El análisis multirregional revela que el eje THBS1-SPP1 en monocitos y macrófagos impulsa la inmunosupresión y afecta el pronóstico en las metástasis hepáticas del cáncer colorrectal.

La metástasis es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer (^[1]). En el cáncer colorrectal (CCR), la tasa de supervivencia a 5 años para pacientes con enfermedad metastásica es de solo el 12%, debido en gran medida a la afectación hepática. Aproximadamente la mitad de los pacientes con CCR desarrollan metástasis hepáticas detectables en un plazo de 5 años desde el diagnóstico de su tumor primario (^[2], ^[3]). Aunque la resección quirúrgica combinada con la quimioterapia perioperatoria ofrece una intención curativa para la metástasis hepática colorrectal (MHC), hasta el 65% de los pacientes experimentan recurrencia de la enfermedad en un plazo de 5 años, lo que subraya la urgente necesidad de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la enfermedad metastásica (^[4]).

El microambiente tumoral de la MHC (MTM) es un ecosistema complejo y dinámico. Las células inmunitarias constituyen la población no cancerosa más abundante (^[5]–^[7]), y su función está determinada por las señales ambientales locales y los estados de activación. La infiltración y la actividad inmunitarias varían espacialmente dentro del MTM, donde coexisten células que promueven el tumor y células que suprimen el tumor (^[8], ^[9]). El núcleo tumoral está en gran medida inmunosuprimido, mientras que las células inmunitarias circulantes a menudo muestran un fenotipo inmunoestimulador que disminuye al entrar en el tumor (^[5], ^[6], ^[10]). Nuestra comprensión de los mecanismos y la sincronización de la inactivación inmunitaria se ha visto limitada por la falta de resolución a nivel de célula única y la cobertura espacial restringida en estudios transcriptómicos previos (^[11]).

Para abordar esto, aplicamos la secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) a muestras de tejido de MHC multirregional fresco, revelando una clara compartimentación inmunitaria espacial. Identificamos tres zonas clave: (i) regiones inmunoactivas en el tejido hepático no afectado (THNA) enriquecidas con células T CD8+ activas; (ii) una zona de pre-agotamiento en el borde del tumor caracterizada por interacciones entre monocitos THBS1+ y células T CD47+CD8+; y (iii) un núcleo tumoral inmunosuprimido enriquecido en células T TIM-3+CTLA4+ agotadas. Los monocitos THBS1+ pueden diferenciarse en macrófagos SPP1+ dentro del núcleo tumoral, lo que perpetúa la inmunosupresión a través de la interacción de puntos de control en las células T agotadas. Por lo tanto, nuestros hallazgos revelan que el direccionamiento de los macrófagos SPP1+ y los puntos de control TIM-3/CTLA4 puede representar estrategias prometedoras para mantener la activación y la citotoxicidad de las células T CD8+ en la MHC.

RESULTADOS

La secuenciación de ARN de célula única multirregional revela zonas inmunitarias espacialmente estructuradas en las MHC

Para desentrañar el intrincado panorama inmunitario dentro de la MHC, realizamos scRNA-seq en células CD45+ aisladas de especímenes hepáticos resecados de seis pacientes con MHC clínicamente caracterizados (tabla S1). Recolectamos muestras emparejadas de tres regiones espacialmente distintas: el núcleo tumoral, el borde tumoral y el tejido THNA adyacente (fig. 1A y figs. S1A y S2A).

Después del control de calidad y la normalización, nuestro conjunto de datos comprendió 74.804 células (fig. S2, B y C). Integrando los datos de todos los pacientes y sitios anatómicos, aplicamos un agrupamiento imparcial, revelando una rica diversidad de poblaciones de células inmunitarias (fig. 1, B y C, y fig. S2, D a F). Utilizando genes expresados diferencialmente (DEG) y marcadores definitorios de linaje, anotamos con confianza los principales tipos de células, incluidos las células T citotóxicas CD8+, las células T colaboradoras CD4+, las células asesinas naturales (NK), las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), los monocitos/macrófagos, los neutrófilos, las células T reguladoras (Treg), las células B, las células linfoides proliferativas, las células dendríticas plasmocitoides y las células cebadas (tabla S2). Se excluyó una población inusual que expresaba marcadores linfoides y mieloides mixtos del análisis posterior (fig. 1, B y C).

Examinando la abundancia general, las células NK surgieron como la población inmunitaria más prevalente (22,7%), seguida de cerca por las células T CD8+ (19,3%), los monocitos/macrófagos (17,9%) y las células T CD4+ (16,6%). Las células MAIT y los neutrófilos también formaron fracciones sustanciales, mientras que las células Treg, las células B y otras aparecieron con menos frecuencia (fig. S2F). Estos hallazgos se alinean bien con estudios previos (^[5], ^[6]) y se validaron mediante citometría de masas en muestras adicionales de MHC (tabla S1 y fig. S3, A a C).

En particular, el análisis espacial reveló diferencias profundas en la distribución de las células inmunitarias en las regiones tumorales. Las células mieloides se enriquecieron tanto en el THNA como en el núcleo tumoral, pero fueron particularmente escasas en el borde tumoral. Las células NK predominaron en el THNA, pero disminuyeron constantemente hacia el núcleo tumoral. En contraste, el borde tumoral y el núcleo albergaron un mayor número de células T CD4+ y células Treg (fig. 1D). En conjunto, estos datos revelan una arquitectura inmunitaria altamente compartimentada en la MHC, con distintas "zonas" inmunitarias que dan forma al MTM.

La diversidad espacial y funcional de los subconjuntos de células T da forma al panorama inmunitario en las MHC

Las células T CD4+ y CD8+ son abundantes y fenotípicamente diversas en las zonas inmunitarias de la MHC. El agrupamiento no supervisado identificó 11 subconjuntos de CD4+, incluidos las células T colaboradoras 17 (TH17), las células T colaboradoras foliculares (Tfh), los efectores CD4+ citotóxicos (ThCTL) y las células Treg (fig. S4, A y B, y tabla S3). Espacialmente, los ThCTL se enriquecieron en el THNA, pero disminuyeron hacia el núcleo tumoral; las células TH17 se agruparon en el borde tumoral, mientras que las células Tfh y Treg aumentaron desde el borde hasta el núcleo (fig. S4, C y D).

Para las células T CD8+, se encontraron 15 grupos distintos, que abarcan poblaciones similares a las ingenuas, circulatorias, NKT, MAIT, γδ, de memoria residentes en los tejidos (Trm) y agotadas (fig. 2, A y B). Las células Trm expresaron marcadores de residencia (CD44 y CCR5), mientras que las células agotadas mostraron una alta expresión de puntos de control inmunitarios (PDCD1 y CTLA4) (tabla S4). Espacialmente, las células T CD8+ circulatorias dominaron el THNA; las células γδ y las células ENTPD1+ agotadas se enriquecieron en el borde tumoral, y las células T CD8+ con proteínas de choque térmico y terminalmente agotadas fueron más abundantes en el núcleo tumoral (fig. 2C y fig. S4, E y F). Esto revela una clara especialización espacial de los subconjuntos de células T en la MHC.

El perfil multirregional de los estados funcionales de las células T CD8+ revela que el borde tumoral es una zona de transición hacia el agotamiento

Para caracterizar la diversidad funcional de las células T CD8+ en la MHC, clasificamos las células en función de las firmas de genes de activación y agotamiento. Las células en reposo (grupo c3) carecían de características citotóxicas o inhibitorias, mientras que las poblaciones activadas expresaban granzimas (GZMA y GZMK), perforina (PRF1), IFNG y marcadores de superficie como CD28 y CD69. En particular, dos grupos (c12 y c14) exhibieron un fenotipo de pre-agotamiento, definido por la coexpresión de genes de activación e inhibición o por la expresión de marcadores de transición como TCF7 y CXCR3, lo que indica un estado preparado entre la función efectora y el agotamiento (^[12], ^[13]). Los grupos terminalmente agotados (c4 y c10) se caracterizaron por una alta expresión de PDCD1, CTLA4, LAG3 y HAVCR2 (fig. 2D).

El mapeo espacial de estos estados reveló una clara zonificación: las células T CD8+ activadas se enriquecieron en el THNA, las células pre-agotadas se localizaron predominantemente en el borde tumoral y las células terminalmente agotadas se acumularon dentro del núcleo tumoral (fig. 2E). Esta organización espacial se sustentó aún más al examinar la expresión de genes asociados al estado de las células T CD8+ en las diferentes regiones del tejido. Los genes asociados con la activación de las células T CD8+ se expresaron predominantemente en el THNA, y hubo una expresión mixta de marcadores de activación y agotamiento en el borde tumoral. En contraste, los genes asociados al agotamiento se expresaron principalmente en el núcleo tumoral (fig. S5A). En conjunto, estos hallazgos establecen que el borde tumoral es un nicho inmunológico distinto donde las células T CD8+ comienzan a perder su función efectora, lo que sugiere una zona de transición clave que puede ser terapéuticamente direccionable.

Las trayectorias de pseudotiempo de las células T CD8+ revelan un agotamiento progresivo hacia el núcleo tumoral en la MHC

Para investigar si las células T CD8+ experimentan una transición gradual desde la activación hasta el agotamiento en las diferentes regiones de la MHC, aplicamos la herramienta de inferencia de pseudotiempo Ouija a los datos transcriptómicos de célula única. El ordenamiento de las células por expresión de marcadores de activación y agotamiento reveló una trayectoria continua: el pseudotiempo temprano se asoció con marcadores de activación (CD69, GZMK y TCF7), predominantemente en células derivadas del THNA, mientras que el pseudotiempo tardío correspondió con marcadores de agotamiento (PDCD1, CTLA4, CXCL13 y HAVCR2), enriquecidos en muestras del borde tumoral y del núcleo (fig. 2F y fig. S5, B y C).

Estos hallazgos transcriptómicos se respaldaron con inmunofluorescencia espacial, que mostró que las células T CD8+CD69+ se localizaron principalmente en el THNA (fig. S5, D y E), y las células T CD8+CTLA4+ agotadas se concentraron en el borde tumoral y el núcleo (fig. 2, G y H). La citometría de masas confirmó aún más este gradiente, con niveles significativamente más altos de marcadores de agotamiento, el receptor inmunocutorio de las células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT) y la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), en las células T CD8+ del núcleo tumoral en comparación con las regiones del THNA y el borde (fig. S5, F y G).

En conjunto, estos datos revelan que, si bien las células T CD8+ citotóxicas activas se reclutan inicialmente a las lesiones metastásicas hepáticas, su funcionalidad disminuye progresivamente a medida que se desplazan hacia el interior. El borde tumoral emerge como un punto de control de "pre-agotamiento" clave, donde algunas células T CD8+ coexpresan marcadores de activación (GNLY, PRF1 y GZMA) e inhibidores (HAVCR2, LAG3 y TNFRSF18), lo que sugiere que estas células de transición aún pueden ser susceptibles de rescate terapéutico (^[14]). Esto presenta una ventana estratégica para detener o revertir el agotamiento y restaurar la inmunidad antitumoral.

Los nichos de macrófagos espacialmente distintos MARCO+, SPP1+ y TREM2+ dan forma a un microambiente tumoral permisivo en las MHC

Para investigar cómo el compartimento mieloide se adapta al microambiente de la MHC, realizamos un agrupamiento no supervisado de células CD45+ en el THNA, el borde tumoral y el núcleo tumoral. Esto, basado en los 50 componentes principales, reveló 25 grupos distintos (fig. 3A). Utilizando DEG (tabla S5) y marcadores mieloides canónicos (fig. S6A), identificamos poblaciones clave de monocitos y macrófagos con patrones de abundancia específicos de la región. Los monocitos dominaron el THNA y el borde tumoral, mientras que los macrófagos se enriquecieron en el núcleo tumoral (fig. S6B).

Para analizar esto con más detalle, reclustreamos las poblaciones de monocitos/macrófagos, revelando 11 subtipos transcripcionalmente distintos, todos los cuales expresan marcadores centrales de monocitos como CSF1R, CD14 y LST1 (fig. 3B y fig. S7A). Cinco grupos coexpresaron genes asociados a macrófagos (CD68, MRC1, FN1 y APOE), lo que es consistente con las identidades de macrófagos derivados de monocitos (MoM) (c2, c4, c7, c8 y c10) (fig. S7B y tabla S6).

El mapeo espacial reveló abundancias altamente dinámicas, particularmente dentro de los grupos MoM, entre las tres ubicaciones. El grupo c7 (C1QB+) se enriqueció en el THNA, lo que sugiere un papel en la vigilancia inmunitaria homeostática. En contraste, los macrófagos SPP1+ (c8) y TREM2+ (c10) se enriquecieron tanto en el borde tumoral como en el núcleo, mientras que los macrófagos MARCO+ (c2) se encontraron casi exclusivamente en el núcleo tumoral (fig. 3C y fig. S7, C a E). El análisis funcional de estos grupos reveló funciones especializadas en la configuración del nicho inmunosupresor: los macrófagos SPP1+ (c8) expresaron genes relacionados con la remodelación de la matriz extracelular y la supresión de las células T. Los macrófagos TREM2+ (c10) mostraron una firma de metabolismo lipídico, a menudo asociada con la actividad promotora del tumor. Los macrófagos MARCO+ (c2) expresaron factores quimiotácticos que pueden respaldar el reclutamiento continuo de monocitos a los sitios metastásicos (fig. S7F y tabla S6).

En conjunto, estos hallazgos revelan una red coordinada de subconjuntos de macrófagos inmunosupresores que ocupan nichos espaciales distintos en la MHC. Al realizar funciones complementarias, que van desde la evasión inmunitaria hasta la remodelación estructural, los macrófagos SPP1+, TREM2+ y MARCO+ contribuyen colectivamente al establecimiento y mantenimiento de un microambiente tumoral permisivo.

Entre los cúmulos de monocitos/macrófagos, la población más grande y llamativa consistió en monocitos THBS1+ (Monoc0THBS1). El mapeo espacial reveló que estas células se encuentran en mayor concentración en la NIL y en el borde del tumor, pero disminuyen en el núcleo del tumor, lo que sugiere un papel de transición en el margen tumoral (fig. S7, C a E).

Hipótesis que los monocitos THBS1+ actúan como precursores de macrófagos inmunosupresores (MoM) dentro del microambiente tumoral (TME) de las metástasis hepáticas (CRLM). Para probar esto, realizamos la inferencia de trayectoria utilizando Monocle3, lo que reveló una clara vía de diferenciación desde Monoc0THBS1 hasta subconjuntos de MoM posteriores, incluidos Macroc2MARCO y, finalmente, Macroc8SPP1 (fig. 3, D y E). Esto apoya informes previos de que los monocitos que expresan THBS1 dan origen a macrófagos SPP1+ en los sitios del tumor primario (^[15]).

Los cúmulos a lo largo de esta trayectoria conservaron firmas genéticas enriquecidas relacionadas con la angiogénesis, lo que indica que los monocitos y su progenie de macrófagos pueden mantener funciones protumorales a lo largo de su diferenciación (fig. S7G y tabla S6) (^[16]).

Se ha descubierto que los macrófagos asociados al tumor se correlacionan con un mal pronóstico (^[17]–^[19]). Para evaluar la relevancia clínica de la población SPP1+, identificamos una firma genética de macrófagos SPP1 derivada de nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), que captura el perfil transcripcional distinto de los macrófagos SPP1+ localizados en el borde y el núcleo del tumor (tabla S7). Luego, aplicamos esta firma a un conjunto de datos de microarrays CRLM de acceso público para evaluar su asociación con los resultados clínicos (^[20]). La alta expresión de la firma de macrófagos SPP1 se asoció fuertemente con un mal pronóstico. Los pacientes con puntuaciones de firma elevadas tuvieron una supervivencia libre de enfermedad y una supervivencia general significativamente más cortas en comparación con aquellos con menor expresión (fig. 3, F y G). Estos resultados resaltan el potencial de los macrófagos SPP1+ como biomarcador pronóstico y como objetivo terapéutico en CRLM.

En conjunto, estos hallazgos revelan una trayectoria de diferenciación conservada de monocitos a macrófagos en el hígado metastásico, en la que los monocitos THBS1+ dan origen a macrófagos inmunosupresores SPP1+ que impulsan la progresión tumoral y empeoran los resultados de los pacientes. Dirigirse a esta vía puede ofrecer una estrategia prometedora para interrumpir la formación de un nicho inmunosupresor en CRLM.

La proximidad al núcleo del tumor remodela la comunicación entre células mieloides y células T, lo que provoca el agotamiento de las células T en CRLM

Para comprender cómo la proximidad espacial al núcleo del tumor moldea el intercambio cruzado inmunitario en CRLM, analizamos las interacciones ligando-receptor entre las células T CD4+ y CD8+ y los subconjuntos mieloides utilizando CellChat. Esto reveló notables diferencias regionales en la comunicación inmunitaria: en el borde del tumor, los monocitos THBS1+ (Monoc0THBS1), las células T de memoria residentes tisulares CD8+ (CD8c0Trm_GZMK) y las células TH17 y TH0 CD4+ formaron una red altamente interactiva. En contraste, dentro del núcleo del tumor, los macrófagos inmunosupresores SPP1+ (Macroc4SPP1) surgieron como el centro de señalización dominante, interactuando principalmente con las células CD8+ agotadas (CD8c4Tex_CTLA4) y los subconjuntos de células T CD4+ (fig. 4A y tabla S8). Para validar estas interacciones predichas, realizamos inmunohistoquímica multiplex y aplicamos la función SpatialScore para cuantificar la proximidad física de los monocitos (CD14+IBA1−), los macrófagos (CD14+IBA1+) y las células T CD8+ (^[21]). Coherente con los hallazgos de CellChat, las células T CD8+ estaban significativamente más cerca de los monocitos en el borde del tumor, mientras que en el núcleo del tumor, estaban más estrechamente asociadas con los macrófagos (fig. 4, B y C), lo que indica un cambio espacial en la regulación inmunitaria. Funcionalmente, las células Trm CD8+ en el borde interactuaron con los monocitos THBS1+ a través de la señalización MIF-CD74/CXCR4 y ANXA1-FPR1/2, vías conocidas por reclutar y polarizar los monocitos, mientras que los subconjuntos de células T CD4+ utilizaron ejes similares (fig. 4D, parte superior, y fig. S8, A y B) (^[22], ^[23]). A su vez, se predijo que los monocitos THBS1+ señalarían a las células T a través de THBS1-CD47, que suprime la señalización del receptor de células T (TCR) (^[24]), y NECTIN2-TIGIT, promoviendo el agotamiento (fig. 4D, parte inferior, y fig. S8, C y D) (^[25]). En el núcleo del tumor, los macrófagos SPP1+ interactuaron con las células T CD4+ a través de TGFB1-TGFBR1/2 para inducir la diferenciación de las células Treg (^[26]–^[28]) y expresaron CXCL16, FN1 y SPP1, que se unen a CXCR6, integrinas y CD44 en las células T CD8+, facilitando la infiltración (^[29]), la retención y el agotamiento funcional (^[30]–^[32]) (fig. 4E). Estos macrófagos también expresaron múltiples ligandos inhibidores (LGALS9-HAVCR2 y CD86-CTLA4), reforzando la disfunción de las células T (fig. S8, E y F). Por último, la deconvolución CIBERSORTx de un conjunto de datos de microarrays CRLM público (GSE159216) confirmó que la abundancia de macrófagos SPP1+ se correlacionaba positivamente con los niveles de células T CD8+ agotadas (fig. 4F). En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que el posicionamiento de las células inmunitarias en relación con el núcleo del tumor gobierna la naturaleza de las interacciones entre las células mieloides y las células T, con los monocitos THBS1+ coordinando un intercambio cruzado inmunitario activo en el borde y los macrófagos SPP1+ impulsando la supresión en el núcleo. Esta reprogramación espacial de la comunicación inmunitaria puede contribuir al agotamiento de las células T CD8+ y sugiere que interrumpir los circuitos mieloides-células T específicos de la región podría representar una oportunidad terapéutica en CRLM.

La secuenciación de ARN de una sola célula multirregional revela zonas inmunitarias espacialmente estructuradas en CRLM

Para desentrañar el intrincado panorama inmunitario dentro de CRLM, realizamos la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células CD45+ aisladas de especímenes de hígado resecados de seis pacientes con CRLM clínicamente caracterizados (tabla S1). Recolectamos muestras coincidentes de tres regiones espacialmente distintas: el núcleo del tumor, el borde del tumor y el tejido NIL adyacente (fig. 1A y figs. S1A y S2A).

Después del control de calidad y la normalización, nuestro conjunto de datos comprendió 74 804 células (fig. S2, B y C). Al integrar los datos de todos los pacientes y sitios anatómicos, aplicamos un agrupamiento no sesgado, revelando una rica diversidad de poblaciones de células inmunitarias (fig. 1, B y C, y fig. S2, D a F). Utilizando genes expresados diferencialmente (DEG) y marcadores definitorios de linaje, anotamos con confianza los principales tipos de células, incluidos las células T citotóxicas CD8+, las células T auxiliares CD4+, las células asesinas naturales (NK), las células T asociadas a la mucosa invariantes (MAIT), los monocitos/macrófagos, los neutrófilos, las células T reguladoras (Treg), las células B, las células linfoides proliferativas, las células dendríticas plasmocitoides y las células cebadas (tabla S2). Se excluyó una población inusual que expresaba marcadores linfoides y mieloides mixtos del análisis posterior (fig. 1, B y C).

Al examinar la abundancia general, las células NK surgieron como la población inmunitaria más prevalente (22,7%), seguida de cerca por las células T CD8+ (19,3%), los monocitos/macrófagos (17,9%) y las células T CD4+ (16,6%). Las células MAIT y los neutrófilos también formaron fracciones sustanciales, mientras que las células Treg, las células B y otras aparecieron con menos frecuencia (fig. S2F). Estos hallazgos se alinean bien con estudios previos (^[5], ^[6]) y se validaron mediante citometría de masas en muestras adicionales de CRLM (tabla S1 y fig. S3, A a C).

En particular, el análisis espacial reveló profundas diferencias en la distribución de las células inmunitarias en las regiones tumorales. Las células mieloides se enriquecieron tanto en la NIL como en el núcleo del tumor, pero fueron particularmente escasas en el borde del tumor. Las células NK predominaron en la NIL, pero disminuyeron constantemente hacia el núcleo del tumor. En contraste, el borde y el núcleo del tumor albergaron un mayor número de células T CD4+ y células Treg (fig. 1D). En conjunto, estos datos revelan una arquitectura inmunitaria altamente compartimentada en CRLM, con distintas "zonas" inmunitarias que dan forma al microambiente tumoral (TME).

La diversidad espacial y funcional de los subconjuntos de células T da forma al panorama inmunitario en CRLM

Las células T CD4+ y CD8+ son abundantes y fenotípicamente diversas en las zonas inmunitarias de CRLM. El agrupamiento no supervisado identificó 11 subconjuntos de CD4+, incluidos las células T helper 17 (TH17), las células T foliculares auxiliares (Tfh), los efectores CD4+ citotóxicos (ThCTL) y las células Treg (fig. S4, A y B, y tabla S3). Espacialmente, las células ThCTL se enriquecieron en la NIL, pero disminuyeron hacia el núcleo del tumor; las células TH17 se agruparon en el borde del tumor, mientras que las células Tfh y Treg aumentaron desde el borde hasta el núcleo (fig. S4, C y D).

Para las células T CD8+, se encontraron 15 grupos distintos, que abarcan poblaciones similares a las ingenuas, circulatorias, NKT, MAIT, γδ, de memoria residentes tisulares (Trm) y agotadas (fig. 2, A y B). Las células Trm expresaron marcadores de residencia (CD44 y CCR5), mientras que las células agotadas mostraron una alta expresión de puntos de control inmunitario (PDCD1 y CTLA4) (tabla S4). Espacialmente, las células T CD8+ circulatorias dominaron la NIL; las células γδ y las células ENTPD1+ agotadas se enriquecieron en el borde del tumor, y las células T CD8+ con proteínas de choque térmico y terminalmente agotadas fueron más abundantes en el núcleo del tumor (fig. 2C y fig. S4, E y F). Esto revela una clara especialización espacial de los subconjuntos de células T en CRLM.

El perfil multirregional de los estados funcionales de las células T CD8+ revela que el borde del tumor es una zona de transición hacia el agotamiento

Para caracterizar la diversidad funcional de las células T CD8+ en CRLM, clasificamos las células en función de las firmas genéticas de activación y agotamiento. Las células en reposo (grupo c3) carecían de características citotóxicas o inhibitorias, mientras que las poblaciones activadas expresaban granzimas (GZMA y GZMK), perforina (PRF1), IFNG y marcadores de superficie como CD28 y CD69. En particular, dos grupos (c12 y c14) exhibieron un fenotipo pre-agotado, definido por la coexpresión de genes de activación e inhibición o por la expresión de marcadores de transición como TCF7 y CXCR3, lo que indica un estado preparado entre la función efectora y el agotamiento (^[12], ^[13]). Los grupos terminalmente agotados (c4 y c10) se caracterizaron por una alta expresión de PDCD1, CTLA4, LAG3 y HAVCR2 (fig. 2D).

El mapeo espacial de estos estados reveló una zonificación clara: las células T CD8+ activadas se enriquecieron en la NIL, las células pre-agotadas se localizaron predominantemente en el borde del tumor y las células terminalmente agotadas se acumularon dentro del núcleo del tumor (fig. 2E). Esta organización espacial se respaldó aún más al examinar la expresión génica asociada al estado de las células T CD8+ en las regiones tisulares. Los genes asociados con la activación de las células T CD8+ se expresaron predominantemente en la NIL, y hubo una expresión mixta de marcadores de activación y agotamiento en el borde del tumor. En contraste, los genes asociados al agotamiento se expresaron principalmente en el núcleo del tumor (fig. S5A). En conjunto, estos hallazgos establecen que el borde del tumor es un nicho inmunológico distinto donde las células T CD8+ comienzan a perder la función efectora, lo que sugiere una zona de transición clave que puede ser terapéuticamente objetivo.

Las trayectorias de pseudotiempo de las células T CD8+ revelan un agotamiento progresivo hacia el núcleo del tumor en CRLM

Para investigar si las células T CD8+ experimentan una transición gradual de la activación al agotamiento en las regiones de CRLM, aplicamos la herramienta de inferencia de trayectoria de pseudotiempo Ouija a los datos de secuenciación de ARN de una sola célula. El ordenamiento de las células por expresión de marcadores de activación y agotamiento reveló una trayectoria continua: el pseudotiempo temprano se asoció con marcadores de activación (CD69, GZMK y TCF7), predominantemente en las células derivadas de la NIL, mientras que el pseudotiempo tardío correspondió con marcadores de agotamiento (PDCD1, CTLA4, CXCL13 y HAVCR2), enriquecido en las muestras del borde y el núcleo del tumor (fig. 2F y fig. S5, B y C).

Estos hallazgos de la transcriptómica se respaldaron con inmunofluorescencia espacial, que mostró que las células T CD8+CD69+ se localizaron principalmente en la NIL (fig. S5, D y E), y las células T CD8+CTLA4+ agotadas se concentraron en el borde y el núcleo del tumor (fig. 2, G y H). La citometría de masas confirmó aún más este gradiente, con niveles significativamente más altos de marcadores de agotamiento, el receptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT) y la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), en las células T CD8+ del núcleo del tumor en comparación con las regiones NIL y del borde (fig. S5, F y G).

En conjunto, estos datos revelan que, si bien las células T CD8+ citotóxicas activas se reclutan inicialmente en las lesiones metastásicas del hígado, su funcionalidad disminuye progresivamente a medida que se desplazan hacia el interior. El borde del tumor emerge como un punto de control clave de "pre-agotamiento", donde algunas células T CD8+ coexpresan marcadores de activación (GNLY, PRF1 y GZMA) e inhibidores (HAVCR2, LAG3 y TNFRSF18), lo que sugiere que estas células transicionales aún podrían ser susceptibles de una recuperación terapéutica (^[14]). Esto presenta una ventana estratégica para detener o revertir el agotamiento y restaurar la inmunidad antitumoral.

Los nichos de macrófagos MARCO+, SPP1+ y TREM2+ espacialmente distintos dan forma a un microambiente tumoral permisivo en las metástasis hepáticas (CRLMs)

Para investigar cómo el compartimento mieloide se adapta al microambiente de las CRLMs, realizamos un agrupamiento no supervisado de las células CD45+ en el NIL, el borde del tumor y el núcleo del tumor. Esto, basado en los 50 componentes principales principales, reveló 25 grupos distintos (fig. 3A). Utilizando los genes diferencialmente expresados (DEGs) (tabla S5) y los marcadores mieloides canónicos (fig. S6A), identificamos poblaciones clave de monocitos y macrófagos con patrones de abundancia específicos de la región. Los monocitos dominaron el NIL y el borde del tumor, mientras que los macrófagos se enriquecieron significativamente en el núcleo del tumor (fig. S6B).

Para analizar esto con mayor detalle, reagrupamos las poblaciones de monocitos/macrófagos, revelando 11 subtipos transcripcionalmente distintos, todos los cuales expresan marcadores centrales de monocitos como CSF1R, CD14 y LST1 (fig. 3B y fig. S7A). Cinco grupos coexpresaron genes asociados a macrófagos (CD68, MRC1, FN1 y APOE), lo que es consistente con las identidades de macrófagos derivados de monocitos (MoM) (c2, c4, c7, c8 y c10) (fig. S7B y tabla S6).

El mapeo espacial reveló abundancias altamente dinámicas, particularmente dentro de los grupos de MoM entre las tres ubicaciones. El grupo c7 (C1QB+) se enriqueció en el NIL, lo que sugiere un papel en la vigilancia inmunitaria homeostática. En contraste, los macrófagos SPP1+ (c8) y TREM2+ (c10) se enriquecieron tanto en el borde del tumor como en el núcleo, mientras que los macrófagos MARCO+ (c2) se encontraron casi exclusivamente en el núcleo del tumor (fig. 3C y fig. S7, C a E). El análisis funcional de estos grupos reveló funciones especializadas en la configuración del nicho inmunosupresor: los macrófagos SPP1+ (c8) expresaron genes relacionados con la remodelación de la matriz extracelular y la supresión de las células T. Los macrófagos TREM2+ (c10) mostraron una firma de metabolismo lipídico, que a menudo se asocia con la actividad promotora del tumor. Los macrófagos MARCO+ (c2) expresaron factores quimiotácticos que pueden favorecer el reclutamiento continuo de monocitos en los sitios metastásicos (fig. S7F y tabla S6).

En conjunto, estos hallazgos revelan una red coordinada de subconjuntos de macrófagos inmunosupresores que ocupan nichos espaciales distintos en las CRLMs. Al realizar funciones complementarias, que van desde la evasión inmune hasta la remodelación estructural, los macrófagos SPP1+, TREM2+ y MARCO+ contribuyen colectivamente al establecimiento y mantenimiento de un microambiente tumoral permisivo.

La diferenciación de los monocitos THBS1+ en macrófagos SPP1+ en el borde del tumor promueve la inmunosupresión en las CRLMs

Entre los grupos de monocitos/macrófagos, la población más grande y más llamativa consistió en monocitos THBS1+ (Monoc0THBS1). El mapeo espacial reveló que estas células se enriquecen en el NIL y el borde del tumor, pero se vuelven escasas dentro del núcleo del tumor, lo que sugiere un papel transicional en el margen del tumor (fig. S7, C a E).

Hipótesis que los monocitos THBS1+ actúan como precursores de macrófagos inmunosupresores (MoM) dentro del microambiente tumoral (TME) de la CRLM. Para probar esto, realizamos la inferencia de trayectoria utilizando Monocle3, lo que reveló una vía de diferenciación clara desde Monoc0THBS1 hasta los subconjuntos de MoM posteriores, incluidos Macroc2MARCO y, en última instancia, Macroc8SPP1 (fig. 3, D y E). Esto apoya informes anteriores de que los monocitos que expresan THBS1 dan lugar a macrófagos SPP1+ en los sitios del tumor primario (^[15]).

Los grupos a lo largo de esta trayectoria conservaron firmas de genes relacionadas con la angiogénesis, lo que indica que los monocitos y su progenie de macrófagos pueden mantener funciones protumorales a lo largo de su diferenciación (fig. S7G y tabla S6) (^[16]).

Se ha descubierto que los macrófagos asociados al tumor se correlacionan con un mal pronóstico (^[17]–^[19]). Para evaluar la relevancia clínica de la población SPP1+, identificamos una firma de genes de macrófagos SPP1 derivada de nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), que captura el perfil transcripcional distinto de los macrófagos SPP1+ localizados en el borde y el núcleo del tumor (tabla S7). Luego, aplicamos esta firma a un conjunto de datos de microarrays de CRLM disponible públicamente para evaluar su asociación con los resultados clínicos (^[20]). La alta expresión de la firma de macrófagos SPP1 se asoció fuertemente con un mal pronóstico. Los pacientes con puntuaciones de firma elevadas tuvieron una supervivencia significativamente más corta, tanto libre de enfermedad como general, en comparación con aquellos con menor expresión (fig. 3, F y G). Estos resultados destacan el potencial de los macrófagos SPP1+ como biomarcador pronóstico y como objetivo terapéutico en las CRLMs.

En conjunto, estos hallazgos revelan una vía de diferenciación de monocitos a macrófagos conservada en el hígado metastásico, por la cual los monocitos THBS1+ dan lugar a macrófagos inmunosupresores SPP1+ que impulsan la progresión tumoral y empeoran los resultados de los pacientes. El direccionamiento de esta vía puede ofrecer una estrategia prometedora para interrumpir la formación de un nicho inmunosupresor en las CRLMs.

La proximidad al núcleo del tumor remodela la comunicación mieloide-células T, lo que provoca el agotamiento de las células T en las CRLMs

Para comprender cómo la proximidad espacial al núcleo del tumor da forma a la interacción cruzada inmune en las CRLMs, analizamos las interacciones ligando-receptor entre las células T CD4+ y CD8+ y los subconjuntos mieloides utilizando CellChat. Esto reveló notables diferencias regionales en la comunicación inmune: en el borde del tumor, los monocitos THBS1+ (Monoc0THBS1), las células T de memoria residentes tisulares CD8+ (CD8c0Trm_GZMK) y las células TH17 y TH0 CD4+ formaron una red altamente interactiva. En contraste, dentro del núcleo del tumor, los macrófagos inmunosupresores SPP1+ (Macroc4SPP1) surgieron como el centro de señalización dominante, interactuando principalmente con las células T CD8+ agotadas (CD8c4Tex_CTLA4) y los subconjuntos de células T CD4+ (fig. 4A y tabla S8). Para validar estas interacciones predichas, realizamos inmunohistoquímica multiplex y aplicamos la función SpatialScore para cuantificar la proximidad física de los monocitos (CD14+IBA1−), los macrófagos (CD14+IBA1+) y las células T CD8+ (^[21]). Coherente con los hallazgos de CellChat, las células T CD8+ estaban significativamente más cerca de los monocitos en el borde del tumor, mientras que en el núcleo del tumor, estaban más asociadas con los macrófagos (fig. 4, B y C), lo que indica un cambio espacial en la regulación inmune. Funcionalmente, las células Trm CD8+ en el borde interactuaron con los monocitos THBS1+ a través de la señalización MIF-CD74/CXCR4 y ANXA1-FPR1/2, vías conocidas por reclutar y polarizar los monocitos, mientras que los subconjuntos de células T CD4+ utilizaron ejes similares (fig. 4D, parte superior, y fig. S8, A y B) (^[22], ^[23]). A su vez, se predijo que los monocitos THBS1+ señalarían a las células T a través de THBS1-CD47, que suprime la señalización del receptor de células T (TCR) (^[24]), y NECTIN2-TIGIT, promoviendo el agotamiento (fig. 4D, parte inferior, y fig. S8, C y D) (^[25]). En el núcleo del tumor, los macrófagos SPP1+ interactuaron con las células T CD4+ a través de TGFB1-TGFBR1/2 para inducir la diferenciación de las células Treg (^[26]–^[28]) y expresaron CXCL16, FN1 y SPP1, que se unen a CXCR6, integrinas y CD44 en las células T CD8+, facilitando la infiltración (^[29]), la retención y el agotamiento funcional (^[30]–^[32]) (fig. 4E). Estos macrófagos también expresaron múltiples ligandos inhibidores (LGALS9-HAVCR2 y CD86-CTLA4), reforzando la disfunción de las células T (fig. S8, E y F). Por último, la deconvolución de CIBERSORTx de un conjunto de datos público de CRLM (GSE159216) confirmó que la abundancia de macrófagos SPP1+ se correlaciona positivamente con los niveles de células T CD8+ agotadas (fig. 4F). En conjunto, estos hallazgos respaldan un modelo en el que el posicionamiento de las células inmunitarias en relación con el núcleo del tumor gobierna la naturaleza de las interacciones mieloide-células T, con los monocitos THBS1+ coordinando la interacción cruzada inmune activa en el borde y los macrófagos SPP1+ impulsando la supresión en el núcleo. Esta reprogramación espacial de la comunicación inmune puede contribuir al agotamiento de las células T CD8+ y sugiere que interrumpir los circuitos mieloide-células T específicos de la región podría representar una oportunidad terapéutica en las CRLMs.

DISCUSIÓN

Utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula multirregional, mapeamos el panorama inmune de las CRLMs y descubrimos una notable diversidad transcripcional en tres zonas distintas: el núcleo tumoral metastásico, el borde del tumor y el NIL distal. Nuestro análisis demuestra que la proximidad espacial al núcleo del tumor da forma a la localización, la activación y la función de las células inmunitarias, lo que afecta tanto a los compartimentos innatos como adaptativos.

Coherente con estudios anteriores, encontramos que las células T CD8+ en el NIL son transcripcionalmente activas, mientras que las que se infiltran en el núcleo del tumor expresan marcadores de agotamiento canónicos como CTLA4, HAVCR2 y TIGIT (^[5]). Fundamentalmente, el borde del tumor surgió como una zona de pre-agotamiento funcionalmente distinta, donde dos subpoblaciones de células T CD8+: una que expresa TCF7 y otra que coexpresa marcadores de activación y agotamiento, sugieren un fenotipo transicional susceptible de reactivación terapéutica (^[13], ^[33]).

También identificamos los monocitos THBS1+ en el borde del tumor como mediadores clave de la inmunorregulación. Estos monocitos interactúan con las células Trm CD8+ GZMK+ a través del eje de señalización THBS1-CD47, que se sabe que inhibe la activación mediada por TCR (^[24]). Esta interacción probablemente contribuye a las etapas iniciales del agotamiento de las células T. THBS1 codifica la trombospondina 1, una proteína matricelular que suprime la angiogénesis y activa el factor de crecimiento transformante-β, lo que vincula a THBS1 con la fibrosis y la supresión inmune (^[34], ^[35]). Apoyando su relevancia clínica, se ha implicado a THBS1 en la promoción de la metástasis en modelos ortotópicos de CRC, donde la eliminación de THBS1 redujo las metástasis en el hígado y los ganglios linfáticos de una manera dependiente de las células T CD8+. Además, se observaron niveles elevados de trombospondina 1 en suero en pacientes con CRC en comparación con aquellos con lesiones benignas, lo que destaca su potencial como biomarcador y objetivo terapéutico en la CRC metastásica (^[36]).

Los atlas mieloides a gran escala recientes han demostrado que los monocitos circulantes dan lugar a macrófagos SPP1+ en la CRC y las CRLMs (^[32]). Nuestro análisis de trayectoria extiende estas observaciones, lo que sugiere que los macrófagos SPP1+ se derivan de la población de monocitos THBS1+ y, con nuestro enfoque multirregional, hipotetizamos que esta transición ocurre en el borde del tumor. SPP1 codifica la osteopontina, una proteína involucrada en la adhesión y la migración celular a través de interacciones con integrinas y CD44 (^[37]). Se ha descrito que los macrófagos SPP1+ son una población inmunosupresora asociada con la metástasis hepática (^[10], ^[32]), la mala supervivencia en la CRC (^[10], ^[16]) y, ahora, según nuestros datos, el mal pronóstico en las CRLMs. Derivamos una firma de genes de macrófagos SPP1 de nuestro conjunto de datos de células individuales y demostramos que se correlaciona fuertemente con una peor supervivencia libre de enfermedad y general en cohortes públicas de CRLM. Además, encontramos que la abundancia de macrófagos SPP1+ se correlaciona positivamente con los niveles de células T CD8+ agotadas en el mismo conjunto de datos, lo que sugiere que estos macrófagos contribuyen a la disfunción de las células T dentro del tumor.

Aunque no pudimos evaluar directamente el impacto de los macrófagos SPP1+ en la respuesta a la inmunoterapia en CRLM debido a la limitada cantidad de datos clínicos, la evidencia emergente de otros cánceres respalda esta conexión. Por ejemplo, una alta infiltración de macrófagos SPP1+ se ha relacionado con una respuesta deficiente a los inhibidores de los puntos de control inmunitario en el melanoma, el cáncer hepatocelular y el cáncer esofágico (^[38]). La neutralización de SPP1 en modelos murinos mejoró significativamente las respuestas anti–PD-1, reduciendo la carga tumoral y la metástasis de mama (^[39]). El silenciamiento genético de SPP1 redujo notablemente la carga tumoral y se asoció con un aumento de la infiltración, activación y respuesta de las células T en el CRC (^[40]) y con el anti–ligando de muerte programada 1 (PD-L1) en el CRLM (^[41]). Nuestro análisis de comunicación célula-célula apoya este mecanismo en el contexto humano, sugiriendo que los macrófagos SPP1+ en el núcleo del tumor interactúan con las células T CD8+ agotadas a través de pares ligando-receptor de puntos de control inmunitario, como LGALS9-HAVCR2 (galectina 9–TIM-3) y CD86-CTLA4, lo que podría contribuir a la supresión inmunitaria. En un estudio clínico de pacientes con CRC avanzado, el bloqueo combinado de CTLA4 y PD-L1 resultó en una mejora marginal en la supervivencia general (6,6 meses frente a 4,1 meses con cuidados paliativos), lo que implica la presencia de otros mecanismos inmunosupresores (^[42]). Identificamos fuertes interacciones inmunosupresoras entre macrófagos y células T en el núcleo del tumor a través del par ligando-receptor SPP1-CD44 y planteamos la hipótesis de que estas interacciones contribuyen a un fenotipo de células T CD8+ agotadas. Los estudios in vivo respaldan esta hipótesis al demostrar que las células T CD8+ reactivas al tumor en las metástasis hepáticas interactúan preferentemente con los macrófagos SPP1+ y que la señalización SPP1-CD44 promueve el agotamiento de las células T, lo que puede revertirse mediante la inhibición de CD44 (^[30], ^[31]). En conjunto, la presencia de interacciones inmunosupresoras potentes, más allá de las que se dirigen con la inmunoterapia actual, puede explicar, al menos en parte, por qué el bloqueo de los puntos de control inmunitario por sí solo ha mostrado una eficacia limitada en estos grupos de pacientes.

Desde el punto de vista mecanicista, proponemos que el borde del tumor sirve como un centro regulador inmunitario crítico en el CRLM. Aquí, los monocitos THBS1+ interactúan con las células T GZMK+ CD8+ a través de vías similares a los puntos de control (THBS1-CD47 y NECTIN2-TIGIT), promoviendo la disfunción de las células T, mientras que las interacciones recíprocas guían simultáneamente la diferenciación de monocitos a macrófagos a través de la señalización ANXA1-FPR2. Esto crea un circuito de auto-reforzamiento en el que los monocitos se diferencian en macrófagos MARCO+ y, finalmente, SPP1+, que infiltran el núcleo del tumor y suprimen aún más la función de las células T. Estos hallazgos posicionan el eje THBS1/SPP1 como un orquestador central de la supresión inmunitaria en el CRLM.

Desde una perspectiva terapéutica, los intentos previos de dirigir ampliamente los monocitos y los macrófagos, incluida la inhibición de CSF1R, han mostrado una eficacia limitada como monoterapia en el CRC, lo que probablemente refleja la redundancia y los programas compensatorios dentro del compartimento mieloide (^[43]). Estas limitaciones resaltan el valor potencial de dirigir subconjuntos inmunosupresores específicos en lugar de la depleción pan-macrófaga. En este contexto, SPP1 representa un candidato con una base mecanicista. Aunque SPP1 se expresa en múltiples poblaciones estromales e inmunitarias, los estudios genéticos indican un papel dominante del SPP1 derivado de macrófagos en la supresión inmunitaria (^[40], ^[41]). En particular, en el estudio de Henriques et al. (^[41]), el silenciamiento de SPP1 redujo los CRLM y se sinergizó con el bloqueo de los puntos de control inmunitario, mientras que el trasplante de médula ósea restauró el fenotipo inmunosupresor. Nuestro estudio con muestras humanas valida estos estudios preclínicos y apoya la implicación de los macrófagos SPP1+ como una población protumorígena clave. Actualmente, la inhibición farmacológica directa de SPP1 se encuentra en la etapa preclínica, con anticuerpos neutralizantes (^[44]) y moduladores dirigidos a macrófagos (^[45]) que muestran eficacia en modelos murinos, y la supresión indirecta a través de vías reguladoras también está en investigación.

En conjunto, nuestro estudio subraya el papel crítico de la organización espacial en la configuración del microambiente inmunitario de los CRLM humanos. Identificamos una zona de pre-agotamiento funcional en el borde del tumor y revelamos las contribuciones inmunosupresoras de los monocitos THBS1+ y los macrófagos SPP1+, proporcionando información mecanicista sobre la evasión inmunitaria y la resistencia a la inmunoterapia. Terapéuticamente, interrumpir la trayectoria de diferenciación de monocitos a macrófagos, mediante la inhibición de THBS1 o SPP1, en combinación con la quimioterapia neoadyuvante y el bloqueo de los puntos de control inmunitario, puede ofrecer una estrategia prometedora para revitalizar la inmunidad antitumoral y mejorar los resultados clínicos de los pacientes con CRLM.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras clínicas

Este estudio en humanos utilizó la plataforma traslacional PINCER (^[46]) y fue aprobado por el Comité del Servicio de Ética Nacional de Investigación (NRES) del Noroeste de Gran Mánchester (REC15/NW/0477). Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito para la donación de tejido de acuerdo con los protocolos institucionales. Se obtuvieron muestras de hígado de pacientes con CRC avanzado y metástasis hepáticas después de completar la quimioterapia neoadyuvante. Tras la resección quirúrgica, se recogieron inmediatamente biopsias de tres regiones anatómicas distintas: el NIL distal (de 5 a 10 cm del núcleo del tumor), el borde del tumor (de 0 a 1 cm del núcleo del tumor) y el núcleo del tumor. Todos los diagnósticos fueron confirmados por un histopatólogo consultor (información clínica que se encuentra en la tabla S1).

Disociación de células individuales de muestras de hígado humano

Las biopsias de hígado se disociaron mediante la disrupción mecánica y enzimática con colagenasa P (1 mg/ml; Roche) en solución salina tamponada con Hanks a 37 °C durante 30 minutos, seguida de la incubación con tripsina al 0,05 % (Sigma-Aldrich) a 37 °C durante 5 minutos. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz de 70 μm (Miltenyi) para eliminar los desechos, y los glóbulos rojos se lisaron utilizando el tampón de lisis de glóbulos rojos (BD Pharm Lyse). Las células inmunitarias se enriquecieron mediante centrifugación de gradiente de densidad con Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) a 400g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin frenos. Se recogieron la interfaz y la capa inferior, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en PBS + 2 % de albúmina sérica bovina (BSA) para su uso posterior.

Clasificación celular activada por fluorescencia

Las suspensiones de células individuales del tejido humano se prepararon como se describió anteriormente, seguida de la resuspensión en tampón MAC (0,5 % de BSA, 2 mM de EDTA y PBS) y el bloqueo sobre hielo durante 10 minutos con el bloqueador de Fc humano TrueStain (BioLegend). A continuación, las células se tiñeron con el marcador de viabilidad Sytox-blue (Thermo Fisher Scientific) y con anticuerpos conjugados con fluorocromos contra CD45 (BioLegend, clon HI30). La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se realizó en un FACS Aria III (BD Biosciences). A continuación, las células se clasificaron directamente en el tampón MAC y se colocaron sobre hielo.

Preparación de la muestra de secuenciación de ARN de célula única

Se prepararon suspensiones de células individuales de tejido humano como se describió anteriormente y se fijaron según el protocolo del fabricante. Las muestras se almacenaron a -80 °C durante un máximo de 3 meses y, posteriormente, se enviaron para la generación de bibliotecas de transcriptoma utilizando la plataforma 10X Genomics Chromium. Dos muestras (CB31 y CB46; ambas del borde del tumor) no superaron el particionado de células individuales en la cámara de microfluidos y se excluyeron del análisis posterior. Las bibliotecas de cDNA se secuenciaron utilizando el instrumento Illumina NovaSeq S1.

Alineación y cuantificación de recuentos

Los datos de secuenciación FASTQ sin procesar se analizaron y se alinearon al genoma de referencia humano GRCh38 con CellRanger (3.0.2). Los recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) se resumieron (UMI) para cada gen de cada célula. A continuación, las matrices de recuento UMI sin procesar se convirtieron en un objeto Seurat v5 (^[47]) en R (4.3.1). Las células con un número bajo de genes 6000 (lo que sugiere dobletes) se eliminaron del conjunto de datos. Por último, las células con más del 15 % de genes codificados por mitocondrias se eliminaron del análisis.

Integración de datos, normalización y reducción de dimensionalidad

Los datos se escalaron con los 2000 genes más variables utilizando la función FindVariableFeatures. Estos genes variables se utilizaron para el análisis de componentes principales, y la función FindNeighbors se utilizó para obtener un mapa de vecinos más cercanos entre las células en el número de componentes principales determinados por la función ElbowPlot. Para eliminar los efectos de lote entre las muestras, realizamos la integración de datos con el paquete R Harmony (^[48]). La función FindClusters se utilizó para obtener grupos de células, y el número de grupos se determinó variando la configuración de resolución. Todas las funciones descritas son de Seurat v5, a menos que se indique lo contrario.

Expresión diferencial

Para anotar e identificar los genes marcadores de los grupos, los DEG se identificaron mediante una prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon implementada en la función FindAllMarkers. Los genes se filtraron para un cambio de registro de 0,25 y se expresaron en al menos el 25 % de las células del grupo.

Análisis de enriquecimiento de la firma génica

Para inferir las funciones de MoM, los DEG entre cada grupo se determinaron mediante la función FindMarkers en Seurat, con los siguientes parámetros: only.pos = T, logfc.threshold = 0,1 y min.pct = 0,1 (^[47]). Los DEG significativos se clasificaron según su cambio de registro. Los genes clasificados se utilizaron en la función gseGO implementada por clusterProfiler (4.8.3). El tamaño máximo del conjunto de genes fue de 500, se utilizó la ontología "BP" y los valores p se ajustaron utilizando el método de Benjamini-Hochberg (^[49]).

Distribución de tejidos de los grupos

El enriquecimiento de los grupos en las tres ubicaciones se cuantificó comparando las frecuencias observadas (O) y esperadas (E) de las células en cada grupo según la fórmula descrita anteriormente (RO/E) (^[50]). Las frecuencias esperadas para cada combinación de grupos de células y ubicaciones se calcularon con una prueba de Chi-cuadrado. RO/E > 1 indicó enriquecimiento.

Análisis de pseudotiempo

Se realizó un ordenamiento de pseudotiempo lineal para los grupos de células T CD8 utilizando el marco estadístico bayesiano de variables latentes Ouija (^[51]), con 10.000 iteraciones. Para acelerar los cálculos, se utilizó una submuestra aleatoria de 800 células por paciente de este subconjunto de células T como entrada. Se utilizó un conjunto de 23 genes marcadores seleccionados (tabla S9) para el aprendizaje del pseudotiempo, y las células individuales se clasificaron en función de sus valores de pseudotiempo asignados para el análisis posterior. Se calculó la media del pseudotiempo para cada muestra y grupo como el promedio del rango de pseudotiempo de todas las células T CD8+ del respectivo grupo/muestra incluidos en el análisis de Ouija.

Inferencia de trayectoria

Para investigar la trayectoria de la diferenciación de MoM, se realizó un análisis de pseudotiempo en un subconjunto de monocitos y MoM utilizando Monocle3 (v1.3.4) (^[52]). Basándonos en los análisis anteriores, seleccionamos Monoc0THBS1 como la raíz de la trayectoria. Dividimos los grupos utilizando la función clustercells con una resolución de 1e-3 y construimos un gráfico principal utilizando la función learngraph. A continuación, la función order_cells se utilizó para asignar a las células un valor de pseudotiempo, que luego se asignó a la aproximación de la variedad uniforme para una mayor visualización e interpretación.

Análisis de supervivencia de los datos de expresión génica de microarrays

Se descargaron datos de microarrays disponibles públicamente del Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso GSE159216 (^[20]). Se derivó una firma de macrófagos SPP1+ de 10 genes a partir de los genes más regulados al alza dentro de este grupo de nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN de célula única. Se calculó una puntuación del programa genético asociado a SPP1 utilizando ssGSEA (GSVA v2.2.0) (^[53]). Los pacientes se dividieron en grupos de alta y baja firma SPP1 utilizando la función surv_cutpoint (mínimo del 20 % por grupo). Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier con survfit y se visualizaron utilizando ggsurvplot.

Desconvolución de la proporción de tipos de células de los datos de microarrays

Hemos cargado una matriz de firmas de referencia de nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) en CIBERSORTx (^[54]) para estimar las proporciones de tipos de células dentro del conjunto de datos GSE159216. La normalización cuantil se desactivó, se aplicó la corrección de lotes en modo S, las permutaciones se establecieron en 500 y se utilizaron otros parámetros con la configuración predeterminada. Se utilizó el análisis de correlación de Spearman para investigar la relación entre las proporciones de los tipos de células de interés.

Análisis de interacción celular

Los subconjuntos de datos de células CD8+ T, células CD4+ T y células mieloides se fusionaron sin integración utilizando la función de fusión en Seurat v5. El objeto fusionado se subdividió para generar dos objetos Seurat con células del núcleo tumoral y el borde tumoral. Todas las funciones descritas aquí provienen del paquete CellChat (v2.1.2) (^[55]). Cada objeto se procesó individualmente con la configuración predeterminada para crear dos objetos CellChat con la función createCellChat. Se ejecutó la función subsetDB para incluir pares de ligandos y receptores asociados con "Señalización secretada", "Receptor de la MEC" y "Contacto célula-célula". Posteriormente, cada objeto se fusionó con la función mergeCellChat. Las diferencias en las intensidades de interacción se calcularon con la función netVisualdiffInteraction con el parámetro measure establecido en "weight". Para identificar poblaciones de células con cambios significativos en la señalización L-R saliente o entrante entre las dos ubicaciones, se ejecutó la función netAnalysiscomputeCentrality con un umbral de 1 × 10−4 en el objeto CellChat fusionado. Se ejecutó netVisual_bubble para identificar las probabilidades de señalización entre grupos específicos de células.

Preparación de muestras para citometría de masas

Se prepararon suspensiones de células individuales y se lavaron con PBS Maxpar (Standard Biotools). El sedimento celular se resuspendió en PBS Maxpar y se tiñó con una dilución de 1:1000 del marcador de viabilidad Cell-ID 103-Rhodium (Standard Biotools) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células se lavaron en tampón de tinción celular Maxpar (Standard Biotools) y se fijaron con un 1,6% de paraformaldehído (Thermo Fisher Scientific) durante 10 minutos sobre hielo. Luego, las células se centrifugaron a 800g durante 5 minutos y se almacenaron a −80 °C.

Después de descongelar sobre hielo, las células se lavaron en PBS Maxpar, se permeabilizaron sobre hielo con tampón de permeabilización Maxpar Barcode (Standard Biotools) durante 10 minutos y se marcaron con 20-Plex Pd Barcoding (Standard Biotools) durante 10 minutos. Después de dos lavados en PBS, las muestras se juntaron. Para la tinción de superficie, las células se incubaron con un cóctel de anticuerpos conjugados con metal (tabla S10) durante 40 minutos a 4 °C. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces con tampón de tinción celular y se tiñaron durante la noche a 4 °C con 125 μM de Intercalator-191Ir (Standard Biotools) diluido 1:2000 en tampón de tinción celular.

Adquisición de muestras y análisis de datos de citometría de masas

Las células se lavaron en tampón de tinción celular Maxpar y se resuspendieron en solución de adquisición celular (Standard Biotools) suplementada con 0,1X de cuentas de calibración de cuatro elementos EQTM (Standard Biotools). La adquisición se realizó en un sistema Helios CyTOF (Standard Biotools) a una velocidad de 1 indicó enriquecimiento.

Análisis de pseudotiempo

Se realizó un ordenamiento lineal de pseudotiempo para los grupos de células T CD8 utilizando el marco estadístico de variables latentes bayesianas Ouija (^[51]), con 10.000 iteraciones. Para agilizar los cálculos, se utilizó una submuestra aleatoria de 800 células por paciente de este subconjunto de células T como entrada. Se utilizó un conjunto de 23 genes marcadores seleccionados (tabla S9) para el aprendizaje del pseudotiempo, y las células individuales se clasificaron en función de sus valores de pseudotiempo asignados para el análisis posterior. El pseudotiempo medio para cada muestra y grupo se calculó como el promedio de la clasificación del pseudotiempo de todas las células T CD8+ de la muestra/grupo respectivo incluidos en el análisis de Ouija.

Inferencia de trayectoria

Para investigar la trayectoria de la diferenciación de MoM, se realizó un análisis de pseudotiempo en un subconjunto de monocitos y MoM utilizando Monocle3 (v1.3.4) (^[52]). Basándonos en análisis previos, seleccionamos Monoc0THBS1 como la raíz de la trayectoria. Dividimos los grupos utilizando la función clustercells con una resolución de 1e-3 y construimos un gráfico principal utilizando la función learngraph. La función order_cells se utilizó para asignar un valor de pseudotiempo a las células, que luego se asignó a la Aproximación y Proyección de Manifold Uniforme para una mayor visualización e interpretación.

Análisis de supervivencia de datos de expresión génica de microarrays

Se descargaron datos de microarrays disponibles públicamente del Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso GSE159216 (^[20]). Se derivó una firma de macrófagos de 10 genes SPP1+ de los genes más regulados positivamente dentro de este grupo de nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN unicelular interno. Se calculó una puntuación del programa de genes asociados a SPP1 utilizando ssGSEA (GSVA v2.2.0) (^[53]). Los pacientes se dividieron en grupos de alta y baja firma SPP1 utilizando la función surv_cutpoint (mínimo 20% por grupo). Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier con survfit y se visualizaron utilizando ggsurvplot.

Desconvolución de la proporción de tipos celulares de datos de microarrays

Cargamos una matriz de firma de referencia de nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN unicelular en CIBERSORTx (^[54]) para estimar las proporciones de tipos celulares dentro del conjunto de datos GSE159216. La normalización de cuartiles se desactivó, se aplicó la corrección de lote en modo S, las permutaciones se establecieron en 500 y se utilizaron otros parámetros con la configuración predeterminada. Se utilizó el análisis de correlación de Spearman para investigar la relación entre las proporciones de los tipos celulares de interés.

Análisis de interacción celular

Los conjuntos de datos de células T CD8+, células T CD4+ y células mieloides se fusionaron sin integración utilizando la función merge en Seurat v5. El objeto fusionado se dividió posteriormente para generar dos objetos Seurat con células del núcleo tumoral y el borde tumoral. Todas las funciones descritas aquí son del paquete CellChat (v2.1.2) (^[55]). Cada objeto se procesó individualmente con la configuración predeterminada para crear dos objetos CellChat con la función createCellChat. Se ejecutó la función subsetDB para incluir pares de ligandos-receptores asociados con “Señalización Secretada”, “Receptor de la MEC” y “Contacto Celular-Celular”. Posteriormente, cada objeto se fusionó con la función mergeCellChat. Se calcularon las intensidades de interacción diferenciales con la función netVisualdiffInteraction con el parámetro measure establecido en “weight”. Para identificar poblaciones de células con cambios significativos en la señalización de ligandos-receptores (L-R) saliente o entrante entre las dos localizaciones, se ejecutó la función netAnalysiscomputeCentrality con un umbral de 1 × 10−4 en el objeto CellChat fusionado. Se ejecutó netVisual_bubble para identificar las probabilidades de señalización entre grupos específicos de células.

Preparación de muestras para citometría de masas

Se prepararon y lavaron suspensiones celulares únicas con Maxpar PBS (Standard Biotools). El sedimento celular se resuspendió en Maxpar PBS y se tiñó con una dilución de 1:1000 de marcador de viabilidad Cell-ID 103-Rhodium (Standard Biotools) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del teñido, las células se lavaron en tampón de teñido celular Maxpar (Standard Biotools) y se fijaron con un 1,6% de paraformaldehído (Thermo Fisher Scientific) durante 10 minutos sobre hielo. Las células se centrifugaron luego a 800g durante 5 minutos y se almacenaron a −80 °C.

Después de descongelar sobre hielo, las células se lavaron en Maxpar PBS, se permeabilizaron sobre hielo con tampón de permeabilización Maxpar Barcode (Standard Biotools) durante 10 minutos y se codificaron por barras utilizando 20-Plex Pd Barcoding (Standard Biotools) durante 10 minutos. Después de dos lavados en PBS, las muestras se juntaron. Para el teñido de superficie, las células se incubaron con un cóctel de anticuerpos conjugados con metal (tabla S10) durante 40 minutos a 4 °C. Después del teñido, las células se lavaron dos veces con tampón de teñido celular y se tiñeron durante la noche a 4 °C con 125 μM de Intercalator-191Ir (Standard Biotools) diluido 1:2000 en tampón de teñido celular.

Adquisición de muestras y análisis de datos de citometría de masas

Las células se lavaron en tampón de teñido celular Maxpar y se resuspendieron en solución de adquisición celular (Standard Biotools) suplementada con 0,1X EQTM Four Element Calibration Beads (Standard Biotools). La adquisición se realizó en un sistema Helios CyTOF (Standard Biotools) a una velocidad de