La inhibición de DJ-1 remodela el microambiente tumoral y potencia los inhibidores de los puntos de control inmunitario.

Las inmunoterapias contra el cáncer han revolucionado el panorama del tratamiento de diversos tipos de cáncer, y los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICIs) han demostrado una eficacia clínica significativa, pero solo en el 15% al 40% de los pacientes con diferentes tipos de cáncer (^[1], ^[2]). Uno de los factores clave que influyen en esta variabilidad en la respuesta es el microambiente tumoral (TME), que desempeña un papel central en la regulación de la inmunidad antitumoral. El TME es una red compleja y dinámica de células inmunitarias, estromales y tumorales, que puede promover o suprimir las respuestas inmunitarias (^[3]). Por lo tanto, identificar y suspender los mecanismos inmunosupresores dentro del TME es fundamental para mejorar la eficacia de la inmunoterapia y lograr que beneficie a más pacientes con cáncer y otras afecciones relacionadas.

La heterogeneidad inmunológica del TME determina los resultados de la inmunoterapia. Los tumores "calientes", altamente infiltrados por subconjuntos inmunitarios efectores, como las células T citotóxicas, tienden a responder mejor a los ICIs que reactivan las células inmunitarias exhaustas preexistentes (^[4], ^[5]). En contraste, los tumores "fríos" con infiltración limitada de células inmunitarias a menudo son resistentes a los ICIs. Esto enfatiza la necesidad de estrategias para reprogramar el TME y mejorar la activación inmunitaria (^[6], ^[7]). La activación de las células T se lleva a cabo principalmente por las células presentadoras de antígenos profesionales (APCs), como los macrófagos asociados al tumor (TAMs), que son notablemente adaptables y pueden ser reeducados por el TME en diversos subconjuntos (^[8], ^[9]). La polarización de los TAMs hacia el fenotipo M1 proinflamatorio mediante la modificación epigenética, el metabolismo de los lípidos y la interacción entre células puede activar las células T CD8+, pero a menudo es menos eficaz debido a las señales competitivas del TME (^[10]–^[12]). Otra estrategia es inducir directamente las citocinas proinflamatorias mediante la focalización de los efectores en las principales vías de regulación inmunitaria innata, incluido el estimulador del gen de interferón (^[13], ^[14]). Sin embargo, estas estrategias enfrentan desafíos importantes, incluidos los riesgos de toxicidad, como las tormentas de citocinas y los efectos fuera del objetivo, y requieren un mayor perfeccionamiento para garantizar la seguridad y la eficacia clínicas (^[15], ^[16]).

Estudios recientes han destacado el impacto del estrés oxidativo en la modulación inmunitaria dentro del TME. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden provocar la activación o la inhibición de diversos procesos celulares, como la activación aberrante de la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas (^[17]). Pero, en muchos casos, la producción de peróxido de hidrógeno es un mediador crítico del reclutamiento de monocitos, y la explosión oxidativa también es necesaria para la eliminación de las células apoptóticas por los macrófagos activados alternativamente (^[18]–^[20]). Por lo tanto, la focalización de los genes relacionados con el estrés oxidativo puede ser una estrategia prometedora para mejorar la eficacia de la inmunoterapia. Investigaciones previas han confirmado que DJ-1, conocido como sensor del estrés oxidativo, participa en la aparición de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, como el cáncer, los trastornos neurodegenerativos y la diabetes tipo 2 (^[21]–^[23]). Recientemente, se ha demostrado que desempeña un papel clave en los trastornos inmunitarios e inflamatorios (^[24], ^[25]), lo que enfatiza su potencial como objetivo terapéutico para las afecciones inflamatorias. Sin embargo, el papel de DJ-1 en el microambiente inmunitario tumoral, particularmente en las células inmunitarias infiltrantes del tumor, aún no se ha explorado en gran medida.

En este estudio, descubrimos que tanto la eliminación sistémica (KO) como la inhibición farmacológica de un regulador clave del estrés oxidativo llamado Park7 (que codifica la proteína DJ-1) en ratones aumentan la inmunidad antitumoral y mejoran sinérgicamente los efectos antitumorales de varios ICIs, incluidos el inhibidor de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) y el inhibidor de la proteína 3 que contiene el dominio de inmunoglobulina y mucina de las células T (TIM-3). Mecánicamente, la deficiencia de Park7 promueve los TAMs proinflamatorios Cxcl9+ en oposición a los TAMs inmunosupresores Spp1+, lo que aumenta el reclutamiento y la activación de las células T. La pérdida de DJ-1 en los macrófagos eleva las ROS, lo que aumenta la expresión de los genes proinflamatorios y la producción de citocinas mediante la modulación de los factores de transcripción, como el transductor de señales y el activador de la transcripción 3 (STAT3) y el factor nuclear κB (NF-κB). En resumen, el bloqueo de DJ-1 representa una estrategia prometedora para reprogramar el TME, mejorar la infiltración y la activación de las células inmunitarias y tiene el potencial de sensibilizar a más pacientes con cáncer a los ICIs curativos.

RESULTADOS

La deficiencia de DJ-1 mejora la actividad antitumoral de los ICIs

La evidencia acumulada sugiere que el estrés oxidativo desempeña un papel importante en la regulación inmunitaria durante la progresión tumoral (^[26], ^[27]). Tanto nuestro grupo como otros han identificado a DJ-1, una proteína codificada por el gen PARK7, como un sensor crucial del estrés oxidativo (^[23], ^[28]). Para determinar si DJ-1 se asocia con la regulación inmunitaria, primero probamos la eficacia antitumoral de los ICIs en los ratones KO de DJ-1 (Park7−/−) y en los ratones de tipo salvaje (WT; Park7+/+) de la misma camada, con un fondo C57BL/6 (Fig. 1A). Como se esperaba, el bloqueo de PD-1 redujo moderadamente (en un 35%) el crecimiento de los tumores de adenocarcinoma de colon MC38 inmunogénicos subcutáneos en los ratones WT. Cabe destacar que Park7-KO redujo el crecimiento tumoral de manera comparable a la inhibición de PD-1, y el bloqueo de PD-1 impidió aún más el crecimiento de MC38 en los ratones Park7-KO, en un 75% en relación con los ratones de la misma camada tratados con un isotipo. Estos datos indican que los ratones con eliminación de Park7 exhiben una respuesta mejorada al bloqueo de PD-1 (Fig. 1, B y C).

Para investigar más a fondo el fenotipo inmunitario dentro del TME, analizamos la infiltración de células T CD8+ en los tumores subcutáneos. Como se muestra en la Fig. 1 (D y E), los tumores de los ratones WT tratados con inmunoglobulina G2a (IgG2a) mostraron solo un 0,5% de infiltración de células T CD8+, mientras que los tratados con α-PD-1 mostraron un modesto aumento hasta el 1,0%. En contraste, los tumores de los ratones KO mostraron una infiltración significativamente mayor de células T CD8+, con un 2,2% observado en el grupo tratado con IgG2a y un 4,3% en el grupo tratado con α-PD-1. Estos resultados indican que los tumores de los ratones KO contienen constantemente más células T CD8+ en comparación con los de los ratones WT, independientemente del tratamiento, lo que sugiere una respuesta inmunitaria mejorada dentro del TME.

Para validar aún más el sólido papel negativo de DJ-1 en la configuración del microambiente inmunitario tumoral, realizamos experimentos adicionales utilizando otro ICI, el anticuerpo α-TIM-3, en el modelo tumoral MC38, así como el anticuerpo α-PD-1 en un segundo modelo tumoral de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC). En los ratones con tumores MC38, la eliminación sistémica de DJ-1 mejoró significativamente la eficacia antitumoral del anticuerpo α-TIM-3, acompañada de un aumento del porcentaje de células T CD8+ dentro de los tejidos tumorales (Fig. 1, F a I), lo que resultó en una rápida regresión tumoral. De manera similar, en el modelo LLC, la deficiencia de DJ-1 potenció sustancialmente la respuesta terapéutica al tratamiento con α-PD-1, lo que demuestra aún más un efecto sinérgico constante (fig. S1, A a D). En conjunto, estos resultados sugieren que DJ-1 regula negativamente la eficacia de las terapias α-PD-1 y α-TIM-3 dentro del TME.

La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) revela que DJ-1 regula negativamente la diferenciación, la activación y el reclutamiento de las células T intratumorales

Para investigar los mecanismos subyacentes a la mayor sensibilidad a los ICIs impulsada por la deficiencia de DJ-1, realizamos una secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en las células inmunitarias intratumorales. Los tumores se disociaron en suspensiones de células individuales, y las células inmunitarias CD45+ se clasificaron para el análisis de scRNA-seq (Fig. 2, A y B). Se analizaron un total de 16.529 células CD45+, que comprendían 9226 células de ratones WT (Park7+/+) y 7303 células de ratones KO de DJ-1 (Park7−/−). El análisis de citometría de flujo y subgrupos identificó una mayor infiltración o supervivencia de cada población de células inmunitarias distinta, incluidas las células mieloides, las células T y las células asesinas naturales (NK), en los tumores KO de DJ-1 (Fig. 2C). El análisis transcriptómico comparativo de las vías de señalización reveló que el tratamiento anti-PD-1 reguló al alza numerosos procesos inflamatorios, como la migración de leucocitos, las respuestas de defensa y la adhesión celular en los tumores deficientes en DJ-1. En particular, los genes clave asociados con la citotoxicidad de las células T, como Nkg7 y Gzmb, se regularon significativamente al alza en los ratones Park7−/− en comparación con los controles Park7+/+. Además, las APC en los tumores deficientes en DJ-1 exhibieron una mayor expresión de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, lo que sugiere una mayor presentación de antígenos (fig. S2, A y B).

Dado el papel fundamental de las células T en la actividad antitumoral mediada por los ICIs, a continuación, nos centramos en el análisis de las células T infiltrantes del tumor en el modelo de cáncer de colon MC38. Utilizando los datos de scRNA-seq, definimos las subpoblaciones de células T en función de la expresión de los genes marcadores clave (^[29], ^[30]): Sell (células T ingenuas), Cd4 y Cxcr6 (células T de memoria), Mki67 y Hmgb2 (células T circulantes), Cd8a y Gzmb (células T citotóxicas), Cx3cr1 y Ccl5 (células T transitorias) y Foxp3 (células T supresoras) (Fig. 2, D y E). El análisis cuantitativo de estas subpoblaciones reveló notables diferencias entre las células T KO de DJ-1 (Park7−/−) y las células T WT (Park7+/+). En particular, las proporciones de las subpoblaciones de células T de memoria, efectoras y en ciclo aumentaron exponencialmente en los tumores de los ratones KO de DJ-1, mientras que las proporciones de las poblaciones de células T transitorias y supresoras disminuyeron notablemente (Fig. 2F). Estos hallazgos sugieren que la deficiencia de DJ-1 mantiene la citotoxicidad de las células T, limita el agotamiento de las células T y promueve el reclutamiento de células T en ciclo, lo que en conjunto mejora la inmunidad antitumoral.

Para explorar aún más el impacto de la deficiencia de DJ-1 en la dinámica de las células T, realizamos una secuenciación de células T de una sola célula (scTCR-seq) en combinación con scRNA-seq, preservando la información del código de barras para vincular los perfiles transcriptómicos con los datos del repertorio inmunitario (^[31], ^[32]). Las células T clonales se identificaron en función de los pares de secuencia TRA/TRB-CDR3, y se analizaron los 20 clones más frecuentes. En las células T Park7+/+, el clon más abundante representó solo el 10,88% de las secuencias detectadas, lo que refleja una expansión clonal relativamente baja. En contraste, las células T Park7−/− exhibieron un notable aumento en la expansión clonal, con el clon superior (CASSLDNYAEQFF) observado más de 100 veces y que representó el 26,12% del total de las secuencias detectadas (Fig. 2G). Estas observaciones implican la influencia distinta de la deficiencia de DJ-1 en la proliferación de los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL).

DJ-1 modula indirectamente la función de las células T

Nuestros datos hasta ahora sugieren un papel clave de las células T en el control tumoral. Para confirmar la participación de las células T CD8+, inyectamos ratones con tumores MC38 KO de DJ-1 y WT con anticuerpos neutralizantes α-CD8 antes del tratamiento con α-PD-1. Como se esperaba, el agotamiento de las células T CD8+ neutralizó la actividad antitumoral del anticuerpo α-PD-1, lo que sugiere firmemente que las células T CD8+ son los principales efectores que matan las células tumorales (Fig. 3A).

A continuación, investigamos si DJ-1 afecta directamente la función de las células T. Las células T esplénicas de los ratones Park7+/+ y Park7−/− se aislaron, y su proliferación se analizó aún más mediante citometría de flujo basada en el éster de carboxyfluoresceína succinimidilo (CFSE). Como se muestra en la Fig. 3B, no se observaron diferencias significativas en la proliferación entre los dos grupos. Además, evaluamos la expresión de los marcadores de activación de las células T (CD25 y CD69) y el receptor inhibidor PD-1 para evaluar los estados de activación y agotamiento de las células T, respectivamente (^[33]). Nuevamente, la eliminación de DJ-1 no alteró significativamente estos marcadores en las células T esplénicas (Fig. 3, C a E).

Para examinar más a fondo la actividad funcional de las células T, las células T esplénicas se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 horas, seguido de tratamiento con un cóctel de activación celular durante 6 horas. Se midió la expresión de la proteína interferón-γ (IFN-γ), una citocina clave asociada con la activación y la citotoxicidad de las células T. Como se muestra en la Fig. 3F, la estimulación aguda de las células T esplénicas KO de DJ-1 no produjo una expresión significativamente alterada de IFN-γ en comparación con las células T esplénicas WT.

En general, estos hallazgos sugieren que la deficiencia de DJ-1 no afecta directamente la actividad, activación o proliferación de las células T. En cambio, la mayor inmunidad antitumoral observada en los ratones deficientes en DJ-1 probablemente se debe a la modulación indirecta de la función de las células T a través de interacciones con otros tipos de células inmunitarias o componentes del microambiente tumoral (TME). Esto destaca a DJ-1 como un regulador upstream de las respuestas inmunitarias, que influye en los efectos antitumorales mediados por las células T a través de mecanismos indirectos. Proponemos que DJ-1 no tiene un papel crítico en la funcionalidad de las células T.

La deficiencia de DJ-1 desencadenó la activación inmunitaria a través de la presentación de antígenos

Los resultados anteriores sugieren que DJ-1 puede influir en las interacciones entre las células inmunitarias para regular la inmunidad de las células T. Por lo tanto, investigamos más a fondo el panorama general de las células inmunitarias infiltrantes tumorales (CD45+) en ratones Park7−/− y Park7+/+ utilizando secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) para explorar la heterogeneidad intrínseca y las interacciones entre células. Después del filtrado de calidad, clasificamos 17.367 células inmunitarias Park7+/+ y 18.643 células inmunitarias Park7−/− en 21 grupos, agrupados en cinco tipos principales de células: células mieloides, células epiteliales, células T, células NK y fibroblastos (Fig. 4A). Para inferir las interacciones moleculares que median la comunicación intercelular, calculamos la fuerza de los pares ligando-receptor en el conjunto de datos de scRNA-seq utilizando el paquete CellChat (^[34]) y observamos un aumento del enriquecimiento en las vías de quimioquinas del motivo C-C y las vías de quimioquinas del motivo C-X-C en las células inmunitarias Park7−/−. Con base en estas observaciones, proponemos que DJ-1 desempeña un papel clave en el aumento del intercambio de señales intercelulares entre las células inmunitarias (Fig. 4, B a D) a través de la señalización de quimioquinas, lo que podría conducir a una presentación de antígenos y activación de células T más eficaces.

Dado el papel fundamental de las APC profesionales en el inicio de las respuestas de las células T, evaluamos más a fondo la función de las APC utilizando una proteína altamente inmunogénica, la albúmina (OVA), en ratones Park7−/−. Los ratones C57BL/6J fueron inmunizados con OVA mezclada con un adyuvante incompleto de Freund, y a los ratones WT y KO se les trasplantaron subcutáneamente células MC38-proteína verde fluorescente (EGFP)-OVA (Fig. 4E). La inmunización continua con la proteína OVA resultó en un crecimiento significativamente más lento de los tumores MC38-EGFP-OVA en los ratones KO en comparación con los ratones WT, lo que indica una respuesta inmunitaria más fuerte en los ratones Park7−/− (Fig. 4, F y G). En línea con esto, se observaron frecuencias elevadas y secreción de IFN-γ de las células TIL de los tejidos tumorales en los ratones KO después de la inmunización (Fig. 4, H e I).

Estos resultados sugieren que los ratones Park7−/− son más sensibles a los efectos antitumorales de la inmunización con OVA, posiblemente debido a la mayor presentación de péptidos antigénicos derivados de OVA por parte de las APC profesionales. Esto sugiere que las APC profesionales pueden ser los objetivos de los efectos inmunomoduladores de DJ-1.

DJ-1 modula la dinámica de Spp1/Cxcl9 en las células TAM para impulsar la formación de un nicho inmunosupresor

Para dilucidar cómo DJ-1 media su función inmunorreguladora, identificamos los genes expresados diferencialmente (DEG) entre las células CD45+ WT y Park7−/− a partir de los datos de scRNA-seq. Las células mieloides infiltrantes tumorales en Park7−/− expresaron significativamente más Cxcl9, H2-Aa y Ly6a y menos Spp1, Ccl2 y Ccl12 (Fig. 5A) en relación con sus contrapartes WT. En particular, Cxcl9 y Spp1 se enriquecieron en diferentes subconjuntos de células TAM (Fig. 5B). Con base en los DEG, clasificamos las células mieloides en dos grupos de monocitos (mono-Ly6c y mono-Cxcl10), dos grupos de células dendríticas (DC) (DC plasmocitoide y DC activada) y varios grupos de macrófagos (Macro-C1qc, Macro-Cxcl9, Macro-Spp1 y Macro-Mki67) (Fig. 5C y fig. S3A). Los ratones Park7−/− tenían más células TAM Cxcl9+ y una menor abundancia de células TAM Spp1+ en comparación con los ratones WT (Fig. 5D).

A continuación, analizamos las células mieloides en el tiempo pseudo para dilucidar sus etapas de desarrollo y funciones inmunorreguladoras. Como se muestra en la Fig. 5E y la fig. S3B, existe una trayectoria de ramificación desde las etapas tempranas hasta las tardías, donde las células TAM C1qc+ y Mki67+ representaron un estado terminalmente diferenciado, que exhibió exclusividad mutua con las células TAM Spp1+. Las células TAM Cxcl9+ se dispersaron a lo largo de la trayectoria, se posicionaron más cerca del final y presentaron una rama distinta en las células TIL Park7−/− en comparación con WT. El análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) reveló que las vías de respuesta inmunitaria y procesamiento de antígenos se enriquecieron en Macro-Cxcl9, lo que se alinea con las características de macrófagos inmunostimulantes. En contraste, las vías de migración celular y angiogénesis se enriquecieron en las células TAM Spp1+, lo que indica su papel protumorogénico (Fig. 5F).

Dado que Macro-Cxcl9 y Macro-Spp1 pueden tener diferencias o incluso efectos opuestos en la inmunidad antitumoral, investigamos a continuación si la expresión de estos dos genes está relacionada con la eficacia clínica de las inmunoterapias. Como se muestra en la Fig. 5G, los pacientes con mayor expresión de SPP1 tuvieron peores resultados después de la terapia anti-PD1, mientras que aquellos con mayor expresión de CXCL9 tuvieron mejores resultados. CXCL9, un tipo de quimioquinas, puede reclutar linfocitos T citotóxicos (CTL) a través de CXCR3, lo que se ha demostrado que promueve la inmunidad de las células T antitumoral. De manera similar, encontramos que la deficiencia de DJ-1 puede inducir a las células T a secretar más quimioquinas y citocinas características de los CTL, como Ccl4, Ccl5 e Ifng (fig. S4A). Además, la base de datos de estimación del entorno inmunitario tumoral (TIMER) mostró que la alta expresión de CXCL9 se correlacionó positivamente con la abundancia intratumoral de células T CD8+ (fig. S4B). En general, estos hallazgos sugieren que DJ-1 modula la proporción de Spp1/Cxcl9 en las células TAM hacia un TME inmunosupresor.

La deficiencia de DJ-1 en los macrófagos induce señales proinflamatorias asociadas con ROS para mejorar la activación de las células T

A continuación, buscamos determinar si las células TAM son las APC principales que regulan la función de las células T a través de DJ-1 mediante la transferencia de macrófagos. En resumen, las células de la médula ósea de ratones Park7−/− o WT C57/BL6 se diferenciaron en macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) in vitro, se mezclaron con células tumorales MC38 y se inocularon por vía subcutánea en un grupo de ratones WT (Fig. 6A). Los tumores inoculados con BMDM Park7−/− crecieron sustancialmente más lentamente en comparación con aquellos que contenían BMDM WT cuando se trataron con anticuerpo anti-PD-1 (Fig. 6, B y C). En el punto final del experimento, la infiltración de células T CD8+ fue en promedio 1,7 veces mayor en los tumores que contenían BMDM Park7−/− (Fig. 6D). El aumento de la expresión de la proteína CXCL9 en estos tumores indicó que la deficiencia de DJ-1 aumenta la expresión de Macro-Cxcl9 (Fig. 6E).

En particular, la inclusión de células dendríticas derivadas de la médula ósea (Park7−/−), otra APC clásica, en los tumores MC38 no afectó la actividad antitumoral del anticuerpo α-PD-1. Esto sugiere que las células TAM, en lugar de las DC, son las APC principales que influyen en la regulación de las células T a través de DJ-1 (fig. S5).

Examinamos más a fondo la activación de las células T por los macrófagos Park7−/−. Las células TAM Park7−/− o WT intratumorales se aislaron, se estimularon con lipopolisacárido y se utilizaron para presentar péptidos derivados de la proteína OVA a las células de ratones OT-1 (Fig. 6F y fig. S6, A y B). Como se muestra en la Fig. 6 (G y H) y la fig. S6C, las células T activadas (CD25+) se regularon al alza y se expresaron más IFN-γ y CXCL9 en presencia de BMDM Park7−/−, lo que indica características proinflamatorias y una activación robusta de las células T. Los datos de ARN-seq revelaron vías enriquecidas relacionadas con la respuesta al oxígeno y la biosíntesis de ácidos orgánicos/carboxílicos, lo que sugiere un papel de DJ-1 en la respiración de los macrófagos y los procesos catabólicos (fig. S7). Los macrófagos proinflamatorios típicamente cambian de la fosforilación oxidativa a la glucólisis aeróbica, lo que aumenta los ROS (^[35]). Como se esperaba, el sensor de ROS 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA) mostró un aumento de los ROS en los macrófagos Park7−/−. En particular, los niveles de fosforilación de STAT3 y NF-κB se elevaron significativamente en los macrófagos Park7−/− (Fig. 6, I y J). Para investigar más a fondo el papel directo de los ROS en la regulación de la activación de las células T mediada por los macrófagos, se añadió el antioxidante N-acetilcisteína (NAC) antes de la presentación del antígeno OVA. El tratamiento con NAC redujo la proporción de células T CD69+, revirtiendo eficazmente el efecto estimulador observado con los macrófagos tratados con el inhibidor de DJ-1 disulfiram (DSF) (Fig. 6, K y L). Dado que Cys106 es fundamental para la actividad antioxidante de DJ-1, sobreexpresamos DJ-1 WT y los mutantes funcionales C106A y C106S en los BMDM KO de DJ-1. Descubrimos que la reintroducción de DJ-1 suprimió la activación de las células T, mientras que los mutantes C106A y C106S no lo hicieron, lo que indica que el sitio Cys106 activo en la reducción es esencial para la regulación de la función de los macrófagos mediada por DJ-1 (fig. S8). En conjunto, la deficiencia de DJ-1 en los macrófagos induce ROS y promueve la expresión de genes proinflamatorios a través de factores de transcripción, mejorando la capacidad de activación de las células T.

La inhibición farmacológica de DJ-1 potencia el bloqueo de los puntos de control inmunitario

Con base en estos resultados, DJ-1 emerge como un posible objetivo farmacológico para mejorar la eficacia de los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICI). Anteriormente identificamos DSF como un inhibidor de DJ-1 de molécula pequeña eficaz a partir de una biblioteca de fármacos comercializados (^[36]). A continuación, preguntamos si DSF podría imitar el KO de DJ-1 para potenciar los ICI y estimular la inmunidad antitumoral en ratones portadores de tumores MC38. Como se había planteado, DSF mejoró significativamente tanto la actividad antitumoral como la infiltración intratumoral de células T CD8+ del bloqueo de PD-1, aunque el efecto antitumoral de DSF solo no fue estadísticamente significativo (Fig. 7, A a C). De manera similar, en el modelo inmunológicamente frío del tumor 4T1, el tratamiento combinado con DSF y α-PD-1 resultó en una marcada inhibición del crecimiento tumoral y un aumento notable de la infiltración intratumoral de células T CD8+ (fig. S9).

En general, tanto la inhibición farmacológica como el KO de DJ-1 estimulan la inmunidad antitumoral e impiden el crecimiento tumoral. Esto fortalece aún más la participación de DJ-1 en la regulación de la inmunidad antitumoral y su potencial como un objetivo de modificación del TME.

La deficiencia de DJ-1 mejora la actividad antitumoral de los ICI

La evidencia acumulada sugiere que el estrés oxidativo desempeña un papel importante en la regulación inmunitaria durante la progresión tumoral (^[26], ^[27]). Tanto nuestro grupo como otros han identificado a DJ-1, una proteína codificada por el gen PARK7, como un sensor crucial del estrés oxidativo (^[23], ^[28]). Para determinar si DJ-1 se asocia con la regulación inmunitaria, primero probamos la eficacia antitumoral de los ICI en ratones KO de DJ-1 (Park7−/−) y en hermanos WT (Park7+/+) con antecedentes C57BL/6 (Fig. 1A). Como se esperaba, el bloqueo de PD-1 redujo moderadamente (en un 35%) el crecimiento de los tumores de colon inmunogénicos MC38 en los ratones WT. En particular, el KO de Park7 redujo el crecimiento tumoral de manera comparable a la inhibición de PD-1, y el bloqueo de PD-1 impidió aún más el crecimiento de MC38 en los ratones Park7-KO en un 75% en relación con los hermanos WT tratados con isotipo (Fig. 1, B y C). Estos datos indican que los ratones con KO de Park7 exhiben una respuesta mejorada al bloqueo de PD-1.

Para investigar más a fondo el fenotipo inmunitario dentro del TME, analizamos la infiltración de células T CD8+ en los tumores subcutáneos. Como se muestra en la Fig. 1 (D y E), los tumores de los ratones WT tratados con inmunoglobulina G2a (IgG2a) exhibieron solo un 0,5% de infiltración de células T CD8+, mientras que aquellos tratados con α-PD-1 mostraron un modesto aumento al 1,0%. En contraste, los tumores de los ratones KO demostraron una infiltración significativamente mayor de células T CD8+, con un 2,2% observado en el grupo tratado con IgG2a y un 4,3% en el grupo tratado con α-PD-1. Estos resultados indican que los tumores en los ratones KO contienen constantemente más células T CD8+ en comparación con los ratones WT independientemente del tratamiento, lo que sugiere una respuesta inmunitaria mejorada dentro del TME.

Para validar aún más el robusto papel negativo de DJ-1 en la modulación del microambiente inmunitario tumoral, realizamos experimentos adicionales utilizando otro inhibidor de puntos de control inmunitarios (ICI), el anticuerpo α-TIM-3, en el modelo tumoral MC38, así como el anticuerpo α-PD-1 en un segundo modelo tumoral de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC). En ratones portadores de tumores MC38, la deficiencia sistémica de DJ-1 mejoró significativamente la eficacia antitumoral del anticuerpo α-TIM-3, acompañado de un aumento del porcentaje de células T CD8+ dentro de los tejidos tumorales (Fig. 1, F a I), lo que resultó en una rápida regresión tumoral. De manera similar, en el modelo LLC, la deficiencia de DJ-1 potenció sustancialmente la respuesta terapéutica al tratamiento con α-PD-1, lo que demuestra aún más un efecto sinérgico consistente (fig. S1, A a D). En conjunto, estos resultados sugieren que DJ-1 regula negativamente la eficacia de las terapias α-PD-1 y α-TIM-3 dentro del microambiente tumoral (TME).

scRNA-seq revela que DJ-1 regula negativamente la diferenciación, activación y reclutamiento de células T intratumorales

Para investigar los mecanismos subyacentes a la mayor sensibilidad a los ICI impulsada por la deficiencia de DJ-1, realizamos secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células inmunitarias intratumorales. Los tumores se disociaron en suspensiones de células individuales y las células inmunitarias CD45+ se clasificaron para el análisis de scRNA-seq (Fig. 2, A y B). Se analizaron un total de 16.529 células CD45+, que comprendían 9226 células de ratones WT (Park7+/+) y 7303 células de ratones con deficiencia de DJ-1 (Park7−/−). La citometría de flujo y el análisis de subgrupos identificaron una mayor infiltración o supervivencia de linfocitos en general de cada población de células inmunitarias distintas, incluidas las células mieloides, las células T y las células asesinas naturales (NK) (Fig. 2C) en los tumores con deficiencia de DJ-1. El análisis transcriptómico comparativo de las vías de señalización reveló que el tratamiento con anti-PD-1 reguló al alza numerosos procesos inflamatorios, como la migración de leucocitos, las respuestas de defensa y la adhesión celular en los tumores con deficiencia de DJ-1. En particular, los genes clave asociados con la citotoxicidad de las células T, como Nkg7 y Gzmb, se regularon significativamente al alza en los ratones Park7−/− en comparación con los controles Park7+/+. Además, las células presentadoras de antígeno (APC) en los tumores con deficiencia de DJ-1 exhibieron una mayor expresión de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, lo que sugiere una mayor presentación de antígenos (fig. S2, A y B).

Dado el papel fundamental de las células T en la actividad antitumoral mediada por los ICI, a continuación, nos centramos en nuestro análisis en las células T infiltrantes tumorales en el modelo de cáncer colorrectal MC38. Utilizando los datos de scRNA-seq, definimos las subpoblaciones de células T en función de la expresión de los genes marcadores clave (^[29], ^[30]): Sell (células T naïvas), Cd4 y Cxcr6 (células T de memoria), Mki67 y Hmgb2 (células T circulantes), Cd8a y Gzmb (células T citotóxicas), Cx3cr1 y Ccl5 (células T transitorias) y Foxp3 (células T supresoras) (Fig. 2, D y E). El análisis cuantitativo de estas subpoblaciones reveló diferencias notables entre las células T con deficiencia de DJ-1 (Park7−/−) y las células T WT (Park7+/+). En particular, las proporciones de subconjuntos de células T de memoria, efectoras y en ciclo aumentaron exponencialmente en los tumores de ratones con deficiencia de DJ-1, mientras que las proporciones de poblaciones de células T transitorias y supresoras disminuyeron notablemente (Fig. 2F). Estos hallazgos sugieren que la deficiencia de DJ-1 mantiene la citotoxicidad de las células T, limita el agotamiento de las células T y promueve el reclutamiento de células T en ciclo, lo que en conjunto mejora la inmunidad antitumoral.

Para explorar aún más el impacto de la deficiencia de DJ-1 en la dinámica de las células T, realizamos una secuenciación de receptores de células T de una sola célula (scTCR-seq) en combinación con scRNA-seq, preservando la información del código de barras para vincular los perfiles transcriptómicos con los datos del repertorio inmunitario (^[31], ^[32]). Las células T clonales se identificaron en función de los pares de secuencias TRA/TRB-CDR3, y se analizaron los 20 clonotipos más expandidos. En las células T Park7+/+, el clonotipo más abundante representó solo el 10,88% de las secuencias detectadas, lo que refleja una expansión clonal relativamente baja. En contraste, las células T Park7−/− exhibieron un notable aumento en la expansión clonal, con el clonotipo principal (CASSLDNYAEQFF) observado más de 100 veces y representando el 26,12% de las secuencias totales detectadas (Fig. 2G). Estas observaciones implican la influencia distinta de la deficiencia de DJ-1 en la proliferación de los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL).

DJ-1 modula indirectamente la función de las células T

Nuestros datos hasta ahora sugieren un papel clave de las células T en el control tumoral. Para confirmar la participación de las células T CD8+, inyectamos ratones MC38 con deficiencia de DJ-1 y WT con anticuerpos α-CD8 neutralizantes antes del tratamiento con α-PD-1. Como se esperaba, el agotamiento de las células T CD8+ neutralizó la actividad antitumoral del anticuerpo α-PD-1, lo que sugiere firmemente que las células T CD8+ son los principales efectores que matan las células tumorales (Fig. 3A).

A continuación, investigamos si DJ-1 afecta directamente la función de las células T. Las células T esplénicas de los ratones Park7+/+ y Park7−/− se aislaron y su proliferación se analizó aún más mediante citometría de flujo basada en el éster de carboxyfluoresceína succinimidilo (CFSE). Como se muestra en la Fig. 3B, no se observaron diferencias significativas en la proliferación entre los dos grupos. Además, evaluamos la expresión de los marcadores de activación de las células T (CD25 y CD69) y el receptor inhibidor PD-1 para evaluar los estados de activación y agotamiento de las células T, respectivamente (^[33]). Nuevamente, la deleción de DJ-1 no alteró significativamente estos marcadores en las células T esplénicas (Fig. 3, C a E).

Para examinar aún más la actividad funcional de las células T, las células T esplénicas se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 horas, seguido de tratamiento con un cóctel de activación celular durante 6 horas. Se midió la expresión de interferón-γ (IFN-γ), una citocina clave asociada con la activación y la citotoxicidad de las células T. Como se muestra en la Fig. 3F, la estimulación aguda de las células T esplénicas con deficiencia de DJ-1 no produjo una alteración significativa de la expresión de IFN-γ en comparación con las células T esplénicas WT.

En general, estos hallazgos sugieren que la deficiencia de DJ-1 no afecta directamente la actividad, la activación o la proliferación de las células T. En cambio, la mayor inmunidad antitumoral observada en los ratones con deficiencia de DJ-1 probablemente proviene de la modulación indirecta de la función de las células T a través de interacciones con otros tipos de células inmunitarias o componentes del TME. Esto destaca a DJ-1 como un regulador ascendente de las respuestas inmunitarias, que influye en los efectos antitumorales mediados por las células T a través de mecanismos indirectos. Proponemos que DJ-1 no tiene un papel crítico en la funcionalidad de las células T.

La deficiencia de DJ-1 desencadenó la activación inmunitaria a través de la presentación de antígenos

Los resultados anteriores sugieren que DJ-1 puede influir en las interacciones de las células inmunitarias para regular la inmunidad de las células T. Por lo tanto, investigamos aún más el panorama global de las células inmunitarias infiltrantes tumorales (CD45+) en los ratones Park7−/− y Park7+/+ utilizando scRNA-seq para explorar la heterogeneidad intrínseca y las interacciones entre células. Después del filtrado de calidad, clasificamos 17.367 células Park7+/+ y 18.643 células Park7−/− de alta calidad en 21 grupos, agrupados en cinco tipos celulares principales: células mieloides, células epiteliales, células T, células NK y fibroblastos (Fig. 4A). Para inferir las interacciones moleculares que median la comunicación intercelular, calculamos la fuerza de los pares ligando-receptor en el conjunto de datos de scRNA-seq utilizando el paquete CellChat (^[34]) y observamos un aumento del enriquecimiento en las vías de los ligandos de quimiocinas del motivo C-C y los ligandos de quimiocinas del motivo C-X-C en las células inmunitarias Park7−/−. Sobre la base de estas observaciones, proponemos que DJ-1 desempeña un papel clave en la mejora del intercambio de información entre las células inmunitarias (Fig. 4, B a D) a través de la señalización de quimiocinas, lo que conduce potencialmente a una presentación de antígenos y activación de células T más eficaces.

Dado el papel fundamental de las APC profesionales en el inicio de las respuestas de las células T, evaluamos aún más la función de las APC utilizando una proteína altamente inmunogénica, la albúmina (OVA), en los ratones Park7−/−. Los ratones C57BL/6J se inmunizaron con OVA mezclada con un adyuvante incompleto de Freund, y los ratones WT y KO se trasplantaron subcutáneamente con células MC38-proteína verde fluorescente (EGFP)-OVA (Fig. 4E). La inmunización continua con la proteína OVA resultó en un crecimiento significativamente más lento de los tumores MC38-EGFP-OVA en los ratones KO en comparación con los ratones WT, lo que indica una respuesta inmunitaria más fuerte en los ratones Park7−/− (Fig. 4, F y G). En línea con esto, se observaron frecuencias elevadas y secreción de IFN-γ de las TIL de los tejidos tumorales en los ratones KO después de la inmunización (Fig. 4, H e I).

Estos resultados sugieren que los ratones Park7−/− son más sensibles a los efectos antitumorales de la inmunización con OVA, posiblemente debido a la mayor presentación de péptidos antigénicos derivados de OVA por las APC profesionales. Esto sugiere que las APC profesionales pueden ser los objetivos de los efectos inmunomoduladores de DJ-1.

La deficiencia de DJ-1 modula la dinámica de Spp1/Cxcl9 en las células TAM para impulsar la formación de un nicho inmunosupresor

Para dilucidar cómo DJ-1 media su función inmunorreguladora, hemos identificado los genes expresados diferencialmente (DEG) entre las células CD45+ WT y Park7−/− de los datos de scRNA-seq. Las células mieloides infiltrantes tumorales en Park7−/− expresaron significativamente más Cxcl9, H2-Aa y Ly6a y menos Spp1, Ccl2 y Ccl12 (Fig. 5A) en relación con sus contrapartes WT. En particular, Cxcl9 y Spp1 se enriquecieron en diferentes subconjuntos de células TAM (Fig. 5B). Sobre la base de los DEG, clasificamos las células mieloides en dos grupos de monocitos (mono-Ly6c y mono-Cxcl10), dos grupos de células dendríticas (DC) (DC plasmocitoide y DC activada) y varios grupos de macrófagos (Macro-C1qc, Macro-Cxcl9, Macro-Spp1 y Macro-Mki67) (Fig. 5C y fig. S3A). Los ratones Park7−/− tenían más células TAM Cxcl9+ y una menor abundancia de células TAM Spp1+ en comparación con los ratones WT (Fig. 5D).

A continuación, analizamos las células mieloides en el tiempo pseudo para dilucidar sus etapas de desarrollo y funciones inmunorreguladoras. Como se muestra en la Fig. 5E y la fig. S3B, existe una trayectoria de ramificación desde las etapas tempranas hasta las tardías, donde las células TAM C1qc+ y Mki67+ representaron un estado diferenciado terminal, que exhibió exclusividad mutua con las células TAM Spp1+. Las células TAM Cxcl9+ se dispersaron a lo largo de la trayectoria, se posicionaron más cerca del final y presentaron una rama distinta en las células TIL Park7−/− en comparación con WT. El análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) reveló que las vías de respuesta inmunitaria y procesamiento de antígenos se enriquecieron en Macro-Cxcl9, lo que se alinea con las características de macrófagos inmunostimulantes. En contraste, las vías de migración celular y angiogénesis se enriquecieron en las células TAM Spp1+, lo que indica su papel protumorogénico (Fig. 5F).

Dado que Macro-Cxcl9 y Macro-Spp1 pueden tener diferencias o incluso efectos opuestos en la inmunidad antitumoral, investigamos a continuación si la expresión de estos dos genes está relacionada con la eficacia clínica de las inmunoterapias. Como se muestra en la Fig. 5G, los pacientes con mayor expresión de SPP1 tuvieron peores resultados después de la terapia anti-PD1, mientras que aquellos con mayor expresión de CXCL9 tuvieron mejores resultados. CXCL9, un tipo de quimiocinas, puede reclutar linfocitos T citotóxicos (CTL) a través de CXCR3, lo que se ha demostrado que promueve la inmunidad antitumoral de las células T. De manera similar, encontramos que la deficiencia de DJ-1 puede inducir a las células T a secretar más quimiocinas y citocinas características de las CTL, como Ccl4, Ccl5 y Ifng (fig. S4A). Además, la base de datos de estimación del microambiente tumoral (TIMER) mostró que la alta expresión de CXCL9 se correlacionó positivamente con la abundancia intratumoral de células T CD8+ (fig. S4B). En general, estos hallazgos sugieren que DJ-1 modula la proporción de Spp1/Cxcl9 en las células TAM hacia un TME inmunosupresor.

La deficiencia de DJ-1 en los macrófagos induce señales proinflamatorias asociadas con ROS para mejorar la activación de las células T

A continuación, buscamos determinar si las células TAM son las principales células presentadoras de antígeno (APC) que regulan la función de las células T a través de DJ-1, mediante la realización de un trasplante de macrófagos. Brevemente, las células de la médula ósea de ratones Park7−/− o WT C57/BL6 se diferenciaron in vitro en macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM), se mezclaron con células tumorales MC38 y se inocularon por vía subcutánea en un grupo de ratones WT (Fig. 6A). Los tumores inoculados con BMDM Park7−/− crecieron sustancialmente más lentamente en comparación con aquellos que contenían BMDM WT cuando se trataron con anticuerpo anti–PD-1 (Fig. 6, B y C). En el punto final del experimento, la infiltración de células T CD8+ fue, en promedio, 1,7 veces mayor en los tumores que contenían BMDM Park7−/− (Fig. 6D). El aumento de la expresión de la proteína CXCL9 en estos tumores indicó que la deficiencia de DJ-1 aumenta la expresión de Macro-Cxcl9 (Fig. 6E).

Cabe destacar que la inclusión de células dendríticas derivadas de la médula ósea Park7−/− (BMDC), otra APC clásica, en los tumores MC38 no afectó la actividad antitumoral del anticuerpo α-PD-1. Esto sugiere que las células TAM, en lugar de las células dendríticas, son las principales APC que influyen en la regulación de las células T a través de DJ-1 (fig. S5).

Examinamos además la activación de las células T por los macrófagos Park7−/−. Los BMDM Park7−/− o WT intratumorales se aislaron, se estimularon con lipopolisacárido y se utilizaron para presentar péptidos derivados de la proteína OVA a las células T de ratones OT-1 (Fig. 6F y fig. S6, A y B). Como se muestra en la Fig. 6 (G y H) y en la fig. S6C, las células T activadas (CD25+) se regularon al alza, y se expresó más IFN-γ y CXCL9 en presencia de BMDM Park7−/−, lo que indica características proinflamatorias y una activación robusta de las células T. Los datos de RNA-seq revelaron vías enriquecidas relacionadas con la respuesta al oxígeno y la biosíntesis de ácidos orgánicos/carboxílicos, lo que sugiere un papel de DJ-1 en la respiración de los macrófagos y los procesos catabólicos (fig. S7). Los macrófagos proinflamatorios típicamente cambian de la fosforilación oxidativa a la glucólisis aeróbica, lo que aumenta la producción de ROS (^[35]). Como se esperaba, el sensor de ROS 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA) mostró un aumento de los ROS en los macrófagos Park7−/−. Cabe destacar que los niveles de fosforilación de STAT3 y NF-κB se elevaron significativamente en los macrófagos Park7−/− (Fig. 6, I y J). Para investigar más a fondo el papel directo de los ROS en la regulación de la activación de las células T mediada por los macrófagos, se añadió el antioxidante N-acetilcisteína (NAC) antes de la presentación del antígeno OVA. El tratamiento con NAC redujo la proporción de células T CD69+, revirtiendo eficazmente el efecto estimulador observado con los macrófagos tratados con el inhibidor de DJ-1 disulfiram (DSF) (Fig. 6, K y L). Dado que Cys106 es fundamental para la actividad antioxidante de DJ-1, sobreexpresamos DJ-1 WT y los mutantes funcionales C106A y C106S en BMDM DJ-1 KO. Descubrimos que la reintroducción de DJ-1 suprimió la activación de las células T, mientras que los mutantes C106A y C106S no lo hicieron, lo que indica que el sitio Cys106 redox-activo es esencial para la regulación de la función de los macrófagos mediada por DJ-1 (fig. S8). En conjunto, la deficiencia de DJ-1 en los macrófagos induce la producción de ROS y promueve la expresión de genes proinflamatorios a través de factores de transcripción y mejora la capacidad de activación de las células T.

La inhibición farmacológica de DJ-1 potencia el bloqueo de los puntos de control inmunitario

Sobre la base de estos resultados, DJ-1 emerge como un posible objetivo farmacológico para mejorar la eficacia de los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICI). Anteriormente, identificamos DSF como un inhibidor eficaz de DJ-1 a pequeña molécula a partir de una biblioteca de fármacos comercializados (^[36]). A continuación, preguntamos si DSF podría imitar el fenotipo de DJ-1 KO para potenciar los ICI y estimular la inmunidad antitumoral en ratones C57BL/6 con tumores MC38. Como se había planteado, DSF mejoró significativamente tanto la actividad antitumoral como la infiltración intratumoral de células T CD8+ del bloqueo de PD-1, aunque el efecto antitumoral de DSF por sí solo no fue estadísticamente significativo (Fig. 7, A a C). De manera similar, en el modelo inmunológicamente "frío" del tumor 4T1, el tratamiento combinado con DSF y α-PD-1 resultó en una marcada inhibición del crecimiento tumoral y un aumento notable de la infiltración intratumoral de células T CD8+ (fig. S9).

En general, tanto la inhibición farmacológica como la deleción de DJ-1 estimulan la inmunidad antitumoral e impiden el crecimiento tumoral. Esto refuerza aún más la participación de DJ-1 en la regulación de la inmunidad antitumoral y su potencial como un objetivo de modificación del microambiente tumoral (TME).

DISCUSIÓN

Aquí, hemos descubierto que DJ-1 reprograma las células TAM para inhibir la inmunidad de las células T a través de vías de señalización de ROS proinflamatorias y hemos validado a DJ-1 como un objetivo farmacológico para potenciar la inmunoterapia contra el cáncer (Fig. 8). Este enfoque contribuye a revertir el microambiente inmunosupresor y restaurar la activación de las células T mediante la modulación de las células TAM multifacéticas que pueden tanto apoyar como restringir la inmunidad, dependiendo de las señales del TME que reciban. Los tumores comúnmente reeducan las células TAM hacia un fenotipo antiinflamatorio para reducir la vigilancia inmunitaria y facilitar la evasión inmunitaria tumoral (^[37]). Por lo tanto, la repolarización de los macrófagos hacia un fenotipo de activación inmunitaria representa una estrategia destacada para liberar la inmunidad antitumoral y el potencial completo de los ICI.

Hemos identificado seis subtipos de células TAM en los ratones DJ-1 KO basándonos en sus perfiles de expresión génica. En comparación con los ratones WT, se encontró que las células TAM Cxcl9+ estaban significativamente enriquecidas, mientras que las células TAM Spp1+ estaban notablemente disminuidas. Los estudios han demostrado que las células TAM Spp1+ exhiben puntuaciones de hipoxia más altas para promover la transición epitelio-mesenquimal y la glucólisis en el TME hipóxico (^[38]), lo que facilita el crecimiento tumoral. Además, las células TAM Spp1+ pueden inhibir la actividad de las células T CD8+ a través de la vía de señalización del adenosín (^[39]). En contraste, CXCL9 es una quimiocina clásica que participa en el reclutamiento de células T. Por lo tanto, es probable que las células TAM Cxcl9+ actúen como guardianes que invitan a las células T tumorales citotóxicas a los tumores. Si bien el tráfico de las células T hacia los tumores es esencial, los estudios recientes han destacado que la proximidad física de las células T y las APC es primordial para una activación eficaz de las células T (^[40]). En consonancia con estos informes, nuestros análisis de interacción celular basados en datos de scRNA-seq sugieren que la pérdida de DJ-1 promueve las interacciones entre las células T y las células TAM en los ratones. Esto se refuerza aún más mediante la regulación al alza de las vías relacionadas con la presentación de antígenos, la activación de las células T mediada por citocinas y la señalización de la migración celular en las células CD45+ intratumorales.

La repolarización de las células TAM hacia un fenotipo Cxcl9+ proinflamatorio mediante la inactivación de DJ-1 proporciona una vía potencial para la intervención terapéutica. Esto se demuestra claramente por nuestro hallazgo de que la inhibición farmacológica de DJ-1 potencia el bloqueo de PD-1. Las APC, como las células TAM, son protagonistas clave en la regulación y activación de la función de las células T. Por lo tanto, la modulación de la actividad de las APC proporciona una estrategia prometedora para activar indirectamente las células T. La polarización precisa y duradera de células altamente adaptables como las células TAM mediante fármacos es un desafío, ya que las señales del TME pueden anular un estado de polarización inducido originalmente (^[41]). Pero, notablemente, los macrófagos deficientes en DJ-1 generados ex vivo conservaron la función de estimulación de las células T incluso después del trasplante en tumores WT. La polarización de las células TAM por la deleción de DJ-1 parece ser enormemente estable, lo que ofrece un beneficio terapéutico superior. La deleción de DJ-1 también proporciona una opción eficaz para mejorar la funcionalidad de los macrófagos de receptores quiméricos de antígenos (CAR-M) (^[42]).

En nuestros estudios anteriores, nos centramos en explorar el papel de DJ-1 (PARK7) como un sensor redox y un objetivo terapéutico en el cáncer. Además, hemos demostrado que DJ-1 gobierna las decisiones del destino tumoral (apoptosis/ferroptosis) mediante la regulación de la actividad de ASK1 en condiciones oxidativas específicas (^[43]) y la modulación de la vía de transulfuración (^[44]). Si bien los ROS desempeñan un papel fundamental en el fenotipo de células TAM activadas inmunológicamente, como el fenotipo M1 proinflamatorio clásico (TAM1), aquí hemos descubierto que la deleción de DJ-1 en los macrófagos acumula ROS y activa las vías de señalización proinflamatorias. Aunque los ROS también desempeñan un papel proinflamatorio en las células dendríticas, el análisis de las células CD45+ intratumorales en los ratones DJ-1 KO sistémicos sugirió que DJ-1 no es un regulador clave de la producción de ROS en las células dendríticas, lo que se verificó además en el experimento de adopción de células dendríticas. En general, la deleción de DJ-1 puede promover la acumulación de ROS, logrando así un efecto antitumoral dual al suprimir el crecimiento tumoral y promover la activación de las células T por las células TAM. Nuestros hallazgos anteriores mostraron que los tumores DJ-1 KO eran más susceptibles a la ferroptosis (^[44]), una forma de muerte celular inmunogénica (ICD) (^[45], ^[46]). La ICD libera una amplia gama de antígenos tumorales, ácidos nucleicos y otros patrones moleculares asociados al peligro que activan las células inmunitarias innatas, incluidos los macrófagos (^[47]). Por lo tanto, proponemos que la inhibición de DJ-1 aumenta la polarización de los macrófagos y la ICD, lo que produce un sistema de sinergia altamente eficaz que estimula la inmunidad antitumoral.

Aunque no observamos efectos secundarios significativos en los ratones DJ-1 KO sistémicos, incluida la esperanza de vida, se sabe que la deficiencia de DJ-1 está asociada con la enfermedad de Parkinson familiar autosómica recesiva (^[22]). Dado que los ratones DJ-1 KO se alojan en entornos libres de patógenos con exposición limitada a los patógenos, no pudimos determinar si la polarización de los macrófagos inducida por DJ-1 podría afectar la susceptibilidad a algunas enfermedades infecciosas. De manera similar, el efecto de la polarización de los macrófagos inducida por la deleción de DJ-1 en las enfermedades autoinmunes sigue sin estar claro. Sin embargo, es probable que estas enfermedades requieran una deficiencia de DJ-1 a largo plazo o que ocurran en condiciones específicas. Por lo tanto, creemos que la inhibición farmacológica temporal de la función de DJ-1 es probablemente segura y no tendrá efectos adversos graves en los ratones y posiblemente también en los humanos.

En conclusión, descubrimos que la deficiencia de DJ-1 induce la acumulación de ROS para desencadenar la polarización de las células TAM hacia un fenotipo inmunoestimulador, mejorando así la actividad de las células T y promoviendo en última instancia la eficacia antitumoral de los ICI. La inhibición farmacológica de DJ-1 por DSF potencia los ICI y establece a DJ-1 como un objetivo farmacológico prometedor para sensibilizar a los pacientes con cáncer a las inmunoterapias. El bloqueo o la deleción genética de DJ-1 representa un enfoque único para la polarización de las células TAM y la mejora de los CAR-M que introduce un paradigma desconocido en el arsenal de la inmuno-oncología.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo celular

Las células de adenocarcinoma de colon MC38 (número de serie: SCSP-5431), las células de carcinoma pulmonar LLC Lewis (número de serie: TCM 7) y las células de cáncer de mama 4T1 (número de serie: TCM32) se compraron al Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shanghái, China), que se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB). Las células se cultivaron en un incubador humidificado a 37 °C con un 5% de CO2.

Plásmidos y transfección celular

El plásmido vector lentiviral pCDH-EF1-Puro se compró a System Biosciences. El plásmido vector lentiviral pMND-Puro se generó en nuestro laboratorio. pLV2-CMV-OVAL-EGFP-Fluc-Puro se compró a la Plataforma Biológica Miao Ling (P28082) y posteriormente se subclonó en el plásmido pCDH con los siguientes cebadores: forwardTGAGACTTCGTGGTGGTAGTATAATCAACT-TTGAAAAACTGGAATTCGAATTTAAATCGGATC y reverseGATCCGATTTAAATTCGAATTCCAGTTTTTCAAAGTGATTATACTACCACCACGAAGTCTCA.

Los genes Park7-WT, Park7-C106A y Park7-C106S fueron sintetizados por GENEWIZ (Suzhou, China) y posteriormente clonados utilizando los siguientes cebadores: forwardACAAAAAAGCAGGCTTCACCGCTAGCATGGCTTCCAAAAGAGC y reverseAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCCTAGTCTTTGAGAACAAGCGGTG.

Los vectores lentivirales se transfectaron en células 293FT para su empaquetamiento. Las partículas virales se recolectaron aproximadamente 36 horas después de la transfección. Para la infección estable, las células MC38 se cultivaron en placas de seis pocillos al 30% de confluencia, y se añadió 1 ml de sobrenadante viral con polibreno a una concentración final de 6 μg/ml durante 12 horas. Las células infectadas se cultivaron en medios frescos durante 72 horas y luego se clasificaron mediante citometría de flujo utilizando el canal de isotiocianato de fluoresceína para obtener una línea celular MC38-OVA estable. Para las BMDM, las células se sembraron en placas de 12 pocillos al 40% de confluencia, y se añadió 1 ml de sobrenadante viral junto con 1× potenciador de transducción lentiviral durante 24 horas. Después de 72 horas en medio fresco, se verificó la expresión de DJ-1 (WT, C106A y C106S) mediante Western blot.

Ratones

Los ratones Park7−/− con fondo C57/BL6 se obtuvieron del Jackson Laboratory, y los ratones OT-1 BALB/c hembra se compraron en el Centro Nacional de Recursos de Animales de Laboratorio (Shanghái, China). La descendencia de la reproducción Park7+/− × Park7+/− incluyó hermanos que eran Park7+/+ (controles WT) o Park7−/− (DJ-1 KO). Todos los experimentos utilizaron ratones de edad similar (de 6 a 12 semanas) y del mismo sexo (machos y hembras) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (número: DW202510211520) del Instituto de Innovación para la Inteligencia Artificial en Medicina de la Universidad de Zhejiang.

Modelo tumoral subcutáneo

Las células tumorales (5 × 105 células MC38 o 1 × 106 células LLC) se inyectaron subcutáneamente en ratones Park7+/+ o Park7−/−, respectivamente. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula (L × W × W)/2, donde L es la longitud del tumor y W es el ancho del tumor. De acuerdo con los requisitos de bienestar animal, los ratones se sacrifican cuando el volumen tumoral alcanza los 2000 mm3, el tumor excede los 20 mm en una dirección o el tumor forma una úlcera.

Terapia con ICI

Cuando el tumor crece hasta ~100 mm3, se inyectaron por vía intraperitoneal en los ratones anticuerpos anti–PD-1 (10 mg/kg; clon RMP1-14, Bio X Cell) o anti-TIM-3 (clon RMT3-23, Bio X Cell) cada 3 días, y el grupo de control recibió la IgG isotípica correspondiente. El tamaño de los tumores se controló cada 2 a 4 días.

Depleción de células T CD8+

Para estudiar la contribución de las células T CD8+ al efecto antitumoral, se inyectó por vía intraperitoneal en los ratones de cada grupo 200 μg de anti-CD8a (clon 2.43, Bio X Cell) o anticuerpo de control isotípico ratón IgG2a (clon 2A3, Bio X Cell), la primera dosis 7 días antes de la implantación del tumor y la segunda dosis 1 día antes de la implantación del tumor. Antes de la implantación del tumor, se recolectó sangre venosa de cada ratón y se realizó citometría de flujo con anticuerpos específicos para CD8 para confirmar la depleción exitosa de las células T CD8+ después de la lisis de los glóbulos rojos. El anticuerpo anti-CD8a neutralizante se administró continuamente cada 6 días para mantener una depleción efectiva.

Carga de antígeno OVA

La proteína OVA se emulsionó con el adyuvante de Freund incompleto en una relación de volumen de 1:1 para formar una emulsión de "agua en aceite". Se administró por vía subcutánea a los ratones un total de 10 μg/20 μl de esta emulsión tres veces durante un período de 10 días para inducir la presentación de antígeno in vivo por las células inmunitarias. Posteriormente, se inocularon 1 × 106 células MC38-OVA en la axila de los ratones. El crecimiento tumoral se controló y midió periódicamente.

Aislamiento e inoculación de BMDM/BMDC

Las BMDM o BMDC se generaron a partir de células de la médula ósea recolectadas de ratones Park7+/+ y Park7−/−. Las células de la médula ósea se sembraron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 1% de antibióticos/antimicóticos y 10% de suero fetal bovino que contiene factor estimulante de colonias de macrófagos (50 ng/ml) para obtener BMDM y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (20 ng/ml) para obtener BMDC, respectivamente. Entre los días 3 y 4, se implantaron células MC38 (5 × 105) mezcladas con BMDM (5 × 105) o células MC38 (4,5 × 105) mezcladas con BMDC (3 × 105) por vía subcutánea en las axilas y se trataron con anticuerpos monoclonales de la misma manera que se describió anteriormente.

Terapia combinada

Para probar el efecto terapéutico del bloqueo combinacional de DJ-1 y PD-1, se administró por vía intraperitoneal un anticuerpo de control o α-PD-1 (clon RMP1-14, Bio X Cell) a 10 mg/kg, y DSF se inyectó por vía intravenosa a una dosis de 20 mg/kg para la terapia única o combinada.

Disociación del tejido tumoral

Las muestras tumorales se disecaron en pequeños trozos utilizando pinzas y tijeras después de retirar los tejidos adiposos. Estos trozos se incubaron luego a 37 °C durante 30 minutos con agitación constante en DMEM suplementado con colagenasa tipo II (1 mg/ml), desoxirribonucleasa I (0,1 mg/ml) y 0,25% de tripsina-EDTA. Después de la incubación, la suspensión celular se filtró a través de un tamiz celular de 70 μm, se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendió para su posterior análisis.

Citometría de flujo (clasificación celular activada por fluorescencia)

Se prepararon suspensiones celulares simples como se describió anteriormente y se tiñeron con anticuerpos. Primero, las muestras se incubaron con solución de bloqueo de Fc (1:100 de dilución del anticuerpo) en PBS 1× que contiene 2% de albúmina sérica bovina. Las muestras se incubaron con los anticuerpos primarios (CD45 clon: 30-F11, CD3 clon: 17A2, CD8 clon: 53-6.7, CD69 clon: H1.2F3, CD25 clon: 3C7, Cd11c clon: N418, F4/80 clon: BM8, I-Ab clon: AF6-120.1, PD-1 clon: RMP1-30) a 4 °C durante 45 minutos en la oscuridad. Luego, las células se lavaron y se analizaron utilizando citómetros de flujo LSR II (BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo. Las células específicas se clasificaron en poblaciones designadas utilizando un clasificador celular de alta velocidad MoFlo MLS (Beckman Coulter).

Estimulación de células T in vitro

Los bazo de los ratones se disociaron mecánicamente y luego se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm. Los linfocitos se aislaron aún más utilizando un medio de separación de linfocitos (Dakewe). Las células T se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 50 μM de β-mercaptoetanol y se añadieron a placas de 24 pocillos. Las placas se pre-recubrieron con anticuerpo anti-CD3 soluble (5 μg/ml) durante 24 horas, luego se cultivaron un total de 1 × 106 células por pocillo en presencia de anticuerpo anti-CD28 soluble (3 μg/ml) e interleucina-2 recombinante (10 ng/ml), y se lavaron dos veces con PBS. Para una estimulación rápida, las células se incubaron con un cóctel de estimulación celular (Thermo Fisher Scientific) que contiene forbol 12-miristato 13-acetato, ionóforo y brefeldina A. Las células se recolectaron y se analizaron mediante citometría de flujo.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Los tejidos se lavaron con PBS preenfriado para eliminar los residuos de sangre o impurezas de la superficie y se homogeneizaron a fondo. Después de cuantificar la proteína mediante un kit de ácido bicinquinónico (BCA) para la normalización, se utilizaron los kits de ensayo inmunoenzimático para ratón IFN-γ (R&D Systems) y Cxcl9 (HuaAn Biotechnology) para detectar los niveles de proteína de IFN-γ y Cxcl9 en estos sobrenadantes de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Inmunoblotting

Se realizó inmunoblotting como se describió anteriormente (^[44]). Los anticuerpos para p-STAT3-Tyr705 (ET1603-40) y p-NF-κB p65-Ser529 (ET1604-27) se obtuvieron de HuaAn Biotechnology. El anticuerpo para β-actina (db7283) se obtuvo de Diagnostic Biosystems.

Preprocesamiento de scRNA-seq

Las células CD45 positivas se clasificaron mediante citometría de flujo, logrando una tasa de viabilidad de más del 90%. Siguiendo el protocolo del kit de secuenciación de células únicas GEXSCOPE, la concentración celular se ajustó a aproximadamente 100 células/μl. La suspensión celular única se mezcló con agua libre de nucleasas y 5′ de premezcla de ARN de célula única antes de cargarse en el chip que contiene cuentas de gel de código de barras y aceite dispensador. El ADN complementario se sintetizó mediante transcripción inversa y se mantuvo a 4 °C. Posteriormente, el ADN complementario se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa y se almacenó a -80 °C. La construcción de la biblioteca de secuenciación de segunda generación para el análisis de la expresión génica se realizó por Singleron Biotech. Los archivos brutos de código de barras, características y matriz se cargaron en R (v4.2.1) y se procesaron con Seurat (v4.3.0) para el control de calidad inicial. Se eliminaron las células con menos de 500 o más de 6000 genes detectados (menos de 1000 o más de 5000 genes detectados en los grupos de células T), más del 5% de genes mitocondriales o más del 3% de genes de eritrocitos. También se excluyeron los genes detectados en menos de tres células. Los datos se normalizaron y se transformaron logarítmicamente para corregir las variaciones en la profundidad de secuenciación. Después del control de calidad, los datos procesados están listos para un análisis adicional.

Análisis de datos de scRNA-seq

Anotación celular

Se realizó un análisis de correlación utilizando los 2000 genes más variables para identificar las células ancla para la integración de datos no supervisada. Para la agrupación celular, se utilizaron los 30 principales componentes (PC) para construir una red neuronal de picos (SNN) y para la visualización de la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP). Se utilizaron marcadores específicos del tipo celular para definir los subconjuntos de células inmunitarias. Para lograr un análisis de mayor resolución de las células T y las células mieloides, estos tipos de células se extrajeron por separado de las células CD45 positivas totales para un análisis adicional. Los 10 principales PC se utilizaron tanto para la construcción del mapa SNN como para la agrupación UMAP. Los mapas de calor, los gráficos de violín y los gráficos de incrustación estocástica t-distribuida (t-SNE) visualizaron la expresión de transcritos en subconjuntos celulares seleccionados, generados utilizando funciones integradas y el paquete ggplot2.

Análisis de pseudotiempo

Se construyó un objeto R utilizando la función newCellDataSet de Monocle2 (^[48]), y se utilizó la función estimateDispersions para estimar la dispersión empírica de cada gen dentro de un modelo binomial negativo. Se filtraron los genes con un nivel de expresión logarítmica promedio inferior a 0,5 en todos los grupos. Los genes restantes se clasificaron en función de sus puntuaciones de sobredispersión. Posteriormente, los genes de mayor rango se utilizaron como entrada para el algoritmo Monocle2 para derivar la trayectoria de pseudotiempo en una proyección bidimensional.

Análisis de scTCR-seq

La información de TCR se extrajo de los datos de scRNA-seq, y la alineación junto con el ensamblaje de novo se utilizaron para validar las lecturas derivadas de TCR y reconstruir las cadenas de TCR. La reconstrucción del repertorio de TCR se realizó por Singleron. Posteriormente, integramos los datos de scTCR con los datos de scRNA-seq de los grupos de células T utilizando códigos de barras de células para un análisis adicional. Se excluyeron los clones de TCR asociados con códigos de barras de células que no estaban presentes en los grupos de células T. Además, cuantificamos la superposición de las secuencias de aminoácidos CDR3 entre los grupos WT y KO.

Análisis de enriquecimiento GO

Para los DEG, se realizó un análisis de enriquecimiento GO utilizando ClusterProfiler (^[49]). Específicamente, se seleccionaron 100 DEG con un valor de P inferior a 0,05 para el análisis estadístico y la visualización con el fin de dilucidar los perfiles funcionales de los genes y los grupos de genes.

Análisis de interacción célula-célula

Para investigar la comunicación célula-célula, se utilizó el paquete CellChat. El subconjunto de "señalización secretada" se seleccionó como la base de datos de comunicación utilizando el comando subsetDB. Se utilizaron objetos Seurat de las muestras como entradas para generar objetos CellChat mediante la función createCellChat. El análisis de comunicación se realizó de acuerdo con el flujo de trabajo estándar de CellChat.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Los datos se expresan como medias ± DE. Para las comparaciones por pares entre dos grupos, se utilizaron pruebas t de dos colas para determinar los valores de P. Para las comparaciones de múltiples grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, y los niveles de significación se definieron como *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001.

Cultivo celular

Las células de adenocarcinoma de colon MC38 (número de serie: SCSP-5431), las células de carcinoma pulmonar LLC (número de serie: TCM 7) y las células de cáncer de mama 4T1 (número de serie: TCM32) se compraron al Banco de Células de la Academia de Ciencias de China (Shanghái, China), que se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Las células se cultivaron en una incubadora humidificada al 5% de CO2 a 37 °C.

Plásmidos y transfección celular

El plásmido vector lentiviral pCDH-EF1-Puro se adquirió de System Biosciences. El plásmido vector lentiviral pMND-Puro se generó en nuestro laboratorio. pLV2-CMV-OVAL-EGFP-Fluc-Puro se adquirió de la plataforma biológica Miao Ling (P28082) y posteriormente se subclonó en el plásmido pCDH con los siguientes cebadores: sentidoTGAGACTTCGTGGTGGTAGTATAATCAACT-TTGAAAAACTGGAATTCGAATTTAAATCGGATC y reversoGATCCGATTTAAATTCGAATTCCAGTTTTTCAAAGTGATTATACTACCACCACGAAGTCTCA.

Los genes Park7-WT, Park7-C106A y Park7-C106S fueron sintetizados por GENEWIZ (Suzhou, China) y posteriormente clonados utilizando los siguientes cebadores: sentidoACAAAAAAGCAGGCTTCACCGCTAGCATGGCTTCCAAAAGAGC y reversoAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCCTAGTCTTTGAGAACAAGCGGTG.

Los vectores lentivirales se transfectaron en células 293FT para su empaquetamiento. Las partículas virales se recolectaron aproximadamente 36 horas después de la transfección. Para la infección estable, las células MC38 se cultivaron en placas de seis pocillos al 30% de confluencia, y se añadió 1 ml de sobrenadante viral con polibreno a una concentración final de 6 μg/ml durante 12 horas. Las células infectadas se cultivaron en medios frescos durante 72 horas y luego se clasificaron mediante citometría de flujo utilizando el canal de isotiocianato de fluoresceína para obtener una línea celular MC38-OVA estable. Para los BMDM, las células se sembraron en placas de 12 pocillos al 40% de confluencia, y se añadió 1 ml de sobrenadante viral junto con 1× potenciador de transducción lentiviral durante 24 horas. Después de 72 horas en medio fresco, la expresión de DJ-1 (WT, C106A y C106S) se verificó mediante Western blot.

Ratones

Los ratones Park7−/− con un fondo C57/BL6 se obtuvieron del Jackson Laboratory, y los ratones OT-1 BALB/c hembra se adquirieron del Centro Nacional de Recursos de Animales de Laboratorio (Shanghái, China). La descendencia de la reproducción Park7+/− × Park7+/− incluyó hermanos que eran Park7+/+ (controles WT) o Park7−/− (DJ-1 KO). Todos los experimentos utilizaron ratones de edad similar (de 6 a 12 semanas) y del mismo sexo (machos y hembras) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (número: DW202510211520) del Instituto de Innovación para la Inteligencia Artificial en Medicina, Universidad de Zhejiang.

Modelo tumoral subcutáneo

Las células tumorales (5 × 105 células MC38 o 1 × 106 células LLC) se inyectaron subcutáneamente en ratones Park7+/+ o Park7−/−, respectivamente. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula (L × W × W)/2, donde L es la longitud del tumor y W es el ancho del tumor. De acuerdo con los requisitos de bienestar animal, los ratones se sacrifican cuando el volumen tumoral alcanza los 2000 mm3, el tumor excede los 20 mm en una dirección o el tumor forma una úlcera.

Terapia con ICI

Cuando el tumor crece hasta ~100 mm3, se inyectaron por vía intraperitoneal en los ratones anticuerpos anti–PD-1 (10 mg/kg; clon RMP1-14, Bio X Cell) o anti-TIM-3 (clon RMT3-23, Bio X Cell) cada 3 días, y el grupo de control recibió la inmunoglobulina G isotípica correspondiente. El tamaño del tumor se controló cada 2 a 4 días.

Depleción de células T CD8+

Para estudiar la contribución de las células T CD8+ al efecto antitumoral, se inyectaron por vía intraperitoneal en los ratones de cada grupo 200 μg de anti-CD8a (clon 2.43, Bio X Cell) o anticuerpo de control isotípico ratón IgG2a (clon 2A3, Bio X Cell), la primera dosis 7 días antes de la implantación del tumor y la segunda dosis 1 día antes de la implantación del tumor. Antes de la implantación del tumor, se recolectó sangre venosa de cada ratón y se realizó citometría de flujo con anticuerpos específicos para CD8 para confirmar la depleción exitosa de las células T CD8+ después de la lisis de los glóbulos rojos. El anticuerpo neutralizante anti-CD8a se administró continuamente cada 6 días para mantener una depleción efectiva.

Carga de antígeno OVA

La proteína OVA se emulsionó con el adyuvante de Freund incompleto en una relación de volumen de 1:1 para formar una emulsión de "agua en aceite". Se administraron por vía subcutánea a los ratones un total de 10 μg/20 μl de esta emulsión tres veces durante un período de 10 días para inducir la presentación de antígeno in vivo por las células inmunitarias. Posteriormente, se inocularon 1 × 106 células MC38-OVA en la axila de los ratones. El crecimiento tumoral se controló y midió periódicamente.

Aislamiento e inoculación de BMDM/BMDC

Los BMDM o BMDC se generaron a partir de células de la médula ósea recolectadas de ratones Park7+/+ y Park7−/−. Las células de la médula ósea se sembraron en medio DMEM modificado con suero fetal bovino (SFB) al 10% y 1% de antibióticos/antimicóticos, suplementado con factor estimulante de colonias de macrófagos (50 ng/ml) para obtener BMDM y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (20 ng/ml) para obtener BMDC, respectivamente. Entre los días 3 y 4, se implantaron por vía subcutánea en las axilas células MC38 (5 × 105) mezcladas con BMDM (5 × 105) o células MC38 (4,5 × 105) mezcladas con BMDC y se trataron con anticuerpos monoclonales de la misma manera que se describió anteriormente.

Terapia combinada

Para probar el efecto terapéutico del bloqueo combinacional de DJ-1 y PD-1, se administró por vía intraperitoneal un anticuerpo de control o α-PD-1 (clon RMP1-14, Bio X Cell) a 10 mg/kg, y DSF se inyectó por vía intravenosa a una dosis de 20 mg/kg, ya sea en terapia única o combinada.

Disociación del tejido tumoral

Las muestras tumorales se disecaron en pequeños trozos utilizando pinzas y tijeras después de retirar los tejidos adiposos. Estos trozos se incubaron luego a 37 °C durante 30 minutos con agitación constante en DMEM suplementado con colagenasa tipo II (1 mg/ml), desoxirribonucleasa I (0,1 mg/ml) y 0,25% de tripsina-EDTA. Después de la incubación, la suspensión celular se filtró a través de un tamiz celular de 70 μm, se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendió para su posterior análisis.

Citometría de flujo (clasificación celular activada por fluorescencia)

Se prepararon suspensiones celulares simples como se describió anteriormente y se tiñeron con anticuerpos. Primero, las muestras se incubaron con solución de bloqueo de Fc (dilución 1:100 del anticuerpo) en PBS 1× que contiene 2% de albúmina sérica bovina. Las muestras se incubaron luego con los anticuerpos primarios (CD45 clon: 30-F11, CD3 clon: 17A2, CD8 clon: 53-6.7, CD69 clon: H1.2F3, CD25 clon: 3C7, Cd11c clon: N418, F4/80 clon: BM8, I-Ab clon: AF6-120.1, PD-1 clon: RMP1-30) a 4 °C durante 45 minutos en la oscuridad. Las células se lavaron y se analizaron utilizando citómetros de flujo LSR II (BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo. Las células específicas se clasificaron en poblaciones designadas utilizando un clasificador celular de alta velocidad MoFlo MLS (Beckman Coulter).

Estimulación de células T in vitro

Los bazo de los ratones se disociaron mecánicamente y luego se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm. Los linfocitos se aislaron aún más utilizando un medio de separación de linfocitos (Dakewe). Las células T se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB y 50 μM de β-mercaptoetanol y se añadieron a placas de 24 pocillos. Las placas se preincubaron con anticuerpo anti-CD3 soluble (5 μg/ml) durante 24 horas y luego se cultivaron un total de 1 × 106 células por pocillo en presencia de anticuerpo anti-CD28 soluble (3 μg/ml) e interleucina-2 recombinante (10 ng/ml), y se lavaron dos veces con PBS. Para una estimulación rápida, las células se incubaron con un cóctel de estimulación celular (Thermo Fisher Scientific) que contiene 12-miristoato 13-acetato de forbol, ionóforo y brefeldina A. Las células se recolectaron y se analizaron mediante citometría de flujo.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Los tejidos se lavaron con PBS preenfriado para eliminar los residuos de sangre o impurezas de la superficie y se homogeneizaron a fondo. Después de cuantificar la proteína mediante un kit de ácido bicinquinónico (BCA) para la normalización, se utilizaron los kits de ensayo inmunoenzimático para ratones IFN-γ (R&D Systems) y Cxcl9 (HuaAn Biotechnology) para detectar los niveles de proteína de IFN-γ y Cxcl9 en estos sobrenadantes de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Inmunoblotting

Se realizó inmunoblotting como se describió anteriormente (^[44]). Los anticuerpos para p-STAT3-Tyr705 (ET1603-40) y p-NF-κB p65-Ser529 (ET1604-27) se obtuvieron de HuaAn Biotechnology. El anticuerpo para β-actina (db7283) se obtuvo de Diagnostic Biosystems.

Preprocesamiento de scRNA-seq

Las células CD45 positivas se clasificaron mediante citometría de flujo, logrando una tasa de viabilidad de más del 90%. Siguiendo el protocolo del kit de secuenciación de células únicas GEXSCOPE, la concentración celular se ajustó a aproximadamente 100 células/μl. La suspensión celular única se mezcló luego con agua libre de nucleasas y 5′ de premezcla de ARN de célula única antes de cargarse en el chip que contiene cuentas de gel de código de barras y aceite dispensador. El ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa y se mantuvo a 4 °C. Posteriormente, el ADNc se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa y se almacenó a −80 °C. La construcción de la biblioteca de secuenciación de segunda generación para el análisis de la expresión génica la realizó Singleron Biotech. Los archivos brutos de código de barras, características y matriz se cargaron en R (v4.2.1) y se procesaron con Seurat (v4.3.0) para el control de calidad inicial. Se eliminaron las células con menos de 500 o más de 6000 genes detectados (menos de 1000 o más de 5000 genes detectados en los grupos de células T), más del 5% de genes mitocondriales o más del 3% de genes de eritrocitos. También se excluyeron los genes detectados en menos de tres células. Los datos se normalizaron y se transformaron logarítmicamente para corregir las variaciones en la profundidad de secuenciación. Después del control de calidad, los datos procesados están listos para un análisis adicional.

Análisis de datos de scRNA-seq

Anotación de células

Se realizó un análisis de correlación utilizando los 2000 genes altamente variables para identificar las células ancla para la integración de datos no supervisada. Para la agrupación celular, se utilizaron los 30 principales componentes (PC) para construir una red neuronal de picos (SNN) y para la visualización de la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP). Se utilizaron marcadores específicos del tipo celular para definir los subconjuntos de células inmunitarias. Para lograr un análisis de mayor resolución de las células T y las células mieloides, estos tipos de células se extrajeron por separado de las células CD45 positivas totales para un análisis adicional. Los 10 principales PC se utilizaron tanto para la construcción del mapa SNN como para la agrupación UMAP. Los mapas de calor, los gráficos de violín y los gráficos de incrustación estocástica t-distribuida (t-SNE) visualizaron la expresión de transcritos en subconjuntos de células seleccionados, generados utilizando funciones integradas y el paquete ggplot2.

Análisis de pseudotiempo

Se construyó un objeto R utilizando la función newCellDataSet de Monocle2 (^[48]), y la función estimateDispersions se utilizó para estimar la dispersión empírica de cada gen dentro de un modelo binomial negativo. Se eliminaron los genes con un nivel de expresión logarítmica promedio inferior a 0,5 en todos los grupos. Los genes restantes se clasificaron en función de sus puntuaciones de sobredispersión. Posteriormente, los genes de mayor rango se utilizaron como entrada para el algoritmo Monocle2 para derivar la trayectoria de pseudotiempo en una proyección bidimensional.

Análisis de scTCR-seq

La información de TCR se extrajo de los datos de scRNA-seq, y la alineación junto con el ensamblaje de novo se utilizaron para validar las lecturas derivadas de TCR y reconstruir las cadenas de TCR. La reconstrucción del repertorio de TCR la realizó Singleron. Posteriormente, integramos los datos de scTCR con los datos de scRNA-seq de los grupos de células T utilizando códigos de barras de células para un análisis adicional. Se excluyeron los clones de TCR asociados con códigos de barras de células que no estaban presentes en los grupos de células T. Además, cuantificamos la superposición de las secuencias de aminoácidos CDR3 entre los grupos WT y KO.

Análisis de enriquecimiento GO

Para los DEG, se realizó un análisis de enriquecimiento GO utilizando ClusterProfiler (^[49]). Específicamente, se seleccionaron 100 DEG con un valor p inferior a 0,05 para el análisis estadístico y la visualización con el fin de dilucidar los perfiles funcionales de los genes y los grupos de genes.

Análisis de interacción célula a célula

Para investigar la comunicación célula a célula, se utilizó el paquete CellChat. El subconjunto de "señalización secretada" se seleccionó como la base de datos de comunicación utilizando el comando subsetDB. Se utilizaron objetos Seurat de las muestras como entradas para generar objetos CellChat mediante la función createCellChat. El análisis de comunicación se realizó de acuerdo con el flujo de trabajo estándar de CellChat.

Anotación de células

Se realizó un análisis de correlación utilizando los 2000 genes más variables para identificar las células ancla para la integración de datos no supervisada. Para la agrupación de células, se utilizaron los 30 componentes principales (CP) principales para construir una red neuronal de picos (SNN) y para la visualización mediante la aproximación y proyección de la variedad uniforme (UMAP). Se utilizaron marcadores específicos de tipo celular para definir los subconjuntos de células inmunitarias. Para lograr un análisis de mayor resolución de las células T y las células mieloides, estos tipos de células se extrajeron por separado del total de células CD45 positivas para un análisis posterior. Los 10 CP más significativos se utilizaron tanto para la construcción del mapa SNN como para la agrupación UMAP. Los mapas de calor, los gráficos de violín y los gráficos de incrustación estocástica de vecinos distribuidos en t (t-SNE) visualizaron la expresión de transcritos en los subconjuntos de células seleccionados, generados utilizando funciones integradas y el paquete ggplot2.

Análisis de pseudotiempo

Se construyó un objeto R utilizando la función newCellDataSet de Monocle2 (^[48]), y la función estimateDispersions se utilizó para estimar la dispersión empírica de cada gen dentro de un modelo binomial negativo. Se eliminaron los genes con un nivel promedio de expresión logarítmica inferior a 0,5 en todos los grupos de muestras. Los genes restantes se clasificaron en función de sus puntuaciones de sobredispersión. Posteriormente, los genes con la clasificación más alta se utilizaron como entrada para el algoritmo Monocle2 para derivar la trayectoria de pseudotiempo en una proyección bidimensional.

Análisis de scTCR-seq

La información de TCR se extrajo de los datos de scRNA-seq, y la alineación junto con el ensamblaje de novo se utilizaron para validar las lecturas derivadas de TCR y reconstruir las cadenas de TCR. La reconstrucción del repertorio de TCR la realizó Singleron. Posteriormente, integramos los datos de scTCR con los datos de scRNA-seq de los grupos de células T utilizando códigos de barras de células para un análisis posterior. Se excluyeron los clones de TCR asociados con códigos de barras de células que no estaban presentes en los grupos de células T. Además, cuantificamos la superposición de las secuencias de aminoácidos de CDR3 entre los grupos WT y KO.

Análisis de enriquecimiento GO

Para los DEG, se realizó un análisis de enriquecimiento GO utilizando ClusterProfiler (^[49]). Específicamente, se seleccionaron 100 DEG con un valor P de corte inferior a 0,05 para el análisis estadístico y la visualización con el fin de dilucidar los perfiles funcionales de los genes y los grupos de genes.

Análisis de interacción célula-célula

Para investigar la comunicación célula-célula, se utilizó el paquete CellChat. El subconjunto de "señalización secretada" se seleccionó como la base de datos de comunicación utilizando el comando subsetDB. Se utilizaron objetos Seurat de las muestras como entradas para generar objetos CellChat a través de la función createCellChat. El análisis de comunicación se realizó de acuerdo con el flujo de trabajo estándar de CellChat.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Los datos se expresan como medias ± DE. Para las comparaciones por pares entre dos grupos, se utilizaron pruebas t de Student de dos colas para determinar los valores P. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, con niveles de significación definidos como *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001.