El nitrato de origen del huésped alimenta la producción de indol por Escherichia coli, lo que favorece la progresión de la enfermedad renal crónica.

El indol derivado de E. coli acelera la progresión de la ERC en ratones gnotobióticos

Si bien algunas toxinas urémicas se eliminan durante la hemodiálisis, el sulfato de indoxilo representa un desafío para el manejo clínico de la insuficiencia renal, ya que su unión a las proteínas plasmáticas impide su eliminación por diálisis (^[12]). El aumento de los niveles séricos de sulfato de indoxilo es directamente proporcional a la gravedad de la ERC (^[13]). El sulfato de indoxilo es producido por el hígado a partir del indol derivado de la microbiota. La triptófano indol-liasa (triptofanasa), codificada por el gen tnaA de Escherichia coli (familia Enterobacteriaceae), degrada el triptófano a indol, piruvato y amoníaco (^[14]). Para confirmar que esta vía metabólica acelera la progresión de la ERC, inducimos insuficiencia renal en ratones libres de gérmenes (Swiss Webster) mediante la administración dietética de adenina (0,2%), un modelo que imita varios aspectos de la ERC (^[15]). Los ratones fueron inoculados con la cepa E. coli Nissle 1917, un aislado humano comercializado como probiótico (^[16]), o con un mutante isogénico de E. coli que carece del gen tnaA1. Ambas cepas bacterianas se injertaron a niveles similares (Fig. 1A), pero el indol solo se detectó en el contenido cecal de los ratones inoculados con la cepa E. coli de tipo salvaje (Fig. 1B) (^[2]). La suplementación con adenina desencadenó lesiones renales (Fig. 1C y 1D) y aumentó los niveles de creatinina sérica (Fig. 1E), un indicador de la disminución de la función renal. Estos signos de la enfermedad se exacerbaron en los ratones gnotobióticos inoculados con la cepa E. coli de tipo salvaje en comparación con los animales libres de gérmenes. Este empeoramiento de los signos de la ERC mediado por E. coli dependió de la producción de indol, ya que ya no se observó en los ratones gnotobióticos inoculados con un mutante E. coli tnaA (Fig. 1C–1E). Curiosamente, se observó una concentración elevada de nitrato en la capa de moco después de injertar ratones tratados con adenina con una cepa de E. coli productora de indol, pero no después del injerto con un mutante E. coli tnaA (Fig. 1F). Sin embargo, nuestro modelo gnotobiótico reduccionista no predijo si E. coli es una fuente importante de indol en los ratones convencionales, ya que la triptofanasa también es producida por otras especies dentro de la microbiota, incluidas algunas miembros de las clases Bacilli, Clostridia y Bacteroidia (^[17]).

La eliminación incompleta del sulfato de indoxilo eleva el nitrato derivado del huésped para promover el crecimiento de E. coli

A continuación, investigamos si la suplementación con adenina en ratones convencionales recapitula el aumento de la abundancia de Enterobacteriaceae observado en las heces de pacientes con ERC. Dado que los ratones C57BL/6 de las granjas Taconic (ratones C57BL/6Tac) tienen Enterobacteriaceae endógenas a niveles inferiores al límite de detección mediante el perfilado convencional de la microbiota (^[18]), utilizamos métodos dependientes del cultivo (es decir, recuentos de colonias fecales en agar MacConkey) para determinar la abundancia absoluta de este taxón en las heces. La suplementación con adenina (0,2%) se asoció con un aumento significativo de la abundancia de Enterobacteriaceae (Fig. 2A), un aumento de los niveles de indol en el contenido cecal (Fig. 2B) y una elevación de los niveles de creatinina en el suero (Fig. 2C). Estos datos sugirieron que nuestro modelo recapitula una firma microbiana de disbiosis observada en pacientes con ERC (^[4]–^[8]).

La abundancia elevada de Enterobacteriaceae en la microbiota intestinal puede estar impulsada por la respiración del nitrato, que se ve favorecida por la mayor expresión de Nos2, el gen que codifica la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) (^[19]). El óxido nítrico producido por la iNOS se descompone en nitrato en el lumen intestinal, lo que favorece el crecimiento de Enterobacteriaceae (^[19]–^[23]). En particular, la concentración de nitrato fue elevada en el moco colónico durante la ERC inducida por adenina en comparación con los controles (Fig. 2D), lo que se acompañó de niveles elevados de transcritos de Nos2 en el ARN aislado de la mucosa intestinal del último grupo (Fig. 2E).

Para determinar si una concentración luminal elevada de nitrato es una causa ecológica del aumento de la abundancia de Enterobacteriaceae durante la ERC, primero establecimos un modelo de ratón convencional que proporcionara un control experimental sobre este taxón. Con este fin, inducimos ERC en ratones del laboratorio Jackson, que no tienen Enterobacteriaceae endógenas, porque el proveedor realiza pruebas para detectar la presencia de este taxón en sus procedimientos específicos libres de patógenos (^[18]). Un nicho ecológico desocupado para Enterobacteriaceae presenta una oportunidad para la edición precisa de la microbiota mediante el injerto de ratones con cepas de E. coli modificadas genéticamente (^[24]). Los ratones C57BL/6 del laboratorio Jackson (ratones C57BL/6J), que se confirmó por cultivo que estaban libres de Enterobacteriaceae, recibieron suplementación con adenina (0,2%) o no (control) y fueron inoculados tres semanas después con E. coli Nissle 1917 o se les inoculó un placebo. En el momento de la inoculación, la suplementación con adenina se asoció con niveles elevados de creatinina sérica (Fig. S1A), una concentración elevada de nitrato en el moco colónico (Fig. S1B) y cambios histopatológicos en los riñones (Fig. S1C). Sin embargo, antes de la inoculación con E. coli, la suplementación con adenina no se asoció con un aumento de la concentración de indol en el contenido cecal (Fig. S1D). Dos semanas después de la inoculación, la suplementación con adenina se asoció con una concentración elevada de nitrato en el moco colónico (Fig. S2A) y un mayor número de E. coli en las heces (Fig. S2B). Dos semanas después de la inoculación con placebo, el daño renal fue evidente por niveles elevados de creatinina sérica (Fig. S2C), puntuaciones de histopatología aumentadas (Fig. S2D y S2E) y niveles elevados de sulfato de indoxilo sérico (Fig. S2F). Sin embargo, la inoculación con E. coli empeoró la mineralización renal (Fig. S2G y S2H) y exacerbó el aumento de la creatinina sérica (Fig. S2C) y los niveles de sulfato de indoxilo sérico (Fig. S2F).

A continuación, utilizamos la genética bacteriana para investigar si una concentración elevada de nitrato estaba causalmente relacionada con un aumento de la abundancia de E. coli en ratones tratados con adenina. Con este fin, los ratones C57BL/6J libres de Enterobacteriaceae recibieron suplementación con adenina (0,2%) o no (control). Tres semanas después, los ratones fueron inoculados con una mezcla 1:1 de E. coli Nissle 1917 (tipo salvaje) y un mutante isogénico que carecía de la respiración del nitrato (napA narG narZ mutante) (^[19]). La suplementación con adenina no afectó al crecimiento de la E. coli Nissle 1917 de tipo salvaje o del mutante napA narG narZ in vitro (Fig. S2I). La E. coli de tipo salvaje y un mutante de E. coli deficiente en la respiración del nitrato se recuperaron en números similares de las heces de los ratones de control dos semanas después de la inoculación. En contraste, la respiración del nitrato proporcionó una ventaja de aptitud considerable en los ratones tratados con adenina, como lo indica la recuperación de la E. coli de tipo salvaje (wt) en 93 veces más número que el mutante de E. coli deficiente en la respiración del nitrato (napA narG narZ mutante) (Fig. 2F). Para determinar si el nitrato era de origen del huésped, los ratones fueron tratados con clorhidrato de aminoguanidina (AG), un inhibidor de la enzima del huésped iNOS que no inhibió el crecimiento de E. coli in vitro (Fig. S2J). En particular, el tratamiento con AG eliminó la ventaja de crecimiento que el nitrato confería a E. coli en los ratones tratados con adenina (Fig. 2G).

A continuación, determinamos si una concentración elevada de nitrato también es una causa ecológica de la disbiosis en otro modelo de ratón para la ERC. Si bien el modelo de dieta de adenina modela la ERC causada por trastornos metabólicos crónicos, como la diabetes, la inyección de ácido fólico (FA) es un modelo de ERC en respuesta a una lesión renal aguda (por ejemplo, después de la sepsis) (^[25]). En los ratones C57BL/6Tac que tienen Enterobacteriaceae endógenas, los niveles de creatinina sérica se elevaron en más del 60% de los animales seis semanas después de la inyección de FA (250 mg/kg) (Fig. S3A). La inyección de FA se asoció con fibrosis renal (Fig. S3B), un aumento de la abundancia absoluta de Enterobacteriaceae endógenas (Fig. S3C), niveles elevados de transcritos de Nos2 en el ARN aislado de la mucosa colónica (Fig. S3D) y una concentración elevada de nitrato en el moco colónico (Fig. S3E). Para determinar si la respiración del nitrato promovió el crecimiento de E. coli en la ERC inducida por FA, los ratones C57BL/6J libres de Enterobacteriaceae fueron inoculados con placebo o inyectados con FA y se les inoculó tres semanas después con una mezcla 1:1 de E. coli Nissle 1917 (tipo salvaje) y un mutante isogénico que carecía de la respiración del nitrato (napA narG narZ mutante). La respiración del nitrato proporcionó una ventaja de aptitud en los ratones con ERC inducida por FA, pero no en los ratones del grupo de control inoculados con placebo (Fig. S3F).

Una primera pista sobre el mecanismo por el cual la ERC inducida por adenina aumenta la concentración de nitrato en la capa de moco provino del hallazgo de que la producción de nitrato en los ratones gnotobióticos tratados con adenina requirió el injerto con una cepa de E. coli productora de indol (Fig. 1F). Por lo tanto, el indol derivado de la microbiota o su conversión en sulfato de indoxilo participan en la inducción de la producción de nitrato en el huésped. El sulfato de indoxilo reduce la expresión de Pcg1a (^[26]), que codifica una coactivadora del receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma (PPAR-γ), un receptor nuclear que reprime la expresión de Nos2 (^[27]). Coherente con estos informes, el tratamiento de las células epiteliales de cáncer de colon humano (CaCo-2) con sulfato de indoxilo o el inhibidor de PGC1α SR-18292 aumentó la expresión de Nos2 y disminuyó los niveles de transcritos de Pcg1a y Angptl4, un gen regulado positivamente por el PPAR-γ y su cofactor PGC1α (Fig. S4). El tratamiento con el agonista de PPAR-γ rosiglitazona revirtió los cambios en la expresión de Nos2, Pcg1a y Angptl4 inducidos por el sulfato de indoxilo. Por lo tanto, hipotetizamos que la eliminación incompleta del sulfato de indoxilo durante la ERC aumenta la concentración sérica de esta toxina urémica para inducir la expresión de Nos2 en la mucosa del colon, lo que en última instancia eleva los niveles de nitrato en el lumen. Coherente con esta idea, la ERC inducida por adenina se correlacionó con niveles elevados de sulfato de indoxilo en el suero de los ratones C57BL/6J injertados con E. coli Nissle 1917 (Fig. S2F). Para probar la causalidad, los ratones C57BL/6J convencionales con función renal normal fueron inyectados por vía intraperitoneal con sulfato de indoxilo o un control (solución salina tamponada con fosfato). Tres horas después de la inyección con sulfato de indoxilo, la concentración sérica de la toxina urémica se elevó (Fig. 2H), los niveles de transcritos de Pcg1a y el gen regulado por PPAR-γ Angpt1a se redujeron, mientras que los niveles de transcritos de Nos2 aumentaron en el ARN aislado de la mucosa colónica (Fig. 2I) y la concentración de nitrato en el moco colónico se elevó (Fig. 2J) en comparación con los animales inyectados con el control. En conjunto, estos datos respaldaron la idea de que la eliminación incompleta del sulfato de indoxilo durante la ERC eleva la concentración de nitrato en la capa de moco, lo que es una causa ecológica del aumento de la abundancia de Enterobacteriaceae en la microbiota fecal.

Enterobacteriaceae se convierte en una especie clave para la producción de indol cuando el nitrato está elevado

A continuación, queríamos determinar si una mayor disponibilidad de nitrato derivado del huésped altera la homeostasis intestinal para generar una “microbiota urémica” que exacerba la enfermedad (^[11]). Para probar si una expansión dependiente de la respiración de nitrato de Enterobacteriaceae afecta la producción de indol por la microbiota intestinal, se administró a ratones C57BL/6J, que se confirmó por cultivo que estaban libres de Enterobacteriaceae, suplemento de adenina o una dieta de control durante cinco semanas. Tres semanas después del inicio de la suplementación con adenina, se inoculó a los ratones con E. coli Nissle 1917 o un placebo. En los ratones que recibieron una dieta de control, la inoculación con E. coli no aumentó la producción de indol por la microbiota intestinal (Fig. 3A). Estos datos sugirieron que E. coli no contribuye a la producción de indol por la microbiota intestinal durante la homeostasis. En ausencia de E. coli, la suplementación con adenina no aumentó significativamente la producción de indol en ratones libres de Enterobacteriaceae. En contraste, la inoculación con E. coli aumentó significativamente la producción de indol en ratones con enfermedad renal crónica (ERC) inducida por adenina. De manera similar, la inoculación de ratones C57BL/6J libres de Enterobacteriaceae con E. coli aumentó los niveles de indol en el contenido cecal de animales con ERC inducida por ácido fólico, pero no en ratones del grupo de control inoculados con placebo (Fig. 3B).

Para investigar si este fenómeno podría observarse con otros aislados de Enterobacteriaceae, inoculamos ratones C57BL/6J libres de Enterobacteriaceae con una mezcla equimolar de cuatro especies de Enterobacteriaceae aisladas de ratones C57BL/6Tac utilizados en el panel de la figura 1A, incluyendo E. coli (indol-positiva, lactosa-positiva), Klebsiella oxytoca (indol-positiva, lactosa-positiva), Proteus mirabilis (indol-negativa, lactosa-negativa) y Enterobacter cloacae (indol-negativa, lactosa-negativa). La suplementación con adenina (0,2%) se asoció con un aumento significativo en la abundancia absoluta de Enterobacteriaceae en comparación con los ratones que recibieron una dieta de control (Fig. S5A), similar a lo que se observó originalmente (Fig. 2A). La secuenciación de amplicones del gen ribosomal 16S (perfilado de la microbiota) reveló cambios en la composición, incluyendo un aumento en Bacilli y una reducción en la abundancia relativa de Actinobacteria (Fig. S5B). Sin embargo, el hallazgo de que la suplementación con adenina no cambió los niveles de indol en el contenido cecal de ratones libres de Enterobacteriaceae (Fig. 3A) sugirió que estos cambios en la composición de la microbiota fueron irrelevantes para los cambios en la producción de indol. Además, Enterobacteriaceae (clase Gammaproteobacteria), que fueron responsables de los cambios en la producción de indol durante la suplementación con adenina (Fig. 3A), siguieron siendo especies minoritarias (es decir,