismos de reparación del ADN tras las roturas de ADN de una sola cadena inducidas por peróxido de hidrógeno^[52] y para mantener la integridad genómica en las células B^[53]. En particular, la pérdida de PARP2 aumenta el estrés en la replicación e impide la progresión de BCL en el modelo Eµ-Myc^[53].

En general, nuestro estudio reveló una interacción entre la disponibilidad de aminoácidos, el metabolismo redox y la integridad del genoma, con PHGDH y PARP como reguladores críticos. En línea con nuestros hallazgos, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) dirigida por NRF2, se demostró recientemente que regula el metabolismo del NAD y la parilación basal, vinculando el control redox a la integridad de la replicación del ADN en las células de cáncer colorrectal con mutación en p53^[54]. Si la reprogramación metabólica inducida por la ASNasa influye en la biosíntesis de NAD⁺ para regular la activación de PARP y los mecanismos de reparación del ADN en las células malignas, requiere más investigación.

Es importante destacar que las muestras de leucemia linfoblástica aguda (LLA) humana resistentes al tratamiento con ASNasa mostraron un enriquecimiento de genes involucrados en la reparación de roturas de doble cadena mediante la replicación inducida por roturas^[55], lo que refuerza nuestra observación de que la asparagina preserva la estabilidad del genoma en las células malignas.

Una característica clave de los inhibidores de PARP es su eficacia para atacar los cánceres sólidos con defectos en la recombinación homóloga (HR), con mayor frecuencia debido a mutaciones en BRCA1/2 de origen germinal o somático. La deficiencia de HR es prevalente en los cánceres avanzados de mama, ovario y páncreas metastásico, y es un factor clave que predice la respuesta tumoral a la inhibición de PARP^[56],^[57]. Aunque las mutaciones en BRCA1/2 son raras en las neoplasias hematológicas, un estudio reciente proporcionó una sólida justificación para el uso de inhibidores de PARP en subconjuntos de linfoma difuso de células B con deficiencia de HR. Específicamente, se demostró que la inhibición de PARP se sinergiza con las quimioterapias basadas en anti-CD20 en un subtipo de linfoma difuso de células B humano caracterizado por la deficiencia de recombinación homóloga impulsada por el dominio LIM 2 (LMO2), una característica que no se observa en el linfoma difuso de células B que carece de LMO2^[58]. LMO2 es una proteína rica en cisteína que impide el reclutamiento de BRCA1 en las roturas de la cadena de ADN^[58]. Las células Eµ-Myc malignas utilizadas en nuestro estudio expresan niveles variables de ARNm de lmo2 (Fig. 5i–j), lo que puede explicar, en parte, su sensibilidad al tratamiento con Olaparib, particularmente en combinación con ASNasa. Se necesitarían más investigaciones para caracterizar exhaustivamente el estado de HR de los linfomas Eµ-Myc y los mecanismos que lo regulan. No obstante, el efecto antineoplásico del co-tratamiento con ASNasa/Olaparib se confirmó en las células de cáncer colorrectal humano con HR competente (HCT-116) cultivadas en 3D, lo que sugiere que otros cánceres con HR competente podrían beneficiarse de esta estrategia combinada. Evaluar la toxicidad en las células no cancerosas (por ejemplo, células inmunitarias, hepatocitos, cardiomiocitos) o en los tejidos normales en ratones WT tratados requeriría estudios farmacológicos dedicados para garantizar los efectos específicos en las células cancerosas. Dicho esto, el Olaparib está bien tolerado en las células normales con HR funcional^[59], lo que posiblemente ofrece una ventana terapéutica en la que las células malignas serían el objetivo preferente del co-tratamiento con ASNasa/Olaparib.

En general, nuestro estudio arroja luz sobre la respuesta metabólica tumoral dinámica y flexible durante la terapia con ASNasa. Estas ideas no solo mejoran nuestra comprensión de los mecanismos metabólicos que facilitan la resistencia a un fármaco aprobado clínicamente, sino que también revelan una estrategia de combinación clínicamente viable para mejorar el índice terapéutico de la ASNasa y abordar los linfomas de células B agresivos mediante la combinación de ASNasa y Olaparib. Si bien los inhibidores de PARP se están evaluando actualmente en combinación con radiación, agentes alquilantes, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de PI3K e inmunoterapias^[60], nuestros hallazgos establecen una prueba de concepto de que la inhibición de PARP se puede combinar eficazmente con un fármaco metabólico, la ASNasa, en los linfomas de células B. En conjunto, nuestros hallazgos revelaron un camino claro para desarrollar una estrategia antitumoral que combine ASNasa e inhibidor de PARP1/2, ofreciendo una alternativa terapéutica para los pacientes tratados con ASNasa u Olaparib, para prevenir la recurrencia tumoral.

Métodos

Ratones

Los ratones transgénicos C57BL/6 Eµ-Myc (Eµ-MycTg/+) se compraron en el Jackson Laboratory (002728) y se crían y mantienen en nuestra instalación local de animales (C3M, INSERM U 1065, Niza, Francia, B 06-088-20). Los ratones de tipo salvaje (WT) C57BL/6JOlaHsd se compraron en Envigo y se alojaron en nuestra instalación local de animales. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos y se mantuvieron en ciclos de luz/oscuridad de 12 horas a 20–24 °C y 50–55 % de humedad. Para todos los experimentos con ratones, se proporcionó alimento (SAFE R04, Safe Lab) ad libitum. Todos los procedimientos de cuidado de los animales, los experimentos y el mantenimiento cumplieron con los protocolos (n.º APAFIS#25228-2020032917261458 v9) aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC de la Universidad de Niza, Côte d’Azur) y el Ministère de la Recherche et de l’Innovation.

Líneas celulares

Las células Eµ-Myc primarias se aislaron de ratones macho o hembra individuales Eµ-MycTg/+ como se describió previamente y se caracterizaron^[8],^[61]. En particular, las células Eµ-Myc #506 y Eµ-Myc #688 dependientes de OxPhos se derivaron del linfoma de células B de hembras Eµ-MycTg/+ #506 y #688, respectivamente. Estas células se mantuvieron en medio DMEM-GlutaMAX (31966047, Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS) (F7524, Sigma), 50 µM de 2-mercaptoetanol (31350010, Thermo Fisher Scientific), 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma), 10 mM de HEPES pH 7,4 (15630056, Thermo Fisher Scientific) y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific). Las células 293T (CRL-1573, ATCC) se mantuvieron en medio DMEM-GlutaMAX (31966047, Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10 % de FBS y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y se utilizaron para producir vectores retrovirales VSV-G. La línea celular de carcinoma pulmonar murino (LLC) (CRL1642, ATCC) se mantuvo en medio DMEM-GlutaMAX (31966047, Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10 % de FBS y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. La línea celular de carcinoma de colon murino CT26 (CRL-2638, ATCC) se mantuvo en medio RPMI-GlutaMAX (61870044, Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10 % de FBS, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y 1 mM de piruvato de sodio (11360070, Thermo Fisher Scientific). La línea celular de adenocarcinoma de colon murino MC38 (SCC172, Sigma) se mantuvo en medio DMEM-F12-GlutamaX (31331028, Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10 % de FBS, 1 mM de piruvato de sodio y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. La línea celular de carcinoma de colon humano HCT116 (CVCL_0291) se obtuvo de ATCC, se cultivó de forma rutinaria en medio McCoy (16600082, Thermo Fisher Scientific), suplementado con 10 % de FBS y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio están libres de micoplasma y se prueban de forma rutinaria para detectar micoplasma.

Medios para estudios in vitro

El medio libre de asparagina se refiere al medio DMEM con alta concentración de D-glucosa (4,5 g/L), sin L-glutamina, sin piruvato (11960044, Thermo Fisher Scientific), suplementado con 10 % de FBS (F7524, Sigma), 3–50 µM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES pH 7,4, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio (11360070, Thermo Fisher Scientific), 2 mM de L-glutamina (25030081, Thermo Fisher Scientific). Este medio contiene una concentración suprafisiológica de serina y glicina.

El medio que contiene asparagina se refiere al medio libre de asparagina descrito anteriormente, suplementado con L-asparagina (0,37 mM).

El medio libre de asparagina, serina y glicina se refiere al medio MEM sin L-glutamina (21090022, Thermo Fisher Scientific), suplementado con 10 % de FBS (F7524, Sigma) dializado (132724, Membrana de diálisis estándar RC Tubing, MWCO 3,5 kDa, Spectra/Por®3), 50 µM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES pH 7,4, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, 20 mM de D-glucosa (J60067, Thermo Fisher Scientific), 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 1 % de cóctel de vitaminas (11120052, Gibco).

El medio libre de glucosa y asparagina se refiere al medio DMEM sin L-glutamina, sin piruvato (A14430-01, Thermo Fisher Scientific), suplementado con 10 % de FBS (F7524, Sigma), 50 µM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES pH 7,4, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina. Este medio contiene una concentración suprafisiológica de serina y glicina.

Formulación de ASNasa

Para todos los experimentos in vitro, se utilizó la L-asparaginasa II nativa de Escherichia-coli (ASNasa) (Kidrolase®, Jazz Pharmaceutical). Para los estudios in vivo presentados en las Figuras 1, 2, 4, S3 y S5, utilizamos Kidrolase®, y para los estudios in vivo en las Figuras 3, 6, 7 y S3, utilizamos la proteína recombinante de L-asparaginasa II nativa de Escherichia-coli (Spectrila®).

Transferencia in vivo de células Eµ-Myc y experimentos de supervivencia

Se transfirieron células primarias de ratón Eµ-Myc #506 o #688 mediante inyección intravenosa (I.V) (100.000 células viables por ratón receptor) a ratas C57BL/6JOlaHsd hembras, sin transgénicos y de 6 semanas de edad (Envigo), que son menos propensas a pelear en comparación con los machos. Siete días después, se trató a los ratones cada 48 horas mediante inyección intraperitoneal (I.P) con vehículo (NaCl 0.9%) o 2500 UI/kg de la E. coli L-asparaginasa nativa (Kidrolase®, Jazz Pharmaceutical) o recombinante (Spectrila®) hasta que el linfoma alcanzó el límite ético. La asparaginasa se diluye en NaCl 0.9%. La aparición del tumor se evaluó mediante palpación del ganglio linfático inguinal. El límite ético (punto final de la enfermedad) se definió utilizando una puntuación clínica asociada a la enfermedad aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC de la Universidad de Niza, Côte d’Azur) y el Ministère de la Recherche et de l’Innovation (n° APAFIS#25228-2020032917261458 v9). Una vez que se detectó la aparición del tumor inguinal, se registraron diariamente las puntuaciones clínicas asociadas a la enfermedad para cada ratón. Cuando se alcanzó la puntuación máxima, los ratones tratados con vehículo y con asparaginasa recibieron una inyección final de vehículo o asparaginasa, respectivamente, y se sacrificaron tres o cuatro horas después mediante dislocación cervical. A continuación, se recolectó sangre mediante punción cardíaca, se colocó en tubos recubiertos con heparina de litio (BD Microtainer), se centrifugó a 6000 × g durante 2 minutos para aislar el plasma. Las muestras de plasma se recolectaron, se congelaron rápidamente y se almacenaron a −80 °C para el análisis metabolómico. La supervivencia de los ratones, definida como la probabilidad de supervivencia (%), se determinó como el tiempo transcurrido entre la inyección I.V de las células Eµ-Myc y el momento en que los ratones tuvieron que ser sacrificados por razones éticas cuando la progresión del linfoma alcanzó el punto final. El porcentaje de ratones libres de tumores (%) se determinó como el tiempo transcurrido entre la inyección I.V de las células Eµ-Myc y el momento en que se pudo palpar un linfoma inguinal.

Para el segundo desafío terapéutico in vivo, se inyectaron por vía intravenosa (I.V) 100.000 células Eµ-Myc viables por ratón receptor a ratas C57BL/6JOlaHsd hembras, sin transgénicos y de 6 semanas de edad (Envigo). Las células Eµ-Myc utilizadas se obtuvieron de BCL después del primer desafío terapéutico in vivo. Siete días después, se trató a los ratones con vehículo o asparaginasa a la misma concentración, frecuencia y vía de administración que se mencionó anteriormente.

Para el co-tratamiento in vivo con asparaginasa y olaparib, se inyectaron por vía intravenosa 100.000 células Eµ-Myc viables por ratón receptor a ratas C57BL/6JOlaHsd hembras, sin transgénicos y de 6 semanas de edad (Envigo). Siete días después, se trató a los ratones con vehículo o con 50 mg/kg de olaparib (I.P diario) o 2500 UI/kg de Spectrila (I.P cada 48 horas) o con la combinación de ambos fármacos (I.P diario de olaparib 50 mg/kg y Spectrila, 2500 UI/kg, I.P cada 48 horas). El olaparib (HY-10162, MCE) se disolvió en DMSO a una concentración de 100 mg/ml y luego se diluyó a 5 mg/ml en una solución de sulfobutiléter-β-ciclodextrina al 20% (HY-17031, MCE, diluida en NaCl 0.9%). El vehículo consiste en inyecciones I.P diarias de una solución de DMSO al 5%/sulfobutiléter-β-ciclodextrina al 95% (en 20% en NaCl 0.9%) y/o I.P de NaCl 0.9% cada 48 horas.

Las funciones de supervivencia se estimaron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon con la prueba de rango logarítmico.### Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real

Se extrajo ARN total de las células Eµ-Myc utilizando el kit RNeasy mini (74104, Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó a partir de 2 µg de ARN utilizando el kit Omniscript RT (205113, Qiagen). Los niveles relativos de ARNm se obtuvieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) en el sistema StepOne™ Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) utilizando el conjunto de cebadores TaqMan para el Phgdh (Mm01623589g1), Psat1 (Mm01613328g1), Psph (Mm01197775m1), Gls (Mm01257297m1), Gclc (Mm00802658m1), Gclm (Mm01324400m1), Nqo1 (Mm01253561m1), slc7a11 (Mm00442530m1), slc6a9 (Mm00433662m1), Asns (Mm01137310g1) (murino) y el TaqMan Universal PCR Master Mix (4304437, Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. La qPCR se realizó a partir de 8 ng de ADNc, excepto para la amplificación de slc7a11, para la cual se utilizaron 100 ng de ADNc. Los niveles relativos de ARNm se normalizaron con el Rplp0 murino (Mm00725448_s1, Thermo Fisher Scientific) y con la condición de control (+Asn, 0.37 mM).### Datos de RNAseq

Los archivos de alineación de secuenciación de ARN (RNA-seq) y la información clínica del estudio EGAS00001002606^[42] se descargaron del European Genome-phenome Archive. La cuantificación de los genes se realizó utilizando featureCounts v1.5.0-p3 basada en las anotaciones Ensembl GTF release 75. Los datos de RNA-seq se normalizaron utilizando el paquete Bioconductor DESeq2. Dieciocho (de 775) muestras que no mostraban expresión de Rplp0 se eliminaron del análisis.

Los datos de RNA-seq de muestras humanas (cánceres sólidos y cánceres hematológicos) se recuperaron y descargaron del programa The Cancer Genome Atlas (TCGA, https://portal.gdc.cancer.gov/) a través del sitio web Gene Expression Profiling Interactive Analysis (http://gepia.cancer-pku.cn). Los niveles de ARNm de slc7a11 se representaron en transcritos por millón (TPM). HNSC, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; LUSC, carcinoma de células escamosas de pulmón; LUAD, adenocarcinoma de pulmón; LGG, glioma de bajo grado del cerebro; GBM, glioblastoma multiforme; STAD, adenocarcinoma de estómago; SKCM, melanoma cutáneo; COAD, adenocarcinoma de colon; DLBCL, linfoma difuso de células B grandes; LAML, leucemias mieloides agudas.

La secuenciación de ARN de las células Eµ-Myc cultivadas in vitro y de las células BCL derivadas de Eµ-Myc tratadas con vehículo y asparaginasa in vivo, se realizó en Illumina NextSeq500 en la plataforma de genómica funcional del IPMC (Francia). Las bibliotecas se generaron utilizando el kit Truseq Stranded mRNA (Illumina), a partir de 1 µg de ARN total extraído de diferentes líneas celulares de Eµ-Myc aisladas de 12 ratones transgénicos Eµ-MycTg/+ individuales y de linfomas de células B obtenidos de ratones injertados con células Eµ-Myc #506 y tratados con vehículo o asparaginasa durante varias semanas. Las bibliotecas se cuantificaron con el kit Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Invitrogen) y se agruparon. Se cargaron 4 nM de este grupo en un flujo de alto rendimiento NextSeq 500 y se secuenciaron en una plataforma NextSeq 500 (Illumina) con química de emparejamiento de extremos de 2  ×  75 bp. Las lecturas se mapearon con STAR 2.4.0a en el genoma del ratón (versión mm10). El conteo se realizó con featureCounts (subread-1.5.0-p3-Linux-x8664, opciones “—primary -g genename -p -s 1 -C”) utilizando la versión Ensembl GRCm38.83. Los conteos brutos se transformaron en valores de fpkm (fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas) para normalizar tanto la profundidad de la secuenciación como la longitud del gen. Los valores de expresión se muestran como log2(fpkm).### Construcciones de ADN

Para amplificar el ADNc murino de Asns o Phgdh, se extrajo ARN total de las células Eµ-Myc y se realizó la transcripción inversa como se mencionó anteriormente. La secuencia codificante murina de Phgdh (sin codón de parada) se amplificó por PCR utilizando una ADN polimerasa Taq recombinante (10342020, Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante y con los siguientes cebadores: directo 5′-GCAATGGCCTTCGCAAATCTGC-3′ y reverso 5′-GGAGCCAGCCCAGGCGT-3′. El producto de PCR se clonó en el vector pCR™ 2.1-TOPO® TA utilizando el kit TOPO™ TA Cloning™ Kit (K455040, Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. El plásmido TOPO-Phgdh resultante se amplificó en células competentes MAX Efficiency Stbl2 (E.Coli) (10268019, Thermo Fisher Scientific) con selección de ampicilina (A9518, Sigma), se purificó (740414.50, Macherey-Nagel) y se secuenció para confirmar la clonación de la secuencia codificante murina Phgdh de tipo salvaje. Una vez confirmado, la secuencia codificante de Phgdh marcada con V5 se sub-clonó desde el vector TOPO-Phgdh en el vector retroviral codificado con GFP pMIG (9044, Addgene), mediante PCR con los siguientes cebadores: directo 5′-GAGAGTCGACATGGCCTTCGCAAATCTGC-3′ y reverso 5′-GGTTAACTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGAAGCAGAACTGGAAAGCCTCCAATAC-3′. Luego, el amplicon se digirió utilizando las enzimas de restricción SalI (R3136S, New England Biolabs) y HpaI (R0105S, New England Biolabs). El vector pMIG se linealizó utilizando las enzimas de restricción XhoI (R0146S, New England Biolabs) y HpaI para generar extremos cohesivos compatibles. El vector pMIG digerido se desfosforiló con fosfatasa antártica (MO289S, Biolabs). El siguiente fragmento de ADN de doble cadena que contiene la secuencia codificante del slc7a11 murino con los sitios de restricción BglII y EcoRI se sintetizó (Thermo Fisher Scientific): “ GGGGAGATCTATGGTCAGAAAGCCAGTTGTGGCCACCATCTCCAAAGGAGGTTACCTGCAGGGCAATATGAGCGGGAGGCTGCCCTCCATGGGGGACCAAGAGCCACCTGGGCAGGAGAAGGTAGTTCTGAAAAAGAAGATCACTTTGCTGAGGGGGGTCTCCATCATCATCGGCACCGTCATCGGATCAGGCATCTTCATCTCCCCCAAGGGCATACTCCAGAACACGGGCAGCGTGGGCATGTCCCTGGTTTTCTGGTCTGCCTGTGGAGTACTGTCACTTTTTGGAGCCCTGTCCTATGCAGAATTAGGTACAAGCATAAAGAAATCTGGTGGTCATTACACATACATTCTGGAGGTCTTTGGTCCTTTGCTGGCTTTTGTTCGAGTCTGGGTGGAACTGCTCGTAATACGCCCTGGAGCTACTGCTGTGATATCCCTGGCATTTGGACGCTACATCCTGGAACCATTTTTTATTCAATGTGAAATTCCTGAACTTGCAATCAAGCTCGTGACAGCTGTGGGCATCACTGTGGTGATGGTCCTAAATAGCACGAGTGTCAGCTGGAGTGCCCGGATCCAGATTTTCCTAACCTTTTGCAAGCTCACAGCAATTCTGATAATTATAGTCCCTGGAGTTATACAGCTAATTAAAGGGCAAACACATCACTTTAAAGATGCATTTTCAGGAAGAGACACAAGTCTAATGGGGTTGCCCTTGGCTTTTTATTATGGGATGTATGCATATGCTGGCTGGTTTTACCTCAACTTTATTACTGAAGAAGTAGACAACCCTGAAAAAACCATCCCCCTTGCAATCTGCATCTCCATGGCTATCATCACAGTGGGCTACGTACTGACAAACGTGGCCTATTTTACCACCATCAGTGCGGAGGAGCTGCTGCAGTCCAGCGCCGTGGCGGTGACCTTCTCTGAGCGGCTGCTGGGAAAATTCTCATTAGCAGTCCCGATCTTTGTTGCCCTCTCCTGCTTCGGCTCCATGAACGGTGGTGTGTTCGCTGTCTCCAGGTTATTCTACGTCGCATCTCGAGAAGGGCACCTTCCGGAAATCCTCTCTATGATTCATGTCCACAAGCACACTCCTCTGCCAGCTGTTATTGTTTTGCATCCTCTGACGATGGTGATGCTCTTCTCCGGAGACCTCTATAGTCTTCTAAATTTCCTCAGTTTTGCCAGGTGGCTTTTTATGGGGCTGGCAGTCGCAGGACTGATTTATCTTCGATACAAACGCCCAGATATGCATCGTCCTTTCAAGGTGCCTCTCTTCATCCCGGCACTATTTTCCTTCACCTGCCTCTTCATGGTTGTCCTCTCTCTTTACTCGGACCCATTCAGCACCGGGGTCGGTTTTCTTATCACCTTGACTGGGGTCCCTGCATATTATCTCTTCATTGTATGGGACAAGAAACCCAAGTGGTTCAGACGATTATCAGACAGAATAACCAGAACATTACAGATTATACTAGAAGTTGTACCAGAAGACTCTAAAGAATTATGAGAATTCGGGG “. Esta secuencia se clonó luego en el vector pMIG utilizando las enzimas de restricción EcoRI (RO101S, New England Biolabs) y BglII (RO143, New England Biolabs).

Los shRNA dirigidos al Phgdh murino se obtuvieron utilizando las siguientes secuencias de oligonucleótidos: directo 5′- GATCCCCGTGGAGAAGCAGAACTTGATTCAAGAGATCAAGTTCTGCTTCTCCACTTTTTA-3′, reverso 5′- AGCTTAAAAAGTGGAGAAGCAGAACTTGATCTCTTGAATCAAGTTCTGCTTCTCCACGGG-3′ (shPhgdh #1) y directo 5′-GATCCCCGGAGGAGCTGATAGCTGAATTCAAGAGATTCAGCTATCAGCTCCTCCTTTTTA-3′, reverso 5′-AGCTTAAAAAGGAGGAGCTGATAGCTGAATCTCTTGAATTCAGCTATCAGCTCCTCCGGG-3′′ (shPhgdh #2). Como control, se obtuvieron shRNA dirigidos a la luciferasa de luciérnaga utilizando las siguientes secuencias de oligonucleótidos: directo 5′-GCGTTATTTATCGGAGTTG-3′ y reverso 5′-CAACTCCGATAAATAACGC-3′ (shSCR). Se recocieron 3 µg de los oligonucleótidos correspondientes y se clonaron en el vector retroviral codificado con GFP pSUPER (VEC-PRT-0006, Oligoengine) linealizado utilizando las enzimas de restricción HindIII (RO104S, New England Biolabs) y BglII según las instrucciones del fabricante.

Tras la purificación en gel (Monarch DNA Gel Extraction Kit, T10205, New England Biolabs), se realizó la ligación utilizando la ADN ligasa T4 (MO202S, Biolabs) con una relación vector:inserto de 1:4. Los vectores generados se amplificaron en células competentes MAX Efficiency Stbl2 (10268019, Thermo Fisher Scientific) con selección de ampicilina (A9518, Sigma), se purificaron y se secuenciaron.### Generación de células Eµ-Myc genéticamente modificadas estables

Se generaron retrovirus auto-inactivados mediante la transfección transitoria de células 293 T (CRL-1573, ATCC) con 8,6 µg de uno de los siguientes vectores: vector vacío pMIG (CTL), pMIG-Asns-v5 (ASNS OE), pMIG-Phgdh-v5 (PHGDH OE) o pMIG-slc7a11 (SLC7A11 OE), pSUPER-shSCR o pSUPER-shPhgdh (#secuencia #1 o #2), 3 µg del plásmido de envoltura phCMV-VSV-G y 8,6 µg de MLV-Gag-Pol, utilizando el método clásico de fosfato de calcio. Después de 15 h, las células 293 T transfectadas se incubaron en un medio Opti-MEM con suero reducido (11058021, Thermo Fisher Scientific) durante 32 h. El sobrenadante celular se centrifugó a 3000 × g a 4 °C durante la noche para concentrar las partículas retrovirales antes de la titulación. Las células Eµ-Myc se transfectaron posteriormente con los retrovirus resultantes utilizando una relación de infección (MOI) de 10. 72 h después de la transfección, las células Eµ-Myc GFP+ se clasificaron (SH800S Cell Sorter, Sony).### Determinación de las concentraciones de glutamina y glutamato en el medio

La E-Coli L-asparaginasa nativa (ASNase, Kidrolase) se incubó en un medio que contenía asparagina en ausencia de células, a las concentraciones indicadas y a 37 °C, 5% CO2. Las concentraciones de glutamina y glutamato (mM) en el medio se determinaron electroenzimáticamente a lo largo del tiempo, utilizando el analizador bioquímico YSI 2950 (Yellow Springs Instruments).### Análisis de Western blot

Las células Eµ-Myc aisladas ex vivo de linfomas de células B inguinales o cultivadas in vitro se lavaron en PBS y se lisaron en tampón de Laemmli para extraer las proteínas totales. Los linfomas de células B axilares congelados se homogeneizaron utilizando un homogeneizador de tejidos de acero inoxidable (1292, BioSpec Products) y las proteínas se extrajeron utilizando el tampón de lisis de Laemmli. Después de la cuantificación de proteínas (23225, kit de ensayo de proteínas Pierce BCA, Thermo Fisher Scientific), se separaron de 15 a 30 µg de lisados de proteínas de células enteras en geles de poliacrilamida SDS al 8–15% y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Las membranas se marcaron con anticuerpos contra ASNS (14681-1-AP, Proteintech, RRID: AB2060119, dilución 1/2000), PHGDH (14719-1-AP, Proteintech, RRID: AB2283938, dilución 1/1000), PSAT1 (10501-1-AP, Proteintech, RRID: AB2172597, dilución 1/1000), PSPH (14513-1-AP, Proteintech, RRID: AB2171464, dilución 1/1000), NRF2 (12721, Cell Signaling, RRID: AB2715528, dilución 1/1000), GLUL (11037-2-AP, Proteintech, RRID: AB2110650, dilución 1/1000), GOT1 (14886-1-AP, Proteintech, RRID: AB2113630, dilución 1/1000), γH2AX (ab81299, Abcam, RRID: AB1640564, dilución 1/2000), ATF4 (11815, Cell Signaling, RRID: AB2616025, dilución 1/500) para las Fig. 2h, 4d y S5c, ATF4 (81798-2-RR, Proteintech; RRID: AB3670506, dilución 1/500) para las Fig. 2d, 5c, d, 7a, S2c y S7a, xCT/SLC7A11 (98051, Cell Signaling, RRID: AB2800296, dilución 1/1000), poliadp-ribosa/mono-adp-ribosa (89190, Cell Signaling, dilución 1/1000); fosfo-ATR (Ser 428) (2853, Cell Signaling, RRID: AB2290281, dilución 1/500), ATR (13934, Cell Signaling, RRID: AB2798347, dilución 1/1000), fosfo-Chk1 (Ser345) (2348, Cell Signaling, RRID: AB331212, dilución 1/1000), Chk1 (2360, Cell Signaling, RRID: AB2080320, dilución 1/1000), fosfo-RPA32/RPA2 (Ser33) (10148, Cell Signaling, RRID: AB3099645, dilución 1/1000), RPA32/RPA2 (52448, Cell Signaling, RRID: AB2750889, dilución 1/1000), fosfo-KAP1 (Ser824) (A300-767A, Thermo Fisher Scientific, RRID: AB669740, dilución 1/1000), KAP1 (4123, Cell Signaling, RRID: 2256670, dilución 1/1000); V5 (R96025, Life Technologies, RRID: AB159313, dilución 1/5000) y ERK2 (sc-1647, Santa Cruz, RRID: AB627547, dilución 1/2000). Las bandas inmunorreactivas se detectaron con anticuerpos anti-ratón (7076, Cell Signaling Technology, RRID: AB330924, dilución 1/3000) o anti-conejo (7074S, Cell Signaling Technology, RRID: AB2099233, dilución 1/3000) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP).

Los inmunoblot se visualizaron (FUJIFILM LAS4000) mediante quimioluminiscencia utilizando sustratos de Western blot Pierce ECL (32106, Pierce ECL, Thermo Fisher Scientific). ERK2 se utilizó como control de carga en todos los experimentos de inmunoblot. Cuando se indicó, la cuantificación del nivel de las proteínas indicadas se realizó utilizando el software ImageJ. La cuantificación relativa se obtuvo normalizando los datos a los niveles de ERK2 y a las condiciones de control indicadas. El lisado celular total obtenido de células Eµ-Myc tratadas con 1 µg/ml de etopósido (HY-13629, MCE) durante 3 h o estimuladas con H2O2 (0,5 mM) durante 5 min se utilizó como control positivo para la expresión de γH2AX y la PARilación, respectivamente.### Actividad de PHGDH

Para las muestras in vitro, las células Eµ-Myc vivas se lisaron durante 10 min sobre hielo, en el tampón A, que contiene 20 mM de Tris pH 7,4, 5 mM de EDTA pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,5% de NP40 (UN3500, EUROMEDEX) y 0,01% de un cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas (1861280, Thermo Fisher Scientific). Para las muestras ex vivo, los linfomas de células B congelados se homogeneizaron utilizando un homogeneizador de tejidos de acero inoxidable (1292, BioSpec Products) y las proteínas se extrajeron en el tampón A. A continuación, se incubaron de 10 a 30 µg de proteínas en un tampón de actividad de PHGDH que contiene 51,5 mM de Tris pH 8,0, 10 mM de MgCl2, 0,05% de BSA (P06-1403500, Panbiotech), 0,01% de Tween 20 (2001-B, Euromedex), 1,25 mM de L-glutamato (49449, Sigma) y 0,3 mM de NAD+ (N1511, Sigma) y 0,1 mM de 3-fosfoglicerato (HY-141412, MedChemExpress) en una placa de pocillos de 96 pocillos negra (655079, Greiner). La actividad de PHGDH se midió en un fluoroscan (Synergy H1, Biotek) a 460 nm después de la excitación a 355 nm como el aumento de la fluorescencia relacionado con la acumulación de NADH. La actividad de PHGDH se determina como el delta de absorbancia, que representa la velocidad de producción de NADH. Los datos se normalizan a miligramos de proteína y se expresan como la media ± DE del porcentaje en relación con la condición de control (+Asn, in vitro o vehículo, in vivo).### Captación de L-[3H(G)]-Serina

Se sembraron un total de 250.000 células Eµ-Myc vivas/ml en un medio libre de asparagina, serina y glicina suplementado con 0,4 mM de L-serina (S4311, Sigma), 0,4 mM de L-glicina (G8790, Sigma) y con o sin 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma) y 0,003 UI/ml de E-Coli L-asparaginasa (Kidrolase) durante 24 h a 37 °C, 5% CO2. El número de células vivas se determinó mediante tinción con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, D9642, Sigma) y análisis por citometría de flujo (Miltenyi Biotech). A continuación, se lavaron 1 × 106 células Eµ-Myc vivas (DAPI negativas) dos veces con PBS y se incubaron en una placa de 12 pocillos en 1 ml de medio precalentado libre de asparagina, serina y glicina suplementado como se describió anteriormente, con L-serina reemplazada por 1 μCi/ml o 0,4 μCi/ml de L-[3H(G)]-Serina (NET248250UC, PerkinElmer), durante 15 min o 3 h a 37 °C, 5% CO2, respectivamente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS preenfriado y se lisaron con 120 μl de 0,1 N de NaOH y se mezclaron con 4 ml de Ultima Gold (6013321, PerkinElmer). La radiactividad (cuentas por minuto, cpm) se midió utilizando un contador de centelleo β (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer). La velocidad de transporte de L-[3H(G)]-serina se expresó como la media ± DE de cpm/106 células.### Ensayo de muerte celular

Se trataron un total de 250.000 células Eµ-Myc vivas/ml con DMSO (0,075%), o E-Coli L-asparaginasa (0,003 UI/ml), o la concentración indicada de inhibidor de PHGDH BI-4916 (HY-126253, MCE), BI-4924 (HY-126254, MCE), NCT-503 (HY-101966, MCE), CBR-5884 (HY-100012, MCE), PKUMDL-WQ2101 (HY-123269, MCE) o Olaparib (AZD2281, HY-10162, MCE), o la combinación de los fármacos indicados, en un medio libre de asparagina suplementado o no con 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma) a 37 °C, 5% CO2 durante el tiempo indicado. Para extinguir las especies reactivas del oxígeno (ROS), se añadió simultáneamente 5 mM de N-acetil-L-cisteína (A9165, Sigma). Para la inhibición de las caspasas, se añadió simultáneamente 20 µM del inhibidor de caspasas qVD-OPh (A1901, APExBIO). Después de 24 o 48 h de tratamiento, las células se etiquetaron con 0,5 µg/ml de DAPI (D9642, Sigma) y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo (Miltenyi Biotec). Los datos representan el porcentaje de células muertas (DAPI+) y se expresan como la media ± DE.### Ensayo de proliferación celular

Se trataron un total de 250.000 células Eµ-Myc vivas/ml con DMSO (0,075%), o E-Coli L-asparaginasa (0,003 UI/ml), o la concentración indicada de inhibidor de PHGDH BI-4916 (HY-126253, MCE), BI-4924 (HY-126254, MCE), NCT-503 (HY-101966, MCE), CBR-5884 (HY-100012, MCE), PKUMDL-WQ2101 (HY-123269, MCE) o Olaparib (AZD2281, HY-10162, MCE), o la combinación de los fármacos indicados, en un medio libre de asparagina suplementado o no con 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma) a 37 °C, 5% CO2 durante el tiempo indicado.

Cultivo celular 3D de células HCT116

Los esferoides de HCT116 se prepararon sembrando 3000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de ultra baja adherencia (650970, Greiner Bio-One). Después de 72 h, se aplicaron los tratamientos indicados. La viabilidad celular se evaluó añadiendo yoduro de propidio (concentración final de 0,3 mg/L) a cada pocillo al final del experimento. Después de una incubación de 30 min, se capturaron imágenes de campo claro y de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia. Las imágenes se analizaron posteriormente utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de la Salud) calculando la fluorescencia total celular corregida (CTCF) utilizando la fórmula CTCF = densidad integrada – (área del objeto fluorescente × fluorescencia media de las lecturas de fondo). Las imágenes se colorearon artificialmente y se recortaron para su publicación.### Trazado de isótopos estables in vitro

Para el experimento de trazado con α−15N-L-glutamina, se incubaron 300.000 células Eµ-Myc vivas/ml en un medio libre de asparagina suplementado con 2 mM de α−15N-L-glutamina (NLM-1016-PK, Cambridge Isotope Laboratories) en lugar de L-glutamina no etiquetada, y con o sin 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma), a 37 °C, 5% CO2, durante 24 h.

Para el experimento de trazado con 13C2-glicina, se incubaron 300.000 células Eµ-Myc vivas/ml en un medio libre de asparagina, serina y glicina suplementado con 0,4 mM de L-serina (S4311, Sigma), 0,4 mM de 13C2-glicina (CLM-1017, Cambridge Isotope Laboratories) y con o sin 0,37 mM de L-asparagina, a 37 °C, 5% CO2, durante 24 h.

Para el experimento de trazado con [U-13C]-glucosa, se incubaron 300.000 células Eµ-Myc viables/ml en un medio libre de glucosa y asparagina, suplementado con 25 mM de [U-13C]-glucosa (CML-1396, Cambridge Isotope Laboratories) y con o sin L-asparagina (0,37 mM) y E. coli L-asparaginasa (0,003 UI/ml), a 37 °C, 5% de CO2, durante 24 h.

Al final del experimento, las células Eµ-Myc se analizaron mediante citometría de flujo para determinar el número de células viables (DAPI-) por mL. A continuación, se recogieron, lavaron dos veces en PBS preenfriado (300 × g, 5 min, centrifugación a 15 °C) y se congelaron rápidamente 1·106 células Eµ-Myc viables por réplica. Las muestras se almacenaron a −80 °C para análisis metabolómicos posteriores basados en LC-MS. Los resultados se corrigieron para la presencia de isótopos estables 15N o 13C que se encuentran de forma natural, utilizando Metabolite AutoPlotter^[62].

Análisis de ATP ex vivo

El ATP se midió utilizando el kit Cell Titer Glo (G7570, Promega). Brevemente, se resuspendieron 20.000 células B malignas obtenidas de linfomas de células B aislados recientemente en 80 µL de medio DMEM suplementado con 10% de FBS y 2 mM de L-glutamina, y se distribuyeron en una placa de 96 pocillos. A continuación, las células se trataron por triplicado durante 1 h con control (DMSO) o 10 µg/ml de oligomicina (O4876, Sigma-Aldrich) o 100 M de yodoacetato (I9148, Sigma-Aldrich), o con la combinación de ambos inhibidores metabólicos, para obtener la cantidad residual de ATP. Se eligió un tiempo de tratamiento corto (1 h) para evitar la muerte celular tras la inhibición de ambas vías metabólicas. A continuación, se añadió 100 µl de la mezcla de reacción Cell Titer Glo en cada pocillo, para obtener un volumen final de 200 µl. Las placas se analizaron para la luminiscencia con un Luminoscan (Berthold Technologies). Se verificó que las mediciones de ATP se encontraban en el rango lineal de la detección. La diferencia entre la producción total de ATP y el ATP producido bajo el tratamiento con oligomicina representa la contribución del ATP de la fosforilación oxidativa (OxPhos). El ATP de OxPhos se representa como un porcentaje del ATP total producido por las células.

Trazado de isótopos estables in vivo

Cuando el desarrollo del linfoma alcanzó el punto final ético, los ratones recibieron dos inyecciones intraperitoneales consecutivas de bolo discreto a intervalos de 20 min de 1 g/kg de [U-13C6]-glucosa (CLM-1396, Cambridge Isotope Laboratories) en NaCl estéril al 0,9% (solución de 100 mg/ml). Se recogió sangre de la vena caudal 40 min después de la primera inyección de bolo de [U-13C6]-glucosa y se aisló el plasma mediante centrifugación a 6000 × g durante 2 min y se congeló rápidamente. Inmediatamente después, se sacrificaron los ratones por dislocación cervical. Se recogieron todos los linfomas de células B y se congelaron rápidamente. Todas las muestras recogidas se almacenaron a −80 °C y los linfomas axilares de células B se utilizaron posteriormente para análisis metabolómicos basados en LC-MS, inmunoblot y otros análisis bioquímicos indicados. Los resultados se corrigieron para la presencia de isótopos estables 13C que se encuentran de forma natural, utilizando Metabolite AutoPlotter^[62].

Metabolómica en estado estacionario in vitro

Se trataron 250.000 células Eµ-Myc viables/ml con los fármacos indicados durante 24 h, en un medio que contiene asparagina o en un medio libre de asparagina, serina y glicina, suplementado o no con L-asparagina (0,37 mM), L-serina (0,4 mM) y glicina (0,4 mM) a 37 °C, 5% de CO2. El número de células viables se determinó a lo largo del tiempo mediante tinción con DAPI (0,5 µg/ml) y análisis por citometría de flujo (Miltenyi Biotec). A continuación, se recogieron, lavaron dos veces en PBS preenfriado (300 × g, 5 min, centrifugación a 15 °C) y se congelaron rápidamente 1·106 células viables (DAPI-) por réplica. Las muestras se almacenaron a −80 °C para análisis metabolómicos posteriores basados en LC-MS. La abundancia del metabolito se representa como área del pico. La relación GSSG/GSH se calculó a partir de los niveles totales de GSH y GSSG determinados por LC-MS.

Análisis de metabolitos específicos mediante LC/MS

Para las muestras in vitro, se utilizaron gránulos congelados de 1·106 células Eµ-Myc para la extracción de metabolitos. Para los linfomas, se homogeneizaron los linfomas axilares de células B congelados utilizando un homogeneizador de tejidos de acero inoxidable (1292, BioSpec Products) y se utilizaron 10 mg de tejido para la extracción de metabolitos. La solución de extracción se compuso de 50% de metanol, 30% de acetonitrilo (ACN) y 20% de agua. El volumen de la solución de extracción se ajustó al número de células o al peso del tejido (1 ml por 1 millón de células o 1 ml por 50 mg de tejido, respectivamente). El plasma se diluyó 20 veces con el mismo disolvente de extracción. Tras la adición de la solución de extracción, las muestras se agitaron en un vórtice durante 5 min a 4 °C y se centrifugaron a 16.000 × g durante 15 min a 4 °C. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a −80 °C hasta el análisis.

Los análisis metabolómicos dirigidos de los experimentos in vitro se realizaron utilizando un mínimo de tres réplicas biológicas por condición, con el número exacto de réplicas biológicas y técnicas indicado en las leyendas de las figuras correspondientes. El perfilado metabolómico dirigido de los linfomas de células B cultivados in vivo incluyó de 6 a 12 muestras individuales por grupo. El trazado de isótopos estables in vivo se realizó utilizando 4 ratones independientes por grupo. El análisis de las muestras de plasma incluyó 20 muestras por grupo. Se incluyeron controles adecuados, como controles de extracción en blanco, muestras de control de calidad agrupadas y estándares de referencia.

Los análisis de LC/MS se realizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap QExactive Plus equipado con una fuente Ion Max y una sonda HESI II acoplada a un sistema UPLC Dionex UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific). Se realizó una calibración de masa externa utilizando una mezcla de calibración estándar cada siete días, según lo recomendado por el fabricante. Se inyectaron 5 µl de las muestras en una columna ZIC-pHILIC (150 mm × 2,1 mm; i.d. 5 µm) con una columna de protección (20 mm × 2,1 mm; i.d. 5 µm) (Millipore) para la separación por LC. El tampón A fue carbonato de amonio 20 mM, 0,1% de hidróxido de amonio (pH 9,2) y el tampón B fue ACN. El gradiente cromatográfico se ejecutó a una velocidad de flujo de 0,200 µl/min de la siguiente manera: 0-20 min, gradiente lineal del 80% al 20% del tampón B; 20-20,5 min, gradiente lineal del 20% al 80% del tampón B; 20,5-28 min, 80% del tampón B. El espectrómetro de masas se operó en modo de barrido completo, polaridad de conmutación, con el voltaje de pulverización establecido en 2,5 kV y el capilar calentado mantenido a 320 °C. El flujo de gas de la vaina se estableció en 20 unidades, el flujo de gas auxiliar en 5 unidades y el flujo de gas de barrido en 0 unidades. Los metabolitos se detectaron en un rango de masa de 75-1000 m/z a una resolución de 35.000 (a 200 m/z) con el control automático de ganancia objetivo establecido en 106 y el tiempo de inyección máximo establecido en 250 ms. Se utilizaron masas de bloqueo para garantizar la precisión de la masa por debajo de 5 ppm. Los datos se adquirieron con el software Thermo Xcalibur (Thermo) y se procesaron utilizando el software Thermo TraceFinder 5.2. Se determinaron las áreas de los picos de los metabolitos y los isotopólogos, se identificaron por la masa exacta de cada ion de carga única y por el tiempo de retención conocido en la columna de HPLC. Para la cuantificación absoluta, se utilizó el método de adición de estándares^[63]. Para la cuantificación de la serina en plasma, se añadió d-serina a las muestras agrupadas y se restaron los niveles endógenos de los estándares añadidos. Se preparó una curva de calibración en un rango de concentración de 0,05-1,5 mM en una muestra mixta para superar los efectos de la matriz. Es importante destacar que la preparación y el procesamiento de las muestras de la curva de calibración se realizaron de forma similar a las de las muestras experimentales para garantizar la coherencia.

Software, gráficos e ilustraciones

Se utilizó el software ImageJ 2.0 para la cuantificación relativa de inmunotransferencias e inmunofluorescencia. Todos los gráficos y estadísticas presentados en este artículo se crearon utilizando el software GraphPad Prism 9 (RRID: SCR002798). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando MacsQuantify 2.13.3 (Miltenyi Biotec). Los gráficos de dispersión y los análisis MSEA de la metabolómica dirigida se generaron con MetaboAnalyst 5.0 (RRID: SCR015539), y los colores de los gráficos de dispersión se editaron utilizando el software Affinity Designer 1.6.1 (RRID: SCR_016952). Los datos de los experimentos de trazado de isótopos estables se corrigieron para la abundancia natural de isótopos estables 15N o 13C utilizando Metabolite AutoPlotter (https://mpietzke.shinyapps.io/AutoPlotter/)^[62]. Las ilustraciones de los ratones están disponibles públicamente en https://pixabay.com/fr/vectors/souris-le-noir-animal-rongeur-297524/.

Estadísticas y reproducibilidad

Todas las representaciones gráficas y los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 9 y el software MetaboAnalyst 5.0. Los datos se presentan como media ± DE o ± SEM, según se indica en las leyendas de las figuras. Las diferencias estadísticas se evaluaron utilizando las pruebas apropiadas, incluidos la prueba t de Student de dos colas, ANOVA de una o dos vías seguida de las pruebas de comparación múltiple de Tukey o Dunnett y la prueba de rango logarítmico. Se consideró que un valor de P < 0,05 era estadísticamente significativo. No se excluyeron datos de los análisis. Para los experimentos in vitro, los tamaños de las muestras se eligieron de acuerdo con la práctica común de los ensayos descritos y se indican con n o con el número de puntos de datos en los gráficos. Para los experimentos de supervivencia en ratones con células Eµ-Myc, nuestros estudios anteriores han demostrado una significación estadística con un mínimo de 6 ratones por grupo^[9], un número que se confirmó utilizando el software G*power como suficiente para detectar diferencias biológicas significativas entre dos (o más) grupos experimentales. En todos los experimentos in vivo, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales y los puntos finales de la enfermedad se evaluaron de forma ciega. El análisis estadístico multivariante de los metabolitos se realizó con el software Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)^[64],^[65]. La concentración relativa de los metabolitos se normalizó mediante la mediana y los datos se autoescalaron (centrados en la media y divididos por la desviación estándar de cada variable) antes del análisis. Tras el escalado de los datos, se realizó un análisis de componentes principales. Se realizó un análisis univariante comparando los niveles de metabolitos entre los grupos en los que las diferencias de metabolitos se definieron mediante el siguiente umbral de cambio de pliegue 0,8 1,25 (que corresponde a un umbral transformado en log2 de -0,3219 +0,3219) y la significación como valor de P sin procesar < 0,05 de la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon, asumiendo una varianza desigual. La representación de los gráficos de dispersión y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos (MSEA) se realizaron en base a los metabolitos discriminantes estadísticamente significativos y se construyeron utilizando el software Metaboanalyst y la herramienta computacional de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG). Los valores de P para MSEA se obtuvieron de la prueba exacta de Fisher^[65]. Para mayor claridad, algunos gráficos muestran estadísticas solo para las comparaciones más relevantes debido al gran número de grupos. Para obtener valores de P individuales detallados, consulte el archivo de datos fuente.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Ratones

Los ratones transgénicos C57BL/6 Eµ-Myc (Eµ-MycTg/+) se compraron en el Jackson Laboratory (002728) y se crían y mantienen en nuestro centro de animales local (C3M, INSERM U 1065, Niza, Francia, B 06-088-20). Los ratones de tipo salvaje (WT) C57BL/6JOlaHsd se compraron en Envigo y se alojaron en nuestro centro de animales local. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos y se mantuvieron en ciclos de 12 h de luz/oscuridad a 20-24 °C y 50-55% de humedad. Para todos los experimentos con ratones, se proporcionó alimento (SAFE R04, Safe Lab) ad libitum. Todos los procedimientos de cuidado de los animales, los experimentos y el mantenimiento cumplieron con los protocolos (n° APAFIS#25228-2020032917261458 v9) aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC de la Universidad de Niza, Côte d’Azur) y el Ministère de la Recherche et de l’Innovation.

Líneas celulares

Se aislaron células primarias Eµ-Myc de ratones individuales Eµ-MycTg/+ machos o hembras, según se describió previamente, y se caracterizaron^[8],^[61]. En particular, las células OxPhos-dependientes Eµ-Myc #506 y Eµ-Myc #688 se derivaron del linfoma de células B de hembras Eµ-MycTg/+ #506 y #688, respectivamente. Estas células se mantuvieron en medio DMEM-GlutaMAX (31966047, Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) (F7524, Sigma), 50 µM de 2-mercaptoetanol (31350010, Thermo Fisher Scientific), 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma), 10 mM de HEPES pH 7,4 (15630056, Thermo Fisher Scientific) y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific). Las células 293 T (CRL-1573, ATCC) se mantuvieron en medio DMEM-GlutaMAX (31966047, Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 10% de FBS y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, y se utilizaron para producir vectores retrovirales VSV-G. La línea celular de carcinoma pulmonar murino Lewis Lung (LLC) (CRL1642, ATCC) se mantuvo en medio DMEM-GlutaMAX (31966047, Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 10% de FBS y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. La línea celular de carcinoma de colon murino CT26 (CRL-2638, ATCC) se mantuvo en medio RPMI-GlutaMAX (61870044, Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y 1 mM de piruvato de sodio (11360070, Thermo Fisher Scientific). La línea celular de adenocarcinoma de colon murino MC38 (SCC172, Sigma) se mantuvo en medio DMEM-F12-GlutamaX (31331028, Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 10% de FBS, 1 mM de piruvato de sodio y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. La línea celular de carcinoma de colon humano HCT116 (CVCL_0291) se obtuvo de ATCC y se cultivó de forma rutinaria en medio McCoy (16600082, Thermo Fisher Scientific), suplementado con un 10% de FBS y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio están libres de micoplasma y se analizan de forma rutinaria para detectar micoplasma.

Medios para estudios in vitro

El medio sin asparagina se refiere a DMEM con alta concentración de D-glucosa (4,5 g/L), sin L-glutamina, sin medio pirúvico (11960044, Thermo Fisher Scientific), suplementado con un 10% de FBS (F7524, Sigma), 3–50 µM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES pH 7,4, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio (11360070, Thermo Fisher Scientific), 2 mM de L-glutamina (25030081, Thermo Fisher Scientific). Este medio contiene una concentración suprafisiológica de serina y glicina.

El medio que contiene asparagina se refiere al medio sin asparagina descrito anteriormente, suplementado con L-asparagina (0,37 mM).

El medio sin asparagina, serina y glicina se refiere al medio MEM sin L-glutamina (21090022, Thermo Fisher Scientific), suplementado con un 10% de FBS (F7524, Sigma) dializado (132724, Membrana de diálisis Spectra/Por®3 Standard RC Tubing, MWCO 3,5 kDa), 50 µM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES pH 7,4, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, 20 mM de D-glucosa (J60067, Thermo Fisher Scientific), 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina, 1% de cóctel de vitaminas (11120052, Gibco).

El medio sin glucosa y sin asparagina se refiere al medio DMEM sin L-glutamina, sin medio pirúvico (A14430-01, Thermo Fisher Scientific), suplementado con un 10% de FBS (F7524, Sigma), 50 µM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES pH 7,4, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de L-glutamina. Este medio contiene una concentración suprafisiológica de serina y glicina.

Formulaciones de ASNasa

Para todos los experimentos in vitro, se utilizó la L-asparaginasa II nativa de Escherichia-coli (ASNasa) (Kidrolase®, Jazz Pharmaceutical). Para los estudios in vivo presentados en las Figuras 1, 2, 4, S3 y S5, utilizamos Kidrolase®, y para los estudios in vivo en las Figuras 3, 6, 7 y S3, utilizamos la proteína recombinante de L-asparaginasa II nativa de Escherichia-coli (Spectrila®).

Transferencia in vivo de células Eµ-Myc y experimentos de supervivencia

Las células primarias de ratón Eµ-Myc #506 o #688 se transfirieron mediante inyección intravenosa (I.V) (100.000 células viables por ratón receptor) en ratonas C57BL/6JOlaHsd no transgénicas y sincrónicas de 6 semanas de edad (Envigo), que son menos propensas a pelear que los machos. Siete días después, se trató a los ratones cada 48 h mediante inyección intraperitoneal (I.P) con vehículo (NaCl 0,9%) o 2500 UI/kg de la L-asparaginasa nativa (Kidrolase®, Jazz Pharmaceutical) o recombinante (Spectrila) de E. coli (ASNasa) hasta que el linfoma alcanzó el límite ético. La ASNasa se diluye en NaCl 0,9%. Se evaluó el inicio del tumor mediante palpación del ganglio linfático inguinal. El límite ético (punto final de la enfermedad) se definió utilizando una puntuación clínica asociada a la enfermedad aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC de la Universidad de Niza, Côte d’Azur) y el Ministère de la Recherche et de l’Innovation (n.º APAFIS#25228-2020032917261458 v9). Una vez que se detectó el inicio del tumor inguinal, se registraron diariamente las puntuaciones clínicas asociadas a la enfermedad para cada ratón. Cuando se alcanzó la puntuación máxima, los ratones tratados con vehículo y con ASNasa recibieron una inyección final de vehículo o ASNasa, respectivamente, y se sacrificaron tres o cuatro horas después mediante dislocación cervical. A continuación, se recogió sangre mediante punción cardíaca, se colocó en tubos recubiertos con heparina de litio (BD Microtainer), se centrifugó a 6000 × g durante 2 min para aislar el plasma. Se recogieron las muestras de plasma, se congelaron rápidamente y se almacenaron a −80 °C para el análisis metabolómico. La supervivencia de los ratones, definida como la probabilidad de supervivencia (%), se determinó como el tiempo transcurrido entre la inyección I.V de las células Eµ-Myc y el momento en que se tuvo que sacrificar a los ratones por motivos éticos, cuando la progresión del linfoma alcanzó el punto final. Los ratones libres de tumores (%) se determinaron como el tiempo transcurrido entre la inyección I.V de las células Eµ-Myc y el momento en que se palpó un linfoma inguinal.

Para el segundo desafío terapéutico in vivo, se inyectaron por vía intravenosa (I.V) 100.000 células Eµ-Myc viables por ratón receptor en ratonas C57BL/6JOlaHsd no transgénicas y sincrónicas de 6 semanas de edad (Envigo). Las células Eµ-Myc utilizadas se obtuvieron del BCL obtenido después del primer desafío terapéutico in vivo. Siete días después, se trató a los ratones con vehículo o ASNasa a la misma concentración, frecuencia y vía de administración que se mencionó anteriormente.

Para el cotratamiento in vivo con ASNasa y Olaparib, se inyectaron por vía intravenosa 100.000 células Eµ-Myc viables por ratón receptor en ratonas C57BL/6JOlaHsd no transgénicas y sincrónicas de 6 semanas de edad (Envigo). Siete días después, se trató a los ratones con vehículo o 50 mg/kg de Olaparib (diario I.P) o 2500 UI/kg de Spectrila (I.P cada 48 h) o la combinación de ambos fármacos (Olaparib 50 mg/kg diario I.P y Spectrila, 2500 UI/kg, I.P cada 48 h). El Olaparib (HY-10162, MCE) se disolvió en DMSO a una concentración de 100 mg/ml y luego se diluyó a 5 mg/ml en una solución de sulfobutiléter-β-ciclodextrina al 20% (HY-17031, MCE, diluida en NaCl 0,9%). El vehículo consiste en inyecciones I.P diarias de una solución de DMSO al 5%/sulfobutiléter-β-ciclodextrina al 95% (al 20% en NaCl 0,9%) y/o I.P de NaCl 0,9% cada 48 h.

Las funciones de supervivencia se estimaron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon con la prueba de rango logarítmico.

Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real

Se extrajo el ARN total de las células Eµ-Myc utilizando el kit RNeasy mini (74104, Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó a partir de 2 µg de ARN utilizando el kit Omniscript RT (205113, Qiagen). Se obtuvieron los niveles relativos de ARNm mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) en el sistema StepOne™ Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) utilizando el conjunto de cebadores TaqMan para el Phgdh murino (Mm01623589g1), Psat1 (Mm01613328g1), Psph (Mm01197775m1), Gls (Mm01257297m1), Gclc (Mm00802658m1), Gclm (Mm01324400m1), Nqo1 (Mm01253561m1), slc7a11 (Mm00442530m1), slc6a9 (Mm00433662m1), Asns (Mm01137310g1) y el TaqMan Universal PCR Master Mix (4304437, Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. La qPCR se realizó a partir de 8 ng de ADNc, excepto para la amplificación de slc7a11, para la cual utilizamos 100 ng de ADNc. Los niveles relativos de ARNm se normalizaron con el Rplp0 murino (Mm00725448_s1, Thermo Fisher Scientific) y con la condición de control (+Asn, 0,37 mM).

Datos de RNAseq

Los archivos de alineación de secuenciación de ARN (RNA-seq) y la información clínica del estudio EGAS00001002606^[42] se descargaron del European Genome-phenome Archive. La cuantificación de los genes se realizó utilizando featureCounts v1.5.0-p3 basada en las anotaciones Ensembl GTF release 75. Los datos de RNA-seq se normalizaron utilizando el paquete Bioconductor DESeq2. Se eliminaron dieciocho (de 775) muestras que no mostraban expresión de Rplp0 del análisis.

Los datos de RNA-seq de muestras humanas (cánceres sólidos y cánceres hematológicos) se recuperaron y descargaron del programa The Cancer Genome Atlas (TCGA, https://portal.gdc.cancer.gov/) a través del sitio web Gene Expression Profiling Interactive Analysis (http://gepia.cancer-pku.cn). Los niveles de ARNm de slc7a11 se representaron en transcritos por millón (TPM). HNSC, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; LUSC, carcinoma de células escamosas de pulmón; LUAD, adenocarcinoma de pulmón; LGG, glioma de bajo grado cerebral; GBM, glioblastoma multiforme; STAD, adenocarcinoma de estómago; SKCM, melanoma cutáneo; COAD, adenocarcinoma de colon; DLBCL, linfoma difuso de células B grandes; LAML, leucemias mieloides agudas.

La secuenciación de ARN de las células Eµ-Myc cultivadas in vitro y de las células derivadas de BCL de Eµ-Myc tratadas con vehículo y ASNasa in vivo, se realizó en Illumina NextSeq500 en la plataforma de genómica funcional del IPMC (Francia). Se generaron las bibliotecas utilizando el kit Truseq Stranded mRNA (Illumina), a partir de 1 µg de ARN total extraído de diferentes líneas celulares de Eµ-Myc aisladas de 12 ratones transgénicos individuales Eµ-MycTg/+ y de linfomas de células B obtenidos de ratones a los que se les injectaron células Eµ-Myc #506 y se trataron con vehículo o ASNasa durante varias semanas. A continuación, se cuantificaron las bibliotecas con el kit Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Invitrogen) y se agruparon. Se cargó 4 nM de este grupo en un flujo de trabajo de alto rendimiento NextSeq 500 y se secuenció en una plataforma NextSeq 500 (Illumina) con química de lectura pareada de 2  ×  75 bp. Las lecturas se mapearon con STAR 2.4.0a en el genoma de ratón (versión mm10). El recuento se realizó con featureCounts (subread-1.5.0-p3-Linux-x8664, opciones “—primary -g genename -p -s 1 -C”) utilizando la versión Ensembl GRCm38.83. Los recuentos brutos se transformaron en valores de fpkm (fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas) para normalizar tanto la profundidad de la secuenciación como la longitud del gen. Los valores de expresión se muestran como log2(fpkm).

Construcciones de ADN

Para amplificar el cDNA de Asns o Phgdh del ratón, se extrajo el ARN total de las células Eµ-Myc y se realizó la transcripción inversa según lo descrito anteriormente. La secuencia codificante de Phgdh del ratón (sin codón de parada) se amplificó mediante PCR utilizando una ADN polimerasa Taq recombinante (10342020, Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante y con los siguientes cebadores: sentido 5′-GCAATGGCCTTCGCAAATCTGC-3′ y reverso 5′-GGAGCCAGCCCAGGCGT-3′. El producto de PCR se clonó en el vector pCR™ 2.1-TOPO® TA utilizando el kit TOPO™ TA Cloning™ (K455040, Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. El plásmido TOPO-Phgdh resultante se amplificó en E.Coli químicamente competente One Shot TOP10 (C404003, Thermo Fisher Scientific) con selección de ampicilina (A9518, Sigma), se purificó (740414.50, Macherey-Nagel) y se secuenció para confirmar la clonación de la secuencia codificante de Phgdh silvestre del ratón. Una vez confirmado, la secuencia codificante de Phgdh marcada con V5 se subclonó desde el vector TOPO-Phgdh al vector retroviral pMIG codificante de GFP (9044, Addgene), mediante PCR con los siguientes cebadores: sentido 5′-GAGAGTCGACATGGCCTTCGCAAATCTGC-3′ y reverso 5′-GGTTAACTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGAAGCAGAACTGGAAAGCCTCCAATAC-3′. A continuación, el amplicón se digirió utilizando las enzimas de restricción SalI (R3136S, New England Biolabs) y HpaI (R0105S, New England Biolabs). El vector pMIG se linealizó utilizando las enzimas de restricción XhoI (R0146S, New England Biolabs) y HpaI para generar extremos cohesivos compatibles. El vector pMIG digerido se desfosforiló con fosfatasa antártica (MO289S, Biolabs). El siguiente fragmento de ADN de doble cadena que contiene la secuencia codificante de slc7a11 del ratón con los sitios de restricción BglII y EcoRI se sintetizó (Thermo Fisher Scientific): “ GGGGAGATCTATGGTCAGAAAGCCAGTTGTGGCCACCATCTCCAAAGGAGGTTACCTGCAGGGCAATATGAGCGGGAGGCTGCCCTCCATGGGGGACCAAGAGCCACCTGGGCAGGAGAAGGTAGTTCTGAAAAAGAAGATCACTTTGCTGAGGGGGGTCTCCATCATCATCGGCACCGTCATCGGATCAGGCATCTTCATCTCCCCCAAGGGCATACTCCAGAACACGGGCAGCGTGGGCATGTCCCTGGTTTTCTGGTCTGCCTGTGGAGTACTGTCACTTTTTGGAGCCCTGTCCTATGCAGAATTAGGTACAAGCATAAAGAAATCTGGTGGTCATTACACATACATTCTGGAGGTCTTTGGTCCTTTGCTGGCTTTTGTTCGAGTCTGGGTGGAACTGCTCGTAATACGCCCTGGAGCTACTGCTGTGATATCCCTGGCATTTGGACGCTACATCCTGGAACCATTTTTTATTCAATGTGAAATTCCTGAACTTGCAATCAAGCTCGTGACAGCTGTGGGCATCACTGTGGTGATGGTCCTAAATAGCACGAGTGTCAGCTGGAGTGCCCGGATCCAGATTTTCCTAACCTTTTGCAAGCTCACAGCAATTCTGATAATTATAGTCCCTGGAGTTATACAGCTAATTAAAGGGCAAACACATCACTTTAAAGATGCATTTTCAGGAAGAGACACAAGTCTAATGGGGTTGCCCTTGGCTTTTTATTATGGGATGTATGCATATGCTGGCTGGTTTTACCTCAACTTTATTACTGAAGAAGTAGACAACCCTGAAAAAACCATCCCCCTTGCAATCTGCATCTCCATGGCTATCATCACAGTGGGCTACGTACTGACAAACGTGGCCTATTTTACCACCATCAGTGCGGAGGAGCTGCTGCAGTCCAGCGCCGTGGCGGTGACCTTCTCTGAGCGGCTGCTGGGAAAATTCTCATTAGCAGTCCCGATCTTTGTTGCCCTCTCCTGCTTCGGCTCCATGAACGGTGGTGTGTTCGCTGTCTCCAGGTTATTCTACGTCGCATCTCGAGAAGGGCACCTTCCGGAAATCCTCTCTATGATTCATGTCCACAAGCACACTCCTCTGCCAGCTGTTATTGTTTTGCATCCTCTGACGATGGTGATGCTCTTCTCCGGAGACCTCTATAGTCTTCTAAATTTCCTCAGTTTTGCCAGGTGGCTTTTTATGGGGCTGGCAGTCGCAGGACTGATTTATCTTCGATACAAACGCCCAGATATGCATCGTCCTTTCAAGGTGCCTCTCTTCATCCCGGCACTATTTTCCTTCACCTGCCTCTTCATGGTTGTCCTCTCTCTTTACTCGGACCCATTCAGCACCGGGGTCGGTTTTCTTATCACCTTGACTGGGGTCCCTGCATATTATCTCTTCATTGTATGGGACAAGAAACCCAAGTGGTTCAGACGATTATCAGACAGAATAACCAGAACATTACAGATTATACTAGAAGTTGTACCAGAAGACTCTAAAGAATTATGAGAATTCGGGG “. Esta secuencia se clonó en el vector pMIG utilizando las enzimas de restricción EcoR1 (RO101S, New England Biolabs) y BglII (RO143, New England Biolabs).

Los shRNA dirigidos a Phgdh del ratón se obtuvieron utilizando las secuencias de oligonucleótidos sentido 5′- GATCCCCGTGGAGAAGCAGAACTTGATTCAAGAGATCAAGTTCTGCTTCTCCACTTTTTA-3′, reverso 5′- AGCTTAAAAAGTGGAGAAGCAGAACTTGATCTCTTGAATCAAGTTCTGCTTCTCCACGGG-3 (shPhgdh #1) y sentido 5′-GATCCCCGGAGGAGCTGATAGCTGAATTCAAGAGATTCAGCTATCAGCTCCTCCTTTTTA-3′, reverso 5′-AGCTTAAAAAGGAGGAGCTGATAGCTGAATCTCTTGAATTCAGCTATCAGCTCCTCCGGG-3′′ (shPhgdh #2). Como control, los shRNA dirigidos a la luciferasa de luciérnaga se obtuvieron utilizando las secuencias de oligonucleótidos sentido 5′-GCGTTATTTATCGGAGTTG-3′ y reverso 5′-CAACTCCGATAAATAACGC-3′ (shSCR). 3 µg de los oligonucleótidos correspondientes, sentido y reverso, se anillaron y se clonaron en el vector retroviral pSUPER codificante de GFP (VEC-PRT-0006, Oligoengine) linealizado utilizando las enzimas de restricción HindIII (RO104S, New England Biolabs) y BglII según las instrucciones del fabricante.

Tras la purificación en gel (Monarch DNA Gel Extraction Kit, T10205, New England Biolabs), se realizó la ligación utilizando la ADN ligasa T4 (MO202S, Biolabs) con una relación vector:inserto de 1:4. Los vectores generados se amplificaron en células competentes MAX Efficiency Stbl2 (10268019, Thermo Fisher Scientific) con selección de ampicilina, se purificaron y se secuenciaron.

Generación de células Eµ-Myc genéticamente modificadas estables

Los retrovirus auto-inactivantes se generaron mediante la transfección transitoria de células 293 T (CRL-1573, ATCC) con 8.6 µg de uno de los siguientes vectores: vector vacío pMIG (CTL), pMIG-Asns-v5 (ASNS OE), pMIG-Phgdh-v5 (PHGDH OE) o pMIG-slc7a11 (SLC7A11 OE), pSUPER-shSCR o pSUPER-shPhgdh (#secuencia #1 o #2), 3 µg del plásmido de envoltura phCMV-VSV-G y 8.6 µg de MLV-Gag-Pol, utilizando el método clásico de fosfato de calcio. Después de 15 h, las células 293 T transfectadas se incubaron en medio Opti-MEM con bajo contenido de suero (11058021, Thermo Fisher Scientific) durante 32 h. El sobrenadante celular se centrifugó a 3000 × g a 4 °C durante la noche para concentrar las partículas retrovirales antes de la titulación. Las células Eµ-Myc se transducieron con los retrovirus resultantes utilizando una multiplicidad de infección (MOI) de 10. 72 h después de la transducción, las células Eµ-Myc GFP+ se clasificaron (SH800S Cell Sorter, Sony).

Determinación de las concentraciones de glutamina y glutamato en el medio

La E-Coli L-asparaginasa nativa (ASNase, Kidrolase) se incubó en un medio que contenía asparagina en ausencia de células, a las concentraciones indicadas y a 37 °C, 5% CO2. Las concentraciones de glutamina y glutamato (mM) en el medio se determinaron electroenzimáticamente a lo largo del tiempo, utilizando el analizador bioquímico YSI 2950 (Yellow Springs Instruments).

Análisis de Western blot

Las células Eµ-Myc aisladas ex vivo de linfomas de células B inguinales o cultivadas in vitro se lavaron en PBS y se lisaron en tampón de Laemmli para extraer las proteínas totales. Los linfomas de células B axilares congelados se homogeneizaron utilizando un molinillo de tejidos de acero inoxidable (1292, BioSpec Products) y las proteínas se extrajeron utilizando el tampón de lisis de Laemmli. Después de la cuantificación de proteínas (23225, kit de ensayo de proteínas Pierce BCA, Thermo Fisher Scientific), se separaron de 15 a 30 µg de lisados proteicos de células enteras en geles de poliacrilamida SDS al 8-15% y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Las membranas se incubaron con anticuerpos contra ASNS (14681-1-AP, Proteintech, RRID: AB2060119, dilución 1/2000), PHGDH (14719-1-AP, Proteintech, RRID: AB2283938, dilución 1/1000), PSAT1 (10501-1-AP, Proteintech, RRID: AB2172597, dilución 1/1000), PSPH (14513-1-AP, Proteintech, RRID: AB2171464, dilución 1/1000), NRF2 (12721, Cell Signaling, RRID: AB2715528, dilución 1/1000), GLUL (11037-2-AP, Proteintech, RRID: AB2110650, dilución 1/1000), GOT1 (14886-1-AP, Proteintech, RRID: AB2113630, dilución 1/1000), γH2AX (ab81299, Abcam, RRID: AB1640564, dilución 1/2000), ATF4 (11815, Cell Signaling, RRID: AB2616025, dilución 1/500) para las Fig. 2h, 4d y S5c, ATF4 (81798-2-RR, Proteintech; RRID: AB3670506, dilución 1/500) para las Fig. 2d, 5c, d, 7a y S7a, xCT/SLC7A11 (98051, Cell Signaling, RRID: AB2800296, dilución 1/1000), Poliadp-ribosa/Mono-adp-ribosa (89190, Cell Signaling, dilución 1/1000); Fosfo-ATR (Ser 428) (2853, Cell Signaling, RRID: AB2290281, dilución 1/500), ATR (13934, Cell Signaling, RRID: AB2798347, dilución 1/1000), Fosfo-Chk1 (Ser345) (2348, Cell Signaling, RRID: AB331212, dilución 1/1000), Chk1 (2360, Cell Signaling, RRID: AB2080320, dilución 1/1000), Fosfo-RPA32/RPA2 (Ser33) (10148, Cell Signaling, RRID: AB3099645, dilución 1/1000), RPA32/RPA2 (52448, Cell Signaling, RRID: AB2750889, dilución 1/1000), Fosfo-KAP1 (Ser824) (A300-767A, Thermo Fisher Scientific, RRID: AB669740, dilución 1/1000), KAP1 (4123, Cell Signaling, RRID: 2256670, dilución 1/1000); V5 (R96025, Life Technologies, RRID: AB159313, dilución 1/5000) y ERK2 (sc-1647, Santa Cruz, RRID: AB627547, dilución 1/2000). Las bandas inmunorreactivas se detectaron con anticuerpos anti-ratón (7076, Cell Signaling Technology, RRID: AB330924, dilución 1/3000) o anti-conejo (7074S, Cell Signaling Technology, RRID: AB2099233, dilución 1/3000) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP).

Los inmunoblot se visualizaron (FUJIFILM LAS4000) mediante quimioluminiscencia utilizando los sustratos de Western blot Pierce ECL (32106, Pierce ECL, Thermo Fisher Scientific). ERK2 se utilizó como control de carga.

Ensayo de muerte celular

Captación de L-[3H(G)]-Serina

Se sembraron 250.000 células Eµ-Myc viables/ml en un medio libre de asparagina, serina y glicina suplementado con 0,4 mM de L-serina (S4311, Sigma), 0,4 mM de L-glicina (G8790, Sigma) y con o sin 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma) y 0,003 UI/ml de E-coli L-asparaginasa (Kidrolase) durante 24 h a 37 °C, 5% CO2. El número de células viables se determinó mediante tinción con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, D9642, Sigma) (0,5 µg/ml) y análisis por citometría de flujo (Miltenyi Biotech). A continuación, se lavaron 1 × 106 células Eµ-Myc viables (DAPI negativas) dos veces con PBS y se incubaron en una placa de 12 pocillos en 1 ml de medio precalentado libre de asparagina, serina y glicina suplementado como se describe anteriormente, con L-serina reemplazada por 1 μCi/ml o 0,4 μCi/ml de L-[3H(G)]-serina (NET248250UC, PerkinElmer), durante 15 min o 3 h a 37 °C, 5% CO2, respectivamente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS preenfriado y se lisaron con 120 μl de 0,1 N NaOH y se mezclaron con 4 ml de Ultima Gold (6013321, PerkinElmer). La radiactividad (cuentas por minuto, cpm) se midió utilizando un contador de centelleo β (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer). La tasa de transporte de L-[3H(G)]-serina se expresó como la media ± DE de cpm/106 células.

Se trató un total de 250.000 células Eµ-Myc viables/ml con DMSO (0,075%) o L-asparaginasa de E. coli (0,003 UI/ml), o con la concentración indicada del inhibidor de PHGDH BI-4916 (HY-126253, MCE), BI-4924 (HY-126254, MCE), NCT-503 (HY-101966, MCE), CBR-5884 (HY-100012, MCE), PKUMDL-WQ2101 (HY-123269, MCE) o Olaparib (AZD2281, HY-10162, MCE), o con la combinación de los fármacos indicados, en un medio libre de asparagina, suplementado o no con 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma) a 37 °C, 5% de CO2, durante el tiempo indicado. Para la desactivación de las especies reactivas de oxígeno (ROS), se añadió simultáneamente 5 mM de N-acetil-L-cisteína (A9165, Sigma). Para la inhibición de las caspasas, se añadió simultáneamente 20 µM del inhibidor pan-caspasa qVD-OPh (A1901, APExBIO). Después de 24 o 48 horas de tratamiento, se etiquetaron las células con 0,5 µg/ml de DAPI (D9642, Sigma) y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo (Miltenyi Biotec). Los datos representan el porcentaje de células muertas (DAPI+) y se expresan como media ± DE.

Ensayo de proliferación celular

Se trató un total de 250.000 células Eµ-Myc viables/ml con DMSO (0,075%) o 0,003 UI/ml de L-asparaginasa de E. coli, o 10 µM de BI-4916 (HY-126253, MCE), o 60 µM de BI-4924 (HY-126254, MCE), o 0,3 µM de Olaparib (AZD2281, HY-10162, MCE), o con la combinación de los fármacos indicados, en un medio libre de asparagina, suplementado o no con 0,37 mM de L-asparagina, a 37 °C, 5% de CO2, durante el período indicado.

Para la proliferación celular en un medio libre de asparagina, serina y glicina, se sembró un total de 250.000 células Eµ-Myc viables/ml en presencia o ausencia de L-asparagina (0,37 mM) y/o L-serina (0,4 mM)/L-glicina (0,4 mM) a 37 °C, 5% de CO2, durante el período indicado.

Cuando las células alcanzaron 1,106 células/ml, se diluyeron en el medio de la condición correspondiente. El número de células viables se determinó a lo largo del tiempo mediante tinción con DAPI (0,5 µg/ml) y análisis por citometría de flujo (Miltenyi Biotec). Los datos se expresan como el número medio de células viables (DAPI−) ± DE o ± EE.

Medición de especies reactivas de oxígeno

Se trató un total de 250.000 células Eµ-Myc viables por ml durante 15 o 20 horas (según se indica en las leyendas) con DMSO (0,075%) o 0,003 UI/ml de L-asparaginasa de E. coli, o 10 µM de BI-4916 (HY-126253, MCE), o la combinación de ambos fármacos, en un medio libre de asparagina, suplementado o no con L-asparagina (0,37 mM) a 37 °C, 5% de CO2. A continuación, se contaron las células mediante citometría de flujo tras la tinción con DAPI (0,5 µg/ml) y se sembraron 1 × 106 células Eµ-Myc viables (DAPI negativas) en 2 ml de su medio respectivo en placas de 12 pocillos y se trataron o no con 10 mM de N-acetil-L-cisteína (A9165, Sigma) 1 hora antes de la adición de 2,5 µM de la sonda CellROX green (C10444, Invitrogen) durante 30 minutos adicionales a 37 °C, 5% de CO2. A continuación, se recogieron las células, se lavaron una vez con PBS, se resuspendieron en 200 µL de PBS, se etiquetaron con 0,5 µg/ml de DAPI (D9642, Sigma) y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo (Miltenyi Biotec). CellROX green es un reactivo permeable a las células y no fluorescente en estado reducido. Tras la oxidación, CellROX green presenta una fuerte señal fluorogénica (excitación: 485 nm; emisión: 520 nm) que se localiza principalmente en el núcleo y en las mitocondrias, lo que proporciona una medida fiable de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en células viables. Los datos se representan como la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la sonda detectada en las células viables (DAPI−), normalizada a la condición de control (+Asn) y se expresan como media ± DE.

Cultivo celular tridimensional de células HCT116

Se prepararon esferoides HCT116 sembrando 3000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de ultra baja adherencia (650970, Greiner Bio-One). Después de 72 horas, se aplicaron los tratamientos indicados. Se evaluó la viabilidad celular añadiendo yoduro de propidio (concentración final de 0,3 mg/L) a cada pocillo al final del experimento. Después de una incubación de 30 minutos, se capturaron imágenes de campo claro y de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia. A continuación, se analizaron las imágenes utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health) calculando la fluorescencia total corregida de las células (CTCF) utilizando la fórmula CTCF = densidad integrada – (área del objeto fluorescente × fluorescencia media de las lecturas de fondo). Las imágenes se colorearon artificialmente y se recortaron para su publicación.

Trazado de isótopos estables in vitro

Para el experimento de trazado con α−15N-L-glutamina, se incubaron 300.000 células Eµ-Myc viables/ml en un medio libre de asparagina, suplementado con 2 mM de α−15N-L-glutamina (NLM-1016-PK, Cambridge Isotope Laboratories) en lugar de L-glutamina no etiquetada, y con o sin 0,37 mM de L-asparagina (A0884, Sigma), a 37 °C, 5% de CO2, durante 24 horas.

Para el experimento de trazado con 13C2-glicina, se incubaron 300.000 células Eµ-Myc viables/ml en un medio libre de asparagina, serina y glicina, suplementado con 0,4 mM de L-serina (S4311, Sigma), 0,4 mM de 13C2-glicina (CLM-1017, Cambridge Isotope Laboratories) y con o sin 0,37 mM de L-asparagina, a 37 °C, 5% de CO2, durante 24 horas.

Para el experimento de trazado con [U-13C]-glucosa, se incubaron 300.000 células Eµ-Myc viables/ml en un medio libre de glucosa y asparagina, suplementado con 25 mM de [U-13C]-glucosa (CML-1396, Cambridge Isotope Laboratories) y con o sin L-asparagina (0,37 mM) y L-asparaginasa de E. coli (0,003 UI/ml), a 37 °C, 5% de CO2, durante 24 horas.

Al final del experimento, se analizaron las células Eµ-Myc mediante citometría de flujo para determinar el número de células viables (DAPI−) por ml. A continuación, se recogieron 1 × 106 células Eµ-Myc viables por réplica, se lavaron dos veces en PBS preenfriado (300 × g, 5 min, centrifugación a 15 °C) y se congelaron rápidamente. Las muestras se almacenaron a −80 °C para su posterior análisis metabolómico basado en LC-MS. Los resultados se corrigieron para la presencia de isótopos estables 15N o 13C de origen natural utilizando Metabolite AutoPlotter^[62].

Análisis de ATP ex vivo

Se midió el ATP utilizando el kit Cell Titer Glo (G7570, Promega). Brevemente, se resuspendieron 20.000 células B malignas obtenidas de linfomas de células B recién aislados en 80 µL de medio DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina y se distribuyeron en una placa de 96 pocillos. A continuación, se trataron las células en triplicado durante 1 hora con control (DMSO) o 10 µg/ml de oligomicina (O4876, Sigma-Aldrich) o 100 M de yodoacetato (I9148, Sigma-Aldrich), o con la combinación de ambos inhibidores metabólicos para obtener la cantidad residual de ATP. Se eligió un tiempo de tratamiento corto (1 hora) para evitar la muerte celular tras la inhibición de ambas vías metabólicas. A continuación, se añadió 100 µL de la mezcla de reacción Cell Titer Glo en cada pocillo para obtener un volumen final de 200 µL. Se analizaron las placas para la luminiscencia con un Luminoscan (Berthold Technologies). Se verificó que las mediciones de ATP se encontraban en el rango lineal de la detección. La diferencia entre la producción total de ATP y el ATP producido bajo el tratamiento con oligomicina representa la contribución del ATP de la fosforilación oxidativa (OxPhos). El ATP de OxPhos se representa como porcentaje del ATP total producido por las células.

Trazado de isótopos estables in vivo

Cuando el desarrollo del linfoma alcanzó el punto final ético, los ratones recibieron dos inyecciones intraperitoneales consecutivas en intervalos de 20 minutos de 1 g/kg de [U-13C6]-glucosa (CLM-1396, Cambridge Isotope Laboratories) en NaCl estéril al 0,9% (solución de 100 mg/ml). Se recogió sangre de la vena caudal 40 minutos después de la primera inyección de [U-13C6]-glucosa y se aisló el plasma mediante centrifugación a 6000 × g durante 2 minutos y se congeló rápidamente. Inmediatamente después, se sacrificaron los ratones por dislocación cervical. Se recogieron todos los linfomas de células B y se congelaron rápidamente. Todas las muestras recogidas se almacenaron a −80 °C y los BCL axilares se utilizaron posteriormente para análisis metabolómicos basados en LC-MS, inmunoblotaje y otros análisis bioquímicos indicados. Los resultados se corrigieron para la presencia de isótopos estables 13C de origen natural utilizando Metabolite AutoPlotter^[62].

Metabolómica de estado estacionario in vitro

Se trataron 250.000 células Eµ-Myc viables/ml con los fármacos indicados durante 24 horas, en un medio que contiene asparagina o en un medio libre de asparagina, serina y glicina, suplementado o no con L-asparagina (0,37 mM), L-serina (0,4 mM) y glicina (0,4 mM) a 37 °C, 5% de CO2. El número de células viables se determinó a lo largo del tiempo mediante tinción con DAPI (0,5 µg/ml) y análisis por citometría de flujo (Miltenyi Biotec). A continuación, se recogieron 1 × 106 células viables (DAPI−) por réplica, se lavaron dos veces en PBS preenfriado (300 × g, 5 min, centrifugación a 15 °C) y se congelaron rápidamente. Las muestras se almacenaron a −80 °C para su posterior análisis metabolómico basado en LC-MS. La abundancia del metabolito se representa como área del pico. La relación GSSG/GSH se calculó a partir de los niveles totales de GSH y GSSG determinados por LC-MS.

Análisis de metabolitos dirigidos por LC/MS

Para las muestras in vitro, se utilizaron gránulos congelados de 1 × 106 células Eµ-Myc para la extracción de metabolitos. Para los linfomas, se homogeneizaron los linfomas axilares congelados utilizando un molinillo de tejidos de acero inoxidable (1292, BioSpec Products) y se utilizaron 10 mg de tejido para la extracción de metabolitos. La solución de extracción se compuso de 50% de metanol, 30% de acetonitrilo (ACN) y 20% de agua. El volumen de la solución de extracción se ajustó al número de células o al peso del tejido (1 ml por 1 millón de células o 1 ml por 50 mg de tejido, respectivamente). El plasma se diluyó 20 veces con el mismo disolvente de extracción. Después de la adición de la solución de extracción, las muestras se agitaron durante 5 minutos a 4 °C y se centrifugaron a 16.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a −80 °C hasta el análisis.

Los análisis metabolómicos dirigidos de los experimentos in vitro se realizaron utilizando un mínimo de tres réplicas biológicas por condición, con el número exacto de réplicas biológicas y técnicas indicado en las leyendas de las figuras correspondientes. El perfilado metabolómico dirigido de los linfomas de células B cultivados in vivo incluyó de 6 a 12 muestras individuales por grupo. El trazado de isótopos estables in vivo se realizó utilizando 4 ratones independientes por grupo. El análisis de las muestras de plasma incluyó 20 muestras por grupo. Los controles adecuados incluyeron controles de extracción en blanco, muestras de control de calidad agrupadas y estándares de referencia.

Los análisis de LC/MS se realizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap QExactive Plus equipado con una fuente Ion Max y una sonda HESI II acoplada a un sistema UPLC Dionex UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific). Se realizó una calibración de masa externa utilizando una mezcla de calibración estándar cada siete días, según lo recomendado por el fabricante. Se inyectaron 5 µL de las muestras en una columna ZIC-pHILIC (150 mm × 2,1 mm; i.d. 5 µm) con una columna de protección (20 mm × 2,1 mm; i.d. 5 µm) (Millipore) para la separación por LC. El tampón A fue carbonato de amonio 20 mM, 0,1% de hidróxido de amonio (pH 9,2) y el tampón B fue ACN. El gradiente cromatográfico se ejecutó a una velocidad de flujo de 0,200 µL/min de la siguiente manera: 0-20 min, gradiente lineal del 80% al 20% del tampón B; 20-20,5 min, gradiente lineal del 20% al 80% del tampón B; 20,5-28 min, 80% del tampón B. El espectrómetro de masas se operó en modo de barrido completo, polaridad de conmutación, con el voltaje de pulverización establecido en 2,5 kV y el capilar calefactor mantenido a 320 °C. El flujo de gas de la vaina se estableció en 20 unidades, el flujo de gas auxiliar en 5 unidades y el flujo de gas de barrido en 0 unidades. Los metabolitos se detectaron en un rango de masas de 75-1000 m/z a una resolución de 35.000 (a 200 m/z) con el control automático de ganancia objetivo establecido en 106 y el tiempo de inyección máximo establecido en 250 ms. Se utilizaron masas de bloqueo para garantizar una precisión de masa inferior a 5 ppm. Los datos se adquirieron con el software Thermo Xcalibur (Thermo) y se procesaron utilizando el software Thermo TraceFinder 5.2. Se determinaron las áreas de los picos de los metabolitos y los isótopos, se identificaron por la masa exacta de cada ion de carga única y por el tiempo de retención conocido en la columna de HPLC. Para la cuantificación absoluta, se utilizó el método de adición de estándares^[63]. Para la cuantificación de la serina en plasma, se utilizó el método de adición de estándares.

Ilustraciones, gráficos e imágenes

Se utilizó el software ImageJ 2.0 para la cuantificación relativa de inmunotransferencias e inmunofluorescencia. Todos los gráficos y las estadísticas presentadas en este artículo se crearon utilizando el software GraphPad Prism 9 (RRID: SCR002798). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando MacsQuantify 2.13.3 (Miltenyi Biotec). Los gráficos de dispersión y los análisis MSEA de la metabolómica dirigida se generaron con MetaboAnalyst 5.0 (RRID: SCR015539), y los colores de los gráficos de dispersión se editaron utilizando el software Affinity Designer 1.6.1 (RRID: SCR_016952). Los datos de los experimentos de trazado con isótopos estables se corrigieron para la abundancia natural de los isótopos estables 15N o 13C utilizando Metabolite AutoPlotter (https://mpietzke.shinyapps.io/AutoPlotter/)^[62]. Las ilustraciones de ratones están disponibles públicamente en https://pixabay.com/fr/vectors/souris-le-noir-animal-rongeur-297524/.

Estadísticas y reproducibilidad

Todas las representaciones gráficas y los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 9 y el software MetaboAnalyst 5.0. Los datos se presentan como media ± DE o ± EE, según se indica en las leyendas de las figuras. Las diferencias estadísticas se evaluaron utilizando las pruebas apropiadas, que incluyen la prueba t de Student de dos colas, ANOVA de una o dos vías seguida de las pruebas de comparación múltiple de Tukey o Dunnett y la prueba de rango log. Se consideró que un valor de P < 0,05 era estadísticamente significativo. No se excluyeron datos de los análisis. Para los experimentos in vitro, los tamaños de muestra se eligieron de acuerdo con la práctica común de los ensayos descritos y se indican con n o con el número de puntos de datos en los gráficos. Para los experimentos de supervivencia en ratones injertados con células Eµ-Myc, nuestros estudios previos han demostrado una significación estadística con un mínimo de 6 ratones por grupo^[9], un número que se confirmó utilizando el software G*power como suficiente para detectar diferencias biológicas significativas entre dos (o más) grupos experimentales. En todos los experimentos in vivo, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales y los puntos finales de la enfermedad se evaluaron de forma ciega. El análisis estadístico multivariado de los metabolitos se realizó con el software Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)^[64],^[65]. La concentración relativa de metabolitos se normalizó mediante la mediana y los datos se autoescalaron (centrados en la media y divididos por la desviación estándar de cada variable) antes del análisis. Después de escalar los datos, realizamos un análisis de componentes principales. Se realizó un análisis univariado comparando los niveles de metabolitos entre los grupos, donde las diferencias de metabolitos se definieron mediante el siguiente umbral de cambio: 0,8 1,25 (lo que corresponde a un umbral transformado en log2 de -0,3219 +0,3219) y significación como valor de P sin procesar < 0,05 de la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon, asumiendo varianza desigual. La representación de los gráficos de dispersión y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos (MSEA) se realizaron en función de los metabolitos discriminantes estadísticamente significativos y se crearon utilizando el software Metaboanalyst y la herramienta computacional de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). Los valores de P para MSEA provienen de la prueba exacta de Fisher^[65]. Para mayor claridad, algunos gráficos muestran estadísticas solo para las comparaciones más relevantes debido al gran número de grupos. Para obtener valores de p individuales detallados, consulte el archivo de datos de origen.

Resumen de la información presentada

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de información de Nature Portfolio vinculado a este artículo.