Elovl6 inhibe la progresión del cáncer colorrectal a través de la fusión mitocondrial y la reprogramación metabólica mediadas por el ácido esteárico.

El cáncer colorrectal (CCR) es un tumor maligno común en el sistema digestivo, ocupando el segundo y tercer lugar en términos de incidencia y tasas de mortalidad a nivel mundial (^[1], ^[2]). Si bien la predisposición genética y los factores ambientales son contribuyentes bien establecidos en la patogénesis del CCR (^[3], ^[4]), los mecanismos moleculares subyacentes a la progresión tumoral aún no se han elucidado por completo. El manejo clínico actual se basa en la elaboración de perfiles moleculares, utilizando estrategias multimodales que combinan la cirugía con la quimioterapia sistémica, los agentes dirigidos a nivel molecular y la inmunoterapia para pacientes seleccionados en función de biomarcadores (^[5], ^[6]). A pesar de estos avances terapéuticos, las tasas de supervivencia a 5 años siguen siendo insatisfactorias, especialmente para los pacientes con enfermedad avanzada (^[7]). Ante los persistentes desafíos de la alta incidencia, la mortalidad y la eficacia limitada del tratamiento, la identificación de dianas moleculares previamente no identificadas y la comprensión de los mecanismos implicados en la patogénesis del CCR son urgentemente necesarias para desarrollar estrategias terapéuticas y preventivas más eficaces.

La reprogramación del metabolismo lipídico se reconoce cada vez más como una característica distintiva del cáncer (^[8]). La evidencia acumulada sugiere que la desregulación del metabolismo lipídico, como la acumulación anormal de lípidos, la lipogénesis y la lipólisis, está estrechamente relacionada con la progresión de la enfermedad del CCR (^[9]–^[11]). En particular, especies lipídicas específicas, incluidos los ácidos grasos (^[12]), los derivados del colesterol (^[13]) y las oxilipinas (^[14]), se han relacionado con el crecimiento, la supervivencia y la diseminación metastásica del CCR. En consecuencia, las enzimas clave del metabolismo lipídico han surgido como prometedoras dianas terapéuticas (^[15], ^[16]). A pesar de estos avances, los mecanismos moleculares precisos por los cuales la remodelación del metabolismo lipídico impulsa la patogénesis del CCR aún no se han elucidado por completo, lo que representa una barrera crítica para el desarrollo de terapias metabólicas dirigidas.

La elongasa de ácidos grasos de cadena muy larga 6 (Elovl6) es una enzima limitante en la síntesis de ácidos grasos que cataliza la elongación de ácidos grasos saturados y monoinsaturados que contienen 14, 16 y 18 carbonos (^[17]). Estudios previos han demostrado que Elovl6 desempeña un papel importante en la regulación de la obesidad y las enfermedades metabólicas relacionadas, incluida la resistencia a la insulina (^[18]), la aterosclerosis (^[19]) y la enfermedad hepática esteatohepatítica no alcohólica (^[20]). Investigaciones recientes han demostrado una fuerte asociación entre Elovl6 y las enfermedades inflamatorias, incluida la atenuación de la inflamación hepática inducida por una dieta rica en grasas (^[20]), la supresión de la fibrosis pulmonar (^[21]) y la regulación del daño cutáneo mecánico (^[22]). Además, se ha relacionado a Elovl6 con la proliferación celular y la apoptosis en varios tipos de cáncer, incluido el CCR (^[23], ^[24]). Sin embargo, la participación mecánica precisa de Elovl6 en la progresión del CCR y su impacto en la remodelación metabólica aún no se comprenden bien y justifican una mayor investigación.

En este estudio, demostramos que la expresión de Elovl6 está disminuida en los tejidos tumorales en comparación con los tejidos normales adyacentes en pacientes con CCR. Para investigar más a fondo la función de Elovl6 en el CCR, construimos tanto ratones con deleción de Elovl6 (KO) como ratones con deleción colónica específica de Elovl6 (CKO). Nuestros hallazgos confirmaron que Elovl6 actúa como un supresor tumoral en el CCR in vivo. Mecánicamente, descubrimos que la deleción de Elovl6 conduce a la disbiosis intestinal y a cambios metabólicos que contribuyen al desarrollo tumoral. Además, Elovl6 reguló la dinámica mitocondrial de forma dependiente del ácido esteárico (SA) al inhibir la ubiquitinación de la mitofusina 1 (MFN1). Estos hallazgos sugieren que Elovl6 puede servir como un biomarcador pronóstico previamente no identificado y como una posible diana terapéutica en el CCR.

RESULTADOS

La baja expresión de Elovl6 se correlacionó con una mala supervivencia de los pacientes con cáncer de colon

Para evaluar el papel de Elovl6 en el CCR, primero examinamos su expresión en muestras clínicas de CCR analizando los datos de secuenciación de ARN de la base de datos del Proyecto Genoma del Cáncer (TCGA). Los resultados indicaron que los niveles de ARNm de Elovl6 estaban significativamente disminuidos en los tejidos de CCR en comparación con los tejidos normales (Fig. 1A). El gen de la proteína p53 (TP53) es el gen mutado con mayor frecuencia en el CCR. Entre los pacientes con mutaciones en TP53 (n = 160), se encontró que la expresión de Elovl6 era menor que en aquellos sin mutaciones (n = 122) (Fig. 1B). Además, evaluamos la expresión de Elovl6 en los tejidos de CCR en diferentes etapas y encontramos que solo estaba presente una expresión significativamente mayor de Elovl6 en las muestras primarias de CCR (etapa N0 sin metástasis en los ganglios linfáticos ni a distancia) (Fig. 1C). Además, el nivel de expresión de Elovl6 se correlacionó con la progresión tumoral, desde las etapas TNM I a IV (Fig. 1D). El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier indicó una asociación positiva entre los niveles de expresión de Elovl6 y la supervivencia general en pacientes con cáncer de colon. Esta asociación fue particularmente significativa en pacientes con enfermedad en etapa I y III, donde una alta expresión de Elovl6 predijo mejores resultados de supervivencia (Fig. 1E). Además, examinamos la expresión de la proteína Elovl6 en pacientes con CCR seleccionados al azar. Los resultados mostraron que 14 de las 20 muestras tumorales exhibieron niveles disminuidos de proteína Elovl6 en comparación con los tejidos normales adyacentes (Fig. 1F). En conjunto, estos resultados sugieren que Elovl6 podría estar implicado en la progresión del CCR y podría ser un posible indicador pronóstico favorable para los pacientes con CCR.

Elovl6 inhibió la proliferación celular y la tumorigénesis del CCR

Para dilucidar aún más el papel funcional de Elovl6 en la patogénesis del CCR, modulamos su expresión en las líneas celulares HCT-116 y Caco-2 (Fig. 2A). Los ensayos de proliferación celular mediante el kit CCK-8 mostraron que el silenciamiento de Elovl6 promovió significativamente la proliferación celular, mientras que la sobreexpresión de Elovl6 revirtió este efecto y restauró la capacidad proliferativa a los niveles de control (Fig. 2B). De manera consistente con esto, los ensayos de formación de colonias demostraron que la depleción de Elovl6 mejoró notablemente la capacidad de formación de colonias de las células de CCR (Fig. 2C). La supresión de Elovl6 no tuvo un efecto significativo sobre la apoptosis, pero aumentó sustancialmente la proporción de células en la fase S, al tiempo que redujo la población en la fase G1 (fig. S1, A y B). En consecuencia, el análisis de Western blot demostró que la supresión de Elovl6 aumentó la expresión de CDK1 y CDK2 y redujo la expresión de p27 Kip1 (fig. S1C).

Para investigar el papel fisiológico de Elovl6 en la patogénesis del CCR in vivo, generamos ratones con deleción de Elovl6 (Elovl6−/−) con un fondo C57BL/6J (fig. S2A). Un análisis exhaustivo confirmó la ablación exitosa de la expresión de Elovl6 en todos los tejidos examinados (fig. S2B). La caracterización fenotípica reveló que la deficiencia de Elovl6 resultó en una reducción significativa del peso corporal en comparación con los hermanos de tipo salvaje (WT) (fig. S2, C y D). De acuerdo con los hallazgos previos (^[18]), los ratones Elovl6−/− demostraron una sensibilidad a la insulina notablemente mejorada (fig. S2, E a G). En particular, el análisis anatómico general no mostró diferencias significativas en los índices de masa de los órganos principales, incluidos el hígado, el bazo y los riñones (fig. S3, A y B). Un perfil hematológico y bioquímico exhaustivo mostró que la ablación de Elovl6 mantuvo los parámetros sanguíneos y la función hepatorenal dentro de los rangos fisiológicos normales (tabla S1 y fig. S3C). Sin embargo, los ratones Elovl6−/− exhibieron cambios en su perfil lipídico en comparación con los ratones WT, que afectaron particularmente a los triglicéridos y los niveles de colesterol total (fig. S3D). Lo más notable es que el análisis cromatográfico de gases demostró una remodelación sustancial de los perfiles de ácidos grasos hepáticos, con efectos particularmente pronunciados en la relación de ácidos grasos C16/C18 (fig. S3E).

La ablación genética de Elovl6 exacerbó modestamente la progresión de la colitis aguda, aumentando la gravedad de la inflamación en la mucosa del intestino delgado (fig. S4). En el modelo de carcinogénesis colorrectal inducida por azoximetano/dextrano sulfato de sodio (AOM/DSS), la deficiencia de Elovl6 no solo aceleró la tumorigénesis colónica, sino que también indujo esteatosis hepática. El examen patológico reveló que los ratones Elovl6−/− desarrollaron una hiperemia colónica pronunciada y un acortamiento significativo del colon después del tercer ciclo de DSS en comparación con los controles WT (fig. S5, A a C). Además, los ratones Elovl6−/− exhibieron una marcada necrosis esplénica y acumulación de lípidos en el hígado (fig. S5, D a G). Tres meses después de la inducción de AOM/DSS, los ratones Elovl6−/− exhibieron una pérdida de peso significativa y un aumento de la incidencia de prolapso rectal (Fig. 2, D y E). Como se esperaba, los grupos Elovl6−/− mostraron más tumores y mayores volúmenes tumorales en comparación con sus ratones de control (Fig. 2, F y G).

La deleción colónica específica de Elovl6 en ratones aceleró la tumorigénesis colorrectal

Para dilucidar el papel supresor tumoral de Elovl6 en la carcinogénesis colorrectal, generamos ratones con deleción colónica específica de Elovl6 (CKO) mediante la recombinación mediada por Cre-loxP entre Elovl6loxp/loxp y ratones Villin-Cre (Fig. 3A y fig. S6, A a C). La ablación exitosa de la expresión de Elovl6 en el colon se confirmó mediante la reacción en cadena de la polimerasa de fluorescencia en tiempo real cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) y el Western blot (fig. S6, D y E). La evaluación fisiológica no reveló alteraciones significativas en el peso corporal, la función hepática/renal o los perfiles lipídicos séricos entre los ratones CKO y los controles (fig. S7). En la colitis inducida por DSS, los ratones CKO exhibieron una inflamación exacerbada, caracterizada por un aumento del índice de actividad de la enfermedad (P < 0,05), el acortamiento del colon (P < 0,01), el daño tisular y los puntajes de histopatología elevados (P < 0,05) (fig. S8, A a E). En particular, los ratones CKO exhibieron mayores tasas de mortalidad en el modelo de colitis inducida por DSS, lo que demuestra una mayor susceptibilidad a la toxicidad mediada por DSS (fig. S8F). Para investigar la tumorigénesis, sometimos a los ratones CKO y a sus hermanos de la camada al protocolo de carcinogénesis AOM/DSS (Fig. 3B). La evaluación endoscópica demostró un daño notablemente mayor de la mucosa colónica en los ratones CKO, con un desarrollo tumoral universal al día 90 (Fig. 3C). El análisis cuantitativo confirmó diferencias significativas en el número de tumores y los volúmenes tumorales entre los grupos CKO y WT (Fig. 3, D a F). Al día 120, los ratones CKO mostraron tumores colónicos generalizados, mientras que los ratones WT solo tenían tumores en los colones distales (Fig. 3G). La progresión tumoral se aceleró notablemente en los ratones CKO, como lo evidencian el aumento del número de tumores (Fig. 3H), el aumento de los volúmenes tumorales (Fig. 3I) y los puntajes de histopatología elevados (Fig. 3J). Para ampliar estos hallazgos, también generamos ratones Apc-mutantes con una deleción de Elovl6. En particular, en comparación con el modelo AOM/DSS, el modelo espontáneo APCmin/+ en sí mismo exhibió una respuesta inflamatoria consistentemente más leve, con una expresión significativamente menor de factor de necrosis tumoral-α, interleucina-6 (IL-6) y IL-1β tanto en el suero como en el tejido del colon (fig. S9). A pesar de este distinto panorama inflamatorio, la ablación genética de Elovl6 en el fondo mutante Apc también mejoró de manera robusta la tumorigénesis (fig. S10). Los enfoques genéticos complementarios que utilizan ratones KO de Elovl6 convencionales y condicionales demostraron de manera consistente un aumento de la carga tumoral, lo que estableció a Elovl6 como un supresor tumoral previamente no identificado en la patogénesis del CCR.

Los ratones KO de Elovl6 mostraron disbiosis de la microbiota intestinal

Existe una creciente evidencia que relaciona la disbiosis de la microbiota intestinal con un importante factor contribuyente a la tumorigénesis colorrectal. Planteamos la hipótesis de que la deleción de Elovl6 podría exacerbar la progresión tumoral al alterar la homeostasis microbiana intestinal. Para probar esto, realizamos un análisis longitudinal de ARN ribosómico 16S (ARNr) mediante secuenciación en muestras fecales obtenidas de ratones KO y WT en el momento basal (día 0), en un punto intermedio (día 50) y al final (día 90) del tratamiento con AOM/DSS. El análisis de la diversidad alfa reveló una diversidad microbiana significativamente mayor en los ratones KO en comparación con los controles (índices de Shannon y Simpson, P < 0,05; Fig. 4A). Cabe destacar que, si bien los ratones WT mostraron una reducción progresiva en la riqueza microbiana [estimador de cobertura basado en la abundancia (ACE), Chao1 e índices de especies observadas] durante el desarrollo del CRC, los ratones KO demostraron una tendencia opuesta (Fig. 4A). El análisis de la diversidad beta indicó que la composición de las comunidades microbianas en el grupo WT-0 era claramente distinta de todos los demás grupos, entre los cuales no se detectaron diferencias estadísticamente significativas (Fig. 4B). Además, analizamos las diferencias en la composición del microbioma entre los ratones KO y los ratones de control. A nivel de filo, ambos grupos mantuvieron Bacteroidota y Firmicutes como filos dominantes, pero los ratones KO mostraron una reducción notable en la relación Firmicutes/Bacteroidota (Fig. 4, C y D). El perfil del microbioma reveló un enriquecimiento significativo de géneros asociados con afecciones inflamatorias intestinales en los ratones KO, incluidos Alistipes, Bacteroides, Parasutterella, Alloprevotella y PrevotellaceaeUCG-001 (fig. S11). Para probar si la microbiota de los ratones Elovl6−/− con tumores tiene una mayor capacidad para promover la tumorigénesis, realizamos un trasplante de microbiota fecal (TMF). Las muestras fecales de los ratones donantes Elovl6−/− que habían sido sometidos al tratamiento con AOM/DSS se transfirieron a ratones receptores WT pretratados con antibióticos (Fig. 4E). La administración oral de diferentes muestras fecales no tuvo ningún impacto en el peso corporal (Fig. 4F). En un plazo de 2 meses, los ratones que recibieron la microbiota Elovl6−/− mostraron una incidencia tumoral notablemente mayor (10 de 11 ratones, 91%) en comparación con los que recibieron la microbiota WT (3 de 11 ratones, 27%). De manera consistente, tanto el número como el volumen de los tumores aumentaron significativamente en el grupo Elovl6_−/−-TMF (Fig. 4, G a I). Estos resultados demostraron que el cambio en la composición de la microbiota intestinal inducido por la deficiencia de Elovl6 podría contribuir, al menos en parte, al desarrollo del CRC.

Los ratones Elovl6-KO mostraron alteraciones en la metabolómica intestinal

Dado el conocido potencial metabólico versátil de la microbiota patógena enriquecida y la posible participación de Elovl6 en la regulación metabólica, realizamos un perfil metabólico integral no dirigido en muestras fecales tanto de los modelos AOM/DSS como APCmin/+. El análisis de componentes principales (ACP) reveló una tendencia consistente de cambio metabólico durante el desarrollo tumoral en ambos modelos. En el modelo AOM/DSS, los metabolomas de los ratones WT y KO se separaron claramente en el momento basal, pero se agruparon en mayor proximidad después de la inducción del tumor (Fig. 5, A y B). Este patrón se reflejó en el modelo APCmin/+, donde los ratones de control y KO sin tumores estuvieron completamente segregados, pero los ratones con tumores de ambos genotipos mostraron una superposición sustancial en sus metabolomas (fig. S12A). El análisis diferencial de metabolitos cuantificó las alteraciones específicas del genotipo en los diferentes modelos: en el modelo AOM/DSS, los ratones KO mostraron 1258 (564 ascendentes y 694 descendentes) y 726 (327 ascendentes y 399 descendentes) cambios en las etapas basal y tumoral, respectivamente (Fig. 5, C y D); se confirmó una escala comparable de desregulación en el modelo APCmin/+ (fig. S12B). En particular, el análisis de enriquecimiento de vías demostró una notable concordancia entre los dos modelos genéticamente distintos. En el estado sin tumores, los metabolitos diferenciales en ambos modelos se enriquecieron de manera consistente en un conjunto central de vías, que incluyen el metabolismo central del carbono en el cáncer; transportadores de casete de unión a adenosina trifosfato (ATP); metabolismo del alanina, aspartato y glutamato; metabolismo del ácido linoleico; metabolismo del β-alanina; y metabolismo de la cisteína y la metionina (Fig. 5E y fig. S12C). Durante la tumorigénesis, las diferencias metabólicas entre los genotipos en ambos modelos convergieron aún más en alteraciones de vías compartidas, notablemente en la biosíntesis de ácidos biliares primarios; metabolismo del glicina, serina y treonina; y metabolismo de los esfingolípidos (Fig. 5F y fig. S12D).

Para dilucidar las alteraciones metabólicas adaptativas en los ratones Elovl6-KO durante la carcinogénesis del colon inducida por AOM/DSS, realizamos un perfil metabólico comparativo en tres fases críticas: momento basal (día 0), inflamación (día 50) y tumorigénesis (día 90). En particular, el ACP mostró una agrupación distinta de los perfiles metabólicos entre los estados saludables y patológicos (inflamación y tumorigénesis) en los ratones WT. En contraste, los ratones KO exhibieron una superposición considerable en sus perfiles metabólicos en los tres puntos temporales (fig. S13A). El análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto reveló distintas adaptaciones metabólicas en los ratones WT durante la progresión de la enfermedad. Durante la inflamación, los ratones WT mostraron una regulación al alza de las interconversiones de pentosa y glucuronato, así como del metabolismo de la cisteína y la metionina, junto con una regulación a la baja del metabolismo del nicotinato y la nicotinamida y la termogénesis (fig. S13B). En la fase tumorigénica, regularon aún más al alza el metabolismo de la cisteína y la metionina y la biosíntesis de arginina, al tiempo que suprimieron la biosíntesis de ácidos biliares primarios y el metabolismo del ácido α-linolénico (fig. S13C). En contraste, los ratones Elovl6-KO mostraron una reprogramación metabólica divergente durante la tumorigénesis. Los metabolitos regulados al alza se enriquecieron predominantemente en el metabolismo de la pirimidina y el metabolismo del ácido linoleico en condiciones inflamatorias, mientras que los metabolitos regulados a la baja se asociaron con el metabolismo del ácido araquidónico y la biosíntesis de ácidos biliares primarios (fig. S13D). En particular, en comparación con los ratones de control, la vía de la biosíntesis de ácidos biliares primarios, que se reguló a la baja en los ratones KO al día 50, surgió como una vía metabólica regulada al alza al día 90 (fig. S13E). Estos resultados sugirieron un remodelamiento metabólico dinámico durante la transición de la inflamación al cáncer, lo que destaca la notable plasticidad metabólica de los ratones deficientes en Elovl6 a lo largo de la progresión de la enfermedad.

A continuación, realizamos un análisis de agrupación de series temporales de todos los metabolitos utilizando Mfuzz (Fig. 5G). Nuestros datos respaldaron la hipótesis de que Elovl6 desempeña un papel crucial en la remodelación metabólica, particularmente en el metabolismo de los lípidos. En particular, aproximadamente el 50% de los metabolitos que mostraron tendencias opuestas entre los dos genotipos fueron especies relacionadas con los lípidos. Para investigar más a fondo este fenómeno, realizamos un análisis lipídico integral de los ratones WT y los ratones Elovl6-KO. Los resultados del análisis mostraron que la deleción de Elovl6 afectó predominantemente al metabolismo de los glicerofosfolípidos (Fig. 5H). Específicamente, Elovl6 KO indujo una regulación al alza significativa de 45 especies de lípidos, incluidos los principales fosfolípidos como la fosfatidiletanolamina (PE) (18:0p/20:4), la esfingomielina (SM) (d16:0/18:1), la fosfatidilcolina (PC) (18:1p/16:0) y la fosfatidilserina (PS) (18:0/22:6), al tiempo que reguló a la baja 22 especies de lípidos, incluidos PE (18:1p/16:0), PC (31:0) y SM (d34:1) (Fig. 5I). Para investigar la naturaleza autónoma de la reprogramación metabólica observada in vivo, realizamos un perfil lipídico en líneas celulares de CRC humanas Elovl6-silenciadas, HCT-116 y Caco-2. La deficiencia de Elovl6 resultó en un aumento significativo de la abundancia celular total de glicerofosfolípidos en ambas líneas (fig. S14, A y B). En concordancia, el análisis de vías identificó "metabolismo de glicerofosfolípidos" como una vía notablemente alterada en las células silenciadas (fig. S14C). Sin embargo, el análisis de mapas de calor reveló que los tipos específicos de glicerofosfolípidos regulados al alza en las dos líneas celulares diferían de los datos in vivo (fig. S14D). Además, el análisis RT-qPCR mostró que el silenciamiento de Elovl6 elevó significativamente la expresión de ARNm de los principales genes relacionados con la biosíntesis de fosfolípidos (Fig. 5J y fig. S14E). Para determinar la capacidad funcional de los glicerofosfolípidos acumulados para promover la tumorigénesis, utilizamos un enfoque basado en la suplementación in vitro e in vivo. La suplementación exógena de cuatro glicerofosfolípidos diferentes mejoró significativamente la capacidad proliferativa de las líneas celulares de cáncer de colon murino MC38 y CT26 in vitro (Fig. 6, A y B). En un modelo de tumor subcutáneo, la administración de glicerofosfolípidos individuales promovió notablemente el crecimiento tumoral in vivo, como lo evidencian los aumentos significativos tanto en el peso como en el volumen del tumor (Fig. 6, C a F). En conjunto, estos análisis multiómicos integrales y la validación funcional establecen que la deficiencia de Elovl6 impulsa una profunda reprogramación metabólica, particularmente en el metabolismo de los glicerofosfolípidos, lo que impulsa una tumorigénesis acelerada en los ratones.

Elovl6 reguló la estructura y la función mitocondrial

La reprogramación metabólica durante la activación celular exhibió una estricta dependencia de la remodelación de la arquitectura mitocondrial (^[25]). Para dilucidar el papel de Elovl6 en la regulación mitocondrial, primero evaluamos los parámetros funcionales clave. El silenciamiento de Elovl6 no mostró efectos significativos en el potencial de membrana mitocondrial, los niveles de calcio mitocondrial o los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) celulares (fig. S15). Sin embargo, el análisis de flujo extracelular de Seahorse reveló que la deficiencia de Elovl6 mejoró notablemente la capacidad oxidativa mitocondrial, como lo evidencian el aumento de la respiración basal, la capacidad respiratoria de reserva y la producción de ATP (Fig. 7A). En corroboración con estos hallazgos, los niveles celulares de ATP aumentaron significativamente en las células deficientes en Elovl6 (Fig. 7B), con efectos consistentes observados en las células Caco-2 (fig. S16, A y B). En particular, el análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica demostró que el silenciamiento de Elovl6 indujo una pronunciada fragmentación mitocondrial, con orgánulos sustancialmente acortados (Fig. 7C). En consonancia con los resultados in vitro, los ratones Elovl6-KO específicos del colon exhibieron una longitud mitocondrial acortada en comparación con los controles WT (fig. S16C). En apoyo de estas observaciones, la tinción con MitoTracker Red reveló tanto una longitud mitocondrial reducida como una integridad de red alterada en las células deficientes en Elovl6 (Fig. 7D). Dado que la arquitectura mitocondrial se regula dinámicamente a través de procesos de fisión y fusión equilibrados mediados por guanosina trifosfatasas especializadas (^[26], ^[27]), examinamos los principales reguladores de la homeostasis de la fisión/fusión. Los resultados del Western blot mostraron que el silenciamiento de Elovl6 reguló específicamente a la baja las proteínas de fusión MFN1 y MFN2, sin alterar la expresión del regulador de la fisión, la proteína relacionada con la dinina 1 (DRP1) (Fig. 7E), lo que indica un cambio hacia la fragmentación mitocondrial a través de una capacidad de fusión deteriorada.

El tratamiento con SA mejoró la capacidad de fusión mitocondrial

En este estudio, confirmamos la interacción entre Elovl6 y MFN1, tanto a nivel de expresión ectópica como endógena, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación (Fig. 8, A y B). Los experimentos de seguimiento con cicloheximida (CHX) demostraron que Elovl6 regula la estabilidad de la proteína MFN1. Como se muestra en la Fig. 8C, la reducción de Elovl6 aceleró notablemente la degradación de MFN1, mientras que la sobreexpresión de Elovl6 confirió estabilización de la proteína. Se requieren investigaciones experimentales adicionales para dilucidar los detalles moleculares de la interacción Elovl6-MFN1. Cabe destacar que identificamos el ácido esteárico (C18:0) como un modulador específico de la fusión mitocondrial mediada por Elovl6-MFN1. La naturaleza dependiente de los ácidos grasos de la regulación de la dinámica mitocondrial por parte de Elovl6 se demostró mediante la incapacidad de la sobreexpresión de Elovl6 para revertir la fragmentación mitocondrial en condiciones de suero deslipidado. En particular, entre los diversos ácidos grasos probados (C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 y C18:2), solo la suplementación con C18:0 restauró eficazmente la integridad de la red mitocondrial (Fig. 8D y Fig. S16D). Las investigaciones mecanicistas revelaron que el C18:0 modula la estabilidad de MFN1 a través de modificaciones postraduccionales, como lo demuestra la reducción de la ubiquitinación (Fig. 8, E y F) y el aumento de la vida media de la proteína en los ensayos de seguimiento con CHX (Fig. 8G). En conjunto, nuestros hallazgos demostraron que el ácido esteárico derivado de Elovl6 actúa como un regulador metabólico crítico de la vía de fusión mitocondrial mediada por Elovl6-MFN1.### La suplementación con ácido esteárico suprimió la tumorigénesis colorrectal.

Para determinar si el ácido esteárico funciona como el efector aguas abajo crítico de la supresión tumoral mediada por Elovl6, realizamos experimentos de rescate complementarios. En las células CRC HCT-116 y Caco-2, la reducción de Elovl6 mejoró significativamente la capacidad proliferativa; este efecto protumorígeno se abolió por completo con la suplementación con ácido esteárico, que restauró la viabilidad celular a los niveles de control (Fig. 9, A y B). Para validar estos hallazgos in vivo, realizamos intervenciones dietéticas en el modelo de CRC inducido por AOM/DSS. Como se muestra en la Tabla S2, los ratones tratados con ácido esteárico (grupo de ácido esteárico) recibieron una dieta suplementada con un 1,5% de ácido esteárico. En el modelo de ratón Elovl6-KO, la suplementación dietética con ácido esteárico redujo significativamente el número de tumores y restringióPotentemente el crecimiento tumoral, con todos los tumores en los ratones KO tratados con ácido esteárico que permanecieron por debajo de 20 mm3 en comparación con los tumores grandes (hasta 54,95 mm3) observados en los controles KO no tratados (Fig. 9, C a E). Además, la suplementación con ácido esteárico en ratones WT suprimió significativamente la tumorigénesis, reduciendo tanto el número de tumores como el volumen (Fig. 9, C a E). En conjunto, estos resultados establecieron el ácido esteárico como un metabolito clave con actividad supresora de tumores, lo que destaca su potencial valor terapéutico para la intervención en el CRC.

La baja expresión de Elovl6 se correlacionó con una mala supervivencia de los pacientes con cáncer de colon

Para evaluar el papel de Elovl6 en el CRC, primero examinamos su expresión en muestras clínicas de cáncer colorrectal mediante el análisis de datos de secuenciación de ARN de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA). Los resultados indicaron que los niveles de ARNm de Elovl6 estaban significativamente disminuidos en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales (Fig. 1A). El gen de la proteína tumoral p53 (TP53) es el gen mutado con mayor frecuencia en el CRC. Entre los pacientes con mutaciones en TP53 (n = 160), se encontró que la expresión de Elovl6 era menor que en aquellos sin mutaciones (n = 122) (Fig. 1B). Además, evaluamos la expresión de Elovl6 en los tejidos de CRC en diferentes etapas y encontramos que solo estaba presente una expresión significativamente aumentada de Elovl6 en las muestras primarias de CRC (etapa N0 sin metástasis en los ganglios linfáticos y a distancia) (Fig. 1C). Además, el nivel de expresión de Elovl6 se correlacionó con la progresión tumoral, desde las etapas TNM I a IV (Fig. 1D). El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier indicó una asociación positiva entre los niveles de expresión de Elovl6 y la supervivencia general en pacientes con cáncer de colon. Esta asociación fue particularmente significativa en pacientes con enfermedad en etapa I y III, donde una alta expresión de Elovl6 predijo mejores resultados de supervivencia (Fig. 1E). Además, examinamos la expresión de la proteína Elovl6 en pacientes seleccionados aleatoriamente con CRC. Los resultados mostraron que 14 de las 20 muestras de tumores exhibieron niveles disminuidos de proteína Elovl6 en comparación con los tejidos normales adyacentes (Fig. 1F). En conjunto, estos resultados sugieren que Elovl6 podría estar implicado en la progresión del CRC y podría ser un posible indicador pronóstico favorable para los pacientes con CRC.

Elovl6 inhibió la proliferación celular y la tumorigénesis del CRC

Para dilucidar aún más el papel funcional de Elovl6 en la patogénesis del CRC, modulamos su expresión en las líneas celulares HCT-116 y Caco-2 (Fig. 2A). Los ensayos de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) mostraron que la reducción de Elovl6 promovió significativamente la proliferación celular, mientras que la sobreexpresión de Elovl6 revirtió este efecto y restauró la capacidad proliferativa a los niveles de control (Fig. 2B). En consonancia con esto, los ensayos de formación de colonias demostraron que el agotamiento de Elovl6 mejoró notablemente la capacidad clonogénica de las células de CRC (Fig. 2C). La reducción de Elovl6 no tuvo un efecto significativo sobre la apoptosis, pero aumentó sustancialmente la proporción de células en la fase S, al tiempo que redujo la población en la fase G1 (Fig. S1, A y B). En consecuencia, el análisis de Western blot demostró que la reducción de Elovl6 aumentó la expresión de CDK1 y CDK2 y redujo la expresión de p27 Kip1 (Fig. S1C).

Para investigar el papel fisiológico de Elovl6 en la patogénesis del CRC in vivo, generamos ratones Elovl6-KO (Elovl6−/−) con un fondo C57BL/6J (Fig. S2A). El análisis exhaustivo confirmó la ablación exitosa de la expresión de Elovl6 en todos los tejidos examinados (Fig. S2B). La caracterización fenotípica reveló que la deficiencia de Elovl6 resultó en una reducción significativa del peso corporal en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje (WT) (Fig. S2, C y D). En concordancia con los hallazgos previos (^[18]), los ratones Elovl6−/− demostraron una sensibilidad a la insulina notablemente mejorada (Fig. S2, E a G). En particular, el análisis anatómico general no mostró diferencias significativas en los índices de masa de los órganos principales, incluidos el hígado, el bazo y los riñones (Fig. S3, A y B). El perfil hematológico y bioquímico exhaustivo mostró que la ablación de Elovl6 mantuvo los parámetros sanguíneos y la función hepatorenal dentro de los rangos fisiológicos normales (Tabla S1 y Fig. S3C). Sin embargo, los ratones Elovl6−/− exhibieron cambios en su perfil lipídico en comparación con los ratones WT, lo que afectó particularmente a los triglicéridos y los niveles de colesterol total (Fig. S3D). Lo más notable es que el análisis cromatográfico de gases demostró una remodelación sustancial de los perfiles de ácidos grasos hepáticos, con efectos particularmente pronunciados en la relación de ácidos grasos C16/C18 (Fig. S3E).

La ablación genética de Elovl6 exacerbó modestamente la progresión de la colitis aguda, lo que aumentó la gravedad de la inflamación en la mucosa del intestino delgado (Fig. S4). En el modelo de carcinogénesis colorrectal inducido por azoximetano/dextrano sulfato de sodio (AOM/DSS), la deficiencia de Elovl6 no solo aceleró la tumorigénesis colónica, sino que también indujo esteatosis hepática. El examen patológico reveló que los ratones Elovl6−/− desarrollaron una hiperemia colónica pronunciada y un acortamiento significativo del colon después del tercer ciclo de DSS en comparación con los controles WT (Fig. S5, A a C). Además, los ratones Elovl6−/− exhibieron una marcada necrosis esplénica y acumulación de lípidos en el hígado (Fig. S5, D a G). Tres meses después de la inducción de AOM/DSS, los ratones Elovl6−/− exhibieron una pérdida de peso significativa y un aumento de la incidencia de prolapso rectal (Fig. 2, D y E). Como se esperaba, los grupos Elovl6−/− mostraron más tumores y mayores volúmenes tumorales en comparación con sus ratones de control (Fig. 2, F y G).

La deleción colónica específica de Elovl6 en ratones aceleró la tumorigénesis colorrectal

Para dilucidar el papel supresor de tumores de Elovl6 en la carcinogénesis colorrectal, generamos ratones Elovl6-KO específicos del colon (CKO) a través de la recombinación mediada por Cre-loxP entre Elovl6loxp/loxp y ratones Villin-Cre (Fig. 3A y Fig. S6, A a C). La ablación exitosa de la expresión de Elovl6 en el colon se confirmó mediante la reacción en cadena de la polimerasa de fluorescencia cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa (RT-qPCR) y el Western blot (Fig. S6, D y E). La evaluación fisiológica no reveló alteraciones significativas en el peso corporal, la función hepática/renal o los perfiles lipídicos séricos entre los ratones CKO y los controles (Fig. S7). En la colitis inducida por DSS, los ratones CKO exhibieron una inflamación exacerbada, caracterizada por un aumento del índice de actividad de la enfermedad (P < 0,05), acortamiento del colon (P < 0,01), daño tisular y aumento de las puntuaciones de histopatología (P < 0,05) (Fig. S8, A a E). En particular, los ratones CKO exhibieron mayores tasas de mortalidad en el modelo de colitis inducida por DSS, lo que demuestra una mayor susceptibilidad a la toxicidad mediada por DSS (Fig. S8F). Para investigar la tumorigénesis, sometimos a los ratones CKO y a los compañeros de camada de control al protocolo de carcinogénesis AOM/DSS (Fig. 3B). La evaluación endoscópica demostró un daño notablemente mayor de la mucosa colónica en los ratones CKO, con un desarrollo tumoral universal al día 90 (Fig. 3C). El análisis cuantitativo confirmó diferencias significativas en el número de tumores y los volúmenes tumorales entre los grupos CKO y WT (Fig. 3, D a F). Al día 120, los ratones CKO mostraron tumores colónicos generalizados, mientras que los ratones WT solo tenían tumores en los colones distales (Fig. 3G). La progresión tumoral se aceleró notablemente en los ratones CKO, como lo demuestra el aumento del número de tumores (Fig. 3H), el aumento de los volúmenes tumorales (Fig. 3I) y el aumento de las puntuaciones de histopatología (Fig. 3J). Para ampliar estos hallazgos, también generamos ratones Apc-mutantes con una deleción de Elovl6. En particular, en comparación con el modelo AOM/DSS, el modelo espontáneo APCmin/+ en sí mismo exhibió una respuesta inflamatoria consistentemente más leve, con una expresión significativamente menor de factor de necrosis tumoral-α, interleucina-6 (IL-6) y IL-1β tanto en el suero como en el tejido del colon (Fig. S9). A pesar de este distinto panorama inflamatorio, la ablación genética de Elovl6 en el fondo Apc-mutante también mejoró robustamente la tumorigénesis (Fig. S10). Los enfoques genéticos complementarios que utilizan ratones Elovl6-KO convencionales y condicionales demostraron de manera consistente un aumento de la carga tumoral, lo que estableció a Elovl6 como un supresor tumoral previamente no identificado en la patogénesis del CRC.

Los ratones Elovl6-KO mostraron disbiosis de la microbiota intestinal

SPANISH TRANSLATION:

Existe una creciente evidencia que relaciona la disbiosis de la microbiota intestinal con la tumorigénesis colorrectal. Planteamos la hipótesis de que la deleción de Elovl6 podría exacerbar la progresión tumoral al alterar la homeostasis microbiana intestinal. Para probar esto, realizamos un análisis longitudinal de ARN ribosómico 16S (ARNr) mediante secuenciación en muestras fecales recolectadas de ratones KO y WT en el momento basal (día 0), en un punto intermedio (día 50) y al final (día 90) del tratamiento con AOM/DSS. El análisis de la diversidad alfa reveló una diversidad microbiana significativamente mayor en los ratones KO en comparación con los controles (índices de Shannon y Simpson, P < 0,05; Fig. 4A). Cabe destacar que, si bien los ratones WT mostraron una reducción progresiva en la riqueza microbiana [estimador de cobertura basado en la abundancia (ACE), Chao1 e índices de especies observadas] durante el desarrollo del CRC, los ratones KO demostraron una tendencia opuesta (Fig. 4A). El análisis de la diversidad beta indicó que la composición de las comunidades microbianas en el grupo WT-0 era claramente distinta de todos los demás grupos, entre los cuales no se detectaron diferencias estadísticamente significativas (Fig. 4B). Además, analizamos las diferencias en la composición del microbioma entre los ratones KO y los controles. A nivel de filo, ambos grupos mantuvieron Bacteroidota y Firmicutes como filos dominantes, pero los ratones KO mostraron una reducción notable en la relación Firmicutes/Bacteroidota (Fig. 4, C y D). El perfil del microbioma reveló un enriquecimiento significativo de géneros asociados con afecciones inflamatorias intestinales en los ratones KO, incluidos Alistipes, Bacteroides, Parasutterella, Alloprevotella y PrevotellaceaeUCG-001 (fig. S11). Para probar si la microbiota de los ratones Elovl6−/− con tumores tiene una mayor capacidad para impulsar la tumorigénesis, realizamos un trasplante de microbiota fecal (TMF). Las muestras fecales de ratones donantes Elovl6−/− que habían sido sometidos al tratamiento con AOM/DSS se transfirieron a ratones receptores WT pretratados con antibióticos (Fig. 4E). La administración oral de diferentes muestras fecales no tuvo ningún impacto en el peso corporal (Fig. 4F). En un plazo de 2 meses, los ratones que recibieron la microbiota Elovl6−/− mostraron una incidencia tumoral notablemente mayor (10 de 11 ratones, 91%) en comparación con los que recibieron la microbiota WT (3 de 11 ratones, 27%). De manera consistente, tanto el número como el volumen de los tumores aumentaron significativamente en el grupo Elovl6_−/−-TMF (Fig. 4, G a I). Estos resultados demostraron que el cambio en la composición de la microbiota intestinal inducido por la deficiencia de Elovl6 podría contribuir, al menos en parte, al desarrollo del CRC.

Los ratones Elovl6-KO mostraron alteraciones en la metabolómica intestinal

Dado el conocido potencial metabólico versátil de la microbiota patógena enriquecida y la posible participación de Elovl6 en la regulación metabólica, realizamos un perfilado metabolómico no dirigido exhaustivo en muestras fecales de los modelos AOM/DSS y APCmin/+. El análisis de componentes principales (ACP) reveló una tendencia consistente de cambio metabólico durante el desarrollo tumoral en ambos modelos. En el modelo AOM/DSS, los metabolomas de los ratones WT y KO se separaron claramente en el momento basal, pero se agruparon en mayor proximidad después de la inducción del tumor (Fig. 5, A y B). Este patrón se reflejó en el modelo APCmin/+, donde los ratones de control y KO sin tumores estuvieron completamente segregados, pero los ratones con tumores de ambos genotipos mostraron una superposición sustancial en sus metabolomas (fig. S12A). El análisis diferencial de metabolitos cuantificó las alteraciones específicas del genotipo en los diferentes modelos: en el modelo AOM/DSS, los ratones KO mostraron 1258 (564 ascendentes y 694 descendentes) y 726 (327 ascendentes y 399 descendentes) cambios en las etapas basal y tumoral, respectivamente (Fig. 5, C y D); se confirmó una escala comparable de desregulación en el modelo APCmin/+ (fig. S12B). Lo más importante es que el análisis de enriquecimiento de vías demostró una notable concordancia entre los dos modelos genéticamente distintos. En el estado sin tumores, los metabolitos diferenciales en ambos modelos se enriquecieron de manera consistente en un conjunto central de vías, que incluyen el metabolismo central del carbono en el cáncer; transportadores de casete de unión a adenosina trifosfato (ATP); metabolismo del alanina, aspartato y glutamato; metabolismo del ácido linoleico; metabolismo del β-alanina; y metabolismo de la cisteína y la metionina (Fig. 5E y fig. S12C). Durante la tumorigénesis, las diferencias metabólicas entre los genotipos en ambos modelos convergieron aún más en alteraciones de vías compartidas, notablemente en la biosíntesis de ácidos biliares primarios; metabolismo del glicina, serina y treonina; y metabolismo de los esfingolípidos (Fig. 5F y fig. S12D).

Para dilucidar las alteraciones metabólicas adaptativas en los ratones Elovl6-KO durante la carcinogénesis del colon inducida por AOM/DSS, realizamos un perfilado metabolómico comparativo en tres fases críticas: momento basal (día 0), inflamación (día 50) y tumorigénesis (día 90). Cabe destacar que el ACP mostró una agrupación distinta de los perfiles metabólicos entre los estados saludables y patológicos (inflamación y tumorigénesis) en los ratones WT. En contraste, los ratones KO mostraron una superposición considerable en sus perfiles metabólicos en los tres puntos temporales (fig. S13A). El análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto reveló distintas adaptaciones metabólicas en los ratones WT durante la progresión de la enfermedad. Durante la inflamación, los ratones WT mostraron una regulación al alza de las interconversiones de pentosa y glucuronato, así como del metabolismo de la cisteína y la metionina, junto con una regulación a la baja del metabolismo del nicotinato y la nicotinamida y la termogénesis (fig. S13B). En la fase tumorigénica, regularon aún más al alza el metabolismo de la cisteína y la metionina y la biosíntesis de arginina, al tiempo que suprimieron la biosíntesis de ácidos biliares primarios y el metabolismo del ácido α-linolénico (fig. S13C). En contraste, los ratones Elovl6-KO mostraron una reprogramación metabólica divergente durante la tumorigénesis. Los metabolitos regulados al alza se enriquecieron predominantemente en el metabolismo de la pirimidina y el metabolismo del ácido linoleico en condiciones inflamatorias, mientras que los metabolitos regulados a la baja se asociaron con el metabolismo del ácido araquidónico y la biosíntesis de ácidos biliares primarios (fig. S13D). Cabe destacar que, en comparación con los ratones de control, la vía de la biosíntesis de ácidos biliares primarios, que se reguló a la baja en los ratones KO en el día 50, surgió como una vía metabólica regulada al alza en el día 90 (fig. S13E). Estos resultados sugieren una remodelación metabólica dinámica durante la transición de la inflamación al cáncer, lo que destaca la notable plasticidad metabólica de los ratones deficientes en Elovl6 a lo largo de la progresión de la enfermedad.

A continuación, realizamos un análisis de agrupación de series temporales de todos los metabolitos utilizando Mfuzz (Fig. 5G). Nuestros datos respaldaron la hipótesis de que Elovl6 desempeña un papel crucial en la remodelación metabólica, particularmente en el metabolismo de los lípidos. Cabe destacar que aproximadamente el 50% de los metabolitos que mostraron tendencias opuestas entre los dos genotipos fueron especies relacionadas con los lípidos. Para investigar más a fondo este fenómeno, realizamos un análisis lipídico exhaustivo de los ratones WT y los ratones Elovl6-KO. Los resultados del análisis mostraron que la deleción de Elovl6 afectó predominantemente al metabolismo de los glicerofosfolípidos (Fig. 5H). Específicamente, Elovl6 KO indujo una regulación al alza significativa de 45 especies de lípidos, incluidos los principales fosfolípidos como la fosfatidiletanolamina (PE) (18:0p/20:4), la esfingomielina (SM) (d16:0/18:1), la fosfatidilcolina (PC) (18:1p/16:0) y la fosfatidilserina (PS) (18:0/22:6), al tiempo que reguló a la baja 22 especies de lípidos, incluidos la PE (18:1p/16:0), la PC (31:0) y la SM (d34:1) (Fig. 5I). Para investigar la naturaleza autónoma de la reprogramación metabólica observada in vivo, realizamos un perfilado lipídico en las líneas celulares de CRC humanas Elovl6-silenciadas HCT-116 y Caco-2. La deficiencia de Elovl6 resultó en un aumento significativo de la abundancia celular total de glicerofosfolípidos en ambas líneas (fig. S14, A y B). En concordancia, el análisis de vías identificó "metabolismo de glicerofosfolípidos" como una vía notablemente alterada en las células silenciadas (fig. S14C). Sin embargo, el análisis de mapa de calor reveló que los tipos específicos de glicerofosfolípidos regulados al alza en las dos líneas celulares diferían de los datos in vivo (fig. S14D). Además, el análisis RT-qPCR mostró que el silenciamiento de Elovl6 elevó significativamente la expresión de ARNm de los principales genes relacionados con la biosíntesis de fosfolípidos (Fig. 5J y fig. S14E). Para determinar la capacidad funcional de los glicerofosfolípidos acumulados para promover la tumorigénesis, utilizamos un enfoque basado en la suplementación in vitro e in vivo. La suplementación exógena de cuatro glicerofosfolípidos diferentes mejoró significativamente la capacidad proliferativa de las líneas celulares de cáncer de colon murino MC38 y CT26 in vitro (Fig. 6, A y B). En un modelo de tumor subcutáneo, la administración de glicerofosfolípidos individuales promovió notablemente el crecimiento tumoral in vivo, como lo evidencian los aumentos significativos tanto en el peso como en el volumen del tumor (Fig. 6, C a F). En conjunto, estos análisis multiómicos exhaustivos y la validación funcional establecen que la deficiencia de Elovl6 impulsa una profunda reprogramación metabólica, particularmente en el metabolismo de los glicerofosfolípidos, lo que impulsa una tumorigénesis acelerada en los ratones.

Elovl6 reguló la estructura y función mitocondrial

La reprogramación metabólica durante la activación celular exhibió una estricta dependencia de la remodelación de la arquitectura mitocondrial (^[25]). Para dilucidar el papel de Elovl6 en la regulación mitocondrial, primero evaluamos los parámetros funcionales clave. El silenciamiento de Elovl6 no mostró efectos significativos en el potencial de membrana mitocondrial, los niveles de calcio mitocondrial o los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) celulares (fig. S15). Sin embargo, el análisis del flujo extracelular de Seahorse reveló que la deficiencia de Elovl6 mejoró notablemente la capacidad oxidativa mitocondrial, como lo evidencian el aumento de la respiración basal, la capacidad respiratoria de reserva y la producción de ATP (Fig. 7A). Corroborando estos hallazgos, los niveles celulares de ATP aumentaron significativamente en las células deficientes en Elovl6 (Fig. 7B), con efectos consistentes observados en las células Caco-2 (fig. S16, A y B). Cabe destacar que el análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica demostró que el silenciamiento de Elovl6 indujo una pronunciada fragmentación mitocondrial, con orgánulos sustancialmente acortados (Fig. 7C). En consonancia con los resultados in vitro, los ratones Elovl6-KO específicos del colon mostraron una longitud mitocondrial acortada en comparación con los controles WT (fig. S16C). Apoyando estas observaciones, la tinción con MitoTracker Red reveló tanto una longitud mitocondrial reducida como una integridad de red alterada en las células deficientes en Elovl6 (Fig. 7D). Dado que la arquitectura mitocondrial se regula dinámicamente a través de procesos de fisión y fusión equilibrados mediados por guanosina trifosfatasas especializadas (^[26], ^[27]), examinamos los principales reguladores de la homeostasis de la fisión/fusión. Los resultados del Western blot mostraron que el silenciamiento de Elovl6 reguló específicamente a la baja las proteínas de fusión MFN1 y MFN2, sin alterar la expresión del regulador de la fisión, la proteína relacionada con la dinina 1 (DRP1) (Fig. 7E), lo que indica un cambio hacia la fragmentación mitocondrial a través de una capacidad de fusión deteriorada.

El tratamiento con SA mejoró la capacidad de fusión mitocondrial

En este estudio, confirmamos la interacción entre Elovl6 y MFN1, tanto a nivel de expresión ectópica como endógena, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación (Fig. 8, A y B). Los experimentos de seguimiento con cicloheximida (CHX) demostraron que Elovl6 regula la estabilidad de la proteína MFN1. Como se muestra en la Fig. 8C, la reducción de Elovl6 aceleró notablemente la degradación de MFN1, mientras que la sobreexpresión de Elovl6 confirió estabilidad a la proteína. Se requieren investigaciones experimentales adicionales para dilucidar los detalles moleculares de la interacción Elovl6-MFN1. En particular, identificamos el ácido esteárico (C18:0) como un modulador específico de la fusión mitocondrial mediada por Elovl6-MFN1. La naturaleza dependiente de los ácidos grasos de la regulación de la dinámica mitocondrial por parte de Elovl6 se demostró mediante la incapacidad de la sobreexpresión de Elovl6 para revertir la fragmentación mitocondrial en condiciones de suero deslipidado. En particular, entre varios ácidos grasos probados (C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 y C18:2), solo la suplementación con C18:0 restauró eficazmente la integridad de la red mitocondrial (Fig. 8D y Fig. S16D). Las investigaciones mecanicistas revelaron que el C18:0 modula la estabilidad de MFN1 a través de modificaciones postraduccionales, como lo demuestra la reducción de la ubiquitinación (Fig. 8, E y F) y el aumento de la vida media de la proteína en los ensayos de seguimiento con CHX (Fig. 8G). En conjunto, nuestros hallazgos demostraron que el ácido esteárico derivado de Elovl6 actúa como un regulador metabólico crítico de la vía de fusión mitocondrial mediada por Elovl6-MFN1.

La suplementación con ácido esteárico suprimió la tumorigénesis colorrectal

Para determinar si el ácido esteárico funciona como el efector descendente crítico de la supresión tumoral mediada por Elovl6, realizamos experimentos de rescate complementarios. En las células CRC HCT-116 y Caco-2, la reducción de Elovl6 mejoró significativamente la capacidad proliferativa; este efecto protumorígeno se abolió por completo con la suplementación con ácido esteárico, que restauró la viabilidad celular a los niveles de control (Fig. 9, A y B). Para validar estos hallazgos in vivo, realizamos intervenciones dietéticas en el modelo de CRC inducido por AOM/DSS. Como se muestra en la Tabla S2, los ratones tratados con ácido esteárico (grupo de ácido esteárico) recibieron una dieta suplementada con un 1,5% de ácido esteárico. En el modelo de ratón Elovl6-KO, la suplementación dietética con ácido esteárico redujo significativamente el número de tumores y restringióPotentemente el crecimiento tumoral, con todos los tumores en los ratones KO tratados con ácido esteárico permaneciendo por debajo de 20 mm3 en comparación con los tumores grandes (hasta 54,95 mm3) observados en los controles KO no tratados (Fig. 9, C a E). Además, la suplementación con ácido esteárico en ratones WT suprimió significativamente la tumorigénesis, reduciendo tanto el número de tumores como el volumen (Fig. 9, C a E). En conjunto, estos resultados establecieron el ácido esteárico como un metabolito clave con efectos supresores de tumores, lo que destaca su potencial valor terapéutico para la intervención en el CRC.

DISCUSIÓN

En este estudio, demostramos que Elovl6 es un supresor tumoral previamente no identificado y un marcador pronóstico favorable en el CRC a través de investigaciones integradas que utilizaron líneas celulares de CRC, ratones Elovl6-KO sistémicos y modelos murinos con deficiencia de Elovl6 específica del intestino. Nuestros datos indicaron que la ablación genética de Elovl6 mejora notablemente la progresión tumoral tanto en el modelo de carcinogénesis asociada a colitis inducida por AOM/DSS como en un modelo impulsado por una mutación espontánea en el gen APC (adenomatous polyposis coli). Los estudios mecanicistas revelaron que Elovl6 ejerce su función supresora de tumores regulando de forma coordinada la aptitud metabólica intrínseca de las células y la dinámica de la fusión mitocondrial, manteniendo así la homeostasis metabólica intestinal y restringiendo la proliferación maligna. Estos hallazgos no solo dilucidan un papel previamente no reconocido de Elovl6 en la patogénesis del CRC, sino que también destacan su potencial terapéutico como un objetivo molecular para la intervención en el CRC.

El papel supresor de tumores de Elovl6 se ve aún más reforzado por su marcada relevancia clínica. Los análisis en múltiples cohortes de pacientes demuestran de forma consistente que la baja expresión de Elovl6 sirve como un potente marcador pronóstico independiente, correlacionándose fuertemente con la etapa avanzada del tumor y la reducción de la supervivencia general. En particular, observamos una clara asociación clínica entre el estado de mutación de TP53 y los niveles disminuidos de expresión de Elovl6. Esta correlación vincula un impulsor genético clave del CRC con la regulación a la baja de una enzima metabólica fundamental. El impacto combinado de la mutación de TP53 y la baja expresión de Elovl6 parece fomentar un microambiente permisivo para la progresión tumoral, probablemente a través de la interrupción de la homeostasis metabólica de los lípidos (^[28], ^[29]). Habiendo establecido esta correlación clínica, a continuación, buscamos determinar su significado funcional. La ablación genética de Elovl6 mejoró notablemente la capacidad proliferativa y la formación de colonias de las células CRC. Coherente con estos hallazgos, tanto los ratones deficientes de Elovl6 sistémicos como los deficientes de Elovl6 específicos del intestino desarrollaron tumores significativamente más graves en el modelo inducido por AOM/DSS, proporcionando evidencia experimental directa de su papel supresor de tumores. La deficiencia de Elovl6 condujo a alteraciones metabólicas sistémicas profundas, evidenciadas por la reducción del peso corporal y la mejora de la sensibilidad a la insulina, incluso en ratones KO que no presentaban tumores (^[18]). En particular, los ratones Elovl6-KO sistémicos exhibieron esteatosis hepática profunda en el modelo de CRC asociado a colitis. Este hallazgo tiene importantes implicaciones clínicas, dado que se ha establecido la asociación epidemiológica entre la enfermedad hepática grasa no alcohólica y el aumento del riesgo de CRC (^[30]). En conjunto, estos hallazgos definen a Elovl6 como un supresor tumoral fundamental en la carcinogénesis colorrectal, que opera en la interfaz crítica de la regulación metabólica y la progresión maligna.

La tumorigénesis colorrectal implica interacciones complejas entre las células tumorales y su microambiente, y la microbiota intestinal desempeña un papel causal cada vez más reconocido en el desarrollo del CRC (^[31]–^[34]). Aquí, demostramos que la ablación genética de Elovl6 induce una profunda disbiosis de la microbiota intestinal en ratones, caracterizada por el enriquecimiento de varios géneros bacterianos, incluidos Bacteroides, Parasutterella, Alloprevotella y PrevotellaceaeUCG-001, que se han asociado con trastornos gastrointestinales (^[35]–^[38]). El trasplante de microbiota fecal (TMF) de ratones deficientes de Elovl6 a receptores WT fue suficiente para promover la tumorigénesis. Es importante tener en cuenta que nuestro enfoque de TMF utilizó microbiota de donantes con tumores. Si bien esto demuestra la capacidad tumoral-promotora funcional de la comunidad microbiana establecida, el diseño experimental no permite distinguir definitivamente si la disbiosis actúa como un impulsor primario iniciado por el estado metabólico deficiente en Elovl6 del huésped o surge secundariamente al microambiente tumoral desarrollado. Por lo tanto, dentro del contexto deficiente en Elovl6_, la microbiota intestinal se interpreta mejor como un modulador y amplificador importante de la tumorigénesis, en lugar de su iniciador. Una limitación clave es nuestra comprensión incompleta de las cepas bacterianas específicas y las interacciones metabólicas huésped-microbio responsables del fenotipo tumoral-promotor observado. Las investigaciones futuras deberían utilizar la secuenciación metagenómica y la culturomía para aislar e identificar las bacterias patógenas clave, seguidas de modelos de ratón gnotobióticos para validar sus contribuciones individuales y sinérgicas a la patogénesis del CRC.

En paralelo, y de importancia central, la deficiencia de Elovl6 impulsa una reprogramación metabólica extensa, un sello distintivo del cáncer (^[39], ^[40]). Nuestro análisis metabolómico integral reveló perturbaciones profundas en múltiples vías, en particular el metabolismo del ácido araquidónico, la biosíntesis de ácidos biliares primarios, el metabolismo de la pirimidina y el metabolismo del ácido linoleico, durante la tumorigénesis colorrectal en ratones Elovl6−/−. Identificamos a Elovl6 como un regulador maestro del metabolismo de los glicerofosfolípidos, con 45 metabolitos lipídicos distintos que mostraron alteraciones significativas. Estos lípidos regulados de forma diferencial, esenciales para la dinámica de la membrana y la señalización mediada por lípidos (^[41]), se validaron funcionalmente como promotores de tumores: la suplementación exógena de estos glicerofosfolípidos mejoró la proliferación de las células tumorales in vitro y aceleró el crecimiento tumoral in vivo. En conjunto, estos datos establecen la desregulación metabólica centrada en el huésped como la vía central directa y autónoma a través de la cual la pérdida de Elovl6 impulsa la patogénesis del CRC. Los estudios futuros deberían dedicarse a identificar las interacciones precisas entre los microbios y los metabolitos dentro de esta red, lo cual es crucial para dilucidar aún más la interacción funcional entre estos dos aspectos clave de la patogénesis del CRC.

Habiendo establecido el papel de Elovl6 en la remodelación de la microbiota intestinal y el metaboloma sistémico, a continuación, buscamos determinar cómo estas perturbaciones convergen a nivel subcelular para impulsar la tumorigénesis. Nuestra investigación reveló que la reducción de Elovl6 mejora significativamente la capacidad de la fosforilación oxidativa en las células tumorales, satisfaciendo sus mayores demandas metabólicas durante la proliferación. Además, encontramos que este cambio metabólico está respaldado por una alteración profunda en la arquitectura mitocondrial: la deficiencia de Elovl6 induce la fragmentación mitocondrial a través de la regulación a la baja coordinada de las proteínas de fusión MFN1 y MFN2. Se ha demostrado que MFN1 y MFN2 son funcional y mecánicamente distintos, a pesar de su alta identidad de secuencia y similitud (^[42]–^[44]). Aquí, demostramos que la inhibición de la fusión mitocondrial mediada por MFN1 parece representar un mecanismo clave a través del cual Elovl6 regula el metabolismo celular. La base mecanicista de la regulación a la baja de MFN2 y su contribución funcional al fenotipo requieren una mayor investigación. Los estudios futuros deberían utilizar enfoques proteómicos para identificar posibles proteínas intermediarias y utilizar experimentos de rescate específicos de MFN1/MFN2 en células deficientes de Elovl6 para diseccionar sus funciones distintas. En particular, identificamos el ácido esteárico, el producto enzimático directo de Elovl6, como un posible regulador de los procesos de fusión mitocondrial. Este hallazgo se alinea con estudios previos que demuestran el papel del ácido esteárico como molécula de señalización que modula la morfología y la función mitocondrial en respuesta al estado nutricional (^[45], ^[46]). Terapéuticamente, nuestros experimentos in vivo demostraron que la suplementación con ácido esteárico reduce significativamente la carga tumoral en huéspedes deficientes de Elovl6. Su eficacia en ratones WT subraya un papel supresor de tumores independiente del genotipo, lo que destaca el amplio potencial de traslación de la suplementación dietética con ácido esteárico.

En resumen, nuestro estudio establece a Elovl6 como un supresor tumoral fundamental en el CRC. Delimitamos un mecanismo central en el que Elovl6 mantiene la homeostasis metabólica y promueve la fusión mitocondrial, restringiendo así la proliferación, con su producto enzimático, el ácido esteárico, que actúa como un mediador clave de estos procesos (Fig. 9F). Estos hallazgos no solo posicionan a Elovl6 como un objetivo terapéutico prometedor, sino que también sugieren que la suplementación dietética con ácido esteárico o la modulación del metabolismo de los lípidos podrían representar una estrategia viable para la prevención del CRC y la terapia adyuvante.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras de CRC humanas

Los especímenes de CRC humanos se recolectaron en el Hospital Provincial del Pueblo de Jiangsu de 2018 a 2020. Los criterios de inclusión para los pacientes son los siguientes: (i) diagnóstico claro por imagen y patológico, (ii) lumpectomía inicial, (iii) sin otros cánceres detectables u otras enfermedades intestinales y (iv) sin poliposis adenomatosa familiar o síndrome de CRC hereditario no polipósico. Las muestras se recolectaron con el consentimiento informado de todos los participantes. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica de la Universidad de Nanjing (número de aprobación AP202502220015) y cumplió con todas las regulaciones éticas pertinentes. La Tabla S3 resume la información de un subconjunto de pacientes.

Líneas celulares y cultivo celular

Las líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano HCT-116 y Caco-2 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Celulares (EE. UU.). Las células HCT-116 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco, EE. UU.) suplementado con 10 % (v/v) de suero bovino fetal (FBS; Gibco, EE. UU.). Las células Caco-2 se cultivaron en medio mínimo esencial (Gibco, EE. UU.) que contenía 20 % (v/v) de FBS, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml) y piruvato de sodio (1 μg/ml) (todo de Gibco, EE. UU.). Todas las líneas celulares se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 y se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma con el fin de garantizar la autenticidad y la pureza de las líneas celulares.

Silenciamiento de Elovl6 en las células HCT-116 y Caco-2

El silenciamiento de Elovl6 en las células HCT-116 y Caco-2 se logró utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Las secuencias de ARN guía único (sgRNA) fueron las siguientes: Elovl6-sgRNA #1: 5′-CAGAATGATGAATATCGTGTCACCTGGAAG-3′; y Elovl6-sgRNA #2: 5′-CGCTGACTCTTGCCGTCTTCAGGTAGGTCG-3′. La construcción del plásmido se realizó utilizando procedimientos estándar, y la correcta inserción de la secuencia de sgRNA se confirmó mediante secuenciación de ADN (Jinsirui Biotechnology Co. Ltd., Nanjing, China). Luego, las células HCT-116 y Caco-2 se transfectaron y se seleccionaron para el silenciamiento estable de Elovl6 utilizando puromicina durante más de 2 semanas, y las células transfectadas con el vector se utilizaron como controles. La eficacia del silenciamiento de Elovl6 se evaluó mediante RT-qPCR y análisis de Western blot.

Ensayo de proliferación celular

La proliferación celular se evaluó utilizando CCK-8 (Beyotime Biotechnology, China) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 24 horas después de la transfección con ARN de interferencia pequeño (Elovl6), las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células por pocillo. Para evaluar el efecto de SA en el crecimiento celular, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y, después de 24 horas, se trataron con 200 μM de albúmina sérica bovina conjugada con SA o un volumen equivalente de control vehículo durante 48 horas. Después de los respectivos tratamientos, el medio se reemplazó con 100 μl de medio fresco que contenía 10 μl de reactivo CCK-8, y las células se incubaron durante 1 hora más. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas Synergy H1 (BioTek, EE. UU.).

Ensayo del ciclo celular y apoptosis

Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se recolectaron y luego se procesaron utilizando un kit de análisis del ciclo celular y apoptosis (Beyotime Biotechnology, China) según las instrucciones del fabricante. Posteriormente, la distribución del ciclo celular y la tasa de apoptosis se analizaron utilizando un citómetro de flujo NovoCyte (ACEA Biosciences Inc., EE. UU.). Los datos se adquirieron y procesaron con el software NovoExpress (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.).

Construcciones transgénicas y generación de ratones transgénicos

Los ratones heterocigotos Elovl6-KO de todo el cuerpo se generaron utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 por Shanghai Model Organisms Center Inc. (Shanghái, China). Los ratones homocigotos Elovl6−/− se obtuvieron mediante el cruce de estos heterocigotos (Elovl6+/−). Los ratones Elovl6–condicionales de knockout (CKO) específicos del colon se generaron utilizando el sistema Cre-loxP. Específicamente, los ratones Villin-Cre y los ratones C57BL/6J-Elovl6 em1(flox) se generaron primero por Shanghai Model Organisms Center Inc. Luego, los ratones Elovl6-CKO específicos del colon (Villin-Cre; Elovl6loxp/loxp) se produjeron cruzando los ratones homocigotos floxed (Elovl6loxp/loxp) con los ratones Villin-Cre. Los ratones Apc
Min/+ se obtuvieron del Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad de Nanjing (Gem Pharmatech Co. Ltd.).

Modelo de colitis aguda y modelo de cáncer colorrectal asociado a colitis

Para inducir la colitis aguda, se trató a ratones transgénicos de 7 semanas de edad y a ratones de la camada de control con 3 % de DSS en su agua de beber durante 1 semana. Se calculó un índice de actividad de la enfermedad diario para cada ratón en función del porcentaje de pérdida de peso, la consistencia de las heces y el sangrado rectal. Los criterios de puntuación se adaptaron de un estudio anterior (^[47]).

El modelo de cáncer colorrectal asociado a colitis se indujo utilizando el protocolo AOM/DSS, como se describió anteriormente (^[48]) con modificaciones. Brevemente, los ratones recibieron una única inyección intraperitoneal de AOM (10 mg/kg; Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemania). Después de 7 días, se sometieron a 1 ciclo de 2,0 % de DSS en agua de beber durante 7 días, seguido de 14 días de agua normal. Este ciclo se repitió dos veces (Fig. 3B). Se realizó una colonoscopia utilizando un sistema endoscópico para ratones de alta resolución (MiniScope 2 V, Yuyan Instruments, Shanghái, China) para controlar la progresión de la enfermedad. Todos los experimentos con animales en este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nanjing (aprobación del IACUC n.º 2107005).

Modelo de tumor subcutáneo y tratamiento

Se utilizaron ratones macho C57BL/6J (de 4 a 6 semanas de edad) para establecer el modelo de tumor subcutáneo. Bajo anestesia inducida por una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico, se inyectó a cada ratón con 5 × 105 células de carcinoma de colon MC38. Cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 50 a 100 mm3, los ratones con tumor se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos. Luego, los ratones recibieron inyecciones subcutáneas de 100 μl de PBS estéril (control) o 100 μl de soluciones (100 μg/ml) de los siguientes fosfolípidos: PC(18:0/22:6), PC(16:0/18:1), PE(18:0/20:4) y PS(18:0/22:6). Las inyecciones se administraron dos veces por semana durante 3 semanas. El volumen del tumor y el peso corporal se registraron periódicamente. Al final del experimento, se disecaron y recolectaron los tumores para su posterior análisis. El volumen del tumor (en milímetros cúbicos) se calculó utilizando la fórmula: Volumen = 1/2 × longitud × ancho2. De acuerdo con las pautas éticas y los informes anteriores, el volumen máximo de tumor permitido (punto final humano) se estableció en 4000 mm3.

Análisis de la microbiota fecal mediante secuenciación de ARNr 16S

Se recolectaron muestras fecales de ratones transgénicos y ratones de la camada de control en múltiples puntos temporales. El ADN genómico total se extrajo de las muestras utilizando el kit QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, n.º de catálogo 51504) según el protocolo del fabricante. La construcción de la biblioteca y la secuenciación se realizaron por Shanghai Ouyi Biotech Company (Shanghái, China). Las regiones hipervariables V3-V4 del gen de ARNr 16S bacteriano se amplificaron con los cebadores 343F (5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′) y 798R (5′-AGGGTATCTAATCCT-3′). Posteriormente, se realizó un análisis bioinformático utilizando la plataforma en línea Omicsmart (www.omicsmart.com/).

Trasplante de microbiota fecal

Para el experimento de trasplante de microbiota fecal (TMF), se administró por vía oral a los ratones receptores un cóctel de antibióticos de amplio espectro durante 2 semanas para agotar la microbiota intestinal y luego se dividieron en dos grupos (n = 11 por grupo). Un grupo recibió material fecal de ratones Elovl6−/− que habían sido sometidos al modelo AOM/DSS, mientras que el otro grupo recibió material fecal de controles de la camada WT bajo las mismas condiciones. Para preparar el inóculo, se recolectaron y homogeneizaron muestras de heces frescas en PBS estéril (1 g en 5 ml). Después de la centrifugación para eliminar las partículas grandes, se recolectó el sobrenadante. Luego, cada ratón receptor recibió 200 μl de la suspensión fecal por gavage oral tres veces por semana. Durante el período de TMF, todos los ratones continuaron recibiendo el régimen AOM/DSS para inducir la tumorigénesis colorrectal.

Análisis de metabolómica fecal mediante perfilado metabolómico no dirigido

Preparación de la muestra: Se recolectaron muestras fecales de ratones transgénicos y ratones de la camada de control en diferentes puntos temporales y se congelaron inmediatamente a −80 °C hasta su análisis. El protocolo de preparación de la muestra se modificó ligeramente a partir de un método descrito anteriormente (^[49]). Brevemente, se homogeneizaron 60 mg de cada muestra de heces en 600 μl de metanol/agua (4:1, v/v), se incubaron a −20 °C durante 2 min y luego se molieron a 60 Hz durante 2 min. Después de 10 minutos de sonicación en un baño de hielo, las muestras se almacenaron a −20 °C durante 30 minutos y luego se centrifugaron (13 000 rpm, 4 °C, 10 min). El sobrenadante resultante (200 μl) se transfirió a viales de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), se mezcló con 300 μl de metanol/agua (1:4, v/v) y se almacenó a −40 °C durante 2 horas. Por último, las muestras se centrifugaron nuevamente (13 000 rpm, 4 °C, 10 min) y se filtraron a través de membranas de 0,22 μm antes del análisis.

Análisis de LC-MS: La separación cromatográfica se realizó en un sistema UPLC ACQUITY equipado con una columna ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 μm; Waters, EE. UU.). Las fases móviles consistieron en (A) agua con 0,1 % de ácido fórmico y (B) acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico. El gradiente de elución se programó de la siguiente manera: de 0 a 5 % de B durante 2 min; de 5 a 30 % de B de 2 a 4 min; de 30 a 50 % de B de 4 a 8 min, de 50 a 80 % de B de 8 a 10 min; y de 80 a 100 % de B de 10 a 14 min. La velocidad de flujo fue de 0,35 ml/min. Los espectros de masas se adquirieron utilizando un espectrómetro de masas VION con espectrometría de movilidad iónica, cuadrupolo de aceleración ortogonal y tiempo de vuelo (Waters, EE. UU.) en ambos modos de ionización por electrospray positivo y negativo. El rango de masas se estableció de m/ z 70 a 1000. La resolución se estableció en 70 000 para los escaneos de MS completos y en 17 500 para los escaneos de MS/MS de disociación de colisión de alta energía (HCD). Los parámetros del espectrómetro de masas fueron los siguientes: voltaje de pulverización, 3800 V (+) y 3000 V (−); velocidad de flujo de gas de envoltura, 40 arb (+) y 35 arb (−); velocidad de flujo de gas auxiliar, 10 arb (+) y 8 arb (−); y temperatura del capilar, 320 °C (+) y 320 °C (−).

Procesamiento de datos: Los datos de LC-MS sin procesar se procesaron utilizando el software Progenesis QI (V2.3; Nonlinear Dynamics, Newcastle, Reino Unido) para el filtrado de la línea de base, la identificación de picos, la integración, la corrección del tiempo de retención, la alineación de picos y la normalización. Los metabolitos se identificaron buscando en la Base de datos del metaboloma humano, LipidMaps (V2.3), Metlin, EMDB y PMDB. Los metabolitos diferencialmente abundantes entre los grupos de comparación se identificaron utilizando la prueba t de Welch o la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Los valores de P resultantes se ajustaron para pruebas múltiples utilizando el procedimiento de tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg. El análisis bioinformático de estos metabolitos diferenciales se realizó en la plataforma Omicsmart (www.omicsmart.com/).

Lipidómica fecal

Preparación de la muestra: Se recolectaron muestras fecales de ratones transgénicos y ratones de la camada de control en los momentos designados y se almacenaron inmediatamente a −80 °C hasta su análisis. El procesamiento de la muestra se realizó como se describió anteriormente (^[50]). Brevemente, se homogeneizaron 30 mg de muestras fecales en 200 μl de metanol/agua (1:1, v/v). Para la normalización cuantitativa y el control de calidad, se agregaron 300 μl de lisofosfatidilcolina 17:0 (0,1 mg/ml en metanol) como estándar interno. La mezcla se molió utilizando cuentas de acero, se agitó durante 30 segundos y se sonicó durante 10 minutos en un baño de hielo. Después de la incubación a −20 °C durante 20 minutos, las muestras se centrifugaron a 13 000 rpm durante 10 minutos (4 °C). La fase de cloroformo (200 μl) se transfirió cuidadosamente a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se sometió a una segunda extracción con 300 μl de cloroformo/metanol (2:1, v/v). Las fases orgánicas combinadas se mezclaron a fondo y se tomaron 200 μl del extracto final y se evaporaron bajo una corriente de gas nitrógeno. El residuo seco se reconstituyó en 300 μl de isopropanol/metanol (1:1, v/v), se agitó durante 30 segundos y se sonicó durante 3 minutos en un baño de hielo para garantizar una solubilización completa. Por último, las muestras se filtraron a través de un filtro de fase orgánica de 0,22 μm antes del análisis de LC-MS.

Análisis LC-MS: La separación cromatográfica se realizó en un sistema UPLC ACQUITY equipado con una columna ACQUITY UPLC BEH C8 (100 mm x 2,1 mm, 1,7 μm; Waters, EE. UU.). El sistema de elución con gradiente binario consistió en fase móvil (A) acetonitrilo/agua (6:4, v:v, que contiene 10 mM de formiato de amonio) y (B) acetonitrilo/isopropanol (1:9, v:v, que contiene 10 mM de formiato de amonio). Se utilizó el siguiente gradiente a una velocidad de flujo de 0,26 ml/min: 32 % de B a los 0 min, mantenido hasta los 1,5 min; aumento hasta el 85 % de B a los 15,5 min; luego hasta el 97 % de B a los 15,6 min y se mantuvo hasta los 18 min; se volvió al 32 % de B a los 18,1 min y se mantuvo hasta los 20 min para el reequilibrio. El volumen de inyección fue de 5 μl y la temperatura del autosamplificador se mantuvo a 4 °C. La detección por espectrometría de masas se realizó utilizando un cromatógrafo de líquidos de ultra alto rendimiento Dionex U3000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) equipado con una fuente de ionización por electrospray calentada (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los parámetros del instrumento se establecieron de la siguiente manera: temperatura del calentador, 350 °C; caudal de gas de envoltura, 50 arb; caudal de gas auxiliar, 15 arb; caudal de gas de barrido, 1 arb; voltaje de pulverización, 3800 V (+) y 3000 V (−); temperatura del capilar, 320 °C; rangos de escaneo MS1, de 135 a 2000.

Procesamiento de datos: Los datos brutos de espectrometría de masas se procesaron utilizando el software LipidSearch para el análisis de espectrometría de masas de múltiples etapas (MSn) y la determinación precisa de m/z de los iones precursores. Las estructuras moleculares de los lípidos y sus patrones de formación de aductos se identificaron basándose en los espectros de iones precursores y la fragmentación de la espectrometría de masas de múltiples etapas. Para la cuantificación relativa, todas las intensidades de los picos se normalizaron al estándar interno dentro de cada muestra. Los lípidos metabólicos diferenciales se identificaron utilizando una prueba t de Student de dos colas, con significancia definida como una puntuación de importancia en la proyección >1,0 y un valor de P 1,0 y un valor de P