Los monocitos inflamatorios limitan la proliferación celular inducida por YAP.

La duplicación genética es útil para la supervivencia a largo plazo de una especie, ya que garantiza la redundancia de rasgos beneficiosos y proporciona el material de partida para la diversidad genética a través de procesos como la neofuncionalización (^[1], ^[2]). Con el tiempo, los genes duplicados sufren mutaciones, lo que lleva a su divergencia y al desarrollo de nuevas funciones. En los vertebrados, los coactivadores transcripcionales Yes1-associated protein (YAP) y su parólogo WW domain containing transcriptional regulator (WWTR1, también conocido como TAZ) son un ejemplo de este proceso.

Se cree que tanto YAP como TAZ se originan a partir del mismo gen ancestral, yorkie (yki) (^[3]). Yki, descubierto originalmente en Drosophila, integra señales intra/extracelulares que regulan programas involucrados en la proliferación celular, la diferenciación y la renovación de las células madre dentro de un marco altamente conservado conocido como la vía de señalización de Hippo (^[4]–^[7]). Yorkie y otros componentes críticos de la vía de Hippo están presentes en linajes premetazoos unicelulares (^[8]–^[10]), y el evento de duplicación del gen que produce YAP y TAZ ocurrió en un ancestro vertebrado temprano (^[11]).

YAP y TAZ a menudo se utilizan indistintamente, probablemente porque los primeros estudios se centraron en su participación en la proliferación (^[12]). Los estudios que definen las diferencias entre YAP y TAZ son relativamente escasos, y las diferencias aparentes en su biología a menudo se hipotetizan como debidas principalmente a su regulación genómica (^[10]). Los vertebrados han adoptado un número creciente de señales de entrada en estas moléculas, pero no está claro si o cómo YAP/TAZ traduce estas señales en resultados diferenciales que requieren la presencia de dos cotransactivadores distintos.

Existen varias similitudes y distinciones entre estas proteínas. Comparten la capacidad de interactuar y activar la familia de factores de transcripción del dominio TEA (TEAD) (^[13]) y parecen responder de manera similar a las quinasas aguas arriba (^[14]). Sin embargo, YAP es significativamente más grande que TAZ, y YAP contiene varios sitios de fosforilación y dominios que están ausentes en TAZ. TAZ tiene la capacidad de homodimerizarse, mientras que YAP no, lo que sugiere que estas moléculas pueden formar diferentes socios de unión intracelulares para activar/inhibir diferentes objetivos transcripcionales aguas abajo (^[15], ^[16]).

Aquí, investigamos el papel que desempeñan estas moléculas manipulando la expresión de YAP o TAZ en hepatocitos. Tanto YAP como TAZ apoyan un aumento inicial de la actividad proliferativa de los hepatocitos. Con el tiempo, los hepatocitos que expresan TAZ superan rápidamente el parénquima hepático, mientras que los hepatocitos que expresan YAP permanecen limitados en su crecimiento. Descubrimos que los hepatocitos que expresan YAP provocan una fuerte respuesta inmunológica, reclutando monocitos y otras células inmunitarias innatas que limitan el crecimiento clonal de YAP. En contraste, los hepatocitos que expresan TAZ muestran menos vías de señalización inmunostimulantes, lo que favorece su crecimiento a largo plazo. En el cáncer colorrectal (CCR) y el carcinoma hepatocelular (CHC), la alta expresión de TAZ se asoció con un tiempo de supervivencia más corto que aquellos que expresan altos niveles de YAP.

RESULTADOS

Las células LATS KO in vivo expresan predominantemente TAZ y muestran una ventaja de crecimiento competitiva sobre YAP

Para examinar los efectos de YAP versus TAZ en el comportamiento celular in vivo, generamos dos líneas de ratón para la comparación. Primero, utilizamos un modelo inducible con tetraciclina previamente publicado de YAPS127A (Fig. 1A, YAP-Tg) (^[17]) que se empareja con un transactivador de tetraciclina inversa constitutiva bloqueado por una casete de parada floxed (^[18]). Los ratones se infectan con un virus adenoasociado altamente específico expresado específicamente en los hepatocitos (AAV-Cre). Luego, se administra doxiciclina en el agua de beber para activar la expresión de YAP de manera específica para el tipo de célula y el tiempo.

En segundo lugar, generamos ratones con deleción de las quinasas 1 y 2 del gran supresor tumoral (LATS1/2) (KO) infectando ratones LATS1/2 floxed con AAV-Cre (Fig. 1A, LATS KO). Las quinasas LATS (LATS1 y LATS2) son reguladores aguas arriba bien establecidos de YAP y TAZ (^[19]–^[22]), que fosforilan estas proteínas para promover su secuestro y degradación en el citoplasma. Estudios previos que utilizaron métodos similares sugirieron que la deleción de LATS1/2 conduce a la regulación al alza de YAP y TAZ (^[23]–^[25]).

Se realizó un estudio de series temporales de ratones YAP-Tg y LATS KO para documentar la dinámica de la expresión de YAP y TAZ in vivo. En todos los puntos de tiempo examinados, los ratones YAP-Tg expresaron predominantemente YAP y cantidades mínimas de TAZ. En los ratones LATS KO, 1 semana después de la infección, hubo una amplia expresión nuclear de YAP en los hepatocitos y una expresión mínima de TAZ. A las 2 semanas, los clones proliferativos mostraron una combinación de expresión nuclear de YAP y TAZ, mientras que a las 3 semanas, los clones en expansión expresaron predominantemente TAZ nuclear y cantidades mínimas de YAP (fig. S1A). Los inmunoblot de hígado en este punto temporal mostraron que los hígados de control (AAV-Cre/R26-lsl-tdTomato) demostraron una expresión modesta de YAP y TAZ. Los hígados YAP-Tg demostraron una alta expresión de YAP y una expresión recíproca baja de TAZ. Coherente con los resultados de la tinción inmunohistoquímica, los hígados LATS KO demostraron una alta expresión de TAZ y, en consecuencia, una baja expresión de YAP (Fig. 1B).

Luego, evaluamos si la activación persistente de YAP o TAZ en un pequeño número de hepatocitos da como resultado diferencias mensurables a largo plazo en el tamaño del hígado o la salud del animal. Utilizando una dosis baja de AAV-Cre para infectar un pequeño número de hepatocitos (~0,1%), seguimos una cohorte de ratones durante un período de tratamiento de 12 semanas. Un reportero tándem-dímero inducible de tdTomato presente en estas líneas facilita el rastreo clonal de las células recombinadas. Los animales LATS KO tuvieron una mortalidad temprana y tasas de supervivencia más bajas (8 de 11) en comparación con el control (10 de 10) y los animales YAP-Tg (9 de 10), lo que sugiere una posible disparidad entre los modelos (fig. S1B, P = 0,08). Cuando se recolectaron los hígados, observamos que los hígados LATS KO eran notablemente más grandes (9,4%, n = 8, P < 0,001; Fig. 1, C y D) y presentaban un color rojo pronunciado en comparación con los grupos de control o YAP-Tg. Los hígados de control y YAP-Tg eran de color marrón claro y tenían relaciones similares entre el peso del hígado y el peso corporal para el control (4,1%, n = 10) y los ratones YAP-Tg (4,8%, n = 9) (Fig. 1, C y D). Estos valores se encuentran dentro del rango normal para los ratones normales (3 a 5%).

Para discernir el comportamiento celular de los hepatocitos en el contexto de la sobreexpresión de YAP o TAZ, examinamos microscópicamente hígados representativos de estos tratamientos. Las células tdTomato+ en los hígados de control eran típicamente células individuales, lo que es consistente con la noción de que los hepatocitos se dividen una o dos veces al año en condiciones de homeostasis (^[26]). En los hígados YAP-Tg, observamos tanto células individuales como pequeños cúmulos heterogéneos dispersos por todo el hígado. Esto es consistente con trabajos previos que demuestran que la sobreexpresión de YAP desempeña un papel en la estimulación del crecimiento de los hepatocitos, aunque no en una medida en que fuera macroscópicamente visible en este entorno. En contraste, los ratones LATS KO tenían pequeñas células tdTomato+ en todo el parénquima hepático (Fig. 1E). Los clones individuales eran indistinguibles en el modelo LATS KO, presumiblemente porque los clones se fusionaron entre sí.

Cuantificamos el número de células tdTomato+ por campo de alto poder (HPF) para medir la persistencia de las células recombinadas 12 semanas después de cada tratamiento. Los hígados de control, YAP-Tg y LATS KO mostraron 10,1, 12,9 y 32,4 células tdTomato+ por HPF, respectivamente (Fig. 1F). La inmunohistoquímica mostró que las células tdTomato+ en los controles no expresaban cantidades sustanciales de YAP o TAZ. Los clones tdTomato+ en los hígados YAP-Tg y LATS KO expresaron predominantemente YAP o TAZ, respectivamente (Fig. 1G y fig. S1, C y D). Estos hallazgos indican que tanto YAP como TAZ estimulan el crecimiento clonal; sin embargo, los hepatocitos TAZHigh muestran una ventaja de crecimiento sustancial sobre los hepatocitos YAPHigh in vivo.

Los hepatocitos YAP-Tg y LATS KO comparten muchos programas transcripcionales comunes, pero también algunos distintos

Para dilucidar los programas transcripcionales estimulados por las células YAP- o TAZ-predominantes y obtener información sobre los mecanismos diferenciales por los cuales se expanden en el hígado, realizamos un secuenciamiento de ARN a granel (RNA-seq) en hepatocitos purificados de hígados de control, YAP-Tg y LATS KO (Fig. 2A). Tres semanas después del tratamiento, clasificamos los hepatocitos del hígado mediante la digestión enzimática y la purificación de células Live+tdTomato+ mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se generaron bibliotecas de RNA-seq a granel y se analizaron a partir de estos ratones utilizando criterios estrictos (cambio de registro > 1,5, valor q < 0,001; Fig. 2B). Con este método, identificamos genes comunes (104 genes, 35,6%), YAP-Tg (172 genes, 58,9) y LATS KO (15 genes, 5,1) que probablemente se expresan de manera común o única en estos tratamientos.

Entre los genes expresados diferencialmente en los hígados YAP-Tg/LATS KO en comparación con el control, se encuentran muchos genes objetivo bien documentados de la vía de Hippo (Fig. 2C, común), incluidos Ctgf, Cyr61, Nuak2 y Tgfb2. En nuestro conjunto de genes comunes, identificamos Anln y Kif23 como genes regulados al alza, genes que se informaron recientemente como genes objetivo clave específicos de TAZ (^[27]). Los hepatocitos LATS KO expresaron Ctla4 y Tigit (Fig. 2C, específico de LATS KO), genes asociados con la promoción de la supresión inmunitaria mediante la regulación a la baja de las células T CD8+ (^[28]). En contraste, los hepatocitos YAP-Tg expresaron varios genes asociados con la activación de la señalización de los interferones, incluidos Irf9, Isg15 y Igtp (Fig. 2C, específico de YAP-Tg).

Para determinar si programas genéticos específicos se activan preferentemente en los hígados YAP-Tg o LATS KO, utilizamos el análisis de vías de Ingenuity (IPA). El análisis reveló varias vías de señalización relacionadas con las vías de activación de interferones y muerte celular que estaban más fuertemente asociadas con YAP-Tg en comparación con LATS KO (Fig. 2D). Entre estos, se encuentran la necrosis mediada por RIPK1 y la vía de señalización de la necroptosis y la señalización de los interferones. Estas vías sugieren un entorno inflamatorio más alto y posibles mecanismos de muerte celular vinculados a la expresión de YAP-Tg. Por el contrario, el análisis de los hígados LATS KO reveló un enriquecimiento de la señalización de la interleucina-10, una vía antiinflamatoria asociada con la regulación a la baja de las respuestas inmunitarias (^[29], ^[30]).

Para confirmar nuestros hallazgos, examinamos un conjunto de datos de RNA-seq independiente que utiliza hepatocitos clasificados de la sobreexpresión de YAP en el hígado (ApoE-YAP) (^[31]) y LATS KO 1 semana después de la inducción (^[25]). Utilizando criterios similares a nuestro análisis de RNA-seq, identificamos una proporción comparable de genes que se agrupan en categorías comunes, ApoE-YAP y específicas de LATS KO (fig. S2A) como en nuestro conjunto de datos. El IPA de este conjunto de datos reveló que el modelo ApoE-YAP se enriqueció con vías asociadas con la eliminación de células y la estimulación inmunitaria. En contraste, los hígados LATS KO mostraron un enriquecimiento de vías relacionadas con la supresión inmunitaria (fig. S2, B y C). En conjunto, estos datos sugieren que las células YAP- y TAZ-predominantes dirigen patrones de expresión distintos. Las células YAP-Tg expresan genes asociados con un mayor reclutamiento y activación de las células inmunitarias innatas y adaptativas, lo que sugiere una respuesta inmunitaria robusta que podría ralentizar su crecimiento (^[32]–^[37]), mientras que las células LATS KO expresan genes asociados con la supresión inmunitaria.

El secuenciamiento de ARN de un solo núcleo de YAP-Tg y LATS KO revela patrones distintos de remodelación celular

Para obtener una comprensión más profunda de los comportamientos celulares que se desarrollan en los ratones YAP-Tg y LATS KO, realizamos un análisis de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) en muestras de hígado de los grupos control (n = 2), LATS KO (n = 4) y YAP-Tg (n = 5) (Fig. 3A). Se recuperaron un total de 45.739 núcleos, identificando 12 grupos principales (Fig. 3B). Entre estos núcleos, distinguimos poblaciones celulares hepáticas clave, incluidos colangiocitos, hepatocitos, células endoteliales, fibroblastos y células inmunitarias. Pudimos definir las tres categorías principales de hepatocitos (periportal, mediozonal y pericentral) mediante la expresión de varios genes marcadores bien conocidos (Fig. 3B y fig. S3A). Clasificamos un pequeño subconjunto de células, denominadas "células madre hepáticas", debido a su expresión de genes de colangiocitos y hepatocitos periportales, lo que sugiere una población de transición entre las principales células epiteliales del hígado. En los controles, estas células representaron el 5,1% de todas las células identificadas (Fig. 3, B a D, y tabla S1).

La activación de YAP en los hepatocitos da como resultado cambios profundos en la proporción de células epiteliales e inmunitarias del hígado. El número y la proporción de células madre hepáticas en los ratones YAP-Tg aumentaron (22,9%) con una disminución concomitante en la proporción de células identificadas como hepatocitos periportales (13,5%) en comparación con los controles (47,4%). En los ratones YAP-Tg, identificamos una nueva población celular que designamos como "células madre hepáticas inducidas" (iHepSCs; 3,1%). Estas células no estaban presentes en los controles y compartían características de colangiocitos y células madre hepáticas. Estas células eran altamente proliferativas, como lo demuestra la expresión de Mki67, y exhibían marcadores de la capacidad de las células madre del cáncer de hígado, como Foxm1 (fig. S3A) (^[38]). La proporción de colangiocitos también aumentó notablemente en el modelo YAP-Tg (18,7%) en comparación con los controles (2%). En comparación, la proporción de células epiteliales en los hígados de los grupos control y LATS KO es muy similar (Fig. 3D). Las iHepSCs estaban presentes en los hígados LATS KO (0,5%), pero constituían una pequeña proporción de estos hígados y eran varias veces menores que en el modelo YAP-Tg.

Para investigar más a fondo cómo YAP o TAZ influyen en las decisiones sobre el destino de las células hepáticas, aplicamos el análisis de trayectoria Monocle3 (^[39], ^[40]) a nuestro conjunto de datos de snRNA-seq del parénquima, ordenando las células a lo largo de un eje de pseudotiempo. En los hígados de los controles, la mayoría de las células del parénquima estaban comprometidas con la línea de los hepatocitos, con una pequeña fracción que hacía la transición entre los destinos de hepatocitos y colangiocitos. Los hígados YAP-Tg demostraron una fuerte preferencia por que los hepatocitos hicieran la transición a colangiocitos, células madre hepáticas e iHepSCs y se alejaran del fenotipo de hepatocitos periportales. En contraste, los hepatocitos en los hígados LATS KO mostraron trayectorias celulares similares a las de la condición de control (Fig. 3E). Estos hallazgos subrayan la tendencia de YAP a dirigir los hepatocitos hacia un estado similar al de las células progenitoras, un fenómeno que no se refleja en la expresión de TAZ.

Hubo cambios notables en las poblaciones de células no parenquimatosas de los hígados YAP-Tg y LATS KO en comparación con los controles, particularmente en la fracción de células inmunitarias. Las células inmunitarias representaron el 17,6 y el 14,7% de los hígados YAP-Tg y LATS KO, respectivamente, mientras que los controles mostraron un 10% (Fig. 3C). Mediante inmunofluorescencia, YAP-Tg (48,9 células CD45+ por HPF, P < 0,0001) tuvo la mayor proporción de reclutamiento de células inmunitarias, seguido de LATS KO (26,7 células CD45+ por HPF, P < 0,001) y luego los controles (10,4 células CD45+ por HPF; fig. S3, C y D). Este cambio también se reflejó cuando se realizó un subagrupamiento para las células que expresan Ptprc (es decir, CD45) de nuestro conjunto de datos. Identificamos varios tipos comunes de células inmunitarias (fig. S3, B y E), como las células de Kupffer (KC), los macrófagos, los monocitos, las células dendríticas y las células B y T, según los genes marcadores inmunitarios comúnmente expresados (^[41], ^[42]). Los monocitos Ly6cHi estaban enriquecidos tanto en los hígados YAP-Tg (10,2%) como en los LATS KO (6,7%) en comparación con los controles (0,6%), pero estaban presentes preferentemente en los hígados YAP-Tg. Los marcadores de la actividad de las células T reguladoras, incluidos Foxp3, Ctla4, Il2ra y Ikzf2, estaban enriquecidos en los hígados LATS KO, lo que respalda un entorno antiinflamatorio en este contexto (fig. S3F).

Utilizando CellChat (^[43]), un algoritmo de aprendizaje automático acoplado a una base de datos conocida de ligandos y receptores, evaluamos las posibles interacciones célula-célula en el contexto de estas condiciones. En los hígados YAP-Tg, la mayoría de las interacciones intercelulares se originaron en las células madre hepáticas, las iHepSCs y los colangiocitos. Estas poblaciones participan en una señalización extensa con las KC, los macrófagos monocíticos (Μϕ) y las células T y B. La intensidad y la frecuencia de estas interacciones predichas se produjeron a una tasa más alta en los hígados YAP-Tg que en las condiciones de control o LATS KO (Fig. 3F).

Varias vías identificadas por CellChat, que son consistentes con nuestro fenotipo, incluyeron la señalización del factor estimulante de colonias 1 (Csf1), un factor quimiotáctico de monocitos/macrófagos bien caracterizado que promueve su supervivencia, proliferación y diferenciación (^[44], ^[45]). Csf1 y su receptor, Csf1r, estaban ausentes en los hígados de los controles, estaban significativamente enriquecidos en los hígados YAP-Tg y aumentaron moderadamente en los hígados LATS KO (Fig. 3G, CSF). La señalización de Egfr y Notch siguió una tendencia similar a la de Csf1. Estas vías son particularmente relevantes con respecto al fenotipo proinflamatorio de los hígados YAP-Tg; Egfr está asociado con el reclutamiento y la activación de macrófagos (^[46], ^[47]), mientras que la señalización Jag1- Notch2 promueve un fenotipo de macrófagos proinflamatorio (^[48], ^[49]). La señalización de la galectina a través de Lgals9 y Cd44 estaba ausente en los hígados YAP-Tg, presente en los controles y enriquecida en los LATS KO. La señalización de la galectina promueve la tolerancia inmunitaria y mantiene la homeostasis hepática al equilibrar las respuestas inmunitarias (^[50]).

Estos análisis implican que YAP-Tg y LATS KO conducen a niveles similares de proliferación, pero difieren en su capacidad para transdiferenciar las células afectadas. YAP-Tg influye en los hepatocitos para que favorezcan un estado celular más similar al de las células madre en comparación con las células LATS KO. Además, YAP-Tg impulsa un mayor reclutamiento de macrófagos y activación inflamatoria, mientras que las células LATS KO se asocian con una señalización inmunitaria antiinflamatoria. En conjunto, estas actividades probablemente conducen a la eliminación de las células YAP-Tg por el sistema inmunitario, a pesar de los niveles de proliferación similares entre estos dos estados.

Los monocitos y las células T se reclutan rápidamente en los hígados YAP-Tg

Para comprender las complejas interacciones intercelulares espaciales insinuadas por el análisis de snRNA-seq, aplicamos la hibridación in situ fluorescente de alta resolución y resistente a errores multiplexada (MERFISH), un método de transcriptómica espacial que permite la imagen directa de las especies de ARN dentro de su entorno tisular nativo (^[51], ^[52]). Nuestro conjunto de sondas de 503 genes (tabla S2) se dirigió a identificar los principales tipos de células, incluidos los colangiocitos, los hepatocitos, las células endoteliales, los fibroblastos y las células inmunitarias. Este enfoque nos permitió resolver espacialmente las distribuciones de los transcritos en los grupos de control y en los puntos de tiempo de 1 y 4 semanas de los tratamientos YAP-Tg y LATS KO (Fig. 4A y fig. S4A). Identificamos más de 2,19 millones de células para el análisis. Identificamos 12 grupos transcripcionalmente distintos que se validaron con respecto a nuestro conjunto de datos de snRNA-seq utilizando los principales genes marcadores (Fig. 4, A a C, y fig. S4B).

Como se esperaba, los hígados de los controles exhibieron una arquitectura normal con una zonificación clara y una mínima infiltración inmunitaria (Fig. 4A, control). Los hepatocitos se pudieron agrupar en sus principales subtipos mediante la expresión de genes marcadores canónicos: periportal (Hal, Sds y Cyp2r2), mediozonal (Igfbp2) y pericentral (Oat, GluI y Cyp2a5). Las células madre hepáticas se caracterizaron por una mezcla de genes de hepatocitos periportales y colangiocitos (Sox9 y Notch2), sin una alta expresión génica que represente el compromiso del destino de los colangiocitos (Krt7 y Krt19). En los controles, las células madre hepáticas representaron el 0,5% de todas las células. Sin embargo, tan pronto como 1 semana después de la inducción, los hígados YAP-Tg estuvieron dominados por las células madre hepáticas (54,2%) que se distribuyeron ampliamente por todo el tejido y persistieron a las 4 semanas después de la inducción (37%; Fig. 4, A y D, YAP-Tg; y tabla S3). Esto pareció ocurrir a expensas de todos los principales subtipos de hepatocitos, ya que todos estos tipos de células se redujeron en comparación con los controles (Fig. 4D y tabla S3). Las células madre hepáticas en los hígados LATS KO representaron una pequeña proporción del hígado en comparación con los YAP-Tg. Representaron el 0,6% de las células a la semana 1 y el 5,6% a la semana 4.

Las iHepSCs también se identificaron mediante MERFISH en este conjunto de datos, aunque a una tasa mucho menor que con snRNA-seq. Estas células tenían la mayor expresión de Ki67 de todos los tipos de células, similar al conjunto de datos de snRNA-seq. Nuestro conjunto de sondas MERFISH no contenía Foxm1, que parece ser un marcador característico de este tipo de células, y puede sugerir que algunas células madre hepáticas son células clasificadas erróneamente. A pesar de estas advertencias, las iHepSCs estaban ausentes en los controles, surgieron en los hígados YAP-Tg de la semana 1 (1,2%) y aumentaron modestamente a la semana 4 (2,1%). En contraste, las iHepSCs fueron del 0,1% a la semana 1 y del 1,6% a la semana 4 en los hígados LATS KO.

Teniendo en cuenta la distribución de estas células, nos preguntamos si había cambios en la composición del vecindario celular local entre las condiciones de control, YAP-Tg y LATS KO. Aplicamos una estrategia que describimos previamente para examinar las frecuencias del vecindario celular local (^[53]). Utilizando las coordenadas espaciales de cada célula etiquetada, calculamos la frecuencia de un tipo de célula dado alrededor de una célula de referencia de interés. Estos pares de tipos de células nos permiten detectar cambios entre las condiciones a la escala del microvecindario y comprender la dinámica local que potencialmente media las interacciones célula-célula (fig. S4C). Los cambios más profundos en las asociaciones de tipos de células se produjeron entre las poblaciones epiteliales en expansión y las células inmunitarias en las condiciones de YAP-Tg y LATS KO. Centramos nuestro análisis posterior en las interacciones epitelio-inmunitarias (Fig. 4, D y E) para obtener información sobre las células de referencia y las células vecinas en estas condiciones.

En los controles, las células madre hepáticas representaron una población rara y se colocalizaron con poca frecuencia con los tipos de células inmunitarias de interés (0 a 7%). En YAP-Tg a la semana 1, la frecuencia con la que los monocitos se asocian con las células madre hepáticas aumentó del 3% en los controles al 44% (P = 5,69 × 10−35). A la semana 4, se colocalizan en un 34% (P = 5,89 × 10−47). En los hígados LATS KO, estas células se colocalizan con frecuencias comparativamente más bajas (4% a la semana 1 y 17% a la semana 4). Al comparar entre las condiciones YAP-Tg y LATS KO, estos tipos de células se asocian con mayor frecuencia a la semana 1 (P = 3,11 × 10−45) y a la semana 4 (P = 0,00) en la condición YAP-Tg.

Se observaron tendencias similares al comparar las asociaciones de otros tipos de células epiteliales que surgen en las condiciones YAP-Tg y LATS KO (es decir, iHepSC y colangiocitos) con las células inmunitarias (Fig. 4E). Las asociaciones más significativas entre las células inmunitarias y las células epiteliales fueron las más altas en los hígados YAP-Tg, lo que sugiere que la sobreexpresión de YAP es consistente con una infiltración inmunitaria relativamente mayor. La proximidad de estas células inmunitarias a las células madre hepáticas, las iHepSCs y los colangiocitos implica una mayor probabilidad de comunicación cruzada celular, lo que respalda el análisis de CellChat de snRNA-seq.

Las células YAP-Tg y LATS KO promueven un entorno inmunitario distintivo asociado con la eliminación o la supresión inmunitaria de las células

Dado que el reclutamiento de células inmunitarias y la interacción con las células activadas por YAP-Tg y LATS KO parecen ser críticos para su persistencia a largo plazo, aislamos las células CD45+ mediante FACS de los hígados YAP-Tg (n = 2) o LATS KO (n = 2) 3 semanas después de la activación genética. A partir de estas células inmunitarias clasificadas, generamos bibliotecas de scRNA-seq para el análisis (Fig. 5A). De esta manera, capturamos un mayor número de células inmunitarias y se identificó una mayor proporción de transcritos celulares de estas células, particularmente los transcritos citoplasmáticos que se pierden en el snRNA-seq.

Tras el filtrado y la agrupación, obtuvimos 40.575 células individuales de estas dos condiciones para su análisis. Se identificaron doce grupos principales de células, como las células B, T, células NK (natural killer), neutrófilos, monocitos, células dendríticas mononucleares (MoKCs) y macrófagos derivados de monocitos (MoMacs) mediante este proceso. Se observó un pequeño pero distinto grupo de células con alta proliferación en ambos entornos, al que denominamos progenitores hematopoyéticos (Cd34HiGata2HiCd34Hi). En este conjunto de datos, no identificamos células dendríticas en nuestras poblaciones YAP-Tg o LATS KO. Los únicos grupos identificados con marcadores de células dendríticas bien establecidos (es decir, Clec4f, Timd4 y Vsig4) también contenían expresión génica asociada con el reclutamiento de monocitos (es decir, Ccr2, Cx3cr1 y Ly6c2) (^[42], ^[54]). Es posible que existan poblaciones de células dendríticas que expresen solo marcadores de células dendríticas dentro de estos hígados, pero es probable que estén enmascaradas dentro de la gran proporción de monocitos que se reclutan en los hígados YAP-Tg y LATS KO y que gradualmente adoptan características de células dendríticas. Los hígados YAP-Tg demostraron una mayor proporción de células T que los LATS KO (28 frente a 21,7%, respectivamente), en particular células T ingenuas (11,8 frente a 2,5%, respectivamente) (Fig. 5, B y C, y fig. S5A). Dado que los hígados YAP-Tg reclutan un 35,5% más de células inmunitarias al hígado que los LATS KO (fig. S3, C y D), esta diferencia es particularmente notable.

Luego, utilizamos CellChat para determinar si, dentro de las células inmunitarias YAP-Tg y LATS KO, existía una señalización intercelular significativa que pudiera respaldar nuestra hipótesis de que YAP-Tg promueve la señalización proinflamatoria, mientras que LATS KO promueve un entorno inmunosupresor. La señalización proinflamatoria estaba presente en ambas condiciones, pero la frecuencia y la complejidad de la posible señalización intercelular dentro del compartimento inmunitario YAP-Tg para vías como el factor de necrosis tumoral-α y el interferón-γ eran más prevalentes. En contraste, las posibles interacciones para la señalización inmunosupresora Cd80/Ctla4 se produjeron con mayor frecuencia en los hígados LATS KO (Fig. 5D).

A partir de nuestros datos de secuenciación espacial, los hepatocitos activados tanto en los hígados YAP-Tg como en los LATS KO aumentan la frecuencia de su interacción con células mieloides y células T. Para comprender los posibles cambios en estas poblaciones y su actividad, examinamos los compartimentos de células mieloides y células T del experimento más amplio, reagrupándolos para generar subdivisiones más finas a partir de las cuales comprender la dinámica compleja dentro de los hígados de estos animales. El conjunto de datos de células mieloides incluyó 14.290 células, divididas en 14 grupos (Fig. 5, E y F, y fig. S5B). Los hígados YAP-Tg demostraron una mayor proporción de neutrófilos-1/-2 que los LATS KO (46,3 frente a 27,0%, respectivamente), grupos que expresan altos niveles de Il1β y Tnfα. Los grupos de MoKC se enriquecieron modestamente en la condición YAP-Tg (24,9 frente a 20,7%), en particular MoKC1 (15,9 frente a 0,7%). Estos grupos expresan altos niveles de complemento (C1qa, C1qb y C1qc), lo que sugiere que pueden estar fagocitando células diana (^[55], ^[56]). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de la población MoKC1 mostró que los programas de genes como la muerte celular y la unión al receptor de quimiocinas CCR5 se favorecían en la condición YAP-Tg, mientras que los programas asociados con la curación de heridas y el metabolismo se favorecían en LATS KO (fig. S6A).

El subconjunto de células T contenía 8413 células que formaban 10 grupos distintos (Fig. 5, F y G, y fig. S5C) después de la reagrupación. Como se mencionó anteriormente, las células T ingenuas dominaron la población de células T YAP-Tg que se amplificó después de la separación de las poblaciones de células B y células mieloides (34,9 frente a 6,3%). La reagrupación permitió la identificación de células NKT invariantes (iNKT) y células efectoras de células T Cd8 que no eran aparentes en el conjunto de datos inmunitarios más grande. Los hígados YAP-Tg expresaron una alta proporción de iNKT (27,3 frente a 8,8%) y células efectoras de células T CD8 (12,9 frente a 4,7%). Se sabe que estos tipos de células median la muerte celular (^[57]–^[59]), y su mayor prevalencia en las condiciones YAP-Tg sugiere que puede desempeñar un papel en su eliminación. Utilizando GSEA para anotar los conjuntos de genes asociados con los subconjuntos iNKT2 y células efectoras de células T Cd8, identificamos programas como el reclutamiento inmunitario, la activación y la regulación del proceso de apoptosis de hepatocitos asociados con YAP-Tg. Al igual que en el análisis de células mieloides, LATS KO se asoció con conjuntos de genes metabólicos y la regulación positiva de la proliferación de hepatocitos (fig. S6B). En conjunto, las células YAP-Tg sesgan el entorno inmunitario hacia un entorno proinflamatorio preparado para mediar la muerte celular.

La inhibición mediada por CCR2 promueve la expansión clonal de YAP-Tg

Para explorar el papel del reclutamiento de monocitos en el crecimiento de las células YAP-predominantes, tratamos a los ratones YAP-Tg con un vehículo o un antagonista de CCR2 (CCR2i). Se ha establecido que CCR2 desempeña un papel como quimioatrayente de monocitos y es necesario para el reclutamiento de monocitos/macrófagos inflamatorios de la sangre a los sitios de los tejidos locales (^[60], ^[61]). Se inyectó a los animales YAP-Tg con una sola dosis baja de AAV-TBG-Cre y se les administró agua con doxiciclina durante un período de 4 semanas para inducir la sobreexpresión de YAP en un pequeño número de hepatocitos. Durante el transcurso de 4 semanas, los animales fueron tratados con un vehículo (control) o un inhibidor de CCR2 (CCR2i; Fig. 6A). Los hígados de control y CCR2i no mostraron diferencias significativas en la morfología general o en el porcentaje de hígado/peso corporal (fig. S7, A y B). El marcador de macrófagos F4/80 reveló una reducción significativa esperada en el grupo CCR2i con un promedio de 48,7 células por campo de alta potencia (HPF) en comparación con un promedio de 96,8 células por HPF en los controles (Fig. 6, B y C; P < 0,01). Luego, aislamos las células inmunitarias del hígado de estos hígados y las analizamos mediante citometría de flujo. Realizamos un análisis de compuerta en macrófagos hepáticos (Live+CD45+Ly6G−F4/80+) y los examinamos para determinar su estado de activación mediante la proporción de macrófagos que muestran Ly6cHiMHClow (Fig. 6D) (^[18], ^[62]). Hubo una ligera disminución de los macrófagos activados en los hígados tratados con CCR2i (Fig. 6E; 51,2 frente a 38,6%, P = no significativo), lo que es consistente con nuestros hallazgos anteriores. El examen microscópico de estos hígados reveló diferencias marcadas en el número de células tdTomato+ por campo. En los controles, había 9,5 células por HPF en comparación con 60,2 células por HPF en CCR2i (Fig. 5, D y E; P < 0,05). Estos hallazgos implican que el reclutamiento de monocitos inflamatorios actúa como un regulador negativo del crecimiento y la persistencia clonal inducidos por YAP-Tg.

Los cánceres TAZHigh se asocian con la menor duración de la supervivencia

Los clones epiteliales YAP- y TAZ-predominantes evocan distintas respuestas inmunitarias en ratones, lo que provoca la eliminación preferencial de los clones YAP. Luego, consideramos si se produce un fenómeno similar en el cáncer humano y si la predominancia de YAP o TAZ conduce a diferencias en los resultados de los pacientes. Utilizando información clínica de pacientes y sus datos de secuenciación de ARN masiva asociados del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA) (^[63], ^[64]), estratificamos a los sujetos en grupos en función de la expresión relativa normalizada de YAP y TAZ de sus tumores (el 30% superior o el 30% inferior).

Los pacientes con CRC se estratificaron en tres grupos: YAPHighTAZLow (YAPHigh), YAPLowTAZHigh (TAZHigh) y YAPLowTAZLow (YTLow). Los pacientes con CRC YAPHigh tenían una tasa de supervivencia a 5 años del 67%, mientras que los pacientes con CRC TAZHigh no sobrevivieron a los 5 años. Los pacientes TAZHigh tenían un tiempo de supervivencia medio de 36,5 meses. A los 3 años, el 100% de los grupos de CRC YAPHigh y YTLow sobrevivieron en comparación con el 58% del grupo de CRC TAZHigh (P = 0,043; Fig. 7A). Se observaron tendencias similares en una cohorte de HCC. La probabilidad de supervivencia de los pacientes con HCC TAZHigh fue del 0% a los 5 años, pero superior al 59% en los grupos YAPHigh y YTLow ( P = 0,38; Fig. 7B).

Luego, investigamos si, en el CRC, estaban presentes programas inmuno-moduladores en los tumores de los pacientes YAPHigh y/o TAZHigh, como en nuestros modelos de ratón. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando vías de la ontología de genes (GO) reveló que el grupo YAPHigh se enriqueció con programas relacionados con la muerte celular y la estimulación inmunitaria, como la eliminación de células apoptóticas, la activación de leucocitos mieloides y la activación de células T (Fig. 7C). Este patrón no se reflejó en el grupo TAZHigh, que se enriqueció con vías relacionadas con el metabolismo de la energía y el colesterol. En general, estos hallazgos sugieren que un programa de expresión génica estimulante del sistema inmunitario se asocia con los cánceres YAPHigh, lo que conduce a una mejora comparativa de la supervivencia de los pacientes en comparación con los cánceres TAZHigh.

Las células LATS KO in vivo expresan predominantemente la expresión de TAZ y muestran una ventaja de crecimiento competitiva sobre YAP

Para examinar los efectos de YAP versus TAZ en el comportamiento celular in vivo, generamos dos líneas de ratones para la comparación. Primero, utilizamos un modelo inducible de tetraciclina publicado previamente de YAPS127A (Fig. 1A, YAP-Tg) (^[17]) que se empareja con un transactivador de tetraciclina inversa constitutiva bloqueado por una casete de parada floxed (^[18]). Se infectan los ratones con un virus adenoasociado altamente específico expresado en hepatocitos (AAV-Cre). Luego, se administra doxiciclina en el agua de beber para activar la expresión de YAP de forma específica en el tipo de célula y en el tiempo.

En segundo lugar, generamos ratones con deleción de las quinasas 1 y 2 del gran supresor tumoral (LATS1/2) (KO) infectando a los ratones LATS1/2 floxed con AAV-Cre (Fig. 1A, LATS KO). Las quinasas LATS (LATS1 y LATS2) son reguladores ascendentes bien establecidos de YAP y TAZ (^[19]–^[22]), que fosforilan estas proteínas para promover su secuestro y degradación citoplasmática. Estudios anteriores que utilizaron métodos similares sugirieron que la deleción de LATS1/2 conduce a la regulación al alza de YAP y TAZ (^[23]–^[25]).

Se realizó un estudio de series temporales de los ratones YAP-Tg y LATS KO para documentar la dinámica de la expresión de YAP y TAZ in vivo. En todos los puntos de tiempo examinados, los ratones YAP-Tg expresaron predominantemente YAP y una cantidad mínima de TAZ. En los ratones LATS KO 1 semana después de la infección, hubo una amplia expresión nuclear de YAP en los hepatocitos y una cantidad mínima de expresión de TAZ. A las 2 semanas, los clones proliferativos mostraron una combinación de expresión nuclear de YAP y TAZ, mientras que a las 3 semanas, los clones en expansión expresaron predominantemente TAZ nuclear y una cantidad mínima de YAP (fig. S1A). Los inmunoblotados del hígado en este momento mostraron que los hígados de control (AAV-Cre/R26-lsl-tdTomato) demostraron una expresión modesta de YAP y TAZ. Los hígados YAP-Tg demostraron una alta expresión de YAP y, recíprocamente, una baja expresión de TAZ. Coherente con los resultados de la tinción inmunohistoquímica, los hígados LATS KO demostraron una alta expresión de TAZ y, en consecuencia, una baja expresión de YAP (Fig. 1B).

Luego, evaluamos si la activación persistente de YAP o TAZ en un pequeño número de hepatocitos da como resultado diferencias mensurables a largo plazo en el tamaño del hígado o en la salud de los animales. Utilizando una dosis baja de AAV-Cre para infectar un pequeño número de hepatocitos (~0,1%), seguimos una cohorte de ratones durante un período de tratamiento de 12 semanas. Un reportero en tándem inducible de tomate (tdTomato) presente en estas líneas facilita el rastreo clonal de las células recombinadas. Los animales LATS KO tuvieron una mortalidad temprana y tasas de supervivencia más bajas (8 de 11) en comparación con los animales de control (10 de 10) y YAP-Tg (9 de 10), lo que sugiere una posible disparidad entre los modelos (fig. S1B, P = 0,08). Cuando se cosecharon los hígados, observamos que los hígados LATS KO eran notablemente más grandes (9,4%, n = 8, P < 0,001; Fig. 1, C y D) y presentaban un enrojecimiento pronunciado en comparación con cualquiera de los grupos de control o YAP-Tg. Los hígados de control y YAP-Tg eran de color marrón y tenían relaciones hígado-cuerpo similares (4,1%, n = 10) y (4,8%, n = 9) (Fig. 1, C y D). Estos valores se encuentran dentro del rango normal para los ratones normales (3 a 5%).

Para discernir el comportamiento celular de los hepatocitos en el contexto de la sobreexpresión de YAP o TAZ, examinamos microscópicamente muestras representativas de hígado de estos tratamientos. Las células tdTomato+ en los hígados de control eran típicamente células individuales, lo que concuerda con la idea de que los hepatocitos se dividen una o dos veces al año en condiciones de homeostasis (^[26]). En los hígados YAP-Tg, observamos tanto células individuales como pequeños cúmulos heterogéneos dispersos por todo el hígado. Esto es consistente con trabajos previos que demuestran que la sobreexpresión de YAP desempeña un papel en la estimulación del crecimiento de los hepatocitos, aunque no en una medida que fuera macroscópicamente visible en este contexto. En contraste, los ratones LATS KO presentaban pequeñas células tdTomato+ en todo el parénquima hepático (Fig. 1E). Los clones individuales eran indistinguibles en el modelo LATS KO, presumiblemente porque los clones se fusionaban entre sí.

Cuantificamos el número de células tdTomato+ por campo de alta potencia (HPF) para medir la persistencia de las células recombinadas 12 semanas después de cada tratamiento. Los hígados de control, YAP-Tg y LATS KO mostraron 10,1, 12,9 y 32,4 células tdTomato+ por HPF, respectivamente (Fig. 1F). La inmunohistoquímica mostró que las células tdTomato+ en los controles no expresaban cantidades sustanciales de YAP o TAZ. Los clones tdTomato+ en los hígados YAP-Tg y LATS KO expresaban predominantemente YAP o TAZ, respectivamente (Fig. 1G y fig. S1, C y D). Estos hallazgos indican que tanto YAP como TAZ estimulan el crecimiento clonal; sin embargo, los hepatocitos TAZHigh muestran una ventaja de crecimiento sustancial sobre los hepatocitos YAPHigh in vivo.

Los hepatocitos YAP-Tg y LATS KO comparten muchos programas transcripcionales comunes, pero también algunos distintos

Para dilucidar los programas transcripcionales estimulados por las células YAP- o TAZ-predominantes y obtener información sobre los mecanismos diferenciales por los cuales se expanden en el hígado, realizamos un secuenciamiento de ARN masivo (RNA-seq) en hepatocitos purificados de hígados de control, YAP-Tg y LATS KO (Fig. 2A). Tres semanas después del tratamiento, clasificamos los hepatocitos del hígado mediante digestión enzimática y purificando las células Live+tdTomato+ mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se generaron y analizaron bibliotecas de RNA-seq masivo a partir de estos ratones utilizando criterios estrictos (cambio de pliegue logarítmico > 1,5, valor q < 0,001; Fig. 2B). Con este método, identificamos genes comunes (104 genes, 35,6%), YAP-Tg (172 genes, 58,9) y LATS KO (15 genes, 5,1) que probablemente se expresan de forma común o única en estos tratamientos.

Entre los genes expresados diferencialmente en los hígados YAP-Tg/LATS KO en comparación con el control, se encontraron muchos genes diana de la vía Hippo bien documentados (Fig. 2C, común), incluidos Ctgf, Cyr61, Nuak2 y Tgfb2. En nuestro conjunto de genes comunes, identificamos Anln y Kif23 como genes con expresión aumentada, genes que se han informado recientemente como genes diana específicos de TAZ (^[27]). Los hepatocitos LATS KO expresaron Ctla4 y Tigit (Fig. 2C, específico de LATS KO), genes asociados con la promoción del silenciamiento inmunitario mediante la regulación a la baja de las células T CD8+ (^[28]). En contraste, los hepatocitos YAP-Tg expresaron varios genes asociados con la activación de la señalización de los interferones, incluidos Irf9, Isg15 y Igtp (Fig. 2C, específico de YAP-Tg).

Para determinar si programas génicos específicos se activan preferentemente en los hígados YAP-Tg o LATS KO, utilizamos el análisis de vías de Ingenuity (IPA). El análisis reveló varias vías de señalización relacionadas con las vías de activación de los interferones y la muerte celular que estaban más fuertemente asociadas con YAP-Tg en comparación con LATS KO (Fig. 2D). Entre ellas, destacan la necrosis mediada por RIPK1, la vía de señalización de la necroptosis y la señalización de los interferones. Estas vías sugieren un entorno inflamatorio exacerbado y posibles mecanismos de muerte celular relacionados con la expresión de YAP-Tg. Por el contrario, el análisis de los hígados LATS KO reveló un enriquecimiento de la señalización de la interleucina-10, una vía antiinflamatoria asociada con la regulación a la baja de las respuestas inmunitarias (^[29], ^[30]).

Para confirmar nuestros hallazgos, examinamos un conjunto de datos de RNA-seq independiente utilizando hepatocitos clasificados del hígado con sobreexpresión de YAP (ApoE-YAP) (^[31]) y LATS KO 1 semana después de la inducción (^[25]). Utilizando criterios similares a nuestro análisis de RNA-seq, identificamos una proporción comparable de genes que se agrupan en categorías comunes, ApoE-YAP y específicas de LATS KO (fig. S2A) en comparación con nuestro conjunto de datos. El IPA de este conjunto de datos reveló que el modelo ApoE-YAP se enriqueció con vías asociadas con la eliminación de células y la estimulación inmunitaria. En contraste, los hígados LATS KO mostraron un enriquecimiento de las vías relacionadas con el silenciamiento inmunitario (fig. S2, B y C). En conjunto, estos datos sugieren que las células YAP- y TAZ-predominantes dirigen patrones de expresión distintos. Las células YAP-Tg expresan genes asociados con un mayor reclutamiento y activación de las células inmunitarias innatas y adaptativas, lo que sugiere una respuesta inmunitaria robusta que podría ralentizar su crecimiento (^[32]–^[37]), mientras que las células LATS KO expresan genes asociados con el silenciamiento inmunitario.

El RNA-seq de un solo núcleo de YAP-Tg y LATS KO revela patrones distintos de remodelación celular

Para obtener una comprensión más profunda de los comportamientos celulares que se desarrollan en los ratones YAP-Tg y LATS KO, realizamos un secuenciamiento de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) en muestras de hígado de control (n = 2), LATS KO (n = 4) y ratones YAP-Tg (n = 5) (Fig. 3A). Se recuperaron un total de 45.739 núcleos, lo que permitió identificar 12 grupos principales (Fig. 3B). Entre estos núcleos, distinguimos las principales poblaciones de células hepáticas, incluidos los colangiocitos, los hepatocitos, las células endoteliales, los fibroblastos y las células inmunitarias. Pudimos definir las tres categorías principales de hepatocitos (periportal, mediozonal y pericentral) mediante la expresión de varios genes marcadores bien conocidos (Fig. 3B y fig. S3A). Clasificamos un pequeño subconjunto de células como "células madre hepáticas" debido a su expresión de genes de colangiocitos y hepatocitos periportales, una población de transición probable entre las principales células epiteliales del hígado. En los controles, estas células representaron el 5,1% de todas las células identificadas (Fig. 3, B a D, y tabla S1).

La activación de YAP en los hepatocitos tiene como resultado cambios profundos en la proporción de células epiteliales e inmunitarias del hígado. El número y la proporción de células madre hepáticas en los ratones YAP-Tg aumentaron (22,9%) con una disminución concomitante en la proporción de células identificadas como hepatocitos periportales (13,5%) en comparación con los controles (47,4%). En los ratones YAP-Tg, identificamos una nueva población celular que designamos como "células madre hepáticas inducidas" (iHepSCs; 3,1%). Estas células no estaban presentes en los controles y compartían características de los colangiocitos y las células madre hepáticas. Estas células eran altamente proliferativas, como lo demuestra la expresión de Mki67, y exhibían marcadores de la plasticidad de las células madre del cáncer hepático, como Foxm1 (fig. S3A) (^[38]). La proporción de colangiocitos también aumentó notablemente en el modelo YAP-Tg (18,7%) en comparación con los controles (2%). En comparación, la proporción de células epiteliales en los hígados de control y LATS KO es muy similar (Fig. 3D). Las iHepSCs estaban presentes en los hígados LATS KO (0,5%), pero constituían una pequeña proporción de estos hígados y eran varias veces menores que en el modelo YAP-Tg.

Para investigar más a fondo cómo YAP o TAZ influyen en las decisiones del destino de las células hepáticas, aplicamos el análisis de trayectoria de Monocle3 (^[39], ^[40]) a nuestro conjunto de datos de snRNA-seq del parénquima, ordenando las células a lo largo de un eje de pseudotiempo. En los hígados de control, la mayoría de las células del parénquima estaban comprometidas con la línea de los hepatocitos, con una pequeña fracción que hacía la transición entre los destinos de los hepatocitos y los colangiocitos. Los hígados YAP-Tg demostraron una fuerte preferencia por que los hepatocitos hicieran la transición a colangiocitos, células madre hepáticas e iHepSCs y se alejaran del fenotipo de los hepatocitos periportales. En contraste, los hepatocitos en los hígados LATS KO mostraron trayectorias celulares similares a la condición de control (Fig. 3E). Estos hallazgos subrayan la tendencia de YAP a impulsar a los hepatocitos hacia un estado similar a un progenitor, un fenómeno que no se refleja en la expresión de TAZ.

Hubo cambios notables en las poblaciones de células no parenquimatosas de los hígados YAP-Tg y LATS KO en comparación con los controles, en particular la fracción de células inmunitarias. Las células inmunitarias representaron el 17,6 y el 14,7% de los hígados YAP-Tg y LATS KO, respectivamente, mientras que los controles mostraron un 10% (Fig. 3C). Por inmunofluorescencia, YAP-Tg (48,9 células CD45+ por HPF, P < 0,0001) tuvo la mayor proporción de reclutamiento de células inmunitarias, seguido de LATS KO (26,7 células CD45+ por HPF, P < 0,001) y luego controles (10,4 células CD45+ por HPF; fig. S3, C y D). Este cambio también se reflejó cuando se realizó una subclasificación de las células que expresan Ptprc (es decir, CD45) de nuestro conjunto de datos. Identificamos varios tipos comunes de células inmunitarias (fig. S3, B y E), como las células de Kupffer (KC), los macrófagos, los monocitos, las células dendríticas y las células B y T, según los genes marcadores inmunitarios comúnmente expresados (^[41], ^[42]). Los monocitos Ly6cHi se enriquecieron tanto en los hígados YAP-Tg (10,2%) como en los hígados LATS KO (6,7%) en comparación con los controles (0,6%), pero estuvieron presentes preferentemente en los hígados YAP-Tg. Los marcadores de la actividad de las células T reguladoras, incluidos Foxp3, Ctla4, Il2ra y Ikzf2, se enriquecieron en los hígados LATS KO, lo que respalda un entorno antiinflamatorio en este contexto (fig. S3F).

Utilizando CellChat (^[43]), un algoritmo de aprendizaje automático acoplado a una base de datos conocida de ligandos y receptores, evaluamos las posibles interacciones célula-célula en el contexto de estas condiciones. En los hígados YAP-Tg, la mayoría de las interacciones intercelulares se originaron en las células madre hepáticas, las iHepSCs y los colangiocitos. Estas poblaciones participan en una extensa señalización con las KC, los macrófagos monocíticos (Μϕ) y las células T y B. La intensidad y la frecuencia de estas interacciones predichas se produjeron a una tasa más alta en los hígados YAP-Tg que en las condiciones de control o LATS KO (Fig. 3F).

Varias vías identificadas por CellChat, que son consistentes con nuestro fenotipo, incluyen la señalización del factor estimulante de colonias 1 (Csf1), un factor quimiotáctico de monocitos/macrófagos bien caracterizado que promueve su supervivencia, proliferación y diferenciación (^[44], ^[45]). Csf1 y su receptor, Csf1r, estaban ausentes en los hígados de control, se enriquecieron significativamente en los hígados YAP-Tg y aumentaron moderadamente en los hígados LATS KO (Fig. 3G, CSF). La señalización de Egfr y Notch siguió una tendencia similar a la de Csf1. Estas vías son particularmente relevantes con respecto al fenotipo proinflamatorio de los hígados YAP-Tg; Egfr está asociado con el reclutamiento y la activación de macrófagos (^[46], ^[47]), mientras que la señalización Jag1- Notch2 promueve un fenotipo de macrófagos proinflamatorio (^[48], ^[49]). La señalización de la galectina a través de Lgals9 y Cd44 estaba ausente en los hígados YAP-Tg, presente en los controles y enriquecida en los hígados LATS KO. La señalización de la galectina promueve la tolerancia inmunitaria y mantiene la homeostasis hepática al equilibrar las respuestas inmunitarias (^[50]).

Estos análisis implican que los YAP-Tg y LATS KO hepáticos conducen a niveles similares de proliferación, pero difieren en su capacidad para transdiferenciar las células afectadas. YAP-Tg influye en los hepatocitos para que favorezcan un estado celular similar a un progenitor en comparación con las células LATS KO. Además, YAP-Tg impulsa un mayor reclutamiento de macrófagos y activación inflamatoria, mientras que las células LATS KO están asociadas con la señalización inmunitaria antiinflamatoria. En conjunto, estas actividades probablemente conducen a la eliminación de las células YAP-Tg por el sistema inmunitario, a pesar de los niveles de proliferación similares entre estos dos estados.

Los monocitos y las células T se reclutan rápidamente en los hígados YAP-Tg

Para comprender las complejas interacciones espaciales intercelulares que se infieren del análisis de secuenciación de snRNA, aplicamos la hibridación in situ por fluorescencia con múltiples sondas y alta robustez contra errores (MERFISH), un método de transcriptómica espacial de alta resolución que permite la imagen directa de las especies de ARN dentro de su entorno tisular nativo (^[51], ^[52]). Nuestro conjunto de sondas de 503 genes (tabla S2) se dirigió a identificar los principales tipos de células, incluidos los colangiocitos, los hepatocitos, las células endoteliales, los fibroblastos y las células inmunitarias. Este enfoque nos permitió resolver espacialmente las distribuciones de los transcritos en los puntos de tiempo de control, 1 y 4 semanas de los tratamientos YAP-Tg y LATS KO (fig. 4A y fig. S4A). Identificamos más de 2,19 millones de células para el análisis. Identificamos 12 grupos transcripcionalmente distintos que se validaron con respecto a nuestro conjunto de datos de secuenciación de snRNA utilizando los principales genes marcadores (fig. 4, de la A a la C, y fig. S4B).

Como se anticipó, los hígados de control exhibieron una arquitectura normal con una zonificación clara y una mínima infiltración inmune (fig. 4A, control). Los hepatocitos se pudieron agrupar en sus principales subtipos mediante la expresión de los genes marcadores canónicos: periportal (Hal, Sds y Cyp2r2), mediozonal (Igfbp2) y pericentral (Oat, GluI y Cyp2a5). Las células madre hepáticas se caracterizaron por una mezcla de marcadores de hepatocitos y colangiocitos periportales (Sox9 y Notch2), sin una alta expresión génica que represente el compromiso del destino de los colangiocitos (Krt7 y Krt19). En los controles, las células madre hepáticas representaron el 0,5% de todas las células. Sin embargo, tan pronto como 1 semana después de la inducción, los hígados YAP-Tg estuvieron dominados por las células madre hepáticas (54,2%) que se distribuyeron ampliamente por todo el tejido y persistieron a las 4 semanas después de la inducción (37%; fig. 4, A y D, YAP-Tg; y tabla S3). Esto parecía ocurrir a expensas de todos los principales subtipos de hepatocitos, ya que todos estos tipos de células se redujeron en general en comparación con los controles (fig. 4D y tabla S3). Las células madre hepáticas en los hígados LATS KO representaron una pequeña proporción del hígado en comparación con YAP-Tg. Representaron el 0,6% de las células a la semana 1 y el 5,6% a las 4 semanas.

Las iHepSCs también se identificaron mediante MERFISH en este conjunto de datos, aunque a una tasa mucho menor que mediante la secuenciación de snRNA. Estas células tenían la expresión más alta de Ki67 de todos los tipos de células, similar al conjunto de datos de secuenciación de snRNA. Nuestro conjunto de sondas MERFISH no contenía Foxm1, que parece ser un marcador característico de este tipo de células, y esto puede sugerir que algunas células madre hepáticas son células clasificadas erróneamente. A pesar de estas limitaciones, las iHepSCs estaban ausentes en los controles, surgieron en los hígados YAP-Tg de la semana 1 (1,2%) y aumentaron modestamente a las 4 semanas (2,1%). En contraste, las iHepSCs fueron del 0,1% a la semana 1 y del 1,6% a las 4 semanas en los hígados LATS KO.

Teniendo en cuenta la distribución de estas células, nos preguntamos si existían cambios en la composición del vecindario celular local entre las condiciones de control, YAP-Tg y LATS KO. Aplicamos una estrategia que describimos previamente para examinar las frecuencias del vecindario celular local (^[53]). Utilizando las coordenadas espaciales de cada célula etiquetada, calculamos la frecuencia de un tipo de célula dado alrededor de un tipo de célula de referencia de interés. Estos pares de tipos de células nos permiten detectar cambios entre las condiciones a la escala del microambiente y comprender la dinámica local que potencialmente media las interacciones célula-célula (fig. S4C). Los cambios más profundos en las asociaciones de tipos de células se produjeron entre las poblaciones epiteliales en expansión y las células inmunitarias en las condiciones YAP-Tg y LATS KO. Centramos nuestro análisis posterior en las interacciones epitelio-células inmunitarias (fig. 4, D y E) para proporcionar información sobre las células de referencia y las células vecinas en estas condiciones.

En los controles, las células madre hepáticas representaron una población rara y rara vez se colocalizaron con los tipos de células inmunitarias de interés (0 a 7%). En YAP-Tg a la semana 1, la frecuencia con la que los monocitos se asocian con las células madre hepáticas aumentó del 3% en los controles al 44% (P = 5,69 × 10−35). A las 4 semanas, se colocalizan en un 34% (P = 5,89 × 10−47). En los hígados LATS KO, estas células se colocalizan con frecuencias comparativamente más bajas (4% a la semana 1 y 17% a las 4 semanas). Al comparar entre las condiciones YAP-Tg y LATS KO, estos tipos de células se asocian con mayor frecuencia a la semana 1 (P = 3,11 × 10−45) y a las 4 semanas (P = 0,00) en la condición YAP-Tg.

Se observaron tendencias similares al comparar las asociaciones de otros tipos de células epiteliales que surgen en las condiciones YAP-Tg y LATS KO (es decir, iHepSC y colangiocitos) con las células inmunitarias (fig. 4E). Las asociaciones más significativas entre las células inmunitarias y las células epiteliales fueron más altas en los hígados YAP-Tg, lo que sugiere que la sobreexpresión de YAP es consistente con una infiltración inmune relativamente mayor. La proximidad de estas células inmunitarias a las células madre hepáticas, las iHepSCs y los colangiocitos implica una mayor probabilidad de comunicación cruzada celular que respalda el análisis CellChat de la secuenciación de snRNA.

Las células YAP-Tg y LATS KO promueven un entorno inmunitario distintivo asociado con la eliminación celular o la supresión inmune

Dado que el reclutamiento de células inmunitarias y la interacción con las células activadas por YAP-Tg y LATS KO parecen ser críticos para su persistencia a largo plazo, aislamos las células CD45+ mediante citometría de flujo de los hígados YAP-Tg (n = 2) o LATS KO (n = 2) 3 semanas después de la activación genética. A partir de estas células inmunitarias clasificadas, generamos bibliotecas de secuenciación de scRNA para el análisis (fig. 5A). De esta manera, capturamos un mayor número de células inmunitarias y se identificó una mayor proporción de transcritos celulares de estas células, particularmente los transcritos citoplasmáticos que se pierden en la secuenciación de snRNA.

Después del filtrado y la agrupación, obtuvimos 40 575 células individuales de estas dos condiciones para el análisis. Se identificaron doce grupos celulares principales, como las células B, T, de células T asesinas naturales (NKT), neutrófilos, monocitos, células dendríticas derivadas de monocitos (MoKCs) y macrófagos derivados de monocitos (MoMacs) a través de este proceso. Se identificó un pequeño pero distinto grupo de células altamente proliferativas presente en ambos entornos que etiquetamos como progenitores hematopoyéticos (Cd34HiGata2HiCd34Hi). En este conjunto de datos, no identificamos células dendríticas en ninguna de nuestras poblaciones YAP-Tg o LATS KO. Los únicos grupos identificados con marcadores de células dendríticas bien aceptados (es decir, Clec4f, Timd4 y Vsig4) también contenían expresión génica asociada con el reclutamiento de monocitos (es decir, Ccr2, Cx3cr1 y Ly6c2) (^[42], ^[54]). Es posible que existan poblaciones de células dendríticas que expresen solo marcadores de células dendríticas dentro de estos hígados, pero probablemente estén enmascaradas dentro de la gran proporción de monocitos que se reclutan en los hígados YAP-Tg y LATS KO y que gradualmente adoptan características de células dendríticas. Los hígados YAP-Tg demostraron una mayor proporción de células T que LATS KO (28 frente a 21,7%, respectivamente), particularmente células T ingenuas (11,8 frente a 2,5%, respectivamente) (fig. 5, B y C, y fig. S5A). Dado que los hígados YAP-Tg reclutan un 35,5% más de células inmunitarias al hígado que LATS KO (fig. S3, C y D), esta diferencia es particularmente notable.

Luego, utilizamos CellChat para determinar si, dentro de las células inmunitarias YAP-Tg y LATS KO, existía una señalización significativa entre células que pudiera respaldar nuestra hipótesis de que YAP-Tg promueve la señalización proinflamatoria, mientras que LATS KO promueve un entorno inmunosupresor. La señalización proinflamatoria estaba presente en ambas condiciones, pero la frecuencia y la complejidad de la posible señalización entre células dentro del compartimento inmunitario YAP-Tg para vías como el factor de necrosis tumoral-α y el interferón-γ fueron más prevalentes. En contraste, las posibles interacciones para la señalización inmunosupresora Cd80/Ctla4 ocurrieron con mayor frecuencia en los hígados LATS KO (fig. 5D).

A partir de los datos de secuenciación espacial, las células hepáticas activadas en los hígados YAP-Tg y LATS KO aumentan la frecuencia de su interacción con las células mieloides y las células T. Para comprender los posibles cambios en estas poblaciones y su actividad, examinamos los compartimentos de células mieloides y células T del experimento más grande, volviéndolos a agrupar para generar subdivisiones más finas a partir de las cuales comprender la dinámica compleja dentro de los hígados de estos animales. El conjunto de datos de células mieloides incluyó 14 290 células, divididas en 14 grupos (fig. 5, E y F, y fig. S5B). Los hígados YAP-Tg demostraron una mayor proporción de neutrófilos-1/-2 que LATS KO (46,3 frente a 27,0%, respectivamente), grupos que expresan altos niveles de Il1β y Tnfα. Los grupos MoKC se enriquecieron modestamente en la condición YAP-Tg (24,9 frente a 20,7%), particularmente MoKC1 (15,9 frente a 0,7%). Estos grupos expresan altos niveles de complemento (C1qa, C1qb y C1qc), lo que sugiere que pueden estar fagocitando células diana (^[55], ^[56]). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de la población MoKC1 mostró que los programas de genes como la muerte celular y la unión al receptor de quimiocinas CCR5 se favorecieron en la condición YAP-Tg, mientras que los programas asociados con la curación de heridas y el metabolismo se favorecieron en LATS KO (fig. S6A).

El subconjunto de células T contenía 8413 células que formaron 10 grupos distintos (fig. 5, F y G, y fig. S5C) después de volver a agruparlas. Como se mencionó anteriormente, las células T ingenuas dominaron la población de células T YAP-Tg que se amplificó después de la separación de las poblaciones de células B y mieloides (34,9 frente a 6,3%). La reagrupación permitió la identificación de células NKT invariantes (iNKT) y células T efectoras Cd8 que no eran aparentes en el conjunto de datos inmunitario más grande. Los hígados YAP-Tg expresaron una alta proporción de iNKT (27,3 frente a 8,8%) y células T efectoras CD8 (12,9 frente a 4,7%). Se sabe que estos tipos de células median la muerte celular (^[57]–^[59]), y su mayor prevalencia en las condiciones YAP-Tg sugiere que puede desempeñar un papel en su eliminación. Utilizando GSEA para anotar los conjuntos de genes asociados con los subconjuntos iNKT2 y células T efectoras Cd8, identificamos programas como el reclutamiento inmunitario, la activación y la regulación del proceso de apoptosis de los hepatocitos asociados con YAP-Tg. Al igual que el análisis de células mieloides, LATS KO se asoció con conjuntos de genes metabólicos y la regulación positiva de la proliferación de hepatocitos (fig. S6B). En conjunto, las células YAP-Tg sesgan el entorno inmunitario hacia un entorno proinflamatorio preparado para mediar la muerte celular.

La inhibición mediada por CCR2 promueve la expansión clonal de las células YAP-Tg

Para explorar el papel del reclutamiento de monocitos en el crecimiento de las células YAP-predominantes, tratamos a los ratones YAP-Tg con un vehículo o un antagonista de CCR2 (CCR2i). Se ha establecido que CCR2 desempeña un papel en su función como quimioatrayente de monocitos y es necesario para el reclutamiento de monocitos/macrófagos inflamatorios de la sangre a los sitios de los tejidos locales (^[60], ^[61]). Se inyectó a los animales YAP-Tg con una sola dosis baja de AAV-TBG-Cre y se les administró agua con doxiciclina durante un período de 4 semanas para inducir la sobreexpresión de YAP en un pequeño número de hepatocitos. Durante el curso de 4 semanas, los animales fueron tratados con un vehículo (control) o un inhibidor de CCR2 (CCR2i; fig. 6A). Los hígados de control y CCR2i no difirieron significativamente en la morfología general o el porcentaje de hígado/peso corporal (fig. S7, A y B). El marcador de macrófagos F4/80 reveló una reducción significativa esperada en el grupo CCR2i con un promedio de 48,7 células por campo de alta potencia (HPF) en comparación con un promedio de 96,8 células por HPF en los controles (fig. 6, B y C; P < 0,01). Luego, aislamos las células inmunitarias del hígado de estos hígados y las analizamos mediante citometría de flujo. Agrupamos las células dendríticas del hígado (Live+CD45+Ly6G−F4/80+) y examinamos su estado de activación mediante la proporción de macrófagos que muestran Ly6cHiMHClow (fig. 6D) (^[18], ^[62]). Hubo una ligera disminución de los macrófagos activados en los hígados tratados con CCR2i (fig. 6E; 51,2 frente a 38,6%, P = no significativo), lo que es consistente con nuestros hallazgos anteriores. El examen microscópico de estos hígados reveló marcadas diferencias en el número de células tdTomato+ por campo. En los controles, hubo 9,5 células por HPF en comparación con CCR2i con 60,2 células por HPF (fig. 5, D y E; P < 0,05). Estos hallazgos implican que el reclutamiento de monocitos inflamatorios es un regulador negativo del crecimiento y la persistencia de los clones inducidos por YAP-Tg.

Los cánceres TAZHigh se asocian con la duración de supervivencia más corta

Los clones epiteliales con predominio de YAP y TAZ evocan distintas respuestas inmunitarias en ratones, lo que provoca la eliminación preferencial de los clones YAP. A continuación, consideramos si se produce un fenómeno similar en el cáncer humano y si el predominio de YAP o TAZ conduce a diferencias en los resultados de los pacientes. Utilizando información clínica de pacientes y sus datos de secuenciación de ARN masivo asociados del The Cancer Genome Atlas (TCGA) (^[63], ^[64]), estratificamos a los sujetos en grupos en función de la expresión relativa normalizada de YAP y TAZ en sus tumores (30% superior o 30% inferior).

Los pacientes con CRC se estratificaron en tres grupos: YAPAltoTAZBajo (YAPAlto), YAPBajoTAZAlto (TAZAlto) y YAPBajoTAZBajo (YTBajo). Los pacientes con CRC YAPAlto tuvieron una tasa de supervivencia a 5 años del 67%, mientras que los pacientes con CRC TAZAlto no sobrevivieron hasta los 5 años. Los pacientes TAZAlto tuvieron un tiempo de supervivencia medio de 36,5 meses. A los 3 años, el 100% de los grupos de CRC YAPAlto y YTBajo sobrevivieron, en comparación con el 58% del grupo de CRC TAZAlto (P = 0,043; Fig. 7A). Se observaron tendencias similares en una cohorte de HCC. La probabilidad de supervivencia de los pacientes con HCC TAZAlto fue del 0% a los 5 años, pero superior al 59% en los grupos YAPAlto y YTBajo (P = 0,38; Fig. 7B).

Luego, investigamos si, en el CRC, estaban presentes programas inmunomoduladores en los tumores de los pacientes YAPAlto y/o TAZAlto, como en nuestros modelos de ratón. GSEA utilizando vías de Gene Ontology (GO) reveló que el grupo YAPAlto se enriqueció con programas relacionados con la muerte celular y la estimulación inmunitaria, como la eliminación de células apoptóticas, la activación de leucocitos mieloides y la activación de células T (Fig. 7C). Este patrón no se reflejó en el grupo TAZAlto, que se enriqueció con vías relacionadas con el metabolismo de la energía y el colesterol. En general, estos hallazgos sugieren que un programa de expresión génica inmunostimulante está asociado con los cánceres YAPAlto, lo que conduce a una mejora comparativa de la supervivencia de los pacientes en comparación con los cánceres TAZAlto.

DISCUSIÓN

La vía de señalización de Hippo se descubrió originalmente a través de cribados genéticos y bioquímicos para identificar reguladores de la proliferación celular (^[65]–^[67]). A través de este proceso, se reveló que yorkie actúa como un regulador principal de la vía. Los genes se duplican comúnmente a través de la evolución, pero preservar estos genes en su estado original es desventajoso. Los genes duplicados deben divergir para asumir nuevos roles esenciales, lo que justifica su mantenimiento. En los vertebrados, YAP y TAZ surgieron de yorkie (^[3]) y se utilizan indistintamente, porque se pueden intercambiar en muchos ensayos celulares. Esta uniformidad percibida enmascara diferencias potencialmente importantes entre los dos.

Aquí, combinamos la sobreexpresión génica dirigida y el rastreo de linaje con un enfoque multiómico para descubrir características no redundantes de YAP y TAZ in vivo. Utilizando el hígado de ratón como modelo, aumentamos la expresión de YAP o TAZ en hepatocitos adultos. Se acepta comúnmente que el KO de LATS utilizado en este trabajo es un modelo de los efectos de la sobreexpresión de YAP/TAZ (^[19]–^[22]). Nuestro descubrimiento de que, en el contexto hepático, los hepatocitos recombinados con KO de LATS expresan predominantemente TAZ y reducen la expresión de YAP después de 2 semanas fue inesperado. Los estudios anteriores se centraron principalmente en el aumento inicial de la proliferación que proporcionan YAP/TAZ, por lo que es posible que no se haya apreciado completamente la posibilidad de que YAP estuviera ausente en momentos posteriores. Reconociendo que YAP es mucho más grande que TAZ y contiene varios sitios de fosforilación y dominios que no están presentes en el otro (^[15], ^[68]), es más fácil apreciar que estas moléculas pueden estar reguladas de manera diferente para cumplir funciones distintas. Queda por determinar si este efecto del KO de LATS sobre la expresión de YAP y TAZ es consistente en otros contextos.

Este trabajo demuestra que los clones con predominio de TAZ producidos por el KO de LATS dan como resultado un notable fenotipo de crecimiento morfológico que no se reflejó cuando generamos clones similares impulsados por YAP. Varios mecanismos están en juego en el desarrollo de estas diferencias de crecimiento. En primer lugar, las células con predominio de YAP pierden rápidamente su identidad de hepatocito, lo que provoca una reprogramación transcripcional hacia un destino similar a una célula madre, caracterizado por la expresión de marcadores de la estirpe hepatobiliar, como Sox9 y Krt8, además del aumento de la expresión de Foxm1. Foxm1 regula los genes implicados en la replicación del ADN y la proliferación celular, mientras que su aumento en el cáncer lo ha implicado como un posible oncogén (^[69]–^[72]). Este cambio de destino se asoció con la expresión de muchos genes asociados con el interferón [es decir, factor regulador del interferón 9 (IRF9), gen estimulado por el interferón 15 (ISG15) y GTPasa inducida por el interferón gamma (IGTP)], que pueden estar estimulando una respuesta antigénica y la producción de varios ligandos (es decir, Jag1, Csf1 y Egf), que podrían reclutar y activar monocitos derivados de la sangre en el hígado. El aumento de este compartimento epitelial similar a una célula madre coincidió con un compartimento inmunitario expandido y evidencia de una mayor comunicación célula-célula con monocitos, células de Kupffer y células T.

En contraste, los clones con predominio de TAZ no sufrieron un cambio de destino y, en cambio, expresaron genes asociados con un fenotipo inmunosupresor (es decir, Ctla4 y Tigit). Clásicamente, Ctla4 se expresa en las células T reguladoras (células Treg) y en las células T activadas para reducir las respuestas inmunitarias (^[25]). También se encuentra en las células tumorales (^[27]), donde su secreción de Ctla4 soluble restringe a las células T a estados no citotóxicos (^[69]–^[72]). De manera similar, la expresión intrínseca de Tigit por las células tumorales de ratón promueve la inhibición de las células asesinas naturales y las células T (^[73], ^[74]), un mecanismo que probablemente esté en juego en las células con predominio de TAZ. Apoyando estos hallazgos, se observó la expresión de marcadores de células Treg (es decir, Foxp3, Il2ra y Ctla-4) dentro de la población más amplia de células T en los hígados que sobreexpresan TAZ nuclear. Además, observamos un aumento de la expresión de marcadores de células Treg efectoras (es decir, Icos, Pd-1 y Cd44), un perfil transcripcional que se ha demostrado que infiltra los tumores y promueve su crecimiento (^[75]).

De las células inmunitarias reclutadas por estos modelos, nos centramos en los monocitos y los macrófagos que son importantes para remodelar el microambiente celular (^[76]–^[78]). Tanto el modelo YAP-Tg como el modelo de KO de LATS se asocian con un aumento de la infiltración inmunitaria, pero el modelo YAP-Tg tuvo una proporción general más alta de reclutamiento de células inmunitarias. La reducción aguda del reclutamiento de monocitos demostró una mejora significativa en el crecimiento estimulado por YAP, lo que apoya su papel como un freno clave que limita el crecimiento celular excesivo. En conjunto, estos hallazgos sugieren que las células inmunitarias reclutadas actúan en conjunto para limitar la expansión clonal de YAP y respaldan la noción de que la expansión clonal con predominio de TAZ se ve favorecida por el desarrollo de un microambiente inmunosupresor.

El mecanismo por el cual se activan o desactivan los objetivos comunes con predominio de YAP o TAZ sigue siendo una pregunta sin respuesta. Varias partes de estas moléculas, como los dominios de unión a TEAD y WW de estas moléculas, están muy conservadas, pero otras partes, como las partes desordenadas de estas moléculas, muestran una divergencia significativa (^[15], ^[68]). Se cree que las proteínas con regiones desorganizadas, como YAP/TAZ, participan en interacciones proteína-proteína complementarias para generar estructuras sin membranas que organizan las funciones biológicas. También denominado condensados ​​bimoleculares o separación de fases, es un mecanismo descrito recientemente para guiar la especificidad transcripcional (^[79], ^[80]). Se ha informado que tanto YAP como TAZ participan en este proceso (^[81], ^[82]). Los condensados ​​de fase de YAP incluyen TAZ (^[81]), pero los condensados ​​de fase de TAZ pueden excluir a YAP (^[82]). Comprender cómo se produce esta selectividad y si impulsa los fenotipos descritos anteriormente es una estrategia clave para avanzar en la terapia regenerativa/oncológica.

Nuestro hallazgo de que la activación de YAP y TAZ impulsa entornos inmunitarios distintos in vivo y se asocia con una supervivencia diferencial de los pacientes en los cánceres YAPAlto y TAZAlto sugiere que se debe investigar más a fondo las propiedades epiteliales y la inmunorreactividad que estas moléculas estimulan. Observamos la presencia de Ctla4 y Tigit en el contexto del KO de LATS. ¿Los tumores con predominio de TAZ responderían a las moléculas de control inmunitario que se dirigen a esta o moléculas similares? ¿Es beneficioso en el CRC o HCC inducir la expresión de YAP cuando la expresión de esta molécula es baja? ¿Conduciría a un entorno inmunostimulante que conduzca a su eliminación? Queda por examinar si los hallazgos que describimos aquí se pueden replicar en cohortes más grandes o independientes.

Existe un interés significativo en el desarrollo de estrategias para aumentar la actividad de YAP/TAZ (^[83]) y dirigirse a su actividad transcripcional descendente (^[84]–^[86]). Ahora, estos enfoques se dirigen al dominio de unión a TEAD común y bien ordenado y están avanzando rápidamente a través de los ensayos clínicos. A partir de este trabajo, el desarrollo de nuevos compuestos discriminatorios para modular la actividad de YAP-TEAD o TAZ-TEAD puede ser una estrategia terapéutica complementaria independiente para el cáncer.

MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas de ratones

Se utilizaron C57BL/6J, LATS1/2fl/fl (^[87]) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) y Yap-S127A inducible con tetraciclina (TetOYAP/YAP-Tg) (^[17]) en este estudio. Los experimentos comenzaron a las 8-12 semanas de edad. Se realizó un análisis de secuenciación solo con ratones machos. Todos los procedimientos y protocolos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale bajo el protocolo n.º 2023-20348.### Administración de genes AAV, sobreexpresión de YAP y KO de LATS1/2

El virus asociado a adenovirus (AAV8)-globulina de unión a hormonas tiroideas (TBG)-recombinasa de ciclización (Cre) (AAV-Cre; Addgene) se administró a los genotipos indicados por vía retro-orbital a 1011 unidades formadoras de placa (UFP) por ratón. Para inducir la expresión de TetOYAP, 3 días después de las inyecciones de AAV-Cre, a los ratones se les administró doxiciclina (1 mg/ml) en el agua de beber ad libitum. Estos ratones se denominan "YAP-Tg" en el texto. Para eliminar LATS1/2 de los ratones, se administró una dosis similar de AAV-Cre a los ratones LATS1/2fl/fl.### Preparación de tejidos, inmunohistoquímica e hibridación in situ de ARN

El tejido se fijó durante la noche en formaldehído tamponado al 10% (Fisher Scientific) y se incluyó en parafina para su seccionamiento. Para la tinción con rojo de picrosirius, las secciones de tejido se rehidrataron e incubaron con 0,1% de Rojo Directo (MilliporeSigma) y 0,08% de Verde Rápido FCF (MilliporeSigma) en ácido pícrico saturado (MilliporeSigma) durante 1 hora. Para la inmunohistoquímica, las secciones de tejido se rehidrataron y se utilizó una solución de desmascaramiento basada en citrato (Vector Labs) antes de la tinción. Las imágenes se tomaron con un microscopio Revolve (Echo).### Análisis de ARN-seq de ApoE-YAP versus KO de LATS publicado anteriormente

Los datos se descargaron del Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE211459 (hígado, hiperactivación de Yap). Los datos de recuento sin procesar se descargaron del archivo complementario de GEO (GSE211459YapHyperCounts.txt.gz) y se cargaron en R. Los recuentos a nivel de gen se extrajeron del archivo complementario. Se asignaron etiquetas de grupo experimental (control, YAP-OE, LATS KO) a cada una de las muestras en función de la información de los metadatos. Para mejorar la compatibilidad de los datos con las herramientas de análisis posteriores, los símbolos de genes de ratón se convirtieron en ortólogos humanos utilizando la función convertmousetohumansymbols() del paquete nichenetr (^[88]). Los genes que no se pudieron convertir se excluyeron del análisis posterior. Para los genes con símbolos duplicados, se almacenó el símbolo más variable (basado en el rango intercuartílico) y se utilizó para el procesamiento posterior. La matriz de expresión limpia final se convirtió en valores numéricos, estableciendo los símbolos de genes como nombres de fila. La transformación voom del paquete limma (^[89]) se utilizó para normalizar los datos después de crear una lista DGE con el paquete edgeR (^[90]). Los datos normalizados se utilizaron luego para el análisis para generar mapas de calor y se aplicaron posteriormente a IPA para el análisis de enriquecimiento.

Preparación de la biblioteca scRNA-seq y análisis de datos

Se aislaron lóbulos individuales del hígado de ratón y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. El día del aislamiento de los núcleos, las muestras congeladas se dividieron suavemente con una hoja de afeitar para obtener pequeños fragmentos de aproximadamente 8 a 10 mm de diámetro. Se preparó el tampón de homogeneización (HB) según lo descrito (^[91]). La muestra se colocó en un tubo de 1,5 ml con 750 μl de HB [0,1% de Triton X-100, 1 μM de ditiotreitol, 242,25 mM de sacarosa, 24,23 mM de KCl, 4,85 mM de MgCl2, 9,69 mM de tris (pH 8,0)] y luego se homogeneizó cinco veces con un pistilo suelto y 10 veces con un pistilo apretado. Luego, la muestra se transfirió a un tubo nuevo y se añadió 250 μl de HB antes de la incubación sobre hielo durante 5 minutos. La muestra homogeneizada se filtró luego a través de un tamiz celular de 100 μm (Corning). El filtrado se pasó luego a través de la tapa del tamiz de 35 μm de un tubo de ensayo de poliestireno (Corning). La muestra se centrifugó a 500g durante 5 minutos a 4 °C. La purificación por gradiente de densidad se realizó con el medio de gradiente de densidad OptiPrep (Sigma-Aldrich).

Las muestras se fijaron y permeabilizaron utilizando el kit de fijación Evercode v2 de Parse Biosciences según las instrucciones del fabricante. Luego, las muestras se almacenaron a −80 °C hasta que se necesitaran para la preparación de la biblioteca. Las bibliotecas se prepararon utilizando un kit de codificación de transcriptoma completo Evercode v2 de Parse Biosciences según las instrucciones del fabricante, como se describe en el manual del usuario de Evercode v2.2.2. Las bibliotecas se secuenciaron en el Centro de Análisis del Genoma de Yale en el NovaSeqX, secuenciación de pares de extremos de 100 pares de bases. Los análisis estadísticos posteriores se realizaron mediante el paquete R Seurat. Los núcleos con más de 400 genes expresados y menos de 5000 recuentos se consideraron núcleos válidos para el análisis posterior. La normalización mediante SCTransform, la integración SCT, la reducción de dimensionalidad UMAP y el análisis de agrupación/anotación de genes se realizaron en las células válidas. Además, se aplicó el paquete R Monocle3 para construir trayectorias de un solo núcleo. Basándose en los datos procesados de Seurat, se infirió un gráfico de trayectoria y los núcleos individuales se ordenaron en una escala de tiempo pseudo.

Procesamiento de tejidos, preparación de muestras, imagen y análisis de datos para MERFISH

Toda la preparación de muestras MERFISH se realizó en condiciones libres de ribonucleasa (RNasa). Los hígados congelados se cortaron en criosecciones de 10 μm de espesor a −16 °C y se montaron en portaobjetos con cuentas MERSCOPE a temperatura ambiente (Vizgen). Después de la adhesión, las secciones se recongelaron durante 5 a 15 minutos y luego se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1× durante 15 minutos. Las secciones se lavaron tres veces con PBS 1× durante 5 minutos cada una y luego se almacenaron en etanol al 70% (EtOH) durante la noche a 4 °C para permeabilizar el tejido. Las secciones se almacenaron en EtOH al 70% durante un máximo de 3 semanas.

La preparación de la muestra se realizó utilizando el kit de preparación de muestras (Vizgen) y las instrucciones del fabricante de Vizgen para tejido no fijado. Primero, para la tinción de los límites celulares, las secciones se lavaron con PBS 1×, se incubaron en solución de bloqueo (inhibidor de RNasa, New England Biolabs) en el tampón de bloqueo premix de límites celulares (Vizgen) durante 1 hora a temperatura ambiente, se incubaron en solución de tinción primaria (mezcla de tinción primaria de límites celulares, Vizgen) en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con PBS 1× durante 5 minutos cada una en una plataforma de balanceo, se incubaron en solución de tinción secundaria [mezcla de tinción secundaria de límites celulares 3:100 (Vizgen) en solución de bloqueo] durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con PBS 1× durante 5 minutos cada una en una plataforma de balanceo, se fijaron en PFA al 4% diluido en PBS 1× durante 15 minutos y se lavaron dos veces con PBS 1× durante 5 minutos cada una. A continuación, las secciones se lavaron con el tampón de lavado de preparación de muestras (Vizgen), se incubaron en el tampón de lavado de formamida (Vizgen) durante 30 minutos a 37 °C y luego se incubaron en la mezcla de paneles de genes durante 42 a 46 horas a 37 °C. Las secciones se incubaron luego dos veces en el tampón de lavado de formamida durante 30 minutos cada una a 47 °C y se lavaron con el tampón de lavado de preparación de muestras durante al menos 2 minutos. Las secciones se recubrieron con solución de incrustación en gel [0,05% p/v de persulfato de amonio, 0,05% v/v de N,N,N′,N′-tetrametiletilendiamina en el premix de incrustación en gel (Vizgen)] y se incubaron a temperatura ambiente durante 1,5 horas, se aclararon en una concentración de 1:5 de proteinasa K en el premix de aclaración (Vizgen) a 37 °C y luego se almacenaron en proteinasa K 1:100 en el premix de aclaración a 37 °C durante la noche o durante un máximo de 7 días para eliminar los lípidos y las proteínas que puedan contribuir al ruido de fondo de la autofluorescencia.

Antes de la imagen, las secciones se lavaron dos veces con el tampón de lavado de preparación de muestras, se incubaron en 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y reactivo de tinción PolyT (Vizgen) durante 15 minutos en una plataforma de balanceo, se incubaron en el tampón de lavado de formamida durante 10 minutos y se lavaron nuevamente con el tampón de lavado de preparación de muestras.

La imagen se realizó en la plataforma MERSCOPE (Vizgen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras se cargaron en la cámara de flujo del instrumento y la región deseada para la imagen se seleccionó utilizando un mosaico de baja resolución de las tinciones DAPI y Poly-T. Luego, las muestras se obtuvieron imágenes de alta resolución con una pila z de siete planos y un espaciamiento de 1,5 μm entre los planos z adyacentes para capturar todo el espesor de 10 μm de las secciones de tejido. Luego, las muestras se obtuvieron imágenes automáticamente según los ajustes de imagen preestablecidos de MERSCOPE.

Se calculó el promedio del volumen mediano en todas las bibliotecas y se filtraron las células grandes con más de tres veces el volumen promedio. A continuación, se eliminaron los dobletes utilizando la herramienta Scrublet (^[92]). Luego, los datos procesados se analizaron aún más utilizando Seurat (^[93]). Por biblioteca, la matriz de recuento de genes por célula se normalizó, seguida del mapeo de referencia al conjunto de datos de snRNA-seq correspondiente para la anotación celular. Además, se realizó el análisis espacial de interacción célula-célula utilizando CellChat (^[43]) y el análisis de proximidad a nivel celular (^[53]). Brevemente, definimos un vecindario espacial celular como las células dentro de cinco veces la distancia mediana de las células vecinas por pares. Como resultado, por tipo de célula, se calcularon las proporciones de interacciones con todos los demás tipos de células.

Tratamiento de ratones con un antagonista de CCR2

A ratones adultos (de 6 a 8 semanas de edad) se les administró RS102895 (MedChemExpress) por sonda oral a una concentración de 10 mg/kg o el mismo volumen de vehículo (25% de dimetilsulfóxido en agua potable) diariamente durante 28 días. Los ratones se sacrificaron y se recolectaron y procesaron los hígados hasta 24 horas después de la administración final de fármaco/vehículo.

Análisis transcripcional de datos de supervivencia de pacientes de TCGA

Los datos de TCGA se recuperaron utilizando el paquete RTCGA (^[94]). Las muestras se estratificaron por expresión de YAP/TAZ, definiendo el 30% superior como alto y el 30% inferior como bajo. El análisis de supervivencia y los gráficos de Kaplan-Meier se generaron utilizando los paquetes R survival y survminer. La prueba de rango logarítmico de Kaplan-Meier se utilizó para comparar las curvas de supervivencia de los grupos YAPHigh, TAZHigh y YTLow. Los genes expresados diferencialmente se identificaron utilizando DESeq2 (^[95]) y se realizó el análisis de enriquecimiento de la vía GO con clusterProfiler (^[96]).

Líneas de ratones

Se utilizaron C57BL/6J, LATS1/2fl/fl (^[87]) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) y Yap-S127A inducible con tetraciclina (TetOYAP/YAP-Tg) (^[17]) en este estudio. Los experimentos comenzaron a las 8 a 12 semanas de edad. El análisis de secuenciación se realizó solo con ratones machos. Todos los procedimientos y protocolos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale bajo el protocolo número 2023-20348.

Administración de genes AAV, sobreexpresión de YAP y KO de LATS1/2

El virus adenoasociado (AAV8)-globulina de unión a hormonas tiroideas (TBG)-ciclo recombinasa (Cre) (AAV-Cre; Addgene) se administró a los genotipos indicados por vía retro-orbital a 1011 unidades formadoras de placa (UFP) por ratón. Para inducir la expresión de TetOYAP, 3 días después de las inyecciones de AAV-Cre, a los ratones se les administró doxiciclina (1 mg/ml) ad libitum en agua potable. Estos ratones se denominan “YAP-Tg” en el texto. Para eliminar LATS1/2 de los ratones, se administró una dosis similar de AAV-Cre a los ratones LATS1/2fl/fl.

Preparación de tejidos, inmunohistoquímica e hibridación in situ de ARN

El tejido se fijó durante la noche en formaldehído tamponado al 10% (Fisher Scientific) y se incrustó en parafina para la sección. Para la tinción con rojo picrosirius, las secciones de tejido se rehidrataron y se incubaron con 0,1% de Rojo Directo (MilliporeSigma) y 0,08% de Verde Rápido FCF (MilliporeSigma) en ácido picríco saturado (MilliporeSigma) durante 1 hora. Para la inmunohistoquímica, las secciones de tejido se rehidrataron y se utilizó la solución de desmascaramiento basada en citrato (Vector Labs) antes de la tinción. Las imágenes se tomaron con un microscopio Revolve (Echo).

Análisis de ARN-seq de datos publicados previamente de ApoE-YAP versus LATS KO

Los datos se descargaron del Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE211459 (hígado, hiperactivación de Yap). Los datos de recuento sin procesar se descargaron del archivo complementario de GEO (GSE211459YapHyperCounts.txt.gz) y se cargaron en R. Los recuentos a nivel de gen se extrajeron del archivo complementario. Se asignaron etiquetas de grupo experimental (control, YAP-OE, LATS KO) a cada una de las muestras en función de la información de los metadatos. Para mejorar la compatibilidad de los datos con las herramientas de análisis posteriores, los símbolos de genes de ratón se convirtieron en ortólogos humanos utilizando la función convertmousetohumansymbols() del paquete nichenetr (^[88]). Los genes que no se pudieron convertir se excluyeron del análisis posterior. Para los genes con símbolos duplicados, se almacenó el símbolo más variable (basado en el rango intercuartílico) y se utilizó para el procesamiento posterior. La matriz de expresión limpia final se convirtió en valores numéricos, estableciendo los símbolos de genes como nombres de fila. La transformación voom del paquete limma (^[89]) se utilizó para normalizar los datos después de crear una lista DGE con el paquete edgeR (^[90]). Los datos normalizados se utilizaron luego para el análisis para generar mapas de calor y se aplicaron posteriormente a IPA para el análisis de enriquecimiento.

Preparación de la biblioteca scRNA-seq y análisis de datos

Se aislaron lóbulos individuales del hígado de ratón y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. El día de la extracción de núcleos, las muestras congeladas se dividieron suavemente con una hoja de afeitar para obtener pequeños fragmentos de aproximadamente 8 a 10 mm de diámetro. Se preparó el tampón de homogeneización (HB) según lo descrito en ^[91]. La muestra se colocó en un tubo de 1,5 ml con 750 μl de HB [0,1% de Triton X-100, 1 μM de ditiotreitol, 242,25 mM de sacarosa, 24,23 mM de KCl, 4,85 mM de MgCl2, 9,69 mM de tris (pH 8,0)] y luego se homogeneizó cinco veces con un pistilo suelto y diez veces con un pistilo apretado. A continuación, la muestra se transfirió a un tubo nuevo y se añadió 250 μl de HB antes de la incubación en hielo durante 5 minutos. La muestra homogeneizada se filtró a través de un tamiz celular de 100 μm (Corning). El filtrado se pasó luego a través del tapón del tamiz de 35 μm de un tubo de ensayo de poliestireno (Corning). La muestra se centrifugó a 500g durante 5 minutos a 4 °C. Se realizó la purificación mediante gradiente de densidad con el medio de gradiente de densidad OptiPrep (Sigma-Aldrich).

Las muestras se fijaron y permeabilizaron utilizando el kit de fijación Evercode v2 de Parse Biosciences, según las instrucciones del fabricante. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta que se necesitaron para la preparación de la biblioteca. Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de codificación de transcriptoma completo Evercode v2 de Parse Biosciences, según las instrucciones del fabricante, como se describe en el manual del usuario de Evercode v2.2.2. Las bibliotecas se secuenciaron en el Centro de Análisis Genómico de Yale en el NovaSeqX, secuenciación de pares de bases de 100 pares. Los análisis estadísticos posteriores se realizaron con el paquete R Seurat. Los núcleos con más de 400 genes expresados y menos de 5000 recuentos se consideraron núcleos válidos para el análisis posterior. Se realizaron la normalización mediante SCTransform, la integración SCT, la reducción de dimensionalidad UMAP y los análisis de agrupación/anotación de genes en las células válidas. Además, se aplicó el paquete R Monocle3 para construir trayectorias de un solo núcleo. Basándose en los datos procesados de Seurat, se infirió un gráfico de trayectoria y los núcleos individuales se ordenaron en una escala de tiempo pseudo.

Procesamiento de tejidos, preparación de muestras, imagen y análisis de datos para MERFISH

Toda la preparación de muestras MERFISH se realizó en condiciones libres de ribonucleasa (RNasa). Los hígados congelados se cortaron en criosecciones de 10 μm de espesor a -16 °C y se montaron en portaobjetos con cuentas MERSCOPE a temperatura ambiente (T.A.) (Vizgen). Después de la adherencia, las secciones se recongelaron durante 5 a 15 minutos y luego se fijaron en un 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1× durante 15 minutos. Las secciones se lavaron tres veces con PBS 1× durante 5 minutos cada una y luego se almacenaron en etanol al 70% (EtOH) durante la noche a 4 °C para permeabilizar el tejido. Las secciones se almacenaron en EtOH al 70% durante un máximo de 3 semanas.

La preparación de la muestra se realizó utilizando el kit de preparación de muestras (Vizgen) y las instrucciones del fabricante de Vizgen para tejido no fijado. Primero, para la tinción de los límites celulares, las secciones se lavaron con PBS 1×, se incubaron en solución de bloqueo (inhibidor de RNasa, New England Biolabs) en el premix del tampón de bloqueo de límites celulares (Vizgen) durante 1 hora a temperatura ambiente, se incubaron en solución de tinción primaria (mezcla de tinción primaria de límites celulares, Vizgen) en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con PBS 1× durante 5 minutos cada una en una plataforma de agitación, se incubaron en solución de tinción secundaria [mezcla de tinción secundaria de límites celulares 3:100 (Vizgen) en solución de bloqueo] durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con PBS 1× durante 5 minutos cada una en una plataforma de agitación, se fijaron en PFA al 4% diluido en PBS 1× durante 15 minutos y se lavaron dos veces con PBS 1× durante 5 minutos cada una. A continuación, las secciones se lavaron con el tampón de lavado de preparación de muestras (Vizgen), se incubaron en el tampón de lavado de formamida (Vizgen) durante 30 minutos a 37 °C y luego se incubaron en la mezcla de paneles de genes durante 42 a 46 horas a 37 °C. A continuación, las secciones se incubaron dos veces en el tampón de lavado de formamida durante 30 minutos cada una a 47 °C y se lavaron con el tampón de lavado de preparación de muestras durante al menos 2 minutos. Las secciones se recubrieron con solución de encapsulación en gel [0,05% p/v de persulfato de amonio, 0,05% v/v de N,N,N′,N′-tetrametiletilendiamina en el premix de encapsulación en gel (Vizgen)] y se incubaron a T.A. durante 1,5 horas, se aclararon en una concentración de 1:5 de proteinasa K en el premix de aclaración (Vizgen) a 37 °C y luego se almacenaron en proteinasa K 1:100 en el premix de aclaración a 37 °C durante la noche o durante un máximo de 7 días para eliminar los lípidos y las proteínas que puedan contribuir al ruido de fondo de la autofluorescencia.

Antes de la imagen, las secciones se lavaron dos veces con el tampón de lavado de preparación de muestras, se incubaron en 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y reactivo de tinción PolyT (Vizgen) durante 15 minutos en una plataforma de agitación, se incubaron en el tampón de lavado de formamida durante 10 minutos y se lavaron de nuevo con el tampón de lavado de preparación de muestras.

La imagen se realizó en la plataforma MERSCOPE (Vizgen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras se cargaron en la cámara de flujo del instrumento y se seleccionó la región deseada para la imagen utilizando un mosaico de baja resolución de las tinciones de DAPI y Poly-T. A continuación, las muestras se obtuvieron imágenes de alta resolución con una pila z de siete planos y un espaciamiento de 1,5 μm entre los planos z adyacentes para capturar todo el espesor de 10 μm de las secciones de tejido. A continuación, las muestras se obtuvieron imágenes automáticamente según los ajustes de imagen de MERSCOPE.

Se calculó la media del volumen mediano en todas las bibliotecas y se eliminaron las células grandes con un volumen tres veces mayor que la media. A continuación, se eliminaron los dobletes utilizando la herramienta Scrublet (^[92]). A continuación, los datos procesados se analizaron aún más utilizando Seurat (^[93]). Por cada biblioteca, la matriz de recuento de genes por célula se normalizó, seguida del mapeo de referencia al conjunto de datos de snRNA-seq correspondiente para la anotación celular. Además, se realizó el análisis espacial de la interacción célula-célula utilizando CellChat (^[43]) y el análisis de proximidad a nivel celular (^[53]). Brevemente, definimos un vecindario espacial celular como las células dentro de cinco veces la distancia mediana de los pares de células vecinas. Como resultado, por cada tipo de célula, se calcularon las proporciones de interacciones con todos los demás tipos de células.

Tratamiento de ratones con un antagonista de CCR2

Se administró RS102895 (MedChemExpress) por sonda oral a ratones adultos (de 6 a 8 semanas de edad) a una concentración de 10 mg/kg o el mismo volumen de vehículo (25% de dimetilsulfóxido en agua de bebida) diariamente durante 28 días. Los ratones se sacrificaron y se recolectaron y procesaron los hígados hasta 24 horas después de la administración final del fármaco/vehículo.

Análisis transcripcional de los datos de supervivencia de pacientes de TCGA

Los datos de TCGA se obtuvieron utilizando el paquete RTCGA (^[94]). Las muestras se estratificaron por la expresión de YAP/TAZ, definiendo el 30% superior como alto y el 30% inferior como bajo. Se generaron análisis de supervivencia y curvas de Kaplan-Meier utilizando los paquetes R survival y survminer. Se utilizó la prueba log-rank de Kaplan-Meier para comparar las curvas de supervivencia de los grupos YAPHigh, TAZHigh y YTLow. Se identificaron los genes expresados diferencialmente utilizando DESeq2 (^[95]) y se realizó el análisis de enriquecimiento de la vía GO con clusterProfiler (^[96]).