El desarrollo de inhibidores KRAS específicos para alelos subraya la importancia de comprender la biología tumoral distinta asociada con las mutaciones comunes de KRAS, G12D y G12C, en modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y muestras de pacientes. Los tumores pulmonares impulsados por la mutación KRAS más común, G12C, muestran un inicio más tardío y una progresión más lenta en comparación con los impulsados por KRAS G12D en pacientes y ratones. Los tumores G12C muestran una menor proliferación y un mayor compromiso de las células inmunitarias, lo que último es consistente con las observaciones en tumores de pacientes. Los inhibidores KRAS G12C/D específicos para alelos suprimen eficazmente el crecimiento de los respectivos tumores pulmonares autóctonos.
Sin embargo, los tumores impulsados por G12D presentan una recurrencia más rápida que los tumores impulsados por G12C en modelos autóctonos, lo que refleja una mayor agresividad intrínseca. Dada esta agresiva conducta clínica, nos centramos en dilucidar el mecanismo de acción y las estrategias para potenciar la inhibición de KRASG12D en modelos de cáncer de pulmón no inmunogénico e inmunogénico. La inhibición de G12D mejora la presentación de antígenos tumorales, activa las células T y permite la citotoxicidad específica del antígeno, lo que conduce a la eficacia con la combinación de bloqueo de puntos de control inmunitarios. Esta combinación induce una memoria inmunitaria duradera en modelos inmunogénicos, pero no en entornos no inmunogénicos.
Nuestros hallazgos subrayan las diferencias clave entre las mutaciones KRAS G12D y G12C en la configuración de la biología del cáncer de pulmón, revelan dinámicas de resistencia distintas bajo la terapia dirigida a largo plazo y descubren mecanismos mediados por el sistema inmunitario específicos para la inhibición de KRASG12D con relevancia clínica y traslacional directa.
La subfamilia RAS consta de tres miembros: el proto-oncogén KRAS, GTPasa (KRAS; variantes de empalme, 4A y 4B), el proto-oncogén NRAS, GTPasa (NRAS) y el proto-oncogén HRAS, GTPasa (HRAS). De estos, KRAS es el gen mutado con mayor frecuencia en todos los tipos de tumores, particularmente en el adenocarcinoma de pulmón (LUAD), el cáncer de páncreas y el cáncer colorrectal. En LUAD, hasta el 25,3–33 % de los pacientes presentan mutaciones en KRAS ([1], [2]), siendo la sustitución de aminoácidos predominante KRAS p.Gly12Cys (G12C, 41 %), seguida de p.Gly12Val (G12V, 21 %) y p.Gly12Asp (G12D, 17 %) ([3]). Las proteínas RAS son componentes esenciales de las redes de señalización que controlan la proliferación, la diferenciación y la supervivencia celular. Por lo tanto, el KRAS mutado altera las vías de señalización descendentes normales, lo que conduce al desarrollo tumoral ([4]). Las diferentes mutaciones de KRAS tienen propiedades bioquímicas únicas con diferentes afinidades hacia las proteínas efectoras descendentes y tasas intrínsecas de hidrólisis de trifosfato de guanosina (GTP) ([5]). En LUAD, las diferentes alelos mutados de KRAS conducen a diferencias en la activación de las vías descendentes, incluida la vía canónica RAF-proteína quinasa activada por mitógenos (MEK)-proteína quinasa regulada por señal extracelular (ERK), la vía de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K)-3-fosfoinositida-proteína quinasa dependiente 1 (PDK1)-AKT y la vía del factor de intercambio de nucleótidos de guanina Ral (RalGEF)-Ral ([5], [6]). Las líneas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) KRASG12C dependen de la señalización RalGEF-Ral, mientras que RAF-MEK-ERK y PI3K-AKT-objetivo de rapamicina (mTOR) son más prominentes en las células con mutación KRASG12D ([6], [7]). Sin embargo, el papel de estas discrepancias de señalización en el crecimiento tumoral no está bien caracterizado en modelos clínicamente relevantes.
Las terapias dirigidas, como los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ALK y RET, han cambiado el panorama del tratamiento para LUAD ([8]). Sin embargo, hasta hace poco, el tratamiento dirigido a KRAS ha sido un desafío debido a su afinidad picomolar por el GTP ([7]). Desde la primera identificación del bolsillo switch-II en KRAS unido a difosfato de guanosina (GDP) ([9]), se desarrollaron inhibidores selectivos de KRASG12C que se unen covalentemente a la cisteína en G12C y bloquean KRAS en la forma inactiva unida a GDP. Los inhibidores de G12C, sotorasib y adagrasib, recibieron la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) como tratamiento de segunda línea en CPNM ([10], [11]). Aunque el beneficio clínico con los inhibidores de G12C es evidente en un subconjunto de pacientes, la mediana de supervivencia libre de progresión (SLP) con sotorasib y adagrasib es de aproximadamente 6,5–6,8 meses, más corta que la observada con los inhibidores de EGFR ([10]–[12]), y el mecanismo de resistencia es desconocido en más de la mitad de los tumores ([13]). El desarrollo de inhibidores de KRAS se ha extendido a otras mutaciones de RAS, incluidos los inhibidores específicos de KRAS G12D o los inhibidores pan-RAS que se dirigen a los estados RAS-OFF o RAS-ON ([14]–[16]). BMS-986508, también conocido como MRTX1133, un inhibidor selectivo no covalente de KRASG12D, se desarrolló y se evaluó en la clínica ([16]). Los estudios en cáncer de páncreas sugieren que MRTX1133 inhibe KRAS ([17]) e induce la regresión tumoral asociada con cambios en el microambiente inmunitario tumoral en modelos de ratón de cáncer de páncreas ([18]). Los efectos de MRTX1133 no se han estudiado en modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) de cáncer de pulmón.
Para personalizar los tratamientos contra el cáncer utilizando inhibidores específicos o pan-RAS, será necesario comprender las dependencias intrínsecas de las células tumorales y del microambiente, así como las dependencias de cada subtipo de KRAS. Aquí, describimos una caracterización exhaustiva de los modelos KrasG12C y KrasG12D y sus respuestas a los respectivos inhibidores de Kras. El inhibidor de G12D mejoró el reconocimiento tumoral por parte de las células T, impulsando la eliminación específica de antígenos, remodelando el microambiente tumoral, induciendo la memoria de las células T y mejorando las respuestas al bloqueo de puntos de control inmunitario (BCPI) en modelos de cáncer de pulmón inmunogénico.
Resultados:
Kras G12D es un oncogén más potente que G12C
Para comparar los subtipos de cáncer de pulmón impulsados por KRAS, generamos cánceres de pulmón utilizando alelos mutantes condicionales KrasLSL-G12C/+ (Kc) ([19]) y KrasLSL-G12D/+ (Kd) ([20]) (Fig. 1A) e indujimos tumores pulmonares utilizando la recombinasa Cre (Adeno-Cre). La iniciación del tumor se retrasó en el modelo impulsado por G12C, y los ratones murieron de cáncer de pulmón significativamente más tarde que los del grupo G12D (supervivencia mediana de Kc frente a Kd: 53,86 frente a 17 semanas, HR = 0,1678, p < 0,0001, Fig. 1B). De manera similar, en los ratones deficientes de la proteína relacionada con la transformación p53 (Trp53), KcP (KrasLSL-G12C/+; Trp53fl/fl) demostró una supervivencia significativamente más larga en comparación con KdP (KrasLSL-G12D/+; Trp53fl/fl) (28,14 frente a 13,57 semanas, HR = 0,2115, p < 0,0001, Fig. 1C). La tasa de progresión tumoral también fue significativamente diferente entre los dos modelos, según lo cuantificado por la resonancia magnética (RM) (Kc frente a Kd, p < 0,01 para dos semanas y p < 0,05 para cuatro semanas, Fig. 1D). También se observaron diferencias en la tasa de progresión en los modelos mutantes de Trp53_ (KcP frente a KdP, p < 0,01 para dos semanas y p < 0,05 para cuatro semanas, Fig. 1E). Se mostraron imágenes representativas de RM de ambas comparaciones (Fig. 1F y Fig. S1A). Coherente con el crecimiento tumoral, la proliferación de los tumores es mayor en los tumores Kd/KdP en comparación con los Kc/KcP, según lo determinado por la inmunohistoquímica (IHC) de Ki67 (Fig. 1, G-I). La histología de los tumores G12C y G12D es similar, con tumores micropapilares, papilares y sólidos en el contexto de p53 WT, mientras que los tumores mutantes de p53 tienen más tumores micropapilares en ambos genotipos (Fig. S1B). Además, los tumores Kd y KdP tienen más pERK1/2 en comparación con Kc y KcP (Fig. 1, G, J y K).
Utilizamos el sistema de fibroblastos embrionarios de ratón (FEM) para evaluar de forma independiente las diferencias en la transformación oncogénica entre Kras G12C y G12D. Los FEM se trataron con Adeno-Cre para inducir la transformación (Fig. S1C). Se realizaron ensayos 3T3, en los que los FEM se pasaron en serie y se calcularon sus duplicaciones en cada paso (Fig. 1L). Todos los FEM de Kd (n = 3) y Kc (n = 3) se inmortalizaron, en contraste con ninguno de los FEM de WT (n = 2). En el paso 17, los FEM de Kd tenían un promedio de 39,36 duplicaciones frente a 25,51 para Kc (p ajustada < 0,05, Fig. 1M), lo que indica un mayor potencial oncogénico de G12D en comparación con G12C. También se evaluó el Kras unido a GTP y la señalización descendente en estas células (Fig. 1N y Fig. S1D). Los FEM de KrasG12D exhibieron mayor Kras unido a GTP en comparación con los FEM de KrasG12C (Fig. 1N y Fig. S1E).
Para contextualizar nuestros descubrimientos dentro del marco clínico, analizamos nuestro conjunto de datos de pacientes con LUAD en etapa temprana (107 G12C y 36 G12D, Fig. S2A). Coherente con los GEMM, los cánceres de pulmón impulsados por KRASG12C se diagnosticaron significativamente más tarde en la vida que los KRASG12D, con una edad media de diagnóstico de cáncer de pulmón para los pacientes cuyos tumores tienen KRASG12C de 66,81 años en comparación con 61,83 para KRASG12D (p < 0,05, Fig. S2A). El porcentaje de pacientes mayores de 70 años fue del 36,45 % en G12C y del 25 % en G12D. No hubo una diferencia significativa en la carga mutacional tumoral (CMT) para los tumores con G12C en comparación con G12D en este conjunto de datos (Fig. S2B). Entre los pacientes con antecedentes de tabaquismo, la edad media de diagnóstico de cáncer de pulmón para los pacientes cuyos tumores tienen KRASG12C es de 66,88 años en comparación con 62,75 para KRASG12D (Fig. S2C). Validamos aún más nuestras observaciones en un segundo conjunto de datos (MSK Mind ([21]), n = 40 para G12C, n = 13 para G12D). Los datos del segundo conjunto de datos fueron consistentes con el conjunto inicial, con una edad media de diagnóstico de KRASG12C de 70,40 años en comparación con 63,69 para KRASG12D (p < 0,05, Fig. S2D). El porcentaje de pacientes mayores de 70 años fue del 52,50 % en G12C en comparación con el 38,46 % en G12D. En los tumores mutantes de G12C, la CMT fue mayor en comparación con el grupo KRASG12D (Fig. S2E).
Los tumores de pulmón mutantes de G12C en pacientes son más inmunogénicos que los tumores mutantes de G12D
Para explorar los posibles mecanismos que contribuyen a las diferencias fenotípicas entre los tumores de pulmón KRASG12C y KRASG12D, analizamos los perfiles de expresión génica de 141 KRASG12C y 47 KRASG12D de LUAD en etapa temprana del conjunto de datos del Proyecto Genoma del Cáncer (TCGA) ([22]) y 290 tejidos normales adyacentes del portal de datos genómicos GDC ([23]). Hubo 1222 genes expresados diferencialmente (DEG) entre G12C y G12D. Específicamente, la expresión de (CD3E) y los genes relacionados con la quimiotaxis de linfocitos (CXCL9, CXCL10, CXCL12, CCL5), la activación de células T efectoras (IFNG) y la citotoxicidad (PRF1), el marcador costimulador (CD86) y la producción de inmunoglobulinas (IGHG1, IGHG3) y CD274 (PDL1) fueron significativamente mayores en los tumores G12C que en los G12D (p < 0,05, Fig. 2A). Coherente con los DEG, los conjuntos de genes involucrados en la producción de inmunoglobulinas, la activación y proliferación de linfocitos y las vías de producción de interferón gamma se enriquecieron en los tumores G12C en comparación con los G12D (Fig. 2, B y C). En contraste, los conjuntos de genes involucrados en el crecimiento celular, la actividad de la GTPasa se enriquecieron en los tumores G12D (Fig. 2, B y C). Tanto G12C como G12D tuvieron una menor expresión de los genes relacionados con la quimiotaxis de linfocitos, la expresión de MHC de clase I (HLA-A, HLA-B), la producción de inmunoglobulinas y la eliminación de linfocitos (GZMB) en comparación con los tejidos normales adyacentes (Fig. S3A).
A continuación, validamos estas diferencias en las muestras de pacientes mediante el perfilado espacial del microambiente inmunitario en 39 tumores de LUAD mutantes de G12C y 17 tumores de LUAD mutantes de G12D. Utilizamos la técnica ImmunoProfile, que utiliza inmunofluorescencia multiplexada para PDL1, CD8, PD1, FoxP3 y citoqueratina (Fig. 2D) ([24]). Los datos de CMT estaban disponibles para la mayoría de los tumores en este conjunto de datos (29/39 G12C y 13/17 G12D), sin una diferencia significativa entre los dos grupos (Fig. S3B). Las células T CD8+ totales (intratumorales (IT) + interfaz tumor-estroma (TSI)) (p < 0,001) y las células T CD8 intratumorales (IT) (p < 0,01) fueron significativamente mayores en los tumores G12C que en los G12D (Fig. 2, E y F). Los tejidos tumorales de G12C contenían más células T positivas para PD1 que los tumores G12D (Fig. 2G). No hubo diferencias en las células FOXP3+ entre los dos grupos (Fig. S3C), pero la proporción de células CD8+ a células FOXP3+ fue mayor en los tumores mutantes de G12C (Fig. 2H). Hubo una mayor expresión general de PDL1 en los tumores mutantes de G12C que en los tumores G12D. El 69,23 % de los tumores mutantes de G12C tuvieron una puntuación combinada positiva (CPS, células tumorales e inmunitarias) > 10 frente al 35,29 % de G12D (Fig. 2I). Cuando se combinaron todas las categorías, no hubo diferencias significativas entre los tumores mutantes de G12C y G12D (Fig. 2J). La puntuación proporcional tumoral (TPS) tampoco fue estadísticamente diferente entre los dos grupos (TPS < 1 %, 47,06 % en G12D frente a 33,33 % en G12C, Fig. S3D). Además, utilizamos un conjunto de datos más grande con 313 muestras mutantes de G12C y 96 muestras mutantes de G12D, donde solo estaba disponible el tinte de PDL1. En este conjunto de datos, la TPS de PDL1 fue significativamente mayor en G12C que en los tumores mutantes de G12D (p < 0,01, Fig. 2K).
Los tumores de pulmón mutantes de G12C en ratones son más inmunogénicos que los tumores mutantes de G12D
Los informes anteriores sugieren una asociación más fuerte de las mutaciones de G12C con el tabaquismo en comparación con las mutaciones de G12D ([25]), lo que podría influir potencialmente en el fenotipo inmunitario de los tumores. Utilizamos los GEMM de ratón para determinar las diferencias fenotípicas entre G12C y G12D en un entorno controlado. Comparamos la expresión génica entre los tumores KcP y KdP e identificamos los procesos biológicos asociados. Los genes relacionados con la quimiotaxis de linfocitos y otras células inmunitarias (Cxcl9, Cxcl10, Cxcl12, Cxcl13 y Ccl5), las células T CD8 (Cd8a) y la citotoxicidad (Gzmb), los marcadores costimuladores en las células presentadoras de antígenos (Cd80 y Cd86), los receptores de puntos de control (Pdcd1, Ctla4, Tigit, Havcr2), la producción de inmunoglobulinas (Ighg2c y Ighm) y PD-L1 (Cd274) fueron mayores en los tumores KcP en comparación con los KdP (Fig. 3A), lo que es consistente con los tumores de pulmón de pacientes que se muestran en la Figura 2, A y B. Los conjuntos de genes relacionados con la producción de inmunoglobulinas, la respuesta inmunitaria adaptativa y las vías de producción de interferón tipo II se enriquecieron en los tumores KcP en comparación con los KdP (Fig. 3, B y C).
Hemos realizado un perfilado inmunitario de tumores pulmonares de ratón procedentes de los modelos GEMM Kc y Kd en etapas comparables de su progresión tumoral natural (51,41 semanas después de la administración de Ade-Cre para Kc y 14,64 semanas para los ratones Kd, fig. S4A). Con un volumen tumoral comparable determinado por RM (fig. 3D), se observó una mayor proporción de células T (CD3+ T/CD45+, p
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