La inhibición de TMED4 mejora la función de los linfocitos T CD8+ y la eficacia de las células CAR-T en tumores sólidos a través del eje IRE1α-autofagia.

Las células T CD8+ desempeñan un papel central en la eliminación tumoral al reconocer y destruir las células cancerosas a través de su receptor de células T (TCR), que detecta los antígenos tumorales presentados en las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I (CMH-I). Sin embargo, muchos cánceres escapan a la vigilancia inmunitaria al reducir la expresión de CMH-I, impidiendo así el reconocimiento y la citotoxicidad mediados por las células T CD8+. Para superar esta limitación, se desarrolló la terapia con células T con receptor quimérico de antígeno (CAR T). Las células CAR T se diseñan para reconocer los antígenos asociados al tumor de forma independiente del CMH, lo que les permite destruir las células cancerosas independientemente de la expresión de CMH-I. Esta estrategia ha demostrado un éxito notable en el tratamiento de neoplasias de células B, pero sigue siendo en gran medida ineficaz en los tumores sólidos debido a la inmunosupresión y el agotamiento de las células T (^[1]–^[3]).

Tanto las células T CD8+ infiltrantes en el tumor como las células CAR T en los tumores sólidos sufren de agotamiento, lo que perjudica su capacidad para montar respuestas antitumorales eficaces. El agotamiento de las células T se caracteriza por la expresión sostenida de receptores inhibitorios [por ejemplo, proteína 1 de muerte programada (PD1), proteína 3 de inmunoglobulina y dominio de mucina que contiene (TIM3), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4) y gen de activación de linfocitos 3 (LAG3)], la reducción de la producción de citocinas [interferón-γ (IFN-γ), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina-2 (IL-2)], la disminución de la secreción de granzima B y la alteración de la proliferación (^[4], ^[5]). Las células T CD8+ (Tex) agotadas existen en dos subpoblaciones distintas: células Tex progenitoras (Texprog) y células T terminalmente agotadas (Texterm). Las células Texprog (PD1int, SLAMF6+ y CXCR5+) conservan la capacidad proliferativa, la producción de citocinas y la capacidad de diferenciarse en células Texterm, que exhiben una alta expresión de PD1 y TIM3, una mayor capacidad citolítica, pero una disminución de la polifuncionalidad de las citocinas, el potencial proliferativo y la longevidad (^[6]–^[8]). Si bien los factores de transcripción, como la caja de alta movilidad asociada a la selección de timocitos (TOX), el factor de transcripción similar a la cremallera leucina básica (BATF), los factores nucleares de las células T activadas y los transductores de señal y activadores de la transcripción, regulan la diferenciación de Tex (^[9]–^[11]), los mecanismos que sustentan el agotamiento de las células T y limitan su actividad antitumoral siguen sin estar claros.

Estudios recientes sugieren que el estrés del retículo endoplásmico (RE) es un regulador clave de la función antitumoral de las células T en el microambiente tumoral (^[12]–^[14]). El estrés del RE surge de la acumulación de proteínas desplegadas y mal plegadas, una característica de las células altamente secretoras y diversas enfermedades, incluido el cáncer, la neurodegeneración y la diabetes (^[15]). Para restaurar la homeostasis celular, se inicia la respuesta de las proteínas no plegadas (UPR) a través de tres sensores principales del RE: enzima 1 que requiere inositol 1α (IRE1α/Ern1), quinasa del RE similar a la quinasa R (PERK/Eif2ak3) y factor de transcripción 6 (ATF6/Atf6) (^[16]). En condiciones normales, estos permanecen inactivos debido a la unión con la proteína de unión a la inmunoglobulina (BIP), pero tras la activación por estrés, IRE1α empalma el ARNm de la proteína de unión a la caja X (Xbp1) en XBP1s (^[17]), PERK fosforila eIF2α (^[18]) y ATF6 sufre una escisión proteolítica en ATF6N (^[19]), lo que inicia las respuestas de adaptación al estrés. A pesar del creciente reconocimiento del estrés del RE en la modulación de la función de las células T, su papel en la regulación del agotamiento de las células T CD8+ aún no se comprende completamente.

Otro regulador intrínseco clave de la función efectora de las células T es la autofagia, un proceso evolutivamente conservado en el que los componentes citosólicos se degradan a través del lisosoma (^[20]–^[23]). La autofagia se activa en las células T tras la estimulación del TCR y de las citocinas, lo que favorece la supervivencia celular, la adaptación metabólica y la formación de memoria (^[20], ^[22], ^[24]). Estudios recientes han demostrado que la autofagia puede contrarrestar el agotamiento de las células T. Por ejemplo, el alto nivel de K+ extracelular desencadena la autofagia para aliviar el agotamiento al limitar la captación de nutrientes (^[25]), mientras que el defecto en la mitofagia provoca el agotamiento a través de la acumulación de mitocondrias disfuncionales (^[26], ^[27]). Se sabe que la autofagia inducida por el estrés del RE impulsa la progresión tumoral y la resistencia a la terapia (^[28]–^[30]), pero su papel en la regulación del agotamiento de las células T y la función antitumoral aún no se ha explorado.

Las proteínas transmembrana que contienen el dominio emp24 (TMED), también conocidas como proteínas p24, regulan el tráfico del RE-Golgi y se han relacionado con la regulación inmunitaria y la progresión del cáncer (^[31]). Se ha demostrado que TMED4, un miembro de esta familia, modula las respuestas al estrés al regular la actividad de las chaperonas del RE y las respuestas al choque térmico dependientes del factor de choque térmico 1 (^[32]). Los análisis de bases de datos han relacionado la expresión de TMED4 con la infiltración de células inmunitarias, la supervivencia y el pronóstico en pacientes con glioma (^[33]). Recientemente demostramos que TMED4 mantiene la función de las células T reguladoras (células Treg) a través de la señalización de especies reactivas de oxígeno dependiente de IRE1α y las respuestas antioxidantes mediadas por el factor nuclear relacionado con el factor eritroide 2 (NRF2) (^[34]). Sin embargo, su papel en el agotamiento de las células T CD8+ y la inmunidad antitumoral sigue siendo desconocido.

En este estudio, identificamos TMED4 como un regulador clave del agotamiento de las células T CD8+ y la inmunidad antitumoral. Mostramos que la deleción de TMED4 mejora la función de las células T CD8+ y las células CAR T, mejorando su capacidad para resistir el agotamiento y eliminar los tumores. Mecánicamente, la deficiencia de Tmed4 activa IRE1α, lo que conduce a la autofagia inducida por el estrés del RE, que favorece las respuestas de las células T antitumorales. La eliminación de IRE1α (Ern1) o del regulador de la autofagia Beclin1 (Becn1) anula los beneficios antitumorales de la deficiencia de Tmed4, lo que confirma que el estrés del RE y la autofagia son vías clave que regulan la función de las células T. Además, las células CAR T deficientes en Tmed4 exhiben una mayor capacidad de eliminación de tumores y una reducción del agotamiento terminal tanto in vitro como in vivo. Por último, demostramos que el silenciamiento mediado por oligonucleótidos antisentido (ASO) de TMED4 mejora la capacidad antitumoral de las células T CD8+, lo que apoya su potencial como un objetivo terapéutico para mejorar las terapias con células CAR T en los tumores sólidos.

RESULTADOS

Tmed4 se correlaciona negativamente con la inmunidad antitumoral mediada por las células T

Para explorar el papel de los miembros de la familia TMED en la inmunidad adaptativa, primero analizamos los subconjuntos de células inmunitarias infiltrantes en tumores de conjuntos de datos de células individuales de cáncer colorrectal (CRC) (fig. S1, A y B) y encontramos una fuerte correlación negativa entre la expresión de TMED4 y la inmunidad mediada por las células T (fig. 1A). El análisis de los datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) reveló que la expresión de TMED4 era notablemente mayor en los tumores en comparación con los tejidos normales adyacentes en múltiples tipos de cáncer, incluido el carcinoma de células transicionales de la vejiga, el carcinoma invasivo de mama, el adenocarcinoma de colon, el glioblastoma multiforme, el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, el carcinoma hepatocelular de hígado, el adenocarcinoma de pulmón, el carcinoma de células escamosas de pulmón, el adenocarcinoma de páncreas, el adenocarcinoma de próstata, el adenocarcinoma de recto y el adenocarcinoma de estómago (fig. 1B). Dado que los subconjuntos de células T son fundamentales para la inmunidad adaptativa, examinamos más a fondo la expresión de TMED4 a nivel transcripcional y proteico en los subconjuntos de células T y encontramos que era mayor en las células T CD8+ que en las células T CD4+ (fig. 1, C y D).

Para evaluar el papel de TMED4 en la inmunidad antitumoral mediada por las células T CD8+ humanas, recogimos muestras de sangre y tumor de pacientes con cáncer colorrectal y de estómago. Observamos que la expresión de TMED4 era significativamente mayor en las células T CD8+ infiltrantes en el tumor [linfocitos infiltrantes en el tumor (TIL)] que en las células T CD8+ derivadas de la sangre (fig. 1E).

El análisis de la base de datos TCGA reveló que los niveles de expresión de TMED4 se correlacionaban negativamente con la fracción de TIL inmunes en todo el pánel (fig. 1F). Un análisis adicional de Tumor Immune Single-cell Hub 2 (TISCH2) mostró que el nivel de expresión de TMED4 en las células T CD8+ se correlacionaba negativamente con la infiltración de TIL CD8+ en múltiples cánceres (fig. 1G y fig. S1, C a F). Además, la baja expresión de TMED4 es más propicia para la respuesta al bloqueo de los puntos de control inmunitario (ICB) (fig. 1H), lo que probablemente se deba a la regulación del agotamiento de las células T CD8+. El análisis en múltiples conjuntos de datos reveló una correlación positiva entre la expresión de TMED4 y los marcadores de agotamiento establecidos (PDCD1, LAG3, HAVCR2, CTLA4, TOX y TIGIT) y la disfunción de las células T (^[35]) (fig. 1, I y J), lo que apoya que TMED4 regula positivamente el fenotipo de agotamiento. En conjunto, estos resultados demostraron que TMED4 se correlaciona negativamente con la inmunidad de las células T y se expresa en gran medida en las células T CD8+ infiltrantes en el tumor.

La deleción de Tmed4 mejora específicamente la función efectora de las células T CD8+

Para investigar el papel de TMED4 en la inmunidad mediada por las células T, cruzamos ratones Tmed4f/f con ratones CD4-Cre para generar ratones Tmed4f/fCD4-Cre (Tmed4ΔT) [designados como ratones de eliminación condicional (cKO)], en los que Tmed4 se eliminó específicamente en las células T (fig. S2, A y B). El análisis de citometría de flujo confirmó que la deleción de Tmed4 no afectó al desarrollo de las células T, ya que el número de células T CD4+, células T CD8+ y células T reguladoras (células Treg) (CD4+CD25+FOXP3+) en el timo no se alteró (fig. S2, C a I). Examinamos más a fondo la homeostasis de las células T en el bazo y los ganglios linfáticos periféricos. Los resultados mostraron que los ratones Tmed4ΔT contienen una mayor proporción y número de células T CD8+, mientras que solo tienen un mayor número de células CD4+ en los ganglios linfáticos (fig. S2, J a L). En contraste, la proporción y el número absoluto de células Treg (fig. S2, M a O), así como la intensidad media de fluorescencia de la expresión de FOXP3 en los ratones Tmed4ΔT, permanecieron sin cambios (fig. S2P). Para la activación de las células T, entre las células T CD4+, las proporciones de los subconjuntos efectores (CD44hiCD62Llo) y naïvos (CD44loCD62Lhi) fueron comparables entre los ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT, mientras que las células T CD8+ en los ratones Tmed4ΔT contenían un mayor porcentaje de células de memoria central (CD44hiCD62Lhi) (fig. 2, A y B). A continuación, examinamos el impacto de la deleción de Tmed4 en la secreción de citocinas proinflamatorias. Si bien la deficiencia de Tmed4 causó solo cambios menores en la frecuencia de las células T CD4+ TNF-α+, aumentó notablemente la frecuencia de las células T CD8+ IFN-γ+, TNF-α+ e IL-2+ (fig. 2D). Estos resultados de tinción intracelular se corroboraron mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA), que mostró que los niveles de IFN-γ e IL-2 permanecieron en gran medida sin cambios en las células T CD4+, pero se elevaron notablemente en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (fig. 2, E y F).

Las tasas de apoptosis, incluidas las etapas temprana (anexina V+PI−) y tardía (anexina V+PI+), fueron comparables entre los grupos (fig. 2G). Mientras tanto, las células T CD8+ deficientes en Tmed4 exhibieron una proliferación significativamente mayor en comparación con las células T CD8+ de tipo salvaje (WT) in vitro (fig. 2H). En conjunto, estos hallazgos indican que TMED4 suprime selectivamente la función efectora de las células T CD8+ y tiene solo un efecto limitado en las células T CD4+.

La pérdida de Tmed4 mejora la inmunidad antitumoral de las células T CD8+

Habiendo establecido que la deficiencia de Tmed4 mejora la activación, la proliferación y la función efectora de las células T CD8+, buscamos a continuación explorar su papel intrínseco en las células T CD8+. Con este fin, realizamos un análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) en células T CD8+ naïvas purificadas estimuladas con anticuerpos anti-CD3/CD28 durante 6 horas in vitro. El análisis transcriptómico reveló una regulación al alza significativa de los mediadores citotóxicos, así como de las quimiocinas y sus respectivos receptores en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (fig. 3, A a C).

Dado el papel fundamental de las células T CD8+ en la inmunidad antitumoral, investigamos si TMED4 regula el crecimiento tumoral a través de las células T CD8+. Las células de cáncer colorrectal MC38 implantadas subcutáneamente en ratones Tmed4ΔT mostraron tamaños tumorales significativamente reducidos y un período de supervivencia prolongado en comparación con los controles heterocigotos Tmed4f/f (Fig. 3, D y E, y Fig. S3A). Se observaron resultados similares en el modelo tumoral de melanoma B16F10 (Fig. 3, F y G, y Fig. S3B). Para abordar directamente los efectos antitumorales intrínsecos de CD8, realizamos experimentos de transferencia adoptiva utilizando subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ específicas para el antígeno. Estos experimentos demuestran que la inmunidad antitumoral mejorada inducida por la deficiencia de Tmed4 está impulsada específicamente por las células T CD8+, mientras que las células T CD4+ con deleción de Tmed4 (KO) no confieren ninguna ventaja sobre las células WT en el control de los tumores (Fig. S3, C a F). Analizamos además el microambiente tumoral en ratones con tumores MC38. Si bien la infiltración general de células inmunitarias CD45+ fue comparable entre los grupos de ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT (Fig. S3G), las células T CD8+ infiltrantes tumorales aumentaron significativamente en el grupo Tmed4ΔT (Fig. 3H y Fig. S3H). Además, la expresión de Ki67, un marcador de proliferación, se elevó en las células T CD8+ infiltrantes tumorales (Fig. 3I).

Para evaluar el impacto funcional de la deleción de Tmed4, analizamos el perfil efector de las células T CD8+ infiltrantes tumorales. Las frecuencias de células T CD8+ TIL IFN-γ+, TNF-α+ y granzima B+ aumentaron significativamente en los tumores de ratones Tmed4ΔT (Fig. 3J). Dado que las células T CD8+ citotóxicas son los principales mediadores de la lisis de las células tumorales, realizamos un ensayo de citotoxicidad in vivo para cuantificar la eliminación de células T CD8+ específicas para el antígeno. Al comparar los porcentajes de lisis específicos entre los grupos experimentales y los controles no inyectados, encontramos que la deleción de Tmed4 mejoró significativamente la citotoxicidad de las células T CD8+ específicas para el antígeno in vivo (Fig. 3, K y L). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la pérdida de Tmed4 mejora la inmunidad antitumoral de las células T CD8+ al promover la proliferación, la infiltración tumoral y la función efectora.

La deficiencia de Tmed4 altera el perfil de transcripción de las células T CD8+ y reduce el agotamiento terminal

Las células T CD8+ desempeñan un papel vital en las respuestas inmunitarias antitumorales en el microambiente tumoral. Para investigar el impacto de la deficiencia de Tmed4 en las células T CD8+, realizamos secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en las células T CD8+ infiltrantes tumorales aisladas de ratones con tumores MC38 Tmed4f/f y Tmed4ΔT utilizando la plataforma 10x Genomics. El agrupamiento no supervisado identificó seis poblaciones distintas de células T CD8+ en función de la expresión de genes característicos: células T CD8+ naïve (CD8Tn), células T CD8+ de memoria efectoras (CD8Tem), células T CD8+ estimuladas por el gen 15 (ISG15CD8T), células T CD8+ IFNG, células T CD8+ proliferativas (CD8Tprf) y células T CD8+ agotadas (CD8Tex) (Fig. 4, A y B). Las células T CD8+ deficientes en Tmed4_ exhibieron un perfil de transcripción alterado y una expresión diferencial de genes marcadores en comparación con las células T CD8+ WT (Fig. S4, A a E).

En comparación con los ratones WT, los ratones Tmed4ΔT tenían una proporción aumentada de células T CD8+ de memoria efectoras y un porcentaje reducido de células T CD8+ agotadas (Fig. 4, C y D). El análisis de la trayectoria de pseudotiempo reveló que las células T CD8+ naïve (CD8Tn) ocupaban las etapas de diferenciación temprana, mientras que las células T CD8+ agotadas (CD8Tex) y las células T CD8+ proliferativas (CD8Tprf) se ubicaban en estados terminales (Fig. 4E). En particular, la distribución de la densidad a lo largo del pseudotiempo mostró que las células T CD8+ de los ratones WT se ubicaban predominantemente en el estado de agotamiento terminal, mientras que las células T CD8+ deficientes en Tmed4 se distribuían de manera más uniforme a lo largo de la trayectoria, lo que indica una menor tendencia al agotamiento (Fig. 4F).

A pesar de un aumento general de las células T CD8+ TIL PD1+ en los ratones Tmed4ΔT (Fig. S5A), la proporción de células T CD8+ terminalmente agotadas (Texterm) PD1+TIM3+ se redujo significativamente, mientras que el subconjunto de células T CD8+ progenitoras agotadas (Texprog) PD1+TCF1+ se elevó en los ratones con tumores B16F10 Tmed4ΔT (Fig. 4G). Además, los niveles de expresión de los marcadores de agotamiento CTLA4 y CD39 fueron más bajos en las células T CD8+ TIL deficientes en Tmed4 (Fig. S5, B y C). Para validar aún más estos hallazgos, inducimos el agotamiento de las células T CD8+ in vitro. La estimulación con anticuerpo anti-CD3/CD28 (1 μg/ml) durante 7 días resultó en una disminución de la frecuencia de células Texterm PD1+TIM3+ en las células T CD8+ Tmed4ΔT (Fig. 4, H e I). En conjunto, estos datos sugieren que la deficiencia de TMED4 se asocia con la reducción de los subconjuntos de células T CD8+ terminalmente agotadas y la expansión de los subconjuntos de células T CD8+ progenitoras agotadas, lo que destaca su papel en la regulación del destino de las células T tanto in vivo como in vitro.

Tmed4 regula la inmunidad antitumoral de las células T CD8+ a través de IRE1α

Dado el papel fundamental de las proteínas TMED en los procesos biológicos asociados con el estrés del RE (^[36], ^[37]), analizamos la relación entre los miembros de la familia TMED (TMED1 a TMED10) y el estrés del RE e identificamos TMED4 como un regulador clave (Fig. S6A). Para determinar cómo Tmed4 influye en las respuestas de estrés del RE en las células T CD8+, realizamos secuenciación de ARN, que reveló la regulación al alza de los genes relacionados con el estrés del RE en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (Fig. 5A). El inmunoblotting confirmó que p-IRE1α, un indicador de la activación de IRE1α, y su objetivo aguas abajo, XBP1 empalmado (XBP1s), se elevaron significativamente en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (Fig. 5B). De manera consistente, la supresión de TMED4 en las células Jurkat (Fig. 5C) y las células T derivadas de humanos (Fig. 5D) también resultó en un aumento de la expresión de p-IRE1α.

Para determinar si TMED4 regula la inmunidad antitumoral de las células T CD8+ a través de IRE1α, generamos ratones de doble deleción Tmed4Ern1ΔT mediante el cruce de ratones Ern1f/f y Tmed4ΔT. Los tumores MC38 se implantaron subcutáneamente en ratones Tmed4f/f, Tmed4ΔT y Tmed4Ern1ΔT, y la curva de crecimiento tumoral mostró que la deleción de Ern1 en las células T atenuó el efecto antitumoral mejorado de los ratones Tmed4 ΔT (Fig. 5E). De manera similar, la proliferación de las células T CD8+ en los ratones Tmed4Ern1ΔT se restableció a los niveles WT (Fig. 5F). Un análisis funcional adicional de las células T CD8+ TIL mostró que los niveles de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y granzima B volvieron a los niveles WT en los ratones Tmed4Ern1ΔT (Fig. 5, G y H, y Fig. S6, B a E), lo que se corroboró aún más mediante la cuantificación de IL-2 mediante ELISA in vitro (Fig. S6F). Además, la deleción de IRE1α restauró la proporción de células T CD8+ terminalmente agotadas (PD1+TIM3+), que se redujo en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 in vitro (Fig. 5I y Fig. S6G). En conjunto, estos hallazgos demuestran que TMED4 regula la capacidad antitumoral de las células T CD8+ a través de la señalización de IRE1α.

La pérdida de Tmed4 activa la autofagia a través de IRE1α

Existe una gran cantidad de evidencia que sugiere que el eje IRE1α-XBP1 promueve el agotamiento de las células T, suprimiendo así la inmunidad antitumoral (^[13], ^[14]). Nuestros datos mostraron que la deleción de Tmed4 en las células T mejoró la inmunidad antitumoral al tiempo que aumentaba la activación de IRE1α-XBP1. Por lo tanto, razonamos que la pérdida de Tmed4 podría activar una vía de señalización compensatoria para contrarrestar la activación de IRE1α-XBP1. Entre las vías inducidas por el estrés del RE, la autofagia desempeña un papel crucial en la promoción de la inmunidad antitumoral (^[25]). Luego, buscamos investigar la interacción entre TMED4, IRE1α y la autofagia en las células T CD8+. El análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) de los datos de secuenciación de ARN de las células T CD8+ reveló la regulación al alza de las vías relacionadas con la autofagia en paralelo con la activación del estrés del RE en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (Fig. 6A). Además, LC3B-II, la forma de fosfatidiletanolamina conjugada de LC3B (también conocida como Maplc3b), un marcador clave de la autofagia, se elevó en las células T CD8+ TIL deficientes en Tmed4 (Fig. 6B), las células Jurkat (Fig. 6C), las células primarias de ratón (Fig. 6D) y las células T CD8+ derivadas de humanos (Fig. 6E). Para diseccionar aún más el papel de TMED4 en la regulación de la autofagia, tratamos las células con rapamicina, un inductor de la autofagia, y bafilomicina A1, un inhibidor de la autofagia en etapa tardía. Al bloquear la fusión de los autolisosomas, la diferencia en la autofagia entre las células WT y las células Tmed4-KO desapareció, lo que sugiere que TMED4 participa en la regulación de la autofagia en etapa tardía (Fig. 6F).

Para determinar si TMED4 regula la inmunidad antitumoral mediada por las células T a través de la autofagia, nos centramos en Beclin 1, una subunidad central del complejo PI3K de clase III que inicia la formación de autolisosomas, un proceso esencial para la inducción de la autofagia en los mamíferos (^[38]). Generamos ratones de doble deleción Tmed4Becn1ΔT mediante el cruce de ratones Becn1f/f y Tmed4ΔT. Tras la implantación de células tumorales MC38, el crecimiento tumoral y el peso tumoral en los ratones de doble deleción Tmed4Becn1ΔT fueron similares a los de los ratones Tmed4f/f, lo que indica que TMED4 regula la inmunidad antitumoral mediada por las células T a través de Beclin 1 (Fig. 6, G y H). El nivel de citocinas inflamatorias IFN-γ, TNF-α y granzima B también volvió a los niveles WT en los ratones Tmed4Becn1ΔT (Fig. 6, I a K, y Fig. S7, A a D).

Por último, examinamos si el aumento de la autofagia en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 fue mediado por IRE1α. En comparación con las células T CD8+ deficientes en Tmed4, las células T CD8+ de doble deleción Tmed4-Ern1 exhibieron una reducción significativa de los niveles de LC3B-II (Fig. 6L), lo que confirmó que el aumento de la autofagia observado en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 dependía del estrés del RE impulsado por IRE1α.

El direccionamiento de Tmed4 aumenta la función antitumoral de las células T CAR y CD8+

La terapia con células T CAR es un pilar revolucionario del tratamiento del cáncer (^[1]). Dado que la deleción de Tmed4 mejora significativamente la inmunidad antitumoral, hipotetizamos que la reducción de la expresión de Tmed4 podría mejorar la eficacia de las células T CAR. Claudin18.2 (CLDN18.2), una proteína de unión estrecha que se expresa principalmente en la mucosa gástrica y que se sobreexpresa de forma aberrante en varios tumores sólidos, incluidos los cánceres gástrico, pancreático y esofágico, ha surgido como un prometedor antígeno diana para las células T CAR. De manera similar, el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), una tirosina quinasa receptora sobreexpresada en los cánceres de mama, estómago, pulmón y páncreas, es un antígeno bien establecido para la terapia con células T CAR. Por lo tanto, construimos un CAR de segunda generación que se dirige a CLDN18.2, que incluye 8E5 scFv, Myc-tag, dominio de bisagra y transmembrana CD8α, 4-1BB (CD137) y CD3ζ, y un CAR de tercera generación que se dirige a HER2, que incluye 4D5 scFv, dominio de bisagra y transmembrana CD28, CD28, 4-1BB y CD3ζ (Fig. S8A y Fig. S9A).

Para evaluar el impacto de la deleción de Tmed4 en la función de las células T CAR, las células tumorales MC38 y B16F10 se transfectaron para expresar CLDN18.2 o HER2 (Fig. S8B y Fig. S9B). Los esplenocitos derivados de ratones Tmed4f/f o Tmed4ΔT se transfectaron con constructos CAR que se dirigían a CLDN18.2 o HER2, respectivamente (Fig. S8C y Fig. S9C). Primero, examinamos la función de las células T CAR CLDN18.2 in vitro. Tres días después de la transfección, las células T CAR deficientes en Tmed4 exhibieron una producción significativamente mayor de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y granzima B en comparación con las células T CAR WT (Fig. S8, D y E). Para evaluar el agotamiento de las células T CAR, las células T CAR CLDN18.2 se cocultivaron con células MC38-CLDN18.2 o B16F10-CLDN18.2 a relaciones efector:diána (E:T) de 1:1, 2:1, 4:1 y 8:1 durante 24 horas. La proporción de células T CAR terminalmente agotadas (PD1+TIM3+) se redujo significativamente en el grupo deficiente en Tmed4 (Fig. S8, F a H). Además, las células T CAR deficientes en Tmed4 demostraron una mayor citotoxicidad contra las células diana MC38-CLDN18.2 y B16F10-CLDN18.2 in vitro (Fig. S8, I y J). Se obtuvieron resultados consistentes con las células T CAR HER2 (Fig. S9, D y E).

Para validar estos hallazgos in vivo, utilizamos múltiples modelos tumorales. Se inocularon ratones WT por vía subcutánea con tumores MC38 o B16F10 que expresaban CLDN18.2 y, posteriormente, se trataron con células CAR T Tmed4-deficientes o WT mediante inyección intravenosa. El crecimiento tumoral se suprimió significativamente en los ratones que recibieron células CAR T Tmed4-deficientes, lo que condujo a una prolongación de la supervivencia (Fig. 7, A a F). Se observaron resultados similares en los modelos tumorales tratados con células CAR T HER2 (Fig. 7, G a L). Estos hallazgos indican que la deleción de Tmed4 mejora la eficacia de las células CAR T, lo que destaca a TMED4 como un posible objetivo inmunoterapéutico.

Para explorar aún más la viabilidad de modular farmacológicamente Tmed4 en las células T CD8+, silenciamos la expresión de Tmed4 en las células T CD8+ OT-I previamente estimuladas utilizando un ASO modificado con 2′-O-metoxietilo (2′-MOE). En comparación con el ASO-Control, el tratamiento con ASO-Tmed4 redujo significativamente la expresión de TMED4 (fig. S9F). Tras la transferencia adoptiva en ratones con tumores MC38, las células T OT-I tratadas con ASO-Tmed4 exhibieron un control tumoral superior, lo que resultó en una reducción significativa de la carga tumoral en comparación con el grupo ASO-Control (Fig. 8, A a C). Se obtuvieron los mismos resultados en las células CAR T tratadas con ASO (Fig. 8, D a F y fig. S9G). Para explorar una posible sinergia con la inmunoterapia, combinamos la depleción de Tmed4 con el tratamiento anti-PD1. La combinación produjo un robusto efecto sinérgico, lo que resultó en la supresión tumoral más potente observada (Fig. 8, G y H). Estos resultados sugieren que la inhibición farmacológica de TMED4 podría ser una estrategia viable para mejorar las inmunoterapias basadas en células T.

Tmed4 se correlaciona negativamente con la inmunidad antitumoral mediada por células T

Para explorar el papel de los miembros de la familia TMED en la inmunidad adaptativa, primero analizamos los subconjuntos de células inmunitarias infiltrantes tumorales de conjuntos de datos de células individuales de cáncer colorrectal (CRC) (fig. S1, A y B) y encontramos una fuerte correlación negativa entre la expresión de TMED4 y la inmunidad mediada por células T (Fig. 1A). El análisis de los datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) reveló que la expresión de TMED4 era notablemente mayor en los tumores en comparación con los tejidos normales adyacentes en múltiples tipos de cáncer, incluido el carcinoma urotelial de la vejiga, el carcinoma invasivo de mama, el adenocarcinoma de colon, el glioblastoma multiforme, el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, el carcinoma hepatocelular de hígado, el adenocarcinoma de pulmón, el carcinoma de células escamosas de pulmón, el adenocarcinoma de páncreas, el adenocarcinoma de próstata, el adenocarcinoma de recto y el adenocarcinoma de estómago (Fig. 1B). Dado que los subconjuntos de células T son fundamentales para la inmunidad adaptativa, examinamos más a fondo la expresión de TMED4 a nivel transcripcional y proteico en los subconjuntos de células T y encontramos que era mayor en las células T CD8+ que en las células T CD4+ (Fig. 1, C y D).

Para evaluar el papel de TMED4 en la inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+ humanas, recolectamos muestras de sangre y tumor de pacientes con cáncer colorrectal y de estómago. Observamos que la expresión de TMED4 era significativamente mayor en las células T CD8+ infiltrantes tumorales [linfocitos infiltrantes tumorales (TIL)] que en las células T CD8+ derivadas de la sangre (Fig. 1E).

El análisis de la base de datos TCGA reveló que los niveles de expresión de TMED4 se correlacionaban negativamente con la fracción de TIL inmunes en todo el pánel (Fig. 1F). Un análisis más profundo de Tumor Immune Single-cell Hub 2 (TISCH2) mostró que el nivel de expresión de TMED4 en las células T CD8+ se correlacionaba negativamente con la infiltración de TIL CD8+ en múltiples cánceres (Fig. 1G y fig. S1, C a F). Además, la baja expresión de TMED4 es más propicia para la respuesta al bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB) (Fig. 1H), lo que probablemente se deba a la regulación del agotamiento de las células T CD8+. El análisis en múltiples conjuntos de datos reveló una correlación positiva entre la expresión de TMED4 y los marcadores de agotamiento establecidos (PDCD1, LAG3, HAVCR2, CTLA4, TOX y TIGIT) y la disfunción de las células T (^[35]) (Fig. 1, I y J), lo que apoya que TMED4 regula positivamente el fenotipo de agotamiento. En conjunto, estos resultados demostraron que TMED4 se correlaciona negativamente con la inmunidad de las células T y se expresa en gran medida en los TIL CD8+.

La depleción de Tmed4 mejora específicamente la función efectora de las células T CD8+

Para investigar el papel de TMED4 en la inmunidad mediada por células T, cruzamos ratones Tmed4f/f con ratones CD4-Cre para generar ratones Tmed4f/fCD4-Cre (Tmed4ΔT) [designados como knockout condicional (cKO)], en los que Tmed4 se eliminó específicamente en las células T (fig. S2, A y B). El análisis de citometría de flujo confirmó que la deleción de Tmed4 no afectó el desarrollo de las células T, ya que el número de células T CD4+, células T CD8+ y células T reguladoras (Treg) (CD4+CD25+FOXP3+) en el timo no se alteró (fig. S2, C a I). Examinamos más a fondo la homeostasis de las células T en el bazo y los ganglios linfáticos periféricos. Los resultados mostraron que los ratones Tmed4ΔT contienen una mayor proporción y número de células T CD8+, mientras que solo tienen un mayor número de células CD4+ en los ganglios linfáticos (fig. S2, J a L). En contraste, la proporción y el número absoluto de células T reguladoras (fig. S2, M a O), así como la intensidad media de fluorescencia de la expresión de FOXP3 en los ratones Tmed4ΔT, permanecieron sin cambios (fig. S2P). Para la activación de las células T, entre las células T CD4+, las proporciones de los subconjuntos efectores (CD44hiCD62Llo) y naïvos (CD44loCD62Lhi) fueron comparables entre los ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT, mientras que las células T CD8+ en los ratones Tmed4ΔT contenían un mayor porcentaje de células de memoria central (CD44hiCD62Lhi) (Fig. 2, A y B). A continuación, examinamos el impacto de la depleción de Tmed4 en la secreción de citocinas proinflamatorias. Si bien la deficiencia de Tmed4 causó solo cambios menores en la frecuencia de las células T CD4+ TNF-α+, aumentó notablemente la frecuencia de las células T CD8+ IFN-γ+, TNF-α+ e IL-2+ (Fig. 2D). Estos resultados de tinción intracelular fueron corroborados por el ensayo inmunoenzimático (ELISA), que mostró que los niveles de IFN-γ e IL-2 permanecieron en gran medida sin cambios en las células T CD4+, pero se elevaron notablemente en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (Fig. 2, E y F).

Las tasas de apoptosis, incluidas las etapas temprana (annexina V+PI−) y tardía (annexina V+PI+), fueron comparables entre los grupos (Fig. 2G). Mientras tanto, las células T CD8+ deficientes en Tmed4 exhibieron una proliferación significativamente mayor en comparación con las células T CD8+ de tipo salvaje (WT) in vitro (Fig. 2H). En conjunto, estos hallazgos indican que TMED4 suprime selectivamente la función efectora de las células T CD8+ y tiene solo un efecto limitado en las células T CD4+.

La pérdida de Tmed4 mejora la inmunidad antitumoral mediada por células T CD8+

Habiendo establecido que la deficiencia de Tmed4 mejora la activación, la proliferación y la función efectora de las células T CD8+, a continuación, buscamos explorar su papel intrínseco en las células T CD8+. Con este fin, realizamos un análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) en células T CD8+ naïvas purificadas estimuladas con anticuerpos anti-CD3/CD28 durante 6 horas in vitro. El análisis transcriptómico reveló una regulación al alza significativa de los mediadores citotóxicos, así como de las quimiocinas y sus respectivos receptores en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (Fig. 3, A a C).

Dado el papel fundamental de las células T CD8+ en la inmunidad antitumoral, investigamos si TMED4 regula el crecimiento tumoral a través de las células T CD8+. Las células de cáncer colorrectal MC38 implantadas por vía subcutánea en ratones Tmed4ΔT exhibieron tamaños tumorales significativamente reducidos y un período de supervivencia prolongado en comparación con los controles de camada Tmed4f/f (Fig. 3, D y E, y fig. S3A). Se observaron resultados similares en el modelo tumoral de melanoma B16F10 (Fig. 3, F y G, y fig. S3B). Para abordar directamente los efectos antitumorales intrínsecos de CD8, realizamos experimentos de transferencia adoptiva utilizando subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ específicas para el antígeno. Estos experimentos demostraron que la inmunidad antitumoral mejorada inducida por la deficiencia de Tmed4 es impulsada específicamente por las células T CD8+, mientras que las células T CD4+ con Tmed4–knockout (KO) no conferían ninguna ventaja sobre las células WT en el control de los tumores (fig. S3, C a F). Analizamos más a fondo el microambiente tumoral en ratones con tumores MC38. Si bien la infiltración general de células inmunitarias CD45+ fue comparable entre los grupos de ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT (fig. S3G), las células T CD8+ infiltrantes tumorales aumentaron significativamente en el grupo Tmed4ΔT (Fig. 3H y fig. S3H). Además, la expresión de Ki67, un marcador de proliferación, aumentó en las células T CD8+ infiltrantes tumorales (Fig. 3I).

Para evaluar el impacto funcional de la deleción de Tmed4, analizamos el perfil efector de las células T CD8+ infiltrantes tumorales. Las frecuencias de células T CD8+ IFN-γ+, TNF-α+ y granzima B+ TIL fueron significativamente mayores en los tumores de los ratones Tmed4ΔT (Fig. 3J). Dado que las células T CD8+ citotóxicas son los principales mediadores de la lisis de las células tumorales, realizamos un ensayo de citotoxicidad in vivo para cuantificar la muerte de las células T CD8+ específicas para el antígeno. Al comparar los porcentajes de lisis específicas entre los grupos experimentales y los controles naïvos no inyectados, encontramos que la deleción de Tmed4 mejoró significativamente la citotoxicidad de las células T CD8+ específicas para el antígeno in vivo (Fig. 3, K y L). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la pérdida de Tmed4 mejora la inmunidad antitumoral de las células T CD8+ al promover la proliferación, la infiltración tumoral y la función efectora.

La deficiencia de Tmed4 altera el perfil de transcripción de las células T CD8+ y reduce el agotamiento terminal

Las células T CD8+ desempeñan un papel vital en las respuestas inmunitarias antitumorales en el microambiente tumoral. Para investigar el impacto de la deficiencia de Tmed4 en las células T CD8+, realizamos una secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) en las células T CD8+ infiltrantes tumorales aisladas de ratones con tumores MC38 Tmed4f/f y Tmed4ΔT utilizando la plataforma 10x Genomics. El agrupamiento no supervisado identificó seis poblaciones distintas de células T CD8+ en función de la expresión de genes característicos: células T CD8+ naïvas (CD8Tn), células T CD8+ de memoria efectoras (CD8Tem), células T CD8+ estimuladas por el gen 15 (ISG15CD8T), células T CD8+ IFNG, células T CD8+ proliferativas (CD8Tprf) y células T CD8+ agotadas (CD8Tex) (Fig. 4, A y B). Las células T CD8+ deficientes en Tmed4_ exhibieron un perfil de transcripción alterado y una expresión diferencial de los genes marcadores en comparación con las células T CD8+ WT (fig. S4, A a E).

En comparación con los ratones WT, los ratones Tmed4ΔT tenían una mayor proporción de células T CD8+ de memoria efectoras y un porcentaje reducido de células T CD8+ agotadas (Fig. 4, C y D). El análisis de la trayectoria de pseudotiempo reveló que las células T CD8+ naïvas (CD8Tn) ocupaban las etapas de diferenciación temprana, mientras que las células T CD8+ agotadas (CD8Tex) y las células T CD8+ proliferativas (CD8Tprf) se ubicaron en los estados terminales (Fig. 4E). En particular, la distribución de la densidad a lo largo del pseudotiempo mostró que las células T CD8+ de los ratones WT se ubicaron predominantemente en el estado de agotamiento terminal, mientras que las células T CD8+ deficientes en Tmed4 se distribuyeron de manera más uniforme a lo largo de la trayectoria, lo que indica una menor tendencia al agotamiento (Fig. 4F).

A pesar de un aumento general de las células T CD8+ PD1+ TIL en los ratones Tmed4ΔT (fig. S5A), la proporción de células T CD8+ PD1+TIM3+ agotadas terminales (Texterm) se redujo significativamente, mientras que el subconjunto de células T CD8+ progenitoras agotadas (Texprog) PD1+TCF1+ aumentó en los ratones con tumores B16F10 Tmed4ΔT (Fig. 4G). Además, los niveles de expresión de los marcadores de agotamiento CTLA4 y CD39 fueron más bajos en las células T CD8+ TIL deficientes en Tmed4 (fig. S5, B y C). Para validar aún más estos hallazgos, inducimos el agotamiento de las células T CD8+ in vitro. La estimulación con anticuerpo anti-CD3/CD28 (1 μg/ml) durante 7 días resultó en una disminución de la frecuencia de las células T CD8+ Texterm PD1+TIM3+ en las células T CD8+ Tmed4ΔT (Fig. 4, H y I). En conjunto, estos datos sugieren que la deficiencia de TMED4 se asocia con la reducción de los subconjuntos de células T CD8+ agotadas terminales y la expansión de los subconjuntos de células T CD8+ progenitoras agotadas, lo que destaca su papel en la regulación del destino de las células T tanto in vivo como in vitro.

La deficiencia de Tmed4 regula la inmunidad antitumoral de las células T CD8+ a través de IRE1α

Dada el papel fundamental de las proteínas TMED en los procesos biológicos asociados con el estrés del RE (^[36], ^[37]), analizamos la relación entre los miembros de la familia TMED (TMED1 a TMED10) y el estrés del RE, e identificamos TMED4 como un regulador clave (fig. S6A). Para determinar cómo Tmed4 influye en las respuestas al estrés del RE en las células T CD8+, realizamos un análisis de ARN-seq, que reveló una mayor expresión de los genes relacionados con el estrés del RE en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (fig. 5A). El inmunoblotting confirmó que p-IRE1α, un indicador de la activación de IRE1α, y su diana aguas abajo, XBP1 empalmado (XBP1s), estaban significativamente elevados en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (fig. 5B). De manera consistente, la inhibición de TMED4 en las células Jurkat (fig. 5C) y en las células T derivadas de humanos (fig. 5D) también resultó en un aumento de la expresión de p-IRE1α.

Para determinar si TMED4 regula la inmunidad antitumoral de las células T CD8+ a través de IRE1α, generamos ratones doblemente deficientes en Tmed4Ern1ΔT mediante el cruce de ratones Ern1f/f y Tmed4ΔT. Se implantaron tumores MC38 de forma subcutánea en ratones Tmed4f/f, Tmed4ΔT y Tmed4Ern1ΔT, y la curva de crecimiento tumoral mostró que la deleción de Ern1 en las células T atenuó el efecto antitumoral mejorado de los ratones Tmed4 ΔT (fig. 5E). De manera similar, la proliferación de las células T CD8+ en los ratones Tmed4Ern1ΔT se restauró a los niveles de WT (fig. 5F). Un análisis funcional adicional de las células T infiltrantes (TIL) CD8+ mostró que los niveles de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y granzima B volvieron a los niveles de WT en los ratones Tmed4Ern1ΔT (fig. 5, G y H, y fig. S6, B a E), lo que se corroboró aún más mediante la cuantificación de IL-2 mediante ELISA in vitro (fig. S6F). Además, la deleción de IRE1α restauró la proporción de células T CD8+ terminalmente exhaustas (PD1+TIM3+), que se redujo en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 in vitro (fig. 5I y fig. S6G). En conjunto, estos hallazgos demuestran que TMED4 regula la capacidad antitumoral de las células T CD8+ a través de la señalización de IRE1α.

La pérdida de Tmed4 activa la autofagia a través de IRE1α

Existe una gran cantidad de evidencia que sugiere que el eje IRE1α-XBP1 promueve el agotamiento de las células T, suprimiendo así la inmunidad antitumoral (^[13], ^[14]). Nuestros datos mostraron que la depleción de Tmed4 en las células T mejoró la inmunidad antitumoral al tiempo que aumentaba la activación de IRE1α-XBP1. Por lo tanto, razonamos que la pérdida de Tmed4 podría activar una vía de señalización compensatoria para contrarrestar la activación de IRE1α-XBP1. Entre las vías inducidas por el estrés del RE, la autofagia desempeña un papel crucial en la promoción de la inmunidad antitumoral (^[25]). Luego, buscamos investigar la interacción entre TMED4, IRE1α y la autofagia en las células T CD8+. El análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) de los datos de ARN-seq de las células T CD8+ reveló una mayor expresión de las vías relacionadas con la autofagia en paralelo con la activación del estrés del RE en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 (fig. 6A). Además, LC3B-II, la forma de fosfatidiletanolamina conjugada de LC3B (también conocida como Maplc3b), un marcador clave de la autofagia, se elevó en las células T infiltrantes (TIL) CD8+ deficientes en Tmed4 (fig. 6B), en las células Jurkat (fig. 6C), en las células primarias de ratón (fig. 6D) y en las células T CD8+ activadas derivadas de humanos (fig. 6E). Para analizar más a fondo el papel de TMED4 en la regulación de la autofagia, tratamos las células con rapamicina, un inductor de la autofagia, y bafilomicina A1, un inhibidor de la autofagia en etapa tardía. Tras bloquear la fusión de los autofagosomas y los lisosomas, la diferencia en la autofagia entre las células WT y las células Tmed4-KO desapareció, lo que sugiere que TMED4 participa en la regulación de la autofagia en etapa tardía (fig. 6F).

Para determinar si TMED4 regula la inmunidad antitumoral mediada por las células T a través de la autofagia, nos centramos en Beclin 1, una subunidad central del complejo PI3K de clase III que inicia la formación de autofagosomas, un proceso esencial para la inducción de la autofagia en los mamíferos (^[38]). Generamos ratones doblemente deficientes en Tmed4Becn1ΔT mediante el cruce de ratones Becn1f/f y Tmed4ΔT. Tras la implantación de células tumorales MC38, el crecimiento tumoral y el peso tumoral en los ratones doblemente deficientes en Tmed4Becn1ΔT fueron similares a los de los ratones Tmed4f/f, lo que indica que TMED4 regula la inmunidad antitumoral mediada por las células T a través de Beclin 1 (fig. 6, G y H). El nivel de citocinas inflamatorias IFN-γ, TNF-α y granzima B también volvió a los niveles de WT en los ratones Tmed4Becn1ΔT (fig. 6, I a K, y fig. S7, A a D).

Por último, examinamos si el aumento de la autofagia en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 fue mediado por IRE1α. En comparación con las células T CD8+ deficientes en Tmed4, las células T CD8+ doblemente deficientes en Tmed4-Ern1 exhibieron una reducción significativa en los niveles de LC3B-II (fig. 6L), lo que confirmó que el aumento de la autofagia observado en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 dependía del estrés del RE impulsado por IRE1α.

La focalización de Tmed4 aumenta la eficacia de las células CAR T y la función antitumoral de las células T CD8+

La terapia con células CAR T es un pilar revolucionario del tratamiento del cáncer (^[1]). Dado que la deleción de Tmed4 mejora significativamente la inmunidad antitumoral, hipotetizamos que la reducción de la expresión de Tmed4 podría mejorar la eficacia de las células CAR T. Claudin18.2 (CLDN18.2), una proteína de unión estrecha que se expresa principalmente en la mucosa gástrica y que se sobreexpresa de forma aberrante en varios tumores sólidos, incluidos los tumores gástricos, pancreáticos y esofágicos, ha surgido como un prometedor antígeno diana para la terapia con células CAR T. De manera similar, el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), una tirosina quinasa receptora que se sobreexpresa en los cánceres de mama, estómago, pulmón y páncreas, es un antígeno bien establecido para la terapia con células CAR T. Por lo tanto, construimos una célula CAR de segunda generación que se dirige a CLDN18.2, que incluye 8E5 scFv, Myc-tag, dominio de bisagra y transmembrana CD8α, 4-1BB (CD137) y CD3ζ, y una célula CAR de tercera generación que se dirige a HER2, que incluye 4D5 scFv, dominio de bisagra y transmembrana CD28, CD28, 4-1BB y CD3ζ (figs. S8A y S9A).

Para evaluar el impacto de la deleción de Tmed4 en la función de las células CAR T, las células tumorales MC38 y B16F10 se transfectaron para expresar CLDN18.2 o HER2 (figs. S8B y S9B). Los esplenocitos derivados de ratones Tmed4f/f o Tmed4ΔT se transfectaron con constructos CAR que se dirigían a CLDN18.2 o HER2, respectivamente (figs. S8C y S9C). Primero, examinamos la función de las células CAR CLDN18.2 in vitro. Tres días después de la transfección, las células CAR deficientes en Tmed4 exhibieron una producción significativamente mayor de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y granzima B en comparación con las células CAR WT (fig. S8, D y E). Para evaluar el agotamiento de las células CAR T, las células CAR CLDN18.2 se cocultivaron con células MC38-CLDN18.2 o B16F10-CLDN18.2 a relaciones efector:diána (E:T) de 1:1, 2:1, 4:1 y 8:1 durante 24 horas. La proporción de células CAR T terminalmente exhaustas (PD1+TIM3+) se redujo significativamente en el grupo deficiente en Tmed4 (fig. S8, F a H). Además, las células CAR deficientes en Tmed4 demostraron una mayor citotoxicidad contra las células diana MC38-CLDN18.2 y B16F10-CLDN18.2 in vitro (fig. S8, I y J). Se obtuvieron resultados consistentes con las células CAR HER2 (fig. S9, D y E).

Para validar estos hallazgos in vivo, utilizamos múltiples modelos tumorales. Se inocularon ratones WT de forma subcutánea con tumores MC38 o B16F10 que expresaban CLDN18.2 y posteriormente se trataron con células CAR CLDN18.2 WT o deficientes en Tmed4 mediante inyección intravenosa. El crecimiento tumoral se suprimió significativamente en los ratones que recibieron células CAR deficientes en Tmed4, lo que condujo a una prolongación de la supervivencia (fig. 7, A a F). Se observaron resultados similares en los modelos tumorales tratados con células CAR HER2 (fig. 7, G a L). Estos hallazgos indican que la deleción de Tmed4 mejora la eficacia de las células CAR T, lo que destaca a TMED4 como una posible diana inmunoterapéutica.

Para explorar más a fondo la viabilidad de modular farmacológicamente Tmed4 en las células T CD8+, silenciamos la expresión de Tmed4 en las células T CD8+ OT-I cebadas utilizando un ASO modificado con 2′-O-metoxietilo (2′-MOE). En comparación con el ASO-Control, el tratamiento con ASO-Tmed4 redujo significativamente la expresión de TMED4 (fig. S9F). Tras la transferencia adoptiva en ratones con tumores MC38, las células T OT-I tratadas con ASO-Tmed4 exhibieron un control tumoral superior, lo que resultó en una reducción significativa de la carga tumoral en comparación con el grupo ASO-Control (fig. 8, A a C). Se obtuvieron los mismos resultados en las células CAR tratadas con ASO (fig. 8, D a F, y fig. S9G). Para explorar una posible sinergia con la inmunoterapia, combinamos la depleción de Tmed4 con el tratamiento anti-PD1. La combinación produjo un robusto efecto sinérgico, lo que resultó en la supresión tumoral más fuerte observada (fig. 8, G y H). Estos resultados sugieren que la inhibición farmacológica de TMED4 podría ser una estrategia viable para mejorar las inmunoterapias basadas en células T.

DISCUSIÓN

El agotamiento de las células T CD8+ en el microambiente tumoral es una barrera crítica para una inmunidad antitumoral eficaz, lo que contribuye a la progresión tumoral y la evasión inmunitaria. Este fenómeno también es un desafío importante en la terapia con células CAR T, donde el agotamiento limita la persistencia y la funcionalidad de las células adoptivamente transferidas, lo que en última instancia conduce al fracaso de la terapia. Si bien se han implicado numerosos reguladores transcripcionales y epigenéticos en el agotamiento de las células T, las estrategias terapéuticas eficaces para contrarrestar este proceso siguen siendo esquivas. Un estudio reciente identificó las proteínas TMED, en particular TMED2, TMED9 y TMED10, como reguladores de la expresión de PD1 y la disfunción de las células T (^[39]). En este estudio, identificamos Tmed4, un gen de respuesta al estrés del RE, como un regulador previamente no reconocido del agotamiento de las células T. Demostramos que la deleción de Tmed4 mejora la inmunidad antitumoral al modular el estrés del RE y promover la autofagia. Además, la reducción de la expresión de Tmed4 mitiga el agotamiento de las células CAR T, mejorando así su eficacia terapéutica contra los tumores sólidos.

El microambiente tumoral impone importantes desafíos metabólicos y relacionados con el estrés a las células inmunitarias infiltrantes debido a la hipoxia, el bajo pH y la privación de nutrientes (^[40]). En respuesta a estas condiciones hostiles, se activa el estrés del RE y la UPR, lo que permite que las células tumorales se adapten y proliferen al tiempo que suprimen la inmunidad antitumoral. Se ha documentado bien que los tumores explotan la UPR para reclutar células supresoras derivadas de la médula ósea y alterar la función de las células T efectoras, facilitando así la evasión inmunitaria. Más allá de la regulación indirecta a través de las células tumorales, el microambiente tumoral también puede ejercer efectos directos sobre las células T infiltrantes al alterar la homeostasis metabólica y provocar una disfunción mitocondrial (^[40]). Por ejemplo, en el cáncer de ovario, los factores solubles derivados del microambiente tumoral inhiben la expresión de GLUT1 e inducen un empalme robusto de XBP1 en las células T, lo que altera la captación de glucosa y la aptitud metabólica (^[14]). De manera similar, se ha informado que los altos niveles de colesterol impulsan el agotamiento mediado por XBP1s en las células T CD8+ (^[13]).

En contraste con los estudios anteriores que vincularon la activación del eje IRE1α-XBP1 con la disfunción de las células T CD8+, encontramos que la deficiencia de Tmed4, a pesar de aumentar la expresión del eje IRE1α-XBP1, paradójicamente mejora la función efectora y mitiga el agotamiento. Esta aparente contradicción puede explicarse por varios factores. Primero, el impacto de la UPR en la supervivencia celular frente a la disfunción es dependiente del contexto y está dictado en gran medida por la gravedad y la duración del estrés del RE. Si bien el estrés del RE crónico y grave en condiciones de privación de nutrientes e hipoxia puede provocar un colapso metabólico y un deterioro funcional en las células T, la activación moderada del estrés del RE observada en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 puede, en cambio, proporcionar un efecto estabilizador, preservando la integridad metabólica y mejorando la función antitumoral. En segundo lugar, encontramos que la activación del eje IRE1α-XBP1s inducida por la deleción de Tmed4 se acompaña de un aumento del flujo de autofagia, lo que puede servir como un mecanismo compensatorio para mitigar el agotamiento y mantener la función efectora.

La autofagia es un proceso celular fundamental que mantiene la homeostasis mediante la degradación de orgánulos dañados y el reciclaje de componentes intracelulares. El estrés del retículo endoplásmico y la autofagia están intrínsecamente relacionados, y la autofagia actúa como un mecanismo protector para aliviar el estrés del retículo endoplásmico mediante la eliminación de proteínas mal plegadas. Sin embargo, el exceso de autofagia también puede exacerbar las respuestas al estrés y promover la muerte celular. En las células T, la autofagia es necesaria para mantener la aptitud celular, particularmente en condiciones de activación crónica (^[20], ^[22], ^[24], ^[25]). Se ha demostrado que la autofagia se induce tras la estimulación del TCR y de las citocinas, mientras que el bloqueo genético o farmacológico de la autofagia conduce a una supervivencia defectuosa de las células T y a una alteración de la formación de la memoria (^[24]). En nuestro estudio, las células T CD8+ deficientes en Tmed4 exhibieron una mayor actividad autofágica, evidenciada por un aumento de los niveles de LC3B-II. Cabe destacar que el aumento del flujo autofágico observado en las células T CD8+ deficientes en Tmed4 dependió parcialmente de IRE1α, que está codificado por el gen Ern1. Para investigar esta relación, generamos ratones doblemente deficientes Tmed4Ern1ΔT, en los que tanto Tmed4 como Ern1 (IRE1α) fueron eliminados en las células T. Las células T CD8+ de estos ratones doblemente deficientes exhibieron niveles más bajos de LC3B-II en comparación con las células T CD8+ Tmed4ΔT, lo que indica que la pérdida de IRE1α revirtió parcialmente el aumento de la autofagia observado en las células T deficientes en Tmed4. Sin embargo, los niveles de LC3B-II en las células T CD8+ Tmed4Ern1ΔT siguieron siendo más altos que en los controles WT, lo que sugiere que, si bien IRE1α desempeña un papel en la regulación de la autofagia mediada por Tmed4, otros mecanismos también pueden contribuir a este proceso.

Nuestros hallazgos van más allá de la biología convencional de las células T al demostrar que la deleción de Tmed4 mejora la eficacia terapéutica de las células CAR T. El agotamiento de las células CAR T representa un obstáculo importante en los tumores sólidos, lo que limita la durabilidad y la potencia de las terapias celulares adoptivas. Mostramos que las células CAR T que carecen de Tmed4 exhiben una función efectora superior, una reducción del agotamiento y una mayor actividad citotóxica contra las células tumorales. Este efecto se observa en múltiples modelos tumorales, incluidos aquellos que expresan CLDN18.2, un prometedor objetivo de las células CAR T en las neoplasias gastrointestinales, y HER2, una tirosina quinasa de receptor sobreexpresada en varios tumores sólidos (^[41]). Cabe destacar que las terapias dirigidas a CLDN18.2 han demostrado respuestas clínicas prometedoras, y algunos pacientes han logrado una remisión tumoral completa, lo que destaca su potencial como un objetivo de células CAR T de próxima generación (^[42]).

También demostramos la viabilidad de dirigir farmacológicamente Tmed4 para mejorar la inmunoterapia de las células T. Utilizando un enfoque ASO, silenciamos con éxito Tmed4 en las células T CD8+ OT-I y en las células CAR específicas del antígeno. Tras la transferencia adoptiva en ratones con tumores, las células T CD8+ y las células CAR silenciadas en Tmed4 exhibieron una mejora significativa en el control tumoral en comparación con las células tratadas con control. Estos hallazgos sugieren que la inhibición de Tmed4 podría servir como una estrategia previamente no identificada para revitalizar las células T agotadas y mejorar la eficacia de la inmunoterapia.

En conclusión, nuestro estudio identifica Tmed4 como un regulador crítico de la función de las células T CD8+ en el microambiente tumoral, donde modula el estrés del retículo endoplásmico y la autofagia. Demostramos que la deleción de Tmed4 promueve la activación de IRE1α-XBP1 al tiempo que mejora el flujo autofágico, en parte a través de mecanismos dependientes de IRE1α, mejorando así la inmunidad antitumoral y la eficacia de las células CAR T. Además, proporcionamos evidencia de que la modulación farmacológica de Tmed4 a través de ASO representa un enfoque viable para mejorar las inmunoterapias basadas en células T. Estos hallazgos destacan el potencial de dirigir Tmed4 como una estrategia para mitigar el agotamiento de las células T y mejorar los resultados de la inmunoterapia contra el cáncer.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ratones

Los ratones C57BL/6 se compraron a Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd. Los ratones Tmed4ΔT se obtuvieron cruzando ratones CD4-Cre (del Jackson Laboratory) con ratones Tmed4f/f, que fueron generados por Shanghai Biomodel Organism Science Technology Development Co. Ltd. Los ratones Ern1 con alelos "floxed" fueron proporcionados por X. Wang y Y. Liu (^[34]), mientras que los ratones Becn1 con alelos "floxed" fueron proporcionados por Q. Zou (^[43]). Los ratones doblemente deficientes Tmed4Ern1ΔT se obtuvieron cruzando ratones Tmed4ΔT con ratones Ern1f/f. De manera similar, los ratones doblemente deficientes Tmed4Becn1ΔT se obtuvieron cruzando ratones Tmed4ΔT con ratones Becn1f/f. Los ratones Tmed4ΔTOT-I o Tmed4ΔTOT-II se generaron cruzando ratones transgénicos TCR OT-I o OT-II con ratones Tmed4ΔT, respectivamente. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Departamento de Ciencia de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong (aprobación n.º JUMC-2023-028-A). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos.

Pacientes y muestras

Las muestras tumorales se obtuvieron y procesaron según lo descrito anteriormente (^[44]). Brevemente, las suspensiones de células tumorales se obtuvieron mediante disociación mecánica seguida de digestión enzimática utilizando colagenasa IV (0,5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, C5138) y desoxirribonucleasa I (DNasa I) (100 U/ml) (STEMCELL Technologies, 07900). Las células mononucleares de la sangre humana se purificaron utilizando Ficoll (Cytiva, 17544602). Las células T CD8+ tanto de las muestras de sangre como de las tumorales se purificaron posteriormente mediante clasificación por citometría de flujo mediante tinción con anti-hCD45-fluoresceína isotiocianato (FITC) (BioLegend, n.º 304006, identificador de recursos de investigación (RRID): AB2562050), anti-hCD3-AF700 (BioLegend, n.º 300323, RRID: AB493738), anti-hCD4-aloficocianina (APC) (BioLegend, n.º 317416, RRID: AB571944), anti-hCD25-ficoeritrina (PE) (BioLegend, n.º 302606, RRID: AB314275) y anti-hCD8-PE-cy7 (BD, n.º 557746, RRID: AB_396852). El ARN total se extrajo con TRIzol (Invitrogen, 15596018CN), seguido de la transcripción inversa para generar una biblioteca de ADN complementario para el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Todos los pacientes con adenocarcinoma de colon o estómago proporcionaron consentimiento informado antes de su inclusión en el estudio, y todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de ética del Hospital Ruijin de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Shanghái (aprobación n.º 2019-186).

Cultivo celular y muestras primarias

Las células Jurkat se compraron a American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (BasalMedia, L210KJ) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, 15140122). Las células MC38 y B16F10 se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (BasalMedia, L110KJ) suplementado con un 10% de SFB y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, 15140122). Se realizaron pruebas de rutina de micoplasma para garantizar que todas las líneas celulares utilizadas en este estudio estuvieran libres de micoplasma. Para generar células MC38 y B16F10 que sobreexpresen la proteína fluorescente verde de copépodo (CopGFP) y la CLDN18.2 murina, se realizó la transducción lentiviral utilizando el siguiente plásmido: pCDH-CMV-CLDN18.2 murina-3 × Flag-EF1-copGFP-T2A-Puro. De manera similar, se sobreexpresó el HER2 humano utilizando el vector pTandem. Se confirmó la transducción exitosa de la CLDN18.2 murina mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo primario específico para CLDN18.2 (ER1902-86, conejo, HUABIO; 1:50, 1 hora de incubación), seguido de un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 647, anti-inmunoglobulina G (IgG) de cabra (Goat anti-Rabbit IgG H&L, ab150079); 1:1000, 30 minutos de incubación). La expresión de HER2 humano se evaluó utilizando el anticuerpo anti-HER2/ERBB2 (APC, Sino Biological Inc., 10004-MM03-A). Las líneas celulares MC38, B16F10, MC38-ovalbúmina (OVA), B16F10-OVA, MC38-CLDN18.2-CopGFP, B16F10-CLDN18.2-CopGFP, MC38-HER2 y B16F10-HER2 se cultivaron en DMEM suplementado con un 10% de SFB y un 1% de penicilina-estreptomicina. Las células tumorales diseñadas para sobreexpresar péptidos antigénicos se mantuvieron en presencia de puromicina (MCE, 53-79-2). A menos que se indique lo contrario, todas las células T primarias se purificaron del bazo y los ganglios linfáticos periféricos y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de SFB (Gibco, A5670701), un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, 15140122), 50 μM de β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, M3148), 100 nM de piruvato de sodio (Gibco, n.º piruvato de sodio), 100 nM de medio mínimo esencial-aminoácidos no esenciales (Sigma-Aldrich, M7145) e IL-2 humana recombinante (100 U/ml) (Novoprotein, C103). La estimulación de las células T se realizó utilizando anti-CD3 (1 μg/ml) (BD Biosciences, 553058) y anti-CD28 (1 μg/ml) (BD Biosciences, 553294). Todas las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2.

Modelos tumorales y modelos de transferencia adoptiva

Para establecer tumores, se inyectaron por vía subcutánea 5 × 105 células MC38 o 3 × 105 células B16F10 en una de las patas traseras de ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad. Para un modelo de transferencia adoptiva, se inyectaron por vía subcutánea 1 × 106 células B16F10-OVA en ratones C57BL/6. Entre los días 8 y 10, cuando los tumores alcanzaron aproximadamente los 100 mm3, se administraron por vía intravenosa (i.v.) 2 × 106 células T CD8+ o células T CD4+ activadas WT o Tmed4-KO. Las células T CD8+ de los ratones Tmed4f/fOT-I y Tmed4ΔTOT-I y las células T CD4+ de los ratones Tmed4f/fOT-II y Tmed4ΔTOT-II se purificaron y activaron in vitro. Las células T CD8+ se estimularon con el péptido OVA257-264 (250 ng/ml), mientras que las células T CD4+ se estimularon con el péptido OVA323-339 (1 μg/ml). Tras una activación de 12 horas, todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con IL-2 humana recombinante (100 U/ml) durante 2 días. A menos que se indique lo contrario, el volumen tumoral se midió cada 2 o 3 días y se calculó utilizando la fórmula: volumen tumoral = longitud × (ancho2) × 0,52.

Estimulación y proliferación de células T in vitro

Las células T CD4+ y CD8+ primarias de ratón se purificaron del bazo y los ganglios linfáticos periféricos utilizando el kit de aislamiento de células T CD4+ de ratón (STEMCELL Technologies, n.º 19852), el kit de aislamiento de células T CD8+ de ratón (STEMCELL Technologies, n.º 18000) y el kit de selección positiva con PE II (STEMCELL Technologies, n.º 17666). Las células T CD4+ y CD8+ purificadas se estimularon con anti-CD3/28 inmovilizado (1 μg/ml) en pocillos de placas de 96 pocillos (1,5 × 105 células por pocillo) para el análisis posterior de qPCR y Western blot. Para la proliferación de células T, las células T CD8+ purificadas se etiquetaron con el tinte de viabilidad Fixable eFluor 450 (E450, eBioscience, 65-0842-90) y se estimularon con anti-CD3/28 inmovilizado (1 μg/ml) en placas de 96 pocillos (1,5 × 105 células por pocillo). Después de 3 días, la proliferación se evaluó mediante citometría de flujo.

Ensayo de citotoxicidad in vivo de células T CD8+ específicas de OVA

Listeria monocytogenes que expresan OVA (Lm-OVA) se cultivaron en medio de caldo de soja tripticase (TSB) (BasalMedia, Q804) con estreptomicina (50 μg/ml) y se incubaron durante la noche a 30 °C con agitación a 230 rpm. Los ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT se inmunizaron con 5000 unidades formadoras de colonias de Lm-OVA, mientras que los ratones C57BL/6 recibieron suero fisiológico (BasalMedia, B320KJ) como control (ratones no inmunizados). Siete días después de la inmunización, se inyectaron a los ratones receptores una mezcla 1:1 de esplenocitos aislados de ratones C57BL/6: (i) esplenocitos pulsados con SIINFEKL [péptido OVA257-264 (10 μg/ml)], etiquetados con éster de carboxyfluoresceína diacetato de alta concentración (CFSE) (2,5 μM, CFSEalto) y (ii) esplenocitos no pulsados, etiquetados con CFSE de baja concentración (0,25 μM, CFSEbajo). Los esplenocitos se resuspendieron en PBS a una concentración final de 5 × 106/100 μl, y se inyectaron por vía intravenosa 200 μl de la mezcla de células en los ratones inmunizados con OVA. Cuatro horas después de la transferencia, se aislaron los esplenocitos de los ratones receptores y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células CFSEaltas y CFSEbajas en cada ratón. Para calcular el porcentaje de lisis específica para cada ratón, se utilizó la siguiente ecuación, comparando los resultados con un ratón no inyectado no inmunizado: % de lisis específica = 100 - [100 × (% CFSEalto ratón inmunizado/% CFSEbajo ratón inmunizado)/(% CFSEalto ratón no inmunizado/% CFSEbajo ratón no inmunizado)].

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Se estimularon células T CD4+ o células T CD8+ purificadas con anti-CD3/28 inmovilizado en placas (1 μg/ml) durante 24 horas en placas de 96 pocillos a una densidad de 1,5 × 105 células por pocillo. Tras la estimulación, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de IFN-γ e IL-2 mediante un ensayo ELISA.### Extracción de ARN, qPCR y análisis de secuenciación de ARN

Se extrajo el ARN total de las células T CD4+ o células T CD8+ utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se cuantificó con NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). El ARN total (1 μg) se transcribió inversamente utilizando un kit de transcripción inversa (Yeasen, 11201ES). Se utilizaron cebadores específicos del gen (qPCR basada en SYBR Green, Yeasen) para cuantificar la expresión génica. Las secuencias de los cebadores utilizadas fueron las siguientes: m-Actin: Forward: GGCTGTATTCCCCTCCATCG y Reverse: CCAGTTGGTAACAATGCCATGT, y m-Tmed4: Forward: GACGGCAAGGTTGTACTGTC y Reverse: GAGAGCCATTCTGGTGGAGT. Se estimularon células T CD8+ nativas purificadas con anti-CD3/28 (1 μg/ml) durante 6 horas para inducir un estado efector antes de la secuenciación de ARN. El análisis de secuenciación de ARN se realizó en la plataforma MGI DNBSEQ T7 con lecturas pareadas de 150 bases en Annoroad Gene Technology (Shanghái, China). Las lecturas se alinearon al genoma de referencia del ratón (mm10) utilizando HISAT2 con la configuración predeterminada. Se identificaron y normalizaron los genes con expresión diferencial mediante DESeq2 (|log2(cambio de expresión)| ≥ 1,5; P < 0,05). Para analizar la inmunidad mediada por células T, el estrés del RE y otras vías de interés en los datos de secuenciación de ARN a granel, aplicamos GSVA utilizando GSVA v1.40.1 con la configuración estándar (^[45]).### Preparación de la biblioteca 10x Genomics

Los ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT se inyectaron subcutáneamente con 5 × 105 células MC38. Las células T CD45+CD3+ intratumorales se aislaron utilizando BD FACSAria III el día 14 después de la inyección del tumor MC38 y se resuspendieron en PBS que contenía 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA). Se contaron las células y se ajustó la densidad celular según la entrada recomendada para el procesamiento y la preparación de la biblioteca de células individuales de 10x Genomics Chromium 3′ v3. La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina NovaSeq 6000 en el Instituto de Inmunología de Shanghái (Shanghái, China), con una profundidad de secuenciación de ~25 000 lecturas por célula individual.### Procesamiento de los datos de scRNA

Procesamos los datos de secuenciación sin procesar utilizando 10x Genomics Cell Ranger v8.0.0 (^[46]) para alinear las lecturas al genoma de referencia mm10 (GRCm38) y resumir los recuentos de identificadores moleculares únicos en matrices de características-código de barras, siguiendo el flujo de trabajo estándar con los parámetros predeterminados. Los dobletes se eliminaron con DoubletFinder v.2.0.4 (^[47]). Luego, conservamos las células según los siguientes criterios: (i) nFeatureRNA entre 200 y 7500, (ii) nCountRNA inferior a 25 000 y (iii) porcentaje de genes mitocondriales inferior al 5%. La normalización de datos, la reducción de dimensionalidad y la agrupación se realizaron utilizando Seurat v.4.4.0 en R v.4.1.0 (^[48]). La integración de datos se realizó con Harmony v.0.1.1 (^[49]). Los grupos de células se anotaron según la expresión de los genes marcadores. Los datos de células individuales del cáncer colorrectal se obtuvieron de seis cohortes de tres estudios públicos (^[50]–^[52]). Aplicamos un enfoque similar al descrito anteriormente para filtrar las células T CD8+ para el análisis posterior. Específicamente, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para cuantificar la asociación entre el nivel de expresión de cada gen de la familia TMED y la puntuación de la vía correspondiente.### Análisis de correlación de Pearson

Para los datos de TCGA, la fracción pan-inmune de TIL de cada muestra se obtuvo del estudio de Thorsson et al. (^[53]). Para la expresión de TMED4 de múltiples cohortes de TCGA, se realizó la prueba de Wilcoxon de rangos con signo de dos colas entre las muestras adyacentes normales y tumorales. Para los datos de la base de datos TISCH2, utilizamos la información de anotación de la base de datos para los análisis posteriores. La infiltración de células CD8T se determinó calculando la proporción de células T CD8+ entre el total de células inmunitarias en cada muestra. El nivel de expresión de TMED4 para las células T CD8+ en cada muestra se representó mediante la media de la expresión de TMED4 en todas las células T CD8+ de esa muestra. Incluimos solo los tipos de tumor con más de 20 muestras y conservamos las muestras en las que tanto la infiltración de células T CD8+ como la expresión de TMED4 en las células T CD8+ eran >0 para el análisis de correlación de Pearson.### Análisis de scRNA relacionado con ICB

Compilamos nueve conjuntos de datos de tratamiento con ICB de ocho estudios publicados (^[54]–^[61]). Siguiendo un flujo de trabajo de procesamiento de células individuales establecido previamente, identificamos las células T CD8+ dentro de las poblaciones de células inmunitarias y cuantificamos tanto la infiltración de células T CD8+ como los niveles de expresión de TMED4 para cada muestra.### Análisis de la trayectoria de las células T

Se utilizó Monocle2 (^[62]) para ilustrar la diferenciación de las células T CD8+. Brevemente, se cargaron las matrices de recuento y los metadatos para crear un nuevo objeto CellDataSet, con el parámetro expressionFamily establecido en negbinomial.size. Durante la construcción de las trayectorias de células individuales, se utilizó la función differentialGeneTest en Monocle2 para filtrar un conjunto de genes que definen la progresión del estado celular. La reducción de dimensionalidad se realizó utilizando el método DDRTree. Por último, se ordenaron las células a lo largo de la trayectoria, estableciendo las células T CD8+ nativas como el estado raíz. Para la visualización, se utilizó la función plotcelltrajectory con color_by establecido en "tipos de células" o "Pseudotiempo", y el pseudotiempo se proyectó en una aproximación y proyección uniforme del espacio (UMAP). Para investigar más a fondo la diferenciación, se seleccionaron las células CD8+ Tn, CD8+ Tem y CD8+ Tex, y se analizaron los cambios en la densidad celular a lo largo del eje del pseudotiempo.### Citometría de flujo y tinción intracelular

El timo, el bazo, los ganglios linfáticos y las células tumorales se procesaron para obtener una suspensión de células individuales de linfocitos. Para el procesamiento del tejido tumoral, las muestras se disociaron mecánicamente y se digirieron enzimáticamente con DNasa I (100 U/ml) (STEMCELL Technologies, n.º 07900) y colagenasa IV (0,5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, n.º 5138) a 37 °C durante 30 min. Las células viables se seleccionaron después de la tinción con Fixable Viability Stain 700 (BD Biosciences, n.º 564997, RRID: AB2869637). Para el análisis de los marcadores de superficie, las células se bloquearon con el anticuerpo anti-CD16/32 (1:300, n.º 553142, RRID: AB394656) y se tiñeron con anticuerpos primarios (1:200) en el tampón de clasificación de células activadas por fluorescencia (PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA) a 4 °C durante 30 min utilizando los siguientes anticuerpos: anti-ratón CD45.2-BV605 (BD, n.º 563051, RRID: AB2737974), anti-ratón CD45.1-PerCP (Invitrogen, n.º 45-0453-82, RRID: AB1107003), anti-ratón CD3e-APC (BD, n.º 553066, RRID: AB398529), anti-ratón TCRβ-APC (BD, n.º 53174, RRID: AB398534), anti-ratón CD4-APC (BioLegend, n.º 100412, RRID: AB312696), anti-ratón CD4-PB (BD, n.º 558107, RRID: AB397030), anti-ratón CD4-FITC (Invitrogen, n.º 11-0041-82, RRID: AB464892), anti-ratón CD8-BV650 (BioLegend, n.º 100742, RRID: AB11124344), anti-ratón CD8-PE (BD, n.º 553032, RRID: AB394571), anti-ratón CD44-BV711 (BD, n.º 563971, RRID: AB2738518), anti-ratón CD62L-APC (BD, n.º 553152, RRID: AB398533), anti-ratón PD1-FITC (BioLegend, n.º 135213, RRID: AB10680238), anti-ratón PD1-APC-cy7 (BioLegend, n.º 135223, RRID: AB2563522), anti-ratón TIM3-PE-cy7 (BioLegend, n.º 119716, RRID: AB2571932) y anti-ratón CTLA4-APC (eBioscience, n.º 17-1522-80, RRID: AB2016631). Para detectar la producción de citocinas intracelulares, las células se estimularon con un cóctel de estimulación (Invitrogen, n.º 00-4970-03) durante 12 a 16 horas antes de la fijación y la permeabilización utilizando el kit de tinción de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm (BD, 554714), según las instrucciones del fabricante. Las células teñidas con marcadores de superficie se fijaron y permeabilizaron según lo descrito anteriormente y luego se tiñeron con anticuerpos monoclonales específicos para anti-ratón IFN-γ-APC (BD, n.º 554413, RRID: AB398551), anti-ratón TNF-α-PE (BD, n.º 554419, RRID: AB395380), anti-ratón IL-2-BV421 (BD, n.º 562969, RRID: AB395380), anti-ratón IL-4-PE-cy7 (BD, n.º 560699, RRID: AB1727548), anti-ratón IL-2-BV711 (BD, n.º 564005, RRID: AB2738537) y anti-ratón IL-17-PerCP-cy5.5 (BD, n.º 506919, RRID: AB961384) (1:150) a 4 °C durante 30 min. Para la tinción de Ki67 (anti-ratón Ki67-PE, Invitrogen, n.º 12-5698-82, RRID: AB11150954), GzmB (anti-ratón GzmB-PerCP, eBioscience, n.º 35-8898-80, RRID: AB2848328 y anti-humano/ratón GzmB-PE-cy7, BioLegend, n.º 372214, RRID: AB2728380) y TCF (anti-ratón TCF1-BV421, BD, n.º 566692, RRID: AB2869822), las células teñidas con marcadores de superficie se fijaron y permeabilizaron utilizando el kit de fijación/permeabilización de factores de transcripción de eBioscience (Invitrogen). Los datos de citometría de flujo se adquirieron utilizando un LSRFortessa o LSRFortessa X-20 (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJoV10.### Inmunoblotting

Las proteínas se extrajeron recolectando las células tratadas después de dos lavados con PBS y lisándolas en un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (20 mM tris-HCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 10% glicerol y 150 mM NaCl) con 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), inhibidores de fosfatasas (keygen biotech, KGB5101-2) y un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche, n.º 4693132001) sobre hielo durante 30 min. Los lisados celulares se centrifugaron a 13 000 rpm y 4 °C durante 15 min, y se determinaron y ecualizaron las concentraciones de proteína. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10%, seguida de la transferencia electroforética a membranas de difluoruro de polivinilideno de 0,45 μm (Immobilon-P). Para el bloqueo, se utilizó un 5% de leche descremada en 1× TBS [10 mM tris-Cl (pH 7,5) y 150 mM NaCl], y las membranas se dejaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios TMED4 (TMED4 humanizado, Abcam, ab153814; TMED4 murino, Proteintech, 14141-1-AP), p-IRE1α (Affinity, AF7150, RRID: AB2843590), IRE1α [Cell Signaling Technology (CST), 3294 T, RRID: AB823545)], PERK (CST, 5683 T, RRID: AB10841299), XBP1 (Abcam, ab37152, RRID: AB778939), gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (CST, 2118 T, RRID: AB561053), MAP1LC3B (Sigma-Aldrich, L7543, RRID: AB796155), β-actina (Santa Cruz, sc-69879, RRID: AB1119529) y β-tubulina (CST, 2146S, RRID: AB2210545) durante la noche a 4 °C. Después de tres lavados con 1× TBS suplementado con 0,05% de Tween 20 (1× TBS-T), las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (CST, 7074S, 7076S) a temperatura ambiente durante 1 hora o a 4 °C durante la noche. Las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Tanon, 180-5001). Todos los anticuerpos primarios se diluyeron 1:1000 en el diluyente de anticuerpos para Western blot (que contiene 1% de BSA, 1% de gelatina y 0,05% de azida sódica). Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP se diluyeron a 1:5000 en un 5% de leche descremada.### Plásmidos y transfecciones

Los constructos de ARN de cadena corta (shRNA) dirigidos a TMED4, así como los constructos de control de shRNA, se clonaron en el vector pLKO.1 (Addgene). Las secuencias de shRNA son las siguientes: Forward: CCGGGCCACCACGCTCAGCTAATTTCTCGAGAAATTAGCTGAGCGTGGTGGC TTTTTG; Reverse: AATTCAAAAAGCCACCACGCTCAGCTAATTTCTCGAGAAATTAGCT GAGCGTGGGC. La transducción lentiviral se utilizó para reducir la expresión de TMED4 en las células T Jurkat. Los plásmidos principales (shRNA-TMED4), la polietilenimina (PEI) y los plásmidos de empaquetamiento (psPAX2 y pMD.2G) se transfectaron en células embrionarias humanas HEK-293T. Después de 48 horas, se recogieron los sobrenadantes, y se utilizaron para transducir las células Jurkat. Las células se cultivaron durante 48 horas y se seleccionaron con puromicina (2 μg/ml) durante 72 horas. El análisis de Western blot se realizó para confirmar la reducción de la expresión de TMED4.### Construcción de CAR

El gen que codifica la región de unión al antígeno de dominio único (scFv) del anticuerpo anti-CD19 se clonó en el vector de expresión de la célula T quimérica de receptor de antígeno (CAR). El dominio extracelular de CD8 se fusionó con el scFv a través de un espaciador de cadena de señal y un espaciador de cadena de unión. El dominio de señalización intracelular de CD3ζ se fusionó con el dominio extracelular de CD8. El plásmido CAR se transfectó en las células T de los pacientes mediante electroporación. Las células T CAR se cultivaron durante 48 horas y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la expresión de CAR.### Inyección de xenoinjerto

Se inyectaron células tumorales humanas (Raji) en el flanco de ratones inmunodeficientes (NSG). Después de 1 semana, se inyectaron las células T CAR en los ratones. El crecimiento tumoral se midió semanalmente utilizando un calibrador.### Análisis de citocinas

Se recogieron las células T CAR de los ratones y se estimularon con células tumorales Raji. Las citocinas en el sobrenadante se midieron mediante un ensayo de ELISA.### Inmunofenotipado

Se recogieron las células T CAR de los ratones y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la expresión de marcadores de superficie, como CD3, CD4, CD8, CD19 y CAR.### Inmunohistoquímica

Se recogieron los tumores de los ratones y se fijaron en formalina. Los tejidos se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm de grosor. Las secciones se tiñeron con anticuerpos contra CD3, CD8 y CD19. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal.### Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante una prueba t de Student o un análisis de varianza de una vía (ANOVA), según corresponda. Se consideró que un valor de p < 0

Se insertó una secuencia CAR de segunda generación murina CLDN18.2 en un vector retroviral de virus de células madre murinas (MSCV) y se subclonó una CAR murina HER2 de tercera generación en el vector retroviral pTandem. Los esplenocitos de los ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT se activaron con Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific) en medio R10 (RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS inactivado por calor, β-mercaptoetanol y penicilina/estreptomicina) a una densidad de 1 × 106 células/ml, con la adición de IL-2 (80 U/ml) durante 24 horas antes de la transducción. Las placas de 24 pocillos no tratadas se recubrieron con RetroNectin (40 μg/ml, Novoprotein) durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de una incubación durante la noche a 4 °C. Se añadió sobrenadante viral (1 ml por pocillo) y las placas se centrifugaron a 2000g durante 3 horas a 32 °C para mejorar la adherencia viral. Posteriormente, las células T activadas se resuspendieron a 1 × 106 células/ml en medio RPMI completo suplementado con IL-2 y 2-mercaptoetanol y se sembraron en los pocillos recubiertos con el virus (1 ml por pocillo). La espinfección se realizó a 600g durante 30 min a 32 °C, tras lo cual las placas se transfirieron a una incubadora y se cultivaron durante la noche. Después de 48 horas, las células T transducidas se expandieron en medio RPMI fresco suplementado con IL-2 (80 U/ml), IL-7 (10 ng/ml), IL-15 (10 ng/ml) y 2-mercaptoetanol. La eficiencia de la transducción se determinó en el día 2 mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-Myc conjugado con PE para la CAR CLDN18.2 o un anticuerpo anti-IgG humano etiquetado con Alexa Fluor 647 para la CAR HER2. Para el ensayo de citotoxicidad de la CAR CLDN18.2, las células T CAR WT y Tmed4-KO se cocultivaron con células diana MC38-CopGFP-CLDN18.2 o B16F10-CopGFP-CLDN18.2 a relaciones E:T de 1:9, 1:6, 1:3 y 1:1 durante 5 días. Las células T no transducidas (UTD) se utilizaron como controles. La intensidad de la fluorescencia de CopGFP se midió cada 24 horas y la citotoxicidad se normalizó al grupo UTD. Para el ensayo de citotoxicidad de la CAR HER2, las células T CAR WT y Tmed4-KO se cocultivaron con MC38-HER2 o B16F10-HER2 a relaciones E:T de 0,625:1, 1,25:1, 2,5:1 y 5:1. La muerte celular lítica se evaluó midiendo la actividad de la lactato deshidrogenasa liberada en sobrenadantes libres de células utilizando un ensayo colorimétrico (Promega) según el protocolo del fabricante. Para los ensayos de función efectora y agotamiento, las células T CAR WT y Tmed4-KO se estimularon con un cóctel de estimulación (Invitrogen) durante 6 u 12 horas, seguido de una tinción intracelular para IFN-γ, TNF-α, IL-2 y granzima B. El agotamiento se evaluó cultivando las células T CAR con células diana a relaciones E:T de 1:1, 2:1, 4:1 y 8:1 durante 24 horas, seguido de un análisis por citometría de flujo de los marcadores de agotamiento. Para el ensayo de transferencia adoptiva de células T CAR in vivo en un modelo tumoral (modelo tumoral CLDN18.2), se inyectaron 1 × 106 MC38-CLDN18.2 o 5 × 105 B16F10-CLDN18.2 por vía subcutánea en una de las extremidades posteriores de ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad. Para el modelo tumoral HER2, se inyectaron 1 × 106 MC38-HER2 o 3 × 106 B16F10-HER2 por vía subcutánea en una de las extremidades posteriores de ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad. En los días 10 a 12, cuando los tumores alcanzaron entre 60 y 150 mm3, se administraron 10 × 106 células T CAR WT o Tmed4-KO por vía intravenosa (i.v.). El volumen tumoral se midió cada 2 o 3 días y se calculó utilizando la fórmula: longitud × ancho2 × 0,52. Se consideró que los ratones habían alcanzado el punto final experimental cuando los tumores superaron los 1500 mm3.

Terapia de transferencia de células adoptivas tratadas con ASO

Los ratones C57BL/6 se inyectaron por vía subcutánea con células tumorales y recibieron una transferencia adoptiva intravenosa de 2 × 106 células CD8+ OT-I o células T CAR control de ASO y ASO-Tmed4. Para los tratamientos con ASO, las células T activadas se transfectaron con 75 μM de ASO control o ASO específico para Tmed4 (GenScript, China) con GeticoFect 3000 (Getico Biotech, 130102). Las secuencias son las siguientes: ASO-control (G*G*C*C*A*A*T*A*C*G*C*C*G*T*C*A) y ASO-Tmed4 (/i2MOErA/*/i2MOErA/*/i2MOErC/*/i2MOErA/*/i2MOErC/*/i2MOErC/*/i2MOErT/ */i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErT/*/i2MOErT/*/i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErG/*/i2MOErT/*/i2MOErT/), (*): enlace fosforotioato, (/i2MOEr/): 2-O-metoxietilo, uniforme.

Cuantificación y análisis estadístico

Los datos se presentan como medias ± SEM, a menos que se indique lo contrario. Se utilizaron las pruebas de Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov para evaluar la normalidad. Para los conjuntos de datos que siguen una distribución normal, se aplicaron pruebas paramétricas como la prueba t o el análisis de varianza (ANOVA). En los casos en que no se cumplió la normalidad, se utilizaron pruebas no paramétricas como la prueba de Mann-Whitney U para las comparaciones por pares. La significación estadística se definió como *P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001 y ****P < 0,0001. El número exacto de réplicas biológicas (n) para cada experimento se detalla en las leyendas de las figuras correspondientes. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 8.0 o SPSS versión 26.

Ratones

Los ratones C57BL/6 se compraron a Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd. Los ratones Tmed4ΔT se obtuvieron cruzando ratones CD4-Cre (del Jackson Laboratory) con ratones Tmed4f/f, que fueron generados por Shanghai Biomodel Organism Science Technology Development Co. Ltd. Los ratones Ern1 con alelos "floxed" fueron proporcionados por X. Wang y Y. Liu (^[34]), mientras que los ratones Becn1 con alelos "floxed" fueron proporcionados por Q. Zou (^[43]). Los ratones de doble knockout Tmed4Ern1ΔT se obtuvieron cruzando ratones Tmed4ΔT con ratones Ern1f/f. De manera similar, los ratones de doble knockout Tmed4Becn1ΔT se obtuvieron cruzando ratones Tmed4ΔT con ratones Becn1f/f. Los ratones Tmed4ΔTOT-I o Tmed4ΔTOT-II se generaron cruzando ratones transgénicos TCR OT-I o OT-II con ratones Tmed4ΔT, respectivamente. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Departamento de Ciencia de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong (aprobación n.º JUMC-2023-028-A). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos.

Pacientes y muestras

Las muestras tumorales se obtuvieron y procesaron según lo descrito anteriormente (^[44]). Brevemente, se obtuvieron suspensiones de células tumorales mediante disociación mecánica seguida de digestión enzimática utilizando colagenasa IV (0,5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, C5138) y desoxirribonucleasa I (DNasa I) (100 U/ml) (STEMCELL Technologies, 07900). Las células mononucleares de la sangre humana se purificaron utilizando Ficoll (Cytiva, 17544602). Las células T CD8+ tanto de las muestras de sangre como de las tumorales se purificaron posteriormente mediante clasificación por citometría de flujo mediante tinción con anti-hCD45-fluoresceína isotiocianato (FITC) (BioLegend, n.º 304006, identificador de recursos de investigación (RRID): AB2562050), anti-hCD3-AF700 (BioLegend, n.º 300323, RRID: AB493738), anti-hCD4-aloficocianina (APC) (BioLegend, n.º 317416, RRID: AB571944), anti-hCD25-ficoeritrina (PE) (BioLegend, n.º 302606, RRID: AB314275) y anti-hCD8-PE-cy7 (BD, n.º 557746, RRID: AB_396852). El ARN total se extrajo con TRIzol (Invitrogen, 15596018CN), seguido de la transcripción inversa para generar una biblioteca de ADN complementario (ADNc) para el análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Todos los pacientes con adenocarcinoma de colon o estómago proporcionaron consentimiento informado antes de su inclusión en el estudio, y todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de ética del Hospital Ruijin de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Shanghái (aprobación n.º 2019-186).

Cultivo celular y muestras primarias

Las células Jurkat se compraron a American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (BasalMedia, L210KJ) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, 15140122). Las células MC38 y B16F10 se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (BasalMedia, L110KJ) suplementado con 10% de SFB y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, 15140122). Se realizaron pruebas de micoplasma de rutina para garantizar que todas las líneas celulares utilizadas en este estudio estuvieran libres de micoplasma. Para generar células MC38 y B16F10 que sobreexpresaran la proteína verde fluorescente de copépodos (CopGFP) y la CLDN18.2 murina, se realizó transducción lentiviral utilizando el siguiente plásmido: pCDH-CMV-CLDN18.2 murina-3 × Flag-EF1-copGFP-T2A-Puro. De manera similar, se sobreexpresó el HER2 humano utilizando el vector pTandem. Se confirmó la transducción exitosa de la CLDN18.2 murina mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo primario específico para CLDN18.2 (ER1902-86, conejo, HUABIO; 1:50, 1 hora de incubación), seguido de un anticuerpo secundario de inmunoglobulina G (IgG) de cabra conjugado con Alexa Fluor 647 (Goat anti-Rabbit IgG H&L, ab150079); 1:1000, 30 minutos de incubación). La expresión de HER2 humano se evaluó utilizando el anticuerpo anti-HER2/ERBB2 (APC, Sino Biological Inc., 10004-MM03-A). Las líneas celulares MC38, B16F10, MC38-ovalbúmina (OVA), B16F10-OVA, MC38-CLDN18.2-CopGFP, B16F10-CLDN18.2-CopGFP, MC38-HER2 y B16F10-HER2 se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de SFB y 1% de penicilina-estreptomicina. A menos que se indique lo contrario, todas las células T primarias se purificaron del bazo y los ganglios linfáticos periféricos y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB (Gibco, A5670701), 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, 15140122), 50 μM de β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, M3148), 100 nM de piruvato de sodio (Gibco, n.º piruvato de sodio), 100 nM de aminoácidos no esenciales del medio mínimo (Sigma-Aldrich, M7145) y IL-2 humano recombinante (100 U/ml) (Novoprotein, C103). La estimulación de las células T se realizó utilizando anti-CD3 (1 μg/ml) (BD Biosciences, 553058) y anti-CD28 (1 μg/ml) (BD Biosciences, 553294). Todas las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.

Modelos tumorales y modelos de transferencia adoptiva

Para establecer tumores, se inyectaron por vía subcutánea 5 × 105 MC38 o 3 × 105 B16F10 en una de las extremidades posteriores de ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad. Para un modelo de transferencia adoptiva, se inyectaron por vía subcutánea 1 × 106 B16F10-OVA en ratones C57BL/6. En los días 8 a 10, cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm3, se administraron por vía intravenosa (i.v.) 2 × 106 células T CD8+ o células T CD4+ activadas WT o Tmed4-KO. Las células T CD8+ de los ratones Tmed4f/fOT-I y Tmed4ΔTOT-I y las células T CD4+ de los ratones Tmed4f/fOT-II y Tmed4ΔTOT-II se purificaron y activaron in vitro. Las células T CD8+ se estimularon con el péptido OVA257-264 (250 ng/ml), mientras que las células T CD4+ se estimularon con el péptido OVA323-339 (1 μg/ml). Tras una activación de 12 horas, todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con IL-2 humano recombinante (100 U/ml) durante 2 días. A menos que se indique lo contrario, el volumen tumoral se midió cada 2 o 3 días y se calculó utilizando la fórmula: volumen tumoral = longitud × (ancho2) × 0,52.

Estimulación y proliferación de células T in vitro

Las células T CD4+ y CD8+ primarias de ratón se purificaron del bazo y los ganglios linfáticos periféricos utilizando el kit de aislamiento de células T CD4+ de ratón (STEMCELL Technologies, n.º 19852), el kit de aislamiento de células T CD8+ de ratón (STEMCELL Technologies, n.º 18000) y el kit de selección positiva con PE II (STEMCELL Technologies, n.º 17666). Las células T CD4+ y CD8+ purificadas se estimularon con anti-CD3/28 unido a la placa (1 μg/ml) en pocillos de placas de 96 pocillos (1,5 × 105 células por pocillo) para el análisis posterior de qPCR y Western blot. Para la proliferación de células T, las células T CD8+ purificadas se etiquetaron con el tinte de viabilidad Fixable eFluor 450 (E450, eBioscience, 65-0842-90) y se estimularon con anti-CD3/28 unido a la placa (1 μg/ml) en placas de 96 pocillos (1,5 × 105 células por pocillo). Después de 3 días, la proliferación se evaluó mediante citometría de flujo.

Ensayo de citotoxicidad de células T CD8+ in vivo

Los ratones C57BL/6 se inyectaron por vía subcutánea con 1 × 106 células MC38. Después de 7 días, los ratones se dividieron en dos grupos y se inyectaron por vía intravenosa con 1 × 106 células T CD8+ WT o Tmed4-KO. Los ratones se sacrificaron 7 días después y se analizaron los tumores.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como medias ± SEM. Se utilizó una prueba t de Student para comparar los grupos. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Listeria monocytogenes que expresa OVA (Lm-OVA) se cultivó en medio de caldo de soja tripticásico (TSB) (BasalMedia, Q804) con estreptomicina (50 μg/ml) y se incubó durante la noche a 30 °C con agitación a 230 rpm. Los ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT se inmunizaron con 5000 unidades formadoras de colonias de Lm-OVA, mientras que los ratones C57BL/6 recibieron solución salina tamponada con fosfato (PBS) (BasalMedia, B320KJ) como control (ratones no inmunizados). Siete días después de la inmunización, se inyectó a los ratones receptores una mezcla 1:1 de esplenocitos aislados de ratones C57BL/6: (i) esplenocitos pulsados con SIINFEKL [péptido OVA257–264 (10 μg/ml)], etiquetados con éster de succinimidilo de carboxyfluoresceína diacetato de alta concentración (CFSE) (2,5 μM, CFSEalto) y (ii) esplenocitos no pulsados, etiquetados con CFSE de baja concentración (0,25 μM, CFSEbajo). Los esplenocitos se resuspendieron en PBS a una concentración final de 5 × 106/100 μl, y se inyectaron 200 μl de la mezcla celular por vía intravenosa en ratones inmunizados con OVA. Cuatro horas después de la transferencia, se aislaron esplenocitos de los ratones receptores y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células CFSEalto y CFSEbajo en cada ratón. Para calcular el porcentaje de lisis específica para cada ratón, se utilizó la siguiente ecuación, comparando los resultados con un ratón control no inyectado: % de lisis específica = 100 – [100 × (% CFSEalto ratón inmunizado / % CFSEbajo ratón inmunizado) / (% CFSEalto ratón no inmunizado / % CFSEbajo ratón no inmunizado)].

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Se estimularon células T CD4+ o células T CD8+ purificadas con anti-CD3/28 inmovilizado (1 μg/ml) durante 24 horas en placas de 96 pocillos a una densidad de 1,5 × 105 células por pocillo. Después de la estimulación, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de IFN-γ e IL-2 mediante un ELISA.

Extracción de ARN, qPCR y análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq)

Se extrajo el ARN total de las células T CD4+ o células T CD8+ utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se cuantificó con NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). El ARN total (1 μg) se transcribió inversamente utilizando un kit de transcripción inversa (Yeasen, 11201ES). Se utilizaron cebadores específicos del gen (qPCR basada en SYBR Green, Yeasen) para cuantificar la expresión génica. Las secuencias de los cebadores utilizadas fueron las siguientes: m-Actin: sentido: GGCTGTATTCCCCTCCATCG y reverso: CCAGTTGGTAACAATGCCATGT, y m-Tmed4: sentido: GACGGCAAGGTTGTACTGTC y reverso: GAGAGCCATTCTGGTGGAGT. Se estimularon células T CD8+ nativas purificadas con anti-CD3/28 (1 μg/ml) durante 6 horas para inducir un estado efector antes de la secuenciación de ARN. El análisis de secuenciación de ARN se realizó en la plataforma MGI DNBSEQ T7 con lecturas pareadas de 150 bases en Annoroad Gene Technology (Shanghái, China). Las lecturas se alinearon al genoma de referencia del ratón (mm10) utilizando HISAT2 con la configuración predeterminada. Se identificaron y normalizaron los genes con expresión diferencial mediante DESeq2 (|log2(cambio de expresión)| ≥ 1,5; P < 0,05). Para analizar la inmunidad mediada por células T, el estrés del RE y otras vías de interés en los datos de secuenciación de ARN a granel, aplicamos GSVA utilizando GSVA v1.40.1 con la configuración estándar (^[45]).

Preparación de la biblioteca 10x Genomics

Se inyectaron por vía subcutánea a los ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT 5 × 105 células MC38. Las células T CD45+CD3+ intratumorales se aislaron utilizando BD FACSAria III el día 14 después de la inyección del tumor MC38 y se resuspendieron en PBS que contenía 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA). Se contaron las células y se ajustó la densidad celular según la entrada recomendada para el procesamiento y la preparación de la biblioteca de células individuales de 10x Genomics Chromium v3. La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina NovaSeq 6000 en el Shanghai Institute of Immunology (Shanghái, China), con una profundidad de secuenciación de ~25 000 lecturas por célula individual.

Procesamiento de los datos de scRNA

Procesamos los datos de secuenciación sin procesar utilizando 10x Genomics Cell Ranger v8.0.0 (^[46]) para alinear las lecturas al genoma de referencia mm10 (GRCm38) y resumir los recuentos de identificadores moleculares únicos en matrices de características-código de barras, siguiendo el flujo de trabajo estándar con los parámetros predeterminados. Se eliminaron los dobletes con DoubletFinder v.2.0.4 (^[47]). Luego, se retuvieron las células según los siguientes criterios: (i) nFeatureRNA entre 200 y 7500, (ii) nCountRNA inferior a 25 000 y (iii) porcentaje de genes mitocondriales inferior al 5%. La normalización de datos, la reducción de dimensionalidad y la agrupación se realizaron utilizando Seurat v.4.4.0 en R v.4.1.0 (^[48]). La integración de datos se realizó con Harmony v.0.1.1 (^[49]). Los grupos de células se anotaron según la expresión de los genes marcadores. Los datos de células individuales del cáncer colorrectal se obtuvieron de seis cohortes de tres estudios públicos (^[50]–^[52]). Aplicamos un enfoque similar al descrito anteriormente para filtrar las células T CD8+ para el análisis posterior. Específicamente, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para cuantificar la asociación entre el nivel de expresión de cada gen de la familia TMED y la puntuación de la vía correspondiente.

Análisis de correlación de Pearson

Para los datos de TCGA, la fracción de TIL paninmune de cada muestra se obtuvo del estudio de Thorsson et al. (^[53]). Para la expresión de TMED4 de múltiples cohortes de TCGA, se realizó la prueba de Wilcoxon de rangos con signo de dos colas entre las muestras adyacentes normales y tumorales. Para los datos de la base de datos TISCH2, utilizamos la información de anotación de la base de datos para los análisis posteriores. La infiltración de células T CD8+ se determinó calculando la proporción de células T CD8+ entre el total de células inmunitarias en cada muestra. El nivel de expresión de TMED4 para las células T CD8+ en cada muestra se representó mediante la media de la expresión de TMED4 en todas las células T CD8+ en esa muestra. Incluimos solo los tipos de tumor con más de 20 muestras y retuvimos las muestras en las que tanto la infiltración de células T CD8+ era >0 como la expresión de TMED4 en las células T CD8+ era >0 para el análisis de correlación de Pearson.

Análisis de scRNA relacionado con la inmunoterapia con inhibidores de puntos de control inmunitario (ICB)

Compilamos nueve conjuntos de datos de tratamiento con ICB de ocho estudios publicados (^[54]–^[61]). Siguiendo un enfoque de procesamiento de células individuales establecido previamente, identificamos las células T CD8+ dentro de las poblaciones de células inmunitarias y cuantificamos tanto la infiltración de células T CD8+ como los niveles de expresión de TMED4 para cada muestra.

Análisis de la trayectoria de las células T

Monocle2 (^[62]) se utilizó para ilustrar la diferenciación de las células T CD8+. Brevemente, se cargaron las matrices de recuento y los metadatos para crear un nuevo objeto CellDataSet, con el parámetro expressionFamily establecido en negbinomial.size. Durante la construcción de las trayectorias de células individuales, la función differentialGeneTest en Monocle2 se utilizó para filtrar un conjunto de genes que definen la progresión del estado celular. La reducción de dimensionalidad se realizó utilizando el método DDRTree. Por último, se ordenaron las células a lo largo de la trayectoria, estableciendo las células T CD8+ nativas como el estado raíz. Para la visualización, se utilizó la función plotcelltrajectory con color_by establecido en "tipos de células" o "tiempo pseudotemporal", y el tiempo pseudotemporal se proyectó en una trama de aproximación y proyección uniforme del espacio (UMAP). Para investigar más a fondo la diferenciación, se seleccionaron las células CD8+ Tn, CD8+ Tem y CD8+ Tex, y se analizaron los cambios en la densidad celular a lo largo del eje del tiempo pseudotemporal.

Citometría de flujo y tinción intracelular

El timo, el bazo, los ganglios linfáticos y las células tumorales se procesaron para obtener una suspensión de células individuales de linfocitos. Para el procesamiento del tejido tumoral, las muestras se disociaron mecánicamente y se digirieron enzimáticamente con DNasa I (100 U/ml) (STEMCELL Technologies, n.º 07900) y colagenasa IV (0,5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, n.º 5138) a 37 °C durante 30 min. Las células viables se seleccionaron después de la tinción con Fixable Viability Stain 700 (BD Biosciences, n.º 564997, RRID: AB2869637). Para el análisis de los marcadores de superficie, las células se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 (1:300, n.º 553142, RRID: AB394656) y se tiñeron con anticuerpos primarios (1:200) en tampón de clasificación de células activadas por fluorescencia (PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA) a 4 °C durante 30 min utilizando los siguientes anticuerpos: anti-ratón CD45.2-BV605 (BD, n.º 563051, RRID: AB2737974), anti-ratón CD45.1-PerCP (Invitrogen, n.º 45-0453-82, RRID: AB1107003), anti-ratón CD3e-APC (BD, n.º 553066, RRID: AB398529), anti-ratón TCRβ-APC (BD, n.º 53174, RRID: AB398534), anti-ratón CD4-APC (BioLegend, n.º 100412, RRID: AB312696), anti-ratón CD4-PB (BD, n.º 558107, RRID: AB397030), anti-ratón CD4-FITC (Invitrogen, n.º 11-0041-82, RRID: AB464892), anti-ratón CD8-BV650 (BioLegend, n.º 100742, RRID: AB11124344), anti-ratón CD8-PE (BD, n.º 553032, RRID: AB394571), anti-ratón CD44-BV711 (BD, n.º 563971, RRID: AB2738518), anti-ratón CD62L-APC (BD, n.º 553152, RRID: AB398533), anti-ratón PD1-FITC (BioLegend, n.º 135213, RRID: AB10680238), anti-ratón PD1-APC-cy7 (BioLegend, n.º 135223, RRID: AB2563522), anti-ratón TIM3-PE-cy7 (BioLegend, n.º 119716, RRID: AB2571932) y anti-ratón CTLA4-APC (eBioscience, n.º 17-1522-80, RRID: AB2016631). Para detectar la producción de citocinas intracelulares, las células se estimularon con un cóctel de estimulación (Invitrogen, n.º 00-4970-03) durante 12 a 16 horas antes de la fijación y la permeabilización utilizando el kit de tinción de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm (BD, 554714), según las instrucciones del fabricante. Las células teñidas con marcadores de superficie se fijaron y permeabilizaron según lo descrito anteriormente y luego se tiñeron con anticuerpos monoclonales específicos para anti-ratón IFN-γ-APC (BD, n.º 554413, RRID: AB398551), anti-ratón TNF-α-PE (BD, n.º 554419, RRID: AB395380), anti-ratón IL-2-BV421 (BD, n.º 562969, RRID: AB395380), anti-ratón IL-4-PE-cy7 (BD, n.º 560699, RRID: AB1727548), anti-ratón IL-2-BV711 (BD, n.º 564005, RRID: AB2738537) y anti-ratón IL-17-PerCP-cy5.5 (BD, n.º 506919, RRID: AB961384) (1:150) a 4 °C durante 30 min. Para la tinción de Ki67 (anti-ratón Ki67-PE, Invitrogen, n.º 12-5698-82, RRID: AB11150954), GzmB (anti-ratón GzmB-PerCP, eBioscience, n.º 35-8898-80, RRID: AB2848328 y anti-humano/ratón GzmB-PE-cy7, BioLegend, n.º 372214, RRID: AB2728380) y TCF (anti-ratón TCF1-BV421, BD, n.º 566692, RRID: AB2869822), las células teñidas con marcadores de superficie se fijaron y permeabilizaron utilizando el kit de fijación/permeabilización de factores de transcripción eBioscience (Invitrogen). Los datos de citometría de flujo se adquirieron utilizando un LSRFortessa o LSRFortessa X-20 (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJoV10.

Inmunoblotting

Las proteínas se extrajeron recolectando las células tratadas después de dos lavados con PBS y lisándolas en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (20 mM tris-HCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 10% glicerol y 150 mM NaCl) con 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), inhibidores de fosfatasas (keygen biotech, KGB5101-2) y cóctel de inhibidores de proteasas (Roche, n.º 4693132001) sobre hielo durante 30 min. Los lisados celulares se centrifugaron a 13 000 rpm y 4 °C durante 15 min, y se determinaron y ecualizaron las concentraciones de proteína. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10%, seguida de la transferencia electroforética a membranas de difluoruro de polivinilideno de 0,45 μm (Immobilon-P). Para el bloqueo, se utilizó un 5% de leche descremada en 1× TBS [10 mM tris-Cl (pH 7,5) y 150 mM NaCl], y las membranas se dejaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (1 μg/ml) durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia.

Los anticuerpos utilizados fueron: anti-TMED4 (n.º 15298-1-AP, Proteintech), anti-GAPDH (n.º 6004-1-Ig, Proteintech).

Plásmidos y transfecciones

Se clonaron en el vector pLKO.1 (Addgene) constructos de ARN de cadena corta (shRNA) dirigidos a TMED4, así como constructos de control shRNA. Las secuencias de los shRNA son las siguientes: Sentido: CCGGGCCACCACGCTCAGCTAATTTCTCGAGAAATTAGCTGAGCGTGGTGGC TTTTTG; Antisentido: AATTCAAAAAGCCACCACGCTCAGCTAATTTCTCGAGAAATTAGCT GAGCGTGGGC. Se utilizó transducción lentiviral para reducir la expresión de TMED4 en células T Jurkat. Los plásmidos principales (shRNA-TMED4), polietilenimina (PEI) y plásmidos de empaquetamiento (psPAX2 y pMD.2G) se transfectaron en células embrionarias de riñón humano-293T. Después de 48 horas, se recogieron, centrifugaron y filtraron los sobrenadantes virales. Las células T Jurkat se infectaron con el sobrenadante que contenía el virus, suplementado con polibreno (10 μg/ml; Sigma-Aldrich), mediante centrifugación a 900g a 37°C durante 1,5 horas. Las células transducidas de forma estable se seleccionaron utilizando puromicina.

Construcción de CARs murinos

Se insertó una secuencia de CAR murino de segunda generación CLDN18.2 en un vector retroviral de virus de células madre murino (MSCV), y se subclonó un CAR murino de tercera generación HER2 en el vector retroviral pTandem. Los esplenocitos de ratones Tmed4f/f y Tmed4ΔT se activaron con Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific) en medio R10 (RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS inactivado por calor, β-mercaptoetanol y penicilina/estreptomicina) a una densidad de 1 × 106 células/ml, con la adición de IL-2 (80 U/ml) durante 24 horas antes de la transducción. Las placas de 24 pocillos no tratadas se recubrieron con RetroNectin (40 μg/ml, Novoprotein) durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de una incubación durante la noche a 4°C. Se añadió sobrenadante viral (1 ml por pocillo) y las placas se centrifugaron a 2000g durante 3 horas a 32°C para mejorar la adherencia viral. Posteriormente, las células T activadas se resuspendieron a 1 × 106 células/ml en medio RPMI completo suplementado con IL-2 y 2-mercaptoetanol y se colocaron en los pocillos recubiertos con el virus (1 ml por pocillo). La espinfección se realizó a 600g durante 30 minutos a 32°C, después de lo cual las placas se transfirieron a una incubadora y se cultivaron durante la noche. Después de 48 horas, las células T transducidas se expandieron en medio RPMI fresco suplementado con IL-2 (80 U/ml), IL-7 (10 ng/ml), IL-15 (10 ng/ml) y 2-mercaptoetanol. La eficiencia de la transducción se determinó en el día 2 mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-Myc conjugado con PE para el CAR CLDN18.2 o un anticuerpo anti-IgG humano etiquetado con Alexa Fluor 647 para el CAR HER2. Para el ensayo de citotoxicidad del CAR CLDN18.2, las células CAR WT y Tmed4-KO se cocultivaron con células diana MC38-CopGFP-CLDN18.2 o B16F10-CopGFP-CLDN18.2 a relaciones E:T de 1:9, 1:6, 1:3 y 1:1 durante 5 días. Las células T no transducidas (UTD) se utilizaron como controles. La intensidad de la fluorescencia de CopGFP se midió cada 24 horas y la citotoxicidad se normalizó al grupo UTD. Para el ensayo de citotoxicidad del CAR HER2, las células CAR WT y Tmed4-KO se cocultivaron con MC38-HER2 o B16F10-HER2 a relaciones E:T de 0,625:1, 1,25:1, 2,5:1 y 5:1. La muerte celular lítica se evaluó midiendo la actividad de la lactato deshidrogenasa liberada en sobrenadantes libres de células utilizando un ensayo colorimétrico (Promega) según el protocolo del fabricante. Para los ensayos de función efectora y agotamiento, las células CAR WT y Tmed4-KO se estimularon con un cóctel de estimulación (Invitrogen) durante 6 u 12 horas, seguido de tinción intracelular para IFN-γ, TNF-α, IL-2 y granzima B. El agotamiento se evaluó cultivando las células CAR con células diana a relaciones E:T de 1:1, 2:1, 4:1 y 8:1 durante 24 horas, seguido de análisis de citometría de flujo de los marcadores de agotamiento. Para el ensayo de transferencia adoptiva de CAR T in vivo en un modelo tumoral (modelo tumoral CLDN18.2), se inyectaron 1 × 106 MC38-CLDN18.2 o 5 × 105 B16F10-CLDN18.2 por vía subcutánea en una de las patas traseras de ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad. Para el modelo tumoral HER2, se inyectaron 1 × 106 MC38-HER2 o 3 × 106 B16F10-HER2 por vía subcutánea en una de las patas traseras de ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad. En los días 10 a 12, cuando los tumores alcanzaron entre 60 y 150 mm3, se administraron 10 × 106 células CAR WT o Tmed4-KO por vía intravenosa. El volumen tumoral se midió cada 2 o 3 días y se calculó utilizando la fórmula: longitud × ancho2 × 0,52. Se consideró que los ratones habían alcanzado el punto final del experimento cuando los tumores superaron los 1500 mm3.

Terapia de transferencia adoptiva de células tratadas con ASO

Se inyectaron ratones C57BL/6 con células tumorales por vía subcutánea y recibieron una transferencia adoptiva intravenosa de 2 × 106 células CD8+ OT-I ASO-control y ASO-Tmed4 o células CAR T. Para los tratamientos con ASO, las células T activadas se transfectaron con 75 μM de ASO de control o ASO específico para Tmed4 (GenScript, China) con GeticoFect 3000 (Getico Biotech, 130102). Las secuencias son las siguientes: ASO-control (G*G*C*C*A*A*T*A*C*G*C*C*G*T*C*A) y ASO-Tmed4 (/i2MOErA/*/i2MOErA/*/i2MOErC/*/i2MOErA/*/i2MOErC/*/i2MOErC/*/i2MOErT/ */i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErT/*/i2MOErT/*/i2MOErC/*/i2MOErT/*/i2MOErG/*/i2MOErT/*/i2MOErT/), (*): enlace fosforotioato, (/i2MOEr/): 2-O-metoxietilo, uniforme.

Cuantificación y análisis estadístico

Los datos se presentan como medias ± SEM, a menos que se indique lo contrario. Se utilizaron las pruebas de Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov para evaluar la normalidad. Para los conjuntos de datos que siguen una distribución normal, se aplicaron pruebas paramétricas como la prueba t o el análisis de varianza (ANOVA). En los casos en que no se cumplió la normalidad, se utilizaron pruebas no paramétricas como la prueba de Mann-Whitney U para las comparaciones por pares. La significación estadística se definió como *P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001 y ****P < 0,0001. El número exacto de réplicas biológicas (n) para cada experimento se detalla en las leyendas de las figuras correspondientes. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 8.0 o SPSS versión 26.